纤维素磁性微球研究

纤维素磁性微球研究（通用7篇）

纤维素磁性微球研究 篇1

磁性琼脂糖微球是一种用于蛋白质层析分离和细胞/酶固定化的载体, 具有易分离回收、操作简便和成本较低等优点。磁性琼脂糖微球的活化度越高, 能嫁接的亲和配基越多, 悬浮吸附分离纯化蛋白质的效率就越高, 更有利于扩大蛋白质生产规模[2], 因此提高磁性琼脂糖微球的活化度已经成为了研究的热点。目前, 常用于载体活化的活化剂主要有环氧氯丙烷、1, 4-二羟基正丁烷、双缩水甘油醚、羰基二亚胺、二乙烯基亚砜等[1], 其作用在于向载体表面引入高密度、稳定的活化基团, 如氨基、环氧基、羟基、氯甲基、酰肼基等[2]。其中, 环氧基是一种常用的活性基团, 与其他基团相比, 环氧基修饰的载体在直接固定化酶时不需要预活化, 反应条件温和 (温度25℃, p H≥7.0) , 酶的活性在固定化过程中不易被破坏, 适合固定化酶的工业化生产。此外, 环氧基可与酶分子中的多种活性基团, 如氨基、巯基及酚羟基、咪唑基等反应, 在适合的条件下, 酶与载体可发生多点键合, 使得制备的固定化酶稳定性好, 不易从载体上脱落。在磁性载体材料上引入环氧基不仅发挥环氧基固定化酶的优点, 还易于回收使用, 同时可应用磁性流动床技术使用固定化酶, 具有更广泛的应用前景, 因此在磁性载体表面引入环氧基具有重要的意义。在固定化载体表面引入环氧基的方法主要有溴化氰活化法、对甲苯磺酸氯活化法、环氧氯丙烷活化法。溴化氰活化法操作步骤简单, 重现性好, 偶联条件温和, 适用于偶联敏感性生物大分子。但是溴化氰活化法形成的异脲键易产生特异性吸附, 且偶联时共价键不稳定, 偶联配基容易脱落, 此外, 溴化氰活化法操作危险性大, 反应后的残余液需经处理才可排放。对甲苯磺酸氯活化法配基偶联过程中不产生新的电荷, 主要用于活化含羟基基质, 但活化反应需在无水丙酮中进行。缩水甘油醚活化法化学性质更稳定, 配基很少脱落, 分离效果好, 对琼脂糖凝胶有交联作用, 凝胶的刚性好, 但是活化的凝胶其偶联配基密度只有溴化氰活化的75%。环氧氯丙烷活化法是目前应用最广泛的活化方法, 环氧氯丙烷试剂易得、偶联配基比较牢固, 且价格低廉, 操作简单易行, 危险性较小。

首先采用反相悬浮包埋法制备磁性琼脂糖微球, 再利用环氧氯丙烷对其进行活化。以微球表面环氧基密度为指标, 考察活化时间、Na OH浓度、环氧氯丙烷体积分数和活化温度对琼脂糖磁性微球活化程度的影响, 确定最优活化条件, 为进一步在微球上结合各种不同官能团或直接吸附生物分子提供了可能, 为琼脂糖磁性微球在生化分离中的应用提供了实验载体和理论基础。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器

试剂:琼脂糖, 分析纯, 阿拉丁试剂有限公司;Span80, 分析纯, 成都市科龙化工试剂厂;液体石蜡, 分析纯, 成都市科龙化工试剂厂;石油醚分析纯, 广东光华化学厂有限公司;异丙醇, 分析纯, 成都市科龙化工试剂厂;Na OH, 分析纯, 成都市科龙化工试剂厂;Na BH4, 分析纯, 国药集团化学试剂有限公司;环氧氯丙烷, 分析纯, 广东汕头市西陇化工厂;硫代硫酸钠, 分析纯, 成都市科龙化工试剂厂;硫酸钠, 分析纯, 成都市科龙化工试剂厂;酚酞, 分析纯, 天津基准化学试剂有限公司。

仪器:DV214C电子天平、HH-S2恒温水浴锅、ZHWY-2102恒温振荡器、S212数显电子恒速搅拌器。

1.2 实验方法

1.2.1 磁性琼脂糖微球的制备

采用反相悬浮包埋法制备磁性琼脂糖微球[3], 具体制备过程如下:称取0.125 g琼脂糖溶于4 m L去离子水, 加热煮沸使其完全溶解, 然后加入1 m L自制的Fe3O4磁流体[2], 混合均匀, 作为水相;称取1.0 g Span80加入到25 m L的液体石蜡中, 恒温 (80℃) 振荡均匀后作为油相;将水相缓慢加入油相中, 持续搅拌 (850 rpm) 10 min后冷却至室温后, 再持续搅拌 (250 rpm) 5 min使微球成形;制得的微球用10 m L石油醚和1m L异丙醇洗涤, 再分别用石油醚和去离子水清洗2次, 即得到磁性琼脂糖微球。

1.2.2 磁性琼脂糖微球的活化实验

称取0.5 g磁性琼脂糖微球放入磨口锥形瓶内, 依次加入一定量的Na OH溶液、一定量的Na BH4和一定体积分数 (环氧氯丙烷体积与反应混合物总体积的百分比) 的环氧氯丙烷, 并置于恒温振荡器中, 设定温度开始振荡活化。活化一定时间后, 用去离子水充分洗至中性, 清洗液中加入硫代硫酸钠和酚酞无显色, 即得到活化的磁性琼脂糖微球。

1.2.3 磁性琼脂糖微球表面环氧基密度的测定

以微球表面环氧基团的密度作为评价琼脂糖磁性微球活化程度的指标。采用硫代硫酸钠滴定法测定微球表面环氧基密度[4], 计算公式为:

其中, S为环氧基修饰密度 (μmol/g) , CHCl为HCl浓度 (mol/L) , V0和V1分别为滴定前和滴定后HCl的体积 (m L) , m为活化微球质量 (mg) 。

2 结果与讨论

2.1 活化时间对环氧基密度的影响

在Na OH溶液浓度为0.9 mol/L, Na BH4浓度为0.5 g/L, 环氧氯丙烷体积分数为20%, 活化温度为40℃时, 研究活化时间 (2 h、4 h、6 h、8 h、10 h) 对环氧基密度的影响。实验结果如图1所示。

由图1可知, 随着活化时间的增加, 微球表面环氧基密度增加, 在4 h时环氧基密度达到最大, 其值为111.5μmol/L。当活化时间大于4 h时, 环氧自由基密度逐渐减小。可能的原因当反应时间过长时, 活化反应经已基本完成, 但微球表面的环氧基和环氧氯丙烷在碱性条件下的水解反应仍在继续, 部分已经修饰于微球表面的环氧基由于发生水解而开环失活。因此, 最佳的活化时间为4 h。

2.2 Na OH浓度对环氧基密度的影响

在Na BH4浓度为0.5 g/L, 环氧氯丙烷体积分数为20%, 活化温度为40℃, 活化时间为4 h时, 研究Na OH浓度 (0.3mol/L、0.6mol/L、0.9mol/L、1.2mol/L、1.5mol/L) 对环氧基密度的影响。实验结果如图2所示。

从图2可以看出, 随Na OH浓度的增大, 微球表面环氧基密度先呈线性增大, 而后线性减小, 在Na OH溶液浓度为0.9 mol/L时达到最大。琼脂糖磁性微球表面含有大量羟基, 羟基接触Na OH后被激活, 为下一步环氧氯丙烷的亲核取代反应提供游离基负离子[5]。Na OH作为环氧氯丙烷与琼脂糖上羟基反应的催化剂, 当其浓度过低时, 活化反应不完全。而且一定浓度的碱液可以保证溶液中的碳负离子的稳定性。但另一方面, 环氧基易水解, 而OH-也是环氧基开环水解的催化剂[6]。因此碱液浓度过高时, 增大了环氧基自身的开环和水解副反应, 导致活化度反而降低。因此, 活化反应中Na OH的最佳浓度为0.9mol/L。

2.3 环氧氯丙烷体积分数对环氧基密度的影响

在Na OH溶液浓度为0.9 mol/L, Na BH4浓度为0.5 g/L, 活化温度为40℃, 活化时间为4 h时, 研究环氧氯丙烷体积分数 (10%、20%、30%、40%、50%) 对环氧基密度的影响。实验结果如图3所示。

从图3可以看出, 随环氧氯丙烷体积分数的增大, 微球表面环氧基密度先明显增加, 后趋于稳定, 在环氧氯丙烷体积分数为40%时达到最大值。说明40%体积分数的环氧氯丙烷与琼脂糖磁性微球上的羟基反应已经饱和。在环氧氯丙烷体积分数为50%时, 微球表面环氧基密度稍有下降。这可能是由于环氧氯丙烷在水中的溶解度有限 (约为6.58%) [1], 环氧氯丙烷体积分数过高, 其强疏水性反而不利于Na OH扩散, 从而导致在高环氧氯丙烷体积分数时, 环氧基修饰密度反而降低[7]。

2.4 Na BH4浓度对环氧基密度的影响

在Na OH溶液浓度为0.9 mol/L, 环氧氯丙烷体积分数为20%, 活化温度为40℃, 活化时间为4 h时, 研究Na BH4浓度 (0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L) 对环氧基密度的影响。实验结果如图4所示。

由图4可知, Na BH4的浓度不断增大, Na BH4浓度在0.5g/L时, 环氧基密度达到最大值;继续增加Na BH4的浓度, 环氧基密度有下降的趋势。是因为在琼脂糖的活化反应中, Na BH4作为封闭剂去掩蔽琼脂糖磁性微球表面的剩余活性基团和电荷, 防止或降低琼脂糖磁性微球偶联配基后剩余的活性基团相互之间的结合或电荷离子交换引起不可逆性吸附, 也避免了琼脂糖微球亲和吸附蛋白质时与杂离子进行交换。但活化时Na BH4过量, 会引起环氧化合物的开环反应, 降低微球的表面环氧基密度[5,8,9,10]。因此, 最佳Na BH4浓度是0.5g/L。

2.5 活化温度对环氧基密度的影响

在Na OH溶液浓度为0.9 mol/L, Na BH4浓度为0.5 g/L, 环氧氯丙烷体积分数为20%, 活化时间为4 h时, 研究活化温度 (30℃、35℃、40℃、45℃、50℃) 对环氧基密度的影响。实验结果如图5所示。

如图5所示, 琼脂糖磁性微球表面环氧基密度随活化温度的升高先增大后减小, 40℃下反应得到的表面环氧基密度最大。活化温度升高, 有利于反应的快速进行, 但同时微球表面的环氧基的水解副反应、与琼脂糖微球表面其它羟基的交联反应速率也会加快, 这三个反应受温度的影响程度不同。当活化温度小于40℃时, 升高活化温度, 活化反应增加的速率大于环氧基水解和交联副反应的速率;当活化温度大于40℃时, 继续升高温度会导致环氧基的水解和交联副反应迅速增加, 水解和交联副反应占有更强的优势, 因而环氧基密度反而逐渐下降[11]。因此, 最佳活化温度为40℃。

3 结论

采用环氧氯丙烷对琼脂糖磁性微球进行了活化, 考察了活化时间、Na OH浓度、环氧氯丙烷体积分数、Na BH4的量和反应温度对活化的影响, 并得出了最优的活化条件。实验结果表明, 环氧氯丙烷活化琼脂糖磁性微球的最有条件为活化时间为4 h, Na OH浓度为0.9 mol/L, 环氧氯丙烷体积分数为40%, Na BH4浓度为0.5 g/L, 反应温度为40℃。

参考文献

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磁性复合微球固定化脂肪酶的研究 篇2

但游离脂肪酶价格较高, 且后续分离步骤困难, 影响了脂肪酶的商业化。固定化脂肪酶, 不仅能保持酶的高效性和专一性, 而且能大大地提高酶的操作稳定性, 同时, 易于分离, 有利于酶的重复使用及产品的纯化[6]。磁性高分子微球作为酶的固定化载体可借助外部磁场方便地将酶回收。近年来, 磁性高分子载体固定脲酶、糖化酶等的研究已有报道[7,8]。

壳聚糖是一种N-脱乙酰基葡萄糖聚合物, 其分子表面含有丰富的氨基和羟基, 生物相容性好, 无毒无副作用。目前已被用于多种酶的固定, 如葡萄糖氧化酶、胃蛋白酶、β-甘露聚糖酶、L-天门冬酰胺酶等[9,10,11]。

本研究以壳聚糖和二氧化硅共同包裹Fe3O4纳米粒子制得磁性高分子微球为载体, 采用戊二醛为交联剂固定脂肪酶, 探讨了固定化的工艺条件, 并对固定化酶的性质进行研究。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料及仪器

脂肪酶:和氏璧生物技术有限公司;壳聚糖:国药集团化学试剂有限公司;正硅酸乙酯:天津市凯信化学工业有限公司;无水乙醇;天津市富宇精细化工有限公司;氨水 (25wt%) :烟台双双化工有限公司;γ―氨丙基三乙氧基硅烷:工业纯, 南京联硅化工有限公司;聚乙烯醇:北京百利化学品开发中心;橄榄油和戊二醛 (25wt%) :上海中秦化学试剂有限公司。

1.2 仪器设备

恒温水浴振荡器:常州国华仪器有限公司;DZF-6021型真空干燥箱:上海中友仪器设备有限公司;紫外分光光度计:贵州赛兰博科技有限公司。

2 实验方法

2.1 磁性复合微球的制备

称取FeCl3·6H2O 1.1674g和FeCl2·4H2O 0.5724g加入三口烧瓶中, 加入43.0ml去离子水, 使得n (Fe3+) =0.1mol/L, 氮气保护下机械搅拌, 加热到60℃, 加入氨水 (25wt%) 6.5ml, 恒温10min, 升温到80℃, 继续恒温60min, 搅拌速度大约为300r/min, 反应完成后, 用永磁体分离得到黑色固体, 用倾注法向容器中加入一定量的去离子水和无水乙醇, 反复洗涤, 制得磁性流体。

将上述制得的Fe3O4粒子, 加入200ml无水乙醇, 50ml的去离子水, 为保证Fe3O4粒子完全分散, 60W超声15min, 然后加入3ml氨水 (25wt%) , 滴加1.5ml正硅酸乙酯, 同时300r/min速度搅拌, 室温下反应6h以上, 反应结束后, 永磁铁分离得到黑色固体, 用倾注法加去离子水和无水乙醇反复洗涤, 真空干燥得到Fe3O4/SiO2粒子。

称取0.08g Fe3O4/SiO2粒子, 分散于40ml壳聚糖乙酸溶液中, 80W超声30min, 用NaOH调节pH=6.0, 滴加20ml 1.5 mg/ml的三聚磷酸钠溶液, 搅拌反应1h, 用永磁体分离得到黑色固体, 然后先用无水乙醇洗, 再用去离子水洗, 真空干燥得到壳聚糖包裹的Fe3O4/SiO2粒子。

2.2 壳聚糖包裹的Fe3O4/SiO2磁性复合微球的氨基化

取2.5g磁性复合微球于250ml圆底烧瓶中, 加入100ml的甲苯, 超声20min, 加入10ml γ-氨丙基三乙基硅烷, 然后120℃油浴连续搅拌回流4h, 反应结束后, 用磁铁分离, 用甲苯和丙酮各洗三次, 除去未反应的γ-氨丙基三乙基硅烷, 再经60℃真空干燥, 得到氨基修饰的磁性复合纳米粒子。

2.3 以戊二醛为交联剂制备固定化酶

取1g氨基修饰后的磁性复合粒子, 置于50ml一定浓度的戊二醛溶液中, 超声处理15min, 慢慢振荡20h, 反应结束后, 用永磁铁分离, 用去离子水洗涤, 真空干燥, 即为戊二醛活化的磁性复合粒子。

用pH6～8的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液配制一定浓度的脂肪酶液10ml, 取戊二醛活化后的磁性微球载体0.05g, 于25℃、转速150r/min下, 在水浴恒温振荡器中振荡反应不同时间, 然后, 将固定化脂肪酶用永磁铁分离, 用磷酸缓冲溶液洗涤多次, 并将其置于真空干燥箱中室温下过夜干燥。

2.4 酶活的测定方法

脂肪酶的活力定义:1g固体酶粉, 于40℃, pH7.5的条件下, 水解脂肪每分钟产生1μmol的脂肪酸, 即为一个脂肪酶国际单位, 以U/g表示。

采用橄榄油乳化法测定脂肪酶的活性:取两个100ml三角瓶, 分别于标记上空白瓶 (A) 和样品瓶 (B) 中, 各加聚乙烯醇橄榄油乳化液4.00ml和磷酸缓冲液5.00ml, 再于A瓶中加入95%乙醇15ml, 于40℃水浴预热10min, 然后, 在两瓶中各加待预测酶液1.00ml, 立即混匀计时30min, 在B瓶中立即补加95%乙醇15.00ml终止反应, 取出;于空白和样品溶液中各加酚酞指示液3滴, 用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定, 直至微红色并保持30s不褪色为终点, 记录消耗的氢氧化钠标准溶液的体积。

相对酶活性的计算公式如下:

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式中, R为相对酶活性;A为每次测得的脂肪酶活性 (U/g) ;A0为测得的脂肪酶最大活性 (U/g) 。

3 结果与讨论

3.1 固定化条件对酶活的影响

3.1.1 戊二醛浓度对固定化酶活的影响

取5份1g氨基修饰后的磁性复合粒子, 分别置于50ml质量分数为2%、4%、6%、8%、10%、12%的戊二醛溶液中, 超声处理15min, 慢慢振荡20h, 反应结束后, 用永磁铁分离, 用去离子水洗涤, 真空干燥, 制备戊二醛活化的磁性复合粒子。

从图1可看出, 当戊二醛浓度低于8%时, 固定化酶的相对酶活随戊二醛浓度增加而增大;当戊二醛浓度继续升高, 固定化酶的相对酶活则有所下降。这是因为戊二醛浓度较低时, 载体表面活性基团较少, 载体机械强度差, 酶在粒子表面易脱落。当戊二醛浓度过高时, 除过量戊二醛自身发生羟醛缩合, 过多的活性醛基导致酶分子与载体之间形成多点结合, 这样会产生空间结构障碍外;还可能会对酶活性中心产生束缚, 造成酶活力下降。故戊二醛最适浓度为8%。

3.1.2 固定化时间对固定化酶活的影响

称取5份0.05g戊二醛活化的磁性复合微球分别浸于10ml浓度为5mg/ml的脂肪酶液 (pH7.5) 中, 振荡反应2、4、6、8、10、12、14、16、18h, 洗涤干燥得到固定化脂肪酶。

由图2可见, 随着固定化时间的延长, 固定化酶的相对酶活性呈现先增加后降低的趋势。这是由于固定化时间过短, 脂肪酶不能很好的结合在载体上, 在用磷酸缓冲液冲洗的时候容易脱落, 因而固定化酶活性较低;当固定化的时间过长, 会使固定化酶活性降低, 因此最佳固定化时间为10h。

3.1.3 固定化pH对固定化酶活的影响

称取5份0.05g戊二醛活化的磁性复合微球分别浸于10ml浓度为5mg/ml的脂肪酶液中, 酶液的pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0, 振荡反应10h, 洗涤干燥得到固定化脂肪酶。

从图3可看出, 固定化酶的相对酶活性随 pH 升高呈现先上升而后下降的趋势, 当 pH=7.5时, 固定化酶相对酶活性最高;因此, 选取pH=7.5为最适固定化pH。

3.2 固定化酶性质分析

3.2.1 酶的最适pH值的确定

在40℃, pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸缓冲溶液中测定游离脂肪酶和固定化脂肪酶的相对酶活力。

从图4可以看出, 与游离酶的最适pH7.5相比, 固定化酶的最适pH7.0向酸性偏移了。酶经过固定化后, 其最适反应pH值常常会发生偏移。其变化与酶和载体的带电性质有关。这是因为在酶的周围存在一个极薄的扩散层, 带电的载体使固定化酶周围微环境的带电状态不同于微环境以外的溶液。带负电荷的载体会使反应溶液中H+局部的集中于扩散层, 使固定化酶微环境的pH低于外侧溶液的pH。为了抵消这种影响, 需提高溶液的pH, 才能使固定化酶表现出最大活力。所以, 带负电的载体通常使酶的最适pH向碱性偏移;反之, 带正电的载体则使酶的最适pH向酸性偏移;中性载体不改变酶的最适pH[12]。壳聚糖是聚阳离子型载体, 故固定化酶的最适pH值向酸性偏移。

3.2.2 酶的最适反应温度的确定

将游离酶和固定化酶分别置于20、30、40、50、60℃不等的温度, pH7.5的条件下, 测定其酶活力。

由图5可以看出, 固定化酶的最适反应温度为50℃, 游离酶的最适反应温度为40℃, 固定化酶的最适反应温度比游离酶高了10℃。这是因为酶经过固定化后, 具有更加稳定的空间立体结构, 热稳定性提高, 故最适温度也随之提高[13]。

3.3 重复使用稳定性的测定

将固定化酶重复用于聚乙烯醇橄榄油乳化液的水解反应, 观察其相对酶活力随重复使用次数的变化。

如图6所示, 固定化酶的相对酶活力随重复使用次数的增加而下降。这一部分是由于酶与载体表面的活性基团结合的不牢固, 使得部分酶分子从载体上脱落下来, 另外, 可能由于外界环境的作用, 使酶的构象发生了不可逆变化从而引起酶活的损失。但固定化酶经过重复使用7次后, 其相对活力仍然可以保持在50%左右, 表明固定化酶具有很高的重复使用稳定性。

4 结论

以壳聚糖包裹Fe3O4/SiO2制得的磁性复合微球为载体, 采用戊二醛交联法固定化脂肪酶, 固定化的最佳条件为戊二醛浓度为8%、pH7.5、时间10h。同游离脂肪酶相比, 固定化脂肪酶最适pH向酸性方向偏移, 最适温度提高了10℃, 表明壳聚糖包裹Fe3O4/SiO2制得的磁性复合微球是固定化脂肪酶的良好载体。

摘要：用壳聚糖和二氧化硅共同包裹Fe3O4纳米粒子制得磁性高分子微球, 并以此为载体, 以戊二醛为交联剂固定化脂肪酶, 探讨了固定化过程中戊二醛浓度、固定化时间、固定化pH对固定化酶活力的影响。结果表明, 固定化脂肪酶的最佳条件:时间为10h, pH为7.5, 戊二醛的浓度为8%。同时还对固定化酶与游离酶的最适温度和最适pH作了测定, 固定化酶的最适温度为50℃, 比游离酶的最适温度为40℃, 提高了10℃;固定化酶的最适pH为7.0, 与游离酶的最适pH7.5相比, 向酸性偏移了0.5。

纤维素磁性微球研究 篇3

一定的溶解性, 由于壳聚糖的高亲水性, 使之与被吸附的基体分离困难。将壳聚糖包覆在磁性材料上, 可以解决吸附过程完成后分离困难的问题, 并可以降低壳聚糖的使用量, 获得很大的吸附比表面[5]。本文用环氧氯丙烷作为交联剂将壳聚糖包覆在由二价和三价的铁离子共沉淀制得的Fe3O4磁子表面, 报道了磁性壳聚糖的热稳定性、结构、形貌及壳聚糖微球的吸附性能。结果显示, 壳聚糖磁性微球对蛋白质的吸附量比较稳定, 且吸附量比较大。这个实验结果向预期目标又前进了一步。

1.实验部分

1.1 主要仪器及试剂

Tecnai12型透射电镜 (荷兰philips公司) ;同步热分析仪 (德国NETZSCH公司) ;TENSOR27型红外光谱仪 (德国BRUKER公司) ;TGL-16C离心机 (上海安亭科学仪器厂) 。752型紫外可见分光光度计 (上海精密科学仪器有限公司。X-射线粉末衍射仪 (日本Mac Science公司) 。

壳聚糖 (CP, 玉环县海洋生物化学有限公司) ;环氧氯丙烷 (CP, 中国上海试剂一厂) ;硫酸亚铁 (FeSO4·7H2O) (CP, 中国医药集团上海化学试剂公司) ;氯化铁 (FeCl3·6H2O) (CP, 中国上海金山化工厂) ;氢氧化钠 (CP, 中国医药集团上海化学试剂公司) ;乙醇 (CP, 中国上海振兴化工厂一厂) ;牛白蛋白 (BR, 国药集团化学试剂有限公司) ;磷酸氢二钠 (AR, 中国医药集团上海化学试剂公司) ;柠檬酸 (AR, 上海化学试剂采购供应站) ;水为去离子水。

1.2 样品制备

1.2.1 磁性壳聚糖的制备

在单口烧瓶中加入Fe3+和Fe2+溶液, 其中n (Fe2+) ∶n (Fe3+) 为1 ∶2, 通入N2 , 水浴加热, 保持反应体系的温度为60℃左右, 搅拌数分钟后滴加1 mol/L的NaOH溶液, 随着体系pH升高, 出现黑色沉淀, 继续加入一定量NaOH, 反应30 min后升高反应温度至90℃, 搅拌熟化2 h, 制得Fe3O4磁粒子。后加入壳聚糖的稀HCl溶液, 再加入一定量的环氧氯丙烷, 加热回流2 h。离心、洗涤直至洗液pH近中性, 用AgNO3检验无AgCl沉淀为止。收集磁珠。

1.2.2 磁性壳聚糖对BSA的吸附

取一定量BSA (小牛白蛋白) 溶液加入到一定量壳聚糖包裹Fe3O4磁性微球中, 反应一段时间后高速离心, 固体是Fe3O4/PAM/BSA复合微球, 上清液用752型紫外可见分光光度计检测蛋白质含量。

2 结果与讨论

2.1 复合微球的TEM谱图分析

在235 kv电压下的Fe3O4/MC/BSA复合微球的TEM图片。从图1中可知Fe3O4/MC/BSA复合微球粒径小于20 nm, 微球呈不规则的球形, 这就为后期制药提供了条件。同时我们也发现在大量微粒的聚集区, 磁性微粒具有较大的团聚作用, 但在水相中仍然以稳定的微小团聚体形式存在, 而不是以单个纳米磁粒的形式存在, 壳聚糖包裹在微小团聚体上, 导致复合微球的形状不完整, 存在明显的缺陷, 这可能与磁性微球团聚及破裂现象有关[6]。

2.2 复合微球的IR谱图分析

图2是磁性微球的红外谱图。由图2a可以看出:在3500 cm-1～3300 cm-1处, 存在伯酰胺的NH伸缩振动吸收峰, 在2925 cm-1和2850 cm-1处存在CH2的碳氢伸缩振动吸收峰, 在1634 cm-1处是伯酰胺的CO伸缩振动引起的强吸收峰, 在1535 cm-1处是伯酰胺中NH的面内弯曲振动吸收峰, 在1420 cm-1处是CN伸缩振动吸收峰, 在580 cm-1左右处存在一强吸收峰, 与无机微粒Fe3O4的标准谱图相对应, 说明产物中含有Fe3O4微粒。从图2a的氢键特征峰 (分别在3432. 92 cm-1) 可以分析出, 由于纳米四氧化三铁表面存在大量的悬键, 会和壳聚糖的羟基发生氢键作用, 造成氢键特征峰的蓝移, 所以壳聚糖成功包裹了四氧化三铁磁微球。图2b是吸附蛋白质之后的谱图, 特征吸收峰均发生了红移, 因为蛋白质含有大量的羰基, 羰基是极性基团, 这将导致振动频率下降, 红外谱峰将发生红移。

2.3 复合微球的热性能分析

由图3中TG-DSC曲线可以看出:在TG曲线上存在明显的阶梯变化, 从开始到465℃左右, 质量变化为22.19%, 从465℃到900℃质量变化为18.64%, 在900℃以后样品几乎没有变化。DSC曲线在724.8℃处有一明显的吸热峰, 在830.3℃处有一放热峰, 在900℃以后的温度范围内样品没有发生大的变化。由上图可以知道:从开始到500℃左右时, 对应的TG曲线变化明显, 可能由于壳聚糖上的侧链小分子受热分解, 温度升高到724.8℃时出现明显的吸热峰, 温度升高到830.3℃时出现放热峰, 可能是壳聚糖的链段受热分解引起的。在900℃以后样品几乎没有变化, 说明样品受热分解完毕。

2.4 复合微球的X射线衍射分析

由图4可知, 除相对强度有所差异外, 复合微球的衍射位置与Fe3O4标准粉末衍射数据卡 (ASTM19-629) (2θ=30.2°、35.5°、43.1°、53.5°、57°、62.7°、71.1°、74.1°、75°、79.1°) 符合得较好, 这就有力的证明了复合微球中的Fe3O4是反式尖晶石结构。X射线衍射分析发现峰型都较宽, 表明样品粒径很小, 运用Scherrer公式 (D=κλ/βCOSθ) 计算得磁性微球粒径为12 nm。

2.5 牛蛋白初始浓度对微球吸附蛋白质的影响

图5是磁性微球对牛白蛋白的吸附受BSA初始质量浓度的影响。实验条件是pH=4.9, 保温时间为60 min, 反应温度为25℃。图5的结果表明, 微球对蛋白质的吸附量随BSA质量浓度的增加而增加, 在较低质量浓度范围内, 吸附量随BSA质量浓度的增加而增大的趋势比较明显, 二者几乎成线性关系;在较高质量浓度范围内, 吸附量随BSA质量浓度的增加而增大的趋势变缓, 直至达到饱和。这是因为磁性微球表面积效应和体积效应的存在使得磁性微球的表面积激增, 吸附性能大大增加, 因此随着BSA质量浓度的增加微球表面吸附的蛋白质分子也逐渐增加, 此时再增加BSA的初始质量浓度, 蛋白质的吸附量不会发生变化, 这可能是因为蛋白质的吸附和解吸是一对平衡关系, 在较稀的浓度范围内以蛋白质的吸附为主, 而在较高浓度范围以蛋白质的解吸为主[7]。

2.6 pH值对微球吸附蛋白质的影响

图6是温度为25℃, 蛋白质初始质量浓度为1 mg/mL时, 微球在溶液pH分别为3.5、4.07、4.48、4.91、6.02、6.59、7.05的条件下, 对蛋白质的吸附量变化结果。由于蛋白质分子在不同pH条件下, 尤其在等电点附近蛋白质所带电荷的变化, 将会影响微球对蛋白质的吸附量。由图可见, 蛋白质的吸附量随pH的增大而降低, 特别是当pH小于BSA的等电点 (pH=4.9) 时, 蛋白质的吸附量随pH的增大而急剧下降。可能是因为随着pH的增大, 特别是当pH大于4.9时, BSA具有负电荷, BSA和壳聚糖磁体之间存在着静电斥力, 导致BSA分子不易被吸附。

2.7 保温时间对微球吸附蛋白质的影响

图7是保温时间的长短对微球吸附蛋白质的影响。实验条件是pH=4.9, 反应温度为25℃, 蛋白质初始质量浓度为1 mg/mL。从图中可知吸附时间小于40 min时, 保温时间对蛋白质的吸附量有较大影响, 蛋白质的吸附量随时间变化几乎成线性增长;而在40 min之后, 吸附量随着时间的递增变化变缓。这是因为壳聚糖链段是亲水性的, 能够被溶涨。在较短的保温时间内, 微球的溶涨还没有达到平衡, 微球的比表面较大因此对蛋白质的吸附能力很大, 随着保温时间的延长 (如60 min后) , 此时微球的溶涨已达到平衡, 其比表面不再发生明显的改变, 其亲/疏水性不会再发生明显的改变。因此, 蛋白质的吸附也基本达到饱和状态, 再延长保温时间其吸附量不会有太大的变化。

2.8温度对微球吸附蛋白质的影响

图8是温度对微球吸附蛋白质的影响。实验条件是pH=4.9, 保温时间为60 min, 蛋白质初始质量浓度为1 mg/mL。从图中可知, 当温度低于37℃时, 随着反应温度的提高, 壳聚糖磁性微球吸附溶液中的蛋白质量与温度呈直线增加, 蛋白质在受热达到一定温度后会发生变性, 当变性程度较轻时, 如去除变性因素, 有的蛋白质仍能恢复或部分恢复其原来的构象及功能, 变性的可逆变化称为复性, 在本章实验这种变性过程是不可逆过程, 故在实验过程中, 当温度达到40℃时, 壳聚糖磁性微球吸附蛋白的量急剧降低, 当温度达到45℃时, 紫外可见分光光度计所检测的已经不是小牛白蛋白质的吸光度。

3 结论

本文利用TEM、TG-DSC、IR、XRD等测试手段表征了Fe3O4/MC磁性微球对BSA的成功吸附, 吸附后Fe3O4/MC/BSA粒径20 nm左右, 微球内部Fe3O4晶型保持完好。考察了牛白蛋白的浓度、溶液pH、温度以及保温时间对微球吸附牛白蛋白程度的影响。结果显示在一定的pH值范围内pH值增大, 蛋白质的吸附量减小;在一定范围内增大蛋白质的初始浓度和延长保温时间均有利于增加蛋白质的吸附量。随着温度的提高, 吸附量增加, 但当温度增加到一定程度后, 蛋白质发生变性, 所检测的蛋白质的吸附量已经没有任何意义。

参考文献

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[3]Hafeli U O, Sweeney S M, Beresford B A, et al.EffectiveTargeting of Magnetic Radioactiwe 90Y-microspheres toTumor Cells by an Externally Applied Magnetic Field[J].Nu-cl med Biol, 1995, 22 (2) :147-155.

[4]余艺华, 薛博, 孙彦, 等.壳聚糖亲和磁性毫微粒的制备及其对蛋白质的吸附性能研究.[J].高分子学报, 2000, 3:340-344.

[5]金玉仁, 李冬梅, 张宝川, 等.磁性壳聚糖的制备及其对三价锕系和镧系元素的吸附性能研究[J].离子交换与吸附, 1999.15 (2) :177-181.

[6]谢钢, 张和鹏, 张秋禹, 等.细乳液聚合法制备磁性复合微球及其表征[J].高分子学报, 2003, (5) :626-630.

纤维素磁性微球研究 篇4

亲和色谱法因具有高度选择性已被广泛应用于蛋白质分离领域[5]。壳聚糖由于具有良好的安全无毒 型,生物相容 性和可降解性,常作为亲和分离的载体材料[6,7,8]。固定化金属亲和磁性微球(IMAM)既能利用金属离子与氨基酸残基的配位作用进行选择性吸附,又能在外磁场作用下充分发挥快速分离的特点,使分离纯化时更迅速有效。

本研究通过制 备固定化Cu2+磁性壳聚 糖微球 (Cu2+IDA-MCS),以α-乳清蛋白 水解体系 中的多肽 片段Val-SerLeu-Pro-Glu-Try(VSLPEW)[9]为模型分子,考察该亲 和介质对VSLPEW的吸附效果,为探究IMAM富集食源ACEI提供理论依据。

1实验部分

1.1试剂与仪器

壳聚糖(脱乙酰度≥95%),浙江金壳生物化学有限公司; VSLPEW(纯度>99%),吉尔生化(上海)有限公司;环氧氯丙烷(分析纯),中国国药集团;FeCl2·4H2O、FeCl3·6H2O、戊二醛等,均为国产化学纯。

激光纳米粒度分析仪(Nano-S),英国Malvern公司;场发射扫描式电子显微镜(SU8020),日本Hitachi公司;傅里叶变换红外光谱仪(NICOLET 6700),美国Thermo Fisher Scientific公司;振动样品磁强 计(7400),美国Lake Shore公司;紫外可见光分光光度计(UV-2550型),日本SHIMADZU公司。

1.2实验方法

1.2.1磁性亲和介质的制备

采用化学共沉 淀法制备Fe3O4磁性纳米 颗粒作为 磁核[10],乳化交联法[11]制备磁性壳聚糖微球。将磁性壳聚糖微球与一定量的环氧氯丙烷和NaoH溶液反应活化,再与碱性 条件下的亚氨基二 乙酸(IDA)溶液反应,最后与一 定浓度的CuSO4溶液反应[12],制备得到固定Cu2+磁性壳聚糖微球亲和介质Cu2+-IDA-MCS。

1.2.2磁性壳聚糖微球的性能表征

样品采用激光纳米粒度分析仪进行粒径分 布测定;采用扫描式电子显微镜进行形貌分析;采用傅里叶变换红外光谱仪进行结构分析;采用振动样品磁强计进行磁学性能分析;采用EDTA分光光度法测定微球表面的Cu2+密度。

1.2.3磁性亲和介质对VSLPEW的吸附研究

将VSLPEW与一定pH值的磷酸 缓冲液配 制成一定 浓度。取15mg亲和介质Cu2+-IDA-MCS置于5mL离心管中 , 将2mL多肽溶液与Cu2+-IDA-MCS在一定温度下混合振荡一定时间,收集上清 液。 用紫外可 见光分光 光度计测 定在280nm时VSLPEW的吸光度,考察Cu2+-IDA-MCS对VSLPEW的吸附效果。可由下式可计算出磁性壳聚糖微球上对多肽的吸附量[6]。

式中,Q为VSLPEW的吸附量,mg/g;C0为VSLPEW初始浓度,mg/mL;C1为吸附后VSLPEW浓度,mg/mL;V0为初始溶液体 积,mL;V1为吸附后 溶液体积,mL;m为微球质 量,g。

2结果与讨论

2.1磁性壳聚糖微球结构及性能表征

2.1.1粒度分析和形貌表征

粒径分析 是评价粒 子分散性 和均一性 的重要指 标。 Fe3O4纳米颗粒和磁性壳聚糖微球的体积粒径分布如图1所示。由图1(a)可知,Fe3O4纳米颗粒平均粒径大约为7nm,磁性壳聚糖微球的 平均粒径 大约为1.3μm,且粒径分 布较窄。 磁性壳聚糖微球经真空干燥后成细粉状,扫描电镜结果见图1 (b)。由图1(b)可看出磁性壳聚糖微球成规则的球形,黏连的微球较少,平均粒径在1~3μm之间,分布较窄,与粒度分析得到的结果一致。

2.1.2傅里叶红外光谱(FT-IR)分析

用红外光谱分析仪分别测定Fe3O4纳米颗粒、壳聚糖及 磁性壳聚糖微球 的官能团 并进行比 较,分别如图2中 (a)、 (b)、(c)所示。其中,谱线(a)中584cm-1处为Fe3O4的特征吸收峰;谱线 (b)中的3423cm-1是O—H的伸缩振 动峰; 1655cm-1处为C O的吸收峰。谱线(c)中保留了 壳聚糖的 特征吸收峰,在1647cm-1处出现了 了C  N的特征吸 收峰[13],说明交联剂戊二醛的醛基和壳聚糖的氨基发生了交联反应;在576cm-1处也出现了Fe3O4特征吸收峰,说明了壳聚糖包裹了Fe3O4磁性纳米颗粒。

2.1.3磁响应性分析

图3为振动样品磁强计对Fe3O4纳米颗粒和磁性壳聚糖微球的磁性分析结果。由图3可知,Fe3O4纳米颗粒和磁性壳聚糖微球的磁 饱和强度 分别为54.05emu/g和25.23emu/g, 均具有超顺磁性。由于壳聚糖包裹了Fe3O4纳米颗粒,所以磁性壳聚糖微球磁性减小,但仍具有良好的磁响应性。

2.2磁性壳聚糖亲和介质对VSLPEW的吸附工艺优化

蛋白质在固定金属亲和介质上的吸附是 静电力、疏水力和金属配位作用共同作用的结果。对于结构 为VSLPEW的食源ACEI,Cu2+-IDA-MCS与其的亲和作用主要在铜离子和肽链中的色氨酸末端氨基中的N原子或羧基中的O原子[14], 形成给予-接受电子的配价键,构成稳定的大环系统。

2.2.1VSLPEW初始浓度对微球吸附效果的影响

VSLPEW在不同初始浓 度下Cu2+-IDA-MCS的吸附量 变化如图4(a)所示。结果表明,Cu2+-IDA-MCS对VSLPEW的吸附量随其初始浓度的升高而增加,初始浓度达到2.0mg/mL之后,吸附量达到饱 和,故选择2.0mg/mL为最佳吸 附初始浓度。

2.2.2吸附时间对微球吸附效果的影响

Cu2+-IDA-MCS对VSLPEW的吸附量 与时间的 变化关系如图4(b)所示。吸附量随 着时间的 延长而不 断增加,在40min之后增加速度变缓,由于亲和介质对VSLPEW的吸附需要经过一定 时间才能 达到平衡,因此选择40min为吸附时间。

2.2.3温度对微球吸附效果的影响

温度是影响吸 附的一个 重要因素。 不同温度 下Cu2+IDA-MCS对VSLPEW吸附量的变化如图4(c)所示。随着温度的升高,吸附量先增后减,在30℃时达到最高。在螯合吸附中,适当升高温度是有利于吸附的,但由于Cu2+与VSLPEW的相互作用存在着静电作用、氢键结合等多种形式的物理结合,温度过高对吸附的几种结合机制均表现出不利的影响,因此温度超过30℃后,Cu2+-IDA-MCS对VSLPEW吸附量反而下降,因此选择30℃ 下Cu2+-IDA-MCS对VSLPEW进行吸附。

2.2.4缓冲液pH值对吸附效果的影响

Cu2+-IDA-MCS对VSLPEW吸附量随缓冲液pH值的变化如图4(d)所示。为防止蛋 白质变性 并有利于 蛋白质的 吸附,溶液的pH通常控制在6.0~8.0。由图可以看出,随着溶液pH的增加,Cu2+-IDA-MCS对VSLPEW的吸附量逐渐增大,在pH值为7.5时吸附量 达到最大 值。原因是由 于随着pH的增加,蛋白质表面配位原子质子化的程度减弱,与铜离子的配位作用增强。

综上所述,在VSLPEW初始浓度 为2.0mg/mL、吸附时间为40min、吸附温度为30℃、缓冲液pH=7.5的体系中,此时亲和介质对VSLPEW的吸附量 可达49.08mg/g。固定化Cu2+亲和分离多用于重组蛋白或抗体的分离,由于重组蛋白或抗体带有多个与金属离子螯合的组氨酸残基,因此亲和吸附较易发生。而对于VSLPEW仅由几个氨基酸残基组 成的活性分子,虽然缺乏与Cu2+配基结合 的结构,但通过优 化吸附条件,仍可使固定化Cu2+磁性亲和 介质对VSLPEW具有较大的吸附量,说明Cu2+-IDA-MCS亲和介质对VSLPEW这类具有特殊活性的ACEI小分子具 有良好的 吸附效果,由于省略了凝胶层析、离子交换层析、超滤等分离步骤,使分离纯 化过程更快捷有效。

3结论

纤维素磁性微球研究 篇5

目前, 制备Fe3O4空心微球的方法有化学共沉淀法、水热法、微波辐射法、溶胶-凝胶法等[7,8,9]。水热法是由于设备工艺简单, 还可批量生产, 制得的粒子均匀性好, 所以成为最常用且有效的制备方法之一。本研究采用乙二醇和油酸作为反应溶剂, 以醋酸钠和三氯化铁为原料, 采用水热法合成出了Fe3O4空心微球, 对样品的微观形貌和物相进行了分析, 并研究了空心微球的磁性能。

1 实验部分

1.1 试剂及仪器

FeCl3·6H2O, 醋酸钠, 乙二醇, 油酸, 乙二胺四乙酸二钠盐 (EDTA) , 无水乙醇, 均为分析纯。聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜, JEOL 2100F型透射电子显微镜, 日本理学Dmax-γA型X射线衍射仪, Lakeshore 7407型振动样品磁强计。

1.2 Fe3O4空心微球的制备

室温下将3.5g FeCl3·6H2O和2.3g醋酸钠加入到40mL乙二醇和40mL油酸的混合溶液中, 持续搅拌, 将反应液加热到50℃, 反应30分钟, 再转入体积为120mL的具有聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中, 密封后在200℃下水热反应15h, 冷却至室温, 过滤, 分别用无水乙醇和去离子水洗涤3次, 空气干燥24h后, 得到黑色Fe3O4粉末, 标记为E0。在相同的制备条件下, 在反应液中添加0.05g EDTA, 合成出的样品标记为E1。

2 结果与讨论

2.1 Fe3O4微球的微观形貌分析

添加与未添加EDTA合成的Fe3O4样品的TEM照片如图1所示, 其中a, b和c为样品E0的TEM照片, d, e和f为样品E1的TEM照片。从图a和d可以看到, 不论是否添加EDTA, 制得的样品均为空心球形颗粒, 形状规整, 分散性好, 大小均匀, 平均粒径在450nm左右。由图b和e可以看出, 空心微球是由许多细小粒子团聚而成的聚集体, 这些细小粒子通过化学键、磁性和范德华力等作用团聚成Fe3O4空心微球[10,11]。

图1c还显示出, 样品E0是由直径大约为12nm的近球形粒子聚合而成的空心微球, 而图1f中样品E1的空心微球则是由边长约为40nm的八面体形粒子聚合在一起形成的。这表明EDTA是影响Fe3O4粒子形貌的主要因素。当不添加ED-TA时, 得到的产品粒子为近球形, 添加了EDTA后, 粒子形貌变为八面体。因为面心立方晶粒的形貌决定于晶核<100>晶面与<111>晶面生长速率的比[12]。EDTA本身是一种很强的配位剂, 可以与Fe3+离子形成非常稳定的配合物, ED-TA作为六齿配体, 用四个氧原子和两个氮原子围绕在金属离子周围, 可形成八面体结构[13]。本实验中, 在EDTA的影响下, 改变了Fe3O4晶核生长的微观环境, 与<111>晶面相比, <100>晶面由于反应速率慢, 因而具有较快的生长速率, 最终倾向于形成规则稳定的八面体结构。

2.2 微球的物相分析

图2a和b分别为样品E0和E1的XRD图, 图谱显示两个样品在2θ为30.1, 35.4, 42.9, 57.5和62.7处, 均出现有Fe3O4的特征衍射峰, 无明显的杂质峰出现, 表明合成的产物均为纯相的Fe3O4。两个样品的衍射峰强度很高而且尖锐, 说明了产物的结晶度良好, 图2a比2b的半峰宽略宽, 表明样品E0的粒子尺寸比样品E1的更小。通过Scherrer公式可计算出样品E0和E1的平均粒径分别为12.05nm和41.8nm, 计算结果与TEM中观察到的粒径大小一致。

2.3 反应时间对粒子的影响

为了研究反应时间对粒子的影响, 在合成过程中固定其它反应条件, 反应液中不添加EDTA, 在反应釜中分别反应10h、15h、20h和25h进行Fe3O4的制备, 其XRD测试结果分别如图3a、b、c和d所示。可以看出, 4个样品均有Fe3O4的特征衍射峰, 而且没有其它杂峰出现, 表明产物均为纯相的Fe3O4。

根据XRD图谱数据, 利用Scherrer公式计算平均粒径, 得到产物粒径随反应时间的变化趋势, 如图4所示。由图4可以看出, Fe3O4晶粒的粒径随反应时间的延长呈缓慢增长的趋势, 从反应10h到25h, 粒径仅增长了0.7nm, 增长幅度较小, 说明粒径受反应时间的影响较小。但从图3可以看到, 随着反应时间的增长, 衍射峰的强度在逐渐增强, 说明反应时间越长, 晶粒的结晶程度越好, 形成的粒子更加均匀、规整。

2.4 微球的磁性能

图5a和b分别给出了样品E0和E1的室温磁化曲线, 可以看到, 样品E0和E1的饱和磁化强度 (Ms) 分别为71.4和80.5emu/g, 矫顽力 (Hc) 分别为11和23Oe。与块状Fe3O4相比[14], Fe3O4空心微球具有较低的饱和磁化强度, 是因为微球颗粒粒径较小, 表面积比块状的大, 而饱和磁化强度会随粒径的减小而减小, 所以合成的空心微球饱和磁化强度略低。样品E0和E1两种空心微球的Ms之间的差别在于, 虽然微球尺寸差别不大, 但由于组成微球的粒子大小不同, E0的粒径小于E1的, 造成样品E0的饱和磁化强度比E1的低。两种样品的矫顽力均较低, 也反映出团聚的细小粒子的粒径很小, 因为粒径越小, 矫顽力越低, 因而, 样品E0具有比E1更低的矫顽力值, 而且接近于零, 表明细小粒子接近于超顺磁性。与粉末状单分散的Fe3O4相比[11], Fe3O4空心微球又具有较高的饱和磁化强度, 这是因为组成Fe3O4空心微球的每个纳米粒子都可以看作一个单畴粒子, 而整个空心微球则可看成一个多畴颗粒。当对Fe3O4空心微球施加外场时, 畴壁沿磁场方向移动, 直至每个粒子的磁矩沿磁场方向排列。磁性微球的空心部分和颗粒之间的间隙产生很强的钉扎效应, 这对畴壁的移动会产生阻力, 从而使Fe3O4空心微球具有较高的饱和磁化强度[15]。

3 结语

采用水热法制备了大小均匀的Fe3O4空心微球, 空心微球由许多细小的粒子团聚而成。研究了EDTA对组成微球的细小粒子形貌的影响, 发现反应时未添加EDTA, 粒子近似球形, 当添加EDTA时, 则形成八面体形粒子。研究了反应时间对粒子的影响, 结果表明, 粒径随反应时间的增加呈缓慢增长的趋势, 影响不是很明显, 不过随着反应时间的增长, 有效地提高了晶粒的结晶程度。合成的Fe3O4空心微球具有较高的饱和磁化强度和较低的矫顽力。

摘要：通过水热法合成了具有优良磁学性能的Fe3O4空心微球。采用透射电子显微镜 (TEM) 、X射线衍射仪 (XRD) 和振动样品磁强计 (VSM) 对样品的微观结构和磁性能进行了表征。结果表明:空心微球尺寸约450nm, 由许多细小的粒子团聚成大小均匀的球形, 当反应中未添加EDTA时, 组成微球的粒子近似球形, 粒径在12nm左右, 当添加0.05g EDTA时, 形成八面体形粒子, 粒径约为40nm;合成的Fe3O4空心微球具有较高的饱和磁化强度和较低的矫顽力。

纤维素磁性微球研究 篇6

吸附效果一般用模型蛋白吸附量来衡量,吸附剂性能好差通常与其物理化学性质、种类、孔隙率等有关,还与吸附外界环境条件紧密相关,比如说环境温度、体系pH、吸附质浓度等。

随着菠萝蛋白酶在食品[1,2,3]、日化[4]、医药[5,6]等行业中发挥着越来越重要的作用,国内外的很多专家对它的提取方法进行了大量的研究,目前运用到工业化生产的有单宁沉淀法、高岭土吸附法和超滤浓缩法[7,8]。目前,离子交换层析法和电泳法可用于菠萝蛋白酶分离纯化,并且已经得到了单组分[9,10,11],但是,由于纯化的材料价格昂贵,所需的成本高,未能进行大规模化生产。目前工业上对菠萝蛋白酶的提取有大量文献,而甘蔗渣再生纤维素微球对菠萝蛋白酶的吸附未见相关报道,本章拟设计单因素实验优化微球对菠萝蛋白酶的吸附工艺,为纤维素基吸附材料的开发与应用提供理论前提和实践依据。

2实验试剂与仪器设备

2.1实验试剂

2.2仪器和设备

2.3实验内容

2.3.1微球的制备

参照钟明良[12]方法制得甘蔗渣再生纤维素微球。

2.3.2不同pH缓冲溶液的配制

按Henderson-Hasselbalch方程配制pH值,用分析天平准确称取6.1 g Tris(C4H11NO3)精确到0.0001 g,在室温条件下,使之溶于500 mL的超纯水中,用p H计验证,若有偏差用事先配制好的1 mol•L-1HCl和1 mol•L-1NaOH溶液将其调至所需pH值。

2.3.3标准溶液液配制

用分析天平精确称量0.14g菠萝蛋白酶溶于一定量超纯水中,制成100.00m L标准母液,然后取不同体积的母液稀释成浓度为200、400、600、800、1000、1200、1400 mg•L-1的菠萝蛋白酶溶液,定容后摇匀于275 nm下测不同浓度的吸光度值,以酶溶液对吸光度值作图,得标准曲线。

2.3.4测定酶活

主要有C.D.U.法、G.D.U.法、F.I.P.法和快速测试法[13],本实验采用F.I.P法测定酶活。

2.3.4.1各试剂的配制

所需各试剂参照实验方法配制[14]。

2.3.4.2测定酶活操作步骤

准备两支15 m L洁净试管(1)和(2),移液管精确量取2.5m L底物溶液分别放入(1)和(2)置于超级恒温槽,调至35℃;然后量2.5 m L的酶制备溶液,移置另外两支编号(3)和(4)试管中,把(3)和(4)试管放入35℃±0.20C的恒温槽预热两分钟;(3)号管加入底物溶液并摇匀,计时恒温10 min,随后移入5.0m L的蛋白质凝固剂,终止反应;(4)试管加入5.0 m L蛋白质凝固剂之后,再迅速加入经预热酶制备溶液,恒温30 min,过滤,(4)号管作空白对照,在紫外波长275 nm下测其吸光度值。

2.3.4.3酶活的计算

计算酶活可参照施特尔马赫酶[13]所著酶活测定一书:

式中:

EF.I.P.——一个F.I.P.菠萝蛋白酶单位酶活(F.I.P.-U/g或F.I.P.-U/m L);

A275——酶试样在275 nm处的吸光度;

W——酶试样量(g或m L);

0.126——0.1μmol/ml酪氨酸溶液在275nm处的吸光度;

10——反应时间(min)

2.3.5静态吸附

本课题以甘蔗渣再生纤维素微球为吸附剂,以菠萝蛋白酶溶液为模型,静态吸附测其吸附量。精确称重一定质量微球于100 m L锥形瓶,移取25 m L浓度为1000 mg•L-1待测液,用封口膜封住瓶口预防待测液飞溅,升至至预定温度振荡一定时间,离心后取清液,275 nm下测,并重复以上步骤三次计算平均吸光度值。

注:qt为t时刻吸附量,mg•g-1;qe为饱和吸附量,mg•g-1;C0为初始浓度,mg•L-1;Ct为t时刻待测液的浓度,mg•L-1;M为微球质量,g;V为菠萝蛋白酶溶液的体积,m L。

2.3.6吸附率测定

吸附率等于吸附后待测液浓度与原液浓度的百分比。

式中:C0为初始浓度,mg•L-1;Ct为t时刻溶液浓度。

2.4结果与讨论

2.4.1标准曲线测定

按2.3.3步骤绘制其标曲,如下:

从图1知,标准曲线方程如下。

其相关系数R2=0.9992,说明其线性关系良好,即可用于推算吸附前后菠萝蛋白酶的浓度差,计算出它的吸附量。

2.4.2单位酶活

参照步骤2.3.4和式(1)计算,其酶活为0.1~0.25F.I.P-U•g-1之间。

2.4.3吸附率计算

由式(4)计算知:微球对菠萝蛋白酶吸附率为22.56~80.40%之间。

2.4.4单因素实验

以甘蔗渣再生纤维素微球为吸附剂,以菠萝蛋白酶为模型蛋白,采用静态吸附进行吸附实验,考察菠萝酶溶液初始浓度C0、时间t、温度T、振荡速率V、溶液p H等工艺条件的影响。

2.4.4.1初始浓度的影响

拟设计C0为400、600、800、1000、1200、1400 mg•L-1条件下测其对菠萝蛋白酶的吸附效果的关系,结果如下:

从图2可知,吸附量随着C0加大呈现快速上升趋势,而当C0过大时甘蔗渣再生纤维素微球吸附量迅速饱和后,不能继续吸附菠萝蛋白酶,而持续振荡会导致部分吸附上的菠萝蛋白酶被脱附下来,表现出来的及时其吸附量又呈现下降趋势,当溶液浓度为1000 mg•L-1时,其吸附达到最大值89.0mg•g-1,故选取C0为1000 mg•L-1最佳。

2.4.4.2温度的影响

拟设计T为293.2、298.2、303.2、310.2、313.2、318.2 K条件下测T对菠萝蛋白酶的吸附效果关系,结果如下:

从图3可知,对比C0与吸附效果关系来说,温度对其影响较小,随着T升高吸附量增大,对模型蛋白吸附量先增大后略微下降,在振荡温度为313.2 K时,吸附量达到最大值92.9 mg•g-1。当温度高于318.2 K时,菠萝蛋白酶变性导致其自身结构发生变化,减少其接触机会故吸附量下降。

2.4.4.3吸附时间的影响

拟设计振荡时间为10、20、40、60、80、100、120 min条件下测其对菠萝蛋白酶吸附效果的关系,结果如下:

从图4可知,在t为10~40 min内,菠萝蛋白酶的吸附量随时间的增加而快速上升,而在40 min后直至120 min期间内,菠萝蛋白酶的吸附量几乎变化不大,笔者可以认为吸附40 min后吸附量达到最大值为98.8 mg•g-1,故选取振荡时间为40 min。

2.4.4.4振荡速率的影响

考察振荡速率V对吸附效果的影响,拟设计V为0、50、100、150、200、250 r•min-1条件下测其对菠萝蛋白酶吸附量的关系。

从图5可知,振荡速率V对吸附效果的影响很大,振荡速率越快吸附效果越好,当V在0~50 r•min-1间,吸附相同的时间内其吸附量变化不明显,是因为振荡速率过小甚至静置甘蔗渣再生纤维素微球与溶液接触不充分,液质混合不均匀导致部分微球吸附不完全;而当速率由50 r•min-1升至100r•min-1时吸附量显著上升,随之上升趋势减弱,速率由200r•min-1提升至250 r•min-1时吸附量变化不大,但是振荡速率过高会造成溶液飞溅出锥形瓶和吸附剂黏在瓶壁上,导致实验结果不准确。故本实验选取振荡速率由200 r•min-1为最佳,此速度下甘蔗渣再生纤维素微球的吸附量为106.4 mg•g-1。

2.4.4.5体系pH的影响

拟设计体系p H分别为4、5、6、7、8、9、10条件下测其对菠萝蛋白酶吸附效果的关系。

从图6可知,其吸附量随体系pH值不断上升而逐渐上升至最大后急剧下降,表现为:pH=9时吸附量最大为111.2mg•g-1,而当体系pH=10时吸附量急剧下降,降至最小值59.3mg•g-1。等电点(菠萝蛋白酶)约为9.55,当体系p H=9时,菠萝蛋白酶分子上正负电荷几乎能相互抵消,在pH为10时失活,菠萝蛋白酶变性使其结果发生变化从而影响菠萝蛋白酶的吸附量[15]。分析认为,体系pH值得改变影响纤维素微球与菠萝蛋白酶之间的静电作用,再加上疏水基的影响,促进了吸附行为进行,所以当体系pH高于或低于其等电点,菠萝蛋白酶表面所含负电荷增多,两者之间的静电排斥力影响吸附行为,直观表现为吸附量下降。

2.5结论

纤维素磁性微球研究 篇7

炭微球的功能化是扩展其应用的另一途径。以炭微球担载SnSb和Pd催化剂已经在锂电和催化领域表现出了潜在的应用价值[8-9]。近年来,多酸作为一种固体酸,以其结构的多样性和可修饰性、优异的氧化还原性质、环境友好等优点被广泛用作构建多功能复合材料的无机成分[10]。但多酸易溶于水、比表面积小等缺点往往需要将其固载在合适的载体上。本研究以玉米秸秆分离出来的半纤维素为原料水热制备炭微球,将其作为载体与硅钨酸(H4SiW12O40,简写为SiW12)原位复合制备炭球@硅钨酸复合物,并考察了产物的结构和催化性能。

1 实验部分

1.1 半纤维素制备炭微球及功能化

玉米秸秆半纤维素由本校其他实验室提供(见致谢部分)。取100mL半纤维素水解液浓缩至23mL(含糖2.279g)转移至30mL反应釜中,180℃下水热反应7h。将产物过滤,分别用去离子水和无水乙醇洗涤若干次,干燥得到棕色粉末。若在上述体系中加入0.456g硅钨酸,相同条件下则原位制备得到炭球@硅钨酸复合物。

1.2 酯化反应实验

取乙酸和无水乙醇各1.5mL于洁净的25mL烧瓶中,以0.05g炭微球/硅钨酸复合物作为催化剂,80℃加热回流3h,离心分离取上清液,采用色谱对其成分进行分析。催化剂离心分离、回收可再利用。

1.3 产物的表征

采用扫描电镜(SEM,JSM-6360LV)、傅里叶红外光谱(Bruker TENSOR 27FTIR spectrometer)、Raman光谱(JYLab-Ram HR800)、热重(TGA,Perkin-Elmer Diamond TG an-alyzer)、色谱(天美GC7900气相色谱仪)等技术手段对样品进行表征。

2 结果与讨论

图1是半纤维素基炭微球及炭球@硅钨酸复合物的扫描电镜(SEM)照片。从图1(a)可知,以半纤维素为碳源制备的产品均为球形,与葡萄糖、蔗糖等制备的炭微球形貌相似[4-5]。由此可见,半纤维素作为一种廉价的原料可作为制备炭微球的良好碳源。从图中也可以看到,炭微球的大小不是很均一,直径范围在2~8μm,这可能由于半纤维素的水解液粘度较大使得水热过程中交联程度不均一所致。图1(b)是炭球@硅钨酸复合物的SEM照片。相对炭微球而言,其形貌和尺寸均没有明显的变化,表明硅钨酸的存在对炭微球的形貌和尺寸没有影响。

图2A是所得产品的拉曼光谱,在拉曼光谱中位于1357cm-1和1588cm-1的峰分别称为D峰和G峰,D峰是无定形碳原子的振动形成的,G峰是石墨曲面层E2对称振动形成的。由图可知,炭微球没有观察到D和G峰的存在,说明由于水热温度较低,炭微球仍然是以无定形炭结构为主。而在硅钨酸参与下,炭微球D峰和G峰均明显提高,这说明硅钨酸可作为催化剂提高炭微球的石墨化程度。

图2B给出了硅钨酸和炭球@硅钨酸复合物的固体紫外-可见光谱,插图是其波长在200~350nm的放大图。从图中可以看出,纯硅钨酸在252nm处有明显的吸收峰,而复合物在此处也有弱吸收,这主要归因于复合物中硅钨酸的吸收;相比纯硅钨酸,复合物在400~700nm波长范围内也有强烈的吸收,这是由于复合物中炭组分对可见光吸收的结果。固体紫外进一步证明了纤维素为碳源可水热原位制备硅钨酸和炭的杂化复合材料。

采用红外光谱对炭微球的官能团进行分析和鉴定。图3A给出了炭微球和炭球@硅钨酸复合材料的红外谱图。从图中可以看出,二者在波数为1750~1024cm-1均存在相同的吸收峰,其中波数在1717cm-1对应的峰是羰基(C=O)的吸收峰,1620cm-1和1512cm-1对应的是C=C吸收峰,1024cm-1对应于芳环的C-H面外弯曲振动。这表明半纤维素在水解过程中产生了一定程度的芳香化,同时脱水、碳化形成双键和碳碳单键,使得产物部分碳化从而制备了炭微球。同时,炭球@硅钨酸的谱图上还观察到波数为988cm-1、928cm-1和790cm-1上的吸收峰,分别对应硅钨酸的W=O,Si-O和W-O-W伸缩振动,表明硅钨酸成功担载到炭微球上并保持其典型的Keggin结构。炭球@硅钨酸复合物与纯硅钨酸相比,其Si-O和W=O键都略微发生了红移,这可能是由于硅钨酸的Si-O,W=O键与炭球表面的-COOH,-OH形成氢键的缘故,说明二者之间存在一定的相互作用,这种相互作用使得硅钨酸不易从碳球表面脱落。

图3B是硅钨酸功能化炭微球前后在空气中的热重分析图。由图可知,二者在270℃ 左右开始失重,当温度到达500℃时炭微球已经分解完全,基本没有残余固体,而炭球@硅钨酸则在温度为580℃时质量不再发生变化,最终剩余固体主要为三氧化钨,由此推算出硅钨酸担载量约为27%。

所制备的炭球@硅钨酸复合物应用于酯化反应中考察其催化性能。在乙酸和乙醇(v/v=1∶1)反应体系中,该催化剂对乙酸转化率可达51%。相比纯硅钨酸用作催化剂,复合物催化剂产品可回收利用,大大提高了其利用效率。该催化实验的条件还有待优化,同时炭球及功能化的复合物在电分析、医药等领域的应用还有待开发。

3 结论