细胞培养技术（精选12篇）
细胞培养技术 篇1
三维细胞培养技术 (3D cell culture) 在组织形成、血管发育和器官再造等发育生物学的分支领域得到了广泛的应用;同时在筛选新药的疗效分析和毒理试验方面, 利用三维培养获得了与二维单层培养完全不同的结果, 引起了生命学家的极大兴趣[1,2,3,4,5,6,7,8,9]。不同于传统的二维单层细胞培养, 三维细胞培养技术是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养, 使细胞能够在载体的三维立体空间中迁移、生长、构成三维的细胞-载体复合物。在真正的活体, 细胞通常在三维环境中生长并建立三维活的组织或器官。细胞培养的微环境对于细胞的形状、代谢、功能、迁移、增殖和分化等具有至关重要的作用。传统单层细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增生逐渐散失了原有的性状, 往往与体内情况不相符;动物试验虽在体内进行, 但体内多种因素制约以及体内和外界环境相互影响而不能观察到研究者最为关心的中间过程。三维细胞培养技术模拟体内的微环境, 填补了单层细胞培养和动物试验的鸿沟。正如Nature中的一篇文章指出:“意识到三维组织培养潜在的优势的科学家还是太少了。但是, 这项技术带来的好处是不言而喻的 (图1) [4]。”三维细胞培养技术作为体外无细胞系统及单层细胞系统的研究与组织器官及整体研究的桥梁, 显示了其既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础, 又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。目前这一技术主要应用在哺乳动物细胞培养研究中, 涉及到植物细胞培养中的研究报道甚少。但是植物细胞和动物细胞有许多相通之处, 例如:原生质体 (去壁后的植物细胞) 和哺乳动物细胞有很多的相似之处, 可以摄入细胞器、微粒体、病毒以及DNA等大分子物质, 这就为将三维细胞培养技术引入到原生质体培养中提供了可能性。笔者根据已有文献检索, 利用木本植物材料开展初步研究, 对于这方面研究中的应用前景作一评述。
1 三维细胞培养支架制备
三维细胞培养的关键在于三维细胞培养支架制备 (3D cell culture scaffold, 3DCCS) (图2) , 其研究内容将涉及微加工制造、生物偶联、表面化学修饰、软光刻制作、高分子合成、细胞生物学等多个领域。目前可用于制备3D-CCS的材料主要有聚苯乙烯 (PS) 、聚己内酯 (PCL) 、聚酰胺 (PA) 、聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 、硅片、玻璃、胶原蛋白或水凝胶等[16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27]。而相应的制备方法有:运用相分离法合成的多孔高分子支架;利用电放纤维技术人工合成的纳米纤维支架;尤其是运用精密微加工技术制备具有均一微结构的支架, 其确保多孔结构的可重复性以及可调控性, 并且可以和微流控技术相集成, 开发新型的微流控三维细胞培养芯片。目前商业化的3DCCS主要有英国Reinnervate公司的alvetex三维支架 (http://www.reinnervate.com) , 其被Scientist网站评为2010年的全球生物技术的十大革新之一, 名列第6位 (http://www the-scientist.com/2010/12/1/47/1/) 。另外, 还有美国3D Biotek公司的3D InsertTM三维支架 (http://www.3dbiotekstore.com/) 和国内的瑞康健生物医学有限公司等。
注:上列:左图来自文献[10], 中间图来自文献[11], 右图来自文献[12];下列:左图来自文献[13], 中间图来自文献[14], 右图来自文献[15]。
笔者利用微乳模板法人工合成了PS三维细胞培养支架。SEM图片 (图3) 显示40μm孔径分布在整个支架的内部, 且相互中通。这些材料正在应用于杂交鹅掌楸细胞的胚胎发育中。
2 基于微流控芯片的细胞培养系统
植物细胞培养是通过一个能模拟生物体内环境的体外空间, 配置以无菌、适当温度、酸碱度和一定营养条件的细胞离体培养体系, 使之生长、发育, 实现植株再生、繁殖或进行特定目标的科学研究的细胞水平的现代试验技术体系。现阶段, 人们多采用瓶、皿或微孔板培养方式, 但这种传统的器皿培养技术, 不仅操作繁琐, 而且试剂耗量大、占用空间多、微环境较难调控。更为重要的是, 相对于细胞的微小尺寸, 这种培养环境与体内环境相差较远, 客观上难以真实反映细胞生命过程的生理、遗传等分子和细胞生物学特征。
微流控芯片技术的出现恰恰为解决这一难题提供了契机。微流控芯片技术是据于微电子的微细加工技术和微机电加工系统 (MEMS) 原理而发展起来的, 现代生物技术、微细精确仪器分析和高分子材料等领域的学科交叉点。它不同于人们熟悉的一次性的生物芯片 (Biochip) 及其技术, 微流控芯片技术通过对微通道中的流体的控制, 把一个分子生物学分析实验室的采样制备、溶液配制、试剂和试验样品进样、反应、分离和检测等功能, 集成到邮票或信用卡大小的芯片上的“芯片实验室”。该申请项目涉及到的植物细胞培养微流控芯片与其他微流控芯片一样, 具有不同操作单元之间在技术上组合灵活、整体可控和规模集成等特点。在用于细胞研究的过程中主要体现在以下几点:一是芯片通道尺寸 (通常10~100μm) 与种子植物细胞直径大小 (10~200μm) 相适应, 有利于单细胞操纵、分析;二是芯片的多维网格结构形成相对封闭的环境, 与植物生命体的正常生理状态下的细胞空间特征接近;三是芯片通道微尺度下传热、传质较快, 可以提供有利于细胞研究环境和进行培养微环境的调控;四是芯片可以满足高通量细胞分析的需要, 可同时获取大量的生物学信息;五是芯片上多种单元技术的灵活组合使集成化的细胞研究成为可能, 诸如细胞进样、培养、分选、遗传操作和分离检测等过程均可在一块芯片上完成。微型化、集成化和自动化的细胞培养系统, 将极大地简化操作步骤, 减少细胞或试剂耗量, 降低成本, 并可方便地与其他单元操作耦联, 有可能使常规细胞培养技术产生根本性变革。
目前基于微流控芯片的细胞培养系统, 多采用灌流式培养方法:将细胞悬液注入微通道或微培养室, 待细胞贴壁后, 将培养液连续灌入培养区域, 实现营养物质的连续更新。芯片材料多采用聚二甲基硅氧烷 (PDMS) , 该类材料具有良好的生物相容性, 对气体有一定的通透性, 有利于细胞培养过程中O2和CO2气体的交换。另外, 由于其透明, 也利于激光共聚焦显微镜等进行动态观察。并且通过软光刻技术, 可以制造复杂的微纳三维结构, 其已被广泛应用于微流控细胞培养芯片的制作。虽然以细胞为对象的微流控芯片研究起步较晚, 但近几年引起了各国科学家的广泛重视。日本东京大学的Teruo Fujii课题组研制的微流控芯片细胞培养系统, 可实现肝癌HepG2细胞株连续10 d培养;在此基础上构筑的多层PDMS芯片组成的堆栈式细胞培养装置, 可实现细胞大规模的培养[28,29]。美国伯克利大学的Luke P Lee课题组通过模拟体内环境设计了一种高通量微流控细胞培养芯片, 这种芯片可以减轻剪切力对细胞的培养[30]。国内大连化物所的林炳承课题组利用通透性水凝胶材料的微加工技术, 研制了一系列具有不同功能的二维或三维结构, 并用于细胞培养。以上这些报道的芯片设计仍然停留在对多个细胞的培养, 无法实现高通量的单细胞培养。在已有的报道主要是拘于动物和人类医学方面应用的研究, 有关植物的研究报道甚少, 在木本植物上的应用尚未见报道。与动物细胞不同, 对于植物细胞而言, 在细胞膜外还具有1层厚厚的细胞壁结构, 植物细胞在人工培养条件下, 会大量合成次生代谢物, 对培养物的微环境干扰大。由于植物细胞生物学结构特点以及在人工培养条件下容易结团、对于剪切力极敏感等固有特点, 使得研制适合于植物, 尤其是木本植物的单细胞培养芯片就显得很为重要。美国麻省理工学院的Joel Voldman曾连续报道了坝式结构和网孔状的微流控芯片可以迅速、高通量的捕获单个植物细胞 (图4) [15,31]。美国伯克利大学的Luke P Lee课题组和美国华盛顿大学的Albert Folch课题组也进行了类似的研究[32,33]。但结果表明, 他们的坝式结构的芯片无法消除培养过程中的流体剪切力对植物细胞的影响, 而网孔状结构的芯片无法实现后续的细胞原位培养。瑞士苏黎世联邦高工的Textor M课题组利用微孔状的PDMS芯片系统研究了细胞的三维培养情况[10]。韩国大学的Lee S H课题组研究了Nicotiana tabacum原生质体在PDMS微流控芯片中的培养情况, 国内的西北农林大学王进义课题组研究了tobacco mesophyⅡ原生质体在PDMS微流控芯片中的培养和细胞融合情况[11,34]。其研究结果显示:相对于传统的培养方式, 原生质体的生长、分化速度都得以提高, 这说明PDMS微环境对于原生质体培养有着有利影响。
注:左图来自文献[15], 中间图来自文献[32], 右图来自文献[33]。
笔者加工了多种不同形状微单元的PDMS芯片。并在真空下, 利用酶液 (纤维素酶、果胶酶) 溶解拟南芥叶片2 h后, 再过筛, 得到直径30μm的原生质体样品。滴加PDMS芯片表面上, 通过原生质体自然沉降, 实现对其捕获。经过大量的沉降参数优化, 发现在真空条件, 亲水处理后的圆形微孔状 (直径40μm) 、间隔40μm阵列分布的PDMS芯片可以有效地捕获原生质体 (图5) 。
3 三维细胞培养技术在植物细胞研究中应用的前景展望
目前该技术主要应用在哺乳动物细胞培养研究中, 涉及到植物细胞培养中的研究报道甚少。但是植物细胞和动物细胞有许多相通之处, 例如:原生质体 (去壁后的植物细胞) 与哺乳动物细胞有很多的相似之处, 例如可以摄入细胞器、微粒体、病毒以及DNA等大分子物质, 这就为将三维细胞培养技术引入到原生质体培养中提供了可能性。尽管也有一些类似的研究已开展, 但现在大多还处于理论探索阶段, 与农、林等生产实践相结台的应用研究也尚处于起步阶段。综合分析认为, 这种多学科的交叉融合和互相渗透无疑将成为今后研究植物细胞培养技术发展趋势。以后研究将主要集中在以下几方面。
(1) 适合植物细胞的单细胞芯片的研发。这种细胞芯片具备以下3个特点:一是可以简单、迅速、大范围的捕获单个细胞;二是可消除流体剪切力对植物细胞生长的影响, 以获得真实的生物学信息;三是便于原位培养, 同时也便于进行原位、长时间动态的跟踪观察和进行精确的高通量分析。
(2) 通过在支架表面固定RGD, 人工建立支架表面-质膜-细胞骨架跨膜的连续体, 研究基底表面纳米几何结构, 对原生质体细胞壁再生、细胞分裂等活动的影响。在微纳米尺度下, ECM的表面几何、化学、力学性质等, 可以调控哺乳动物细胞在材料表面的粘附、生长、运动等。这主要是由于动物细胞膜表面上的存在整合素这样的受体, 其胞外域可以结合ECM, 胞内域与细胞骨架连接, 确保了细胞与环境, 或细胞与细胞间信号传递的通道。类似的植物细胞中同样存在RGD依赖的识别系统, 该系统参与协调控制植物细胞壁的分裂和适当细胞壁的合成[10]。因此, 通过在支架表面固定RGD, 人工建立支架表面-质膜-细胞骨架跨膜的连续体, 进而改变支架表面纳米结构, 必然会影响原生质体细胞壁再生、细胞分裂等活动。
细胞培养技术 篇2
在体外对细胞培养并进行研究的技术, 也叫细胞克隆技术.细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。
细胞培养技术主要包括二大方面内容: 1.微生物细胞培养技术
2.动, 植物细胞培养技术 ：1)器官培养技术 2)组织培养技术 3)细胞培养技术 二.细胞培养的优点
1.得到的是活细胞：能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动 2.可控制：（1）可控制-选择对象：类型： 上皮？间质？性质：正常？肿瘤？（2）可控制-调节条件：各种因素:物理、化学、生物等因素（3）可控制-利用方法。采用各种研究技术、记录方法：
研究：倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记--记录：摄影照片、缩时电影、电视--3.应用广（1）学科多：（2）对象广：各种动物：低等动物--高等动物--人类；一种动物：不同年龄；不同组织: 正常或异常（肿瘤）
4.较经济：花钱较少但可得到大量、同时、重复性好的生物学性状相似的实验对象 5.不易污染环境
三、细胞培养的缺点
1.现人工无法完全模拟体内环境：
a.失去彼邻关系b.失去神经体液的调节和细胞相互间的影响
2.细胞趋向单一化
3.失去原有组织结构和细胞形态
4.分化减弱或不显：要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。5.某些类型细胞还很难培养 6.大规模培养难度大
四.体外细胞培养的方式
1.粘附型培养: 附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。
粘附是大多数有机体细胞在体内外生存和生长发育的基本存在方式
2.悬浮型培养: 不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。来源:来自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞.癌肿细胞也可以.特点:在悬浮中生长良好,细胞圆形，单个或小细胞团
优点 : 生存空间大，提供数量大,传代方便(不需消化),易于收获可获得稳定状态.缺点:观察不方便, 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)五.体外培养细胞的生长形态分类 根据形态大致的不同，主要2类：
1.上皮样：来源：来源于外胚层，内胚层细胞如：皮肤及其衍生物, 消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核易相连成片相靠—紧密相连—成薄层—铺石状
2.成纤维细胞样：培养中形态与成纤维细胞类似。来源：中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮
形态：似体内成纤维细胞的形态，胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等的突起，中有卵圆形核。3.其它，不定型 六.常用术语
1.细胞系（cell line）：原代培养物首次传代后，就可以称细胞系。不能或有限传代下去称有限细胞系。能连续传代的称连续细胞系。
2.细胞株：某类细胞经传代克隆并保持了该类细胞理化特征的细胞群体。3.原代培养：直接取自生物体的组织细胞并进行培养
4.传代培养：将细胞从一个培养物内分散到另一个培养物的过程。5.转染（transfection）：将某个基因转移到培养细胞核内。
6.lipofection：常用细胞转染剂（脂质体），它搭载基因（DNA）后形成复合物可转染到动物细胞。
第二章 细胞培养的条件及设备
一、细胞培养室
二、常用设备 1.超净工作台； 2.纯水装置； 3.抽气泵； 4.消毒装置； 5.干燥装置；
6.CO2培养箱(孵箱)； 7.液氮生物容器； 8.冰箱； 9.离心机 10.天平
11.显微镜 12.过滤装置 13.空调 14.酸度计 15.干燥器
三、常用消耗器材
1.培养瓶及各种相关玻璃用品、塑料用品和棉制品 2.手术器材
四、培养用液
1.天然培养基（液）：血清、鸡胚浸出液、鼠尾胶
2.人工合成培养液：合成培养基、平衡盐溶液、缓冲液、蒸馏水、消化液和抗菌素等
五、消耗性器皿的清洗、包装及消毒
第三章 细胞培养基本技术
一、原代培养基本技术：取材→漂洗→剪切→消化→计数→接种
二、传代培养技术：去旧换新液→消化→分装
三、细胞冻存及复苏技术
培养液高度：2.5~3.0mm 第四章 每代细胞基本的生长过程
一.游离期：细胞接种后最初一段时间, 细胞在培养基中呈悬浮状, 胞体圆形 二.贴壁期：细胞附着于支持物上 三.潜伏期： 四.指数增长期
影响因素
1.细胞种类
(附着最强)巨噬细胞(30’)一成纤维
细胞——上皮细胞——血细胞(最弱)2.生物因素
血清、培养液中的促附着因子 3.机械，物理等
离心：促进附着
流动：培养液流动可阻止细胞附着
低温：可抑制附着 增加细胞粘附的措施（因素）1.增加支持物粘附性
a.赖氨酸类 b.血清
c.某些生物活性物质,纤维性物质 d.减少接种时细胞悬液的量
待细胞粘附和贴壁之后，再补充足够的培养液 e.减少培养液中血清的含量
使培养液黏度降低
f.培养液中离子成分及其浓度
如，培养液中的Ca含量过低时不利于
细胞的粘附、贴壁和铺展 g.培养液的温度
低温会减低细胞的活动，妨碍黏附和贴壁 伸展过程
细胞悬浮在培养液中时，近似球体形状
当接触坚硬平面
即铺展于底物上，扁平状
与底物形成很多接触点
伸展分几个阶段
(1)开始阶段
开始附着铺开
细胞附着于底物
球形的细胞，下方表面与底物接触成扁
但尚未形成新的伪足(2)放射状铺展阶段
在球形细胞体的周围形成很多伪足隆起 伪足形状
主要 柱形丝状: 直径0.2-0.5um 长10-20 扁平片状: 厚0.1-0.5 宽2-5 尚有: 小泡状叶状: 直径1-2 开始时: 絲状多
以后 片状增加
许多伪足
形成薄的胞质小片牢固贴于底物
胞体中央部分 扁
整亇细胞扁平(3)极化阶段
细胞最后伸展附着的情况
实验：用多种细胞，以显微操作及缩时电影
定位细胞附着于玻璃和聚苯乙烯情况
检测--显微针头— 结果：附着规律 附着点： 附着规律
几乎未见于细胞的中央区
(如不在核之下)总在边缘，边缘”摆动”活动的部位
凸的边缘
在薄的边缘
附着区：
约为细胞下面表面的15-35％ 附着、伸展的条件
底物
细胞能在很多固体表面附着
最终铺展的程度，取决于底物的性质
影响因素：
活性物质(贴附、伸展因子):血清、培养液中，或细胞分泌的生物活性物质被底物吸附后可利于细胞的铺展
细胞借助这些分子,可附着于各种”非特异性”的底物上
如Fn，胶原，聚赖氨酸
机械，物理因素 三.潜伏期 细胞活着但无分裂.细胞株6—24h 原代24—96h 四.指数(对数)增长期
细胞增殖旺盛, 数量成倍增多, 最适合实验研究.3—5d以后来到. 判断方法: a.细胞群体倍增时间 B.细胞分裂指数
五.停止期(衰退期)
细胞长满瓶壁, 有活力, 不增殖, 能存活一段时间.如传代进入下一循环.传代培养到一定的代数时，细胞的生命活动明显减弱。即使及时传代也无效 表明培养物已经进入衰退期，再向前发展，只有退化、死亡
接触抑制和
密度依赖性生长仰制 增殖的密度抑制 实验
方法：3T3细胞，接种105于6cm培养皿，5d细胞计数
培养5~6岁宝宝的运动细胞 篇3
5岁的宝宝喜欢玩各种球类，虽然有时还不能很好地“驾驭”那个比自己手掌大的球：他们喜欢做手工，虽然拿剪刀的技巧还不是很成熟，妈妈还是会担心他们把自己弄伤……5岁是宝宝肢体发育的重要时期，如果家长能够好好把握，会影响孩子一辈子。
都说“生命在于运动”，在宝宝运动时，他们的肌肉得到了全面的锻炼和发展。除了锻炼，5岁以后的孩子由于动作和语言的发展，生活范围的扩大，他们的运动已经有了一定的目的性和计划性。虽然这时候的运动还是“玩”的成分居多，但宝宝还是会想大量的方法来赢得这场游戏，或者让自己表现得最好。
他们玩的游戏内容、形式多种多样，每天不同，甚至会自己创造一些新的游戏玩法，这大大丰富了他们的想象力和创造力。虽然这时期的宝宝玩的游戏一般还是比较简单，但相比以前还是有了一定的飞跃。他们会以日常生活的事件、社会的事件为每次游戏的主题来进行游戏。
面对新的游戏，宝宝还肩负着对小伙伴讲解游戏规则的“艰巨任务”，这就锻炼了宝宝的表达能力和人际沟通能力。甚至，宝宝还要“言传身教”地告诉小伙伴如何做这个新游戏，这又起了一个“带领”的作用，也培养了宝宝的统筹能力。
宝宝不爱运动怎么办
由于性格原因，的确有的宝宝不喜欢剧烈的运动，甚至厌恶“竞争性”的游戏。这时，父母不应该硬性规定宝宝要进行某项运动，应该观察宝宝的喜好，选择适合宝宝的运动。
例如，现在市面上带贴纸游戏的图书，就非常适合一些文静的宝宝。别以为这些图书对宝宝的发展没有什么作用。其实，当宝宝运用剪刀和浆糊细心地把东西粘在一起的时候，就锻炼了手部肌肉协调能力、手脑协调能力和审美能力。这些都是宝宝发育必不可少，也容易被父母忽略的方面。
培养宝宝其他方面的技能
专家认为，5岁以后的宝宝通过做家务也可以锻炼肢体的能力。这时，宝宝所做的事情已经有了明确的目的性，已经能掌握某些简单劳动的技能和技巧，如做些手工作业，饭前饭后帮助整理饭桌椅，自己洗手、穿衣等。他们懂得这些不是游戏，但可以帮助他们自己也获得锻炼，所以有些宝宝也会热衷这类活动。
动物细胞培养技术研究现状与思考 篇4
动物细胞培养技术在生物、医学等研究领域都有着广泛的应用, 动物细胞培养方式包括原代和传代培养。培养方式有贴壁、悬浮以及固定化培养等方式。动物细胞的生长除了要给细胞组织提供一个无菌、恒温的环境, 还要给予充分的营养。动物细胞培养技术有着很大潜力的开放空间, 前景光明, 但是它同时也面临着技术方面的诸多问题和挑战。本文将通过分析细胞喂养技术取得的进展, 探讨动物细胞培养存在的问题以及动物细胞未来的发展方向, 从而建立并筛选出合适的细胞系培养方法。
1 动物细胞培养的基本概念
细胞培养指的是从体内组织取出细胞, 并为其提供一个无菌、具有适当温度及酸碱度的环境, 给予充分营养, 使其生长繁殖并维持其结构和功能的一种培养技术。从体内取出的细胞进行的首次培养式细胞培养最初的阶段, 也称为原代培养。原代培养式细胞培养当中重要的必经环节。原代培养细胞生长到一定时候后, 由于受群体环境影响, 需要转移到另一个容器, 这种培养称为传代培养。传代后的动物细胞与原代培物形状一致的话, 则表示传代成功, 这些细胞称为细胞系或细胞株。
2 动物细胞培养技术的内容
2.1 体外培养动物细胞的生物学特性
动物细胞没有细胞壁结构, 机械强度低, 对剪切力较为敏感, 因此无法很好地适应体外环境。此外, 在体外进行培养的细胞失去了神经体液调节以及细胞间相互影响等作用, 她们不仅失去原有组织结构, 还不易保持原有细胞形态, 处于缺乏动态平衡的生活环境中, 分化能力也降低, 直至发展成为恶性细胞。因此, 在体外进行动物细胞培养应密切关注体外细胞的状态, 生长环境提供的条件是否适宜生存, 有无被微生物感染等。
2.2 细胞培养所需环境
(1) 无菌无毒环境无菌无毒的操作环境是保证动物细胞体外培养成功的前提。体外培养细胞面临着被微生物感染或受自身代谢物质影响的难题, 因此, 在进行体外细胞培养时, 要及时清除细胞产生的代谢废物, 确保为体外培养的细胞提供一个无菌无毒的生存环境。
(2) 气体环境气体主要是O2和CO2, O2可以给细胞提供能量, 而CO2不仅是细胞增殖所需的物质, 也是其自身的代谢产物, 此外, CO2还有着调节培养基p H的作用。
(3) 温度适宜的温度能够维持细胞持续旺盛生长, 若温度超出适宜温度范围, 不仅会影响到细胞的正常代谢, 损伤细胞, 甚至会使其致死。
(4) 缓冲环境缓冲环境的作用是为细胞提供一个酸碱度在培养细胞生理范围内的培养液, 提供水分和无机盐, 维持细胞的正常代谢。
(5) 培养基培养基分为天然培养基和合成培养基两种, 它是细胞生长繁殖的直接环境, 为细胞提供所需的营养。天然培养基是从动物体液或组织中分离提取获得的。血浆、血清以及淋巴液等物质都可作为天然培养基。动物细胞培养主要用的是合成培养基。合成培养基含细胞生长所需的无机盐、糖类、维生素、氨基酸等基本物质, 有特殊要求的还会添加适量血清。
2.3 细胞培养方式
(1) 贴壁培养对于那些具有贴壁依赖性的细胞一般使用贴壁培养的方式。一般这样的细胞需贴附于不起化学作用的物质的表面生长, 最终在表面生长至单层, 当整个平面被铺满时, 细胞会出现接触抑制的现象。
(2) 悬浮培养悬浮适应细胞、肿瘤细胞等非贴壁依赖性细胞不需要生长的支撑面, 细胞可悬浮于液体培养基, 并大量增殖。因此, 悬浮培养是大规模细胞培养的理想方式。尽管, 动物细胞培养当中存在着各式各样的困难, 科研人员还是会不断提高分子生物学的研究水平, 扩大研究范围, 因为动物细胞培养技术是多个学科研究领域当中重要的工具。
(3) 固定化培养无论是贴壁依赖性细胞还是非贴壁依赖性细胞都可用固定化培养方式进行体外细胞培养。固定化培养属于包埋培养方式, 目前已有的固定化培养方式包括微载体培养、中空纤维培养以及微囊发培养三种方式。固定化培养不仅剪切力较低, 传递效果较好, 而且还易于收集并分离纯化细胞产物。用此种方式培养的细胞也具有较强的抗污能力, 细胞生长较为集中, 生长密度也高。
3 动物细胞培养存在的问题及展望
近一个世纪以来, 动物细胞培养技术经过研究人员的不断开发, 已经有了很大的进步。但是, 目前的技术水平还无法彻底满足细胞生物制品开发和生产的要求。首先, 由于动物细胞培养的技术和方法还不太成熟, 细胞的成活率和利用率较低, 从而造成动物细胞技术效率较低的现象发生。其次, 在进行较长时间、较大规模的细胞培养中, 工作人员无法排除细胞代谢产物对自身的影响, 且细胞群体的生理机能也会在这个过程中受到影响, 一般会表现出分泌和代谢能力的降低甚至丧失。此外, 动物细胞培养技术所用的培养设备和培养用微载体耗费昂贵, 导致研究成本增加, 限制了我国大规模开展动物细胞培养的工程。
4 总结
动物细胞培养技术在未来的发展方向应将重点放在优化细胞环境, 改进细胞特性等方面上, 最终达到提高生物制品的产率和产量, 扩大生产规模的效果。尽管, 动物细胞培养当中存在着各式各样的困难, 科研人员还是会不断提高分子生物学的研究水平, 扩大研究范围, 因为动物细胞培养技术是多个学科研究领域当中重要的工具。在不久的将来, 许多生物实验材料和工业化生产都需要动物细胞培养技术来开展自身的研发工作。
参考文献
[1]顾芸, 等.壁虎脊髓细胞的原代培养及形态学观察[J].南通大学学报 (医学版) .2007, 1.
[2]郑鑫, 等.中国林蛙输卵管上皮细胞的培养及其生物学特性研究[J].食品科学.2006, 5.
动物细胞培养总结! !!! 篇5
1.实验器械、器皿的清洗和消毒（1）清洗和包装
离心管(1.5ml，2ml,15ml)若干，冻存管若干放进铝饭盒，用牛皮纸包裹，系紧棉绳，用笔在饭盒上和牛皮纸上标记盒内所装物品名称、数量、日期和所属人名称。
蓝枪头两盒，黄枪头白枪头各一盒用牛皮纸包裹，用棉绳扎紧。取适量蒸馏水于4L玻璃瓶，瓶盖拧松半圈。
过滤器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自来水毛刷洗涤剂刷洗，蒸馏水润洗，烘干。
过滤器两部分分别包裹，先将瓶口部位用锡纸包裹后，再罩以牛皮纸，再用棉布密包起来，用棉绳扎紧。
玻璃瓶拧下瓶盖，瓶身浸酸。浸酸时应注意安全，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁以便浸酸结束后清洗耐酸手套，防止走动时酸液滴到地板上不好清洗。瓶口慢慢沉入液面下，注意缓慢降低瓶身，使液体慢慢浸入瓶内，以免产生气泡溅出酸液，发生危险。浸酸时器皿要充满酸液，勿留气泡，浸泡过夜。取出瓶身时，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁，取出后将瓶身放入盆内水中在转移至水池边清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。换水洗几次，待水澄清后开始冲洗，每瓶都用自来水灌满，倒掉，重复15次，再用蒸馏水漂洗5次，去离子水漂洗3次，烘干备用。（2）消毒灭菌
1>全自动高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，放入物品，瓶类物体须拧松盖子后放最上面一筐，盖上灭菌锅盖，拧紧盖子至温度显示栏的左上角有一红点亮灯，按start开始升温。若灭有无菌水或玻璃瓶待降温至常温再打开，打开后立即拧紧，无菌水瓶口封上封口膜。若没灭瓶类物品，降温至80度左右即可打开灭菌锅，须戴上线手套取出。
2>手提式高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，检查设定是否为121度20分钟，放入物品，盖上灭菌锅盖，注意导气管一定插到锅底并不能堵塞，用手对称地拧紧锅盖螺栓，再用扳手继续拧紧。加温升压之前，先打开排气阀门，加温约半小时后见排气阀处开始排残留在锅内的冷空气，排气五分钟，关闭排气阀，继而开始升压。灭菌后不要立即打开气阀放气以免水汽喷出。待自然降温至常压才能打开气阀。
玻璃瓶须拧紧，饭盒，枪头灭菌后放入烘箱烘干备用。2.无菌间消毒及设备检查
用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兑水，抹布、拖把擦洗。配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔细擦拭CO2培养箱，超净台，超净台内物品，显微镜，桌面，若培养箱内未培养细胞可以再打开高温灭菌模式将培养箱灭菌一次。
用蒸馏水擦拭清洗水浴锅内壁，注意底座不要沾水。检查CO2总压力表，若读数不足四分之一提前预定CO2瓶，换瓶时需要扳手。CO2培养箱最下层的增湿盘须定期观察加水，将增湿盘内注入1/2无菌蒸馏水，并将盘直接放置在培养箱中央。启动培养箱，培养箱接通电源，增湿盘加水，连接好气体供给，检查有无漏气，输入系统设置。设置温度和二氧化碳。
紫外照射无菌间30分钟，注意屋内不要有人以及培养基等试剂。3.细胞培养用液的配置及分装
RPM1640培养基配制：将干粉型RPM1640培养基溶于总量1/3的去离子水中，再用1/3水冲洗包装内2次，倒入培养基中，以保证所有干粉都溶解成培养液，根据产品说明的要求和实验补加谷氨酰胺和NaHCO3 ,倾斜三角瓶轻轻放入转子，用磁力搅拌器搅拌2h。用泵使培养基在超净台内通过灭菌的过滤器，过滤除菌，分装后置4度冰箱保存备用。使用前调pH至7.0，加双抗于培养液中浓度为1%，使用时加胎牛血清10%FBS.胎牛血清FBS的处理：使用前应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体，将胎牛血清放入56度水浴中30分钟，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。分装前提前2天放4度冰箱解冻，溶解完全后于超净台内分装为25ml每管，留2管放四度备用，余下放-20度冻存。配制含血清培养基或冻存液前务必提前一天取出分装后的血清四度溶解备用，血清融化很慢。
5%NaHCO3溶液配制：5g NaHCO3，100ml蒸馏水，NaHCO3溶于水后，过滤除菌。0.25%胰蛋白酶液200ml在超净台内分装成每管1ml或2ml，封口膜封口，-20度备用。
双抗溶液配制：80万单位青霉素加4ml灭菌D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。100万单位链霉素加5ml灭菌的D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。两溶液各取0.5ml混合，加入9mlD-Hanks液，则成含青链霉素各1万单位/ml，分装后置于4度冰箱保存备用。
二．操作步骤 注意事项：
1、所有实验用的器械，仪器灭菌，消毒，烘干。
2、打开溶剂，培养瓶瓶盖时，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下。
3、用完溶剂，培养瓶时，瓶口及瓶盖也要在酒精灯上烤一下。
4、所有物品放入超净台需用酒精棉擦拭，包括手伸出窗口拿取物品再回到窗内时需要重新用酒精棉擦拭。开始工作：
1、实验前换紫外照过的白大褂和拖鞋。
2、戴橡胶手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。
3、取待用的细胞，旋紧瓶盖。
4、胰酶消化缓慢时可以将细胞置于5%CO2、37度培养箱中1min-2min，目的是提高酶活性，促进消化。1.细胞复苏
提前预冷离心机，设参数为4度，1000r/min,5min。
将枪头，装有离心管的饭盒，垃圾盒放入超净台，酒精棉擦一遍超净台台面和移液器尤其枪口，以防别人用枪时不慎沾染脏污堵塞枪口。超净台和房间照15分钟紫外，照紫外的同时取出无血清培养基和含血清培养基37度水浴加热。
关闭紫外，打开风机，升高窗高，点燃酒精灯，用镊子从饭盒中取2个15ml离心管放至试管架，每管加入3ml无血清培养基，提前剪好2条封离心管的封口膜备用。
戴上橡胶手套再套上线手套，用镊子从液氮中取出塑料冻存管，用手拿冻存管迅速浸入37度水浴中，剧烈急速摇晃冻存管，因为有防水胶布缠裹不用担心进水染菌，使其急速融化，注意管内冻存细胞的融化情况。基本转为液态时将冻存管取出，摘下线手套，冻存管转移至超净台内，用酒精擦手，擦拭冻存管尤其管口，撕下胶布和封口膜，再擦拭管口，整个溶解过程尽量在30s至1min内完成。(注意：这一步对细胞存活率至关重要。既要尽快融化以减少融化过程对细胞的损害，又要尽可能减少细胞在较高温度停留的时间以减少DMSO对细胞的毒害，切不可将冻存管放在烧杯内不管。)打开冻存管管盖，逐滴加入1ml无血清培养基，轻柔地将冻存管内的细胞悬液吸取出来，转移至已备好的离心管内，轻轻摇混匀，盖上管盖，轻轻地上下颠倒混匀。封上封口膜。
低俗离心1000r/min,5min。小心地吸出上清液，要求上清液尽可能吸走，同时又不触及管底沉淀的细胞。（较高要求时可以用手指轻弹离心管管底，将细胞团分散，加入10ml无血清培养基混匀离心10min弃上清再洗一次，有助于减少DMSO残留。）加3至5ml培养液至沉淀的细胞，轻轻摇晃使分散成细胞悬液，将细胞转移至培养瓶中，拧紧盖子，转移至培养箱中再反旋拧松半圈，以利于瓶口内外进行气体交换，注意取出培养瓶时须先拧紧瓶口。37度恒温箱中培养。第二天观察细胞生长情况。培养基瓶盖过火，拧紧后封上封口膜。收好物品，擦一遍台子，灭酒精灯。2传代培养
附着型胞(adherentcell)传代培养
离心法提前预冷离心机，设置好参数4度，1000r/min,5min。倒液法不需要。
将灭菌枪头，装有离心管的饭盒，新培养皿/瓶,垃圾盒放入超净台，酒精棉擦一遍超净台台面和移液器尤其枪口，以防别人用枪时不慎沾染脏污堵塞枪口。超净台和房间照15分钟紫外，照紫外的同时从冰箱取出PBS,胰酶，含血清培养基于37度水浴加热。关闭紫外，打开风机和照明，升高窗高，点燃酒精灯，将所需试剂先擦瓶底，放在台子上再擦侧壁一圈，擦瓶口瓶盖，撕下封口膜，再仔细擦一遍瓶口。用喷过酒精的塑料筐将细胞培养瓶拧紧盖子拿到超净台旁的椅子上放平放稳，每三瓶/皿一摞拿入超净台先擦最下面一个的底部，擦好后放在台面上，擦一摞的侧面一圈，在分别擦底面顶面瓶口，直到所有培养瓶各个面及瓶口擦好，注意不要擦到有marker标记字迹的部位，酒精会擦掉字迹，若擦到字迹待酒精干后立即补写上以防事后记不清。
轻轻倒掉旧培养液，注意不要使液体倒流回来冲击细胞，挂在外壁的残留液滴用酒精棉擦掉,培养瓶可以轻轻翻转瓶子使细胞生长的面在上，顶面在下，液体留至顶面后直接倒掉液体。加1ml PBS，注意枪冲着不长细胞的培养皿侧壁或翻转培养瓶朝瓶的顶壁或侧壁打入PBS，尽量不碰到瓶口或培养皿，若怀疑碰壁，弃掉枪头。轻轻摇晃培养皿或瓶，使PBS沾到所有细胞，洗涤细胞一遍，轻轻倒掉PBS。
加入0.25%胰蛋白酶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，若是高倍胰酶先稀释（0.25%为1X胰酶），37℃作用数分钟。等待消化期间准备好新的培养皿/瓶，每25cm2小皿/瓶加入2ml含血清培养基。消化中的皿盖好盖子或瓶拧紧盖子，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状，有10%细胞漂动时，倒掉胰酶溶液，加入1ml(25cm2小皿/瓶)含血清之新鲜培养基终止胰酶作用。(若细胞将要分离而呈现圆粒状且80%细胞漂动，则不移去胰酶，在胰酶作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止胰酶作用，吹打成细胞悬液转移至离心管，封上封口膜，离心后再吸掉上清液。）
轻轻摇晃培养瓶使细胞自瓶壁脱落，以吸管上下轻轻吸放数次以打散细胞团块，注意吹打时有系统性的将所有面积都打到不要集中只吹打一处而一些地方没吹打到，吸和吹时枪头都不要离开液面以减少气泡，气泡多破裂时对细胞有冲击且会增加体积不利于操作，培养瓶吹打时操作角度小不方便，用倒液法（10%细胞漂动即倒掉胰酶加含血清培养基终止消化）时吹打细胞要用二档多吹打几次，用皿或离心法（80%细胞飘动不弃胰酶直接加含血清培养基再离心弃上清）时细胞很容易脱落，可以用一档轻轻吹打，保证所有面积都吹打到即可。混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，拧紧瓶盖，镜下观察细胞数量多，培养液澄清，若细胞密度过低将影响生长可适当补充细胞悬液，若细胞密度过大将影响迅速生长一天后即需传代，可根据实验适当添加培养基或细胞悬液使生长速度符合预期，转移至CO2培养箱，拧松半圈瓶盖，37度培养。试剂瓶瓶盖过火，拧紧后封上封口膜。密封收好物品。擦一遍台子，灭酒精灯。
3细胞换液
取待用的细胞，旋紧瓶盖。
弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。
用微量枪加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。
用微量枪加入适量的细胞培养液于培养瓶中。旋紧瓶盖。将细胞置于5%CO2、37度培养箱，反旋拧松瓶盖半圈，培养。
4细胞冻存 1>准备工作：
提前一天将血清FBS从-20度取出放在4度冰箱解冻。选取对生增生期细胞（镜下密密麻麻，胞体突触明显），在收集细胞24h前换液一次。
进入细胞室前，首先用75%酒精擦试工作台，接着紫外灭菌30，过后，关闭紫外灯，通风10min。从冰箱中取出胰酶、PBS缓冲液、培养基，血清37度水浴。取出室温放置的DMSO。找到防水的医用胶布，滤菌膜，针管和所需枪头饭盒等物品，喷一遍酒精，放入台子照紫外。2>开始工作：
实验前在更衣间换上紫外照过的白大褂和拖鞋。戴上橡胶手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。酒精擦拭胰酶、PBS缓冲液、培养基放入超净台。过火镊子取出离心管于试管架，剪好封口膜备用。用滤菌膜和针管过滤DMSO以除菌。
75%无血清培养基，20%的血清，5%过滤除菌的DMSO，混匀配制成所需的冻存液。
取待用的细胞，旋紧瓶盖。
弃去旧的培养液，挂壁残液注意用酒精棉擦去，用微量枪朝不长细胞的侧壁或顶部打枪，加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。用微量枪朝不长细胞的侧壁或顶部打枪，加入适量胰酶约2ml，弃掉枪头。消化数分钟，等待期间，用过火镊子从饭盒中取出冻存管和管盖标记好细胞名称和冻存日期，直立于台面备用。
用微量枪加入适量的完全培养液冲洗（吹散细胞）细胞，将瓶底粘着的细胞吹散下来，再将细胞悬液移入的离心管中，封口，标签。离心5min，1000转/min。
细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液。用微量枪将冻存液平均加入离心管中，混匀离心管中细胞冻存液。用微量枪将含细胞的冻存液移入冻存管中，封口膜封口，防水医用胶布再缠一圈，标签时间，细胞名称。
冻存，需缓慢冻存，先放置4度冰箱20min，然后放置-20度冰箱30min，再置于-80度冰箱过夜，最后置于液氮灌-196度中保存。5 铺板和细胞计数
用传代方法制成细胞悬液。倒掉培养基，用PBS液洗涤后，0.25%的胰蛋白酶液消化，加入培养液吹打制成待测细胞悬液转至离心管，封上封口膜，离心1000r/min,5min。
等待离心其间，取细胞计数板，盖玻片酒精擦拭，均在酒精灯上烤一下，将盖玻片盖在细胞计数槽上，使覆盖细胞计数板上的上下两个“十字”区域。取一只新的15ml离心管，做好标记，摆放好。离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液，加入全培养液吹散沉淀细胞成细胞悬液，拧紧管盖，上下颠倒混匀。用枪吹打混匀离心管中含完全培养液的细胞，再从离心管中取1ml细胞悬液移入新的15ml离心管，加入4ml完全培养液，即稀释五倍，吹打混匀细胞悬液，上下颠倒混匀细胞悬液。
上下颠倒混匀新15ml离心管内细胞悬液，计数前将待测液吹打均匀，用微量枪从新15ml离心管中取出细胞悬液（约10μl），滴入计数板上盖玻片的一侧缝隙旁，虹吸作用液体会吸入盖玻片下（不能有气泡，不然会影响细胞计数，注意滴入悬液量不能太大致使细胞悬液流入旁边的槽中），镜下观察细胞，数出计数板四角大方格中的细胞数（16个小格×4个大格），用计数器计数（约200个）
细胞数 万个/mL原液=（4大方格细胞数之和/4）×稀释倍数（常稀释5倍，若细胞过多不能数清则加大稀释倍数，不断调整新离心管中细胞悬液的细胞浓度，直至镜下观察细胞数目符合要求。）每皿/瓶需铺板50-100万个细胞，根据细胞计数算出每皿所细胞悬液需毫升数，加入悬液时注意混匀，不得有气泡，吸时注意每次枪尖是否都吸满液体。每皿加入细胞悬液后，用含血清培养基补足至2ml/皿/瓶。24h后观察细胞长至八成满时即可加药处理。
6检验判断细胞状态与加药处理
细胞复苏或传代后24内不可传代，传代4小时后开始贴壁。1>培养基颜色澄清度：
正常生长的细胞培养基澄清透明，倾斜使培养基聚集，对着灯看可透光，若出现丝状沉淀或倾斜培养基对着灯看出现浑浊不透光且镜下细胞之外的部分有密密麻麻的小黑点，很可能是染菌，应弃掉。若镜检在细胞之外部分有一些浑浊，可能因为细胞代谢旺盛分泌物堆积，或者因为消化时间不够以至于过度强硬吹打细胞，造成细胞损伤产生大量细胞碎片，应换液。
新鲜培养基呈粉红色，代谢代谢旺盛的细胞的培养基会变黄，此时若细胞贴壁应换液，若此时细胞已长满，应传代。2>密度：
细胞密度过低，镜下观察稀稀疏疏，则生长缓慢，甚至死亡。较大的细胞密度可促进细胞之间相互作用，促进细胞增殖生长。密度过大，密密麻麻，部分细胞不能伸展成圆形，必须传代，此时不传代，一两天后细胞状态持续不好，开始死亡，镜检漂浮细胞增多。3>状态：
镜下观察细胞，当左右上下移动镜头时漂动的是未贴壁细胞或死细胞，固定不动的是贴壁细胞，贴壁细胞是活细胞。
状态良好的贴壁SY5Y细胞有圆形的胞体和细细分支的突触，突触分明。状态不好的SY5Y细胞，突触不明显，看不到什么细细的分支，甚至成圆形。
消化时快离壁的细胞呈亮亮的圆形。
细胞培养技术 篇6
【摘 要】目的建立一种小鼠腹腔巨噬细胞分离培养的简便方法。方法以无血清的DMEM培养液灌洗小鼠腹腔，分离获取小鼠腹腔巨噬细胞，在含有10%成牛血清的DMEM培养液中培养。采用倒置显微镜观察细胞形态，台盼蓝染色计算存活率，瑞氏染色计算纯度。结果 获得高纯度的巨噬细胞，具备巨噬细胞的形态特征。结论该方法是一种简单可行的分离巨噬细胞的方法。
【关键词】小鼠；巨噬细胞；分离；培养；鉴定
0.引言
巨噬细胞是动物机体内重要的免疫细胞， 具有抗肿瘤和免疫调节等重要作用[1， 2] ， 被广泛应用于体外免疫增强药物的非特异性免疫功能评价[3] 。有很多文献报到已能从多种组织和器官中分离纯化巨噬细胞，但这些方法大多都是繁琐、复杂，所需时间长且耗资较大。本实验以小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象， 探索建立一种巨噬细胞体外分离培养与鉴定简便的方法。
1.材料与方法
1.1实验对象
清洁级巴贝斯小鼠，体重在（30-32g），由兰州大学实验动物中心提供。
1.2实验方法
1.2.1小鼠腹腔单核巨噬细胞的分离培养
随机选取巴贝斯小鼠，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培养液5ml。轻柔小鼠腹部2-3min，静置5-7min后将小鼠颈椎脱臼处死，至于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用注射器抽取腹腔液，离心5min （1000r/min），弃上清，用PBS洗涤2遍。再用含10%成牛血清的RPMI-1640培养液（0.1%双抗溶液）调节至2×106ml-1，接种于培养瓶及6孔板，置37℃，5%CO2培养箱培养2h，弃上清。用不含小牛血清的RPMI-1640培养液洗涤2遍，然后加含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液在37℃CO2培养箱中继续培养[4]。倒置显微镜观察细胞形态。
1.2.2巨噬细胞的观察与鉴定
（1）台盼蓝染色计算存活率。
4%台盼蓝母液：称取4g台盼蓝，加少量蒸馏水研磨，加双蒸水至100ml，用滤纸过滤，4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。（也可买Gibco的成品）； 胰酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，并作适当稀释。染色：细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9：1混合混匀。（终浓度0.04%） ； 计数：在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。镜下观察，死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。
（2）瑞氏染色计算细胞纯度。
细胞涂片自然干燥后，用蜡笔在两端画线，以防染色时染液外溢。随后将玻片平置于染色架上，滴加染液3-5滴，使其盖满涂片，大约1分钟后，滴加等量或稍多的II液，用吸耳球轻轻混匀。冲洗：染色5-10分钟用流水染液，待干。 结果观察，将干燥后的血涂片置显微镜下观察。先用低倍镜观察涂片，再用油镜。
2.结果
2.1小鼠巨噬细胞的分离培养
（1）巨噬细胞的观察与鉴定.
巨噬细胞体外培养24h观察结果。如图1
（2）台盼蓝染色结果。
从腹腔分离出来的巨噬细胞进行台盼蓝染色结果显示巨噬细胞的成活率>95%，如图2
（3）瑞氏染色结果。
从腹腔分离出来的巨噬细胞进行瑞氏染色结果显示巨噬细胞的纯度>98%，如图3
图1巨噬细胞体外培养24h观察 图2台盼蓝染色结果
图3 瑞氏染色结果
3.讨论及结论
巨噬细胞广泛分布于体内，它不仅参与非特异性免疫，而且是特异性免疫中一类关键的细胞，参与集体众多的生理和病理反应过程，如巨噬细胞的吞噬和消除病原微生物[5]，通过加工处理提成抗原，启动特异性免疫应答[6]，以及巨噬细胞通过细胞凋亡清除吞噬的致病病原体等。由于腹腔巨噬细胞多游离存在于腹腔的腹水中，易于获得，因此许多实验室在进行基础或配合临床研究巨噬细胞功能及其与疾病的关系、或筛选免疫增强药物和探讨其作用机制时，往往选用小鼠腹腔巨噬细胞为研究对象。
虽然腹腔巨噬细胞的提取方法都是灌胃洗腹腔后，吸出含有巨噬细胞的灌洗液了，但具体操作略有差异[7]。预先注入的巨噬细胞刺激剂有淀粉溶液、肉汤、糖原等，以产生大量的巨噬细胞计入腹腔。虽然这些刺激剂能分离收集到大量的巨噬细胞，但注入的大分子抗原物质对巨噬细胞吞噬功能有一定的影响，获得的巨噬细胞已不再是原体内巨噬细胞的基础功能。本实验提取巨噬细胞的方法是对文献中方法的改进，关键在于活体腹腔注射不含血清的培养液，轻揉腹部后静置几分钟，然后颈椎脱臼致死小鼠，无菌打开腹腔吸取腹腔液[4]。此方法相对处死小数后进行系列操作而言，洗出的灌洗液中混杂的白细胞少，提取局势细胞的纯度高，是一种简便的小鼠腹腔巨噬细胞的分离方法，为巨噬细胞的相关研究奠定了基础。
【参考文献】
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动物细胞培养技术教学实践与探索 篇7
通过大量的问卷调查和日常接触,我们发现医药专科生普遍存在理论基础差,底子薄,并且学习积极性不高的特点。根据学生的这个特点及我们培养应用型人才的培养目标,在实际教学过程中,我们采取以学生为主体设计来设计课程,倡导自主、合作、探究的学习方式。教学主要根据专科层次的专业设计特点,特别强调理论知识与对应的细胞培养操作技能关联学习,通过课堂教学活动的组织和教学评价强化学生的技能。
1 理论和情景教学相结合的课程设计
基于动物细胞培养的工作过程,按照动物细胞培养的工作任务结构,本课程主要设计了三个方面的内容,即动物细胞培养的仪器设备设施条件,动物细胞培养的基本技能,药学细胞工程常见技术。本课程在学生学习了《药用基础化学》、《有机化学》、《医学基础》、《微生物学基础》、《基础生物化学》和《生物药品》等课程之后开设,目的是使学生有了一定的生物学基础知识和相对扎实的化学基础知识和操作技能之后,能更好地完成本课程的学习要求。
没有理论指导的实践是盲目的、不规范的,因此医药专科生在学习细胞培养技术之前,必须先学习理论知识。传统的学习方法是先进行理论教学,后穿插进行实验教学。我们针对医药专科生理论基础相对薄弱,学习能力欠佳的特点,没有采用传统的教学方法,而是采用理论和情景教学相结合。对理论内容进行精心选择,紧扣实验的需求和工作中应用的需要,在实验技术上注重基本技能的培养和常见技术的实践。同时按照动物细胞培养的特殊要求,我们设计了循序渐进的7个学习情境:(1)常见细胞培养实验室的布局;(2)细胞培养主要仪器设备的操作;(3)细胞培养用液的配制;(4)无菌操作技术及细胞培养无菌器材的准备;(5)细胞培养的基本操作,包括传代培养、克隆化培养、原代培养、扩大培养;(6)细胞大规模培养与生物反应器技术;(7)细胞冻存与细胞复苏技术。对于每一个学习情境,我们采取理论和实验教学并行的模式,对于基本的实验技能如显微镜的使用、传代技术及细胞计数技术等我们鼓励学生发挥卖油翁的精神,反复操作直至技术娴熟。
2 实验教学活动的组织
2.1 课前准备
在上课前写好板书,将本次情景学习的重点部分写在黑板上。这样做一方面可以让学生在课前很快了解本堂课需要掌握的知识,并对即将展开的情景学习设置一些相关的问题,如“动物细胞培养液的主要成分是什么?”、“为什么培养前要将细胞分散成单个细胞”等,让学生带着问题和思考进入学习,在实验中更好理解和学习知识,避免对知识死记硬背,达到情景教学的目的。
2.2 教学过程组织
2.2.1 固定分组
从第一次实验就要进行固定人员的分组,这样有利于配合和相互协作,也有利于锻炼团队协作能力。每小组的人员不宜太多,2~3为宜,统筹规划实验流程,高效完成实验内容。根据当堂的实验,教师提前统筹安排好各组成员的任务,使实验有序高效地进行。对于有些不需要相互帮忙的实验尽量安排一人一组,目标是通过本课程的学习,每个学生都具备独立完成相应实验操作的能力。
2.2.2 实验演示
实验课是需要学生自己动手操作来完成课堂的内容,学生的操作是否正确,很大程度上取决于教师的指导,因此教师必须做好示教。首先有教学经验很丰富的教师来担任主任课老师;其次要求任课老师在上课之前对内容了如指掌,参加集体备课,统一带教标准,明确教学重点、难点;最后根据教师在企业挂职和走访经验,在示教过程中强调标准化操作流程(SOP),将实验的标准操作步骤和要求以统一的格式描述出来,指导和规范日常的教学工作。
2.2.3 学生操作
在教学过程中,教师放手不放眼,全程观察学生的每一个操作过程,鼓励学生大胆细心操作,遇到问题要自己先仔细思考。经过一些实验的训练和尝试,同学们操作技能有了很大的提高,同时思考问题的方式也有了较大的转变,由原来不会直接问老师“这要怎么做?”转变成了自己思考后问老师“我这样做对吗?”。
2.2.4 操作考核
在七个教学情境中,我们选取了传代培养、克隆化培养及冻存与复苏等实验进行操作考核。传代培养考核主要考核学生的无菌操作能力及细胞消化、吹打和计数的综合能力,具体要求学生连续传代2个月的时间,最后根据学生传代细胞的培养状态(有无染菌、死细胞多少等)进行评分;克隆化培养考核除了考核学生细胞计数、消化和吹打等技能之外,还考查学生实验设计和计算能力,最后根据单克隆孔的多少进行打分;细胞冻存和复苏实验除了考核无菌操作和细胞计数之外,主要考核学生实验任务的组织能力、操作手感及冻存液配制能力等,最后通过自己冻存细胞的复苏存活率进行考核。动物细胞培养对生物制药专业的学生来说是一门非常重要的技术,只要是技术都免不了要反复的联系,我们以任务驱动的模式让学生反复练习其中最基本的技能,并通过考核来检验他们的学习成果,同时如果学生不满意自己的成绩还可以在课程开设期间重新参加考核,通过这种方式,让学生真正掌握细胞培养的基本技能,养成良好的实验习惯,为他们从事相关工作打下扎实的基础。
2.2.5 课后总结
动物细胞培养技术这门课程是实践性非常强的课程,实验结束后学生都会有自己的操作体会,还会有相应的实验结果,细胞培养的结果我们要求学生倒置显微镜拍照后提交到教师机,其他具体的实验目的、原理、试剂材料、步骤、结果及分析等内容则要求写成实验报告,教师对学生的实验结果及报告进行批改,并对有问题的地方进行标注。最后,对于一些共性的问题下次课上课前进行统一的点评,是学生对相应的操作有更好、更深的理解。
3 教学评价
多元化评价是指对每组或每位同学的实验课成绩考核多元化,既要通过课前预设计实验和课后的实验报告等纸质材料反映,也要通过多种手段和途径对学生的身心素质、专业知识、专业技能和个性特长等方面进行全方面的评价,其目的是促进学生的全面发展。动物细胞培养考核主要包括平时常规评价和过程与结果评价两部分。平时常规评价注重学习态度、考勤和随堂问题回答,占总成绩的20%;过程与结果评价包括三部分:(1)实验操作手法、实验结果与实验操作考核占总成绩的30%;(2)实验报告占总成绩的20%;(3)期末考核占总成绩的40%。
4 结论
实验课和其他实践教学环节是高校培养学生掌握实践技能、形成良好的工作习惯的必要过程,因而必须重视实验教学活动。上述动物细胞培养技术的课程设计、课堂组织和教学评价,目的使医药专科生掌握了基本的理论知识和操作技能,将企业的标准化操作流程灌输到学生的学习过程中,为学生在就业后尽快上手奠定了良好的基础。
摘要：动物细胞大规模培养技术已成为生物制药生产、研究和开发过程中一项非常重要的基本技术。探索从医药专科生的实际出发,围绕培养应用型人才的目标,从课程设计、课堂教学活动的组织到教学评价三个维度一体化教学实践,使学生掌握相关理论知识的同时,强化学生操作技能。
关键词：细胞培养技术,情景教学,操作考核
参考文献
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[5]袁雅红,李东升.细胞培养技术教学实践与思考[J].求知导刊,2015,(20):137-138.
细胞培养技术 篇8
1.1细胞原代培养技术
细胞的原代培养是指取样完成后的第一次培养实验, 它能够在细胞分化、药物测试或病毒试验等方面取得显著培养效果。其技术的应用首先先对提取的样品组织进行清洗, 然后将其切成较小组织块, 可在1或2mm, 再给予分散剂扩大组织块, 时间1小时或半小时, 之后进行吹打, 并在混匀后利用过滤网滤过, 将细胞与细胞团离心出来, 放在对应浓度的培养基上, 调整好培养箱, 温度在37 摄氏度, 二氧化碳在5%, 将培养基置于培养箱中开始培养实验, 此技术的试验成功率很高。
1.2细胞传代培养技术
传代培养的应用是在离体细胞生长一定时间后, 当其发生分裂且增殖逐渐缓慢或要终止生长死亡前, 从一个培养瓶按一定比率转移到另一个培养瓶内继续培养和生殖的方法, 这种方法被称作传代培养技术。此技术的应用首先将原旧培养液吸出, 取PBS缓冲液对其进行两次冲洗, 然后取胰蛋白酶液滴入其中给予消化处理, 之后利用显微镜进行查看, 待细胞恢复饱满样时, 将胰酶液吸出后再将新鲜血清培养基加入到瓶中, 避免细胞粘壁进行吹打, 并将其分装于培养瓶中培养, 保证培养液充分并使细胞均匀浮于上面, 之后加强观察, 一旦又出现细胞分裂到一定程度时再给予传代培养。
1.3细胞冻存技术
细胞的冻存可以有效保证细胞活性和长期保存, 一般在~80摄氏度的冷存环境下细胞可储存一年的时间, 若在液氮环境下, ~196 摄氏度中能够长期保存, 直至使用, 也有相关学者表明, 长期保存的牙髓成纤维细胞, 其使用率及成活率在80%以上。这种冻存技术的操作中, 在细胞冻存前应该先对对数细胞进行培养液培养, 然后将其去除, 再投入消化液、离心, 离心后将上清液去除, 加入冻存液, 待细胞密度适度调整以后, 取悬液细胞并分别装在冻存管中, 封闭, 明确写明细胞名称、代数、冻存时间等, 先于4摄氏度存放半小时, 再移入~20摄氏度冷箱内冻一小时, 之后放在~80 摄氏度冻箱内冻存24 小时, 最后可置于电子技术控制的冰冻箱中长久存储。
1.4细胞的复苏技术
细胞复苏技术的应用主要是对冻存细胞进行复苏, 促使其恢复活性, 当冻存管从液氮环境中取出后, 马上放入准备好的37 摄氏度水环境中进行快速、反复晃动, 晃致冻存液彻底融化为止, 然后将融化后的细胞置入离心管内, 取4ml培养液渐渐滴入其中, 用每分钟1000转速度离心, 然后在细胞沉淀以后进行密度调整, 再行细胞培养。
2细胞培养中引起污染产生的原因
2.1微生物
微生物在生活环境中是无处不在的, 无论是静止物体, 还是人们皮肤表层、动物皮毛等, 其表面均存在细菌。而在实验室进行细胞培养时, 如果工作人员对微生物学及相关技术不了解或没有经过严格培训, 其操作中会忽视很多细节, 造成微生物污染, 如细胞培养使用的培养基、器皿、使用设施、从一处转移另一处时等, 这些操作若不能有效避免, 严格无菌操作, 或在切割时不遵从无菌切开等, 均可产生微生物污染。
2.2工作人员
人体是在不断活动的, 在实验室内工作人员是产生污染的最大来源, 细胞培养各种操作都需要工作人员进行, 其皮肤鳞屑、活动中带动空气或说话时飞沫与口腔内存在的多种微生物等, 均可对细胞培养造成污染威胁, 而且一旦工作人员携带病菌或感染病毒, 进入实验室就是一个高危污染源。同时实验室的通风口、棚板口、排水口等各种通道也存在不断产生新污染的危害, 像一些水槽、潮湿培养箱等潮湿地方也存在滋生细菌并提供污染的危险。
2.3试剂
细胞培养中试剂的使用同样存在一定潜在污染概率, 购进的试剂及培养基具体的应用要明确, 它们有无细菌, 具体作用及有无必要进行灭菌等。就如生长因子或血清在培养试验中, 易发生病毒污染, 所以说有的试剂原材料购进时未灭菌, 而有的培养基, 如猪胰蛋白酶, 它含有动物病毒, 试验中会导致细胞培养结果的不准确, 因此需要对试剂进行风险评估, 确定其使用的可靠, 减低试剂使用不当引起的污染。
3避免污染的措施
3.1工作人员和环境
工作人员进实验室行细胞培养前必须彻底对手、手臂清洁和消毒, 穿戴一次性胶手套、无菌外衣、鞋, 扎好袖口;细胞培养前将各种用具放于无菌照射下灭菌30min;各操作必须按照无菌操作流程进行;同时细胞培养试验台与培养储存柜、清洁区等要保持较远距离;定期对潮湿区域检测, 及时给予处理, 防止产生污染。
3.2细胞培养的用品和试剂
细胞培养中涉及的各种如试管、过滤器等用品, 使用前均进行酒精喷擦, 酒精度80%;使用的一次性无菌塑料用品开封后必须单独存放;试验中试剂瓶打开后, 将盖口向下置于无菌台上, 关盖前必须用酒精灯烤后在盖严;试剂的选购严格检验生产日期、批次等, 对一些没有灭菌的试剂进行评估确定后再使用等。
摘要：医学研究中最具技术含量的研究手段就是细胞培养, 同时它还是生物学研究中应用比较广泛的一种方法。下面本文就细胞培养技术方法进行分析, 观察其操作中引发污染的情况, 同时提出几点避免污染的措施, 内容如下。
关键词：细胞培养技术,污染,措施
参考文献
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[3]史嘉林;杨栋.细胞培养及避免细胞污染的方法[J].养殖技术顾问.2010 (07) .
细胞培养技术 篇9
细胞悬浮培养技术是当代最先进的抗原生产工艺技术, 与传统的培养方式相比具有明显优势:一是单位细胞培养容积生产效率提高140倍以上。二是单位抗原效价提高10倍～100倍。就高效价猪瘟疫苗来说, 转瓶培养时每毫升抗原效价为8万RID, 悬浮培养高达150万RID, 抗原效价提高了18倍。三是同等产能所用空间减少50%。四是有效化解外源病毒污染风险。传统的牛睾丸原代细胞生产方式易携带牛病毒性腹泻黏膜病病毒 (BVDV) , 给猪瘟疫苗带来了巨大的外源病毒污染风险, 而传代细胞悬浮培养可有效化解这一生产难题。五是密闭自动化运行, 大大减少了人工操作步骤和污染机会, 悬浮培养条件稳定, 可保持病毒的生物学特性, 生物安全性好, 质量稳定。
普莱柯公司利用国内首创的传代细胞悬浮培养技术研制成功的高效价猪瘟疫苗, 创造了猪瘟疫苗质量新标准。目前, 猪瘟疫苗的国家标准有两个:一是市售标准, 其单剂量抗原效价为750RID。二是政府采购标准, 其单剂量抗原效价为7500RID。专家建议每头猪用3～4剂量, 相当于30～40剂量的市售猪瘟疫苗。普莱柯公司利用国内首创的传代细胞悬浮培养技术所开发成功的猪瘟疫苗单剂量抗原效价高达3万RID, 相当于政府采购标准的4个剂量, 相当于市售标准的40个剂量, 引发了我国猪瘟疫苗生产方式的革命。
采用悬浮培养技术开发成功的高效价猪瘟疫苗, 使我国生物制品产业实现了两大突破:一是实现了工厂化抗原生产由单层细胞培养升级为悬浮培养的重大工艺技术突破;二是实现了猪瘟疫苗生产由牛睾丸原代细胞升级为传代细胞的重大工艺技术突破。
细胞培养技术 篇10
1 材料与方法
1.1 动物与试剂
实验动物:新生1～3d的Wistar大鼠, 由佳木斯大学实验动物中心提供。 主要试剂:Neuralbasal培养基、B27培养基添加剂、青链霉素 (Gibco公司产品) , 胰蛋白酶、胎牛血清、多聚赖氨酸 (Sigma公司产品) , 阿糖胞苷 (上海华联制药有限公司) 。
1.2 方法
1.2.1 培养板的处理
在取海马前一天, 用35mm孔径的6孔培养板, 每个孔中加入0.1g/L的聚L-赖氨酸2mL, 静止30min除去溶液, 用三蒸水冲洗3遍, 放入二氧化碳培养箱内过夜待用。
1.2.2 培养方法
取新生1～3d的Wistar大鼠, 用95%乙醇消毒, 开颅, 剥离脑膜, 迅速分离出海马组织在Hanks液中剪碎约1mm3, 然后离心500r/min, 5min, 去掉Hanks液, 加入0.125%胰蛋白酶2mL, 消化约20min (37℃、5%CO2条件下) , 中间轻轻振摇2～3次, 尽量去除胰酶, 加入10%胎牛血清终止消化, 离心500r/min, 5min, 去上清, 加入无血清培养基, 用火焰刨光的玻璃吸管轻轻吹打数次, 用200目的细胞筛过滤后, 取0.1mL按台盼蓝拒染法进行活细胞计数, 制成5×105/mL密度的细胞悬液, 种植于多聚赖氨酸包被的6孔培养板中, 每孔加2mL, 24h后全量换无血清培养基。第3天加入抗有丝分裂剂阿糖胞苷 (终浓度为5mg/L) 以抑制非神经细胞增殖, 24h后更换为无血清培养基, 此后每3天更换1次, 每次换1/2量, 倒置相差显微镜定期观察培养过程中细胞生长情况, 于第7天神经元突触联络成网状。
1.2.3 锥虫蓝实验观察细胞活性
用2%锥虫蓝置于长有细胞的盖玻片, 在2min内观察细胞数, 不着色的为活细胞, 呈蓝色为死细胞, 计算活细胞百分比。
1.2.4 神经细胞纯度的测定
第2天换液后在不同培养时间在倒置显微镜下 (高倍) 随机5个视野, 分别计数所有细胞和神经细胞, 计算神经元纯度。
1.2.5 培养细胞的形成学观察
种植的6～12h内用倒置相差显微镜观察神经细胞生长情况, 此后每天都要对神经细胞进行观察, 同时进行拍照。
2 结果
2.1 神经元的存活率
①锥虫蓝实验表明细胞的存活率较高, 本实验大于90%。②不同培养时间神经元纯度的测定结果见表1, 表中可见, 用含Neurobasal和B27无血清培养基及联合应用阿糖胞苷的这种培养方法, 获得的海马神经细胞纯度逐渐提高, 神经胶质细胞则逐渐死亡而减少, 在培养的7～9d, 神经细胞的纯度已达到了90%以上, 故在此期间可进行细胞实验研究, 如在此期间可制备细胞癫痫模型, 进行癫痫方面的研究。
2.2 不同培养时间细胞形态学观察
种植后6～12h, 大部分细胞可贴壁, 呈圆形或椭圆形, 其中部分细胞开始伸出1～2个突起 (图1) , 24h后, 大部分细胞贴壁, 生长旺盛, 很多细胞伸出较长突起 (图2) 。培养2～3d后, 细胞突起增多伸长, 有双极或多极突起, 胞体发亮, 周边有光晕, 细胞多呈纺锤形 (图3) , 培养6～7d后, 神经细胞生长更加旺盛, 胞体增大, 呈锥体形, 突起增多伸长, 且分支很多, 粗大, 突起交织成网状, 形成神经细胞网络 (图4) 。10～14d神经细胞状态良好, 可见清晰的胞核及核仁, 适于膜片钳及生化实验 (图5) 。14d后, 细胞逐渐衰老。约20d后细胞开始退化变性, 胞内出现空泡, 光晕消失, 细胞变形。
3 讨论
海马神经元的原代培养, 其选材较为重要, 一般取孕鼠的胚胎, 因为只有胚胎发育过程中的神经细胞才能在体外继续生长分化, 也可取乳鼠的脑组织, 但必须使用出生日期不超过3d的乳鼠, 才能保证有较多的神经元能够存活[2]。为了使新生鼠中枢神经细胞培养成功, 在众多因素中, 我们体会较重要的是培养过程中应注意以下几个方面: ①取材要迅速, 整个取材过程均在冰上进行, 这样更好保持了细胞的活力。分离细胞时, 酶消化时间应控制好, 细胞吹打时动作一定要轻柔, 避免损伤神经元, 影响培养效果。 ②选用进口6孔培养板, 使用前一天, 在无菌条件下涂多聚赖氨酸, 用三蒸水冲洗三遍, 放入二氧化碳培养箱内待用。 ③ Neurobasal培养液中加入了B27添加剂, 由于B27添加剂中含30多种促进神经元生长和存活的微量元素, 其种类和数量都比血清中丰富, 改善神经元的生长状态以及延长存活时间[3]。 ④适量胶质细胞的存在是神经细胞培养的必要条件, 但如果胶质细胞过量生长时, 神经元的生长分化便受到一定影响, 常使神经元提早退化。因此需在胶质细胞增值的高峰时, 使用一定量的阿糖胞苷, 以抑制其过度生长。 ⑤细胞接种密度亦是影响培养效果的重要因素, 一般接种密度应维持在5×108～5×109/L, 否则会由于密度太低使神经元缺乏相互间的支持和营养而导致培养失败[4]。
摘要：目的:建立海马神经细胞原代培养技术。方法:取新生13d的Wistar大鼠, 开颅, 迅速分离出海马组织在Hanks中剪碎, 加入0.125%胰蛋白酶2mL消化, 胎牛血清终止消化, 细胞计数后种植于多聚赖氨酸包被的6孔培养板中。结果:神经细胞存活率高, 纯度达90%以上, 神经细胞生长良好。结论:用此方法能成功获取大鼠海马神经细胞。
关键词：海马神经细胞,原代培养,胰蛋白酶
参考文献
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细胞培养技术 篇11
关键词：细胞学 切片 行动导向课程 职业行动能力
基金项目：西安职业技术学院2014年基金项目?以商品花卉蝴蝶兰为起点的校企合作模式探索? （项目编号：2014YB05）
R329.1
在德国职业教育领域， 重视学生职业行动能力的培养是具有悠久历史的传统教育理念。德国马格德堡大学职业教育学与企业教育学研究所教授巴德教授认为：“在职业教育领域，职业行动能力是人类在职业情境中从事熟练而职业化的、个体深思熟虑的以及承担社会责任的行动的本领和状态，一方面它是个体在社会关系中的学习过程和发展过程的现实结果，另一方面也是个体能力继续开发的前提”[1]。也就是说， 职业行动能力属于课程开发操作层面上、 职业教育学的概念。德国职业行动能力的结构划分也独树一帜，在横向内容结构层面则包括专业能力、方法能力和社会能力[2]。
?植物生产与环境?课程讲述植物生长发育环境条件的调控知识与技术。“徒手切片制做及细胞结构观察”属于?植物生产与环境?的项目化教学模块之一。为提升本专业学生的职业行动能力，更好服务于职业需求，围绕“学习领域课程模式的目标——培养职业行动能力；学习领域课程内容的选择——行动领域；学习领域的课程实施——行动导向的教学范式”，设计了“徒手切片制做及细胞结构观察”的行动导向课堂教学模式。通过课外任务的开展，引入课堂项目，并以课外拓展加深学生对职业行动能力内涵的领悟。
1.课外任务
1.1 理论基础
细胞是植物体结构与功能的基本单位。细胞学说于1838年由德国植物学家Schleiden和动物学家Schwan提出，该学说指出，任何一个细胞都是从其他细胞中产生出来的；细胞是构成有机体的基本单位；植物和动物的细胞大致是相似的。细胞从结构上分为细胞壁、细胞膜、细胞质及细胞核。细胞器分布在细胞质基质中。细胞器主要包括：内质网、核糖体、高尔基体、溶酶体、线粒体、质体、微体、液泡、微管、微丝等。后含物是细胞原生质体代谢作用的产物，它们可以在细胞生活的不同时期产生和消失，其中有的是贮藏物，有的是废物。后含物主要包括淀粉、蛋白质、脂肪、丹宁、色素、晶体等。
植物细胞及后含物不仅是衡量植物生长发育状态的指标，也是联系食品、医药、纺织等行业的基础知识。项目“徒手切片制作及细胞结构观察”是在细胞学知识学习的基础上，为培养学生解决问题的专业能力、社会能力及方法能力而设计的行动导向课堂教学内容。
1.2课外任务
在基本理论知识掌握的基础上，为使学生对职业行动能力有初步概念，布置了课外任务“树叶黏贴画制作”，即以自然界五颜六色、千姿百态的树叶为原料，制作树叶黏贴画，看那组同学完成的最好。在这个过程中，重点关注：各组制作思路及方案（方法能力）、各组同学配合协作性（社会能力）、五颜六色的叶色形成的细胞学原因（专业能力），等（图1）。
“树叶黏贴画制作”任务完成后，教师对各小组的作品进行点评。可以发现，通过完成此课外任务，学生对贯穿于其中的专业能力、社会能力、方法能力有所领悟。
2.课内项目
2.1项目导入
俗语“磨刀不误砍柴工”、“授人以鱼不如授人以渔”的涵义？在学生思考讨论的基础上，正式引入职业行动能力的概念。职业行动能力所包含的专业能力不只是由与职业有关的知识和技能组成，迁移知识和将知识应用于新任务也属于此种能力。社会能力指合作、解决冲突、沟通以及互动能力。方法能力指能够将已学到的和使用过的技能和经验灵活地和创造性地应用到新的、至今还不熟悉的情景和行动领域中。行动导向课程的核心除了培养学生社会能力和方法能力之外，要培养学生在日后工作中必须具备的专业理论和实践能力（专业能力）。后者在解决复杂任务的过程中完成（图2）。
2.1 项目“徒手切片制作及细胞结构观察”实施
2.1.1资讯
此步骤中学生需独立了解项目概况以及项目开展所需知识基础，如植物细胞、细胞器、后含物，等，并通过查阅文献资料对项目实施过程，即取镜—切片—显微观察—生物绘图有所了解。掌握实施项目所需专业技术如显微镜使用保养方法、徒手切片制作、生物绘图等。对所需仪器材料如显微镜、载玻片、盖玻片、刀片、镊子、、洋葱、马铃薯、红辣椒、大葱、菠菜等有全面罗列。通过学生的这些学习活动可训练其独立行动能力。
2.1.2 计划
项目计划中的关键步骤如表1所示，此环节中以组为单位共同规划，以促进相互沟通，培养分析性思维。
2.1.3 决策
各小组派代表向全班同学讲解自己小组的项目实施方案，教师首先对各小组共性失误指正、纠错，再逐一讲解6个小组的个性失误。最后各小组修改项目实施方案，教师审核，方案定稿。此步骤旨在培养学生自主决策能力。
2.1.4实施
学生在实验室开始切片、观察及绘图（专业能力训练）。但计划没有变化快，项目实施过程中，会不断出现新问题，新状况，项目如何继续呢？此时，需要教师指出解决思路：学生需检查、反思项目实施过程中可能出现的问题及漏洞，并学习新的理论知识和操作技能，解决问题。
2.1.5 检查
项目实施过程中，常见问题及解决思路如下：
总之，兵来将挡，水来土掩。熟悉解决问题基本思路（方法能力训练）之后，徒手切片制作及细胞结构观察项目顺利完成。
2.1.6评价
评价体系由以下几部分构成（表2）。评价体系贯穿整个完整行动模型，并以方法能力的考核为重点。
3. 课后拓展
在课外任务“树叶黏贴画制作”及课内项目“徒手切片制作及细胞结构观察”完成的基础上，为巩固学生对职业行动能力所包含的方法能力、社会能力及专业能力的理解，并为下一个项目“植物组织、器官切片制作及结构观察”的实施做准备，公布本节相关知识的一些网络链接，布置课后预习任务，以拓展学生知识结构的内涵及外延。
德国职业教育界围绕如何培养职业行动能力提出了“行动导向” 教学原则，根据其理念，学习领域的课程模式，应建设成真正意义上的工作过程系统化、行动导向的课程模式[5]。学生通过与真实工作情境相联系的行动领域的学习，以最快的速度获取包括专业能力、方法能力和社会能力的职业能力。學习领域课程应是为职业行动能力的培养而设计的。我们在借鉴其理念的基础上，通过“徒手切片制作及细胞结构观察”项目的实施，尝试了行动导向的课堂教学模式，以期在植物细胞学知识学习及操作技能训练的基础上，培养学生走上工作岗位后解决问题的专业能力、方法能力及社会能力。
参考文献
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细胞培养技术 篇12
1 材料与方法
1.1 主要试剂及器材
RPMI1640培养基:购自GIBCO公司。胎牛血清:购自杭州四季青生物制品公司。葡萄糖酸钾 (K-Gluconate) , ConA, 兔抗人神经烯醇化酶抗体 (NSE) :购自美国SIGMA公司。DAB显色试剂盒购自美国V E C T O R公司。电极内液成分 (m m o l/L) :K-Glucose 140, EGTA3, MgCl2 2, HEPES 10。细胞外液成分 (mmol/L) :K-Glucose 10, NaCl 150, KCl 5, MgCl2 1, CaCl2 3, HEPES 10。细胞培养基:每100毫升RPMI1640培养基中分别加入10mL胎牛血清, 10mL ConA上清液, 1mLL-谷氨酰胺, 青霉素100U/mL, 链霉素100μg/mL。Axon 200A型膜片钳放大器, Axon 1200型D/A-A/D板, pClamp8.0实验程序:美国A x o n公司产品。P P-8 3微电极拉制仪:日本Narishige公司产品。
1.2 接膜法联合组织块法培养RCECs
健康成年重1.5～2.0kg的新西兰白兔由西安交通大学医学院动物中心提供, 耳缘静脉空气栓塞处死后立即取出完整的眼球。用庆大霉素生理盐水 (400U/mL) 反复冲洗后置入超净工作台。在体视解剖显微镜下, 于角膜缘内1mm环形剪取角膜片, 揭取内皮细胞层, 将其切割成1mm×2mm大小的组织块, 内皮面向下置于以0.1%明胶及胎牛血清预处理的无菌培养瓶中, 放入37℃, 5%CO2培养箱中待贴壁后, 加入培养液孵育。待细胞生长接近融合期时采用胰蛋白酶消化法进行传代。将二代细胞利用NSE免疫组化ABC法进行鉴定, 细胞浆中出现棕黄色颗粒为阳性表达。
1.3 膜电位的记录方法
于实验当日将外径1.4mm, 内径0.8mm的毛细玻璃管经过两次拉制而成直径1～2μm的微电极。分别取体外原代培养7d及传二代培养5d的RCECs, 消化后待其贴壁。采用Axon 200A型膜片钳放大器进行实验, 当1GΩ以上的封接电阻形成时, 负压吸破细胞膜, 形成全细胞记录状态。通过电流钳方式, 测定单个RCEC的静息膜电位。温度 (20±3) ℃。
2 实验结果
2.1 RCECs的鉴定
使用相差倒置显微镜观察:培养原代RCECs 72h后, 即可见RCECs自组织块边缘迁出, 呈细长的多角形, 随后逐渐呈现典型的CECs多角形形态, 鹅卵石样。培养到6～10d时细胞生长最旺盛, 形成单层片状, 可见细胞间汇合 (图1) 。传代后的RCECs24h贴壁, 呈多角形或类圆形。传代后第3～5天为细胞生长旺盛期, 形成典型的多角形外观。NSE是一种鉴定CECs的标志酶。RCECs经NSE染色后, 可见胞浆内粗大棕色颗粒, 细胞核不着色呈NSE阳性表达 (图2) 。综上, 本研究中培养的细胞为R C E C s。
2.2 RCECs膜电位测值
采用SPSS for Windows 11.5t检验 (P<0.05) 进行统计学分析:原代RCECs的平均膜电位水平为 (-20.9±1.7) mV (n=6) , 而传二代RCECs为 (-15.1±1.8) mV (n=6) , t=5.825, P<0.01, 2组间差异具有统计学意义。
3 讨论
CECs的膜电位是反映胞膜上离子传导性的纯粹数值。近几年对于膜电位的更为准确的测定多来自于膜片钳实验, 它是一种研究小到一个细胞的离子的实验技术。目前多数学者认为, 现有的培养条件下CECs无法通过不停传代达到扩增细胞数的目的, 若是用于实验目的最好用传二代细胞。本次研究中我们观察到在传三代之后, RCECs失去了其典型的形状特征, 且传代后RCECs的膜电位降低了, 可能是经过传代导致与CECs的离子流有关的某些成份发生了变化, 故原代CECs的生物学活性更接近在体细胞, 可能更适合某些实验的要求。
到目前为止, 许多学者检测了各种角膜内皮标本, 发现其膜电位呈现负值, 显示了细胞膜对于钾离子有较大的选择性, 本次研究结果也与此一致。研究发现阴离子激活的钾通道电流与温度敏感性钾通道电流被认为是CECs静息电位的主要来源[1]。A电流及内向整流的钾离子电流可能与CECs膜电位的调节和离子的跨膜转运有关[2,3]。我们的实验结果与Wigham[4]等的研究结果最接近, 但是到目前为止, 各个实验室的结果均有所不同[5,6]。考虑导致差异的原因可能有以下几点: (1) 文献中报道的所用角膜内皮细胞来自人、牛、鼠、兔等不同的种系; (2) 体外细胞培养体系的选择不一而足; (3) 各个实验室的温度条件不统一; (4) 实验对象的来源差异甚大:有单层角膜内皮, 有急性离散的细胞, 甚至体外培养的细胞; (5) 文献中所用的人CECs一般都是永生性细胞, 和正常细胞存在一定差异。另外, 细胞膜电位的影响因素是复杂的。胡维琨等[7]的研究证实:在培养牛CECs上存在容积调节性氯通道 (ClC-3) , 它在维持细胞体积动态平衡中发挥重要作用。而Alaminos等[8]的最新研究提出:CECs体积的变化会影响膜内外钾离子和氯离子的流动, 细胞汇合后建立细胞连接形成内皮屏障都可能对离子流造成影响。所以目前的检测结果可能都不是十分准确。这种结果究竟能多大程度上反映在体的情况, 还有待于进一步研究。
摘要：目的利用膜片钳技术测定体外培养的兔角膜内皮细胞 (RCECs) 的膜电位。方法运用接膜法联合组织块法获得原代及传代培养的RCECs, 利用免疫组织化学方法对其鉴定, 采用全细胞膜片钳方法, 测定培养RCECs的膜电位。结果原代RCECs的平均膜电位水平为 (-20.9±1.7) mV (n=6) , 而传二代细胞为 (-15.1±1.8) mV (n=6) 。2组间差异具有统计学意义。结论利用膜片钳技术成功记录到体外培养的RCECs膜电位且原代RCECs的平均膜电位水平高于传二代RCECs。
关键词：角膜内皮细胞,膜片钳,膜电位
参考文献
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