纤维分解

纤维分解（共9篇）

纤维分解 篇1

摘要：分析我国非木材纤维原料制浆的特征, 提出了利用有机酶酶化草本植物制备造纸用原浆的方法。试验表明:香蕉茎秆、玉米茎杆和稻草通过切片, 将有机酶通过计量泵喷雾式喷射在磨浆机入口处的物料上, 一次中浓磨解可得到叩解度为27～30度的造纸用本色原浆。

关键词：造纸原浆,非木材纤维,有机酶,香蕉茎秆,玉米茎杆,稻草

0 引言

众所周知造纸的原料有木材与非木材之分, 由于人类生活文明的进步均离不开纸, 纸品成了人类生活中不可缺少的物品之一。木材生长周期长, 砍伐木材用于造纸, 势必影响水土保持, 破坏大自然的生态。

我国是农业大国, 每年秋收后的稻草杆、玉米杆、麦杆等除少部分得到利用以外都成为了废弃物, 在农村随处可见, 任其腐烂和污染环境。以上材料均是上等造纸原料, 如果充分利用, 能替代不少木材。例如我国有6.67×105hm2的香蕉种植面积, 均分布在海南、广东、广西、福建和云南等省区。香蕉果树属巨型草本植物, 生长周期为8个月, 终身一次收成, 收果后必须把果树砍掉, 每公顷树杆以75.00t算, 6.67×105hm2, 每年就有5.0×107t的香蕉茎杆作为农业垃圾丢弃在田间地头。造成了农业垃圾的污染, 这些香蕉茎杆其纤维含量为6.00% (干重) , 可取代5.00×106m2的造纸原木材料。

为解决现有非木材造纸工艺技术存在的问题, 现初探提出一种利用“有机酶”酶化草本植物制备造纸用原浆的方案, 根据熊猫、牛、马和羊等动物消化系统内分泌能降解纤维有机酶的特点, 采用“有机酶”酶化草本植物纤维, 实现草本植物制浆免蒸煮、无污染环境排放物的造纸工艺新技术;浆的得率比传统磨解高20%, 而叩解度提高2~3度。

1 非木材纤维原料制浆的特征

应用非木材原料制浆已有几百年的历史, 但从现代化生产的角度来看, 它的技术仍不完善, 如何利用好如此大量的可再生资源, 仍需要不断地技术创新。

非木材纤维资源制浆造纸的主要特征如下。

1.1 秸秆生物结构

秸秆生物结构的不均匀性。即茎秆、叶、穗等部分不均匀, 而且各部分的化学成分及纤维形态差异很大, 对制浆过程的影响大。

1.2 化学成分

化学成分的差异。非木材纤维和木质结构的差异及其在制浆过程中溶出、机理的差异。

1.3 纤维形态

纤维形态的特征。特别是细小纤维组分及杂细胞组分含量高。

1.4 木材和非木材植物纤维特点区别

和木材相比, 非木材植物纤维的特点是组织疏松、吸液量大、木质素含量低、灰分含量高, 这就是导致非木材纤维浆成纸强度差、不透明度低、浆料得率低、滤水性差、有粘着性、颜色深, 对碱回收不利;但非木质纤维原料浆成纸均度好、平滑度好、吸墨性好、易蒸煮、易施胶。来源丰富, 在我国有着广阔的应用前景。

2 早期非木材造纸工艺技术

非木材造纸工艺技术早已实现, 其主要方法是:通氧碱蒸煮法;氢氧化钾法;互硫酸盐—甲醇式硫酸钠法等等。但以上各种方法都离不开蒸煮, 最关健的是后期的废水处理难度较大, 并需要一笔不少的投入, 不符合国家的生物产业和环保政策。

3 有机酶酶化草本植物制备造纸用原浆的方法

3.1 技术方案

酶化草本纤维的有机酶, 是发明人根据动物牛、羊、马、熊猫等吃了草本植物纤维后, 肠胃内分泌的发酵酶的特点进行研究, 得出的发明成果。本发明的宗旨是提供一种原生态、无污染、绿色造纸的磨浆技术, 解决了一直以来困扰造纸工业的蒸煮磨浆和得率低的难题, 采用本发明, 废水可在简单的聚合硫酸铝溶液滴定絮凝处理后进行循环利用, 每生产1t纸外排的废水不到4m3。

3.1.1 草本植物制原浆过程

以草本植物为原料, 用切片机将原料切成一定的小块物料, 再送入造纸用的高浓度液压磨浆机进行磨解, 将有机酶通过计量泵喷雾式喷射在磨浆机入口处的物料上, 物料在磨浆机内的磨盘运行摩擦升温至60~70℃, 磨解后的原浆在浆池内通过推进器的不断搅拌和翻滚20~30min, 即可得到符合造纸要求的柔软粗纤维;再通过常规的60目斜筛过滤把灰份以及不利于抄造纸品的半纤维素, 果胶等物虑掉, 再进行一次中浓磨解就可以得到叩解度为27~30度的造纸用原浆。

3.1.2 有机酶配方

所述的有机酶由如下原料配制:生石灰100kg, 幌伞枫木叶5kg, 含量98%的淀粉酶2kg、糯米粉5kg, 含量88%的乙氧基乙基磷酸500g、含量90%的双吡啶盐5kg和含量95%的乙基麦芽酚30g。

3.1.3 有机酶的制备

3.1.3. 1 取100kg的生石灰放入容器内, 加入1000kg的

清水浸泡12h, 用普通的打浆机进行磨解, 然后放到第二个容器中澄清10h后, 用80目的滤布进行过滤, 得到石灰溶液, 取上清液调整p H值6~7得到清石灰溶液, 放入塑料桶内备用。所用容器选择每个有5m3容积, 材质可以是塑料、不锈钢或铝质的。

3.1.3. 2 把无霉变的5kg幌伞枫木叶用30kg80℃的温

水浸泡7h后, 用普通的磨浆机将其磨成细浆, 在常温下放进钢质的容器内顺时针搅拌, 并徐徐地加入2kg淀粉酶, 然后再加入5kg糯米粉, 搅拌30min, 使物料混合成饱和浆液后静置待用。

3.1.3. 3 将步骤3.1.3. 1制得的清石灰液加温至70~

80℃, 再把步骤3.1.3.2制得的幌伞枫木叶浆液以喷雾方式加入到清石灰液内, 顺时针方向搅拌20min后, 先加入500g乙氧基乙基磷酸, 继续搅拌30min后再加入5kg双吡啶盐, 搅拌混合后用清水把混合液的p H值调整到7~8, 静置3h, 再用90目的滤布进行过滤即得到有机酶溶液, 放入塑料桶内放于通风阴凉处待用;有机酶溶液在用前40min加入30g乙基麦芽酚并搅拌混合均匀。

3.2 实施案例

3.2.1 案例一

选用3t新鲜的香蕉茎秆通过切片机切成4~6cm的小块物料, 再利用普通造纸用的高浓度液压磨浆机进行磨解。将有机酶通过计量泵喷雾式喷射在磨浆机入口处的物料上, 按重量计, 每吨物料用6kg有机酶溶液, 6kg有机酶溶液用清水稀释为20kg后, 用计量泵喷雾式喷射在磨浆机入口处的物料上, 物料在磨浆机内控制机内温度60~70℃, 在酶和温度的作用下磨解瞬间促使纤维产生分子裂变, 磨解后排出的细浆在浆池内通过推进器的不断搅拌和翻滚20~30min, 再通过常规的60目斜筛过滤, 把灰份以及不利于抄造纸品的半纤维素、果胶等物虑掉, 再进行一次中浓磨解就可以得到叩解度为27~30度的造纸用本色原浆2.1t (湿重) 。

3.2.2 案例二

选用5t新鲜的玉米茎杆通过切片机切成每段长4~6cm的小块物料, 再利用普通造纸用的高浓度液压磨浆机进行磨解。将有机酶通过计量泵喷雾式喷射在磨浆机入口处的物料上, 按重量计每吨物料用10kg有机酶溶液, 10kg有机酶溶液用清水稀释为33kg后, 用计量泵喷雾式喷射在磨浆机入口处的物料上, 物料在磨浆机内控制机内温度60~70℃, 在酶和温度的作用下磨解瞬间促使纤维产生分子裂变, 磨解40~60min后排出的细浆在浆池内通过推进器的不断搅拌和翻滚20~30min, 再通过常规的60目斜筛过滤把灰份以及不利于抄造纸品的半纤维素, 果胶等物虑掉, 再进行一次中浓磨解就可以得到叩解度为27~30度的造纸用本色原浆3t (湿重) 。

3.2.3 案例三

用7t绝干稻草通过切片机切成4~6cm的小段, 再利用普通造纸用的高浓度液压磨浆机进行磨解。将有机酶通过计量泵喷雾式喷射在磨浆机入口处的物料上, 按重量计每吨物料用14kg有机酶溶液, 14kg有机酶溶液用清水稀释为46kg后, 用计量泵喷雾式喷射在磨浆机入口处的物料上, 物料在磨浆机内控制机内温度60~70℃, 在酶和温度的作用下磨解瞬间促使纤维产生分子裂变, 磨解40~60min后排出的细浆在浆池内通过推进器的不断搅拌和翻滚20~30min, 再通过常规的60目斜筛过滤, 把灰份以及不利于抄造纸品的半纤维素、果胶等物虑掉再进行一次中浓磨解就可以得到叩解度为27~30度的造纸用本色原浆4.9t (湿重) 。

3.2.4 小结

以上案例在云南省西双版纳星鑫农业科技有限公司和西双版纳倡华生物科技有限公司香蕉茎秆综合利用中试车间, 历时两年的实际应用中均取得良好的效果。

4 结语

我国制浆造纸原料的特点是木材供应不足, 造纸业长期以草浆作为主要的造纸原料。项目研究在分析草类纤维的纤维结构和化学组成的基础上, 针对草类纤维原料的特性, 打破旧框框, 不用高温、高压和强碱的蒸煮方式, 换用新型有机酶酶化草本植物制备造纸用原浆新工艺, 生产中不产生黑液, 从根本上解决传统草类原料碱法化学法制浆的污染问题;能适应各种草类原料, 如稻草、麦草、棉秆沙柳、蔗渣、芦苇、桑条和麻类等几乎所有非木材纤维原料。

参考文献

[1]孙中华, 董荣业.论草类纤维原料制浆造纸[D].上海:中国科学院上海冶金研究所, 2000.

[2]李金花等.我国制浆造纸木材纤维原料的现状及发展对策[D].上海:中国科学院上海冶金研究所, 2000.

[3]国家发展和改革委员会.造纸产业发展政策[J].中华纸业, 2007, (11) .

[4]汤兴然, 汤军, 鹿守明.一种“酶化转化+膨化”的草类纤维制浆造纸方法[P].中国专利:CN1924187A, 2007-03-07.

纤维分解 篇2

一、教材分析

本课题作为课题1的应用和课题2的深入，分离某种特定的微生物，难度较大、探索性更强，在高考中考查的可能性也很大。教材在课题背景中利用学生已经学过的纤维素的化学组成推广到生活中纤维素的广泛分布和应用。而若要充分利用纤维素，就应将其分解，引导学生自然而然地过渡到分解纤维素的微生物及其产生的相关酶。之后，教材紧接介绍了纤维素、纤维素酶以及如何从土壤中分离分解纤维素的微生物，通过对课题中实验设计思路的深入学习，要求学生掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术。

二、教学目标

1、知识与技能

（1）能简单叙述纤维素酶的种类和作用。

（2）能从土壤中分离出分解纤维素的微生物，了解这类微生物的应用。

（3）掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术。

2、过程与方法

分析分离分解纤维素的微生物的实验流程，掌握实验操作的原理。

3、情感、态度与价值观

（1）通过自主设计、完成实验，培养勇于探究的科学精神。

（2）通过了解土壤中能分解纤维素的微生物在保护环境中的作用，增强社会责任感。

三、教学重难点

1．重点

从土壤中分离分解纤维素的微生物。2．难点

从土壤中分离分解纤维素的微生物。

四、教学准备

多媒体课件。

五、课时安排

1课时。

六、教学过程

【课程导入】 糖类是生物体进行生命活动的主要能源，人类以淀粉作为能量的主要来源，但完全不能消化纤维素，二反刍动物和大量的微生物却能以纤维素作为能量的主要来源，此中奥妙何在？让我们一起来了解这种能分解纤维素的微生物。

【基础知识】

（一）纤维素和纤维素酶

1、棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。

2、纤维素酶的组成及作用：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。

（二）纤维素分解菌的筛选

1、方法：刚果红染色法

2、纤维素分解菌筛选方法的原理:刚果红是一种染料，它可以与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解为中心的透明圈。这样我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

【实验设计】

（一）分离分解纤维素的微生物的实验流程

土壤取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落

1、土壤取样

选择纤维素丰富的环境，依赖于生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。

2、选择培养

（1）目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物（2）操作：将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下震荡培养1～2天，直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。

3、梯度稀释

按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养液进行等比稀释101~107倍，之后，将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。

4、将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上（1）制备培养基：参照旁栏中的比例。（2）倒平板操作。

（3）涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上，30℃倒置培养，菌落周围会出现明显的透明圈。

5、挑选产生透明圈的菌落

参照课本刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落

（二）刚果红染色法

方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应 方法二：在倒平板时就加入刚果红 方法一

缺点是操作烦琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂； 优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二

优点是操作简便，不存在菌落混杂问题；

缺点一是由于培养基中还含有淀粉类物质，可以使能产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应；缺点二有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红，形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。

（三）土壤中纤维素分解菌的分离实验的具体操作步骤

1、土样采集

土样采集的方法与本专题课题2类似。土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。

2、选择培养

选择培养需要的仪器有：250 mL锥形瓶、无菌称量瓶、药匙、1 mL和10 mL的移液管、天平、摇床、温度计等。

培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在250 mL锥形瓶中装入30 mL培养基，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸（或报纸），用线绳扎紧，在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。

选择培养的操作：称取土样20 g，在无菌条件下加入装有30 mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30 ℃下振荡培养1～2 d，至培养基变混浊。此时可以吸取0.1 mL培养液进行梯度稀释和涂布平板，也可以按课本中所述，重复选择培养的步骤一次，然后再进行梯度稀释和涂布平板。

3、刚果红染色法分离纤维素分解菌

这一步所需要的仪器有：无菌培养皿、涂布器、1 mL移液管，装有9mL无菌水的20 mL大试管，温箱等。

培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在500 mL三角瓶中装入200 mL培养基，在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。

倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿中倒入15～20 mL培养基，凝固后待用。

制备菌悬液：按照本专题课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数至106。

涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1 mL，滴加在平板培养基上，用涂布器将菌液涂布均匀，在30 ℃倒置培养，至菌落长出。每个稀释度下需涂布3个平板，并注意设置对照。刚果红染色的具体操作步骤参照课本［资料三］。

（四）课题成果评价

1、培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落：对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。

2、分离的结果是否一致：由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。

七、课堂小结

纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素分解菌的筛选方法是刚果红染色法，它有两种方法，一是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；二是在倒平板时就加入刚果红。

八、教学反思

纤维分解 篇3

关键词：纤维素酶；滤纸崩解试验；筛选鉴定；16SrDNA

中图分类号： X173文献标志码： A

文章编号：1002-1302（201412-0386-03[HS][HT9SS]

收稿日期：2014-01-13

作者简介：廖瀚峰（1989—，男，广西桂林人，硕士研究生，从事微生物菌剂研究。E-mail：5851122lhf@163com。

通信作者：周礼红，博士，副教授，从事微生物研究。E-mail：Lhzhou33@126com。

垃圾处理是当代世界各国共同关注并亟待解决的环境问题之一，也是城市发展与健康领域中的一项重要研究内容。我国城市生活垃圾年清运量约为16亿t，除少部分焚烧、堆肥或回收利用外，绝大部分被运送到填埋场进行填埋处置，在填埋过程中由于有机质腐败分解，不可避免地造成恶臭污染[1-2]。城市突发性恶臭污染越来越严重，严重干扰了人们的正常生产生活，投诉量不断攀升[3-4]。近些年来，在北京、上海、杭州、广州等一些大中城市发生的垃圾填埋场恶臭扰民事件，成为填埋场周边地区的社会不稳定因素，严重制约我国经济、社会和环境的持续发展。

我国城市垃圾比较特殊，垃圾中有机物占主要成分，主要有淀粉、蛋白质、脂类、纤维素、半纤维素、木质素等。其中木质素难以被微生物降解[5]；纤维素和半纤维素因为具有紧密的结晶结构，使其具有很强的不可降解性，积累过多会导致环境问题。城市生活垃圾中有大量纤维素，且随着人们生活水平提高而呈现逐年上升的趋势[6]。所以纤维素和半纤维素的处理也是生物法处理城市垃圾的关键环节之一[7]。筛选出同时具备分解纤维素和快速除臭能力的菌株对于采用生物法处理城市垃圾尤为重要。本研究通过筛选出具有产纤维素酶能力的快速除臭菌株，以期为提高生物法处理城市垃圾效率、微生态除臭提供更多的微生物菌种资源。

1材料与方法

11材料

111供试菌株供试菌株为贵州大学生命科学学院微生物实验室保存的16株具有快速发酵及一定除臭功能的菌株（分别编号为G1、G2、G3、G4、G5、X1、X2、X3、X4、X5、X6、F1、F2、F3、Y1、Y2。

112试剂DNS试剂[8]、005 mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液（pH值85、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制的1 % 羧甲基纤维素钠（CMC-Na溶液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液配制的1%水杨苷溶液、蒸馏水。

113培养基（1滤纸崩解培养基：05 g MgSO4，2 g H2PO4，05 g Cl，0001 g FeSO4·7H2O，10 g酵母膏，1 g蛋白胨，1 000 mL蒸馏水，自然pH值。（2发酵产酶培养基：10 g CMC-Na，05 g MgSO4，2 g 2HPO4，05 g Cl，001 g FeSO4·7H2O，5 g[JP2]酵母膏，05 g蛋白胨，1 000 mL蒸馏水，pH值为72～74。（3菌种活化培养基：10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，16 g琼脂粉，1 000 mL蒸馏水，pH值为72。

114主要设备与仪器S1000 PCR扩增仪，美国伯乐 BIO-RAD 公司生产；DYY-11型电泳仪，北京市六一仪器厂生产；Gel Doc XR+凝胶成像系统，美国伯乐BIO-RAD公司生产；TH2-82A數显气浴恒温振荡器，常州普天仪器有限公司；Olympus生物显微镜，奥林巴斯株式会社。

12方法

121种子液的制作将供试菌株转接到用250 mL三角瓶装的100 mL液体菌种活化培养基中，于37 ℃、170 r/min培养24 h，制成种子液。

122滤纸崩解试验将活化后的供试菌株接种到用 250 mL 三角瓶装的150 mL滤纸崩解培养基中，再加入1条15 cm×80 cm灭菌过后的Whatman No1滤纸条，同时设立不接任何菌株的空白对照C，在37 ℃、160 r/min下培养；间隔 72 h 后，观察滤纸片的崩解情况，并选出滤纸崩解效果明显的菌株，测定其滤纸酶、内切葡聚糖苷酶、β-葡萄糖苷酶的酶活。

123粗酶液的提取将滤纸崩解效果明显的菌株从试管斜面转接至发酵产酶培养基中，于37 ℃、170 r/min培养 48 h，再于4 000 r/min离心10 min，取上清液，即为粗酶液。

124滤纸酶活的测定[9] 在试管中放入1 cm×6 cm的Whatman NO1滤纸（约50 mg1条，加入05 mL适当稀释的纤维素酶粗酶液以及1 mL 甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，45 ℃ 温浴60 min后，立即加入3 mL DNS试剂终止反应，沸水浴 5 min 后迅速冷却至室温，加蒸馏水定容至25 mL，在540 nm扣除空白测吸光度，根据葡萄糖标准曲线换算成IU/mL。空白管的粗酶液先用沸水水浴10 min，加入DNS试剂后加入粗酶液，其余操作和样品管一样。1个滤纸酶活力单位定义为：以滤纸为底物，在45 ℃恒温的条件下，水解反应中1 min催化底物水解形成1 μmol葡萄糖的酶量。

125内切葡聚糖苷酶的测定在试管中加入05 mL适当稀释的纤维素酶粗酶液和2 mL 1% CMC-Na溶液作为底物，45 ℃温浴30 min后，立即加入3 mL的DNS试剂终止反应，沸水浴5 min后迅速冷却至室温，加蒸馏水定容至25 mL，冷却后在540 nm扣除空白测吸光度，根据葡萄糖标准曲线换算成IU/mL。空白管的粗酶液先用沸水水浴10 min，加入DNS试剂后加入粗酶液，其余操作和样品管一样。1个内切葡聚糖苷酶活力单位定义为：以1%CMC-Na为底物，在 45 ℃ 恒温的条件下，水解反应中1 min催化底物水解形成 1 μmol 葡萄糖的酶量。

126β-葡萄糖苷酶的测定在试管中加入05 mL适当稀释的纤维素酶粗酶液和2 mL 1%水杨苷溶液作为底物，45 ℃ 温浴60 min后，立即加入3 mL的DNS试剂终止反应，沸水浴5 min后迅速冷却至室温，加蒸馏水定容至25 mL，冷却后在540 nm扣除空白测吸光度，根据葡萄糖标准曲线换算成IU/mL。空白管的粗酶液先用沸水水浴10 min，加入DNS试剂后加入粗酶液，其余操作和样品管一样。1个β-葡萄糖苷酶酶活力单位定义为：以1%水杨苷为底物，在 45 ℃ 恒温的条件下，水解反应中1 min催化底物水解形成1 μmol葡萄糖的酶量。

12716S rDNA 序列分析采用生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式基因组 DNA 抽提试剂盒（细菌提取。

PCR 反应体系（ 25 μL：125 μL Dream TaqTM Green PCR Master Mix（2×；1 μL 16S上游通用引物27F；1 μL 16S下游通用引物1492R；95 μL ddH2O；1μL模板DNA。

上游通用引物27F序列为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游通用引物1492R序列为5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反应条件为：94 ℃，4 min；94 ℃预变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸 15 min，30个循环；72 ℃终延伸10 min，4 ℃停止。

PCR 产物由生工生物工程上海股份有限公司使用Applied Biosystems 3730XL测序仪进行测序。将所得序列通过 NCBI的BLAST功能进行序列比对分析。利用MEGA 50软件制作系统进化树。

2结果与分析

21初筛试验结果

通过滤纸崩解试验，从供试菌中筛选具有产纤维素酶能力的菌株。将16株供试菌接入有无菌滤纸条的滤纸崩解培养基后72 h观察结果。空白组滤纸条保持完整，边缘没有崩解情况。菌株F1对滤纸条产生一定程度的崩解效果，滤纸发生断截并且边缘呈絮状，但总体保持完整。菌株Y6、X1、X4、G1均对滤纸产生明显的崩解效果，培养基浑浊且底部有部分絮状物，推测是滤纸条完全崩解后产生的沉淀物。菌株G2对滤纸条表现出较为彻底的崩解效果，培养基相对于其他菌株较为澄清，底部只有少量絮状残留物。Y1等其余10株供试菌株没有明显的滤纸崩解现象（图1。[FL]

[F（W11][TPLHF1tif][F]

[FL（22]22复筛试验

将滤纸崩解作用明显的6个菌株用液体产酶培养基发酵2 d后测定其滤纸酶、内切葡聚醣苷酶和β-葡萄糖苷酶的酶活。根据滤纸崩解和酶活力测定结果筛选出具有较高纤维素酶活力的菌株。在45 ℃、pH值85条件下，G2的滤纸酶活性和内切葡聚糖苷酶活性最高，分别为1737、3179 IU/mL，比其他菌株至少分别高出5001%、2902%。滤纸酶活性最低的是F1菌株，为0616 IU/mL，同时其β-葡萄糖苷酶活性只有0394 IU/mL，这可能是在滤纸崩解试验中该菌株对滤纸条的分解利用不如其他5个菌株的原因（图2。关于纤维素酶水解天然纤维素的机制，目前普遍认为是由纤维素酶3种组分协同作用的结果。内切葡聚糖苷酶负责进攻纤维素的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带还原性末端或非还原性末端的小分子纤维素，外切葡聚糖苷酶从纤维素线状分子的末端水解切下纤维二糖单位，β-葡萄糖苷酶最后将纤维二糖水解成葡萄糖[10]。虽然菌株G1内切葡聚糖苷酶活性较低（0628 IU/mL，生成小分子纤维素效率较慢，但是高活性的β-葡萄糖苷酶（1441 IU/mL可以快速将由外切葡聚糖苷酶水解产生的纤维二糖水解成葡萄糖，故G1的滤纸酶活性依然可以保持在较高的水平。

结合滤纸崩解试验和酶活力测定试验，认为G2是有相对较高纤维素酶活力的菌株，其滤纸酶、内切葡聚醣苷酶和β-葡萄糖苷酶的酶活分别为1737、3179、1232 IU/mL。

23高纤维素酶活力菌株G2的鉴定

菌株G2的显微形态：菌体呈短杆状，大小为（05～08 μm×（15～30 μm，染色均匀，具運动性，兼性厌氧，可形成内生芽孢，芽孢囊膨大，呈椭圆形， 芽孢着生点在菌体

[F（W10][TPLHF2tif][F]

中心，游离芽孢表面着色弱，革兰氏染色阳性（图3。菌株G2在LB培养基上呈白色不透明菌落，表面粗糙，菌落边缘不规则，在多种培养基上均不产色素。

以菌株G2的全基因组DNA为模板，PCR扩增后经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到1条约15 kb的特异性条带，经序[CM（25]列测定，长度为1 452 bp。将其与GenBank中报道菌株的[CM]

[F（W10][TPLHF3tif][F]

16S rDNA序列进行相似性分析表明，亲缘关系相近的前20个序列都为芽孢杆菌属（Bacillus的菌株，同源性均超过98%。运用MEGA50软件中的邻接法计算菌株G2的16S rDNA序列与同源性99%以上序列的进化关系，以地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis作外群，经1 000次bootstrap验证，获得系统进化树（图4。[FL]

[F（W11][TPLHF4tif][F]

[FL（22]结合形态学与16S rDNA分子鉴定结果，初步确定G2为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens。

3结论

国际上常用的除臭方法一般有化学法、物理法和生物法。生物除臭法中主要的作用因素是具有除臭功能的微生物，筛选高效除臭菌不仅可以提高恶臭物质的消化和降解速率，抑制恶臭菌的生长，同时也能够有效分解垃圾中难降解的大分子有机物。国内对垃圾微生物除臭已有相关研究，如王光玉等利用微生物加速降解条件的初步研究[10]；汪英学等筛选可以降低垃圾填埋场氨气和硫化氢气体的微生物[11]；叶劲松等研究了垃圾中纤维素含量与纤维素降解菌之间的变化规律[12]。但是目前尚未筛选出同时具有除臭和产纤维素酶能力菌株的相关报道。本研究从贵州大学生命科学学院微生物实验室提供的具有快速发酵和除臭功能的菌株中，通过滤纸崩解试验筛选到6株具有一定产纤维素酶能力的菌株。通过在45 ℃、pH值85条件下测得各菌株的滤纸酶、内切葡聚醣苷酶和β-葡萄糖苷酶的酶活，挑选出纤维素酶活性最好的菌株G2。通过形态学和菌株16S rDNA扩增与分析，初步确定G2是解淀粉芽孢杆菌（B amyloliquefaciens。[JP+1]本试验筛选出同时具有除臭及产纤维素酶能力的菌株，对有效利用分解城市垃圾中的纤维素和半纤维素、缩短垃圾发酵时间、增加垃圾发酵效率，以及为微生物除臭菌剂的制备提供菌种资源。

[HS2][HT85H]参考文献：[HT8SS]

[1][（#]石磊，边炳鑫，赵由才，等 城市生活垃圾卫生填埋场恶臭的防治技术进展[J] 环境污染治理技术与设备，2005，6（2：6-9

[2]刘景岳，刘晶昊，徐文龙 我国垃圾卫生填埋技术的发展历程与展望[J] 环境卫生工程，2007，15（4：58-61

[3]吴希文，李秀荣，黄国强，等 恶臭污染影响评价概述[J] 环境科学动态，2002（2：21-23

[4][JP2]Rotton J，White S M Air pollution，the sick building syndrome，and social behavior[J] Environment International，1996，22（1： 53-60

[5]杨朝晖，曾光明，蒋晓云，等 城市垃圾堆肥过程中的生物学问题研究[J] 微生物学杂志，2005，25（3：57-61

[6]陈坚 环境生物技术[M] 北京：中國轻工业出版社，1999：244-245

[7]EL-Masry H G Utilization of Egyptian rice straw in production of cellulases and microbial protein[J] Journal of the Science of Food and Agriculture，1983，34： 725-732

[8] QB 2583—2003纤维素酶制剂[S]

[9] Ghose T Measurement of cellulase activities[J] Pure and Applied Chemistry，1987，59（2： 257-268

[10]王光玉，陈雷，宣世伟，等 生活垃圾好氧堆肥微生物接种的初步研究[J] 环境科学与技术，2005，28（2：20-21

[11]汪英学，赵述淼，吴定心，等 新型复合微生物制剂对垃圾填埋场的除臭效果[J] 湖北农业科学，2012，51（1：35-38

纤维分解 篇4

1 材料与方法

1.1 材料与培养基

1.1.1 菌株

地衣芽孢杆菌4株, 编号分别为703、704、705、706, 高温放线菌2株, 编号为720、722。

1.1.2 培养基

牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3.0 g, 蛋白胨10.0 g, Na Cl 5.0 g, H2O 1 000 m L, 琼脂15.0g, p H7.0。

纤维素刚果红培养基:KH2PO40.5 g, Mg SO4·7H2O0.25g, 微晶纤维素1.88g, 明胶2.0g, 刚果红0.2g, 土壤浸出液100 m L, H2O 900 m L, 琼脂15g, p H 6.5。

CMC培养基:CMC-Na 15g, NH4NO31.0g, 酵母膏1.0 g, Mg SO4·H2O 0.5 g, KH2PO41.0 g, H2O 1 000 m L。

改良的PDA培养基:土豆200 g, 葡萄糖20 g, K2HPO41.0 g, Mg SO42.0 g, Ca CO32.0 g, H2O 1 000 m L p H 7.0。

液体产酶发酵培养基:CMC 10.00 g, 蛋白胨2.50 g, 牛肉膏0.50 g, Mg SO40.5 g, k H2PO41.0 g, Na2HPO41.00 g, Na Cl 1.00 g, H2O 1 000 m L, p H 7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株间的适应性试验

采用两两配对的方式, 进行完全组合。

细菌间采用两两培养交叉划线的方法, 观察菌株间生长的协同性及是否有拮抗作用等。

采用琼脂块法测定放线菌间和放线菌与细菌间的影响, 将在平板培养基生长了3 d的放线菌平板, 用打孔器打下一个小圆片, 再将其摆放在均匀涂布了细菌菌悬液或放线菌菌悬液的平板上。每皿3个重复。

1.2.2 菌株单独发酵与混合发酵对酶活力的影响

1.2.2. 1 发酵方法

单菌株发酵:取各菌株经发酵16 h的发酵液各0.6 m L接种至含100 m L液体发酵培养基的三角瓶中, 在55℃±2℃, 150 r/min, 培养36~48 h, 于第3 d和5 d分别取样测纤维素酶活及菌密度。

混合菌株发酵:将各处理接种至含100 m L液体发酵培养基的三角瓶中, 在55℃±2℃, 150 r/min, 培养36~48 h, 于第3 d和5 d分别取样测蛋白酶活、纤维素酶活及菌密度。

处理1:取各细菌菌株16 h的发酵液各0.15 m L混合。

处理2:取各放线菌菌株16 h的发酵液各0.3 m L混合。

处理3:取各菌株16 h的发酵液各0.1 m L混合。

1.2.2. 2 测定方法

平板测定:取菌株单独发酵液和混合发酵液各1滴滴加于同一纤维素刚果红培养基平板, 重复3皿。培养2 d, 取出, 记录水解透明圈的有无与透明圈的直径, 酶的水解能力用R表示, 公式如下:

R=D/d

R-酶的水解能力

D-水解透明圈的直径, mm

d-菌落的直径, mm

纤维素酶活测定:还原糖标准曲线与酶活的测定方法参照GB20287-2006《农用微生物菌剂》DNS比色法和房兴堂等、孙军德等的实验方法略作改动。以1 m L原样酶液, 1 min产生1 ug葡萄糖定义为1个酶活单位 (U) 。分别测定羧甲基纤维素酶 (CMC) 酶活力和滤纸酶 (FPA) 酶活力。测定方法如下:

原样酶液的制备:称取10.0 g或10.0 m L样品, 加入装有玻璃珠的三角瓶中, 再加入10 m L蒸馏水稀释10倍, 静置20 min, 200 r/min振荡30 min, 然后用四层纱布过滤, 滤液3 000 r/min离心10 min。离心后的上清液根据酶活力稀释至适当浓度, 即为原样酶液, 供测试用。

羧甲基纤维素酶 (CMC) 酶活力测定步骤:取4支大试管, 1支作为空白对照, 其余3支作为平行样品管。样品管中加1.0 m L原样酶液, 然后4支试管中分别加入4.0 m L已预热至60℃的CMC缓冲液, 在60℃的水浴锅中反应20 min取出, 每管立即加入3.0m L DNS显色液, 摇匀后在对照管中加入1.0 m L原样酶液。将4支试管放入沸水浴中, 显色5 min后立即取出, 流水冷却, 490 nm处测定其OD值。

滤纸酶 (FPA) 酶活力测定步骤:取4支大试管, 1支作为空白对照, 其余3支作为平行样品管。将样品管中加1.0 m L原样酶液, 然后4支试管中分别加入4.0 m L磷酸钠缓冲液并将1×6 cm的新华滤纸浸入其中, 在60℃的水浴锅中反应60 min取出, 每管立即加入3.0 m L DNS显色液, 摇匀后在对照管中加入1.0 m L原样酶液。将4支试管放入沸水浴中, 显色5 min后立即取出, 流水冷却, 490 nm处测定其OD值。

2 结果与分析

2.1 菌株复配试验

从菌株复配的结果看, 菌株间存在着很好的协同作用, 无论是细菌间还是放线菌与细菌间, 放线菌间均不存在抗性, 菌株间的生长不存在生长竞争的关系。细菌划线的交叉点上菌落正常生长, 有融合的现象, 菌苔更丰厚;放线菌与细菌间不存在拮抗作用, 细菌生长正常, 在放线菌周围, 细菌的生长似乎更活跃;放线菌之间, 相互间无抗性, 正常生长。

2.2 菌株单独发酵与混合发酵对酶活力与生长量的影响

从表1~表3的方差分析与显著性比较看:混合培养的高温菌群的酶活性较菌株单独发酵的酶活要高, 整个高温菌群的酶活与单一菌株的酶活力差异性大, 菌群的酶活力明显优于单一菌株的酶活。从纤维素酶活力的强弱分析, 处理3>处理2>处理1>各单菌株, 处理2与处理1的纤维素酶活力与705、722菌株间的差异不显著, 与平板法测定的纤维素分解能力基本一致;处理3的纤维素酶活最高, 与单一菌株的酶活力之间存在极显著的差异, 5 d时纤维素酶活达到68.99 U。说明有机大分子物质的降解是一个复杂的过程, 单一的酶类不能对大分子的物质进行有效的降解, 只有多种酶系的综合作用才能提高对大分子物质的降解能力。不同种的微生物之间存在着协同作用比同种微生物的协同作用好, 这验证了前面的菌株复配的结果。

注:11-720, 12-722, 13-703, 14-704, 15-705, 16-706, 10-放线菌混培, 17-细菌混培, 中间为6株菌的混合培养

备注:纤维素酶活LSD0.01=5.65 LSD0.05=5.01

3 结论与讨论

从目前的研究来看, 混合菌发酵降解木质纤维素比单菌株更具优势, 因为混合菌各菌株可通过对产物的相互利用减少反馈抑制作用, 并产生不同类型的纤维素酶, 通过酶系互补提高对纤维素的降解效率[6,7]。本研究的结果也很好地印证了这一理论, 纤维素的有效降解应该是一个复合酶系作用, 单一菌株的作用是有限的, 不足以完成整个的降解过程, 不同种群的相互作用更有利于纤维素的降解。目前, 关于菌株间协同降解的机理及其酶系的组成等还有待进一步的研究。

参考文献

[1]孙永明, 李国学, 张夫道, 等.中国农业废弃物资源化现状与发展战略[J].农业工程学报, 2005, 21 (8) :169-173.

[2]张进良.高温纤维素分解菌的鉴定与分离[J].河南师范大学学报 (自然科学版) , 2011, 39 (3) :141-143.

[3]崔宗均, 李美丹, 朴哲, 等.一组高效稳定纤维素分解菌复合系MCI的筛选及功能[J].环境科学, 2002, 23 (3) :36-39.

[4]张瑞青, 孙燕霞, 袁堂玉, 等.一组常温纤维素分解菌稳定复合系的创建及其功能[J].山东科学, 2011, 24 (1) :40-44.

[5]吴圣进, 韦仕岩, 覃晓娟, 等.一组高温高效纤维素分解菌群的筛选及功能特性研究[J].西南农业学报, 2012, 25 (4) :1257-1261.

[6]司美茹, 薛泉宏, 蔡艳.混合发酵对纤维素酶和淀粉酶活性的影响[J].西北农林科技大学学报 (自然科学舨) , 2002, 50 (5) :69-74.

纤维分解 篇5

好氧堆肥中高温纤维素分解菌的筛选及性状研究

从规模化好氧堆肥的高温阶段筛选获得6株具有较高纤维素降解能力的高温菌.这些菌株的生长速率、温度稳定性以及纤维素酶活性检测结果表明,它们能在45～65 ℃的`温度下生长,最适生长温度为50～60 ℃;在普通细菌培养基和以羧甲基纤维素钠(CMC)为唯一碳源的限制性培养基上均能够快速启动并旺盛生长,分别在培养14 h和36 h左右达到最大活菌数.纤维素酶活性检测结果表明,获得的菌株均具有较高的Cx酶活和滤纸崩解能力,能够在2～3 d内快速启动滤纸条崩解,并显著降低滤纸条中纤维素含量.

作 者：王志超 陆文静 王洪涛 WANG Zhichao LU Wenjing WANG Hongtao 作者单位：清华大学环境科学与工程系,北京,100084刊 名：北京大学学报(自然科学版) ISTIC PKU英文刊名：ACTA SCIENTIARUM NATURALIUM UNIVERSITATIS PEKINENSIS年，卷(期)：200642(2)分类号：X1关键词：高温 纤维素分解菌 筛选 纤维素酶

纤维分解 篇6

1 材料与方法

1.1 试验材料

原料:牛粪、秸秆堆腐物、稻壳粉;培养基:纤维素粉、刚果红;菌株来源:堆肥、牛粪、秸秆堆腐物分离的纤维素分解菌。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株筛选及性能测定。

将堆肥、秸秆堆腐物样品点接在赫奇逊—滤纸平板上,置于28℃恒温培养,挑选生长速度快、分解滤纸能力强的菌落。将其接入刚果红平皿中,其活性按透明圈与菌落直径大小之比(D/d)计。再将透明圈与菌落直径大的菌株接种到赫奇逊液体培养基中恒温振荡培养,测定滤纸失重率。

1.2.2 堆肥试验。

试验设3个处理,处理1:84%牛粪+16%调理剂+纤维素分解菌剂1‰(FDQ1+FDQ2);处理2:84%牛粪+16%调理剂+纤维素分解菌剂1‰(FDQ1+FDQ3);对照(CK):84%牛粪+16%调理剂。鲜牛粪和鸡粪,以稻壳粉为调理剂调至含水量65%左右,混匀后堆成2.0m×1.5m×1.2m的堆体,根据发酵温度进行翻堆。

1.3 测定项目

滤纸失重率测定:用滤纸过滤发酵液将残留物在80℃下烘干称重,用减重法计算滤纸失重率。(CMC)酶活力:用DNS法测定还原糖的含量。纤维素分解率测定:利用CXC-06型粗纤维测定仪测堆肥发酵前及发酵后中纤维素含量,差值为纤维素分解率。有机质:马福炉550℃灼烧法。全碳测定:重铬酸钾外加热法。纤维素含量测定:重铬酸钾—碘量法。

2 结果与分析

2.1 菌株初筛

从堆肥、牛粪、秸秆堆腐物中分离4株纤维素分解菌。在以Whatman fiberous cellulose powder CF11为唯一碳源纤维素粉培养基中,有4株3~5d长满平皿,且在刚果红培养基中出现透明圈,透明圈与菌落直径比值较大。叶姜瑜研究证明,在纤维素刚果红培养基上,凡能形成红色水解圈的菌落即是能产纤维素酶的菌株。产酶愈多,水解圈愈大,产酶越快,水解圈出现越早。由表1可知,培养5d时,菌株FDQ1和FDQ2的透明圈直径大于4.0cm,透明圈直径与菌落直径比值分别为2.5、2.1,FDQ3和FDQ4的透明圈直径大于3.0cm,透明圈直径与菌落直径比值为2.0和1.9。初步判断FDQ1、FDQ2、FDQ3、FDQ4产纤维素酶能力较强。

2.2 菌株复筛

2.2.1 滤纸降解率。

对透明圈直径与菌落直径比值大的菌株进行滤纸失重研究,其结果见图1。FDQ1、FDQ2、FDQ3的滤纸失重率较高,随着培养时间的延长失重率明显提高,第6天分别达到34.8%、33.2%和30.0%,明显高于FDQ4菌株。

2.2.2 (CMC)酶活力。

以(CMC)酶活力作为复筛指标,将初筛得到的4个菌株在液体发酵培养基中培养5d,菌株FDQ1、FDQ2和FDQ3(CMC)酶活力第4天时达到高峰(图2),其中FDQ1最高,为697.58U/m L;其次是菌株FDQ2和FDQ3,分别为634.85U/m L和601.34 U/m L;FDQ4酶活最低。培养6d时所有菌株酶活力均呈下降趋势。FDQ4培养3d时酶活力虽然达到高峰,但第4天开始下降,且一直低于其他菌株。

2.3 不同菌株间协同效应研究

将滤纸失重率和(CMC)酶活力较高的FDQ1、FDQ2、FDQ3菌株分别以1∶1比例接种于赫奇逊培养液中(以滤纸碎片为唯一碳源)进行双菌混合培养,接种总量为5%。混菌发酵滤纸失重率见图3。可以看出,组合FDQ1+FDQ2、FDQ2+FDQ3、FDQ1+FDQ3均高于单菌培养滤纸失重率,随着培养时间的延长明显提高,第6天时的滤纸失重率分别为44.10%、33.51%、36.04%。FDQ1+FDQ2混合培养的滤纸失重率最高,较单菌分别培养提高26.72%和32.83%;FDQ2+FDQ3双菌混合滤纸失重率与FDQ2基本一致,较FDQ3单独培养时提高11.70%。FDQ1+FDQ3混合培养较单菌提高3.56%和20.13%。说明3个菌株间有协同效应。

2.4 纤维素混合菌剂对堆肥含碳物质转化的影响

2.4.1 使用混合菌剂堆肥有机质的变化动态。

在堆肥过程中,微生物首先利用易降解、结构简单的有机物合成细胞物质,以满足自身生长和繁殖需要,同时也伴随着有机物质的降解。选择FDQ1+FDQ2和FDQ1+FDQ3进行堆肥,由图4可知,FDQ1+FDQ2、FDQ1+FDQ3在1~3d内有机质含量明显下降,第3天时分别降至57.84%和59.47%;此后进入高温期,第4~5天时温度达到60℃以上,有机质含量的变化趋于平稳。5d后有机质又快速下降。堆肥结束时,FDQ1+FDQ2和FDQ1+FDQ3分别下降了19.57%和18.40%,对照只下降了6.58%。发酵前后的有机质含量反映出堆肥腐熟程度和堆肥品质。2.4.2使用混合菌剂堆肥全碳含量变化动态。全碳和有机质的含量变化趋势基本相同。初期FDQ1+FDQ2、FDQ1+FDQ3全碳的含量下降较快,对照全碳含量下降速度较慢(图5)。在堆肥的1~7d,FDQ1+FDQ2和FDQ1+FDQ3全碳含量明显下降,7d后趋缓慢下降,堆肥结束时全碳量分别为31.33%、32.42%,对照为41.20%,全碳量分别较发酵初期降低13.80%、12.71%和3.93%。可见,纤维素分解菌在堆肥中促进了碳素的矿化。

2.4.3 混合菌剂对堆肥纤维素分解率的影响。

接种纤维素分解混合菌剂,纤维素分解率较对照有明显提高,FDQ1+FDQ2和FDQ1+FDQ3纤维素分解率分别为67.59%和61.87%,较对照(34.64%)提高95.12%和78.61%。说明接种纤维素分解混合菌剂有利于堆肥中纤维素类大分子物质转化,提高堆肥中可溶性小分子有机物质的含量,促进碳素循环,提高堆肥品质。

3 结论

混菌组合发酵滤纸降解率和(CMC)酶活力均高于单菌。堆肥接种纤维素分解混合菌剂能有效地促进有机质转化,提高纤维素分解率,促进碳素的矿化,加快堆肥的腐殖化进程。

参考文献

[1]胡代泽.我国农作物秸秆资源的利用现状与前景[J].资源开发与市场,2000,16(1):19-20.

[2]陈敏.一种改进的纤维素分解菌鉴别培养基[J].杭州师范学院学报,2001(6):11-12.

[3]陈石根,周润琦.酶学[M].上海:复旦大学出版社,2001.

[4]傅力,丁有昉,张.虎纤维素酶测定方法的研究[J].新疆农业大学学报,2000(2):45-48.

[5]万先凯.一株高活力纤维素分解菌的筛选及酶学性质研究[D].天津:天津大学,2004.

[6]张松柏,肖兵南,邱美玲,等.牛粪中高温纤维素降解菌的分离[J].湖南畜牧兽医,2009(4):15-17.

[7]陈建军,陈海燕.不同培养条件下纤维素分解菌对稻草的分解研究[J].微生物学杂志,2004(4):12-14.

[8]席北斗,刘鸿亮,白庆中,等.堆肥中纤维素和木质素的生物降解研究现状[J].环境污染治理技术与设备,2002(3):19-23.

[9]陈庆森,刘剑虹,潘建阳,等.利用多菌种混合发酵转化玉米秸秆的研究[J].生物技术,1999,9(4):15-20.

纤维分解 篇7

氧化铝纤维属于高性能无机纤维, 具有高强度、耐高温等特点, 同时还具有耐腐蚀性强、绝热性能好并且质量轻、体积较小等特点, 在民用复合材料、工业及军事中都有着非常重要的用途[2,3]。其制备方法主要有淤浆法[4]、预聚合法[5]、浸渍法[6]、阳极模板法[7]、溶胶-凝胶法[8]等, 但在一定程度上都存在某些不足, 比如阳极模版法对设备要求较高, 溶胶-凝胶法通常与静电纺丝[9]结合使用, 工艺复杂且影响因素较多。

目前用水热法来制备具有一定长径比氧化铝纤维的相关文献介绍较少, He[10]通过微波水热制备了长径比在10~30的碳酸铝铵, 煅烧后形成的氧化铝纤维长径比范围较大、不均一。Lu[11]制备的γ-AlOOH纤维长径比较小。本研究以相对低廉易得的硝酸铝与尿素反应生成前驱体碳酸铝铵沉淀, 在普通反应釜中恒温反应, 在表面活性剂聚乙二醇的模板导向作用下, 控制工艺条件, 水热分解后煅烧得到一定长径比的纳米氧化铝纤维。将该氧化铝纤维应用于基材表面, 可提高基材的耐腐蚀性。该制备方法简单可行、成本较低, 易于工业化。

1 实验

1.1 实验试剂和仪器

实验所用试剂:九水合硝酸铝 (Al (NO3) 3·9H2O, 台山市粤侨试剂塑料有限公司, AR) , 聚乙二醇 (PEG-6000, 西陇化工股份有限公司, CP) , 尿素 (西陇化工股份有限公司, AR) , 无水乙醇 (广州化学试剂厂, AR) 。所用水为一次蒸馏水。所有试剂未经过进一步纯化处理。

实验所用仪器:SH2-D (Ⅲ) 循环水式真空泵 (巩义市予华仪器有限责任公司) , XMTH数显温控电热恒温鼓风干燥箱 (浙江余姚市远东数控仪器厂) , 78-2双向磁力加热搅拌器 (江苏金坛市环宇科学仪器厂) , JA-2003型电子天平 (上海良平仪器仪表有限公司) , SB12D超声波清洗机 (宁波新芝生物科技股份有限公司) , HH-2数显恒温水浴锅 (江苏金坛市顺华仪器有限公司) , BZF50型真空干燥箱 (上海博迅实业有限公司医疗设备厂) , SX2-4-13实验电炉 (武汉亚华电炉有限公司) , CJF-2L水热反应釜 (上海丞明) , 反应釜内衬为聚四氟乙烯, 容积为50mL。

1.2 实验制备

将7.5g (0.02mol) Al (NO3) 3·9H2O缓慢加入恒温蒸馏水中, 搅拌均匀后加入6.0g (0.1mmol) PEG (Mn=6000) , 形成透明溶液后加入6.0g (0.1mol) 尿素, 搅拌至完全溶解。将得到的反应液转移至聚四氟乙烯内衬的水热反应釜中, 在200℃水热反应24h, 自然冷却至室温, 将所得沉淀用蒸馏水、乙醇充分洗涤, 抽滤分离后得到前驱体碳酸铝铵纤维 (AACH) , 前驱体AACH经1300℃煅烧后得到具有一定长径比的氧化铝纤维。

1.3 表征方法

通过傅里叶红外光谱仪 (VERTEX70, 布鲁克光谱仪器亚太有限公司) 分析样品的分子结构和化学组成;采用同步热分析仪 (STA409PC, 德国耐池仪器制造有限公司) 分析样品对应的物化过程;采用超高分辨率发射扫描电子显微镜 (FEI/Nova Nano SEM430电子扫描显微镜, FEI company) 表征样品的形貌分布及尺寸;用SEM联用的电子能谱EDS (EBSD, 美国) 分析样品元素组成。

2 结果与讨论

2.1 AACH纤维制备及反应机理

图1为碳酸铝铵 (AACH) 纤维生长过程图[12]。酸性条件下, 反应液中含有大量氢离子, 破坏了生成的AACH纳米晶体层间的结合。在表面活性剂诱导作用下[13], 纳米晶层通过聚乙二醇羟基基团上的氢键吸附于其胶束表面。氢键降低AACH的表面能, 使分离的AACH纳米晶层在卷曲生长机制[14,15]作用下卷曲生长为纳米棒。随后聚乙二醇单体选择吸附于纳米棒的表面, 通过方向附着作用[16]按照一定结晶方向定向生长为微棒状结构。经过奥斯瓦尔德熟化[17,18]后得到具有纤维状结构的AACH纤维。最后自然冷却, 经过洗涤、抽滤、干燥后, 得到形状规则、表面光滑的纤维。

在该过程中, 涉及以下几个反应:

碳酸铝铵晶体中铝原子和氧原子形成八面体结构[19], 如图2所示。为验证其组成, 对所得样品进行了EDS能谱分析, 结果见图3, 可以看出铝、氧原子比为1∶6, 进一步佐证了其结构。八面体与氧原子间通过共价键作用连接成长链, 游离的NH4+和HCO3-离子又通过弱化学键与长链结合。当尿素的量足够时, AACH粒子表面的能量足以支持其形成新的表面, 将会形成更多新的粒子, 则粒子的平均尺寸将会减小[20]。同时, NH4+和HCO3-离子的大量存在, 将会破坏Al-O八面体链自身之间的交联, 使得长链之间相互分离, 各自生长, 从而形成可控形貌的AACH纤维, 如图4所示。

2.2 反应温度的影响

为研究反应温度对AACH形貌的影响, 以表面活性剂PEG-6000作为软模板, 在硝酸铝浓度为0.5mol·L-1, 尿素浓度为2.8 mol·L-1, 水热反应时间为24h, 干燥时间为24h时, 于不同温度下制备了AACH样品, 其SEM如图5所示。在较低温度下, 140℃时 (图5 (a) ) 反应主要处于成核阶段, 由于水热驱动力不够, 大部分颗粒还不能完整成长, 形成少量的棒状结构;温度升高到160℃ (图5 (b) ) 时, 温度相对仍较低, AACH原子在成核的同时, 还不足以给所有的晶核提供足够的轴向生长所需的能量, 使得不同晶体生长速度不一样, 从而使纤维长短不一;温度升到180℃ (图5 (c) ) 时, 原子在形核过程中同时进行沿晶核表面的堆积生长, 但在晶体生长过程中, 小粒径的粒子会沿着部分较大的晶核表面继续生长, 从而形成部分形貌不规则的团聚体;当温度达到200℃ (图5 (d) ) 时, 晶体生长达到饱和, 晶粒生长均匀, 形成分布均匀的纤维;继续升高温度到220℃ (图5 (e) ) , 温度过高, 在刚开始时成核和生长过程同时发生, 颗粒增大得不到控制而使形成过程复杂, 从而使形成的形貌部分不规则、纤维长短不一。因此, 实验反应温度控制在200℃左右为宜。

2.3 结构分析

图6是制备的AACH纤维及1300℃煅烧2h后的Al2O3的红外图。在图6 (a) 中, 宽峰3445.86cm-1对应的是少量吸附水和AACH纤维中O-H键吸收振动峰。区域3015.81~3173.14cm-1对应NH4+离子对称弯曲吸收振动峰, 1721.72cm-1、1389.46cm-1对应其拉伸吸收振动峰, 1540.17cm-1、1451.81cm-1对应CO32-非对称拉伸吸收振动峰, 1105.90cm-1、980.45cm-1、858.89cm-1对应表面活性剂PEG中C-O-C、-CH2-键吸收振动峰, 763.96cm-1对应Al-O键吸收振动峰。经过1300℃煅烧2h后, 可以观察到NH4+、CO32-, 吸附水中的O-H键, PEG中C-O-C、-CH2-键吸收振动峰都基本消失, 只剩下Al-O键吸收振动峰, 如图6 (b) 所示, 表明经过煅烧后, AACH和PEG发生分解生成易挥发组分, 并形成Al2O3纤维。

2.4 热重分析

在空气气氛下, AACH纤维以20℃·min-1速率从常温升温到1300℃的热重曲线如图7所示。图7 (a) 为AACH纤维的TG-DTG曲线图, 可以看出样品纤维在25~172℃主要是结合水的失去。172~657℃主要有2个失重阶段。第一个阶段是172~262℃, 主要是碳酸铝铵分解生成AlOOH、CO2、NH3和H2O, 并有PEG的分解。在这个过程中, 247℃处质量损失有最大值, 同时在该处有最大吸热峰值8.66mW·mg-1 (图7 (b) ) , 说明该处聚乙二醇开始分解, 伴随着AACH的分解释放出二氧化碳、氨气和水, 并且开始形成AlOOH粒子。根据理论公式:

可以算出碳酸铝铵理论失重53.87%, 实际失重99.35%-42.28%=57.07%, 可估算出参与模板导向作用的聚乙二醇的量约为57.07%-53.87%=3.2%。第二个失重阶段是262~657℃, 主要是AlOOH向氧化铝相转变阶段, 发生的反应如下:

在这个主要失重阶段发生的反应如下:

从式 (6) 可以看出, 碳酸铝铵含有氧化铝粉末36.71%/96.15%=38.2%, 易挥发组分61.8%。水热合成的样品中, 含碳酸铝铵纤维96.15%, 聚乙二醇3.2%, 吸附水0.65% (均为质量分数) 。

从DSC曲线上可以看出在167~302℃有1个吸热宽峰, 面积 (即焓变值) 为303J·g-1, 说明在该处分解需要吸收大量热量, 因此AACH可以用作阻燃材料。升温超过657℃后, TG曲线已逐渐变得平稳, 质量基本不变, 在877℃转变为γ相, 峰值为-4.09132mW·mg-1, 1172℃转变为α相, 峰值为-12.99515mW·mg-1, 说明在相转变过程中放出大量的热。

2.5 形貌分析

图8是AACH纤维和经过1300℃煅烧后Al2O3纤维的SEM图。

可以观察到纤维煅烧后 (图8 (b) ) 形貌基本无太大变化, 有少许团聚, 可能是由于烧结温度有点偏高。图8 (a) 为AACH纤维, 经计算其直径为80~100nm, 长径比在20~25之间。经过煅烧后形成的Al2O3纤维与AACH纤维相比, 在直径方向上有所收缩, 可能是由于AACH纤维和PEG分解失去易挥发组分CO2、NH3和H2O, 经计算其直径大约在80nm, 长径比分布在30~35之间。

3 结论

(1) 采用水热分解法, 在较大反应浓度下, 以表面活性剂PEG-6000作为模板导向剂, 硝酸铝作为铝源, 尿素作为沉淀剂, 水热制备出碳酸铝铵 (AACH) 纤维, 经过煅烧分解得到氧化铝纤维, 得出最佳实验条件为:水热反应温度200℃, 硝酸铝浓度0.5mol·L-1, 尿素浓度2.8mol·L-1, 水热反应时间为24h, 干燥时间为24h。利用红外、热重、SEM手段对产物进行表征, 结果表明制备的AACH纤维直径为80~100nm, 长径比在20~25之间, 经过煅烧后形成的Al2O3纤维直径大约在80nm, 长径比分布在30~35之间。

(2) 对反应温度影响AACH粒子的形貌可控性进行了讨论, 运用表面活性剂诱导机制、卷曲生长机制、方向附着机制和奥斯瓦尔德熟化机制系统探索研究了氧化铝纳米纤维的生长机理。

纤维分解 篇8

近年来, 随着分子生物学的迅速发展, 无需进行细菌纯培养的16S rDNA序列分析技术被率先引入瘤胃细菌多样性的研究[3,4,5], 而且已被应用于多种复杂微生态的研究, 解决了很多以前未解决的问题。在瘤胃微生态结构特征的研究上应用分子生物学技术扩大了瘤胃中可研究微生物的范围, 而且直接将微生物的遗传物质作为研究对象, 其研究结果也更为客观可信[6]。20世纪80年代中期发展起来的PCR技术以其高度的特异性、选择性、灵敏性、快速、简便、重复性好和易自动化等突出优点成为目前细菌分类鉴定的一种常用方法。试验以瘤胃细菌中的优势菌种——纤维分解菌为目的菌种, 旨在通过PCR技术建立一种定性研究瘤胃微生物的方法。

1 材料与方法

1.1 试验动物、日粮和样品收集

选用3只平均体重为20 kg的带有永久性瘤胃瘘管的健康山羊作为试验动物。山羊的日粮配制参照《中国肉羊饲养标准》, 精粗比为30∶70, 其中精料组成为20%麸皮、20%棉粕和60%玉米, 粗料为花生藤, 每天饲喂2次 (8∶00和18∶00) , 自由饮水, 专人管理。瘤胃液样品于每天9:00 (饲喂后1 h) 用瘘管收集, 用灭菌的4层纱布过滤, -20 ℃保存, 待测。

1.2 瘤胃细菌总DNA的提取

采用OMEGA公司的细菌DNA提取试剂盒按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 PCR引物的设计与合成

在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed 中查找黄色瘤胃球菌 (Ruminococcus flavefaciens) 和产琥珀酸丝状杆菌 (Fibrobacter succinogenes) 不同菌株的16S rDNA序列, 利用DNASIS v2.5软件进行同源性比较, 寻找种内保守区和种外特异区, 然后利用Primer Premier 5.0软件设计及筛选引物。

1.4 PCR扩增

2种纤维分解菌特异性引物设计如下:

(1) 产琥珀酸丝状杆菌引物长度为449 bp, 序列为上游引物5′-ATTTATCGGTATGGGATGAGC-3′ (Tm=56.2 ℃) , 下游引物5′-GCCCCTGAACTATCCAAGAGA-3′ (Tm=58.4 ℃) 。

(2) 黄色瘤胃球菌引物长度为500 bp, 序列为上游引物5′-GCTTCTGGAAACGGATGG-3′ (Tm=57.3 ℃) , 下游引物5′-CCGCTTACCTCTACTTCACTCA-3′ (Tm=60.7 ℃) 。

以上引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

采用25 μL PCR反应体系, 反应条件为94 ℃ 5 min;94 ℃ 40 s, 51 ℃ 40 s, 72 ℃ 30 s, 30个循环;72 ℃ 5 min。经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.5 PCR产物DNA序列的测定

由上海联众基因研究所对PCR产物进行测序, 用DNASIS v2.5分析测序结果, 并与GenBank中的已知序列进行同源性比较。

2 结果

2.1 瘤胃细菌总DNA的提取结果 (见图1)

1, 2. 瘤胃微生物总DNA;M.DL 2 000 Marker。

由图1可见:粗提得到的DNA条带很亮, 说明DNA的产量较高;DNA片段为3 kb左右;电泳点样胶孔中不含杂质, 无蛋白质污染。

2.2 特异性PCR扩增结果 (见图2)

M.DL 2 000 Marker;1. 黄色瘤胃球菌;2.产琥珀酸丝状杆菌。

由图2可见, 经1.0%琼脂糖凝胶电泳, Tanon GIS凝胶成像系统照像观察, 在600 bp和400 bp附近各有1条清晰的特异条带, 与预期片段大小相符, 可初步判定1, 2泳道的条带即为黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌的PCR产物。

2.3 PCR产物的测序及序列分析结果

对2份PCR产物进行测序, 得到良好的测序结果, 见图3, 4。

Ⅰ.黄色瘤胃球菌PCR产物全序列;Ⅱ. 原序列 (AF104841) 。

由图3可见:黄色瘤胃球菌的16S rDNA基因与原序列 (AF104841) 高度相似, 扩增序列16S rDNA在59～276 bp和283～500 bp片段的序列相似性达到100%;扩增出的全序列与原序列 (AF104841) 的同源性达到99.4%。

Ⅰ.产琥珀酸丝状杆菌;Ⅱ.原序列 (AJ505937) 。

由图4可见:产琥珀酸丝状杆菌扩增全序列16S rDNA在53～246 bp和256～437 bp片段中序列相似性达到100%;扩增出的全序列与原序列 (AJ505937) 的同源性达到94.6%。

3 讨论

瘤胃细菌种类繁多、功能各异, 其中包括很多分解纤维素和半纤维素的细菌, 对宿主动物的营养供给起了极其重要的作用。纤维分解菌作用于细胞表面, 并且形成一系列降解纤维所需的酶, 在这些纤维素酶的作用下, 纤维素一直被分解为葡萄糖。纤维分解菌中黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌比较活跃, 具有很强的降解纤维素的能力, 在瘤胃中普遍存在。瘤胃本身及其中的微生物异常复杂, 且瘤胃微生物生长需要复杂的营养因素和严格的厌氧环境, 因此往往缺少选择性培养基, 传统的微生物分离培养法受到了极大的限制[6]。由于细菌的16S rDNA的保守性及大小适中 (约1.5 kb) , 利用测序技术可以较容易地得到其序列, 分析其序列可以初步判定不同菌属、菌种间遗传关系的远近, 并对瘤胃微生物的多样性进行分析, 因此, 16S rDNA成为一个科学可靠的指标广泛应用于微生物的遗传特征和分子差异的研究。随着分子生物学的发展, PCR技术以其高度的特异性、选择性、灵敏性、快速、简便、重复性好和易自动化等突出优点在细菌分类鉴定中得到广泛应用。

免培养技术绕过微生物的纯培养, 从瘤胃环境中提取混合微生物DNA, 直接在DNA水平上对其进行研究。研究以提取的瘤胃细菌总DNA为模板进行特异性PCR扩增, 并结合16S rDNA的序列测定, 定性检测目的细菌。从试验结果来看, 16S rDNA特异性PCR扩增及序列分析技术是定性检测瘤胃纤维分解菌的一种有效方法, 同时试验结果也为下一步定量检测特定瘤胃细菌奠定了技术基础。

参考文献

[1]冯仰廉.反刍动物营养学[M].北京:科学出版社, 2004.

[2]黄庆生, 王加启.16S rRNA/rDNA序列分析技术在瘤胃细菌微生态系统研究中的应用[J].中国畜牧兽医, 2003, 30 (1) :7-11.

[3]TAJIMA K, AMINOV R I, NAGAMINE T, et al.Rumen bacterialdiversity as determined by sequence analysis of 16S rDNA libraries[J].FEMS Microbiology Ecolog, 1999, 29:159-169.

[4]TAJIMA K, ARAI S, OGATA K, et al.Rumen bacterial communitytransition during adaptation to highgrain diet[J].Anaerobe, 2000, 6:273-284.

[5]姚文, 朱伟云, 韩正康, 等.应用变性梯度凝胶电泳和16S rDNA序列分析对山羊瘤胃细菌多样性的研究[J].中国农业科学, 2004, 37 (9) :1374-1379.

纤维分解 篇9

在纤维素资源的综合利用上筛选到高效纤维素分解菌,是利用纤维素的关键,但由于我国北方冬季时间长、气温低,纤维素降解慢,多而且为期综合利用数纤维素降解菌的生长温度都比较高、降解能力低,不适宜在年平均气温较低的北方应用。

本项研究立足于黑龙江省的实际情况,从牛粪中分离筛选出高效纤维素分解性细菌,为我省丰富的纤维素资源的充分利用提供宝贵的菌株资源,而且为其综合利用提供了一条崭新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料

黑龙江省哈尔滨市道里区太平镇奶牛牛粪

1.2 培养基

1.2.1 肉汁胨培养基

牛肉膏:3g,蒸馏水:1000ml,蛋白胨:10g,Na Cl:5g,pH:7.2～7.4

1.2.2 初筛培养基(依姆歇涅茨基纤维素分解菌培养基)[5]

K2HPO4:1g,Fe C13·5H2O:0.1g,Mg SO4·7H2O:0.3g,Ca Cl2:0.1g,Na Cl:0.1g,Na NO3:2.5g,蒸馏水:l000ml,pH:7.2～7.4

将培养基分装试管内,然后加入滤纸条一张(普通滤纸剪成5×0.7cm或7×1cm纸条),纸条贴于试管内壁,一半浸入培养液中,一半暴露于空气中,121℃,灭菌20-30min[6]。

1.2.3 分离培养基[7]

CMC-Na:0.5%,营养盐:100ml,琼脂2%,pH:7.2营养盐:

(NH4)H2PO4:0.5g,MnSO4·H2O:2.5g,K2HPO4:2g,Fe SO4·7H2O:7.5mg,Mg SO4:2g,Na Cl:0.3g,自来水:1000ml

1.2.4 纤维素分解菌鉴别培养基(刚果红纤维素培养基)

K2HPO4:0.59,Mg SO4:0.25g,刚果红:0.24g,琼脂14.00g,纤维素粉l.88g,明胶2.00g,土壤浸汁:100ml,蒸馏水:900 ml,pH:7.0

配制前应对纤维素粉和琼脂进行预处理,纤维素应加lmol/L的HCL溶液浸泡12h,然后蒸馏水洗多次至pH值中性,烘干。

1.2.5 细菌液体发酵培养基

蛋白胨:0.3%,Mg SO4·7H2O:0.03%,酵母膏:0.05%,Ca C12·2H2O:0.03%

KH2PO4:0.4%,CMC-Na:0.5%,pH:7.2～7.3

1.3 试剂及缓冲液

1.3.1 3,5一二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)

甲液:溶解6.99结晶酚于15.2ml、10%氢氧化纳溶液中,并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9gNaH-SO3。

乙液:称取255g酒石酸钾钠加到300ml、10%氢氧化钠溶液中,再加入880ml、1%3,5-二硝基水杨酸溶液。

将甲、乙二液相混合即得黄色试剂,贮存于棕色瓶中室温放置7～10d后使用。

1.3.2 pH4.8醋酸-醋酸钠缓冲液

吸取20ml0.2mol/L的醋酸和30ml0.2mol/L的醋酸钠混匀。

1.3.3 羧甲基纤维素钠(CMC-Na)缓冲液

用羧甲基纤维素钠(CMC-Na)以pH4.4的醋酸缓冲液配成0.5%的溶液。

1.3.4 0.1%葡萄糖标准溶液

分析纯葡萄糖105℃干燥到恒重后,准确称取100mg,用少量蒸馏水溶解并定容至100ml,冰箱保存备用。

1.3.5 1.0mol/LHCl溶液、1.0mol/LNaOH溶液

1.4 方法

1.4.1 低温微生物的生长情况观察

用液体肉汁胨培养基培养菌株,在5℃的低温条件下培养7d观察。目测样品中菌株在低温条件下的生长情况。

1.4.2 菌种的分离与初筛[8]

将样品稀释成10-1～10-9的各级浓度的稀释液,将装有“初筛培养基”的试管编号,用无菌移液管吸取lml稀释液对号接种在有“初筛培养基”的试管中,培养至滤纸条上出现溃烂斑,选择滤纸溃烂程度高的试管,从溃烂处挑取菌落于“分离培养基平板”,多次划线分离,分离至得到纯化的单菌落,将得到的单菌落点种于刚果红纤维素鉴别培养基,培养48h,测量分解纤维素的透明圈直径大小,进行初筛。

1.4.3 菌种的复筛(测定发酵液的酶活性)

1.4.3. 1 粗酶液的制备

采用液体发酵培养基,在150r/min摇床上进行振荡培养,培养48h后,将发酵液直接于3000r/min,4℃离心15min,取上清液。

1.4.3. 2 纤维素酶活性(CMCase)的测定[9]

酶活测定:移取含有0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)的醋酸缓冲液(0.05mol/L,pH4.4)1.5ml于试管中,加入酶液0.5ml,50℃,反应30min,加入DNS终止反应,沸水浴5min,冷却后加水稀释到25ml,在520nm处测还原糖。从还原糖的数量来求得酶活力的大小。

酶活性单位定义:pH4.4、50℃条件下每毫升纤维素粗酶液能水解羧甲基纤维素钠(CMC-Na),产生1ug的葡萄糖,称为一个纤维素酶活单位,单位:U/ml。

1.4.3. 3 还原糖的测定(比色法定糖)方法[10]

本研究中采用3,5-二硝基水杨酸比色法,又称DNS法。

原理:3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原糖的醛基还原成棕色的氨基化合物,即3-氨基-5-硝基水杨酸,在一定范围内,还原糖的量和反应液的颜色深度成比例关系,利用该方法可测定还原糖浓度。该方法操作简单、快速,较少受其它杂质干扰而重现性好,所以被用来测定纤维素酶水解产生的还原糖的浓度。

1.4.3. 4 葡萄糖标准曲线的绘制

取9支比色管,在其中加入不同浓度的葡萄糖标准溶液等试剂,将各管溶液混匀后,在721分光光度计上(52Onm)进行比色测定,用空白管溶液调零后,测定各管光密度值。以葡萄糖浓度为横坐标,光密度值为纵坐标,得标准曲线。(见图1)

根据菌株的生物量和产酶活性对菌株进行筛选,从而筛选出高效的纤维素分解菌株。

1.4.4 高效纤维素降解菌产酶特性研究[11]

1.4.4. 1 培养时间对菌株产酶的影响

将菌种接种于种子培养基中,摇床培养(温度5℃,摇床转速150r/min),每隔24h取样测生物量以及测酶活,通过酶活随接种量的变化绘制产酶曲线。取产酶最高的培养时间作为最适培养时间。

1.4.4. 2 培养基起始pH值对菌株产酶的影响

用1mol/L的HCl或lmol/LNa OH调节培养基的pH值,使p H值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,将菌种接种于不同p H值的种子培养基中,三角瓶摇床培养(温度5℃,摇床转速150r/min),48h后取样测生物量以及测酶活,通过酶活随接种量的变化绘制产酶曲线。取产酶最高的起始pH值作为最适起始pH值。

1.4.4. 3 不同氮源对菌株产酶的影响

将菌种接种于改变了氮源的产酶培养基中,分别以1.5g/L的牛肉膏、蛋白胨、酵母膏;0.5g/L的硫酸铵、氯化铵、硝酸铵为不同氮源进行发酵试验,三角瓶摇床培养(温度5℃,摇床转速150r/min),48h后取样测生物量以及测酶活,通过酶活随pH值的变化绘制产酶曲线。取产酶最高的氮源作为培养基最适氮源。

1.4.4. 4 接种量对菌株产酶的影响

向产酶培养基中分别加入2%、3%、4%、5%、6%、7%的种子培养液,三角瓶摇床培养(温度5℃,摇床转速n=150r/min),48小时后取样测生物量以及测酶活,通过酶活随接种量的变化绘制产酶曲线。取产酶最的接种量作为最适接种量。

2 结果与讨论

2.1 结果

2.1.1 菌株的分离与初筛

采集的样品经分离纯化共得到50株细菌菌株。在初筛平板上培养48h后,经含有刚果红的纤维素鉴别培养基培养,其中有4株菌株的透明圈比较明显,它们在刚果红鉴别平板上的透明圈直径(见表1)。纤维素分解细菌分泌纤维素酶而将平板培养基中的纤维素降解成小分子的低聚糖及纤维二糖、葡萄糖等,水解后的糖列同刚果红染粒可以形成红色沉淀。因此在纤维素刚果红培养基上,纤维素分解菌周围均能形成红色的水解圈,且水解圈的大小同酶活的高低有一定的数量关系。因此,刚果红纤维素平板透明圈筛选法可用于识别产纤维素酶的菌株,可用于初步判定酶活性高低。产酶越多,透明圈越大,产酶越快,透明圈出现越早。然而,虽然透明圈大小直接反映了酶浓度高低,但不能完全代表菌株产酶能力,因为酶液样品的酶浓度与透明圈的直径呈线性关系,可以对酶活进行初步定量。但是仅以水解圈大小作为菌株产纤维素酶活力大小的唯一定量指标是不太可靠的,其原因是对方面的,如固体和液体培养基条件不同;不同菌株具有不同的生长和产酶速度以及不同的纤维素酶系;菌苔大小及在平板上堆积情况的差异等都会造成透明圈大小与液体发酵酶活的不完全一致,所以液体发酵复筛必不可少。

2.1.2 菌株的复筛

将初筛得到的4株细菌菌株接入复筛细菌液体发酵培养基中进行摇甁培养,采用3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS法)分别测定J-019、J-039、J-048和J-050菌株产纤维素酶的酶活,酶活分别为523U、422U、466U和407U。根据以上实验结果优选出1株活力最高的菌株J-019,并对其产酶条件进行研究。

2.1.3 培养时间对菌株产酶的影响

按1.2.4.1方法,获得J-019随培养时间变化的产酶曲线图(如图2)。

由图2可以看出,在24h的时候,酶活已经较高,到48h的时候酶活最大,达到551U,之后酶活下降很快,72h后,到酶活基本稳定,可以看出当培养48h时菌株正值产酶高峰,并不是随培养时间的增加产酶也随之增加,原因是菌体快速繁殖,到达对数生长后期,由于营养物质消耗殆尽及溶解氧浓度低下,细菌活力降低,从而使产酶量降低,所以培养48h为菌株J-019菌株的最适产酶温度。

2.1.4 培养基起始pH值对菌株产酶的影响

按1.2.4.2方法,获得J-019随培养基起始pH值变化的产酶曲线图(如图3)。

由图3可以看出,培养基起始pH值对菌株产酶有很大影响,当起始pH值在4～7之间时,随pH值升高,菌株酶活出现上升高趋势,在pH值为7时,菌株酶活最高,酶活为557U,菌株酶活仅次于pH值为7时的酶活,当起始p H值大于7时菌株酶活下降,起始pH值为大于8以后菌株酶活下降比较明显,起始pH值在6～8之间时菌株酶活比较稳定,且pH值等于7为菌株J-019菌株产酶的最适起始pH值。

2.1.5 不同氮源对菌株产酶的影响

按1.2.4.3方法,获得J-019随培养基不同氮源变化的产酶曲线图(如图4)。

由图4可以看出,培养基氮源对菌株产酶有很大影响,分别以蛋白胨、牛肉膏和酵母膏为氮源时,菌株酶活比较高,可以看出有机氮源促进产酶的效果明显好于无机氮源,因为有机氮源相比于硫酸铵等无机氮源更容易被J-019菌株所利用来促进其产酶。其中以蛋白胨为氮源时,菌株酶活最高,酶活为547U,所以蛋白胨为J-019菌株产酶的最适培养基氮源。

2.1.6 接种量对菌株产酶的影响

按1.2.4.4方法,获得J-019随接种量变化的产酶曲线图(如图5)。

由图5可以看出,接种量对菌株产酶有很大影响,接种量从2%～4%时,酶活急剧增加,在接种量为4%时酶活达到最大值,酶活为539U,接种量在4%以后酶活有所下降,接种量在5%～7%之间,酶活基本稳定,这说明接种量为4%时有利于菌株产酶,而过高或过低的接种量效果都不好,原因是接种量过低,菌体繁殖慢,产酶量低,接种量过高,由于菌体的快速繁殖,会导致营养物的竞争及溶解氧浓度低下,细菌活力降低,从而使产酶量降低,所以4%的接种量时为J-019菌株产酶的最适接种量。

2.2 讨论

能够降解纤维素的微生物有很多,如:真菌、细菌和放线菌都参与纤维素的分解过程。但由于细菌繁殖速度快,发酵周期短,有利于工业生产。在制浆、造纸和洗涤工业等污染行业的废水治理上有着潜在的应用前景,近年来关于细菌产纤维素酶的研究日益引起人们的重视,尤其我省的纤维素资源丰富,纤维素资源的综合利用前景广阔,但现有的纤维素分解性细菌的生长及产酶温度一般都比较高,并不适合在年平均气温较低的我省应用。本研究结合我省的实际情况,在低温条件下从牛粪中分离能降解纤维素的细菌菌株,通过初筛、复筛最终筛选出1株酶活比较高的菌株J-019,并对其产酶条件进行了初步研究,找出了菌株产酶的最适培养时间、培养基起始pH值、培养基氮源和接种量,分别为:最适培养时间为48h,最适培养基起始p H值为pH=7,最适培养基氮源为蛋白胨,最适接种量为4%。该菌株比较适合我省年平均气温较低的实际情况,并且具有较高的纤维素酶活性,具有比较好的应用前景,在今后的研究中将进一步对该菌株的产酶条件进行摸索,并可以通过诱导等方法进一步提高酶活力。

参考文献

[1]张加春,易琴,黄遵锡.纤维素酶曲的潜盘生产研究[J].云南师范大学学报:自然科学版,2002(2):50～52.

[2]费尚芬,鹿宁,刘坤,等.白腐菌纤维素酶高酶活菌株的筛选[J].安徽农业科学,2006,34(1):22～23.

[3]胡代泽.我国农作物秸秆资源利用现状与前景[J].资源开发与市场,2000,16(1):19～20.

[4]CHERRY J R,FIDANIW A L.Dierctede evolution of indusaial enzymes:an update[J].Curr Opin Biotechnol,2003,14:438～443.

[5]谢正场,吴恺芳.现代微生物培养基和试剂手册[M].福州:福建科学技术出版社,1994.

[6l张秀红,张彩琴,张韵茹.高活性纤维素分解细菌的筛选及其产酶条件的研究[J].山蒯氓范大学学报,2002,16(3):56～60.

[7]李日强,辛小云,刘继青.天然秸杆纤维素分解菌的分离选育[J].上海环境科学,2002,21(1):8～11.

[8]楚杰,李树品等.纤维素酶高活性菌株的选育及酶最适作用条件的研究[J].山东科学,1998,11(2):51～54.

[9]张瑞萍.纤维素酶的滤纸酶活和CMC酶活的测定[J].印染助剂,2002,19(5):51～53.

[10]李亮亮,牛森.纤维素酶活测定方法的比较研究[J].辽宁农业科学,2001(4):16～18.