产生菌株

产生菌株（共3篇）

产生菌株 篇1

生物表面活性剂 (biosurfactant) 是微生物在一定的培养条件下, 代谢分泌的具有一定表面活性与界面活性、集亲水基与疏水基结构于一分子内部的两亲性化合物。目前发现的生物表面活性物质包括许多不同的种类, 如糖脂、脂肽、多糖-脂类复合物、磷脂、脂肪酸和中性脂等。与化学合成的表面活性剂相比, 生物表面活性剂除具有降低表面张力、稳定乳化液和发泡等相同特性外, 还具有化学合成表面活性剂所不具备的无毒、生物降解性及生物兼容性等特性, 在医药、化妆品、洗涤剂和食品等工业领域具有广阔的应用前景。目前已成为人们竞相研究的热点。

本文从长期被石油污染的土样中采用原油乳化和排油圈法筛选得到一株能产生物表面活性剂的芽孢杆菌, 并对该菌株产生的生物表面活性剂进行了定性分析。

1 试验材料与方法

1.1 材料

分离材料取自济南某加油站、莱西某加油站、莱西某汽修厂、东营某油田和东营某输油管道长期受石油污染的土壤。

1.2 培养基

(1) 富集培养基 (g/L) :原油2g/瓶, 硫酸铵2.5, 硫酸镁0.5, 磷酸二氢钾4.0, 磷酸氢二钠4.0, 氯化钠2.0, 酵母膏0.5, 微量元素液5.0, pH值7.0。其中, 微量元素液 (g/L) :Z硫酸锌0.29, 氯化钙0.24, 硫酸铜0.25, 硫酸镁0.17。

(2) 斜面培养基 (g/L) :牛肉膏3.0, 蛋白胨10.0, 氯化钠5.0, pH值7.0, 琼脂20。

(3) 原油液体培养基 (g/L) :原油2g/瓶, 硫酸铵2.5, 硫酸镁0.5, 磷酸二氢钾4.0, 磷酸氢二钠4.0, 氯化钠2.0, 酵母膏0.5, pH值7.0。

(4) 发酵培养基 (g/L) :葡萄糖20.0, 硫酸铵2.5, 磷酸二氢钾4.0, 磷酸氢二钠4.0, 硫酸镁0.5, pH值7.0。

1.3 菌种筛选方法

(1) 平板分离。取2g土样加入到盛有35mL无菌水的三角瓶中, 震荡2h后静置30min, 制成土壤悬液。将土壤悬浮液以5% (V/V) 接种量接种入富集培养基, 装液量35mL/250mL三角瓶, 37℃摇瓶振荡培养, 待观察到三角瓶中的培养基有乳化现象时, 将富集培养液适当稀释后涂布到平板培养基上, 37℃恒温培养, 待长出单菌落后转接到斜面4℃保存。

(2) 摇瓶复筛。将初筛得到的单菌落分别接种到原油液体培养基, 装液量35mL/250mL三角瓶, 于37℃、180r/min摇瓶振荡培养, 选择原油乳化效果好的菌株。

(3) 排油圈法复筛。将具有原油乳化效果的菌株分别接种入发酵培养基, 装液量35mL/250mL三角瓶, 于37℃、180r/min摇瓶振荡培养4d, 离心后测上清液的排油圈直径, 选择排油活性最强的菌株作为下一步的研究对象。

1.4 表面活性的测定方法

排油圈法:发酵液4 000r/min离心10min, 取上清液备用。取一直径9cm的培养皿, 加30mL蒸馏水, 在水面滴加0.2mL液体石蜡, 待形成油膜后, 在油膜中央滴加0.2mL适当稀释的的发酵液上清液, 形成稳定的排油圈后测量排油圈直径。选择排油圈直径最大的菌株。

1.5 生物表面活性剂的提取

生物表面活性剂的提取采用改进的酸沉降法。将发酵液调pH值至8.0后, 于4 000r/min离心10min除菌体, 连续操作2次将上清液用6mol/L的HCl调pH值至2.0, 出现絮状沉淀。4℃下静置过夜, 4 000r/min离心20min收集沉淀, 冷冻干燥, 得生物表面活性剂粗产品。进一步提纯用体积比为2:1的氯仿/甲醇混合液进行萃取, 萃取2次合并有机相, 萃取时间2h, 最后用选装蒸发仪挥发掉萃取剂即得生物表面活性剂粗品。

1.6 生物表面活性剂的定性分析

(1) 发酵产物的带电性能的检测。阴离子生物表面活性剂检测方法 (亚甲基蓝-氯仿测定法) :取一25mL试管, 加入5mL发酵液, 10mL亚甲基蓝溶液和5mL氯仿, 用力振荡数分钟, 氯仿层变蓝色则证明是阴离子生物表面活性剂。

阳离子生物表面活性剂检测方法 (溴酚蓝测定法) :取25mL试管, 加入5mL样品, 再加2~5滴溴酚蓝溶液, 若样品-溴酚蓝混合液变成深蓝色则证明是阳离子生物表面活性剂。

(2) 发酵产物中糖组分分析。生物表面活性剂粗品加入6mol/L HCl溶液, 置沸水浴中加热水解20min, 用6mol/L NaOH溶液中和, 最后定容至10mL, 得到样品水解液。采用3, 5-二硝基水杨酸 (DNS) 比色法对水解液中的糖组分进行分析。

(3) 发酵产物中氨基酸和磷酸组分分析。将酸沉和萃取所得的产物用6mol/L的盐酸水解, 采用薄层层析鉴定其水解产物中是否含有氨基酸成分。

展层剂:氯仿:甲醇:水=65∶15∶2 (V/V/V)

显色剂: (1) 0.5%茚三酮无水丙酮溶液, 氨基酸显色剂; (2) 钼酸铵-高氯酸显色剂, 磷酸显色剂。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选结果

2.1.1 平板分离

采用富集培养和平板分离法从采集的土样中共挑取269株单菌落, 见表1。

2.1.2 摇瓶复筛

将平板初筛得到的菌株, 接种于原油液体培养基中进行摇瓶发酵进行初筛, 挑选原油乳化效果好的菌株。本轮筛选共获得6株原油乳化效果较好的菌株。图1为原油培养基筛选原油乳化效果。

2.1.3 排油圈复筛

将初筛获得的6株菌接种入摇瓶发酵培养基进行复筛。装液量35mL/250mL三角瓶, 于37℃、180r/min培养4d后, 离心除菌体, 将上清液稀释2倍, 测定排油圈直径, 比较它们产生物表面活性剂能力的大小, 复筛结果见表2。

由表2可知:菌株BS8-17与其他菌株相比, 发酵液排油圈直径均最大, 且性能稳定, 通过显微镜观察为一株芽孢杆菌。

2.2 菌株BS8-17产生物表面活性物质定性分析

微生物来源的生物表面活性剂种类很多, 按化学结构可分为糖脂类、脂肽/脂蛋白类、脂肪酸和磷脂、聚合表面活性剂和微粒表面活性剂5大类 (Kosaric, 1993) 。其中, 糖脂和脂肽是目前研究最多的两大类生物表面活性剂。芽孢杆菌产生物表面活性剂的报道非常多, 枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌居多, 主要的是产脂肽类生物表面活性剂。

发酵液通过酸沉, 4℃过夜, 离心得到生物表面活性剂的粗品。进一步提纯用体积比为2∶1的氯仿/甲醇混合液进行萃取, 萃取2次合并有机相, 萃取时间2h, 最后用选装蒸发仪挥发掉萃取剂即得产物生物表面活性剂。冷冻干燥以后得生物表面活性剂为黄褐色粉末。

2.2.1 发酵产物带电性检测

产物由阴离子生物表面活性剂测定方法检测发现氯仿层变蓝色;由阳离子生物表面活性剂测定方法检测发现样品-溴酚蓝混合液并未变为深蓝色。表明该产物是阴离子生物表面活性剂, 结果见表3。

注:“+”氯仿层变蓝色或样品-溴酚蓝混合液变为深蓝色;“-”氯仿层未变蓝色或样品-溴酚蓝混合液未变为深蓝色。

2.2.2 发酵产物中糖组分分析

分别取适当稀释的未经酸水解和经酸水解后的发酵液各1mL, 用DNS法测定水解前后还原糖的变化。结果表明:水解前后吸光度值基本没有变化, 初步推测菌株BS8-17产物不含还原糖组分。

2.2.3 发酵产物中氨基酸组分分析

发酵液萃取所得生物表面活性剂粗制品进行硅胶薄层层析分析, 直接用茚三酮进行染色不显色;将粗制品放人装有浓盐酸的密封瓶内于110℃原位水解后, 再用茚三酮染色, 显紫红色斑点, 说明菌株BS8-17本身不含游离氨基, 酸解后可产生游离氨基。可初步得出结论:菌株BS8-17所产生的生物表面活性物质为脂肽, 图2是产物水解后茚三酮显色结果。

3 结论

本试验采用原油乳化和排油圈法建立了快速筛选产生物表面活性剂菌株的模型, 从东营长期被石油污染的土样中筛选得到1株能产生物表面活性剂 (BS) 的芽孢杆菌BS8-17通过酸水解和薄层层析鉴定产物为脂肽类生物表面活性剂。该菌株对原油具有较好的乳化效果, 在微生物采油上具有很大的研究潜力。

摘要：利用原油乳化和排油圈法从长期被石油污染的土样中筛选得到一株能产生物表面活性剂 (BS) 的芽孢杆菌菌株BS8-17, 并对其代谢产物进行了初步鉴定, 借助于薄层层析 (TLC) 分析代谢产物的酸水解物组分, 初步确定该菌株产生的表面活性物质属于脂肽类。

关键词：生物表面活性剂,菌种筛选,芽孢杆菌,脂肽

参考文献

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产生菌株 篇2

关键词：D-核糖,噬菌体,抗噬菌体菌株,发酵

D-核糖 (D-Ribose, D-R) 是一种具有重要生理意义的五碳糖, 广泛应用于食品及医药工业, 是目前合成维生素B2的重要原料, 也可用于合成抗病毒、抗肿瘤的药物[1]。它的生产方法主要有三种, 一是抽提法, 二是化学合成法, 三是生物发酵法。前两种因其产率低、成本高、环境污染大等诸多问题, 在规模化生产中基本上被淘汰, 而生物发酵法是葡萄糖利用微生物发酵生产, 因其成本低、易于大规模生产、环境污染较小等优点[2], 已得到国内外D-核糖生产厂家的普遍采用。D-核糖发酵是磷酸戊糖途径 (I-IMP) 的非氧化支路缺失, 使微生物改变酶系, 积累阻断反应的前体来进行代谢控制发酵的[3], 但D-核糖产生菌--枯草芽孢杆菌转酮醇酶变异株常常会受到噬菌体的污染而使生产受到影响, 抗噬菌体菌株的选育是发酵工业噬菌体防治的重要方法之一。国外已将菌株的抗噬菌体特性作为评价或筛选发酵剂优良菌株的重要标准[4]。为此, 我们从D-核糖的异常发酵液中分离纯化了噬菌体并开展了抗噬菌体菌株的选育工作, 本文报道了此项研究结果。

1 材料和方法

1.1 材料。

枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis) 转酮醇酶 (Transketolase) 变异株XB02, 本公司自备。

噬菌体P001, 本公司异常发酵液中分离纯化而得。

1.2 培养基

1.2.1 肉汤培养基

牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、可溶性淀粉2.0%、NaC1 0.5%、酵母膏0.1%, pH值7.0-7.2, 加入琼脂2.0%则为固体培养基。该培养基用于细菌和噬菌体的保藏、扩增及活化等。

1.2.2 噬菌体培养基

上层培养基配比:淀粉1%, 精解蛋白胨0.2%, NaC1 0.1%, NaNO30.1%, K2HPO40.1%, MgSO4·7H2O 0.05%, FeSO4·7H2O 0.001%, 琼脂1%, pH 7.8-8.0;

下层培养基配比:牛肉膏0.3%, 蛋白胨1.0%, NaC1 0.5%, 琼脂2.0%, pH 7.4-7.5。

1.2.3 种子培养基

葡萄糖2.0%、酵母膏0.35%、K2HPO40.3%、KH2PO40.1%, pH7.0-7.2。

1.2.4 发酵培养基

葡萄糖20%、玉米浆3%、 (NH4) 2SO40.6%、Ca CO3 3.6%、MnSO4·4H2O 0.005%。pH7.0-7.2。

1.3 培养方法

敏感菌株、抗性菌株及噬菌体在肉汤培养基或双层琼脂培养基上的培养温度为35±0.5℃, 培养时间为24h。噬菌体原液的制备、摇瓶种子培养及发酵均在旋转式摇床上进行, 培养温度为35±0.5℃, 转速220rpm, 培养周期分别为24、20和72h。

注:+p表示在培养基中加入噬菌体。

50L发酵罐的培养条件:温度为35±0.5℃, 罐压为0.1Mpa, 搅拌转速为400rpm, 通气量为1:0.5v/v/m。

1.4 噬菌体的分离纯化、原液制备及效价测定

取D-核糖异常发酵液4000r/min离心20min。上清液经微孔滤膜过滤除菌得到含有噬菌体的样液, 然后在双层琼脂平板上进行噬菌体的分离。噬菌体的分离、纯化及原液制备参照文献[5,6]。噬菌体效价测定采用双层平板法[7]。

1.5 抗噬菌体菌株的选育方法

1.5.1 抗噬菌体菌株的筛选

抗噬菌体菌株的选育方法采用紫外线诱变法。从活化好的敏感菌斜面中刮出菌苔, 制成单细胞悬浮液。在直径6cm的培养皿中加入3mL单细胞悬浮液, 放人暗箱并用电磁搅拌器进行搅拌, 在l5w紫外灯下距离 (20cm、25cm) 照射 (15、20、25s) (紫外灯先预热20min, 使其波长稳定) 。黑暗中静置30min后, 取菌悬液1mL接入种子培养基中, 同时加入噬菌体液1mL (108pfu/m1) , 摇床振荡培养24h后取培养液进行适当稀释, 将其涂布于肉汤培养基平板上培养, 挑取单菌落用划线点滴法[8]测定其对噬菌体的抗性, 同时对其进行镜检, 挑选出既具有抗性又与出发菌株相似的菌株。将这些菌株分别接入种子培养基中, 同时加入噬菌体混合培养。比较上述菌株在摇瓶发酵中的产D-核糖能力, 最后选出既有稳定抗性又高产的菌株作为目的菌株。

1.5.2 抗性菌株遗传稳定性试验

将选育获得的抗性菌株分别含噬菌体的液体种子培养基、发酵培养基进行连续传代。每次传代后用双层琼脂法、35±0.5℃培养48h做抗性检查。在低倍镜下观察是否出现噬菌斑。

1.6 测定方法

D-核糖含量的检测采用苔黑酚法[9]。

菌体生长量 (OD值) 的测定:用蒸馏水稀释发酵液10倍, 以蒸馏水作空白, 用721分光光度计测定发酵液在590nm处的光密度。

2 结果与讨论

2.1 噬菌体的分离纯化和浓缩

经多次分离、纯化, 从D-核糖的异常发酵液中获得了一种噬菌体, 将其命名为P001, 它在双层琼脂平板上可产生一种形态基本一致的噬菌斑。P001的噬菌体为透明的边缘清晰的圆形噬菌斑, 直径约2.4mm左右。将纯化后的噬菌体加入已接菌的种子培养基中进行增殖培养, 可以得到效价达1000pfu/mL以上的噬菌体原液。

2.2 抗噬菌体菌株的选育

以枯草芽孢杆菌转酮醇酶变异株XB02为出发菌株, 经紫外线诱变法诱变, 得出最佳诱变工作参数为:采用15W紫外灯 (预热20min) 下, 距离25cm照射25S。获得了16株对噬菌体P001具有抗性的变异菌株, 挑选出生长正常产D-核糖能力、生长状况与出发菌株相近的菌株5株。经多次复筛获得了2株抗噬菌体的D-核糖高产菌株Kp03、Kp14。菌株Kp03、Kp14在噬菌体存在的条件下产D-核糖水平达到了对照敏感株的正常产D-核糖水平 (如表1) 。

2.3 菌株Kp03、Kp14抗噬菌体能力的检测

将菌株Kp03、Kp14及敏感株XB02分别接入混有0.2 mL噬菌体原液 (效价1000pfu/mL) 的种子液中进行摇瓶发酵培养。在整个培养过程中, 敏感菌株XB02的生长受到明显抑制, 并产生大量的噬菌体, 培养液中噬菌体的浓度最高可达1005pfu/mL以上。而抗株Kp03、Kp14表现正常, 对试验浓度下的噬菌体P001具有明显的抗性。

2.4 抗噬菌体菌株的遗传稳定性

在噬菌体P001存在的条件下。对抗株Kp03、Kp14进行摇瓶种子培养和发酵试验, 考察了多次传代后抗株的种液OD值及发酵产D-核糖能力;结果表明抗株Kp03在种子培养及发酵中出现异常现象, 遗传稳定性差。而抗株Kp14在种子培养及发酵过程中均未出现抗性改变的现象, 具有较好的遗传稳定性, 镜检也未发现异常情况。

2.5 抗噬菌体菌株的发酵性能测定

按敏感菌株XB02的发酵条件, 在生产环境中噬菌体大量存在的情况下, 在50 L的发酵罐上对抗株Kp14进行了连续5批次的发酵试验 (表2) 。结果表明, 在发酵过程中, 抗株Kp14与敏感株XB02的正常发酵大致相同, 未出现受噬菌体污染的迹象。从产D-核糖能力上看, 抗株Kp14这5批次的平均发酵转化率达到了50.61%, 平均D-核糖产量达91.48 g/L, 平均发酵周期52 h, 与未受噬菌体污染的敏感株XB02基本相当。

结论

本文对D-核糖产生菌--枯草芽孢杆菌转酮醇酶变异株XB02抗噬菌体菌株的选育进行了研究, 通过紫外诱变得到了遗传特性稳定、发酵性能与出发菌株相似的抗株Kp14。但要把该抗株放心地用于工业生产, 还要对它的最适发酵培养基、发酵的工艺条件等进行进一步的研究。

参考文献

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产生菌株 篇3

噬菌体污染对发酵工业具有比较严重的危害性。它通常会导致发酵迟缓, 产、收率下降, 周期延长, 以致使生产成本提高, 给企业造成较大的经济损失。

针对噬菌体污染的现象, 常用的防治措施有:保持生产车间的环境卫生、严禁活菌体排放、轮换生产菌株、使用药物抑制等多种办法[1,2]。其中, 采用抗性菌株由于能够从根本上克服噬菌体对菌种的侵染, 又是一种较为经济有效的手段, 因而较易于为生产厂家所接受。然而, 抗性菌株却不可能从此一劳永逸地杜绝噬菌体污染的隐患, 故仍有必要坚持“防重于治”的原则。

某厂使用抗性菌株采用间接发酵法生产D-Vc数年后, 突然再次爆发了噬菌体污染, 车间生产几乎陷于停顿。为了迅速恢复生产, 我们对其生产菌株2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌Ac9作了研究。采用紫外诱变与自然选择相结合的方法, 我们获得了两株新的抗性菌株。在发酵培养基中添加噬菌体的条件下, 其产酸能力与原出发菌株在没有噬菌体存在的情况下大体相同。本文对此作了报道。

1材料和方法

1.1菌种和噬菌体

菌种:郑州市生物化工厂发酵车间生产菌株:2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌Ac9。

噬菌体:从某厂发酵车间已被噬菌体污染的发酵液中分离、提取、制备而成的噬菌体悬液。

1.2培养基

种子培养基 (%) :葡萄糖2.0, 玉米浆1.0, 尿素0.2, KH2PO40.2, MgSO4·7H2O 0.05, pH 7.0

发酵培养基 (%) :葡萄糖16.0, 玉米浆2.0, CaCO34.5, pH 6.7～7.0。

蛋白胨液 (%) :蛋白胨1.0, pH 7.0

肉汤琼脂培养基 (%) :牛肉膏0.5, 蛋白胨1.0, NaCL 0.5, 琼脂2.0, pH 7.0。

双层培养基 (%) :上层琼脂0.6, 下层琼脂1.8, 其余成分同肉汤琼脂培养基。

上述各培养基均采用高压蒸汽灭菌, 121℃, 15min。

1.3方法

1.3.1有关噬菌体的处理方法

噬菌体悬液的制备:取已被噬菌体污染的发酵液离心, 4 000r/min, 20min。将上清夜经微孔滤膜过滤除菌后, 即得噬菌体悬液。

噬菌体悬液稀释:以1mL无菌吸管取噬菌体悬液1mL, 注入含有9mL无菌蛋白胨液的试管内, 振摇试管混匀, 此为稀释度为10-1的噬菌体悬液;另换一支无菌吸管, 按前述方法操作依次作10倍稀释, 得稀释度为10-2的噬菌体悬液。依此类推得到更大稀释度的噬菌体悬液。

噬菌体扩增:将已制备好的噬菌体悬液适当稀释, 取适量接入已接菌株Ac9的种子培养基中, 31℃, 摇瓶培养24h。

噬菌斑试验:双层培养基法

1.3.2培养方法

斜面、平板肉汤琼脂培养基培养:31℃, 18～24h

种子摇瓶培养:250mL三角瓶, 装量20mL, 31℃, 265r/min (偏心距25cm) , 24h

发酵摇瓶培养:250mL三角瓶, 装量20mL, 接种量10%, 31℃, 265r/min (偏心距25cm) , 72h

1.3.3诱变筛选

(1) 将菌株Ac9活化斜面转接种子培养基, 31℃, 摇瓶培养12～14h。 (2) 取种子培养液5mL, 无菌离心, 4 000r/min, 20min, 去除上清夜, 用无菌生理盐水离心洗涤两次。 (3) 用无菌生理盐水制备光密度OD650为0.2左右的菌悬液。 (4) 使用30W的紫外灯, 相距20cm照射已制好的菌悬液。 (5) 分别选取不同照射时间 (15s, 25s) 的菌悬液1mL, 接入已加入1mL稀释度为10-2噬菌体悬液的种子培养基, 31℃, 摇瓶培养24～48h。 (6) 将已长好的种子培养液稀释涂肉汤琼脂平板, 31℃, 培养18～24h。 (7) 挑取在平板上长出的单菌落并用划线点滴法[3]初步测定其对噬菌体的抗性。将有抗性的菌株转接肉汤琼脂斜面培养基培养, 31℃, 18～24h。 (8) 将已长好的斜面菌种依次接种子培养基、发酵培养基, 摇瓶培养 (9) 测定发酵培养液中2-酮基-D-葡萄糖酸的含量 (10) 将产酸能力较高的菌株转接保藏斜面。

1.3.4分析方法

种子培养液中菌体生长量的测定:用蒸馏水将种子培养液稀释20倍, 以该蒸馏水作空白, 1cm比色皿, 使用721型分光光度计测定其在波长为650nm处的光密度。

发酵培养液中菌体生长量的测定:用0.2mol/L的稀盐酸稀释发酵培养液20倍, 以该稀盐酸作空白, 1cm比色皿, 使用721型分光光度计测定其在波长为650nm处的光密度。

发酵培养液中2-酮基-D-葡萄糖酸含量的测定:发酵培养结束以后, 往摇瓶内加洁净水, 使其体积达到初始体积的4倍。离心, 4 000r/min, 20min。取适量上清夜测定其旋光值, 再由此计算出2-酮基-D-葡萄糖酸的含量[4]。注意使样品的温度保持一致。

pH测定:采用国产精密试纸。

2结果与讨论

2.1出发菌株

Ac9对噬菌体的敏感性试验

将菌株Ac9活化斜面接种于数瓶种子培养基中, 再分别往其中添加稀释度为原液、10-2、10-4的噬菌体悬液各1mL, 31℃, 摇瓶培养24h。测定各培养液中的pH、菌体生长光密度, 并做镜检。以不添加噬菌体的培养液作为对照。结果见表1, 图1。

从表1可以看出, 菌株Ac9对噬菌体较为敏感稀释度为10-2的噬菌体悬液即对菌株Ac9产生较强的抑制作用。

图1为定时分别取添加了1mL稀释度为10-2噬菌体悬液的种子培养液和对照培养液, 测定其pH值和菌体生长光密度值, 并据此绘制而成的菌体生长曲线。

图1直观地显示了噬菌体对菌株Ac9生长的抑制作用。

2.2 抗性菌株的选育

经多次诱变、筛选, 初步得到47株抗性菌株, 选取其中产酸能力最高的两株菌株Au4-2与Af3。这两株菌株的产酸水平与出发菌株相近。

2.3 抗性菌株与出发菌株生长对比试验

将突变菌株Au4-2、Af3与出发菌株Ac9活化斜面分别接种于种子培养基中, 添加1ml稀释度为10-2噬菌体悬液, 31℃, 摇瓶培养24h。测定种子培养液中的pH、菌体生长光密度, 并作镜检。结果见表2、图2。

结果表明, 与出发菌株Ac9相比, 突变菌株Au4-2、Af3对噬菌体已产生了耐受性, 其在种子培养液中的生长不受噬菌体的影响。

2.4 抗性菌株与出发菌株产酸能力对比试验

分别将抗性菌株Au4-2、Af3与出发菌株Ac9活化斜面接种于种子培养基中, 31℃, 摇瓶培养24 h。然后以10%的接种量分别接入已添加1 mL稀释度为10-2噬菌体悬液的发酵培养基中, 31℃, 摇瓶培养72 h。另将这三种菌株的种子培养液以10%的接种量接入不添加噬菌体的发酵培养基作为参照。待发酵结束后测定发酵液中的pH、菌体生长光密度和2-酮基-D-葡萄糖酸的含量, 并作镜检。结果见表3。

由表3可知, 在发酵液中添加噬菌体的情况下, 对照菌株Ac9由于菌体的生长受到噬菌体的抑制, 已不能正常产酸;而抗性菌株Au4-2、Af3的生长则不受噬菌体的影响, 其发酵产酸的能力与对照菌株在不添加噬菌体的情况下水平相当。

2.5 抗性菌株的遗传稳定性试验

将抗性菌株Au4-2、Af3多次传代后, 再接入含有1 mL稀释度为10-2噬菌体悬液的发酵培养基中, 31℃, 摇瓶培养72 h。测定发酵液中菌体生长光密度及2-酮基-D-葡萄糖酸的含量。结果见表4。

由表四可以看出, Au4-2、Af3经多次传代后, 其产酸能力及对噬菌体的耐受性均无明显改变。

3 结论

本次筛选得到的两株抗性菌株Au4-2、Af3是优良的抗噬菌体2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌株。其在培养基中含有噬菌体的条件下, 产酸水平与出发菌株相近, 并且对噬菌体的抗性具有遗传稳定性, 因而完全可以作为新的生产菌株用于车间进行间接发酵法异Vc的生产。

摘要：以2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌Ac9为出发菌株, 采用紫外线诱变与添加噬菌体进行筛选相结合的方法, 获得了两株抗性菌株Au4-2和Af3。在种子培养基中含有噬菌体的条件下, 31℃, 摇瓶培养24h, 抗性菌株Au4-2与Af3的菌体生长光密度值OD650×20分别为0.74, 0.55。镜检显示菌体量多, 呈短杆状;而对照菌株Ac9的菌体光密度值则为0.14, 镜检显示菌体量少, 呈球状。在发酵培养基中添加噬菌体的条件下, 31℃, 摇瓶培养72h, 抗性菌株Au4-2与Af3产酸分别可达15.45g/100mL, 14.55g/100mL;而对照菌株则几乎没有产酸。

关键词：D-Vc,诱变,抗噬菌体菌株

参考文献

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[2]王福源.生物工艺技术.中国轻工业出版社, 2006:308—310

[3]余茂效, 那淑敏, 董扣洪, 等.微生物学报, 1986;26 (3) :232—237