gc1细胞培养技巧

gc1细胞培养技巧

gc1细胞培养技巧 篇1

1 材料与方法

1.1 乳腺组织的获取

用无菌外科手术的方法取处于妊娠后期或泌乳期的健康初产荷斯坦奶牛乳腺组织5～10 g,置于DMEM/F12完全培养液[含青霉素300 IU/mL、链霉素300 μg/mL、两性霉素2.5 μg/mL、庆大霉素50 μg/mL、20%胎牛血清(FBS)]中,迅速带回实验室。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM/F12(12400-016),Invitrogen公司生产;胎牛血清(南美洲,SV30087.02),Hyclone公司生产;胰蛋白酶(1∶250,0458),Amresco公司生产;细胞角蛋白-18(MS-142-P0)、波形蛋白(MS-129-P0),Neomarker公司生产;兔/鼠通用S-P免疫组化试剂盒(KIT9710)、DAB(0031),福州迈新生物技术开发有限公司生产;抗体稀释液(C-0007),北京博奥森生物技术有限公司生产;DMSO(D-5879),Sigma公司生产;青霉素钠、硫酸链霉素,华北制药股份有限公司生产;丙酮等其他试剂均为国产分析纯。

CO2培养箱(型号为HEPA class 100),Thermo公司制造;倒置相差显微镜(型号为IX71),Olympus公司制造;普通光学显微镜(型号为YS100),Nikon公司制造;离心机(型号为3-30K),Sigma公司制造;生物安全柜(型号为AC2-4S1),ESCO公司制造。

1.3 奶牛乳腺组织细胞的原代培养

用组织块贴壁法培养原代细胞,具体方法如下:将带回实验室的乳腺组织用37 ℃预热的灭菌生理盐水洗涤数次,清除血迹、乳汁及其他杂质;用无菌小剪镊分离腺泡于盛有灭菌生理盐水的小烧杯中,反复冲洗至冲洗液清亮后,将腺泡转移至生物安全柜中盛有灭菌PBS(含有青霉素200 IU/mL、链霉素200 μg /mL,pH值为7.4)的小烧杯中;将腺泡组织置于75%乙醇中浸泡约1 min后,用双抗PBS洗涤3次,每次3 min;然后将其转入青霉素小瓶中剪至约1 mm3大小的小块,备用。用牙科探针挑取组织块,将其轻轻铺于细胞培养瓶底壁上,植块间距0.5 cm,尽量使组织块黏附于瓶壁后沿对侧瓶壁加入DMEM/F12培养液(含青霉素200 IU/mL、链霉素200 μg/mL、15%FBS),旋上瓶盖,翻转培养瓶,使有组织块的一面向上,置于37 ℃、含5% CO2的饱和湿度培养箱中翻转培养2 h,使组织块微干涸;然后轻轻将培养瓶翻转过来,使培养液浸没组织块,根据培养液的颜色变化及细胞的生长情况每3～4 d更换一次培养液;待大多数组织块周围游出较多细胞时,用牙科探针轻轻掀掉组织块,并将组织块转瓶,使其继续贴壁培养,原瓶换液使细胞长满至汇合。

1.4 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的纯化培养

每日观察细胞的生长情况并记录,待细胞生长至汇合后,根据成纤维细胞和上皮细胞对胰蛋白酶的耐受时间与贴壁速度的差异,结合使用差时胰酶消化与差时贴壁2种方法分别纯化出奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞,具体方法如下:弃去培养液,用D-hank’s液冲洗3次后,加入0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA于37 ℃消化3～5 min;至成纤维细胞变圆、细胞间距增大、有少量细胞团块漂起后,加入培养液(含青霉素100 IU/mL、链霉素100 μg/mL、10%FBS)终止消化,反复轻轻吹打成纤维细胞区域,吸取消化液转入新的细胞培养瓶中,置于培养箱培养1 h;待大多数成纤维细胞贴壁后,轻轻去除上清液,加入新的培养液继续培养至细胞长满并汇合,得到以成纤维细胞为主的细胞;去除成纤维细胞后,用D-hank’s液再冲洗3次,然后加0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA于37 ℃消化4～5 min;至上皮细胞回缩变圆、细胞间距增大乃至细胞成片(团)脱落时加入含10%FBS的DMEM/F12培养液终止消化,反复轻轻吹打,按细胞密度加入培养液,置于培养箱中约1 h;取培养上清液转到新的细胞瓶中继续培养至细胞长满、汇合,得到以上皮细胞为主的细胞。如此反复进行纯化以得到较纯净的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞。

1.5 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的形态学观察与鉴定

1.5.1 倒置相差显微镜观察

每天定时观察细胞的形态和生长情况,拍照并作记录。根据每天对细胞生长情况的观察,掌握奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的生长特性和细胞形态的差异。

1.5.2 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的鉴定

将处理过的小盖玻片置于12孔细胞培养板的底壁,加少量培养液使其粘在培养孔底壁,分别将纯化的乳腺上皮细胞和成纤维细胞接种于含盖玻片的孔中,培养5 d后,用无血清培养基处理24 h并进行鉴定。

姬姆萨染色:将细胞爬片取出,PBS洗3次,每次3 min;冷冰酮固定20 min;用PBS洗3次,每次3 min;姬姆萨染液染色50 min;用灭菌水反复冲洗,置37 ℃温箱干燥6 h以上;二甲苯透明,中性树胶封片,镜检,观察细胞的形态并拍照。

免疫组化鉴定:每组细胞爬片分成3份,分别作为细胞角蛋白、波形蛋白和阴性对照,具体步骤为将细胞爬片取出,PBS浸洗3次,每次3 min;冷丙酮固定20 min,PBS浸洗3次,每次3 min,并将爬片放入湿盒中;加0.5%TritonX-100(用PBS配制)室温作用20 min;用PBS冲洗3次,每次3 min;滴加内源性过氧化酶阻断液(S-P试剂盒A液),避光作用10 min;用PBS液冲洗3次,每次3 min;滴加动物非免疫血清(羊) (S-P试剂盒B液),37 ℃孵育20 min;轻轻甩掉血清,勿冲洗;分别滴加鼠抗人细胞角蛋白-18单克隆抗体和鼠抗人波形蛋白单克隆抗体,均用抗体稀释液按1∶100倍稀释,阴性对照加PBS,37 ℃孵育2 h;PBS液冲洗3次,每次3 min;滴加生物素标记羊抗鼠/兔IgG(S-P试剂盒C液),37 ℃孵育20 min;PBS液冲洗3次, 每次3 min;滴加链霉素抗生物蛋白-过氧化酶(S-P试剂盒D液),37 ℃孵育20 min;用PBS液冲洗3次,每次3 min;滴加DAB作用5～10 min (现配现用),显微镜下观察并控制显色,用纯化水漂洗终止显色;苏木精复染5 min,在 0.25%盐酸乙醇溶液中浸提一下,自来水返蓝15 min;用纯化水浸洗,37 ℃温箱干燥6 h以上,二甲苯透明,中性树胶封片,镜检并拍照。

1.5.3 细胞生长曲线的绘制

分别将乳腺上皮细胞和成纤维细胞按每孔2×105个接种于24孔板中,每组3孔,共分为14组。分别于接种后每天同一时间计数细胞平均数,每孔计2次,直至细胞的生长达到平台期。以培养时间为横坐标、细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.6 细胞的冻存与复苏

1.6.1 细胞的冻存

用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA将细胞消化下来,1 000 r/min离心5 min;收集细胞,加入1 mL新鲜培养液重悬细胞,用台盼蓝染色,用血细胞计数板计数后,加含20%FBS的DMEM/F12培养液调整细胞数至5×106～10×106个/mL,并按10%的比例缓慢加入DMSO,混匀后分装于2 mL冻存管中,每管1 mL,4 ℃放置15 min;-20 ℃放置20 min;-80 ℃过夜,然后沉入液氮罐中长期保存。

1.6.2 细胞的复苏

从液氮罐中取出冻存管,立即投入37 ℃水浴中晃动,使其在1 min内完全融化。加入5 mL培养液悬浮细胞,1 000 r/min离心5 min;收集细胞,根据细胞密度加入生长培养液重悬细胞,将其接种于细胞培养瓶中,置37 ℃、含5% CO2的饱和湿度培养箱中培养。

2 结果

2.1 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的培养纯化及形态观察结果

2.1.1 组织块的培养结果(见169页彩图1)

培养1～2 d后细胞贴壁,3～5 d后开始游出,以成纤维样细胞和上皮细胞为主,并且这2种细胞并不混杂生长,存在着明显的界限(见169页彩图1a,b)。其中成纤维样细胞先从组织块周围向外游出,其形态多为长梭形,排列疏松,呈旋涡状或放射状生长(见169页彩图1a,b);而后上皮样细胞从组织块周围游出,多为单层多角形,排列紧密,细胞核呈圆形或椭圆形,核仁清晰可见,多呈鹅卵石样或铺路石样聚集生长(见169页彩图1a,b)。

2.1.2 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的纯化及形态学观察结果

经差时胰酶消化和差时贴壁2种方法对奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞分别进行纯化,上皮细胞多成团生长,未纯化完全时成纤维细胞常包裹于上皮细胞的外围生长(见169页彩图1c)。细胞经3～5次纯化后即可分别得到较为纯净的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞。纯化的上皮细胞大多为多角形,细胞排列紧密,细胞核呈圆形或椭圆形,有时可出现双核或多核现象,核仁清晰可见,以3～5个居多,多呈单层铺路石样或鹅卵石样成团聚集生长(见169页彩图1d)。传代的上皮细胞贴壁后,多成团聚集生长形成岛屿状,并且成团的多角形上皮细胞聚集生长时增殖快,而单个散在圆形贴壁细胞很难继续增殖。随着培养时间的延长,一些上皮细胞的胞浆出现大小不一的空泡和泡状结构(见169页彩图1e),这是上皮细胞分泌产生的大小不等的乳滴。上皮细胞传到第5～6代时生长仍很旺盛,随着细胞密度的增加,多形成类似腔的结构,在腔的周围细胞密集包绕生长,更换培养液后继续培养,一些生长迅速的新生细胞可向腔内生长,并出现拉丝样支架将两侧细胞连接起来(见169页彩图1f),细胞沿着支架继续增殖可达到融合,形成类似圆顶样结构,随传代次数的增多和培养时间的加长这种结构会逐渐增多。此外,在一些区域,上皮细胞还可形成腺泡样结构(见169页彩图1g)。上皮细胞传至第7～8代,其形态基本一致,只不过有些细胞体积较大,呈圆饼样,增殖速度慢;有的细胞体积较小,呈鹅卵石样,增殖迅速,随着培养时间的加长,细胞间的界限愈加明显;随着细胞密度的增加,细胞受到挤压,一些细胞呈短梭形。而当细胞传到第8～9代以后形态变得非常不均一(见169页彩图1h),出现长形、梭形和三角形等多种形态共存,而典型的上皮细胞越来越少。纯化的奶牛乳腺成纤维细胞单层生长,呈典型的放射状或旋涡状排列(见169页彩图1i),且随着传代次数的增多,成纤维细胞的形态和生长特性基本不发生改变。

2.2 细胞的鉴定结果

2.2.1 姬姆萨染色法鉴定细胞的形态(见169页彩图2)

乳腺上皮细胞为深蓝染,胞核呈圆形或椭圆形,核仁清晰可见,多为3～5个,并且胞浆内常可见大小不一的白色空泡(见169页彩图2a),这是上皮细胞分泌的乳滴。成纤维细胞多呈长梭形,胞核蓝染,为椭圆形,位于细胞中央,一般可见核仁呈旋涡状或放射状排列生长(见169页彩图2b)。

2.2.2 免疫组织化学法鉴定细胞的纯度

镜检可见细胞胞浆内有特异性棕黄色或棕褐色颗粒沉着者判为阳性。结果(见170页彩图3)显示,乳腺上皮细胞角蛋白-18反应呈阳性,波形蛋白反应呈阴性(见170页彩图3a,b);乳腺成纤维细胞角蛋白-18反应呈阴性,波形蛋白反应呈阳性(见170页彩图3c,d);阴性对照均为阴性(见170页彩图3e,f)。经纯化后,2种细胞的纯度均可达到95%以上。乳腺上皮细胞传至第8～9代以后,细胞的形态开始发生变化,出现长形、梭形、三角形等多种细胞共存,而直至细胞传至第14代时,细胞角蛋白-18反应仍呈阳性(见170页彩图3g),阴性对照为阴性(见170页彩图3h)。

2.3 细胞的生长曲线(见图4)

奶牛乳腺上皮的生长曲线(见图4a)和成纤维细胞的生长曲线(见图4b)均呈较典型的“S”型,其中成纤维细胞较上皮细胞潜伏期短,增殖快。

2.4 细胞的冻存与复苏

代次较低的奶牛乳腺上皮(3～6代)细胞经冻存复苏后生长状态良好,传1～2代后细胞的形态和生长特性均未发生改变,而代次较高(7～8代)的细胞冻存复苏后形态正常,但传代后细胞形态就发生了改变。复苏后的成纤维细胞生长状态良好,形态和生长特性均未发生明显改变。

3 讨论

3.1 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的培养与纯化

目前,有关奶牛乳腺上皮细胞培养的研究已有很多,培养方法主要有组织块培养法、机械破碎法和酶消化方法。也有人从乳汁中分离出奶牛乳腺上皮细胞[6,7],有待于进一步验证。机械破碎法和酶消化法极易丢失和损伤细胞,最终造成细胞不能正常生长和增殖[8,9],其中以组织块培养法最能保持乳腺上皮细胞二倍体特性,不破坏细胞的活性。本试验根据奶牛乳腺上皮细胞较成纤维细胞贴壁和生长慢、贴壁牢、不易被消化下来的特性,应用组织块贴壁转瓶培养,采用差时胰酶消化法和差速贴壁法结合的方法,用较少的组织即分别培养及纯化出奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞。

目前,关于奶牛乳腺细胞体外培养的研究主要集中在上皮细胞上,而关于成纤维细胞的报道并不多见,不过后者培养和纯化都相对较容易。研究发现,奶牛乳腺上皮细胞纯化的难易程度跟乳腺组织的取材也有很大的关系,在腺泡发育好的妊娠期和泌乳期取材所获取的细胞活性好,生长快,细胞中上皮细胞占的比例较大[10,11],此时纯化出上皮细胞就相对较容易,所以把握取材时机非常关键。另外,去除脂肪和结缔组织,分离乳腺腺泡进行培养也很关键[10,12]。

3.2 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的形态学观察

试验培养得到的奶牛乳腺上皮细胞的形态特征与王亨等[10]、彭新荣等[11]及E.Matitashvili等[13]的报道基本一致,奶牛乳腺成纤维细胞的形态特征与吴娟等[14]报道的结果一致。乳腺上皮细胞是构成乳腺腺泡的主要成分,具有分泌乳汁的功能。本研究中,在体外培养奶牛乳腺上皮细胞时,胞浆内出现大小不一的空泡和泡状结构即为上皮细胞分泌的乳滴,与崔立莉[7]报道的结果一致;与彭新荣等[11]报道的结果不一致,其认为胞浆内出现的小颗粒和泡状结构可能为变形的线粒体及溶酶体。上皮细胞还可形成乳腺腺泡管样结构,与王治国等[15]和E.Matitashvili等[13]的试验结果一致。不过,王治国等[15]的试验中添加了一些激素和生长因子,E.Matitashvili等[13]的试验中添加了ECM,而本试验中未添加。而上述现象在成纤维细胞中均没有,可见在体外培养条件下,奶牛乳腺上皮细胞仍保留着其原有的一些功能和特性。

体外培养的乳腺上皮细胞传代后的大小和形态并不完全一致,经纯化传代后,细胞多成团、聚集成岛屿状,其中体积较小的呈鹅卵石样,聚集成长的细胞增殖较快,而体积较大的呈圆饼形,细胞的增殖则较慢,这2种细胞可能为乳腺上皮细胞不同发育时期的细胞。前者可能为较幼稚的细胞,分裂增殖较快;而后者为接近终末分化的细胞,故增殖较慢。与王亨等[10]的试验结果相一致。另外,乳腺上皮细胞成团时增殖较快,而单个细胞很难贴壁并增殖[10,11];因此细胞的接种密度对于细胞的生长非常重要。随着上皮细胞生长密度的增加,可形成许多类似腔的结构,细胞继续增殖达融合后,可形成类似圆顶样结构,与丁月云等[16]的试验结果相一致,而8～9代以后部分细胞渐渐分化,细胞形态变得不均一,出现长形、梭形和三角形的细胞,与彭新荣等[11]的试验结果相一致。

3.3 细胞鉴定

奶牛乳腺腺泡上皮细胞中的骨架蛋白以角蛋白-7,8,18为主,而肌上皮细胞以角蛋白-5和14为主[16],故角蛋白-18可用于奶牛乳腺腺泡上皮细胞的鉴定。波形蛋白是间质细胞特异性表达的一种中间纤维蛋白,是间质细胞和成纤维细胞的标志蛋白之一[17],可用于成纤维细胞的鉴定。综合应用这2种蛋白不仅可以鉴定细胞的类型,而且可以鉴定细胞的纯度。本试验结果表明:奶牛乳腺上皮细胞对角蛋白-18反应阳性,与E.Matitashvili等[13]的研究结果一致;对波形蛋白反应阴性,与J.L.Anaya-Lopez等[18]的研究结果一致。而成纤维细胞与上皮细胞的结果相反,对角蛋白-18反应阴性,对波形蛋白反应阳性,表明结果成立。经鉴定,上皮细胞传至14代后,对细胞角蛋白-18的反应仍为阳性,表明虽然细胞的形态发生了变化,但所得的细胞仍为上皮细胞。

3.4 细胞的冻存与复苏

由于原代奶牛乳腺上皮细胞具有二倍体的特性,属于有限细胞系,随着传代次数的增多,细胞的形态和生长特性会逐渐发生改变,导致其失去二倍体细胞的特性甚至发生细胞转化;因此,在纯化后对其及早进行冻存非常重要[5]。与上皮细胞不同,奶牛乳腺成纤维细胞的形态和生长特性受传代和冻存的影响相对较小,但仍应在其生长旺盛、传代次数较少时将其冻存,以防影响细胞的特性。

试验采取妊娠后期或泌乳期荷斯坦奶牛乳腺组织分离腺泡,培养后应用组织块贴壁转瓶培养,采用差时胰酶消化和差速贴壁结合的方法,用较少的组织即分别培养并纯化出了乳腺上皮细胞和成纤维细胞,所得细胞形态良好,生长曲线呈较典型的“S”型,符合细胞生长的一般生物学规律,经鉴定细胞的纯度可达95%以上。目前,国内外的许多研究者认为乳腺上皮细胞的贴壁依赖于基质,生长依赖于激素和生长因子的添加,而本试验中未使用基质和激素也成功培养出了生长良好并具有泌乳功能的乳腺上皮细胞,避免了胶原和激素所造成的影响,为相关的后续研究奠定了良好的基础。

a.细胞从组织块中游出并在组织块周围生长(100×);b.上皮细胞与成纤维细胞不混杂生长,之间存在明显的界限,上皮细胞排列紧密形成细胞单层,而成纤维细胞排列疏松(100×);c.成纤维细胞包裹未纯化完全的上皮细胞(100×);d.纯化的上皮细胞呈鹅卵石样或铺路石样生长(100×);e.上皮细胞胞浆内有大小不一的空泡和泡状结构(100×);f.细胞向腔内生长,并出现拉丝样支架将两侧细胞连接起来,细胞沿着支架继续增殖可达到融合(200×);g.上皮细胞形成腺泡样结构(100×);h.上皮细胞的形态发生改变(100×);i.纯化的成纤维细胞呈旋涡状或放射状生长(100×)。

a.中央处上皮细胞深蓝染,细胞核为圆形或椭圆形,核仁清晰可见,胞浆内还可见许多大小不一的白色空泡;b.成纤维细胞为长梭形,呈旋涡状或放射状排列生长。