动物细胞培养（精选11篇）
动物细胞培养 篇1
关键词：动物细胞培养,组织培养技术,研究
动物细胞培养技术在生物、医学等研究领域都有着广泛的应用, 动物细胞培养方式包括原代和传代培养。培养方式有贴壁、悬浮以及固定化培养等方式。动物细胞的生长除了要给细胞组织提供一个无菌、恒温的环境, 还要给予充分的营养。动物细胞培养技术有着很大潜力的开放空间, 前景光明, 但是它同时也面临着技术方面的诸多问题和挑战。本文将通过分析细胞喂养技术取得的进展, 探讨动物细胞培养存在的问题以及动物细胞未来的发展方向, 从而建立并筛选出合适的细胞系培养方法。
1 动物细胞培养的基本概念
细胞培养指的是从体内组织取出细胞, 并为其提供一个无菌、具有适当温度及酸碱度的环境, 给予充分营养, 使其生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。从体内取出的细胞进行的首次培养式细胞培养最初的阶段, 也称为原代培养。原代培养式细胞培养当中重要的必经环节。原代培养细胞生长到一定时候后, 由于受群体环境影响, 需要转移到另一个容器, 这种培养称为传代培养。传代后的动物细胞与原代培物形状一致的话, 则表示传代成功, 这些细胞称为细胞系或细胞株。
2 动物细胞培养技术的内容
2.1 体外培养动物细胞的生物学特性
动物细胞没有细胞壁结构, 机械强度低, 对剪切力较为敏感, 因此无法很好地适应体外环境。此外, 在体外进行培养的细胞失去了神经体液调节以及细胞间相互影响等作用, 她们不仅失去原有组织结构, 还不易保持原有细胞形态, 处于缺乏动态平衡的生活环境中, 分化能力也降低, 直至发展成为恶性细胞。因此, 在体外进行动物细胞培养应密切关注体外细胞的状态, 生长环境提供的条件是否适宜生存, 有无被微生物感染等。
2.2 细胞培养所需环境
(1) 无菌无毒环境无菌无毒的操作环境是保证动物细胞体外培养成功的前提。体外培养细胞面临着被微生物感染或受自身代谢物质影响的难题, 因此, 在进行体外细胞培养时, 要及时清除细胞产生的代谢废物, 确保为体外培养的细胞提供一个无菌无毒的生存环境。
(2) 气体环境气体主要是O2和CO2, O2可以给细胞提供能量, 而CO2不仅是细胞增殖所需的物质, 也是其自身的代谢产物, 此外, CO2还有着调节培养基p H的作用。
(3) 温度适宜的温度能够维持细胞持续旺盛生长, 若温度超出适宜温度范围, 不仅会影响到细胞的正常代谢, 损伤细胞, 甚至会使其致死。
(4) 缓冲环境缓冲环境的作用是为细胞提供一个酸碱度在培养细胞生理范围内的培养液, 提供水分和无机盐, 维持细胞的正常代谢。
(5) 培养基培养基分为天然培养基和合成培养基两种, 它是细胞生长繁殖的直接环境, 为细胞提供所需的营养。天然培养基是从动物体液或组织中分离提取获得的。血浆、血清以及淋巴液等物质都可作为天然培养基。动物细胞培养主要用的是合成培养基。合成培养基含细胞生长所需的无机盐、糖类、维生素、氨基酸等基本物质, 有特殊要求的还会添加适量血清。
2.3 细胞培养方式
(1) 贴壁培养对于那些具有贴壁依赖性的细胞一般使用贴壁培养的方式。一般这样的细胞需贴附于不起化学作用的物质的表面生长, 最终在表面生长至单层, 当整个平面被铺满时, 细胞会出现接触抑制的现象。
(2) 悬浮培养悬浮适应细胞、肿瘤细胞等非贴壁依赖性细胞不需要生长的支撑面, 细胞可悬浮于液体培养基, 并大量增殖。因此, 悬浮培养是大规模细胞培养的理想方式。尽管, 动物细胞培养当中存在着各式各样的困难, 科研人员还是会不断提高分子生物学的研究水平, 扩大研究范围, 因为动物细胞培养技术是多个学科研究领域当中重要的工具。
(3) 固定化培养无论是贴壁依赖性细胞还是非贴壁依赖性细胞都可用固定化培养方式进行体外细胞培养。固定化培养属于包埋培养方式, 目前已有的固定化培养方式包括微载体培养、中空纤维培养以及微囊发培养三种方式。固定化培养不仅剪切力较低, 传递效果较好, 而且还易于收集并分离纯化细胞产物。用此种方式培养的细胞也具有较强的抗污能力, 细胞生长较为集中, 生长密度也高。
3 动物细胞培养存在的问题及展望
近一个世纪以来, 动物细胞培养技术经过研究人员的不断开发, 已经有了很大的进步。但是, 目前的技术水平还无法彻底满足细胞生物制品开发和生产的要求。首先, 由于动物细胞培养的技术和方法还不太成熟, 细胞的成活率和利用率较低, 从而造成动物细胞技术效率较低的现象发生。其次, 在进行较长时间、较大规模的细胞培养中, 工作人员无法排除细胞代谢产物对自身的影响, 且细胞群体的生理机能也会在这个过程中受到影响, 一般会表现出分泌和代谢能力的降低甚至丧失。此外, 动物细胞培养技术所用的培养设备和培养用微载体耗费昂贵, 导致研究成本增加, 限制了我国大规模开展动物细胞培养的工程。
4 总结
动物细胞培养技术在未来的发展方向应将重点放在优化细胞环境, 改进细胞特性等方面上, 最终达到提高生物制品的产率和产量, 扩大生产规模的效果。尽管, 动物细胞培养当中存在着各式各样的困难, 科研人员还是会不断提高分子生物学的研究水平, 扩大研究范围, 因为动物细胞培养技术是多个学科研究领域当中重要的工具。在不久的将来, 许多生物实验材料和工业化生产都需要动物细胞培养技术来开展自身的研发工作。
参考文献
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动物细胞培养 篇2
动物细胞生产和培养过程
8.1背景
尽管先前有许多调查者研究了动物细胞在试管中的习性。但是。1949年，这种能产生有用物质的动物细胞首次被利用。在当时，J.F Enders 证明了脊髓灰质炎病毒在培养的动物细胞中可以生长，而这种细胞源于灵长类动物的神经和非神经组织中。
简洁的总接一下这一伟大的探索工作，开始与19世纪80年代早期。根据论证白细胞能在躯体外分裂。这种细胞是通过观察注入在血清、淋巴或腹水中以切成片状的动物组织所得。（1907年）Ｒ．Hａｒｒｉｓｏｎ的悬在下面的淋巴当中的（蝌蚪骨髓）组织方法。而这种盖玻片密封在一个中间挖空的载玻片上。这项伟绩（１９１３年）由Ｃａｒｒｅｌ所继承和发展。他研发了一种维持外来物质特别是细菌培养的复杂方法，其他人很少有这种能力，然而，截至１９２８年，培养基的发展促进动物细胞的增长以至于Ｍａｉｔｌａｎｄｓ能够在装有切碎的老鼠或小鸡胚胎的试管中培养病毒。ｅｎｄｅｒｓ在脊髓灰质炎的工作中运用此方法。脊髓灰质炎的作用是有他和他的同事通过使用抗生素获得相当多的帮助，这些抗生素在十年前是非常流行的，２０世纪５０年代早期Salk发明的脊髓灰质炎疫苗是由猴子的肾和睾丸细胞在试管培养中生产的。一旦这种技术被确立，培养中生长的小鸡或其他原始的胚胎细胞生产其他疫苗。【麻疹病毒（１９５８年）。流行性腮腺炎病毒（１９５１年）、腺病毒（１９５８年）】
８．２从动物细胞培养中获得的不同产物
动物细胞过去是现在仍然是从培养动物细胞中获得最具有商业性的产物，目前，每年生产大约１．５＊１０９剂量的口啼疾疫苗，近似于纽卡斯尔病和马立克氏病的家禽疫苗。人类病毒疫苗以每年１０８剂或者较低一点的速度在运用。干扰素生产的过程也是一大规模，接近或超过这些运用于兽医疫苗的情况下，然而有利于具体的合成杂交瘤细胞相对于免疫学方面是毫无疑问的，在未来的十年里是举足轻重的。表８。１中列出已经或者可能在培养动物细胞过程中获得的主要产物，这并不是唯一的产物，而是表现着主要产物以及能在这些区域内获得的物质的类型。
８．３产物生产方法的综述
图８。１到８。３概括的描述了对于动物细胞培养体系中产物的发展。它包括三个阶段，第一个阶段是准备阶段，第二阶段是动物细胞培养阶段，第三阶段是产物的产生阶段。早某种体系上（荷尔蒙和免疫生物产物）最后一阶段是区别于单元细胞的生产方式。然而在其它方面，最后一阶段跟病毒细胞培养的传染有关或与诱生剂有关。（如干扰素，见表８。３）
对生产经营的很多努力涉及到质量控制系统，与此同时，在线和离线检测在生物技术领域中随处可见。质量控制测试的设计不仅能够确保使用的物质能够促进细胞或产物的发展，还能确保他们摆脱外来的生体，例如，污染物
图表８。２清楚的表明生长培养基的准备工作是一项艰难而又需要专门的技术的过程，当培养基所确定的组份容易控制时，最有困难的两种组份是水和血清。
水可以从多种资源中获得，甚至蒸馏和去离子作用后，水也可能包含着对细胞生长不利的物质。对此，格陵兰冰岛底部所融化的病是一种很有用的参考物质，贮备水的缺乏带来一些困难。细菌能在室温蒸馏水中达到１０５单元的含量，同时远离组成的变量，这种细菌的产物少部分可能是有毒的，在８０C贮藏的水通常被攻克，在这个温度下表面将无菌。
也可以制备没有血清的培养基，但并非所有的细胞可以再生。然而这种细胞培养基的结合对密封材料的产生没有多大用处。
以去除免疫球蛋白成分的血清在病毒生产体系方面最有用这种病毒生产体系是通过当地生产的血清包含的对生产病毒的抗体的一种体系，虽然买的和做实验的血清的价格不菲，但是室内生产是有可能的，血清质量的控制的彻底性对可靠的重复运转是很有必要的。在零下２０C贮存预先测试的血清是经常可取的，因为他能够代替新鲜血清质量减退的这些时光，（通常夏天较容易）。牛胎血清经常被应用于细胞生长发面，但是牛胎血清既贵又罕见。带有噬菌体支原体这样的物质也是最可靠的。也能成批成批的管擦牛胎血清的生长特性，由于来自幼地鼠地肾的细胞，９０％利润从成年牛的血清也可以得到。动物细胞能生长在两种不同类型的培养基上，如果多数动物细胞首次被运用到表层或者固体基质。那么他们可以被诱导分裂，正好相反，一些可能在悬浮液中被诱导自由生长，前者被称为单层细胞，应为他们在基质上形成一层厚壁细胞，即使在连续培养的添加组织也能形成，依赖基质生长的细胞被称为是悬浮细胞或非贴壁依赖性细胞。
我们认为只是生长的单层细胞比悬浮细胞有特别少的致癌基因（能使细胞致癌的基因序列），因此对于人类的消耗，这种细胞被用于生产物质，多种也证明此种 细胞比在悬浮液中的生长的细胞有能力生成更多的病毒毒性。但是如病毒或是产物从悬浮生长的细胞生产制造，那么多数过程会相对容易些，兽医所使用的产物按这种方法所得（脚嘴病毒），同时也包括a-干扰素以及有关杂交瘤细胞的免疫学生物特性。尽管在选择测试体系方面，后两种产物所使用的细胞被证明是可以致癌的，但是在生产阶段不会有什么危害，或者是优先使用单位细胞的产物。在表8.2中，有一个对于单层细胞使用有利和不利条件的总结。我们可以得出结论，在细胞类型方面能够生产商业性细胞是很有必要的。并且也需要两种必要的但不同的技术，下面将陈述两种不同的技术。
8.4单层细胞培养系统
获取基质的生产细胞系统可以被划分为两种类型，一种是增加设备单元的数量以扩大进程；另一种是多重和过程。通过增加设备的尺寸来实现扩大
8.4.1单层细胞生长的多重过程
传统的来讲，固定的玻璃瓶或者是培养皿内已经生成了单层细胞，这种瓶子有许多结构，被命名为brockway，roux ,Carrel,Baxter或Medical Flats，钠玻璃可能被使用，但是硼硅酸盐会更受欢迎，因为他尽管越复杂，但越坚硬越容易修理。那玻璃瓶也许会单独使用，但是经常固定在搁架上便于运输。能够使细胞生长在瓶的内表面而不是瓶底的系统，它的发展同样是滚瓶系统的发展。尽管所使用的矩形瓶和十字型瓶也能够转动，但是对于这个系统，圆柱型瓶被广泛使用，有许多瓶子能够达到180cm长，滚筒上边放着瓶子，而这样的滚筒放在机械支架上。一套标准的设备可以转动12个瓶子，6~10套支架可以组成一个生产单元，在意大利布雷西亚的Zooprofilattico Sperimentale大学学院有7000个瓶子在每四个培养箱里可同时转动。再次，滚动瓶系统被发展到了极限，对于已大量瓶子为媒介的细胞和病毒的生长同时还要保持无菌培养，所以这种增长是很难克服的，布雷西亚单元高度的自动化装置提高了这种方法的经济可行性。
8.4.2单层细胞生长的单元程序
20世纪60年代中期，关于单层细胞的培养单元程序得到发展，同时单元程序的发展现在已变成一项易于接受的首选的实用技术。最近，其他方面的创始人重新检查了这一系统的许多细节，结果跟随最近的发展，不同的系统将在下边描述
根据可靠的成功的多重过程的运转，被设计取代他们的单元模式跟随多重系统的基本模式，这样，在器皿中的一套弹簧片单元程序得到发展，同时使人联想到一架子的瓶子，这样的系统有一次性的聚苯乙烯、聚碳酸酯和钠玻璃组成。后期的发展是采用一叠盘子同时以直接构造的形式转动他们，要么以水平的形式转动他们，后期系统正在扩大密集利用的情况下，目前作为B或纤维素细胞干扰素的一种方式，在清理与细胞培养运行期间，这种系统的扩大反映着一系列工程技术困难与操作问题，按照这种方式装入容器的表层数量很有限，却有两种结果：
（a）磁盘双方都被使用，（b）以稀释形式生产产物正如生长培养基冲洗过后，而培养基要么达到饱和程度，要么至少半饱和程度，总共达到外面容器的容积。从已经发展的大范围多试管细胞的繁殖，我们看到了滚瓶系统的发展，系统达到2001量的大规模发展，近期的一套细胞大量生长的设备，Gyrogen有一排平行的试管组成，这种试管是从1001的量结合外界圆柱形壳在外部力量的驱动下转动。这套昂贵的设备可用来生产，但是是否合理的利用能得到经济上有力的价值好没有被证实。半空纤维中的试管收缩是唯一导致生物量的发展。对小规模来讲，在外界纤维以细胞生长的方式刺激动物组织结构或者通过纤维腔来促使营养培养基的渗漏。这是非常有可能实现的，在两种意义上，这种系统有些优势，正如废弃物质（含有细胞毒素），和产物能够从细胞当中分开，这种细胞是通过纤维的半透膜产生的。最近，这种自然系统已经发展到了0.21，同时在良好的发展计算机控制和检测系统得到了商业化的应用和发展。
目前，为了细胞和产物的生产，许多项目组利用填充层，例如B干扰素，口蹄疫病毒和猪水疱病病毒。经过玻璃球瓶内的聚苯乙烯小白球随着弹簧不锈钢带的变化而变化，然而，伴随着大多数便利的集中在辅助培养基贮藏中控制活性（PH和二氧化碳），通过循环流动的培养基，最基本的填充曾在多数系统中是很普通的，他们相对容易和扩展，这是由于处理圆柱形填充的机械故障很容易得到排除处理，正如玻璃作为一种基质。操作的可靠性得到提高，同时实验室研究的 在玻璃表层和细胞之间的关系也没有改变，更愿意不来说，当在一个熟悉的基质中形成产品时，控制新的生物产品的生产者几乎没有多大问题。
很显然，静态填充床没有他们自己的问题。跨层的斜度是相同的，检测培养细胞有一些难度，但不能放在显微镜下观察。通过检测循环的培养基的成分，（细胞生长的葡萄糖浓度，细胞分裂的乳酸脱氢酶活性好最终病毒解体），尽管后边的问题容易处理，但是不均一的多项系统问题仍然存在。
A．J.van Wezel发展了对于单层动物细胞生长的同种系统。1967年它表明细胞以火胶棉镀膜能生长在0.2mm的葡聚糖纤维素A50颗粒上，凭借微小的搅动，这种颗粒可以成悬浮状态，相对密度为1.05，同时当系统从它本身的方式搅拌时，细胞可以吸附在这种为载体上，由于这些最初的观察，众多的观察者已经表明可以达到5001的量。生长在为载体上的细胞产生物质是有可能的。最新报告表明，来自非洲的猿猴肾细胞脊髓灰质炎病毒的产量是存在一个现代的为载体表面。其他为载体有聚苯乙烯、聚丙烯甚至是玻璃微球体。然而，在大多数情况下似乎葡聚糖为载体提供了最合适的基质。
众多研究者已经能够成功可靠的用为载体系统来操作，然而，有些研究人员的实验还有很大的困难，涉及到研究者所希望生成的特殊细胞任然有些困难。特殊细胞本身是集体组成的产物，以及他生成次生产物的方法问题。源于其他合适设备与不合适设备的不当使用以及培养基选择的不恰当问题上。这些选择阶段或者是细胞与玻璃粉。首次关键性的联合或者时候起贴壁细胞的可重复性。
总之，对于基质有要求的细胞的生产，在此环境下，微载体成为首选方法。而且操作良好并且可靠，但是玻璃球的填充层能够提供一个可靠的后补系统。其他系统也会有一定的位置，为准备一种独特的细胞类型能够生长和生产产物提供的特殊的环境。
8.4.3悬浮细胞的生产过程
悬浮动物细胞的培养过程不同于细菌的培养，一条近期的评论描述了许多需要检测和控制的参数，所使用的设备是一个有较低的搅拌和通风度相当标准的发酵器。把传统方法当作一个系统，并且此系统已经增大到8000L。来自于幼地鼠肾细胞货真不同细胞的用于口啼疫病毒的商业产物，如此规模得益于仓鼠，也就是所谓的2FFA-3.同样，有Nsmalwa淋巴细胞所产生的a-干扰素，目前以同样的规模的相似设备来生产。搅拌驱使系统的最基本的修改等同于气升式发酵罐的运用。通过在发酵罐底部引进气泡来提供三料的混合。因为这些在移动也提上是非常有效的而且不会破坏细胞。传统的喷射会对动物细胞引起严重的破坏，这种喷射通过产生一些小的气泡试图增加气泡的表层区域的面积。溶氧水平在标准状况下本身下降15%一下或者上升到溶氧量以上才会有害。但在气液接口处的相互作用的细胞可能会导致细胞活性的损失。令人惊奇的是，起因于叶轮的飞快的速度造成的物理搅拌似乎没有多大伤害，然而，对于相关参数的效应和数量的研究中需要被保留着。
当传统的的不锈钢槽作为科技的主导时。科技不发达的国家可能会修改一些系统。对此通过外磁条力量来驱动，101搅拌瓶可以制造出许多有用的疫苗，（每年均有5*106剂）。印度尼西亚的泗水市安装了此系统。在此地，每个月将产生250000剂疫苗。同样Polgolla和斯里兰卡基本设备的安装也很到位。
生产细胞还是为这些细胞收集信息，动物细胞的连续培养是可行并且有用的方式。最近研究已经表明了在系统的计算机在线监测和控制的优势。购买相应的计算机硬件设备也比较容易。
然而动物细胞的连续型生产利用以及具有商业吸引力的细胞产物还，没有实现。
8.5后期过程
当动物细胞应用于原材料生产时，许多后期过程等同于蛋白质化学技术的其他领域。仍然考虑到存在些更多的独特细节的操作系统。例如，过滤、筛选操作，离心分离操作（适速），沉降操作，包析发的层析操作以及浓缩干燥（反渗透法），这些普通的加工技术很难应对，生物病毒物质的钝化，整个病毒颗粒活性子单元的产生以及用于有用物质的形成具有划时代意义。而这种划时代是以动物细胞为根据的独特的处理工程。
8.5.1钝化作用
尽管许多疫苗是由易感染的病毒粒子形成，但是一些被杀死或钝化。钝化在确保接受着没有没有危险是非常重要的，钝化药物通常使用甲醛，然而用B—丙醇酸内酯来钝化狂犬病毒。进来。用亚胺（乙炔和吖丙叮）来钝化脚口疾病病毒。然而亚胺会使脚口疾病病毒的结构发生轻微的变化。甲醛与衣壳体交联形成更稳定的结构。其他钝化法的紫外线辐射和缩水甘油醛，在所有钝化方法中，确保钝化的病毒具有单分散性是非常重要的，以至于失活剂不能阻止病毒在中型团块中有效的钝化。
8.5.2亚基的形成
病毒疫苗必须考虑接受疫苗者的危险，如果不适当的钝化可能会形成亚基。依靠亚基的裂解最终将会形成一小部分致疾病的病毒。能够形成亚基的病毒有狂犬病毒，肝炎病毒、单纯性疱疹、巨细胞病毒和流感病毒。近来，尝试从流感病毒中分离血凝素糖蛋白免疫原表明疫苗的有效性了、，尽管有效性和天然病毒不同，到目前为止，研究表明从病毒中分离出的糖蛋白的竞争性比原始病毒低。但当足够的材料管理可以得到足够的保护反应。8.5.3产品配方
活的病毒疫苗通常包含1~4种不同类型的病毒。每剂有10活性病毒，有些材料需要冷冻干燥保存再生物保护剂中像流感病毒，人或牛的牛痘病毒或血清蛋白谷氨酸盐和磷酸盐离子。另一方面，杀死的病毒疫苗大约10为一剂.这些混合物被称为佐剂，佐剂有强效的生物免疫原特性。佐剂的化学组成是不均等的，像强心苷、皂素、各种铝盐（氢氧化物，硫酸盐。磷酸盐）和一些确定的油脂，与水中悬浮的病毒均匀的发生生物交联结合形成水油乳状混合物。油水乳状物在含有去垢剂的无机盐水溶液中经过第二次乳化作用。这些物质的作用许多是一致的，他们促使身体和化学免疫系统最大速率合成大量的有用抗原。
8.6 基因工程动物细胞和细菌
在原核细胞和真核细胞中插入确定的核酸序列的能力对于细菌和动物细胞具有很广泛的意义。作为一种产物，蛋白质能够插入特定的核酸。而基于动物细胞的活的病毒疫苗形成过程不可能取代基于基因工程细菌的过程。这是清楚的，一些动物细胞生产的胰岛素和一些α-干扰素商业上用原核生物生产。另外一些像用于口蹄疫病毒
有关动物细胞核移植过程的思考 篇3
人教版普通高中课程标准实验教科书《生物·选修三》——《现代生物科技专题》47页给出的动物细胞核移植的观念为：动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。用核移植的方法得到的动物称为克隆动物。同时，教材48页还以图解的形式提供了克隆牛的培育过程（具体过程略。请参照此教材48页《体细胞核移植过程流程图》）。
核移植的概念强调的是核的移植，但在操作过程中却是将供体的细胞植入了受体细胞——去核的卵母细胞。上课时有学生就提出了此问题。其实我在备课的时候也想到了，但没有深究，过后就给忘了。哪想在我校高三（2）班上课时，有个别同学在课堂直接就提出来：体细胞核移植过程和概念不符，是不是错了？我强调：“概念肯定没有错的，大学教材也是这么定义的，此操作过程中之所以将整个受体细胞注入是为了提高成功率。”其实在内心深处，我说这句话的底气是不足的，我为自己没有认真研究教材而感到惭愧。
上完高三（2）的课，我就马上查阅相关资料，研究此问题。首先我们看一下克隆羊多利的培育过程：
“多莉”绵羊是如何“创造”出来的呢？Wilmut等学者先给“苏格兰黑面羊”注射促性腺素，促使它排卵，得到卵之后，立即用极细的吸管从卵细胞中取出核，与此同时从怀孕三个月的“芬多席特”六龄母羊的乳腺细胞中取出核，立即送入取走核的“苏格兰黑面羊”的卵细胞中；手术完成之后，用相同频率的电脉冲刺激换核卵，让“苏格兰黑面羊”的卵细胞质与“芬多席特”母羊乳腺细胞的核相互协调，使这个“组装”细胞在试管里经历受精卵那样的分裂、发育而形成胚胎的过程，然后，将胚胎巧妙地植入另一只母羊的子宫里进一步发育。Wilmut等人一共进行了277次这样的乳腺细胞移植实验，获得29个发育为8细胞的“胚”，分别移植入13头代孕母亲的子宫中。1996年7月5日，原始记录为6LL3的羊羔出生了，它被命名为“多莉”。
通过克隆羊的培育过程我们确实看到在此过程中是将供体细胞的细胞核植入了受体的去核卵母细胞（以上材料来自百度百科——克隆技术——克隆多莉羊）。
我们再阅读下面的来自《基础生命科学》第二版197页有关“克隆羊培育过程”的部分文字：将来自一头6岁的白色芬兰母羊（核供体）的冷冻乳腺上皮细胞取出，并进行营养限制性培养。然后通过电脉冲技术使芬兰母羊乳腺细胞中的细胞核释放并融合进入到去核的苏格兰黑面母羊卵细胞的细胞质中。电脉冲还进一步刺激了这种重组卵细胞一周内分裂了3次，形成8细胞的“胚”。8细胞的“胚”最后被植入另一头苏格兰黑面母羊（代孕母亲）的子宫内进一步发育。
通过这些资料显示，可见在克隆羊的培育过程中确实是将受体细胞的细胞核取出后，再植入了受体细胞中的，这对体细胞核移植的概念做了非常完美的阐述。但这并不意味教材48页《体细胞核移植过程流程图》或克隆牛过程中将供体细胞（不是细胞核）通过显微操作注入受体细胞不符合体细胞核移植的要求。
其实，科学家按供体核移植入受体细胞（即卵母细胞）的部位不同，可将核移植分为：胞质内直接注射法和透明带下注射法。胞质内直接注射法是用注射针（直径约为10um）吸取供体核，然后直接刺破去核的卵母细胞的细胞膜，将核注入，完成核移植。但是，这种方法对卵膜和胞质的损伤比较大，容易造成卵母细胞的死亡，故目前多采用后一种方法。透明带下注射法即用注核针将完整的核供体细胞注射到透明带和去核卵母细胞之间的卵周隙中，使之和供体细胞和卵母细胞质膜接触，然后用电脉冲刺激诱导其进行融合，使供体核进入受体细胞，形成重组细胞。这种方法的优点是，可避免对卵母细胞膜和胞质的损伤，提高重组胚的存活率。
可见，教材48页体细胞核移植过程是对体细胞核移植概念更准确、更深刻、更全面的阐述。因此在具体教学过程中可对教材进行适当的拓展和延伸，有助于学生对体细胞核移植的准确理解。
通过对教材体细胞核移植概念和过程的探究，我得到的启发是：难点、疑点最怕的就是研究，只要你能沉下心去研究教材、研究知识，你的课堂永远是精彩的。同时，作为知识的传播者，不断地更新知识，紧跟时代步伐，才是你知识文库永葆青春的法宝。
动物细胞培养技术教学实践与探索 篇4
通过大量的问卷调查和日常接触,我们发现医药专科生普遍存在理论基础差,底子薄,并且学习积极性不高的特点。根据学生的这个特点及我们培养应用型人才的培养目标,在实际教学过程中,我们采取以学生为主体设计来设计课程,倡导自主、合作、探究的学习方式。教学主要根据专科层次的专业设计特点,特别强调理论知识与对应的细胞培养操作技能关联学习,通过课堂教学活动的组织和教学评价强化学生的技能。
1 理论和情景教学相结合的课程设计
基于动物细胞培养的工作过程,按照动物细胞培养的工作任务结构,本课程主要设计了三个方面的内容,即动物细胞培养的仪器设备设施条件,动物细胞培养的基本技能,药学细胞工程常见技术。本课程在学生学习了《药用基础化学》、《有机化学》、《医学基础》、《微生物学基础》、《基础生物化学》和《生物药品》等课程之后开设,目的是使学生有了一定的生物学基础知识和相对扎实的化学基础知识和操作技能之后,能更好地完成本课程的学习要求。
没有理论指导的实践是盲目的、不规范的,因此医药专科生在学习细胞培养技术之前,必须先学习理论知识。传统的学习方法是先进行理论教学,后穿插进行实验教学。我们针对医药专科生理论基础相对薄弱,学习能力欠佳的特点,没有采用传统的教学方法,而是采用理论和情景教学相结合。对理论内容进行精心选择,紧扣实验的需求和工作中应用的需要,在实验技术上注重基本技能的培养和常见技术的实践。同时按照动物细胞培养的特殊要求,我们设计了循序渐进的7个学习情境:(1)常见细胞培养实验室的布局;(2)细胞培养主要仪器设备的操作;(3)细胞培养用液的配制;(4)无菌操作技术及细胞培养无菌器材的准备;(5)细胞培养的基本操作,包括传代培养、克隆化培养、原代培养、扩大培养;(6)细胞大规模培养与生物反应器技术;(7)细胞冻存与细胞复苏技术。对于每一个学习情境,我们采取理论和实验教学并行的模式,对于基本的实验技能如显微镜的使用、传代技术及细胞计数技术等我们鼓励学生发挥卖油翁的精神,反复操作直至技术娴熟。
2 实验教学活动的组织
2.1 课前准备
在上课前写好板书,将本次情景学习的重点部分写在黑板上。这样做一方面可以让学生在课前很快了解本堂课需要掌握的知识,并对即将展开的情景学习设置一些相关的问题,如“动物细胞培养液的主要成分是什么?”、“为什么培养前要将细胞分散成单个细胞”等,让学生带着问题和思考进入学习,在实验中更好理解和学习知识,避免对知识死记硬背,达到情景教学的目的。
2.2 教学过程组织
2.2.1 固定分组
从第一次实验就要进行固定人员的分组,这样有利于配合和相互协作,也有利于锻炼团队协作能力。每小组的人员不宜太多,2~3为宜,统筹规划实验流程,高效完成实验内容。根据当堂的实验,教师提前统筹安排好各组成员的任务,使实验有序高效地进行。对于有些不需要相互帮忙的实验尽量安排一人一组,目标是通过本课程的学习,每个学生都具备独立完成相应实验操作的能力。
2.2.2 实验演示
实验课是需要学生自己动手操作来完成课堂的内容,学生的操作是否正确,很大程度上取决于教师的指导,因此教师必须做好示教。首先有教学经验很丰富的教师来担任主任课老师;其次要求任课老师在上课之前对内容了如指掌,参加集体备课,统一带教标准,明确教学重点、难点;最后根据教师在企业挂职和走访经验,在示教过程中强调标准化操作流程(SOP),将实验的标准操作步骤和要求以统一的格式描述出来,指导和规范日常的教学工作。
2.2.3 学生操作
在教学过程中,教师放手不放眼,全程观察学生的每一个操作过程,鼓励学生大胆细心操作,遇到问题要自己先仔细思考。经过一些实验的训练和尝试,同学们操作技能有了很大的提高,同时思考问题的方式也有了较大的转变,由原来不会直接问老师“这要怎么做?”转变成了自己思考后问老师“我这样做对吗?”。
2.2.4 操作考核
在七个教学情境中,我们选取了传代培养、克隆化培养及冻存与复苏等实验进行操作考核。传代培养考核主要考核学生的无菌操作能力及细胞消化、吹打和计数的综合能力,具体要求学生连续传代2个月的时间,最后根据学生传代细胞的培养状态(有无染菌、死细胞多少等)进行评分;克隆化培养考核除了考核学生细胞计数、消化和吹打等技能之外,还考查学生实验设计和计算能力,最后根据单克隆孔的多少进行打分;细胞冻存和复苏实验除了考核无菌操作和细胞计数之外,主要考核学生实验任务的组织能力、操作手感及冻存液配制能力等,最后通过自己冻存细胞的复苏存活率进行考核。动物细胞培养对生物制药专业的学生来说是一门非常重要的技术,只要是技术都免不了要反复的联系,我们以任务驱动的模式让学生反复练习其中最基本的技能,并通过考核来检验他们的学习成果,同时如果学生不满意自己的成绩还可以在课程开设期间重新参加考核,通过这种方式,让学生真正掌握细胞培养的基本技能,养成良好的实验习惯,为他们从事相关工作打下扎实的基础。
2.2.5 课后总结
动物细胞培养技术这门课程是实践性非常强的课程,实验结束后学生都会有自己的操作体会,还会有相应的实验结果,细胞培养的结果我们要求学生倒置显微镜拍照后提交到教师机,其他具体的实验目的、原理、试剂材料、步骤、结果及分析等内容则要求写成实验报告,教师对学生的实验结果及报告进行批改,并对有问题的地方进行标注。最后,对于一些共性的问题下次课上课前进行统一的点评,是学生对相应的操作有更好、更深的理解。
3 教学评价
多元化评价是指对每组或每位同学的实验课成绩考核多元化,既要通过课前预设计实验和课后的实验报告等纸质材料反映,也要通过多种手段和途径对学生的身心素质、专业知识、专业技能和个性特长等方面进行全方面的评价,其目的是促进学生的全面发展。动物细胞培养考核主要包括平时常规评价和过程与结果评价两部分。平时常规评价注重学习态度、考勤和随堂问题回答,占总成绩的20%;过程与结果评价包括三部分:(1)实验操作手法、实验结果与实验操作考核占总成绩的30%;(2)实验报告占总成绩的20%;(3)期末考核占总成绩的40%。
4 结论
实验课和其他实践教学环节是高校培养学生掌握实践技能、形成良好的工作习惯的必要过程,因而必须重视实验教学活动。上述动物细胞培养技术的课程设计、课堂组织和教学评价,目的使医药专科生掌握了基本的理论知识和操作技能,将企业的标准化操作流程灌输到学生的学习过程中,为学生在就业后尽快上手奠定了良好的基础。
摘要：动物细胞大规模培养技术已成为生物制药生产、研究和开发过程中一项非常重要的基本技术。探索从医药专科生的实际出发,围绕培养应用型人才的目标,从课程设计、课堂教学活动的组织到教学评价三个维度一体化教学实践,使学生掌握相关理论知识的同时,强化学生操作技能。
关键词：细胞培养技术,情景教学,操作考核
参考文献
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[2]朱庆虎,秦红丽,陈弘等.动物细胞大规模培养技术[J].专论与综述,2010,(9):8-9.
[3]余豪.提高研究生《动物细胞培养技术》实验课教学质量的思考与探索[J].西北医学教育,2012,(8):714-716.
[4]马辉,赵序永,王永芬等.高职动物细胞培养技术课程教学改革实践[J].郑州牧业工程高等专科学校学报,2011,(5):55-56.
[5]袁雅红,李东升.细胞培养技术教学实践与思考[J].求知导刊,2015,(20):137-138.
动物细胞工程教案 篇5
【教学目标】 1．知识目标：
1.1简述动物细胞的培养过程、条件及其应用； 1.2简述克隆动物的概念含义和基本原理
1.3简述体细胞核移植技术和动物克隆技术，以及应用前景 1.4简述细胞融合的方法过程和单克隆抗体的制备过程应用 1.5关注克隆技术的伦理问题。2．能力目标：
2.1通过阅读、自学、质疑、讨论、总结等环节，提高获取知识、分析问题和解决问题的能力
2.2由植物体细胞杂交技术导出动物细胞融合过程，培养学生的知识迁移能力和思维能力
2.3通过设计单克隆抗体的制备过程，使学生了解生物科学认识模式发展学生的创造性能力。3．情感态度与价值目标：
3.1 初步培养学生探索、创新和合作精神
3.2 明确知识不断更新并向前发展，认识到学无止境，形成终生学习的意识。
【教学重点】简述动物细胞的培养过程；举例说出细胞融合和单克隆抗体；关注克隆技术的伦理问题。
【教学难点】动物细胞培养过程；细胞融合技术和单克隆抗体的制备。【教学设计思路】 采用自学、指导模式对动物细胞培养技术进行较深刻、透彻地学习，这部分内容主要是解决三个问题：（1）为什么要进行动物细胞的培养？（2）什么是动物细胞的培养？（3）怎样进行动物细胞的培养？第三个问题是本节课的重点。关于动物细胞的培养过程，教师可参照教材中的动物细胞培养过程示意图进行讲解，讲解中要注意区分原代培养和传代培养这两个概念。对于动物细胞培养的条件，则要从学生已有的内环境的知识出发，启发学生自己动脑思考这个问题，以加深对培养条件的理解。为学习其他动物细胞工程打好基础。在动物体细胞核移植技术及克隆动物的教学中，可首先让学生列举所知道的克隆动物，调动学生已有的知识。随后可向学生提问：克隆动物的方法与植物组织培养一样吗？然后向学生说明目前动物体细胞克隆是通过核移植技术来实现的，以引入本节的主题。关于核移植技术发展简史，可让学生在课堂上阅读，本节的重点和难点是在动物体细胞核移植技术过程，教材中选用了 “多利羊”为例，来说明体细胞核移植的过程。教师应充分利用和挖掘教材内容，带领学生一步步弄清动物体细胞核移植技术的过程。对于体细胞核移植技术的应用前景和存在的问题这部分内容，可结合本节教材“积极思维”中的有关问题，让学生讨论。在细胞融合和单克隆抗体的教学中，教师启发学生回忆植物体细胞杂交过程；通过新旧知识对比，引导学生大胆推测动物细胞融合过程，培养学生知识迁移能力，并通过课件演示细胞融合的全过程，加强教学的直观性，培养学生的观察、思维能力。教师要讲明动物细胞融合技术的意义和应用，以便自然过渡到单克隆抗体上来。关于单克隆抗体的教学，教师要利用好教材提供的材料，突出从问题入手的思路，先介绍医疗实践中仅靠细胞培养难以获得大量抗体，然后，一步一步启发学生讨论怎样解决这个问题。要把科学家在研制单克隆抗体过程中，通过大胆的想像，创造性地解决问题的过程作为本节教学的重点和亮点，使学生在获得单克隆抗体知识的同时，受到创新精神的教育。【教学课时】二课时 【教学过程】
（一）导入新课 图片展示:克隆羊“多利”的复制品 投影：新华网
克隆羊多利重生 这4只克隆羊在遗传上与多莉毫无差异。多莉诞生于14年前，是第一个使用成熟细胞克隆的哺乳动物。克隆羊多莉(Dolly)已经获得“重生”。最初进行此项克隆研究的英国科学家又培育出4只克隆羊，被形象地称之为“Dollies”(多莉的复数)。它们是多莉的复制品，在遗传上与多莉丝毫不差，多莉在7年前离开这个世界。
问题导入
师：克隆羊“多利”的重生，采用的是什么技术？ 生：细胞工程技术？
师：动物细胞工程技术到底是干啥的？下面请同学们带着以下问题阅读与总结：（阅读课本P53,回答）
一、动物细胞工程：
1、主要理论依据？ 2技术手段？ 学生：1.细胞生物学 分子生物学
2.①动物细胞和组织培养 ②细胞核移植③体细胞克隆④细胞融合⑤单克隆抗体制备
3.①探索并改造生物的遗传特性，②大量培养细胞。
师：动物细胞与组织培养是细胞工程的基础，它开始于20世纪初期，那么动物细胞与组织培养主要是指什么？请读课本P53-54,完成以下内容。
二、动物细胞与组织培养：
1、概念： ①材料：取自 ； ②场所： 模拟动物体 ；
③条件：在、和 等条件下； ④目的：
使
动
物
细
胞
或
组
织
继续。
学生：①动物胚胎或出生后不久的幼龄动物的器官或组织
②体外 体内环境 ③无菌 温度适宜 营养充足 ④生长、增殖并维持原有结构和功能
师：动物细胞与组织培养是指在体外模拟动物体内环境，将动物体细胞或组织，在无菌、温度适宜和营养充足条件下培养，使其继续生长、增殖并维持原有结构和功能的技术。那么请同学们思考并讨论一下问题：（投影展示）
1、动物细胞培养的原理是什么？
学生：
1、细胞增殖
2、为什么要取动物胚胎或出生后不久的幼龄动物的器官或组织进行培养？
学生：因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强。一般幼体细胞比老龄细胞易培养，分化程度低的细胞比分化程度高的细胞易培养。
3、动物细胞体外培养需要满足哪些条件？ 学生：①无菌、无毒的环境：（添加一定量的抗生素；定期更换培养液，以便清除代谢产物。）②营养物质(引导学生引导学生引导学生引导学生区分天然培养基与合成培养基区分天然培养基与合成培养基区分天然培养基与合成培养基区分天然培养基与合成培养基)（无机盐、葡萄糖、氨基酸、核酸、维生素、动物血清等。）③温度和pH：37℃, 7.2-7.4 ④气体环境： O2和CO2（95%空气和5% CO2）
4、组织分散成单个细胞的方法是什么？ 学生：用胰蛋白酶处理。教师补充：动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。
5、能够用胃蛋白酶代替胰蛋白酶吗？为什么？ 学生：不能，因为动物细胞培养适宜的pH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。投影展示：动物细胞与组织培养过程
示
意
图
10代细胞 教师：：：： 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁生长当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
思考：细胞发生接触抑制后如何使细胞继续分裂增殖？ 学生：将原代培养的细胞分离稀释后转入新的培养瓶中继续培养，称为传代培养。
思考：传代培养的细胞能一直传代下去吗？
细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40～50代，这种传代细胞为细胞株。
细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。教师引导学生总结动物细胞培养过程。
过渡：动物细胞培养能否像植物组织培养那样最终培养成新个体？我们来一起比较一下这两个过程：比较项目 植物组织培养 动物细胞培养 因此，目前还不能用类似植物组织培养的方法获得完整的动物个体，用动物体细胞克隆的动物，实际是通过核移植来实现的。
三、细胞核移植与动物体细胞克隆: 读课本P54-57,完成以下内容。
1、体细胞克隆： 是将供体 的细胞核与受体去核 的细胞质进行，借助于 的发育能力，经过培养发育成 进而形成 的技术。其关键是。
学生：细胞核 卵细胞 人工组合 卵细胞 胚胎 个体 细胞核移植技术
2、细胞核移植： 是一种利用 将某种动物细胞的移入
或
动物的去除细胞核的成熟 内的技术。
学生：：：：显微操作技术 细胞核 同种 异种
3、展示克隆羊“多利”产生过程归纳克隆流程： 供体细胞 →
①
-------→ ③------→ 早期胚胎------→ 代孕动物 受
体
细
胞
→
②
-------→ 克隆个体
学生：细胞核 去核的卵细胞 融合的细胞
问题：1）、上述多利羊的成功培育过程表明了什么？也反映出了什么问题？
学生：动物体细胞核具有全能性。许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，脏器缺陷，免疫失调等。
2）、书上说治疗性克隆和生殖性克隆的大讨论，你有何观点，请说出来。你认为生殖性克隆会带来哪些伦理上的问题？（发散思维）3）克隆个体性状与亲本性状的关系怎样？ 学生：克隆个体性状与供核亲本性状一致。
4、意义：在克服动物、创造 等方面有重要意义。
学生：种间杂交繁殖障碍 新物种
5、应用① ；② ； ③ 等。
学生：①利用克隆技术大量复制实验动物，减少实验误差；②利用异种动物借腹妊娠挽救珍稀动物 ；③利用患者自身的细胞培育新的组织和器官以治疗疾病。
四、细胞融合与单克隆抗体：读课本P57,完成以下内容。
（一）细胞融合：
1、概念：指在一定的条件下将 或 细胞 为 的过程。
2、结果：形成，如。
3、原理：
学生：
1、2个 多个 融合 一个细胞
2、杂种细胞 鼠—鸡、鼠—猴等
3、细胞膜具有一定的流动性
4、物理法、化学法和生物法
5、制备单克隆抗体 动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：：：： 植物体细胞杂交（获得杂种植株）动物细胞融合（制备单抗）原理 融合前的处理 促融方法 意义和用途 过渡：何为单克隆抗体？
（二）单克隆抗体：：：：读课本P58-59,完成以下内容。
动物细胞培养 篇6
教师设问：展示番茄马铃薯植株，请问该植物体通过什么完成？
生：植物体细胞杂交。
师：回顾必修1：1970年，有两位科学家做了一个人—鼠细胞的融合实验，以证明细胞膜上的蛋白质分子是运动的。那么，如何实现人—鼠细胞的融合，以及动物细胞融合后还有什么用途呢？今天我们一起学习动物细胞融合和单克隆抗体。
探究一：动物细胞的融合
师：问题1：植物体细胞杂交的过程是怎样的？
问题2：动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？
生：先用酶去除两种植物细胞的细胞壁，使之成为原生质体，再用物理或化学的方法，诱导两种原生质体融合成杂种细胞，最后用植物组织培养的方法把其培育成新的植物体。
请阅读P52第二段找到动物细胞融合的概念。
师设问：动物细胞融合是怎么一回事？
生：动物细胞融合，也叫细胞杂交，指的是两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。
师：动物细胞融合的基本原理与植物原生质体融合的基本原理是否相同？
生：应该相同。
师：对，动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同，那么动物细胞融合的具体过程是否也和植物原生质体融合的过程一样呢？
生：应该基本一样吧？
师：植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？
生：物理法、化学法。
师：动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？
生：生物法：灭活的病毒。
师：灭活的含义？融合的原理？详读生物资料卡寻找答案。
生：因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
师：思考1：不灭活的病毒能做诱导剂吗？
生：不能，因为不灭活的病毒会感染细胞，而不能诱导细胞融合。
师：回答得非常好！从示意图中我们可以看出，把两个不同的动物细胞放在一起，用灭活的病毒处理细胞后，它们就先质融合，再核融合，进而形成杂交细胞，这个细胞有丝分裂后仍能形成两个完整的杂交细胞。刚才我们是用两个动物细胞，那在实际中我们用多少个动物细胞合适呢？
生：多个。
师：为什么用多个呢？如果有很多个杂交细胞，那么如何处理呢？这个问题大家下去后讨论一下。在弄清楚动物细胞融合的原理和过程后，还需说明的是任何一项技术的发现，都不是凭空产生的，必定有一个发展的过程，下面我们阅读课本P52中的小字，了解动物细胞融合技术的发展简史。
思考2：两两融合后可产生几种杂交细胞？
生：两种，自身融合，非自身融合。
师：意义：打破生殖隔离，使远缘杂交成为可能；广泛应用；制备单克隆抗体。
物种间由于存在生殖隔离使得有性杂交方法有局限性，而细胞融合技术能打破生殖隔离，使远缘杂交成为可能。
正因为如此，细胞融合技术已广泛应用于细胞学、遗传学、免疫学及生物新品种培育等领域，但此技术还有一个十分重要的用途，就是制备单克隆抗体。那么单克隆抗体是什么呢？与克隆、抗体有什么关系呢？下面我们就共同学习单克隆抗体。
探究二：单克隆抗体制备原理
师：在弄清什么是单克隆抗体之前，我们先回顾抗体的基础知识，思考1：传统的抗体生产方法及缺陷是什么？抗体是从何来的？请同学们在阅读课本P52的最后一个自然段的基础上，讨论这个问题。
生：传统的抗体生产方法是向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需要的抗体。这种生产抗体的方法产量和纯度都很低，而且制备的抗体特异性差。
师：回答得很好！下面我们再来讨论第二个问题2：抗体是由上面细胞产生的？B淋巴细胞有什么特点？请同学们继续阅读课本P53第一自然段，讨论并回答这个问题。
生：B淋巴细胞能产生抗体，但每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。
师：很好！根据B淋巴细胞的这个特点，若要想获得大量的单一抗体，则如何做呢？
生：克隆细胞群。
师：阅读教材P53，找出单克隆抗体的概念。
生：单个效应B淋巴细胞克隆：无性繁殖。
概念：单个效应B淋巴细胞克隆形成细胞群，细胞群产生的化学性质单一、特异性强的抗体。
师：一个B淋巴细胞不能无限增殖，科学家是如何解决这一问题的呢？阅读P53，两位科学家的设想是什么？
生：科学家的设计方案：
一种效应B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 骨髓瘤细胞能无限增殖
活动探究三：单克隆抗体的制备
师：设问1.注射特定抗原的目的是什么？
生：使小鼠脾脏细胞中产生特定抗体的效应B淋巴细胞。
师：设问2.从小鼠脾脏中分离效应B淋巴细胞是一种还是多种？
生：是一系列效应B淋巴细胞B1B2B3……
师：设问3.诱导细胞融合的手段有哪些？
生：离心、振荡、电刺激、PEG、特有的灭活的病毒。
师：设问4.若细胞两两融合后，有几种融合情况？处理后的细胞种类有几种？
生：三种：BB、B瘤、瘤瘤。
五种：BB、B瘤、瘤瘤、B、瘤。
师：设问5.第一次筛选的目的是什么？阅读P54第五行。
生：筛选出杂交瘤细胞（一系列的多种杂交瘤细胞）。
师：设问6.第二次筛选是为什么？具体如何实现克隆化培养和抗体检测？
生：第二次筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
师：详细讲解抗体检测及克隆化培养（拓展）
通常用“有限稀释法”选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那么上清液可与特定X抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，可能既有能产生特定抗体的杂交瘤细胞，又有其他杂交瘤细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。
该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。
经过多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
活动探究四、单克隆抗体的应用
师：1.单克隆抗体最主要的优点是什么？
生：特异性强、灵敏度高，可大量制备。
2.单克隆抗体的应用有哪些？
（1）诊断试剂——最广泛应用
在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等，与常规抗体相比，具有准确、高效、简易、快速的特点。
（2）治疗疾病和运载药物
主要用于治疗癌症，单克隆抗体作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”，准确杀伤癌变细胞。
“生物导弹”=单克隆抗体+药物
优点：疗效高、副作用小。
动物细胞培养 篇7
常规培养动物细胞的方法是用人工合成培养液加上一定量的小牛血清, 将细胞放在不同的容器中进行培养, 如微孔板、培养皿以及各种培养瓶等。一船培养容器的体积很小, 最大培养体积为1~2L。用这种方法培养的细胞所分泌或产出的产物是有限的, 无法满足实验研究、应用研究和产业化生产的需要, 而且容易导致产品批间差大, 而且操作劳动强度大。应用细胞工程技术, 建立大规模细胞培养系统生产各种生物活性物质, 是一种比较经济可靠的技术。为了培养规模的进一步扩大、优化细胞培养环境、提高产品的产出率与保证其质量, 动物细胞大规模培养技术已成为各生产企业发展至关重要的环节。具有代表性的有机械搅拌式培养系统、气升式深层培养系统、微载体培养系统、微囊培养系统、大载体培养系统以及中空纤维培养系统, 它们具有不同的技术特点, 但仍需不断完善。
1 大规模细胞体外培养系统的基本要求
1.1 培养系统的设备要求
大规模培养系统是集中多种高技术含量的机电一体化系统, 不能简单的认为是一种机械加工与仪表的结合。随着计算机软硬件技术进展、以及传感技术、化学工程的流型研究技术及其他元器件等技术进步, 大规模培养系统--生物反应器技术必将对生物技术产业化做出巨大贡献。培养系统的设备必须满足体外大规模培养动物细胞的技术和经济要求。
1.1.1达到模拟动物体内细胞高密度的生长环境, 扩大体外培养细胞的表面积和增加细胞密度同体内细胞一样生长。
1.1.2无菌操作安全可靠、保温和气体交换系统优良, 可靠的泡沫控制和适于大批量的混合装置, 能保证p H值之稳定。
1.1.3清洗方法简便快速, 制造用料合适, 成本低。
1.1.4体积要小且使用方便, 并适于多种产物的使用, 便于扩大生产等。
1.1.5监视控制自动化, 便于大规模培养控制。
根据上述要求, 研制一台理想的细胞培养系统需要多学科的技术共同研究、设计, 并与生产部门密切合作才能达到要求。
1.2 细胞株 (系) 要求
1.2.1细胞株 (系) 在体外生长时要保持良好的生长速率和分泌功能。
1.2.2为了保持高产稳产的细胞株 (系) , 应该定期进行筛选工作。
1.2.3支原体对动物细胞培养威胁最大, 它们的感染力很高又不易被检测。因此, 细胞在使用前必须经过严格的检测。
1.2.4为了防止意外事故发生, 应将没有支原体污染的细胞定期留样进行低温保存。
1.2.5为了减少血清用量, 要逐步驯化细胞, 使其适应于低血清或无血清培养。
1.3 培养液要求
1.3.1根据所采用的不同细胞株 (系) , 选用相应的宜于细胞生长的培养液。
1.3.2使用低血清或无血清培养液。大规模培养细胞的培养液中, 血清用量大, 质量不易控制, 生产成本也高, 且使产品的后加工增加了一定的难度。为此, 可尝试低血清或无血清培养液。
1.3.3大规模培养对培养的物质要求极高, 在培养液制备时必须采用高纯度的水。
1.4 细胞生长状况控制
1.4.1 温度控制
动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。温度低于37℃, 细胞生长缓慢, 反之则细胞失去存活力。因此, 动物细胞培养比多数微生物培养对温度控制具有更为严格的要求。
1.4.2 pH控制
p H值是细胞培养的关键性参数, 它影响细胞的存活力、生长及代谢。细胞生长的最适p H值因细胞类型不同而异, 范围为7.0~7.5左右。缓冲液系统通常用CO2、碳酸氢盐调节, p H值取决于培养液中的CO2和碳酸氢盐的浓度比。加入CO2即p H值降低, 而加入碳酸氢盐则使p H值升高。在培养初期阶段细胞产生的CO2和乳酸量较少, CO2可以从系统中置换出来。在细胞生长的后期阶段, 细胞密度增加, 由于细胞产生的CO2和乳酸量增加, 使p H值变得偏酸。这可根据需要用加酸或加碱液的方法, 对p H值加以控制。但此法有产生局部p H值和增加培养液渗透压的危险。控制p H的较安全的办法, 是通过供给细胞所需的氧而改变通入反应器气流中的CO2浓度。用CO2控制p H值会强烈地受溶氧控制系统的影响, 这因为控制溶氧 (空气、N2或O2) 而加入的任何气体都将导致CO2的被置换, 从而引起p H值升高。因此, 在设计p H值控制系统时, 应顾及溶氧控制。
1.4.3 溶氧 (DO) 的测量与控制
溶氧是细胞代谢中的重要养分, 它可以影响细胞的产率, 且间接或直接地影响细胞的代谢。在低氧压下, 细胞往往生长缓慢。而氧压过高, 使培养液会变得对细胞具有毒性。人们已发现溶氧的最适水平是依赖于不同细胞的类型, 空气饱和度应在10%~100%的范围内。可根据需要向培养液内加入氧气、空气或氮气控制溶氧。值得注意的是, p H值控制可以影响溶氧控制。在设计过程中应有一种控制器, 通过调节输入反应器的空气、O2、N2和CO2各类气体的混合比例, 使溶氧与p H值的控制结合在一起。
1.4.4 葡萄糖和乳酸的监测
为了及时了解大规模培养细胞的健康状况, 应逐日或隔日吸取培养液样品进行乳酸的产量及葡萄糖摄入量的测定, 以便监测细胞生长的动态状况。
2 几种大规模细胞培养系统类型
2.1 机械搅拌式培养系统
搅拌式培养系统是靠搅拌桨提供液相搅拌的动力, 它有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性, 因此在大规模培养中被广泛使用。但由于动物细胞没有细胞壁的保护, 因此对剪切作用十分敏感, 直接的机械搅拌很容易对其造成损害, 传统的用于微生物的搅拌反应器用作动物细胞的培养显然是不合适的。所以, 动物细胞培养中的搅拌式细胞反应器都是经过改进的, 包括改进供氧方式、搅拌桨的形式及在反应器内加装辅件等。笼式供氧是搅拌式动物细胞反应器供氧方式的一种, 即气泡用丝网隔开, 不与细胞直接接触。另外, 采用双螺旋带状搅拌桨, 顶部的法兰盖上安装了3块表面挡板。每块挡板相对于径向的夹角为30o, 垂直插入液面, 挡板的存在减小了液面上的旋涡。改进后的反应器既维持了较小的剪切力, 又能保证良好的混合效果以满足细胞生长的要求。该系统具有几个优点: (1) 设计简单, 操作方便; (2) 细胞密度高, 易于放大生产; (3) 便于无菌操作, 不易污染; (4) 氧的转换率高, 能满足了该培养系统中细胞在生长时所需的要求。其缺点是对细胞损伤较大, 产物含量不高。
2.2 气升式深层培养系统
气升式深层培养系统是在70年代初开始发展起来的一种培养方式, 首先应用于植物细胞德发酵培养, 而后应用于动物细胞的大规模培养中。全自动气升式深层培养系统为全部密闭结构, 混合气体自培养器底部管道输入, 气体沿着培养器中央的内管上升。一部分气体从培养器的顶部逸出, 另一部分气体被引导沿培养器的内缘下降, 直达培养器底部和新吹入的气体混合而再度上升。这样借助气体的上下不断循环搅动培养器内的细胞, 使之不贴壁。通过微机程序控制混合气体的组分, 维持培养液内一定的溶氧张力和p H值。气升式深层培养系统按结构可以分为内环流和外环流两种形式。当气体通过气体分布器进入中心导流筒后, 造成管内流体密度比管外低, 在静压差和进入气体的动量作用下, 使液体携带气泡在反应器内形成循环流动, 从而达到良好的气液混合。
气升式细胞培养系统与搅拌式生物反应器相比, 气升式反应器中产生的湍动温和而均匀, 剪切力相当小;同时反应器内无机械运动部件, 因而细胞损伤率比较低;反应器通过直接喷射空气供氧, 氧传递速率高;反应器内液体循环量大, 细胞和营养成分能均匀分布于培养基中。
该系统具有几个优点: (1) 完全密封, 没有移动器件; (2) 便于无菌操作, 不易污染; (3) 结构设计简单, 不具反应液泄漏点和卫生清理死角; (4) 便于放大生产, 氧的转换率高。
2.3 微载体培养系统
微载体大规模培养动物细胞是1967年Van Wezel首先创立的, 用于培养锚地依赖性细胞的大规模培养技术。这种培养技术是在生物反应器内加入培养液和一种对细胞无毒害作用的材料支撑的颗粒 (微载体) , 使细胞在微载体表面附着和生长, 并通过不断搅拌使微载体保持悬浮状态。培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面, 从而实现细胞的高密度培养。由于扩大了细胞的附着面, 能充分利用生长空间和营养液, 因此大大提高了细胞的生长效率和产量。微载体直径在60~250μm不等, 是由天然葡萄糖聚合物 (葡聚糖) 、凝胶或者各种合成的聚合物组成的, 如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。由这些材料及其改良型制成的微载体主要参考了细胞的粘附特性, 在其表面带有大量电荷及其他生长基质物质, 因而有利于细胞的粘附、铺展和增殖。微载体培养只需对微生物发酵罐或气升式深层培养系统稍加改进即可, 适合于培养原代细胞、二倍体细胞株, 它对生产重组产品来说是必不可少的有效方法。该系统具有的特点: (1) 表面积增大, 单位体积培养液的细胞产率高; (2) 生长环境均一, 条件易于控制; (3) 取样及细胞计数简单; (4) 细胞与培养液易于分离; (5) 细胞收获过程相对简单, 劳动强度小。
2.4 微囊培养系统
微囊培养技术是在70年代, 由Lin和Sun首先创造的一种培养方法。把生物活性物质、完整的活细胞或组织及生长介质共同包裹在薄的半透膜中, 即称为微囊技术。该技术在无菌条件下, 将活细胞或生物活物质悬浮在1.4%海藻酸钠溶液的生长介质中, 通过特制的成滴器, 将含有细胞的悬液形成一定大小的小滴, 滴入氯化钙溶液中, 形成内含活细胞的凝胶小珠。每一个胶化的小珠, 再用长链氨基酸聚合物、多聚赖氨酸包被, 形成坚韧、多孔可通透的外膜。重新液化胶化小珠, 使其成胶的物质从多孔膜流出, 活细胞或生物活性物质留在多孔外膜内, 放入搅拌式或气升式培养系统中进行增殖。营养物质和氧分子可通过膜孔进入囊内, 细胞代谢的小分子产物可排出囊外, 分泌的大分子产物如Ig G, 不能透过膜孔, 积聚在囊内。该系统具有几个特点: (1) 微囊内的活细胞由于有半透性微囊外膜, 可防止细胞在培养过程中受到物理损伤; (2) 活性蛋白不能从囊中自由出入半透膜, 从而提高细胞密度和产物含量; (3) 细胞密度大, 产物单位体积浓度高; (4) 分离纯化操作经济简便; (5) 膜孔的大小可根据需要而改变。但微囊技术具有微囊制作复杂, 成功率不高;收集产物必须破壁, 不能实现生产连续化等缺点, 在生产应用中受到很大限制。
2.5 大载体培养系统
大载体培养系统, 是一种新型的大规模培养细胞装置, 配有先进的主要部件, 如溶解氧、p H测定以及培养液输入和产物的收获均由微机程控调节。培养器外面套以水浴玻璃缸加温。混合气体从培养器底部输入使细胞悬浮培养, 通气量大而对细胞损伤减少到最低程度。大载体是由海藻酸钠构成, 海藻酸钠含有重复排列的葡糖醛酸和甘露糖醛酸, 在钙溶液中形成适宜于附着的网络状凝胶珠。在收集细胞时, 可用Na-EDTA和枸橼酸钠, 使细胞从凝胶中分离出来。该培养系统连续生产周期约3个月以上, 已培养过10多种有经济价值的细胞株, 生产单克隆抗体和干扰素产品获得满意的结果。该系统的优点是: (1) 操作控制方便, 可随机取样检测; (2) 人工增加附着细胞密度高; (3) 消耗用品价格低廉, 产物收获量大, 有明显经济效益。该系统不具有细胞分泌产物的浓缩装置。
2.6 中空纤维培养系统
中空纤维培养系统是从1972年开始发展起来的培养系统, 是模拟细胞在体内生长的三维状态, 利用一种人工的“毛细管”即中空纤维给培养的细胞提供物质代谢条件而建立的一种体外培养系统。
动物细胞培养 篇8
《动物细胞培养技术》课程教学存在的问题
《动物细胞培养技术》是在学习了生物化学、微生物学、免疫学等课程的基础上, 研究如何使细胞在体外良好增殖的一门课程, 是生物技术及应用专业的一门重要的核心技能课。以往这门课程的实践教学体系存在着很多问题, 主要表现在以下方面。
实践教学目标定位存在偏差高职教育以职业应用能力为主线这一本质要求未落到实处。尽管制定教学培养计划时安排的实践教学课时不少, 但实践教学效果不佳, 教学过程形式化, 不能突出实践技能和综合素质的培养, 偏重理论考核, 轻视现场职业技能考核。教学内容没有将体现职业技术能力、贴近生产、贴近技术的实训项目纳入实践教学体系, 不能很好地适应人才培养目标的需求。
实践教学内容与生产实际联系不够紧密2006年, 我们对专业教学计划进行了重新修订, 加大了实践教学的比例, 但由于受各种条件的限制, 在实践教学内容的选取上综合性、设计性、应用性实验较少, 新技术、新工艺未能及时充实到实验教学中;顶岗实习中工学相脱离, 学生在顶岗过程中与企业员工同样仅仅从事单一项目机械单调的重复性工作, 没有明确的顶岗实习课程标准, 达不到顶岗实习的预期目标。
实践教学保障条件不足实训条件与学科专业建设、课程建设并不完全匹配, 校内实践教学设备、场所建设等投入不足, 缺乏现代化实际生产设备或模型, 与工厂生产一线缺乏联系。校外实训基地建设不足, 学生在实训过程中真正动手进行操作的机会很少, 影响了学生实践能力的提高。另外, 还缺乏优秀而富有实践经验的实践指导教师。
缺乏严格规范的实践教学管理体系对实践教学计划执行的监控不严, 未能真正实现全过程管理, 尤其是顶岗实习管理不能落实到位。顶岗实习时间较长, 学生分布地域广, 企业数量多, 教师指导不到位, 监控指标不具体、不科学, 管理机制不健全, 致使部分学生校外顶岗实习处于无人管理状态。
构建一个符合高职教育特点的实践教学体系是高职教学改革的必然要求。近年来, 我校的《动物细胞培养技术》课程组对课程的实践教学体系进行了研究和重新设计, 使实践学习过程能充分满足学生职业能力培养的需要, 有利于高职生物工程类人才的培养。
课程改革的内容
重视实践技能教学, 重构教学体系通过对生物技术及应用专业毕业生近三年就业岗位进行调查研究, 发现学生首次就业岗位主要是分离提取、疫苗生产和诊断试剂三类企业的营销和生产岗位。经过发展, 再次就业的岗位主要有产品检测岗位、产品营销岗位等。实践性教学环节是理论与实践相结合的纽带, 是实现学生与企业“无缝对接”的重要环节, 因此, 应根据企业需要重构实践课程, 重视学生校内学习技能与实际工作需要的一致性, 积极推行工学交替、任务驱动、项目导向、顶岗实习等有利于增强学生能力的教学模式。近年来, 我校课程组教师采用多层次复合化实践教学, 使实践教学时数占整个教学时数的60%左右, 并构建了由物品准备模块、技能操作模块、细胞检测模块及职业实训模块4个技术模块组成的教学体系, 并与固定企业建立了长期合作关系, 制定了企业接收学生实习的制度, 加强了学生的生产实习和社会实践, 保证学生至少有半年时间到企业顶岗实习。2009年, 全球出现了“甲流”肆虐, 我国的华兰生物工程股份有限公司承担了大规模生产疫苗的工作, 我校生物工程系从当年的5月~11月选派了137名生物技术及应用专业的学生充实到华兰公司生产第一线, 参与治疗“甲流”疫苗的全面生产。除此之外, 在2006~2009年间, 我校生物工程系生物技术及应用专业与华兰生物工程股份有限公司联合成立了订单培养班“华兰班”, 搭建了校企合作发展联盟;与普莱柯生物制品公司联合成立了订单培养班“普莱柯班”, 拓宽了学生的就业渠道;与三叶兽药公司联合成立了订单培养班“三叶班”, 扩展了校企合作的空间;与天宇兽药有限公司成立了“天宇班”, 进一步为学生就业搭建了平台。通过校企合作, 深化课程内容改革, 强化细胞培养的几项技能训练, 突出学生实践能力的培养, 实现了学生与企业之间的“无缝对接”, 同时也增强了学生的就业能力。
改革授课方式授课方式采取校内专业教师与企业兼职教师相结合的方式进行, 使得实践技术与理论有机结合, 将企业技能需求与职业标准融入课程体系, 将企业真实的工作任务作为载体进行项目训练, 加强学生职业能力的培养。实习周、专业实训项目在企业的真实环境中完成, 同时, 在疫苗生产旺季安排学生去企业顶岗实习, 巩固专业技能。
构建严格的实践教学管理体系, 强化实践教学的过程管理实践教学管理分为目标管理、过程管理、质量管理三个方面。针对每项实践教学环节, 应制定具体明确的质量标准, 并严格规范执行。各实践教学环节的质量标准包括实验大纲 (或指导书) 、实训大纲 (或项目单卡) 、顶岗实习大纲、学生实训手册、学生实训报告等。要求教师严格按照教学工作规范和质量标准执行, 加强学生顶岗实习期间的过程管理, 解决“放羊式”顶岗实习的弊病。
构建科学的考核模式课程考核采取理论笔试成绩+在企业的实践成绩+平时成绩的方式。理论部分采用笔试考核, 主要考核基本理论知识和实验技能原理, 即考查学生分析问题、解决问题的能力;平时成绩通过考勤、学习态度、课后作业情况等方面加以衡量。在企业的实践成绩通过顶岗实习后企业反馈的学生表现情况进行评定, 我们专门制定了学生定岗实习实践考核的量化标准, 并严格按照量化标准对学生进行实践考核。成绩的评定构成为:20%实践考核+70%理论考核+10%平时成绩。
加强课程组专兼结合的教学团队建设在教学过程中, 教师要根据知识体系及学生的认知发展水平, 在有秩序、有步骤的教学过程中使学生掌握细胞培养的基本知识与技能, 形成严谨周密、无菌操作的实验习惯。课题组还通过有计划地选派教师到企业进行一年以上的实践锻炼等措施优化师资队伍。此外, 还聘请企业骨干作为兼职教师来校讲学, 兼职教师的理念融入了企业生产中技术手段的前沿和方向, 并为课堂教学的改革不断注入新鲜的血液。
建立健全实践教学保障机制要通过多渠道筹措资金, 优化实践教学环境, 加强校内外实习实训基地建设。除了学校加大投入外, 要争取政府及高职院校行政主管部门的支持, 也可以面向社会和市场多渠道筹集资金, 积极争取社会的支持和企业的协助;要提高“双师型”教师的实践能力, 增加校外兼职教师授课的比重, 完善与现有校外专家指导队伍的关系和活动规则;还要加强实训教材建设。
从教学效果看, 通过将实践技术与理论知识有机结合, 将企业技能需求与职业标准融入课程体系, 将企业真实的工作任务作为载体进行项目训练, 学生对《动物细胞培养技术》课程从思想上更加重视, 学习的主动性较高, 参与意识较强, 影响面较大, 充分提高了学生自主学习的能力和解决问题的能力。通过对《动物细胞培养技术》课程的改革, 为企业获得相应的专业人才提供了保障, 为学生的实习就业打通了渠道, 为学校的人才培养明确了方向, 为校企合作、订单培养搭建了平台, 因此具有十分重要的意义。
摘要：高职高专院校应根据企业需要重构动物细胞培养技术课程体系, 保证学生校内学习实验技能与工作岗位所需技能的一致性, 同时应采取顶岗实习、订单培养、合作发展联盟等措施, 强化学生实践技能, 为学生就业拓宽渠道, 并通过选派专业课教师到企业实岗锻炼, 聘请企业技术人员担任兼职教师等方式, 实现学校与企业合作的“无缝对接”。
关键词：高职高专,动物细胞培养技术,课程,教学改革,创新
参考文献
[1]焦建国, 孙学岭.关于工学结合的实践与探索[J].教育与职业, 2008, (7) .
[2]陈玉华.工学结合教学模式的探讨与实践[J].中国大学生就业, 2008, (13) .
[3]姜大源.职业教育学研究新论[M].北京:教育科学出版社, 2007:230.
哺乳动物细胞核移植研究进展 篇9
1 核移植技术的国内外研究现状
细胞核移植技术是德国发育生物学家Spermann[1]于1938年为解决核质相互关系问题提出把分化的细胞导入去核的卵母细胞中并观察其胚胎发育情况的研究,同年他还提出将任何时期的细胞核注入去核卵母细胞内然后通过观察其发育能力就可以确定该时期细胞核的发育潜能的设想。但由于当时核移植技术条件的限制,用分化的细胞未能获得成功。直到20世纪50年代,才有两栖类美洲豹蛙和非洲瓜蟾克隆的报道(Briggs和King,1952)。随后Gurdon等用蟾蜍、蝌蚪的肠上皮细胞和体外短期培养的完全分化的体细胞进行核移植分别获得成体蟾蜍和蝌蚪,证实两栖类已分化细胞的基因组具有结构上的完整性和功能上的全能性。此后,人们转向哺乳动物细胞核移植研究。
哺乳动物核移植研究的最初成果在1981年取得,Illmensee和Hoppe[2]用鼠内细胞团细胞直接注入去核的合子后,培育出发育正常的3只小鼠。但这一试验未能被重复出来;1983年,Mc Grath和Solth首次利用显微操作技术和细胞融合技术,以单细胞期的小鼠胚胎作为供核细胞进行核移植,得到了核移植后代,并建立了重复性很高的核移植操作程序[3];1994年,Collas和Barrnes将供核细胞通过卵母细胞内直接注射的方法构建了核移植重构胚胎,并得到了犊牛[4];这一时期许多研究者对胚胎干细胞和成年动物体细胞的核移植试验也做了大胆尝试,但进展不大。1997年,在细胞核移植研究历史上发生了一件具有轰动效应的事件,英国罗斯林研究所的研究人员首次利用成年母绵羊的乳房上皮细胞,通过细胞核移植技术得到了体细胞克隆羊———“Dolly”[5],“Dolly”的出生以事实向人们证明,完全分化的体细胞不仅可以被逆转,而且完全可以发育成一个新的个体。从此以后,全世界掀起了体细胞克隆的热潮。1998年Wakayama等利用小鼠卵丘细胞进行体细胞核移植研究获得成功[6];1999年Wells等用牛颗粒细胞进行核移植也获得了成功[7]。至2002年,Keefer等[9]人将91枚重构胚移植到8只受体山羊体内,50%受孕,生出7只小山羊,核移植效率明显比以前提高。迄今为止,全世界已有乳腺细胞[5]、卵丘细胞和输卵管上皮细胞[8]、颗粒细胞[7]、肌肉细胞[10]、皮肤细胞[11]、睾丸支持细胞[12]、胎儿成纤维细胞[9]和耳皮肤成纤维细胞[13]等9种体细胞克隆后代成功诞生。
我国的细胞核移植技术研究开始于20世纪60年代。1963年,著名试验胚胎学家童第周利用胚胎细胞克隆技术进行鱼类囊胚细胞核移植研究,在70年代获得属间和种间核移植鱼。上个世纪九十年代起,国内学者开始进行哺乳动物克隆研究。1991年,张涌等[14]利用4~32细胞的胚胎克隆了5只山羊。2000年,杨向中领导的科研小组,用一头17岁高龄奶牛耳皮肤细胞进行体细胞核移植研究,获得了6头体细胞克隆牛[15]。标志着中国已完全掌握了世界一流的体细胞克隆牛技术,从1997年到现在短短几年的时间里,在体细胞核移植领域里,人们相继在牛、山羊、猪、猫和兔等多种动物上取得了成功。
2 目前核移植技术中存在的问题
2.1 体细胞克隆成功率低
同体外授精相比,效率低是目前核移植技术应用发展中普遍存在的现象。主要表现在:囊胚发育率不稳定,移植后受胎率低,出现畸胎、死胎、流产以及出生后早亡率高,造成效率低。但不同的学者对此产生的意见却不一,有人认为是培养条件未达到最佳化,也有人认为是细胞的问题,现有资料表明,即使应用体内培养的方法成活率也不过10%,看来试图通过改进培养体系来提高核移植效率还无从着手。因此,要更深入地研究核质间的互作机理,以便使核移植技术得到进一步改善。
2.2 供体核与受体胞质细胞周期同步的问题
第一次体细胞核移植获得成功的重要因素之一就是对细胞周期同步化的认识,而且研究人员也首次认识到应用G0期细胞的必要性。目前体细胞核移植中常用的方法就是将处理后的供体细胞核移入到去核的MII期卵母细胞中,迄今为止,几例成功的猪体细胞核移植研究中,都采用了去核的成熟MII期卵母细胞作为核受体。大多数研究者认为用成熟的去核MII期卵母细胞作为核受体,有利于启动已分化的供体核在重构胚中的再程序化,保证一定的核移植成功率。当用去核的MII期卵母细胞作为受体细胞时,必须使供体细胞与受体细胞的细胞周期同步化,这样有助于重组胚胎的发育。在卵母细胞激活后,MPF活性下降、染色质去凝集,在核膜重建的过程中DNA复制,染色体加倍,因而核移植时供体细胞周期的选择对于第一次细胞分裂末期,染色体二倍体的保持是很重要的。
2.3 体细胞基因突变和其他遗传问题
研究证明,基因突变与DNA复制次数有着密切的关系,分裂次数越多的体细胞,发生突变的可能性越大。对于核移植材料来源方面,这是不可避免的问题。如果把动物的基因组弄清楚,并能对体细胞的突变基因加以修复的话,核移植的效率一定能够得到大大的提高。
3 哺乳动物核移植技术的应用前景
3.1 扩大优良育种群和拯救濒危动物
采用核移植技术可加速育种的过程,在短时间内有效地扩大种群的数量,保持种群的性状,避免了自然交配所带来的优良性状的分离和减弱。将核移植与基因打靶相结合,可以对物种的基因进行定点修饰,产生具有优良性状的新品种。用家畜的体细胞进行(下转第97页)(上接第33页)基因打靶可将我们感兴趣的目的基因插入到特定的位置,把筛选出的阳性克隆作为核供体进行核移植,这样便可获得组织特异性表达的转基因动物。
3.2 体细胞克隆技术在医药生产方面的价值
将体细胞克隆技术与生物反应器的生产制作技术结合可以对体细胞进行转基因或基因组修饰后,制作生产生物反应器利用动物的乳腺、膀胱等器官,生产治疗人类疾病、保健所需的蛋白。许多全球知名的生物技术企业尤其看重体细胞克隆技术在这些方面的应用价值,纷纷投资科研机构开展研究,实际上第一个体细胞克隆动物绵羊Dolly的诞生就是这种动机的直接产物。
3.3 在临床方面的作用
通过深入研究细胞核质的相互作用控制胚胎细胞的分化方向,有望获得适合向人体移植的具有遗传改变的动物器官。通过细胞核移植技术可以避免不必要的免疫排斥作用。目前,人们已经利用体细胞克隆技术获得了小鼠-小鼠、人-兔、人-人ES细胞系,并已经在小鼠模式上开展了如帕金森氏症等神经退行性疾病的治疗尝试。
4 结语
动物细胞培养 篇10
1 动物脂肪细胞结构及形成机制
动物脂肪组织由大量的脂肪细胞聚集而成, 在脂肪细胞之间, 疏松结缔组织将其分隔成许多脂肪小叶, 脂肪细胞胞质中贮存大量脂类, 多数为三酰甘油, 其余为磷脂及胆固醇等。动物脂肪细胞胞质除了含大量储存能量物质的脂滴细胞器外, 还有内质网、溶酶体、过氧化物酶体等细胞器, 这些细胞器之间存在着相互作用的关系, 共同调控着动物及其他生物的生命活动[3];因此, 脂肪细胞内的脂滴是动物蓄能和供能的结构, 尤其是三酰甘油作为动物能量存储在脂肪特异性脂滴内, 是所有哺乳动物能量需要的基础。脂肪在细胞内的存留可以防止脂肪酸在肌肉和肝脏内过多的沉积[4]。
动物脂肪沉积的前提条件是在它们消化、吸收的能量满足了自身活动消耗以外, 剩余能量被利用的过程, 这个过剩能量的包裹和存储是为以后动物自身能量消耗超过有效能量的补给。哺乳动物脂肪组织自身作为一个内分泌器官, 是以三酰甘油为特殊形式进行能量存储和补给的组织, 包括所有的真核细胞和有些原核生物细胞, 它们在细胞内以脂质的形式存储一定量的脂肪, 这种存储结构大多是以脂滴的形式保存, 这个结构的其他术语名称还有脂质体、脂肪体等[3]。脂肪细胞形成的动力学过程实际上就是脂滴在脂肪细胞内与其他细胞器 (内质网、溶酶体、过氧化物酶体) 相互作用, 调控着脂滴的形成、生长、运动和相互融合分离的过程。
构成脂肪细胞的主体结构——脂滴到底来自哪里?研究表明, 真核生物包括动物脂肪细胞的脂滴来自内质网[5]。脂滴形成的机理可能是酯化的脂质在内质网内聚集并填充, 导致内质网膜相互分离。随着脂滴内酯化的脂质量的增多, 脂滴向细胞质的方向扩充, 最终质膜收缩融合, 脂滴形成并脱离内质网。脂滴内除了脂质外, 还有核糖体结合的膜蛋白及单层磷脂层的其他蛋白和游离的胆固醇等[6,7]。脂滴在结构上与脂蛋白相似, 其形成过程比较复杂, 相比于由小泡组成的细胞器官的磷脂双分子层结构而言, 脂滴是由高度疏水的酯化脂质作为核心被磷脂单分子层组成的外膜所包围。S.Baoukina等[8]通过使用分子动力学模型研究脂质单层内陷的分子机理, 为脂质在脂肪细胞内形成脂滴的过程提供了有力的证据。
2 动物脂质生成的生理学作用
动物脂肪在沉积过程中, 单个细胞水平的分化、代谢和遗传都存在明显差异[9];例如, 猪的皮下前体脂肪细胞的增殖要比来自于内脏器官的脂肪细胞更活跃, 三酰甘油的沉积表现出更快的积累速度[10]。以羊作为动物模型确定了动物内脏衍生的前体脂肪细胞比皮下派生的前体脂肪细胞分化的速度慢[11], 这种差异主要取决于饲喂的粗饲料含量水平, 区域性差异表现在脂肪细胞的发育形态、细胞结构、脂肪含量, 以及与其相对应的代谢调控作用、动员脂质的能力和特异性组织脂肪贮存方面[12]。胚胎发育和胎儿初生阶段骨骼肌肉内的脂肪生成对出生后肌肉脂肪细胞总数有明显的效应, 因为脂肪细胞的总数出现时是多数肉食动物达到青春期或成熟期;然而, 控制胎儿和出生后脂肪生成的机理在所有动物脂肪贮存研究中仍然还是空白[1]。
脂肪是动态组织, 从细胞的角度透视脂肪贮存增大或许发生在成年期。一个关键的问题是, 新的脂肪细胞来自于哪里?人们普遍认为, 这些细胞大多数来自于脂肪组织内和部分结缔组织前体细胞;但是, 成熟脂肪细胞和子细胞增殖的双向分化构成了另一个新脂肪细胞形成的资源。反刍动物 (肉牛、绵羊) 和单胃动物 (猪) 的脂肪细胞具有去分化能力。在体外形成具有潜能的增殖后代细胞, 这些细胞能够耐受细胞群的扩张, 继而再次分化形成充满脂质的脂肪细胞[13]。研究表明, 特定的脂肪细胞在肉牛出生后整个生命阶段都有不同的脂肪贮存期, 而且脂肪组织的总量是由动物及其脂肪组织贮存基础决定的。M.E.Fernyhough 等[14]研究表明, 每100个成熟脂肪细胞里就有1个细胞在体外具有分化和形成增殖潜能的子细胞;因此, 脂肪细胞内几乎所有的细胞类型, 包括成熟的脂肪细胞, 都有增殖和分化能力, 也有很大的潜力填充脂肪组织。多数人认为, 新的补充到脂肪贮存里的细胞只能来自前体脂肪细胞、脂成纤维细胞或贮存未识别的干细胞。事实上, 根据细胞数量, 成熟脂肪细胞的去分化潜在效应对组织再生是有利的, 或许还可以改变出生后干细胞, 这对各种组织再生工程具有非常重要的意义。
3 动物的脂质代谢作用
反刍动物与非反刍动物的脂质代谢是不同的, 反刍动物具有厌氧发酵的前胃系统 (瘤胃) , 位于肠道和真胃的前面, 反刍动物的脂肪组织主要是新合成的脂肪酸, 这与非反刍动物体内肝脏合成的脂质有明显的区别。研究发现, 反刍动物肌肉脂肪细胞合成的主要底物是葡萄糖, 而皮下脂肪细胞的底物是醋酸纤维素等, 其肌肉大理石纹脂肪的增加是由于饲料中的碳水化合物在瘤胃内不经过发酵而在肠道内消化为葡萄糖造成的。碳水化合物饲粮从瘤胃内的流失程度主要取决于饲喂过程和其他因素, 然而肉牛饲喂高含量的淀粉饲粮相比于其他饲草动物更有利于小肠直接吸收葡萄糖。脂质在人体骨骼肌中的沉积效率相比其他脂肪组织贮存要高, 能量耐受性碳在骨骼肌里也间接增加;因此, 猪、牛和羊等在脂质代谢方面呈现的模式明显不同于人和啮齿类动物。
非反刍动物猪的代表性饲粮为谷类, 含脂量比较低, 单糖和脂肪酸在小肠内直接被吸收, 有些单糖到达肝脏通过门静脉吸收, 而有些脂肪酸重新转化成乳糜微滴运送到淋巴系统, 然后通过血液循环被吸收。任何葡萄糖并不是立刻代谢生成能量所需的脂肪酸, 而是以三酰甘油的形式存储在脂肪组织内。与人类和啮齿类不同的是, 这些剩余的能量将不会立即转变成脂肪酸和三酰甘油, 而是在猪的肝脏中形成极低密度脂蛋白。肝脏对极低密度脂蛋白的合成主要取决于脂肪组织内的三酰甘油脂解为脂肪酸的有效性, 脂肪酸可以通过脂蛋白脂肪酶把脂肪组织、心脏、骨骼肌和肝脏的乳糜微滴脂解释放出来。饲粮脂肪转变成不同组织的脂质可以通过建立动物模型观察相应组织脂肪酸组成的改变来确定, 高脂肪蛋白饲粮有助于增加肝脏脂肪和合成极低密度脂蛋白, 如特异性极低密度脂蛋白产物。脂肪酸是通过脂质水解脂肪组织贮存的三酰甘油释放出来的, 用于肝脏极低密度脂蛋白的合成。新的脂质合成和脂蛋白合成在猪是被完全分开的, 当柠檬酸过量时, 会产生过多的乙酰辅酶A, 它可将贮存的脂质快速利用, 猪肝脏的线粒体可释放醋酸纤维素等替代酮类, 猪脂质的代谢类似于人类和啮齿类动物[15]。
动物脂肪细胞内脂质的存储及其利用对维持细胞能量动态平衡起着重要的作用。脂滴是胞质器, 存储三酰甘油和胆固醇等, 在营养缺乏条件下, 三酰甘油被水解产生自由脂肪酸, 脂肪酸再被氧化以提供能量。对于饥饿的第2个细胞反应是细胞自吞, 在这个过程中细胞内的蛋白质和细胞器在双层膜囊里被释放的溶酶体降解消化来提供营养。脂解和自吞在调控和功能方面是相似的, 但相互间的关系不是很清楚。R.Singh[16]等研究了细胞自吞在调控脂质代谢中的一个新功能, 他们将这种功能称之为“巨大噬脂细胞”, 在这个过程中, 脂滴和自吞组分在饥饿期间结合, 而细胞自吞的抑制则会增加脂滴中的脂质存储。自吞作用是将脂滴释放给溶酶体, 通过降解来促进脂质水解和自由脂肪酸的生成, 这项研究发现自吞在调控脂质代谢中的作用, 为防止疾病中的脂质积累提供了新的途径。
4 农业动物作为脂肪代谢研究模型的利用
反刍动物已经作为动物模型进行了脂肪细胞生化或是脂质代谢研究。牛的体格大, 饲养费用较高, 在乳腺的生理、脂肪肝的发生、特异性脂肪贮存或脂肪生成调控研究方面都已用到, 但是仅通过组织和细胞培养进行由肌肉内脂肪储存过多引起的肥胖和相关疾病的分子调控研究是不行的, 只有通过不同时间段肌肉内脂肪组织发育的活组织样本, 结合激光解剖显微镜, 从肉食动物脂肪组织内把脂肪细胞进行分离, 用于转录组学和蛋白质组学进行研究结果才更为可信。农业动物作为代谢研究模型存在的主要问题是特异物种间存在明显的差异, 共轭脂肪酸所取得的成果是一个很好的实例, 广泛研究其抗癌行为和潜在改变脂质沉积, 在不同的物种内具有不同的效应;例如, 在3T3 L1细胞内9～11共轭亚油酸异构体可以抑制细胞的分化[17], 但在猪的初级前体脂肪细胞内出现了相反的结果[18], 这表明前体脂肪细胞的分化变异主要取决于它们来自哪类物种的细胞系或供体。利用肉食动物作为模型来验证脂质在肌肉内或皮下组织细胞内沉积的假设, 结合胰岛素抗性相关的研究结果, 能更好地理解肌肉内脂肪沉积的机理。
5 小结
动物细胞培养 篇11
1 中医药对白细胞介素的作用
白细胞介素( interleukin,IL) 简称白介素,目前命名的白介素有IL-1 ~ IL-29,IL能够促进免疫细胞增殖分化,诱导免疫类型和强度; 诱导急性期反应,促进炎症反应等; 在OA的形成机制中,IL促进OA炎症反应的形成,破坏软骨基质。目前研究参与OA发病机制的IL主要有IL-1、IL-6、IL-10、IL-12、IL-17、IL-18等。大多研究表明中医药能够抑制IL的形成,减缓OA的发病进程。
1. 1 IL-1
Heraud等[2]研究表明IL-1在调控软骨细胞凋亡方面发挥重要作用,IL-1干扰正常软骨的代谢,影响软骨胶原和蛋白多糖的合成; 同时还可以使基质金属 蛋白酶 ( metalloproteinase,MMP) /基质金属蛋白酶组织抑制因子( tissue inhibitor of metalloproteinase,TIMP) 平衡失调,使软骨基 质胶原和蛋白多糖分解进而导致软骨的破坏。软骨基质破坏不能为软骨细胞提供正常微环境,软骨细胞的代谢影响软骨基质成分分解与合成代谢的平衡。陈飞雁等[3]研究指出威灵仙注射液可以通过抑制IL-1的水平对OA起防治作用。张爱玲等[4]表明补肾壮骨颗粒能够有效降低IL-1的表达对OA起到治疗作用。 王秀华等[5]研究发现空白组未检测出IL-1,模型组( 兔膝骨关节炎模型) 与治疗组( 西药组、丹参组) 均能检测出IL-1 ,由此可以得出IL-1在OA发病过程中可能起重要作用; 经过一段时间的膝关节腔内注射发现: 造模组( 生理盐水组) IL-1的水平明显高于中药治疗组( 丹参组) ,P < 0. 01; 差异有显著统计学意义; 西药组( 激素) 低于中药组( 丹参组) ,差异有统计学意义( P < 0. 05) ,研究表明丹参能有效降低OA中IL-1,同时能有效有效治疗OA,但效果略次于西药组。刘英杰等[6]通过治疗组( 独活寄生汤) 与对照组相比发现: 在治疗3周、5周以后,IL-1的水平下 降,差异有统 计学意义( P < 0. 01) ,说明独活寄生汤通过抑制炎性因子( IL-1) 的表达而达到治疗OA的作用。钟玉等[7]证实复元胶囊通过降低IL-1的表达而达到抑制对软骨细胞的损伤。
1. 2 IL-6
IL-6是单核吞噬细胞等在IL-1、肿瘤坏死因子-α( tumor necrosis factor-α,TNF-α) 等诱导下产生的一种细胞因子,具有多种生物学活性,包括激活T细胞和B细胞,以及产生急性期蛋白等。Westacott等[8]研究指出健康人与OA患者软骨细胞都可以自发的分泌IL-6,但是在正常人滑膜组织中检测不到IL-6的存在,OA患者的滑膜组织中可以检测出大量IL-6。Silaccip等[9]研究证实IL-6与IL-6受体结合形成复合物,这种复合物可诱导成骨细胞MMP-13增加,抑制TIMP-1在滑膜细胞和软骨细胞中表达,使MMP/TIMP之间的平衡受影响,引起关节软骨基质的退变。IL-6同时可以协同IL-1的作用,抑制软骨细胞合成蛋白聚糖,导致软骨基质缺失。杨惠琴等[10]治疗组( 青藤碱注射液组) 与模型组( 生理盐水组) 相比,P值均小于0. 01,有统计学意义,该研究表明青藤碱注射液能够有效减低OA关节液及血液中IL-6的水平,通过抑制IL-6的水平对OA起防治作用。孟祥奇等[11]研究指出化痰祛湿剂通过抑制IL-6、IL-1的水平而达到对膝OA的防治目的。
1. 3 IL-8
Yang等[12]研究表明: 在OA患者软骨细胞骨桥蛋白的形成可以上调IL-8的表达,骨桥蛋白的形成与IL-8的浓度成正比。IL-8是一种趋化因子,其生物学活性是激活和诱导中性粒细胞,诱导机体局部的炎症反应,达到杀菌和细胞损伤的目的。陈元良等[13]研究发现: 与正常对照组比较,模型组、骨碎补总黄酮治疗组和维固力治疗组动物血清中IL-8表达水平均明显升高。经4周的灌胃治疗后,骨碎补总黄酮组和维固力组的IL-8表达与模型组比较有明显降低( P < 0. 01) ; 骨碎补总黄酮组与维固力组比较,IL-8表达差异不明显( P > 0. 05) 。骨碎补总黄酮确实可以抑制炎性因子的分泌,阻断骨关节的炎症反应,其作用机制可能是通过抑制IL-8的释放而实现的。金晓东等[14]研究表明与模型组相比,红花注射液能显著降低滑液中细胞因子IL-8的表达,这表明红花注射液可以通到降低炎性因子的表达达到对OA的治疗作用。
1. 4 IL-10
IL-10具有较强免疫抑制和免疫调节功能,同时还能促进软骨蛋白多糖的合成,保护软骨。陈文超等[15]研究表明骨灵膏可能通过增强IL-10的抗炎作用阻止软骨退行性变,保护了关节软骨。
2 中医药对肿瘤坏死因子的作用
肿瘤坏死因子( tumor necrosis factor,TNF) 分为TNF-α 和TNF-β 两种,前者主要由活化的单核 / 巨噬细胞产生,后者主要由活化的T细胞产生。目前TNF家族有30余种细胞因子,主要在调节免疫应答、诱导细胞凋亡和杀伤靶细胞等过程中发挥作用。Reboul等[16]研究指出TNF-α 与OA软骨破坏及滑膜炎有一定关系,TNF-α 可以选择性地抑制蛋白多糖的合成,同时促进其蛋白多糖的降解,促进OA的形成。TNF-α 与相应受体结合,刺激滑膜细胞产生PEG,促进软骨和骨的破坏。综上所述,TNF-α 能够诱导和促进OA的形成。然而,近年来越来越多的研究表明中药能够降低血清和关节液中TNF-α 的水平达到保护关节软骨的作用。方策等[17]通过测定血清和关节液TNF-α水平得出中药组关节液和血清中TNF-α 明显低于对照组,差异有统计学意义( P < 0. 01) ,中药健骨活血丸能有效抑制兔OA血清和关节液中TNF-α 的水平,达到对OA的保护和治疗作用。肖晓金[18]等过检测4周、8周时中药低、中、高剂量组兔子血清及关节液中TNF-α浓度,发现与模型组相比,高剂量组血清及关节液中TNF-α 比模型对照组显著降低,差异有统计学意义( P < 0. 05) ,由此可推测透骨消痛胶囊可能通过降低异常升高的TNF-α 的水平,减轻炎症反应,减缓对软骨的破坏。朗继孝[19]等研究证实壮骨颗粒可能通过影响TNF-α 水平达到对OA的治疗作用。
3 中医药对 OA 中转化生长因子的影响
转化生长 因子 ( transforming growth factor-β,TGF-β) 是具有多功能的蛋白多肽,能抑制免疫细胞的增殖、淋巴细胞以及细胞因子的分化,抑制上皮细胞、破骨细胞、内皮细胞生长和脂肪、心肌、骨骼肌的形成; 但能够促进促进成纤维细胞、成骨细胞的生长,同时也能促进细胞外基质如胶原蛋白、纤粘连蛋白的表达和抑制细胞外基质的降解,对细胞的形态发生、增殖和分化过程起着重要作用,有利于细胞修复。Livne等[20]证实TGF-β 能促进细胞增殖、调节细胞分 化、促进细胞 外基质合 成作用。TGF-β 可促进OA软骨细胞迅速生长[21]。越来越多的研究表明,补肾中药能上调TGF-β 的表达,提高TGF-β 的水平。宁显明等[22]采用原位杂交法测定膝骨关节软骨中的TGF-β 的水平,分析正常组、模型组、西药组( 芬必得组) 、中药组TGF-β 的表达及排列顺序得出补肾中药具有上调TGF-β 在OA关节软骨中表达的作用,且修复后软骨细胞排列较规则。牛维等[23]采用荧光定量 - PCR和蛋白免疫印迹杂交方法分别检测TGF-βmRNA和蛋白表达,分析得出鹿茸低剂量、高剂量组在灌胃后2、4、6周,TGF-βmRNA和蛋白表达量逐步增加,且表达量均高于( 正常组、西药组、模型组) ,有统计学意义,差异显著( P < 0. 01) ,证实了鹿茸通过上调TGF-β 的表达,起到促进软骨细胞增殖、分化的作用。王孟琳[24]等研究指出通过动物OA模型病理变化及测定软骨和滑膜组织中的TGF-β水平,得出杜灵注射液可能通过提高TGF-β 的水平,促进软骨细胞的增生及细胞基质蛋白的合成达到保护软骨的作用。
4 中药对结缔组织生长因子的影响
结缔组织生长因子( connective tissue growth factor,CTGF) 是一种富含半胱氨酸的分泌肽,具有多种生物学功能,参与机体血管生成、创伤修复、肿瘤的发生发展、骨的形成与修复等生理及病理过程。欧阳冰等[25]认为CTGF能够促进软骨细胞的增殖,促进软骨胶原和蛋白多糖的合成,促进衰老软骨细胞反分化及抑制软骨细胞去分化。Kawata等[26]证实CTGF能够不仅促进软骨细胞的增殖、成熟与再生,同时还能刺激成骨细胞的增殖与分化。由此可见,CTGF能够促进软骨细胞的增殖,参与骨的形成与修复。孙剑等[27]通过实验研究发现阳和汤组CTGF、CTGFmRNA表达水平低于模型组,差异有统计学意义( P < 0. 05) ,证实了阳和汤可能通过下调CTGF的表达以降低CTGF介导的软骨细胞的增殖与表达,减缓OA骨赘的形成。
5 结语与展望