哺乳动物细胞（通用11篇）
哺乳动物细胞 篇1
哺乳动物细胞核移植是指将发育不同时期胚胎细胞或成年动物体细胞的细胞核,经显微操作,移植到成熟的去核卵母细胞中,组成重构胚并使之发育成新动物个体的技术。细胞核移植是动物克隆的主要途径,所以又称之为克隆技术。1997年体细胞克隆绵羊Dolly的诞生(Wilmut et al,1997),是细胞核移植技术的一个重要的里程碑。它向全世界证明了高度分化的体细胞具有遗传的全能性和发育的可逆性。在科学领域引发了克隆动物研究的高潮。
1 核移植技术的国内外研究现状
细胞核移植技术是德国发育生物学家Spermann[1]于1938年为解决核质相互关系问题提出把分化的细胞导入去核的卵母细胞中并观察其胚胎发育情况的研究,同年他还提出将任何时期的细胞核注入去核卵母细胞内然后通过观察其发育能力就可以确定该时期细胞核的发育潜能的设想。但由于当时核移植技术条件的限制,用分化的细胞未能获得成功。直到20世纪50年代,才有两栖类美洲豹蛙和非洲瓜蟾克隆的报道(Briggs和King,1952)。随后Gurdon等用蟾蜍、蝌蚪的肠上皮细胞和体外短期培养的完全分化的体细胞进行核移植分别获得成体蟾蜍和蝌蚪,证实两栖类已分化细胞的基因组具有结构上的完整性和功能上的全能性。此后,人们转向哺乳动物细胞核移植研究。
哺乳动物核移植研究的最初成果在1981年取得,Illmensee和Hoppe[2]用鼠内细胞团细胞直接注入去核的合子后,培育出发育正常的3只小鼠。但这一试验未能被重复出来;1983年,Mc Grath和Solth首次利用显微操作技术和细胞融合技术,以单细胞期的小鼠胚胎作为供核细胞进行核移植,得到了核移植后代,并建立了重复性很高的核移植操作程序[3];1994年,Collas和Barrnes将供核细胞通过卵母细胞内直接注射的方法构建了核移植重构胚胎,并得到了犊牛[4];这一时期许多研究者对胚胎干细胞和成年动物体细胞的核移植试验也做了大胆尝试,但进展不大。1997年,在细胞核移植研究历史上发生了一件具有轰动效应的事件,英国罗斯林研究所的研究人员首次利用成年母绵羊的乳房上皮细胞,通过细胞核移植技术得到了体细胞克隆羊———“Dolly”[5],“Dolly”的出生以事实向人们证明,完全分化的体细胞不仅可以被逆转,而且完全可以发育成一个新的个体。从此以后,全世界掀起了体细胞克隆的热潮。1998年Wakayama等利用小鼠卵丘细胞进行体细胞核移植研究获得成功[6];1999年Wells等用牛颗粒细胞进行核移植也获得了成功[7]。至2002年,Keefer等[9]人将91枚重构胚移植到8只受体山羊体内,50%受孕,生出7只小山羊,核移植效率明显比以前提高。迄今为止,全世界已有乳腺细胞[5]、卵丘细胞和输卵管上皮细胞[8]、颗粒细胞[7]、肌肉细胞[10]、皮肤细胞[11]、睾丸支持细胞[12]、胎儿成纤维细胞[9]和耳皮肤成纤维细胞[13]等9种体细胞克隆后代成功诞生。
我国的细胞核移植技术研究开始于20世纪60年代。1963年,著名试验胚胎学家童第周利用胚胎细胞克隆技术进行鱼类囊胚细胞核移植研究,在70年代获得属间和种间核移植鱼。上个世纪九十年代起,国内学者开始进行哺乳动物克隆研究。1991年,张涌等[14]利用4~32细胞的胚胎克隆了5只山羊。2000年,杨向中领导的科研小组,用一头17岁高龄奶牛耳皮肤细胞进行体细胞核移植研究,获得了6头体细胞克隆牛[15]。标志着中国已完全掌握了世界一流的体细胞克隆牛技术,从1997年到现在短短几年的时间里,在体细胞核移植领域里,人们相继在牛、山羊、猪、猫和兔等多种动物上取得了成功。
2 目前核移植技术中存在的问题
2.1 体细胞克隆成功率低
同体外授精相比,效率低是目前核移植技术应用发展中普遍存在的现象。主要表现在:囊胚发育率不稳定,移植后受胎率低,出现畸胎、死胎、流产以及出生后早亡率高,造成效率低。但不同的学者对此产生的意见却不一,有人认为是培养条件未达到最佳化,也有人认为是细胞的问题,现有资料表明,即使应用体内培养的方法成活率也不过10%,看来试图通过改进培养体系来提高核移植效率还无从着手。因此,要更深入地研究核质间的互作机理,以便使核移植技术得到进一步改善。
2.2 供体核与受体胞质细胞周期同步的问题
第一次体细胞核移植获得成功的重要因素之一就是对细胞周期同步化的认识,而且研究人员也首次认识到应用G0期细胞的必要性。目前体细胞核移植中常用的方法就是将处理后的供体细胞核移入到去核的MII期卵母细胞中,迄今为止,几例成功的猪体细胞核移植研究中,都采用了去核的成熟MII期卵母细胞作为核受体。大多数研究者认为用成熟的去核MII期卵母细胞作为核受体,有利于启动已分化的供体核在重构胚中的再程序化,保证一定的核移植成功率。当用去核的MII期卵母细胞作为受体细胞时,必须使供体细胞与受体细胞的细胞周期同步化,这样有助于重组胚胎的发育。在卵母细胞激活后,MPF活性下降、染色质去凝集,在核膜重建的过程中DNA复制,染色体加倍,因而核移植时供体细胞周期的选择对于第一次细胞分裂末期,染色体二倍体的保持是很重要的。
2.3 体细胞基因突变和其他遗传问题
研究证明,基因突变与DNA复制次数有着密切的关系,分裂次数越多的体细胞,发生突变的可能性越大。对于核移植材料来源方面,这是不可避免的问题。如果把动物的基因组弄清楚,并能对体细胞的突变基因加以修复的话,核移植的效率一定能够得到大大的提高。
3 哺乳动物核移植技术的应用前景
3.1 扩大优良育种群和拯救濒危动物
采用核移植技术可加速育种的过程,在短时间内有效地扩大种群的数量,保持种群的性状,避免了自然交配所带来的优良性状的分离和减弱。将核移植与基因打靶相结合,可以对物种的基因进行定点修饰,产生具有优良性状的新品种。用家畜的体细胞进行(下转第97页)(上接第33页)基因打靶可将我们感兴趣的目的基因插入到特定的位置,把筛选出的阳性克隆作为核供体进行核移植,这样便可获得组织特异性表达的转基因动物。
3.2 体细胞克隆技术在医药生产方面的价值
将体细胞克隆技术与生物反应器的生产制作技术结合可以对体细胞进行转基因或基因组修饰后,制作生产生物反应器利用动物的乳腺、膀胱等器官,生产治疗人类疾病、保健所需的蛋白。许多全球知名的生物技术企业尤其看重体细胞克隆技术在这些方面的应用价值,纷纷投资科研机构开展研究,实际上第一个体细胞克隆动物绵羊Dolly的诞生就是这种动机的直接产物。
3.3 在临床方面的作用
通过深入研究细胞核质的相互作用控制胚胎细胞的分化方向,有望获得适合向人体移植的具有遗传改变的动物器官。通过细胞核移植技术可以避免不必要的免疫排斥作用。目前,人们已经利用体细胞克隆技术获得了小鼠-小鼠、人-兔、人-人ES细胞系,并已经在小鼠模式上开展了如帕金森氏症等神经退行性疾病的治疗尝试。
4 结语
尽管目前来看,哺乳动物核移植仍然面临很多问题,哺乳动物核移植技术自身仍在不断完善中但相信随着分子遗传学、细胞生物学和发育生物学等相关基础学科的进一步发展,哺乳动物核移植将在未来的生物学及人体器官移植等方面扮演着重要的角色。S
哺乳动物细胞 篇2
由于本节要训练学生的能力太多，为了保证顺利实施教学方案，还必须做到如下几点：
1、平时的教学中要提倡学生敢于质疑，乐于探究的学习习惯。我一贯坚持这种理念，所以学生在本节课提出了许 多值得探究的问题，如为什么要滴生理盐水?能否改用其他染液?口腔溃疡处的细胞与正常的口腔上皮细胞有何区别平等。
2、课前要嗽好口或自带一瓶清水，用消毒牙签时要注意安全，不要刺破口腔，老师最好示范一下。
3、有的学生觉得在口腔里面取细胞很恶心，教育他们要有科学精神。
4、对于口腔里面的上皮细胞，压片时并没有植物那样容易，老师应先做好一片装片用显微投影在屏幕上，让学生了解这些上皮细胞成什么形态后再自己观察，这样易于学生找到细胞，而且也不用老师逐个指导。
5、由于学生的人数太多，一节课很难保证关注到每一组同学，所以我只能在每一列(共4个列)培养一名得力助手，由他负责对本列的每一小组的实验情况进行评价，最后评出每一列的冠军，老师给予表彰。
哺乳动物细胞 篇3
关键词：克隆 核移植 异常发育
中图分类号：Q132 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2013）14-0036-03
1997年2月27日，英国《自然》杂志公布了一项爱丁堡罗斯林研究所威尔莫特等人的研究成果：经历了247次失败之后，终于在1996年他们得到了一只克隆雌性小绵羊，取名“多利”。自从多利产生国内外生物科学工作者在克隆动物技术上取得了显著的成绩。在畜牧业中，克隆动物具有提高动物生产性能、繁育优良品种、改善畜产品质量等优势；在医药方面，克隆动物在研究人类疾病模型、异种器官移植和生产生物医药产品方面都显示出了巨大的研究潜力。但是目前生产的克隆动物普遍出现死亡率高，个体发育不正常的现象。通过研究发现这一现象与许多细胞因素有关，包括：核供体的重编程、卵母细胞的成熟发育、X染色体活性和基因表达、线粒体的变化、细胞因子的效应等。
1 核供体重编程和卵母细胞成熟
核移植一大目的就是获得多产的后代，但是要成功的获得后代还需要许多事件能够正常发生。首先就是核供体需处在一种能够被重塑，基因组能够被逐渐的重编程的状态；其次就是受体卵母细胞必须成熟，能够启动重组胚的发育；再者，就是体外培养体系必须适应这种胚胎的生长需求。代孕动物的生理状态对核移植后代的成功繁育也有着十分重要的影响，例如，处于排卵前或是排卵后的状态，不同的季节等对应的胚胎的妊娠率和分娩率都有所不同。
核移植过程中，目前不仅囊胚发育率和妊娠率较低，而且产生的后代个体也多有异常问题而出现新生胎儿出生不久就死亡的现象。主要表现在胎儿个头大，心脏肥大、卵圆孔闭合不全、瓣膜发育不全，肝脏肿大和充血、肝组织发育不全、脂肪沉积严重，肺不能正常充气、形态畸形，脾脏较小、出血，肾脏不成形、伴有大量脂肪沉积，脑组织发育不全、含量少，等。1-7究其原因，除了上面提到的，估计得追溯到表观修饰异常和发育相关基因表达异常等细胞内深入的活动机制上来。8-10
2 X染色体
由于剂量补偿效应，哺乳动物的雌性胚胎中的一条X染色体会发生失活。Xist基因的表达决定了这一效应的发生，而且Xist在二细胞时期就开始表达。其表达还引起了子代细胞中X染色体复制不同步，特别是在胚胎致密化之后，这种不同步X复制的细胞比例逐渐增加。
体外生产的胚胎在培养过程中，雄性胚的生长状况要优于雌性胚，特别是在培养液中含有高浓度的葡萄糖、血清以及相对较高的温度都会给雌性胚的生长带来不利影响。这种发育的二态现象，很可能是由于培养环境引起了基因的差异表达。但让人迷惑的是，有一研究发现，有384个基因在正常胚与体外形成胚里表达有差异，其中85%基因在IVP胚胎中表达下调；而与X染色体相关的基因表达却上调11，而且这一情况在雄性胚和雌性胚中相同。Xist与二态现象之间究竟有什么样的关系人需要进一步探索。
在研究X相关基因在存活和死亡克隆牛中的表达时，发现很多基因出现异常表达。有意思的是，Xist基因在雄性克隆牛的组织中呈高度甲基化，而在雌性克隆牛组织内Xist普遍处于低甲基化水平，而且出生后死亡的克隆牛比围产期死亡的还要低。这与核重编程不完全有很大的关系，而且与X染色体选择性随机失活受到干扰有关。尽管Xist基因的甲基化和Xist的转录都有是组织差异的，但是Xist基因DNA甲基化程度高的样品的Xist转录水平也高，这似乎暗示着还存在其他因素在调控Xist转录上起着更大的作用。总之，X染色体的剂量效应及其印记修饰状况与胚胎的正常发育有着重要的作用。
3 线粒体
线粒体在机体里发挥重要作用，它不仅给细胞直接提供能量，而且能维持细胞稳态，介导了信号转导和凋亡等生理活动。线粒体在细胞内的数量，形态和分布状态都影响着细胞的生理功能。线粒体内部基因功能不全，其分离、融合等过程都受到核基因的协作。在成熟的卵母细胞中线粒体的拷贝数约为105个，当其受精后，胚胎发育到囊胚的这段时期，线粒体都不重新合成，都是使用卵母细胞遗传而来的线粒体。近来，研究发现含有高拷贝线粒体的卵母细胞其受精率更高，而且对胚胎发育更有利。Wai等发现含有4000个拷贝的线粒体能够发育到胚胎附植前，而要能够完成完成附植后发育线粒体的数量至少要40000-50000个12。对附植前的胚胎进行研究，发现体外培养条件能引起胚胎内线粒体过早的开始复制，线粒体的形态与定位模式也有所改变。但是目前线粒体影响细胞功能的详细机理还不太清楚。
4 细胞因子
目前，由体细胞核移植或体外受精生产的胚胎成功发育为个体的成率要低于10%。高达70%的核移植胚胎在妊娠的前三个月就会发生流产。而胎盘发育异常是这一现象的主要原因，表现为胎盘子叶重量增加，胎盘子叶数量减少。即使部分胚胎幸运地发育到个体，不少个体也会出现巨大综合症。这些克隆带来的非正常现象，主要与基因不能按照正常的模式表达有关。其中，与细胞分裂增殖和个体生长发育密切相关的类胰岛素生长因子，及其对应的受体和结合蛋白的正常表达对维持胚胎的正常发育有重要的意义。
IGFs有两种类型，IGF-I和IGF-II。IGF-I既有促进生物合成代谢的功能，又有促生长的功能。IGF-II可以介导酶和生物大分子的降解。结合蛋白除了能运输IGFs帮助其定位外，还能延长其半衰期以及调节其活性。它们在胚胎发育期的一个重要的作用就是可以调节出生个体的大小。
研究发现：在25日龄牛胚中，体外受精产生的胚胎表达的IGF-I的水平要显著高于正常发育的胚胎组织；核移植形成的胚胎表达的IGF-II的水平又要显著高于体外受精形成的胚胎；核移植产生的胚盘组织中表达的IGF-II的水平也要显著高于正常的胚盘13。研究还发现：看似正常的克隆牛在出生时血浆中IGF-II的浓度明显高于人工受精的正常对照牛，而出生15天后的IGF-II浓度明显降低； IGF-I在妊娠150天胎儿血浆中的浓度明显高于IVP的正常对照；核移植胎盘尿囊液中IGFBP-l的水平也明显升高14。
5 结语
当前动物克隆技术作为一项新技术，由于其巨大的科研价值和应用价值而发展迅速，但是克隆动物成活率低成为此项技术的制约瓶颈，在克隆动物技术中还存在许多科学问题仍尚待解决。克隆动物的异常发育原因可能与细胞内活动的许多因素都相关，除了上诉提到的因素以外，还有组蛋白的修饰、其他类型的细胞因子、体外培养条件等方面的因素。时下较为流行的重编程理论和表观遗传学理论还不能在微观层面深入对异常发育现象作出合理的解释，新的研究方法和技术以及新发现急需出现。
参考文献
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哺乳动物细胞 篇4
本文就BCB在筛选成熟培养前的卵母细胞后,对于卵母细胞质量、后续胚胎发育效率和早期胚胎发育相关基因表达的影响方面的研究予以综述,期望对于动物胚胎工程研究领域的同行有一定的借鉴意义。
1 BCB筛选卵母细胞质量的研究
在BCB筛选小鼠卵母细胞的研究方面,有研究发现[10],BCB+组的卵母细胞染色体周围核仁的数量较多,并且其胞质成熟较充分(通过GSH水平和线粒体的分布方式),成熟后期具有较好的发育潜力。这个结论已经在很多动物中卵母细胞筛选中得到证实,概述如下。
(1)在BCB筛选牛卵母细胞的研究方面,有研究发现:用26、39、52μmol/L的亮甲酚蓝染色后所得到的BCB+组(27.7%、27.6%、31.9%),较13μmol/L的亮甲酚蓝染色后所得到的BCB+组(2.1%)差异显著,而且其BCB染色后,BCB+组的体外成熟率(77.4%)显著高于BCB-组(51.3%)和对照组(60.2%)[11]。
(2)在BCB筛选猪卵母细胞的研究方面,有研究发现:BCB+组卵母细胞的核成熟率(80.8%)显著高于BCB-组(44.2%)和空白对照组(72.4%)[12]。此外,在通过BCB染色提高猪体外胚胎培养体系的效率的研究中发现[13]:BCB+组的猪卵母细胞的91.16%已经达到减数分裂Ⅱ期,显著高于BCB-组(64.10%)和对照组(77.15%)。
(3)在BCB筛选山羊卵母细胞的研究方面,有研究发现:BCB+和BCB-组的卵母细胞的平均直径分别为136.6、125.5μm,可见BCB+组的卵母细胞显著长于BCB-组(P<0.001);BCB+和BCB-组的卵母细胞的体外成熟率分别为81.4%和52.5%,并且BCB+组也显著高于对照组(72.4%);此外,BCB+组卵母细胞的正常受精率(23.5%)也显著高于BCB-组(8.2%)和对照组(11.9%)[14]。
由此可见,以亮甲酚蓝染色为基础的哺乳动物卵丘—卵母细胞复合体的区分可以用来有效地选择更具发育活力的卵母细胞,为后续转基因动物的研究奠定基础。
2 BCB筛选后早期胚胎发育效率的研究
在研究BCB对于牛卵母细胞选择后胚胎进一步的发育发现,胞质染蓝色的牛体外受精胚胎的囊胚率达到32.99%,而对照组和无色组分别为17.64%和3.57%;同时进一步进行核移植研究发现,在用BCBG筛选的卵母细胞进行核移植研究发现[15]:BCB+组不仅可以获得较高的核移植囊胚率,而且其囊胚细胞总数也显著高于对照组、控制对照组和BCB-组[16]。有研究发现,经过BCB筛选能够显著降低牛卵母细胞后续的胚胎发育细胞凋亡率,BCB+组、对照组和BCB-组的凋亡率分别为6.50%、28.21%、39.06%。最近的研究发现,BCB+组的孤雌囊胚形成率达到32.9%,而BCB-组的孤雌囊胚形成率仅为10.1%;BCB+组显微操作核移植胚胎的囊胚发育率(14.1%)显著高于BCB-组(3.4%),但与对照组之间无显著差异;各组手工克隆胚胎发育率之间无显著差异[12]。有研究发现,BCB+组、对照和BCB-组孤雌猪胚胎的囊胚率分别为34.19%、23.11%和9.15%,BCB+组比BCB-组显著高25.04%;BCB+核移植猪胚胎的囊胚率可以达到23.10%,而BCB-组的囊胚率仅有5.10%。通过对BCB染色的猪卵母细胞的孤雌胚胎和核移植胚胎发育情况的统计分析发现,BCB+组孤雌囊胚率和核移植囊胚率分别为34.28%和23.74%,显著高于BCB-组(12.25%和6.28%)和对照组(26.52%和17.05%),并且BCB+组具有较多的囊胚细胞[17]。
综上可见,以亮甲酚蓝染色为基础的卵丘—卵母细胞复合体的区分可以用来有效地选择更具发育活力的卵母细胞,其后续构建的胚胎具有更大的发育潜力。因此,亮甲酚蓝可用于卵母细胞染色的选择,并作为判断卵母细胞质量的一个重要标记。
3 BCB筛选后早期胚胎相关基因表达的研究
最近的研究发现,BCB+组卵母细胞的胞质成熟对于受精后正常的胚胎发育是至关重要的,亮甲酚蓝染色液(BCB)能有效筛选出胞质成熟卵母细胞[18]。为进一步了解经过BCB筛选的卵母细胞中母源基因m RNA表达量的差异性,进而更为准确地评价BCB对卵母细胞筛选的可行性和可靠性,判断母源基因与卵母细胞的胞质成熟的相关性,为深入了解哺乳动物卵母细胞成熟和早期胚胎发育提供技术手段。经过BCB筛选后对于不同类卵母细胞的母源性物质表达差异研究表明,4种母源基因(Gdf9、Mater、Zar1和Dnmt1)在BCB+卵母细胞中的表达量显著低于BCB-(P<0.05),说明上述基因的m RNA表达量可能与卵母细胞的质量呈现负相关关系。此外,研究结果还表明,越接近成熟24 h的绵羊卵母细胞其玻璃化冷冻保存的效果越好,而上述4种基因的m RNA表达量与玻璃化冷冻呈现一定的相关性,可能与卵母细胞质量、体外培养效率呈负相关关系[19]。
动物细胞教学反思 篇5
难点，从而能更容易地达到了教学目的，使学生在愉快、轻松的环境中获得知，识培养了技能。因此多媒体辅助教学逐渐成为目前教学技术手段的主流之一。
通过这节课的教学尝试，使我感受到了改变教学方法的重要性以及得到良好效果的快乐，也看到了学生的那种渴望创新、探索、渴求表现的要求，也使我看到了学生们的巨大的潜能，更大的发展性、可塑性，对于我在今后教学中给予学生更大的发展空间提供了基础。我会不断实践、不断学习、不断反思来不断的提高自己的教学水平。成为一名受学生欢迎的老师和朋友，达到一种“亦师亦友”的境界。
总之，在今后的教学中我会发挥自己的优势，多利用多媒体教学，也会多向其他教师学习，取长补短。
哺乳动物细胞 篇6
教师设问：展示番茄马铃薯植株，请问该植物体通过什么完成？
生：植物体细胞杂交。
师：回顾必修1：1970年，有两位科学家做了一个人—鼠细胞的融合实验，以证明细胞膜上的蛋白质分子是运动的。那么，如何实现人—鼠细胞的融合，以及动物细胞融合后还有什么用途呢？今天我们一起学习动物细胞融合和单克隆抗体。
探究一：动物细胞的融合
师：问题1：植物体细胞杂交的过程是怎样的？
问题2：动物细胞融合时需要进行去壁处理吗？为什么？
生：先用酶去除两种植物细胞的细胞壁，使之成为原生质体，再用物理或化学的方法，诱导两种原生质体融合成杂种细胞，最后用植物组织培养的方法把其培育成新的植物体。
请阅读P52第二段找到动物细胞融合的概念。
师设问：动物细胞融合是怎么一回事？
生：动物细胞融合，也叫细胞杂交，指的是两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。
师：动物细胞融合的基本原理与植物原生质体融合的基本原理是否相同？
生：应该相同。
师：对，动物细胞融合与植物原生质体融合的基本原理相同，那么动物细胞融合的具体过程是否也和植物原生质体融合的过程一样呢？
生：应该基本一样吧？
师：植物体细胞杂交诱导原生质体融合常用的方法有哪些？
生：物理法、化学法。
师：动物细胞融合能利用上述两类方法吗？还有其他方法吗？
生：生物法：灭活的病毒。
师：灭活的含义？融合的原理？详读生物资料卡寻找答案。
生：因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。
师：思考1：不灭活的病毒能做诱导剂吗？
生：不能，因为不灭活的病毒会感染细胞，而不能诱导细胞融合。
师：回答得非常好！从示意图中我们可以看出，把两个不同的动物细胞放在一起，用灭活的病毒处理细胞后，它们就先质融合，再核融合，进而形成杂交细胞，这个细胞有丝分裂后仍能形成两个完整的杂交细胞。刚才我们是用两个动物细胞，那在实际中我们用多少个动物细胞合适呢？
生：多个。
师：为什么用多个呢？如果有很多个杂交细胞，那么如何处理呢？这个问题大家下去后讨论一下。在弄清楚动物细胞融合的原理和过程后，还需说明的是任何一项技术的发现，都不是凭空产生的，必定有一个发展的过程，下面我们阅读课本P52中的小字，了解动物细胞融合技术的发展简史。
思考2：两两融合后可产生几种杂交细胞？
生：两种，自身融合，非自身融合。
师：意义：打破生殖隔离，使远缘杂交成为可能；广泛应用；制备单克隆抗体。
物种间由于存在生殖隔离使得有性杂交方法有局限性，而细胞融合技术能打破生殖隔离，使远缘杂交成为可能。
正因为如此，细胞融合技术已广泛应用于细胞学、遗传学、免疫学及生物新品种培育等领域，但此技术还有一个十分重要的用途，就是制备单克隆抗体。那么单克隆抗体是什么呢？与克隆、抗体有什么关系呢？下面我们就共同学习单克隆抗体。
探究二：单克隆抗体制备原理
师：在弄清什么是单克隆抗体之前，我们先回顾抗体的基础知识，思考1：传统的抗体生产方法及缺陷是什么？抗体是从何来的？请同学们在阅读课本P52的最后一个自然段的基础上，讨论这个问题。
生：传统的抗体生产方法是向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需要的抗体。这种生产抗体的方法产量和纯度都很低，而且制备的抗体特异性差。
师：回答得很好！下面我们再来讨论第二个问题2：抗体是由上面细胞产生的？B淋巴细胞有什么特点？请同学们继续阅读课本P53第一自然段，讨论并回答这个问题。
生：B淋巴细胞能产生抗体，但每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。
师：很好！根据B淋巴细胞的这个特点，若要想获得大量的单一抗体，则如何做呢？
生：克隆细胞群。
师：阅读教材P53，找出单克隆抗体的概念。
生：单个效应B淋巴细胞克隆：无性繁殖。
概念：单个效应B淋巴细胞克隆形成细胞群，细胞群产生的化学性质单一、特异性强的抗体。
师：一个B淋巴细胞不能无限增殖，科学家是如何解决这一问题的呢？阅读P53，两位科学家的设想是什么？
生：科学家的设计方案：
一种效应B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 骨髓瘤细胞能无限增殖
活动探究三：单克隆抗体的制备
师：设问1.注射特定抗原的目的是什么？
生：使小鼠脾脏细胞中产生特定抗体的效应B淋巴细胞。
师：设问2.从小鼠脾脏中分离效应B淋巴细胞是一种还是多种？
生：是一系列效应B淋巴细胞B1B2B3……
师：设问3.诱导细胞融合的手段有哪些？
生：离心、振荡、电刺激、PEG、特有的灭活的病毒。
师：设问4.若细胞两两融合后，有几种融合情况？处理后的细胞种类有几种？
生：三种：BB、B瘤、瘤瘤。
五种：BB、B瘤、瘤瘤、B、瘤。
师：设问5.第一次筛选的目的是什么？阅读P54第五行。
生：筛选出杂交瘤细胞（一系列的多种杂交瘤细胞）。
师：设问6.第二次筛选是为什么？具体如何实现克隆化培养和抗体检测？
生：第二次筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。
师：详细讲解抗体检测及克隆化培养（拓展）
通常用“有限稀释法”选择。将杂交瘤细胞稀释，用多孔细胞培养板培养，通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那么上清液可与特定X抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞还不能保证是来自单个细胞，可能既有能产生特定抗体的杂交瘤细胞，又有其他杂交瘤细胞，挑选阳性孔的细胞继续进行有限稀释，一般需进行3～4次，直至确信每个孔中增殖的细胞为单克隆细胞。
该过程即为杂交瘤细胞的克隆化培养。
经过多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
活动探究四、单克隆抗体的应用
师：1.单克隆抗体最主要的优点是什么？
生：特异性强、灵敏度高，可大量制备。
2.单克隆抗体的应用有哪些？
（1）诊断试剂——最广泛应用
在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等，与常规抗体相比，具有准确、高效、简易、快速的特点。
（2）治疗疾病和运载药物
主要用于治疗癌症，单克隆抗体作为载体，运载抗癌药物，形成“生物导弹”，准确杀伤癌变细胞。
“生物导弹”=单克隆抗体+药物
优点：疗效高、副作用小。
动物细胞培养技术研究现状与思考 篇7
动物细胞培养技术在生物、医学等研究领域都有着广泛的应用, 动物细胞培养方式包括原代和传代培养。培养方式有贴壁、悬浮以及固定化培养等方式。动物细胞的生长除了要给细胞组织提供一个无菌、恒温的环境, 还要给予充分的营养。动物细胞培养技术有着很大潜力的开放空间, 前景光明, 但是它同时也面临着技术方面的诸多问题和挑战。本文将通过分析细胞喂养技术取得的进展, 探讨动物细胞培养存在的问题以及动物细胞未来的发展方向, 从而建立并筛选出合适的细胞系培养方法。
1 动物细胞培养的基本概念
细胞培养指的是从体内组织取出细胞, 并为其提供一个无菌、具有适当温度及酸碱度的环境, 给予充分营养, 使其生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。从体内取出的细胞进行的首次培养式细胞培养最初的阶段, 也称为原代培养。原代培养式细胞培养当中重要的必经环节。原代培养细胞生长到一定时候后, 由于受群体环境影响, 需要转移到另一个容器, 这种培养称为传代培养。传代后的动物细胞与原代培物形状一致的话, 则表示传代成功, 这些细胞称为细胞系或细胞株。
2 动物细胞培养技术的内容
2.1 体外培养动物细胞的生物学特性
动物细胞没有细胞壁结构, 机械强度低, 对剪切力较为敏感, 因此无法很好地适应体外环境。此外, 在体外进行培养的细胞失去了神经体液调节以及细胞间相互影响等作用, 她们不仅失去原有组织结构, 还不易保持原有细胞形态, 处于缺乏动态平衡的生活环境中, 分化能力也降低, 直至发展成为恶性细胞。因此, 在体外进行动物细胞培养应密切关注体外细胞的状态, 生长环境提供的条件是否适宜生存, 有无被微生物感染等。
2.2 细胞培养所需环境
(1) 无菌无毒环境无菌无毒的操作环境是保证动物细胞体外培养成功的前提。体外培养细胞面临着被微生物感染或受自身代谢物质影响的难题, 因此, 在进行体外细胞培养时, 要及时清除细胞产生的代谢废物, 确保为体外培养的细胞提供一个无菌无毒的生存环境。
(2) 气体环境气体主要是O2和CO2, O2可以给细胞提供能量, 而CO2不仅是细胞增殖所需的物质, 也是其自身的代谢产物, 此外, CO2还有着调节培养基p H的作用。
(3) 温度适宜的温度能够维持细胞持续旺盛生长, 若温度超出适宜温度范围, 不仅会影响到细胞的正常代谢, 损伤细胞, 甚至会使其致死。
(4) 缓冲环境缓冲环境的作用是为细胞提供一个酸碱度在培养细胞生理范围内的培养液, 提供水分和无机盐, 维持细胞的正常代谢。
(5) 培养基培养基分为天然培养基和合成培养基两种, 它是细胞生长繁殖的直接环境, 为细胞提供所需的营养。天然培养基是从动物体液或组织中分离提取获得的。血浆、血清以及淋巴液等物质都可作为天然培养基。动物细胞培养主要用的是合成培养基。合成培养基含细胞生长所需的无机盐、糖类、维生素、氨基酸等基本物质, 有特殊要求的还会添加适量血清。
2.3 细胞培养方式
(1) 贴壁培养对于那些具有贴壁依赖性的细胞一般使用贴壁培养的方式。一般这样的细胞需贴附于不起化学作用的物质的表面生长, 最终在表面生长至单层, 当整个平面被铺满时, 细胞会出现接触抑制的现象。
(2) 悬浮培养悬浮适应细胞、肿瘤细胞等非贴壁依赖性细胞不需要生长的支撑面, 细胞可悬浮于液体培养基, 并大量增殖。因此, 悬浮培养是大规模细胞培养的理想方式。尽管, 动物细胞培养当中存在着各式各样的困难, 科研人员还是会不断提高分子生物学的研究水平, 扩大研究范围, 因为动物细胞培养技术是多个学科研究领域当中重要的工具。
(3) 固定化培养无论是贴壁依赖性细胞还是非贴壁依赖性细胞都可用固定化培养方式进行体外细胞培养。固定化培养属于包埋培养方式, 目前已有的固定化培养方式包括微载体培养、中空纤维培养以及微囊发培养三种方式。固定化培养不仅剪切力较低, 传递效果较好, 而且还易于收集并分离纯化细胞产物。用此种方式培养的细胞也具有较强的抗污能力, 细胞生长较为集中, 生长密度也高。
3 动物细胞培养存在的问题及展望
近一个世纪以来, 动物细胞培养技术经过研究人员的不断开发, 已经有了很大的进步。但是, 目前的技术水平还无法彻底满足细胞生物制品开发和生产的要求。首先, 由于动物细胞培养的技术和方法还不太成熟, 细胞的成活率和利用率较低, 从而造成动物细胞技术效率较低的现象发生。其次, 在进行较长时间、较大规模的细胞培养中, 工作人员无法排除细胞代谢产物对自身的影响, 且细胞群体的生理机能也会在这个过程中受到影响, 一般会表现出分泌和代谢能力的降低甚至丧失。此外, 动物细胞培养技术所用的培养设备和培养用微载体耗费昂贵, 导致研究成本增加, 限制了我国大规模开展动物细胞培养的工程。
4 总结
动物细胞培养技术在未来的发展方向应将重点放在优化细胞环境, 改进细胞特性等方面上, 最终达到提高生物制品的产率和产量, 扩大生产规模的效果。尽管, 动物细胞培养当中存在着各式各样的困难, 科研人员还是会不断提高分子生物学的研究水平, 扩大研究范围, 因为动物细胞培养技术是多个学科研究领域当中重要的工具。在不久的将来, 许多生物实验材料和工业化生产都需要动物细胞培养技术来开展自身的研发工作。
参考文献
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动物细胞培养技术教学实践与探索 篇8
通过大量的问卷调查和日常接触,我们发现医药专科生普遍存在理论基础差,底子薄,并且学习积极性不高的特点。根据学生的这个特点及我们培养应用型人才的培养目标,在实际教学过程中,我们采取以学生为主体设计来设计课程,倡导自主、合作、探究的学习方式。教学主要根据专科层次的专业设计特点,特别强调理论知识与对应的细胞培养操作技能关联学习,通过课堂教学活动的组织和教学评价强化学生的技能。
1 理论和情景教学相结合的课程设计
基于动物细胞培养的工作过程,按照动物细胞培养的工作任务结构,本课程主要设计了三个方面的内容,即动物细胞培养的仪器设备设施条件,动物细胞培养的基本技能,药学细胞工程常见技术。本课程在学生学习了《药用基础化学》、《有机化学》、《医学基础》、《微生物学基础》、《基础生物化学》和《生物药品》等课程之后开设,目的是使学生有了一定的生物学基础知识和相对扎实的化学基础知识和操作技能之后,能更好地完成本课程的学习要求。
没有理论指导的实践是盲目的、不规范的,因此医药专科生在学习细胞培养技术之前,必须先学习理论知识。传统的学习方法是先进行理论教学,后穿插进行实验教学。我们针对医药专科生理论基础相对薄弱,学习能力欠佳的特点,没有采用传统的教学方法,而是采用理论和情景教学相结合。对理论内容进行精心选择,紧扣实验的需求和工作中应用的需要,在实验技术上注重基本技能的培养和常见技术的实践。同时按照动物细胞培养的特殊要求,我们设计了循序渐进的7个学习情境:(1)常见细胞培养实验室的布局;(2)细胞培养主要仪器设备的操作;(3)细胞培养用液的配制;(4)无菌操作技术及细胞培养无菌器材的准备;(5)细胞培养的基本操作,包括传代培养、克隆化培养、原代培养、扩大培养;(6)细胞大规模培养与生物反应器技术;(7)细胞冻存与细胞复苏技术。对于每一个学习情境,我们采取理论和实验教学并行的模式,对于基本的实验技能如显微镜的使用、传代技术及细胞计数技术等我们鼓励学生发挥卖油翁的精神,反复操作直至技术娴熟。
2 实验教学活动的组织
2.1 课前准备
在上课前写好板书,将本次情景学习的重点部分写在黑板上。这样做一方面可以让学生在课前很快了解本堂课需要掌握的知识,并对即将展开的情景学习设置一些相关的问题,如“动物细胞培养液的主要成分是什么?”、“为什么培养前要将细胞分散成单个细胞”等,让学生带着问题和思考进入学习,在实验中更好理解和学习知识,避免对知识死记硬背,达到情景教学的目的。
2.2 教学过程组织
2.2.1 固定分组
从第一次实验就要进行固定人员的分组,这样有利于配合和相互协作,也有利于锻炼团队协作能力。每小组的人员不宜太多,2~3为宜,统筹规划实验流程,高效完成实验内容。根据当堂的实验,教师提前统筹安排好各组成员的任务,使实验有序高效地进行。对于有些不需要相互帮忙的实验尽量安排一人一组,目标是通过本课程的学习,每个学生都具备独立完成相应实验操作的能力。
2.2.2 实验演示
实验课是需要学生自己动手操作来完成课堂的内容,学生的操作是否正确,很大程度上取决于教师的指导,因此教师必须做好示教。首先有教学经验很丰富的教师来担任主任课老师;其次要求任课老师在上课之前对内容了如指掌,参加集体备课,统一带教标准,明确教学重点、难点;最后根据教师在企业挂职和走访经验,在示教过程中强调标准化操作流程(SOP),将实验的标准操作步骤和要求以统一的格式描述出来,指导和规范日常的教学工作。
2.2.3 学生操作
在教学过程中,教师放手不放眼,全程观察学生的每一个操作过程,鼓励学生大胆细心操作,遇到问题要自己先仔细思考。经过一些实验的训练和尝试,同学们操作技能有了很大的提高,同时思考问题的方式也有了较大的转变,由原来不会直接问老师“这要怎么做?”转变成了自己思考后问老师“我这样做对吗?”。
2.2.4 操作考核
在七个教学情境中,我们选取了传代培养、克隆化培养及冻存与复苏等实验进行操作考核。传代培养考核主要考核学生的无菌操作能力及细胞消化、吹打和计数的综合能力,具体要求学生连续传代2个月的时间,最后根据学生传代细胞的培养状态(有无染菌、死细胞多少等)进行评分;克隆化培养考核除了考核学生细胞计数、消化和吹打等技能之外,还考查学生实验设计和计算能力,最后根据单克隆孔的多少进行打分;细胞冻存和复苏实验除了考核无菌操作和细胞计数之外,主要考核学生实验任务的组织能力、操作手感及冻存液配制能力等,最后通过自己冻存细胞的复苏存活率进行考核。动物细胞培养对生物制药专业的学生来说是一门非常重要的技术,只要是技术都免不了要反复的联系,我们以任务驱动的模式让学生反复练习其中最基本的技能,并通过考核来检验他们的学习成果,同时如果学生不满意自己的成绩还可以在课程开设期间重新参加考核,通过这种方式,让学生真正掌握细胞培养的基本技能,养成良好的实验习惯,为他们从事相关工作打下扎实的基础。
2.2.5 课后总结
动物细胞培养技术这门课程是实践性非常强的课程,实验结束后学生都会有自己的操作体会,还会有相应的实验结果,细胞培养的结果我们要求学生倒置显微镜拍照后提交到教师机,其他具体的实验目的、原理、试剂材料、步骤、结果及分析等内容则要求写成实验报告,教师对学生的实验结果及报告进行批改,并对有问题的地方进行标注。最后,对于一些共性的问题下次课上课前进行统一的点评,是学生对相应的操作有更好、更深的理解。
3 教学评价
多元化评价是指对每组或每位同学的实验课成绩考核多元化,既要通过课前预设计实验和课后的实验报告等纸质材料反映,也要通过多种手段和途径对学生的身心素质、专业知识、专业技能和个性特长等方面进行全方面的评价,其目的是促进学生的全面发展。动物细胞培养考核主要包括平时常规评价和过程与结果评价两部分。平时常规评价注重学习态度、考勤和随堂问题回答,占总成绩的20%;过程与结果评价包括三部分:(1)实验操作手法、实验结果与实验操作考核占总成绩的30%;(2)实验报告占总成绩的20%;(3)期末考核占总成绩的40%。
4 结论
实验课和其他实践教学环节是高校培养学生掌握实践技能、形成良好的工作习惯的必要过程,因而必须重视实验教学活动。上述动物细胞培养技术的课程设计、课堂组织和教学评价,目的使医药专科生掌握了基本的理论知识和操作技能,将企业的标准化操作流程灌输到学生的学习过程中,为学生在就业后尽快上手奠定了良好的基础。
摘要：动物细胞大规模培养技术已成为生物制药生产、研究和开发过程中一项非常重要的基本技术。探索从医药专科生的实际出发,围绕培养应用型人才的目标,从课程设计、课堂教学活动的组织到教学评价三个维度一体化教学实践,使学生掌握相关理论知识的同时,强化学生操作技能。
关键词：细胞培养技术,情景教学,操作考核
参考文献
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动物细胞工程实验教学改革与实践 篇9
但是, 通过对动物生物技术专业人才培养质量的深度解析后发现, 运用原有的课程体系、教学方法和实验方案等培养出来的学生已不能很好地适应日新月异的社会发展需求, 各个教学环节都需要进一步完善、改进, 如实验教学内容不够合理、实践教学体系不够规范、实验教学方法落后、学生缺乏系统训练等。因此, 为了培养出高素质的复合型专业技术人才, 吉林大学调整了实验教学体系, 在实验教学内容、教学方法等方面进行了改革, 逐步建立了一个比较完善的动物细胞工程的实验教学体系, 现介绍如下。
1 加强仪器设备配置, 更新管理观念
实验室的建设是进行动物细胞工程实验的前提条件及有力保障。吉林大学畜牧兽医学院2008年投资建设了符合GMP要求的动物生物技术综合实验室, 占地面积约400 m2, 投入资金500余万元, 设有12个功能实验室及4个辅助实验室, 包括细胞培养室、细胞株保存室、供应室、灭菌室、大型仪器室等, 配有细胞培养在线观察系统、生物安全柜、细胞融合仪、酶标仪、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、超纯水系统、AriaⅡ 流式细胞分析分选仪 (2009年购进) 等, 为实验课的顺利开展创造了良好的条件, 为实现理论知识向专业技能转换提供了重要平台。
鉴于仪器设备较昂贵, 应加强仪器管理, 采用专人负责制, 制订了仪器简明操作方法、注意事项, 对仪器的使用情况进行登记并定期维护保养, 以确保仪器的正常运转, 从而保证了实验课顺利开展。
2 精选实验教学内容, 凸显专业特色
2.1 重编实验教材
实验教材是教学的依据, 一本内容丰富、适合本科教学的实验教材, 既有利于强化实验基础理论知识的学习及实验操作能力的训练, 又有利于培养学生综合素质及创新思维能力。自编教材能够融合本院教师多年的教学科研实际, 引入最新内容, 体现本学院学科特色和科研优势, 而原有的实验教材内容已明显落后于科技前沿。基于上述原因, 学院组织本学科领域经验丰富的教师, 成立实验教材编写领导小组, 在原有实验教材基础上, 重新编写了《细胞生物学与细胞工程实验指导》, 并于2008年9月份由吉林大学出版社公开出版。新的实验教材增加了综合性、设计性实验的比例, 将最新理论和应用引到实验教学内容中, 使学生及时了解、掌握本领域科技发展前沿信息, 对学生的考研、就业等提供有力的支持。
2.2 整合、优化教学资源, 建立多层次实验教学体系
动物细胞工程是一门实践性和应用性很强的学科, 为了让学生真正掌握动物细胞工程这门学科的技术, 培养具有综合实践能力和创新能力的人才, 实验课程被分为3 个层次进行。共设置了基础性实验、综合性实验、科研创新与毕业论文相结合的设计性实验的多层次实验教学体系。
在基础性实验中, 设置了实验器材及培养基的制备, 仪器的操作培训, 骨髓瘤细胞SP2/0和BHK细胞的观察及计数, 细胞的复苏、冻存及传代, 小鼠的保定及眼眶取血, 原代细胞的培养等。强化了基础知识和基本技能的训练, 为后续的综合、设计、创新实验做了充足的准备。
在综合性实验中, 主要开设了人血清白蛋白单克隆抗体的制备实验。由于实验周期长, 考虑实验内容的关联性, 采取实验周方式进行。单克隆抗体的制备实验主要包括以下内容:Balb/c小鼠的腹腔注射免疫试验、饲养层细胞 (腹腔巨噬细胞) 的制备、杂交瘤的制备 (SP2/0与免疫脾细胞的融合) 、ELISA检测、亚克隆、腹水的制备及收获等。通过以上实验, 学生可以融会贯通基本技能, 提高综合思维和独立操作、解决问题的能力, 培养了学生综合实践能力。
在创新、设计性实验中, 积极将教师最新的科研成果转化到实验教学中去, 鼓励学生积极参加教师的科研课题研究, 使实验内容和科研项目紧密相连, 如G418对BHK-21细胞最适作用浓度的筛选、EGFP基因的转染及在Hela细胞中的表达、外源基因EGFP在细胞中的RT-PCR检测等。学生自主选材、自主设计、独立完成实验, 使学生更早地接触科学前沿, 掌握新知识、新技术、新方法, 开拓了视野, 培养和激发了学生对科学研究的兴趣, 同时也为参加吉林大学大学生创新实践计划及毕业论文的设计与完成奠定了坚实的基础。
3 创新实验教学方法, 激发学生学习兴趣
3.1 自主完成实验准备
动物细胞工程实验课所需实验试剂及耗材要求比较高;因此, 实验试剂、材料等的准备是实验进行的关键环节。改变以往由实验教师或实验辅助工提前做好实验准备工作的方式, 让学生自己完成全部实验过程, 包括细胞培养瓶、培养皿、5 mL弯头玻璃吸管、眼科剪刀和镊子等的清洗及干烤, 细胞培养基及各种母液的配制及高压灭菌, 无菌水及无菌材料的准备等。通过上述工作, 使学生充分了解了药品的用途及配制方法, 培养了学生的动手操作能力, 加深了对无菌概念的理解, 调动了学生的主人翁意识, 为成功完成实验课奠定了基础。
3.2 开放式教学
由于动物细胞工程实验课实验内容多, 连续性强, 实验周期长, 实验室资源有限, 在规定的上课时间无法满足学生要求, 这就要求实验室尽可能开放, 这也给实验室的管理工作提出了更高的要求。做法是:执行预约登记制度 (包括进入、离开实验室时间及领取试剂耗材、仪器使用等) ;通过上课前考核, 选择一些责任感强, 有一定实验室经历的学生为实验组长, 参与管理工作;同时, 将一定数目的实验技术人员和研究生纳入到实验室工作中。开放式教学使学生在课程设置阶段随时进入实验室, 有更多的机会进行实验技能训练, 增加了学生之间、学生与实验技术人员之间的沟通和互动, 也充分利用了学院拥有实验室及实验仪器设备的资源优势。
3.3 现代化教学手段的运用
动物细胞工程实验课涉及到仪器的使用方法、小鼠的保定、细胞的观察和计数、细胞的复苏和传代、人血清白蛋白单克隆抗体的制备等内容, 实验难度大, 操作复杂, 对无菌操作要求高, 稍有不慎就会导致实验的失败;因此, 开课前让学生撰写预习报告至关重要。为此, 笔者建立了QQ群, 将动物细胞工程实验课教学内容、教学安排、教学计划、视频等资料上传到群里, 使学生明确实验目的, 熟悉实验原理和方法, 了解实验过程中的注意事项及可能出现的问题。在实验课的讲授上, 改变传统填鸭式的教学方法。实验仪器操作方面, 采取制订简明操作流程及现场讲解相结合的方法, 使学生更准确地掌握仪器操作方法, 避免使用时由于操作不当造成仪器的损坏。在实验内容的讲解上, 采取多形式、多手段的方式进行, 如多媒体课件、演示动画、教学视频等, 利用网路资源, 多多收集与实验课相关素材;对实验操作中的难点及学生容易出现操作错误的实验, 教师可以把规范的实验过程用摄像机录下来, 制作DVD光碟;同时, 利用吉林大学农学部精品课建设的机会, 完成了“人血清白蛋白单克隆抗体的制备”的教学视频并投入使用, 视频中包括了小鼠的免疫、饲养层细胞的制备方法、细胞的融合、亚克隆、腹水的制备和获取及产物的纯化等内容。通过以上方式的教学, 使教学内容更形象直观、生动活泼, 增加了学生学习的主动性和趣味性, 激发了学生的创造性思维, 提高了实验的成功率, 取得了良好的实验效果。
4 健全学生实验考核体系, 提高实验效果
客观公正、真实有效的实验考核体系, 不仅能提高学生对实验的重视程度, 也能调动学生对知识探索的积极性, 增加学习兴趣, 督促和引导学生日常学习情况和态度, 从而提高实验教学的效果[3]。为此, 我们制订了多元化的考核体系, 包括平时成绩、实验报告、考试成绩、创新设计性实验评价、团队合作精神等。平时成绩占30%, 包括出勤率、预习报告的撰写、实验操作的熟练程度和正确性、值日情况等, 由老师、实验技术人员和实验组长打分;实验报告占30%, 主要考察学生原始数据的记录是否真实完整;对实验结果的分析讨论是否正确客观, 实验现象的解释是否合理;考试成绩占20%, 包括口试、基本实验技能操作、笔试成绩;创新设计性实验评价占15%, 主要考察学生在设计性实验部分的技术路线设计是否可行, 实验结果分析是否合理, 实验论文撰写是否规范, 答辩过程是否清晰流畅;实验团队合作精神占5%。新的考核体系, 从基础知识、操作技能、实验态度和科研能力等方面全面反馈了实验教学的质量。
5 加强师资队伍的建设与培养, 确保实验教学质量
动物细胞工程学科跨度大、实践性强, 科技信息量增长迅速, 因此对实验教学队伍建设提出了更高的要求[3]。目前, 该实验课的教学任务由吉林大学畜牧兽医学院生物工程教研室承担, 由1名教授主讲, 1名讲师和1名实验技术人员给学生示范操作, 3～4名博士研究生辅助参与实验指导, 近几年来逐步建立了教学、科研、理论和实验教学互通、知识结构合理、团结协作的实验教学队伍。在实验课开课前, 由经验丰富的教授负责组织集体备课, 共同研究讨论教学内容, 对参与实验指导的教师和研究生进行培训, 包括本学科领域的最新发展前沿、学术成果、新方法、新技术及学生在实验过程中的关键点、难点, 可能出现的问题进行系统地讲解, 从而保证了实验教学的质量。
6 小结
经过几年的教学改革, 动物细胞工程实验课取得了明显的教学效果, 激发了学生的学习热情, 学生动手操作能力、实验设计能力、分析解决问题能力和理论联系实际能力明显提高, 许多学生在此基础上申请了国家级和校级创新实验项目, 积极参与教师科研项目, 撰写学术论文并在核心期刊上发表, 为学生毕业论文的选题和完成奠定了坚实的基础。
摘要：为满足动物细胞工程实验教学体系和模式改革的需求, 吉林大学通过对仪器设备更新换代、重编实验教材、建立多层次实验教学模式、采用开放式教学、健全实验考核评价制度、强化师资力量等方法, 建立了动物细胞工程的实验教学体系。结果表明:新教学体系提高了实验教学质量, 激发了学生的学习兴趣, 为培养高素质复合型动物生物技术专业人才打下坚实基础。
关键词：动物细胞工程,实验教学,教学改革
参考文献
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哺乳动物细胞 篇10
动物细胞大规模培养的操作模式, 主要分为分批式操作、流加式操作、半连续式操作、连续式操作和灌流式操作等五种操作模式。
1 分批式操作
批式操作是动物细胞规模培养进程中较早期采用的方式, 也是其它操作方式的基础。该方式采用机械搅拌式生物反应器, 将细胞扩大培养后, 一次性转入生物反应器内进行培养, 在培养过程中其体积不变, 不添加其它成分, 待细胞增长和产物形成积累到适当的时间, 一次性收获细胞、产物、培养基的操作方式。在细胞分批培养过程中, 不向培养系统补加营养物质, 而只向培养基中通入氧, 能够控制的参数只有p H值、温度和通气量。因此细胞所处的生长环境随着营养物质的消耗和产物、副产物的积累时刻都在发生变化, 不能使细胞自始至终处于最优的条件下, 因而分批培养并不是一种理想的培养方式。
分批培养过程中, 细胞的生长分为五个阶段:延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期。分批培养的周期时间多在3~5d, 细胞生长动力学表现为细胞先经历对数生长期 (48~72h) 细胞密度达到最高值后, 由于营养物质耗竭或代谢毒副产物的累积细胞生长进入衰退期进而死亡, 或由于细胞内某些酶的作用而使细胞发生自溶现象。表现出典型的生长周期。收获产物通常是在细胞快要死亡前或已经死亡后进行。
该方式的特点: (1) 操作简单。培养周期短, 染菌和细胞突变的风险小。反应器系统属于封闭式, 培养过程中与外部环境没有物料交换, 除了控制温度、p H值和通气外, 不进行其他任何控制, 因此操作简单, 容易掌握; (2) 直观的反应细胞生长代谢的过程。由于培养期间细胞的生长代谢是在一个相对固定的营养环境, 不添加任何营养成分, 因此可直观的反应细胞生长代谢的过程, 是动物细胞工艺基础条件或“小试”研究常用的手段; (3) 可直接放大。由于培养过程工艺简单, 对设备和控制的要求较低, 设备的通用性强, 反应器参数的放大原理和过程控制, 比较其它培养系统较易理解和掌握, 在工业化生产中分批式操作是传统的、常用的方法, 其工业反应器规模可达12000L。
经过改进的搅拌式生物反应器, 目前仍是大规模培养动物细胞用以生产各种药物的主要设备, 也是早期用以生产单抗的主要途径。在用搅拌式生物反应器分批式培养单抗中, 最多采用的是微囊或巨载体培养。与一般的悬浮培养比较, 杂交瘤细胞依托微囊化或巨载体后, 相对固定化, 降低了搅拌培养时对细胞的剪切力, 提高了细胞的密度和稳定性及生产率。
2 流加式操作
流加式操作是在分批式操作的基础上, 采用机械搅拌式生物反应器系统, 悬浮培养细胞或以悬浮微载体培养贴壁细胞, 细胞初始接种的培养基体积一般为终体积的1/2~1/3, 在培养过程中根据细胞对营养物质的不断消耗和需求, 流加浓缩的营养物或培养基, 从而使细胞持续生长至较高的密度, 目标产品达到较高的水平, 整个培养过程没有流出或回收, 通常在细胞进入衰亡期或衰亡期后进行终止回收整个反应体系, 分离细胞和细胞碎片, 浓缩、纯化目标蛋白。流加式操作只是向培养系统补加必要的营养成分, 以维持营养物质的浓度不变。由于流加式培养能控制更多的环境参数, 使得细胞生长和产物生成容易维持在优化状态。
流加式培养的特点就是能够调节培养环境中营养物质的浓度:一方面, 它可以避免在某种营养成分的初始浓度过高时影响细胞的生长代谢以及产物的形成;另一方面, 它还能防止某些限制性营养成分在培养过程中被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。同时在流加式培养过程中, 由于新鲜培养液的加入, 整个过程的反应体积是变化的。
流加培养主要有以下特点: (1) 流加培养根据细胞生长速率、营养物消耗和代谢产物抑制情况, 流加浓缩的营养培养基, 流加的速率通常与消耗的速率相同, 根据测得的底物浓度控制相应的流加过程, 以保证合理的培养环境与较低的代谢产物抑制水平。 (2) 培养过程以低稀释率流加, 细胞在培养系统中停留时间较长, 总细胞密度较高, 产物浓度较高。 (3) 流加培养过程须掌握细胞生长动力学, 能量代谢动力学, 研究细胞环境变化时的瞬间行为。流加培养细胞培养基的设计和培养条件与环境优化, 是整个培养工艺中的主要内容。 (4) 在工业化生产, 悬浮流加培养工艺参数的放大原理和过程控制, 比较其它培养系统较易理解和掌握, 可采用工艺参数的直接放大。
流加培养工艺是当前动物细胞培养工艺中占有主流优势的培养工艺, 也是近年来动物细胞大规模培养研究的热点。流加培养工艺中的关键技术是基础培养基和流加浓缩的营养培养基。通常进行流加的时间多在指数生长后期, 细胞在进入衰退期之前, 添加高浓度的营养物质。流加的总体原则是维持细胞生长相对稳定的培养环境, 营养成分即不过剩而产生大量的代谢副产物造成营养利用效率下降而成为无效的利用;营养成分也不缺乏导致细胞生长抑制或死亡。
流加工艺中的营养成分主要分为三大类:
(1) 葡萄糖。葡萄糖是细胞的供能物质和主要的碳源物质, 然而当其浓度较高是会产生大量的代谢产物乳酸, 因而需要进行其浓度控制, 以足够维持细胞生长而不至于产生大量的副产物的浓度为佳;
(2) 谷氨酰胺。谷氨酰胺是细胞的供能物质和主要的氮源物质, 然而当其浓度较高是会产生大量的代谢产物氨, 因而也需要进行其浓度控制, 以足够维持细胞生长而不至于产生大量的副产物的浓度为佳;
(3) 氨基酸、维生素及其他。主要包括营养必需氨基酸、营养非必需氨基酸、一些特殊的氨基酸如羟脯氨酸、羧基谷氨酸和磷酸丝氨酸;此外还包括其他营养成分如胆碱、生长刺激因子。添加的氨基酸形式多为左旋氨基酸, 因而多以盐或前体的形式替代单分子氨基酸, 或者添加四肽或短肽的形式。在进行添加时, 不溶性氨基酸如胱氨酸、酪氨酸和色氨酸只在中性p H值部分溶解, 可采用泥浆的形式进行脉冲式添加;其他的可溶性氨基酸以溶液的形式用蠕动泵进行缓慢连续流加。
流加式操作分为两种类型:单一补料分批式操作和反复补料分批式操作。 (1) 单一补料分批式操作是在培养开始时投入一定量的基础培养液, 培养到一定时期, 开始连续补加浓缩营养物质, 直到培养液体积达到生物反应器的最大操作容积, 停止补加, 最后将细胞培养液一次全部放出。该操作方式受到反应器操作容积的限制, 培养周期只能控制在较短的时间内。 (2) 反复补料分批式操作是在单一补料分批式操作的基础上, 每隔一定时间按一定比例放出一部分培养液, 是培养液体积始终不超过反应器的最大操作容积, 从而在理论上可以延长培养周期, 直至培养效率下降, 才将培养液全部放出。
3 半连续式操作
半连续式操作又称为重复分批式操作或换液操作。采用机械搅拌式生物反应器系统, 悬浮培养形式。在细胞增长和产物形成过程中, 每间隔一段时间, 从中取出部分培养物, 再用新的培养液补足到原有体积, 使反应器内的总体积不变。这种类型的操作是将细胞接种一定体积的培养基, 让其生长至一定的密度, 在细胞生长至最大密度之前, 用新鲜的培养基稀释培养物, 每次稀释反应器培养体积的1/2~3/4, 以维持细胞的指数生长状态, 随着稀释率的增加培养体积逐步增加。或者在细胞增长和产物形成过程中, 每隔一定时间, 定期取出部分培养物, 或是条件培养基, 或是连同细胞、载体一起取出, 然后补加细胞或载体, 或是新鲜的培养基继续进行培养的一种操作模式。剩余的培养物可作为种子, 继续培养, 从而可维持反复培养, 而无需反应器的清洗、消毒等一系列复杂的操作。在半连续式操作中由于细胞适应了生物反应器的培养环境和相当高的接种量, 经过几次的稀释、换液培养过程, 细胞密度常常会提高。
半连续式操作的特点为: (1) 培养物的体积逐步增加; (2) 可进行多次收获; (3) 细胞可持续指数生长, 并可保持产物和细胞在一较高的浓度水平。 (4) 操作简便, 生产效率高, 可长时期进行生产, 反复收获产品。
4 连续式操作
连续式操作是一种常见的悬浮培养模式, 采用机械搅拌式生物反应器系统。该模式是将细胞接种于一定体积的培养基后, 为了防止衰退期的出现, 在细胞达最大密度之前, 以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基。与此同时, 含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出, 以保持培养体积的恒定。理论上讲, 该过程可无限延续下去。连续培养的最大优点是反应器的培养状态可以达到恒定, 细胞在稳定状态下生长。稳定状态可有效的延长分批培养中的对数生长期。在稳定状态下细胞所处的环境条件如营养物质浓度、产物浓度、p H值可保持恒定, 细胞浓度以及细胞比生长速率可维持不变。细胞很少受到培养环境变化带来的生理影响, 特别是生物反应器的主要营养物质葡萄糖和谷氨酰胺, 维持在一个较低的水平, 从而使他们的利用效率提高, 有害产物积累有所减少。然而在高的稀释率下, 虽然死细胞和细胞碎片及时清除, 细胞活性高, 最终细胞密度得到提高, 可是产物却不断在稀释, 因而产物浓度并未提高。尤其是细胞和产物不断的稀释, 营养物质利用率、细胞增长速率和产物生产速率低下。
连续式操作的优点为: (1) 细胞维持持续指数增长; (2) 产物体积不断增长; (3) 可控制衰退期与下降期。连续式操作缺点为: (1) 由于是开放式操作, 加上培养周期较长, 容易造成污染; (2) 在长周期的连续培养中, 细胞的生长特性以及分泌产物容易变异; (3) 对设备、仪器的控制技术要求较高。
5 灌流式操作
灌流式操作是在灌注培养中把细胞和培养基一起加入反应器后, 收获培养液的同时不断地加入新鲜的培养基。灌注培养的主要优点是连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分, 并可带走代谢产物。同时, 细胞保留在反应器系统中, 可以达到很高的细胞密度。同半连续培养方法相比, 半连续培养在取培养物时同时也取出了部分细胞。灌注培养的产率可以提高一个数量级, 并可大大降低劳动力消耗。
灌注培养主要可分为两大类:悬浮灌注培养和床层培养。
(1) 悬浮灌注培养是在普通悬浮培养的基础上, 加上一个细胞分离器而成, 以微载体悬浮培养加旋转过滤分离器最为常见。细胞截留系统开始多采用微孔膜过滤或旋转膜系统, 最近开发的有各种形式的沉降系统或透析系统。中空纤维生物反应器是连续灌流操作常用的一种。它采用的中空纤维半透膜, 透过小分子量的产物和底物, 截流细胞和分子量较大的产物, 在连续灌流过程中将绝大部分细胞截留在反应器内。
(2) 床层培养则把细胞直接保留于床层, 不需要细胞分离器, 其中堆积床和大孔载体培养的应用较广。固定床或流化床生物反应器, 固定床是在反应器中装配固定的篮筐, 中间装填聚脂纤维载体, 细胞可附着在载体上生长, 也可固定在载体纤维之间, 靠上搅拌中产生的负压, 迫使培养基不断流经填料, 有利于营养成分和氧的传递, 这种形式的灌流速度较大, 细胞在载体中高密度生长。流化床生物反应器是通过流体的上升运动使固体颗粒维持在悬浮状态进行反应, 适合于固定化细胞的培养。
灌注培养可以从两个方面入手, 一是改变动物细胞的培养环境, 实行阶段培养;二是进行代谢调控。具体说来, 阶段培养可以用以下方法:p H值阶段培养、溶氧阶段培养、化学试剂诱导阶段培养。代谢调控主要针对在培养过程中对动物细胞产生影响物质或主要代谢产物而言, 主要有以下方法:控制葡萄糖浓度法、控制谷氨酰胺法、控制葡萄糖和谷氨酰胺法、代谢产物的去除。
哺乳动物细胞 篇11
《动物细胞培养技术》课程教学存在的问题
《动物细胞培养技术》是在学习了生物化学、微生物学、免疫学等课程的基础上, 研究如何使细胞在体外良好增殖的一门课程, 是生物技术及应用专业的一门重要的核心技能课。以往这门课程的实践教学体系存在着很多问题, 主要表现在以下方面。
实践教学目标定位存在偏差高职教育以职业应用能力为主线这一本质要求未落到实处。尽管制定教学培养计划时安排的实践教学课时不少, 但实践教学效果不佳, 教学过程形式化, 不能突出实践技能和综合素质的培养, 偏重理论考核, 轻视现场职业技能考核。教学内容没有将体现职业技术能力、贴近生产、贴近技术的实训项目纳入实践教学体系, 不能很好地适应人才培养目标的需求。
实践教学内容与生产实际联系不够紧密2006年, 我们对专业教学计划进行了重新修订, 加大了实践教学的比例, 但由于受各种条件的限制, 在实践教学内容的选取上综合性、设计性、应用性实验较少, 新技术、新工艺未能及时充实到实验教学中;顶岗实习中工学相脱离, 学生在顶岗过程中与企业员工同样仅仅从事单一项目机械单调的重复性工作, 没有明确的顶岗实习课程标准, 达不到顶岗实习的预期目标。
实践教学保障条件不足实训条件与学科专业建设、课程建设并不完全匹配, 校内实践教学设备、场所建设等投入不足, 缺乏现代化实际生产设备或模型, 与工厂生产一线缺乏联系。校外实训基地建设不足, 学生在实训过程中真正动手进行操作的机会很少, 影响了学生实践能力的提高。另外, 还缺乏优秀而富有实践经验的实践指导教师。
缺乏严格规范的实践教学管理体系对实践教学计划执行的监控不严, 未能真正实现全过程管理, 尤其是顶岗实习管理不能落实到位。顶岗实习时间较长, 学生分布地域广, 企业数量多, 教师指导不到位, 监控指标不具体、不科学, 管理机制不健全, 致使部分学生校外顶岗实习处于无人管理状态。
构建一个符合高职教育特点的实践教学体系是高职教学改革的必然要求。近年来, 我校的《动物细胞培养技术》课程组对课程的实践教学体系进行了研究和重新设计, 使实践学习过程能充分满足学生职业能力培养的需要, 有利于高职生物工程类人才的培养。
课程改革的内容
重视实践技能教学, 重构教学体系通过对生物技术及应用专业毕业生近三年就业岗位进行调查研究, 发现学生首次就业岗位主要是分离提取、疫苗生产和诊断试剂三类企业的营销和生产岗位。经过发展, 再次就业的岗位主要有产品检测岗位、产品营销岗位等。实践性教学环节是理论与实践相结合的纽带, 是实现学生与企业“无缝对接”的重要环节, 因此, 应根据企业需要重构实践课程, 重视学生校内学习技能与实际工作需要的一致性, 积极推行工学交替、任务驱动、项目导向、顶岗实习等有利于增强学生能力的教学模式。近年来, 我校课程组教师采用多层次复合化实践教学, 使实践教学时数占整个教学时数的60%左右, 并构建了由物品准备模块、技能操作模块、细胞检测模块及职业实训模块4个技术模块组成的教学体系, 并与固定企业建立了长期合作关系, 制定了企业接收学生实习的制度, 加强了学生的生产实习和社会实践, 保证学生至少有半年时间到企业顶岗实习。2009年, 全球出现了“甲流”肆虐, 我国的华兰生物工程股份有限公司承担了大规模生产疫苗的工作, 我校生物工程系从当年的5月~11月选派了137名生物技术及应用专业的学生充实到华兰公司生产第一线, 参与治疗“甲流”疫苗的全面生产。除此之外, 在2006~2009年间, 我校生物工程系生物技术及应用专业与华兰生物工程股份有限公司联合成立了订单培养班“华兰班”, 搭建了校企合作发展联盟;与普莱柯生物制品公司联合成立了订单培养班“普莱柯班”, 拓宽了学生的就业渠道;与三叶兽药公司联合成立了订单培养班“三叶班”, 扩展了校企合作的空间;与天宇兽药有限公司成立了“天宇班”, 进一步为学生就业搭建了平台。通过校企合作, 深化课程内容改革, 强化细胞培养的几项技能训练, 突出学生实践能力的培养, 实现了学生与企业之间的“无缝对接”, 同时也增强了学生的就业能力。
改革授课方式授课方式采取校内专业教师与企业兼职教师相结合的方式进行, 使得实践技术与理论有机结合, 将企业技能需求与职业标准融入课程体系, 将企业真实的工作任务作为载体进行项目训练, 加强学生职业能力的培养。实习周、专业实训项目在企业的真实环境中完成, 同时, 在疫苗生产旺季安排学生去企业顶岗实习, 巩固专业技能。
构建严格的实践教学管理体系, 强化实践教学的过程管理实践教学管理分为目标管理、过程管理、质量管理三个方面。针对每项实践教学环节, 应制定具体明确的质量标准, 并严格规范执行。各实践教学环节的质量标准包括实验大纲 (或指导书) 、实训大纲 (或项目单卡) 、顶岗实习大纲、学生实训手册、学生实训报告等。要求教师严格按照教学工作规范和质量标准执行, 加强学生顶岗实习期间的过程管理, 解决“放羊式”顶岗实习的弊病。
构建科学的考核模式课程考核采取理论笔试成绩+在企业的实践成绩+平时成绩的方式。理论部分采用笔试考核, 主要考核基本理论知识和实验技能原理, 即考查学生分析问题、解决问题的能力;平时成绩通过考勤、学习态度、课后作业情况等方面加以衡量。在企业的实践成绩通过顶岗实习后企业反馈的学生表现情况进行评定, 我们专门制定了学生定岗实习实践考核的量化标准, 并严格按照量化标准对学生进行实践考核。成绩的评定构成为:20%实践考核+70%理论考核+10%平时成绩。
加强课程组专兼结合的教学团队建设在教学过程中, 教师要根据知识体系及学生的认知发展水平, 在有秩序、有步骤的教学过程中使学生掌握细胞培养的基本知识与技能, 形成严谨周密、无菌操作的实验习惯。课题组还通过有计划地选派教师到企业进行一年以上的实践锻炼等措施优化师资队伍。此外, 还聘请企业骨干作为兼职教师来校讲学, 兼职教师的理念融入了企业生产中技术手段的前沿和方向, 并为课堂教学的改革不断注入新鲜的血液。
建立健全实践教学保障机制要通过多渠道筹措资金, 优化实践教学环境, 加强校内外实习实训基地建设。除了学校加大投入外, 要争取政府及高职院校行政主管部门的支持, 也可以面向社会和市场多渠道筹集资金, 积极争取社会的支持和企业的协助;要提高“双师型”教师的实践能力, 增加校外兼职教师授课的比重, 完善与现有校外专家指导队伍的关系和活动规则;还要加强实训教材建设。
从教学效果看, 通过将实践技术与理论知识有机结合, 将企业技能需求与职业标准融入课程体系, 将企业真实的工作任务作为载体进行项目训练, 学生对《动物细胞培养技术》课程从思想上更加重视, 学习的主动性较高, 参与意识较强, 影响面较大, 充分提高了学生自主学习的能力和解决问题的能力。通过对《动物细胞培养技术》课程的改革, 为企业获得相应的专业人才提供了保障, 为学生的实习就业打通了渠道, 为学校的人才培养明确了方向, 为校企合作、订单培养搭建了平台, 因此具有十分重要的意义。
摘要：高职高专院校应根据企业需要重构动物细胞培养技术课程体系, 保证学生校内学习实验技能与工作岗位所需技能的一致性, 同时应采取顶岗实习、订单培养、合作发展联盟等措施, 强化学生实践技能, 为学生就业拓宽渠道, 并通过选派专业课教师到企业实岗锻炼, 聘请企业技术人员担任兼职教师等方式, 实现学校与企业合作的“无缝对接”。
关键词：高职高专,动物细胞培养技术,课程,教学改革,创新
参考文献
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