培养神经细胞

培养神经细胞（共12篇）

培养神经细胞 篇1

海马锥体神经元是海马区的主要成分, 主要功能是参与近期记忆、情绪及内脏功能调节, 是老年性痴呆、癫痫等疾病的主要病灶之一[1]。为了能在细胞水平和分子水平深入研究发育中海马神经细胞的生化、代谢、生理、药理及形态, 建立海马神经细胞原代分散培养技术, 越来越引起基础医学和临床医学的重视。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

实验动物:新生1～3d的Wistar大鼠, 由佳木斯大学实验动物中心提供。 主要试剂:Neuralbasal培养基、B27培养基添加剂、青链霉素 (Gibco公司产品) , 胰蛋白酶、胎牛血清、多聚赖氨酸 (Sigma公司产品) , 阿糖胞苷 (上海华联制药有限公司) 。

1.2 方法

1.2.1 培养板的处理

在取海马前一天, 用35mm孔径的6孔培养板, 每个孔中加入0.1g/L的聚L-赖氨酸2mL, 静止30min除去溶液, 用三蒸水冲洗3遍, 放入二氧化碳培养箱内过夜待用。

1.2.2 培养方法

取新生1～3d的Wistar大鼠, 用95%乙醇消毒, 开颅, 剥离脑膜, 迅速分离出海马组织在Hanks液中剪碎约1mm3, 然后离心500r/min, 5min, 去掉Hanks液, 加入0.125%胰蛋白酶2mL, 消化约20min (37℃、5%CO2条件下) , 中间轻轻振摇2～3次, 尽量去除胰酶, 加入10%胎牛血清终止消化, 离心500r/min, 5min, 去上清, 加入无血清培养基, 用火焰刨光的玻璃吸管轻轻吹打数次, 用200目的细胞筛过滤后, 取0.1mL按台盼蓝拒染法进行活细胞计数, 制成5×105/mL密度的细胞悬液, 种植于多聚赖氨酸包被的6孔培养板中, 每孔加2mL, 24h后全量换无血清培养基。第3天加入抗有丝分裂剂阿糖胞苷 (终浓度为5mg/L) 以抑制非神经细胞增殖, 24h后更换为无血清培养基, 此后每3天更换1次, 每次换1/2量, 倒置相差显微镜定期观察培养过程中细胞生长情况, 于第7天神经元突触联络成网状。

1.2.3 锥虫蓝实验观察细胞活性

用2%锥虫蓝置于长有细胞的盖玻片, 在2min内观察细胞数, 不着色的为活细胞, 呈蓝色为死细胞, 计算活细胞百分比。

1.2.4 神经细胞纯度的测定

第2天换液后在不同培养时间在倒置显微镜下 (高倍) 随机5个视野, 分别计数所有细胞和神经细胞, 计算神经元纯度。

1.2.5 培养细胞的形成学观察

种植的6～12h内用倒置相差显微镜观察神经细胞生长情况, 此后每天都要对神经细胞进行观察, 同时进行拍照。

2 结果

2.1 神经元的存活率

①锥虫蓝实验表明细胞的存活率较高, 本实验大于90%。②不同培养时间神经元纯度的测定结果见表1, 表中可见, 用含Neurobasal和B27无血清培养基及联合应用阿糖胞苷的这种培养方法, 获得的海马神经细胞纯度逐渐提高, 神经胶质细胞则逐渐死亡而减少, 在培养的7～9d, 神经细胞的纯度已达到了90%以上, 故在此期间可进行细胞实验研究, 如在此期间可制备细胞癫痫模型, 进行癫痫方面的研究。

2.2 不同培养时间细胞形态学观察

种植后6～12h, 大部分细胞可贴壁, 呈圆形或椭圆形, 其中部分细胞开始伸出1～2个突起 (图1) , 24h后, 大部分细胞贴壁, 生长旺盛, 很多细胞伸出较长突起 (图2) 。培养2～3d后, 细胞突起增多伸长, 有双极或多极突起, 胞体发亮, 周边有光晕, 细胞多呈纺锤形 (图3) , 培养6～7d后, 神经细胞生长更加旺盛, 胞体增大, 呈锥体形, 突起增多伸长, 且分支很多, 粗大, 突起交织成网状, 形成神经细胞网络 (图4) 。10～14d神经细胞状态良好, 可见清晰的胞核及核仁, 适于膜片钳及生化实验 (图5) 。14d后, 细胞逐渐衰老。约20d后细胞开始退化变性, 胞内出现空泡, 光晕消失, 细胞变形。

3 讨论

海马神经元的原代培养, 其选材较为重要, 一般取孕鼠的胚胎, 因为只有胚胎发育过程中的神经细胞才能在体外继续生长分化, 也可取乳鼠的脑组织, 但必须使用出生日期不超过3d的乳鼠, 才能保证有较多的神经元能够存活[2]。为了使新生鼠中枢神经细胞培养成功, 在众多因素中, 我们体会较重要的是培养过程中应注意以下几个方面: ①取材要迅速, 整个取材过程均在冰上进行, 这样更好保持了细胞的活力。分离细胞时, 酶消化时间应控制好, 细胞吹打时动作一定要轻柔, 避免损伤神经元, 影响培养效果。 ②选用进口6孔培养板, 使用前一天, 在无菌条件下涂多聚赖氨酸, 用三蒸水冲洗三遍, 放入二氧化碳培养箱内待用。 ③ Neurobasal培养液中加入了B27添加剂, 由于B27添加剂中含30多种促进神经元生长和存活的微量元素, 其种类和数量都比血清中丰富, 改善神经元的生长状态以及延长存活时间[3]。 ④适量胶质细胞的存在是神经细胞培养的必要条件, 但如果胶质细胞过量生长时, 神经元的生长分化便受到一定影响, 常使神经元提早退化。因此需在胶质细胞增值的高峰时, 使用一定量的阿糖胞苷, 以抑制其过度生长。 ⑤细胞接种密度亦是影响培养效果的重要因素, 一般接种密度应维持在5×108～5×109/L, 否则会由于密度太低使神经元缺乏相互间的支持和营养而导致培养失败[4]。

摘要：目的:建立海马神经细胞原代培养技术。方法:取新生13d的Wistar大鼠, 开颅, 迅速分离出海马组织在Hanks中剪碎, 加入0.125%胰蛋白酶2mL消化, 胎牛血清终止消化, 细胞计数后种植于多聚赖氨酸包被的6孔培养板中。结果:神经细胞存活率高, 纯度达90%以上, 神经细胞生长良好。结论:用此方法能成功获取大鼠海马神经细胞。

关键词：海马神经细胞,原代培养,胰蛋白酶

参考文献

[1]曾可斌, 胡长林, 陈阳美.大鼠海马神经元培养与鉴定[J].基础医学与临床, 2002, 24 (5) :574-577

[2]孙怡, 田玉科, 王鹏.大鼠海马神经元的体外原代培养[J].中华麻醉学杂志, 2004, 24 (5) :396-397

[3]任铁玲, 胡前胜, 傅洪军, 等.大鼠海马神经元无血清原代培养技术的建立[J].中国卫生检验杂志, 2004, 14 (2) :539-542

[4]杜怡峰, 张晨.新生大鼠海马神经细胞原代培养方法的改良[J].青岛大学医学院学报, 2002, 38 (1) :55-56

培养神经细胞 篇2

摘要：随着生命科学时代的带来，基因研究已经取得了巨大的进展，克隆技术特别是人的克隆技术作为基因研究的重要组成部分，引起了社会各界的广泛关注。克隆包含动物、植物等方面，动物克隆在畜牧业生产、医药生产、疾病治疗、生物学基础理论研究、以及动物转基因工程等诸多领域蕴藏着巨大的应用潜力。通过科学研究者的努力，哺乳动物的克隆技术在农业和生物制药等方面取得了进步，展示了克隆技术的应用价值和发展前景。

关键词：动物克隆技术

1、克隆技术含义: “克隆”，即无性细胞繁殖系，又称为一个细胞株或细胞系，细胞株与细胞系没有本质的区别。也可以理解为复制，拷贝，就是从原型中产生出同样的复制品，它的外表及遗传基因与原型完全相同，但大多行为思想不同。无性繁殖的手段有很多种，包括孤雌生殖，胚胎切割和细胞核移植等等。而产生克隆动物的方法则称为动物克隆技术。

在《中国大百科全书·生物学者》中，对“克隆”的解释是：克隆又称无性繁殖细胞系和无性繁殖系，是一个细胞或个体以无性繁殖重复分裂或繁殖所产生的一群细胞或一群个体，在不发生突变的情况下，具有完全相同的遗传结构。克隆技术同整个生物界的进程一样，是由低级到高级，有简单的复杂不断发展和进步的。它由单个细胞获得2个以上细胞、生物体，发展到生物体内的生物大分子的自我复制，在DNA复制酶的作用下，复制生成俩个一模一样的DNA分子。

2、动物克隆的进程：

1938年，国外就有人提出提出成年动物的细胞核入卵子法克隆哺乳动物的设想。

1978年，我国著名科学家童第周成功地进行看了克隆黑斑蛙的实验，他将黑斑蛙的红细胞核移入到事先去除了核的黑斑蛙卵中，这种换核卵发育成了黑斑蛙的蝌蚪。

1996年，用成年哺乳动物体细胞克隆出的哺乳动物个体克隆羊多莉出世，开创了体细胞繁殖哺乳动物的成功先例。

2003年，克隆马出世，是世界上首例哺乳动物生下自己的克隆体。

2003年8月，中国科学家在世界上首次采用克隆技术培育出含人免DNA混合物胚胎。

2003年9月，沃斯宣布他已克隆出了含人，牛DNA的混合胚胎。

2008年1月7日，2头具有绿色荧光遗传特征的小猪在哈尔滨诞生。

3、动物克隆技术的应用：

动物克隆近几年取得的一些突破性进展，为动物发育过程中基因表达的调控及发育生物学，遗产学等相关学科的发展必将产生深远的影响。虽然目前这种方法尚不成熟，但它已显示出诱人的应用前景。

动物克隆技术将首先应用于医药领域。利用体细胞供体经核移植生产转基因动物，可望降低生产成本。到目前为止，产生转基因动物的方法仍主要是1985年Hammer等建立的原核显微注射法。但是，这种方法只能使大约5%的动物携带外源基因外源基因整合动物基因组是个随机的过程，这导致外源基因在许多转基因动物系中的表达量不够高，而且因整合进生殖细胞的几率低难以遗传给下一代。Schnieke等发现，利用体细胞克隆技术生产含人凝血因子IX的转基因羊比原核显微注射法要有效得多。其中，两者最显著的差异是体细胞克隆的中的受体母羊全都携带外源基因，而原核显微注射法会产生许多不带外源基因的羊羔。这是由于，原核微注射法中所用胚胎在体外培养的时间较短，在此期间被检测为阳性的转基因可能会在以后的发育过程中丢失。用作核移植供体的细胞在体外培养的时间则较长，有较多的检测机会。另外，显微注射法制备的转基因动物的性别只有等到动物出世后才能得知，而核移植可以通过鉴别核供体的核型而预先得知转基因动物的性别，可选择性的制备雌性的转基因动物，有利于在母乳中表达外源基因。

克隆技术除了可以生产各种医用人体蛋白外，对人类的细胞和组织治疗也大有好处。利用克隆技术，可以用患者本人细胞培养出新组织，用来治疗糖尿病、帕金森氏病、神经损伤等多种疾病。用这种方法培养出的组织具有与患者正常组织完全相同的基因构成，因此不会产生免疫排斥反应。但是这些都涉及到克隆人这个敏感话题，目前克隆人在许多国家是法律禁止的。随着人类胚胎干细胞培养技术的完善。目前已有两家美国公司开始研究利用克隆技术培育人胚胎，希望大批量生产治疗疾病的干细胞。事实上，几年前人们就曾把人胎儿神经组织用来治疗帕金森氏症。考虑到伦理上的原因，人们也可以用克隆动物的胚胎干细胞作异源移植，以解决人类移植器官供求矛盾。

动物克隆技术还有助于加速动物育种的进程。利用优良动物品种的体细胞作核供体克隆动物，可以避免自然条件下选种所受到的动物生育周期和生育效率的限制，从而大大缩短了育种年限，提高育种效率。动物克隆技术用于拯救濒危动物也受到广泛的关注。中国科学院动物研究所陈大元研究员提出用动物克隆技术拯救大熊猫的计划，在国内外均引起一定的反响。

4、动物克隆技术的不足及未来发展方向

动物克隆技术然取得了一定的进展，在生物医药领域也得到了初步的应用。但是，该技术目前还很不完善。存活率低是当今核移植技术的最大缺陷。它突出表现为：孕期流产率高，围产期死亡率高，新生儿体重较重及产生后对环境的适应性较差。以成体细胞核作核供体问题更为严重。最近，Shiels等报道克隆羊的端粒较同年羊短。Renard等报道，体细胞核移植可能影响克隆动物免疫系统的正常发育。他们用胚胎细胞克隆牛的耳细胞通过核移植克隆出一头牛。牛犊看起来很健康，但出生一个半月后，它体内的淋巴细胞和红血球急剧减少，不久就死于贫血。尸体解剖发现，该牛犊脾脏、胸腺和淋巴结等淋巴组织都没有得到正常发育。

导致动物克隆存活率低和异常发育的原因很多，缺乏基础理论支持是其中之一。动物克隆技术的不断完善，还需要分子遗传学、细胞学、发育生物学等相关基础学科的进一步研究和发展。迄今为止，人们虽然在动物克隆过程中已经积累不少数据，但一些很基本的问题任亟需解决。

动物克隆技术条件的优化还没有解决。如核供体和卵细胞的选材、核质比的选择、重组胚胎的激活方式、是否需要做连续核移植等。

综上所述，动物克隆研究已在理论基础、技术优化及实际应用等方面取得很大的进步。但该技术目前还很不完善，相关理论研究还很薄弱，人们要提高动物克隆的成功率还需不懈的努力。另外克隆动物与正常胚胎的发育有何异同，也值得深入研究。这些问题的解决将有助于人们对动物胚胎发育过程中分子机制的认识。

5、结束语

要紧跟世界科技发展的潮流，充分利用克隆技术为人类带来巨大的利益，又要严格控制可能造成混乱的克隆人出现。

参考文献：

《生命伦理学》、《生命的化学》 学院：呼和浩特职业学院

专业：生物技术及应用 年级：12级

单细胞藻类培养方法的改进 篇3

1常用种类

贝类育苗中常用种类较多，有小球藻、塔胞藻、扁藻、金藻（等鞭金藻和叉变金藻）、硅藻（新月菱形藻）；海参育苗中常用种类有盐藻、角毛藻和新月菱形藻。以上几种藻类对温度、盐度、光照有着不同的适宜范围，在不同的育苗期可以提供相应的大量饵料。

2培养方法

主要有一级培养、二级培养、三级培养。在大规模生产中，饵料室条件好的，一级种源较多的可以省略二级培养，由一级培养直接到三级培养，下面就一级培养和三级培养分别做如下介绍。

2.1一级培养

2.1.1容器工具主要有三角烧瓶（5 000 mL），根据生产规模决定需要多少，还有1 000 mL三角烧瓶2个，配制营养液用，还有10 mL移液管，水桶、脱脂棉、毛巾、漏斗、棉手套等。

2.1.2消毒海水和工具都采用加热消毒法，分别要烧开1～2 min，待凉后再用。

2.1.3扩种当藻种达到生长高峰期时是扩种的最佳时期，以前老方法是一瓶扩出一瓶，一次性按比例添加营养盐，（1 000 mL加1 mL）这样大概7 d一个周期，现在采用新方法，一瓶扩成三瓶加水到3 000 mL，加营养液，3～4 d藻液达到指数生长期，再加水倒5 000 mL同时加营养液，3 d后藻液浓度达到高峰期，这样同样一周的时间可以多培养一瓶藻液。营养液要用kv方，营养全面，藻液生长速度最快。

2.2三级培养

2.2.1培育池池深最好不要超过1 m，一般80～90 cm为最佳，5～10 m2为一个培养池。

2.2.2消毒水泥池要用1:1 HCl刷洗，后用清水冲洗干净。海水、工具要在接种前一天用含有效氯100 mg/L的漂白液充气消毒，充匀后可停气，消毒时间要在12 h以上，接种当天要用100 mg/L硫代硫酸钠中和，充气搅匀检查无余氯后可使用。

2.2.3施肥首先是营养盐的配置，硝酸钠60 mg/L；磷酸二氢钾4 mg/L；柠檬酸铁铵0.45 mg/L；硅藻类还可添加硅酸钠4.5 mg/L；小球藻类可添加尿素4 mg/L；营养盐根据需要按海水比例配置，可提前用烧开消毒的海水配置好，根据需要添加。

2.2.4接种海水经消毒处理，营养盐配好后可进行接种，首先在温度上要和藻液温度接近，温差最好<3℃。其次选种在质量上，选择生活力强、生长旺盛、颜色正、无沉淀、无吸附现象，无敌害生物污染的；在数量上，藻种必须达到一定的浓度，要加大起始接种量，使一开始培养藻类就在培养中占优势，对敌害生物也起到抑制作用，又能缩短培养周期。接种比例一般为1∶5。

2.2.5管理每天搅拌4次，上午8:00、11:00下午14:00、17:00，每次1 min，每次操作都要做好消毒处理，严格消毒避免污染。每天要做好镜检和定量工作，及时处理饵料是否有污染和生长密度的各种变化。以便及早做出处理决定。（提前决定啥时扩种，有污染的不能继续扩种等日常管理）

3小结

培养神经细胞 篇4

1 材料与方法

1.1 乳腺组织的获取

用无菌外科手术的方法取处于妊娠后期或泌乳期的健康初产荷斯坦奶牛乳腺组织5～10 g,置于DMEM/F12完全培养液[含青霉素300 IU/mL、链霉素300 μg/mL、两性霉素2.5 μg/mL、庆大霉素50 μg/mL、20%胎牛血清(FBS)]中,迅速带回实验室。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM/F12(12400-016),Invitrogen公司生产;胎牛血清(南美洲,SV30087.02),Hyclone公司生产;胰蛋白酶(1∶250,0458),Amresco公司生产;细胞角蛋白-18(MS-142-P0)、波形蛋白(MS-129-P0),Neomarker公司生产;兔/鼠通用S-P免疫组化试剂盒(KIT9710)、DAB(0031),福州迈新生物技术开发有限公司生产;抗体稀释液(C-0007),北京博奥森生物技术有限公司生产;DMSO(D-5879),Sigma公司生产;青霉素钠、硫酸链霉素,华北制药股份有限公司生产;丙酮等其他试剂均为国产分析纯。

CO2培养箱(型号为HEPA class 100),Thermo公司制造;倒置相差显微镜(型号为IX71),Olympus公司制造;普通光学显微镜(型号为YS100),Nikon公司制造;离心机(型号为3-30K),Sigma公司制造;生物安全柜(型号为AC2-4S1),ESCO公司制造。

1.3 奶牛乳腺组织细胞的原代培养

用组织块贴壁法培养原代细胞,具体方法如下:将带回实验室的乳腺组织用37 ℃预热的灭菌生理盐水洗涤数次,清除血迹、乳汁及其他杂质;用无菌小剪镊分离腺泡于盛有灭菌生理盐水的小烧杯中,反复冲洗至冲洗液清亮后,将腺泡转移至生物安全柜中盛有灭菌PBS(含有青霉素200 IU/mL、链霉素200 μg /mL,pH值为7.4)的小烧杯中;将腺泡组织置于75%乙醇中浸泡约1 min后,用双抗PBS洗涤3次,每次3 min;然后将其转入青霉素小瓶中剪至约1 mm3大小的小块,备用。用牙科探针挑取组织块,将其轻轻铺于细胞培养瓶底壁上,植块间距0.5 cm,尽量使组织块黏附于瓶壁后沿对侧瓶壁加入DMEM/F12培养液(含青霉素200 IU/mL、链霉素200 μg/mL、15%FBS),旋上瓶盖,翻转培养瓶,使有组织块的一面向上,置于37 ℃、含5% CO2的饱和湿度培养箱中翻转培养2 h,使组织块微干涸;然后轻轻将培养瓶翻转过来,使培养液浸没组织块,根据培养液的颜色变化及细胞的生长情况每3～4 d更换一次培养液;待大多数组织块周围游出较多细胞时,用牙科探针轻轻掀掉组织块,并将组织块转瓶,使其继续贴壁培养,原瓶换液使细胞长满至汇合。

1.4 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的纯化培养

每日观察细胞的生长情况并记录,待细胞生长至汇合后,根据成纤维细胞和上皮细胞对胰蛋白酶的耐受时间与贴壁速度的差异,结合使用差时胰酶消化与差时贴壁2种方法分别纯化出奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞,具体方法如下:弃去培养液,用D-hank’s液冲洗3次后,加入0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA于37 ℃消化3～5 min;至成纤维细胞变圆、细胞间距增大、有少量细胞团块漂起后,加入培养液(含青霉素100 IU/mL、链霉素100 μg/mL、10%FBS)终止消化,反复轻轻吹打成纤维细胞区域,吸取消化液转入新的细胞培养瓶中,置于培养箱培养1 h;待大多数成纤维细胞贴壁后,轻轻去除上清液,加入新的培养液继续培养至细胞长满并汇合,得到以成纤维细胞为主的细胞;去除成纤维细胞后,用D-hank’s液再冲洗3次,然后加0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA于37 ℃消化4～5 min;至上皮细胞回缩变圆、细胞间距增大乃至细胞成片(团)脱落时加入含10%FBS的DMEM/F12培养液终止消化,反复轻轻吹打,按细胞密度加入培养液,置于培养箱中约1 h;取培养上清液转到新的细胞瓶中继续培养至细胞长满、汇合,得到以上皮细胞为主的细胞。如此反复进行纯化以得到较纯净的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞。

1.5 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的形态学观察与鉴定

1.5.1 倒置相差显微镜观察

每天定时观察细胞的形态和生长情况,拍照并作记录。根据每天对细胞生长情况的观察,掌握奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的生长特性和细胞形态的差异。

1.5.2 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的鉴定

将处理过的小盖玻片置于12孔细胞培养板的底壁,加少量培养液使其粘在培养孔底壁,分别将纯化的乳腺上皮细胞和成纤维细胞接种于含盖玻片的孔中,培养5 d后,用无血清培养基处理24 h并进行鉴定。

姬姆萨染色:将细胞爬片取出,PBS洗3次,每次3 min;冷冰酮固定20 min;用PBS洗3次,每次3 min;姬姆萨染液染色50 min;用灭菌水反复冲洗,置37 ℃温箱干燥6 h以上;二甲苯透明,中性树胶封片,镜检,观察细胞的形态并拍照。

免疫组化鉴定:每组细胞爬片分成3份,分别作为细胞角蛋白、波形蛋白和阴性对照,具体步骤为将细胞爬片取出,PBS浸洗3次,每次3 min;冷丙酮固定20 min,PBS浸洗3次,每次3 min,并将爬片放入湿盒中;加0.5%TritonX-100(用PBS配制)室温作用20 min;用PBS冲洗3次,每次3 min;滴加内源性过氧化酶阻断液(S-P试剂盒A液),避光作用10 min;用PBS液冲洗3次,每次3 min;滴加动物非免疫血清(羊) (S-P试剂盒B液),37 ℃孵育20 min;轻轻甩掉血清,勿冲洗;分别滴加鼠抗人细胞角蛋白-18单克隆抗体和鼠抗人波形蛋白单克隆抗体,均用抗体稀释液按1∶100倍稀释,阴性对照加PBS,37 ℃孵育2 h;PBS液冲洗3次,每次3 min;滴加生物素标记羊抗鼠/兔IgG(S-P试剂盒C液),37 ℃孵育20 min;PBS液冲洗3次, 每次3 min;滴加链霉素抗生物蛋白-过氧化酶(S-P试剂盒D液),37 ℃孵育20 min;用PBS液冲洗3次,每次3 min;滴加DAB作用5～10 min (现配现用),显微镜下观察并控制显色,用纯化水漂洗终止显色;苏木精复染5 min,在 0.25%盐酸乙醇溶液中浸提一下,自来水返蓝15 min;用纯化水浸洗,37 ℃温箱干燥6 h以上,二甲苯透明,中性树胶封片,镜检并拍照。

1.5.3 细胞生长曲线的绘制

分别将乳腺上皮细胞和成纤维细胞按每孔2×105个接种于24孔板中,每组3孔,共分为14组。分别于接种后每天同一时间计数细胞平均数,每孔计2次,直至细胞的生长达到平台期。以培养时间为横坐标、细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.6 细胞的冻存与复苏

1.6.1 细胞的冻存

用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA将细胞消化下来,1 000 r/min离心5 min;收集细胞,加入1 mL新鲜培养液重悬细胞,用台盼蓝染色,用血细胞计数板计数后,加含20%FBS的DMEM/F12培养液调整细胞数至5×106～10×106个/mL,并按10%的比例缓慢加入DMSO,混匀后分装于2 mL冻存管中,每管1 mL,4 ℃放置15 min;-20 ℃放置20 min;-80 ℃过夜,然后沉入液氮罐中长期保存。

1.6.2 细胞的复苏

从液氮罐中取出冻存管,立即投入37 ℃水浴中晃动,使其在1 min内完全融化。加入5 mL培养液悬浮细胞,1 000 r/min离心5 min;收集细胞,根据细胞密度加入生长培养液重悬细胞,将其接种于细胞培养瓶中,置37 ℃、含5% CO2的饱和湿度培养箱中培养。

2 结果

2.1 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的培养纯化及形态观察结果

2.1.1 组织块的培养结果(见169页彩图1)

培养1～2 d后细胞贴壁,3～5 d后开始游出,以成纤维样细胞和上皮细胞为主,并且这2种细胞并不混杂生长,存在着明显的界限(见169页彩图1a,b)。其中成纤维样细胞先从组织块周围向外游出,其形态多为长梭形,排列疏松,呈旋涡状或放射状生长(见169页彩图1a,b);而后上皮样细胞从组织块周围游出,多为单层多角形,排列紧密,细胞核呈圆形或椭圆形,核仁清晰可见,多呈鹅卵石样或铺路石样聚集生长(见169页彩图1a,b)。

2.1.2 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的纯化及形态学观察结果

经差时胰酶消化和差时贴壁2种方法对奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞分别进行纯化,上皮细胞多成团生长,未纯化完全时成纤维细胞常包裹于上皮细胞的外围生长(见169页彩图1c)。细胞经3～5次纯化后即可分别得到较为纯净的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞。纯化的上皮细胞大多为多角形,细胞排列紧密,细胞核呈圆形或椭圆形,有时可出现双核或多核现象,核仁清晰可见,以3～5个居多,多呈单层铺路石样或鹅卵石样成团聚集生长(见169页彩图1d)。传代的上皮细胞贴壁后,多成团聚集生长形成岛屿状,并且成团的多角形上皮细胞聚集生长时增殖快,而单个散在圆形贴壁细胞很难继续增殖。随着培养时间的延长,一些上皮细胞的胞浆出现大小不一的空泡和泡状结构(见169页彩图1e),这是上皮细胞分泌产生的大小不等的乳滴。上皮细胞传到第5～6代时生长仍很旺盛,随着细胞密度的增加,多形成类似腔的结构,在腔的周围细胞密集包绕生长,更换培养液后继续培养,一些生长迅速的新生细胞可向腔内生长,并出现拉丝样支架将两侧细胞连接起来(见169页彩图1f),细胞沿着支架继续增殖可达到融合,形成类似圆顶样结构,随传代次数的增多和培养时间的加长这种结构会逐渐增多。此外,在一些区域,上皮细胞还可形成腺泡样结构(见169页彩图1g)。上皮细胞传至第7～8代,其形态基本一致,只不过有些细胞体积较大,呈圆饼样,增殖速度慢;有的细胞体积较小,呈鹅卵石样,增殖迅速,随着培养时间的加长,细胞间的界限愈加明显;随着细胞密度的增加,细胞受到挤压,一些细胞呈短梭形。而当细胞传到第8～9代以后形态变得非常不均一(见169页彩图1h),出现长形、梭形和三角形等多种形态共存,而典型的上皮细胞越来越少。纯化的奶牛乳腺成纤维细胞单层生长,呈典型的放射状或旋涡状排列(见169页彩图1i),且随着传代次数的增多,成纤维细胞的形态和生长特性基本不发生改变。

2.2 细胞的鉴定结果

2.2.1 姬姆萨染色法鉴定细胞的形态(见169页彩图2)

乳腺上皮细胞为深蓝染,胞核呈圆形或椭圆形,核仁清晰可见,多为3～5个,并且胞浆内常可见大小不一的白色空泡(见169页彩图2a),这是上皮细胞分泌的乳滴。成纤维细胞多呈长梭形,胞核蓝染,为椭圆形,位于细胞中央,一般可见核仁呈旋涡状或放射状排列生长(见169页彩图2b)。

2.2.2 免疫组织化学法鉴定细胞的纯度

镜检可见细胞胞浆内有特异性棕黄色或棕褐色颗粒沉着者判为阳性。结果(见170页彩图3)显示,乳腺上皮细胞角蛋白-18反应呈阳性,波形蛋白反应呈阴性(见170页彩图3a,b);乳腺成纤维细胞角蛋白-18反应呈阴性,波形蛋白反应呈阳性(见170页彩图3c,d);阴性对照均为阴性(见170页彩图3e,f)。经纯化后,2种细胞的纯度均可达到95%以上。乳腺上皮细胞传至第8～9代以后,细胞的形态开始发生变化,出现长形、梭形、三角形等多种细胞共存,而直至细胞传至第14代时,细胞角蛋白-18反应仍呈阳性(见170页彩图3g),阴性对照为阴性(见170页彩图3h)。

2.3 细胞的生长曲线(见图4)

奶牛乳腺上皮的生长曲线(见图4a)和成纤维细胞的生长曲线(见图4b)均呈较典型的“S”型,其中成纤维细胞较上皮细胞潜伏期短,增殖快。

2.4 细胞的冻存与复苏

代次较低的奶牛乳腺上皮(3～6代)细胞经冻存复苏后生长状态良好,传1～2代后细胞的形态和生长特性均未发生改变,而代次较高(7～8代)的细胞冻存复苏后形态正常,但传代后细胞形态就发生了改变。复苏后的成纤维细胞生长状态良好,形态和生长特性均未发生明显改变。

3 讨论

3.1 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的培养与纯化

目前,有关奶牛乳腺上皮细胞培养的研究已有很多,培养方法主要有组织块培养法、机械破碎法和酶消化方法。也有人从乳汁中分离出奶牛乳腺上皮细胞[6,7],有待于进一步验证。机械破碎法和酶消化法极易丢失和损伤细胞,最终造成细胞不能正常生长和增殖[8,9],其中以组织块培养法最能保持乳腺上皮细胞二倍体特性,不破坏细胞的活性。本试验根据奶牛乳腺上皮细胞较成纤维细胞贴壁和生长慢、贴壁牢、不易被消化下来的特性,应用组织块贴壁转瓶培养,采用差时胰酶消化法和差速贴壁法结合的方法,用较少的组织即分别培养及纯化出奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞。

目前,关于奶牛乳腺细胞体外培养的研究主要集中在上皮细胞上,而关于成纤维细胞的报道并不多见,不过后者培养和纯化都相对较容易。研究发现,奶牛乳腺上皮细胞纯化的难易程度跟乳腺组织的取材也有很大的关系,在腺泡发育好的妊娠期和泌乳期取材所获取的细胞活性好,生长快,细胞中上皮细胞占的比例较大[10,11],此时纯化出上皮细胞就相对较容易,所以把握取材时机非常关键。另外,去除脂肪和结缔组织,分离乳腺腺泡进行培养也很关键[10,12]。

3.2 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的形态学观察

试验培养得到的奶牛乳腺上皮细胞的形态特征与王亨等[10]、彭新荣等[11]及E.Matitashvili等[13]的报道基本一致,奶牛乳腺成纤维细胞的形态特征与吴娟等[14]报道的结果一致。乳腺上皮细胞是构成乳腺腺泡的主要成分,具有分泌乳汁的功能。本研究中,在体外培养奶牛乳腺上皮细胞时,胞浆内出现大小不一的空泡和泡状结构即为上皮细胞分泌的乳滴,与崔立莉[7]报道的结果一致;与彭新荣等[11]报道的结果不一致,其认为胞浆内出现的小颗粒和泡状结构可能为变形的线粒体及溶酶体。上皮细胞还可形成乳腺腺泡管样结构,与王治国等[15]和E.Matitashvili等[13]的试验结果一致。不过,王治国等[15]的试验中添加了一些激素和生长因子,E.Matitashvili等[13]的试验中添加了ECM,而本试验中未添加。而上述现象在成纤维细胞中均没有,可见在体外培养条件下,奶牛乳腺上皮细胞仍保留着其原有的一些功能和特性。

体外培养的乳腺上皮细胞传代后的大小和形态并不完全一致,经纯化传代后,细胞多成团、聚集成岛屿状,其中体积较小的呈鹅卵石样,聚集成长的细胞增殖较快,而体积较大的呈圆饼形,细胞的增殖则较慢,这2种细胞可能为乳腺上皮细胞不同发育时期的细胞。前者可能为较幼稚的细胞,分裂增殖较快;而后者为接近终末分化的细胞,故增殖较慢。与王亨等[10]的试验结果相一致。另外,乳腺上皮细胞成团时增殖较快,而单个细胞很难贴壁并增殖[10,11];因此细胞的接种密度对于细胞的生长非常重要。随着上皮细胞生长密度的增加,可形成许多类似腔的结构,细胞继续增殖达融合后,可形成类似圆顶样结构,与丁月云等[16]的试验结果相一致,而8～9代以后部分细胞渐渐分化,细胞形态变得不均一,出现长形、梭形和三角形的细胞,与彭新荣等[11]的试验结果相一致。

3.3 细胞鉴定

奶牛乳腺腺泡上皮细胞中的骨架蛋白以角蛋白-7,8,18为主,而肌上皮细胞以角蛋白-5和14为主[16],故角蛋白-18可用于奶牛乳腺腺泡上皮细胞的鉴定。波形蛋白是间质细胞特异性表达的一种中间纤维蛋白,是间质细胞和成纤维细胞的标志蛋白之一[17],可用于成纤维细胞的鉴定。综合应用这2种蛋白不仅可以鉴定细胞的类型,而且可以鉴定细胞的纯度。本试验结果表明:奶牛乳腺上皮细胞对角蛋白-18反应阳性,与E.Matitashvili等[13]的研究结果一致;对波形蛋白反应阴性,与J.L.Anaya-Lopez等[18]的研究结果一致。而成纤维细胞与上皮细胞的结果相反,对角蛋白-18反应阴性,对波形蛋白反应阳性,表明结果成立。经鉴定,上皮细胞传至14代后,对细胞角蛋白-18的反应仍为阳性,表明虽然细胞的形态发生了变化,但所得的细胞仍为上皮细胞。

3.4 细胞的冻存与复苏

由于原代奶牛乳腺上皮细胞具有二倍体的特性,属于有限细胞系,随着传代次数的增多,细胞的形态和生长特性会逐渐发生改变,导致其失去二倍体细胞的特性甚至发生细胞转化;因此,在纯化后对其及早进行冻存非常重要[5]。与上皮细胞不同,奶牛乳腺成纤维细胞的形态和生长特性受传代和冻存的影响相对较小,但仍应在其生长旺盛、传代次数较少时将其冻存,以防影响细胞的特性。

试验采取妊娠后期或泌乳期荷斯坦奶牛乳腺组织分离腺泡,培养后应用组织块贴壁转瓶培养,采用差时胰酶消化和差速贴壁结合的方法,用较少的组织即分别培养并纯化出了乳腺上皮细胞和成纤维细胞,所得细胞形态良好,生长曲线呈较典型的“S”型,符合细胞生长的一般生物学规律,经鉴定细胞的纯度可达95%以上。目前,国内外的许多研究者认为乳腺上皮细胞的贴壁依赖于基质,生长依赖于激素和生长因子的添加,而本试验中未使用基质和激素也成功培养出了生长良好并具有泌乳功能的乳腺上皮细胞,避免了胶原和激素所造成的影响,为相关的后续研究奠定了良好的基础。

a.细胞从组织块中游出并在组织块周围生长(100×);b.上皮细胞与成纤维细胞不混杂生长,之间存在明显的界限,上皮细胞排列紧密形成细胞单层,而成纤维细胞排列疏松(100×);c.成纤维细胞包裹未纯化完全的上皮细胞(100×);d.纯化的上皮细胞呈鹅卵石样或铺路石样生长(100×);e.上皮细胞胞浆内有大小不一的空泡和泡状结构(100×);f.细胞向腔内生长,并出现拉丝样支架将两侧细胞连接起来,细胞沿着支架继续增殖可达到融合(200×);g.上皮细胞形成腺泡样结构(100×);h.上皮细胞的形态发生改变(100×);i.纯化的成纤维细胞呈旋涡状或放射状生长(100×)。

a.中央处上皮细胞深蓝染,细胞核为圆形或椭圆形,核仁清晰可见,胞浆内还可见许多大小不一的白色空泡;b.成纤维细胞为长梭形,呈旋涡状或放射状排列生长。

《动物细胞培养》教学反思 篇5

动物细胞培养教学反思

杨建波

赛课已经结束，但我的表现并不好。首先，引入新课不够精彩，没有激发学生的求知欲。我觉得应该以演员SELINA演习时皮肤大面积烧伤,治疗通常是取健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，如何来治疗该病人作为问题引起同学们讨论，引出这节课的主要内容——动物细胞培养。在此之前学生已经学过了植物组织培养，因此我先回顾植物组织培养的原理并提出了一个问题：动物细胞培养能否像植物组织培养那样最终培养成新个体？引导同学们思考两者之间的异同。在讲述培养过程时，学生阅读课本自主总结和借助课件展示过程，帮助学生理解培养的过程及把握注意事项。本堂课上完后，我发现了自己有不少缺点和不足，需要在以后的教学中加以改正：1．没有充分发挥学生的主体地位。新课程的理念是要转变教师和学生的角色，让学生成为课堂的主导者，而本节课仍然以传统的教学模式为主，仍然是教师为主体。在实际教学过程中，主观的想引导学生探究问题，思考问题，得出结论，而事实上学生回答问题答不到点子上，我就匆匆的把答案公布了，没有真正做好引导工作。2．没有充分调动学生的积极性。课堂教学的气氛对整堂课的教学质量是至关重要的，纵观整节课，学生对问题的思考、回答等积极性不高。3．时间安排不够紧凑。导致最后讲动物细胞培养技术的应用时时间紧，讲得比较匆忙。当然本节课的成功之处是采用了多媒体教学，使课堂的知识容量比较大，对前面学过的内容可以比较快的复习，真正做到温故而知新。

培养神经细胞 篇6

[关键词] 视网膜 微血管 内皮细胞 细胞培养

许多视网膜疾病如糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等均与视网膜血管病理性改变密切相关。随着对视网膜血管性疾病的研究深入发现视网膜血管内皮细胞是血管病变过程中的关键细胞。通过体外分离培养视网膜血管内皮细胞获得大量完整、纯度高的内皮细胞，从而对其进行形态、结构、生理功能和病理变化等方面的观察，为视网膜血管性疾病研究提供体外模型。本实验综合国内外几种方法，以人视网膜为材料，探索简便、有效的人视网膜微血管内皮细胞的培养方法。现报告如下：

1 材料与方法

1.1 材料

0.1%Ⅱ型胶原酶（Sigma公司，美国）、胎牛血清(Gibco公司，美国) 、DMEM培养液(Gibco公司，美国)、含0.02%EDTA的0.25%胰酶(Gibco公司，美国)、纤维连接蛋白（Sigma公司，美国）、内皮细胞生长因子ECGF(Sigma公司，美国) 、Percoll分离液（Gibco公司，美国）、肝素（Sigma公司，美国）、PBS（Sigma公司，美国）、培养瓶、培养皿、眼科器械、匀浆器、吸管、离心管、细胞筛、第Ⅷ因子相关抗原抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，完全培养液：DMEM培养液+15%FBS+90ug/ml肝素+0.1ug/L的ECGF，培养瓶：培养前1天用10ug/cm2纤维连接蛋白包被。

1.2 方法

1.2.1 人视网膜微血管内皮细胞的分离与原代培养

原代细胞培养使用的眼球为角膜移植后残留的供体眼球。无菌操作，浸入酒精中消毒2遍，转入DMEM培养液中。距角膜缘后3mm穿刺，剪去眼前节，娩出玻璃体，吸取DMEM培养液将视网膜神经层吹起吸出，将视网膜置于DMEM培养液中洗涤2-3次，去除色素组织并夹出较大的血管，再将视网膜转入另一培养皿中剪碎后匀浆，将匀浆液过两层细胞标准筛（先过220um，后过86um），将第2层细胞筛翻转后用DMEM培养液充分冲洗，收集洗脱液后离心（1000r/min，10min），弃上清后加入3倍体积的0.1%胶原酶吹打均匀后移入离心管中在37℃200r/min摇床上消化60min，离心（1000r/min，10min），弃上清，用DMEM培养液悬浮细胞，将Percoll分离液加入DMEM培养液中，以20000r/min离心30min制备连续密度梯度，吸取上述细胞悬液2ml小心加入25ml离心管顶层分离介质面上，离心（1000r/min，10min），用注射器针头吸取所需的细胞层(第2层)，以添加ECGF的完全培养液悬浮细胞，接种于包被有10ug/cm2纤维连接蛋白的培养瓶内，将培养瓶置于5%CO2、37℃培养箱内培养细胞。24 h内严禁移动培养瓶。培养2d后首次换液，以后每2d换液1次，保持ECGF的浓度。换液前相差倒置显微镜下观察视网膜血管内皮细胞，标记杂细胞位置，用细胞刮去除杂细胞。

1.2.2 人视网膜微血管内皮细胞的传代培养

当原代细胞融合80％以上后，开始传代培养。吸去培养液，用PBS清洗1～2次；加入0.25%胰蛋白酶与0.02 EDTA混合消化液，室温下消化，在相差显微镜下观察，当铺路石样细胞开始变圆收缩，细胞间隙变大时，倒出消化液；以含15%FBS的完全培养液终止消化，反复吹打瓶壁上细胞，脱壁后形成细胞悬液，按1：2的比例进行传代，接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶中。传代后每2～3 d换液1次。

1.2.3 人视网膜微血管内皮细胞的鉴定

(1)形态学：在相差倒置显微镜下观察视网膜血管内皮细胞形态特征、生长特性及与微血管碎片的距离，并运用目镜网格器计数法观察记录培养瓶中混杂的其他细胞，每瓶选择3个视野，实验各重复3次。(2)Ⅷ因子相关抗原免疫组化检查：以0.5×105/L的细胞密度接种2mL细胞悬液接种于预先置有20mm×20mm盖玻片的六孔板中，并置于37℃的培养箱中培养24h至细胞爬满玻片后取出，PBS漂洗细胞2次，以4%多聚甲醛固定20min；PBS冲洗3次，免疫细胞化学染色二步法检测Ⅷ因子相关抗原。阴性对照：一抗用PBS代替。显微镜下观察、采集图像。

2 结果

2.1 视网膜血管内皮细胞形态学特点

经过分离纯化后接种于培养瓶的视网膜血管内皮中混杂有许多杂细胞，如红细胞、胶质细胞、周细胞等。24h后可见有血管内皮细胞贴壁，呈扁平梭形；5-7d细胞分裂、克隆样生长，形成细胞集落，呈类圆形、多边形形状；12d左右细胞融合呈铺路石样，单层生长，铺满瓶底，可见接触抑制现象。

2.2 视网膜血管内皮细胞免疫组织化学鉴定

视网膜血管内皮细胞经第Ⅷ因子相关抗原抗体染色，即胞浆中有棕色着色，98%以上细胞呈阳性染色。阴性对照组无着色。

3 讨论

视网膜血管内皮细胞的分离和培养在认识视网膜血管性疾病的病理生理等过程中发挥了重要作用。视网膜微血管内皮的培养由于取材困难，培养的细胞不易纯化，一直是视网膜细胞培养中的难点。

3.1 视网膜微血管内皮细胞的分离

取材过程中，要采用新鲜的人眼，并保证操作过程绝对无菌，尽量去除视网膜上的视网膜色素上皮细胞，并夹除可见的大血管。视网膜微血管段的分离和内皮细胞的获取、纯化作为视网膜血管内皮细胞培养中的关键步骤，对微血管段的分离程度要求较高，因此我们采用剪碎匀浆分离法获得视网膜微血管段。在匀浆器的选择上，注意玻璃杵与管壁应有一定的间隙，匀浆物与匀浆液的比例控制在1：1左右，研磨次数不宜太多，以免微血管段过度破碎。将组织分离后得到的匀浆液进行过滤和离心。用220um及86um的细胞筛可分别筛去未分离的血管段组织和一些较大的细胞以及血细胞等比血管内皮细胞小的细胞及一些碎片，得到较为纯净的微血管段。我们采用0.1g/L胶原酶在37℃200r/min摇床上消化60min，能够将视网膜间质消化获得单细胞悬液并保持较好的细胞活性。

3.2 视网膜微血管内皮细胞的贴壁和纯化

我们使用纤维连接蛋白包被的培养瓶能够有效地促进内皮细胞贴壁，同时抑制其他混杂细胞贴壁生长[1]。在培养液的选择上，我们配制了添加有15g/LFBS、90ug/ml肝素、0.1ug/L ECGF的内皮细胞培养基，形成只利于内皮细胞生长的选择性培养环境，使内皮细胞进一步得到纯化[2]。周细胞与内皮细胞的分离是纯化技术的难点，我们采用密度梯度离心和物理刮除等方法去除周细胞。Percol1分离液是一种外面被聚乙酰胺吡咯烷酮包被的硅胶颗粒，它无毒、无刺激性，对细胞无吸附作用，产生的渗透压很小，因此在全部密度范围保持等张。Percoll在离心过程中会自然形成密度梯度，内皮细胞和周细胞因其密度不同而在分离液中处于不同的层面。从而将提高内皮细胞纯度[3]。原代培养3-5d后，一些混杂的细胞常常分区成片的生长，可以利用内皮细胞呈独特的铺路石样形态单层生长，而周细胞呈长梭状的可重叠生长，在培养瓶底部标记后用细胞刮匙刮除杂细胞，从而获得较纯的内皮细胞[4]。此外，在传代过程中，采用含0.02%EDTA的0.25%胰酶可使周细胞较内皮细胞更先松动，利用该特点可以除去部分周细胞。

综上所述，我们认为使用纤维连接蛋白包被培养瓶及添加肝素和内皮细胞生长因子的培养基，并结合物理刮除、密度梯度离心法等可以成功获得高纯度的视网膜血管内皮细胞，为体外研究视网膜血管相关疾病奠定了基础。

参考文献

[1] Schor AM,Schor SL.The isolation and colture of endothelial cells and pericytes from the bovine retinal microvasculature: a comparative study with large vessel vascular cells. Microvase Res,1986,32(1):21-38.

[2] Lin C,Mctough R,Aswad B,et al.Hypoxin induces HIF-1,alpha and VEGF expression in chondrosarcoma cells and chondrocytes[J]. J Orthop Res, 2004, 22(4): 1175-1181.

[3] ZhouB,Oka JA,SinghA,et a1.Purificationand subunit characterization of the rat liver endocytic hyaluronan receptor[J]. J Biol Chem,1999,26,274(48): 33831- 33834．

培养神经细胞 篇7

1 三维细胞培养支架制备

三维细胞培养的关键在于三维细胞培养支架制备 (3D cell culture scaffold, 3DCCS) (图2) , 其研究内容将涉及微加工制造、生物偶联、表面化学修饰、软光刻制作、高分子合成、细胞生物学等多个领域。目前可用于制备3D-CCS的材料主要有聚苯乙烯 (PS) 、聚己内酯 (PCL) 、聚酰胺 (PA) 、聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 、硅片、玻璃、胶原蛋白或水凝胶等[16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27]。而相应的制备方法有:运用相分离法合成的多孔高分子支架;利用电放纤维技术人工合成的纳米纤维支架;尤其是运用精密微加工技术制备具有均一微结构的支架, 其确保多孔结构的可重复性以及可调控性, 并且可以和微流控技术相集成, 开发新型的微流控三维细胞培养芯片。目前商业化的3DCCS主要有英国Reinnervate公司的alvetex三维支架 (http://www.reinnervate.com) , 其被Scientist网站评为2010年的全球生物技术的十大革新之一, 名列第6位 (http://www the-scientist.com/2010/12/1/47/1/) 。另外, 还有美国3D Biotek公司的3D InsertTM三维支架 (http://www.3dbiotekstore.com/) 和国内的瑞康健生物医学有限公司等。

注:上列:左图来自文献[10], 中间图来自文献[11], 右图来自文献[12];下列:左图来自文献[13], 中间图来自文献[14], 右图来自文献[15]。

笔者利用微乳模板法人工合成了PS三维细胞培养支架。SEM图片 (图3) 显示40μm孔径分布在整个支架的内部, 且相互中通。这些材料正在应用于杂交鹅掌楸细胞的胚胎发育中。

2 基于微流控芯片的细胞培养系统

植物细胞培养是通过一个能模拟生物体内环境的体外空间, 配置以无菌、适当温度、酸碱度和一定营养条件的细胞离体培养体系, 使之生长、发育, 实现植株再生、繁殖或进行特定目标的科学研究的细胞水平的现代试验技术体系。现阶段, 人们多采用瓶、皿或微孔板培养方式, 但这种传统的器皿培养技术, 不仅操作繁琐, 而且试剂耗量大、占用空间多、微环境较难调控。更为重要的是, 相对于细胞的微小尺寸, 这种培养环境与体内环境相差较远, 客观上难以真实反映细胞生命过程的生理、遗传等分子和细胞生物学特征。

微流控芯片技术的出现恰恰为解决这一难题提供了契机。微流控芯片技术是据于微电子的微细加工技术和微机电加工系统 (MEMS) 原理而发展起来的, 现代生物技术、微细精确仪器分析和高分子材料等领域的学科交叉点。它不同于人们熟悉的一次性的生物芯片 (Biochip) 及其技术, 微流控芯片技术通过对微通道中的流体的控制, 把一个分子生物学分析实验室的采样制备、溶液配制、试剂和试验样品进样、反应、分离和检测等功能, 集成到邮票或信用卡大小的芯片上的“芯片实验室”。该申请项目涉及到的植物细胞培养微流控芯片与其他微流控芯片一样, 具有不同操作单元之间在技术上组合灵活、整体可控和规模集成等特点。在用于细胞研究的过程中主要体现在以下几点:一是芯片通道尺寸 (通常10~100μm) 与种子植物细胞直径大小 (10~200μm) 相适应, 有利于单细胞操纵、分析;二是芯片的多维网格结构形成相对封闭的环境, 与植物生命体的正常生理状态下的细胞空间特征接近;三是芯片通道微尺度下传热、传质较快, 可以提供有利于细胞研究环境和进行培养微环境的调控;四是芯片可以满足高通量细胞分析的需要, 可同时获取大量的生物学信息;五是芯片上多种单元技术的灵活组合使集成化的细胞研究成为可能, 诸如细胞进样、培养、分选、遗传操作和分离检测等过程均可在一块芯片上完成。微型化、集成化和自动化的细胞培养系统, 将极大地简化操作步骤, 减少细胞或试剂耗量, 降低成本, 并可方便地与其他单元操作耦联, 有可能使常规细胞培养技术产生根本性变革。

目前基于微流控芯片的细胞培养系统, 多采用灌流式培养方法:将细胞悬液注入微通道或微培养室, 待细胞贴壁后, 将培养液连续灌入培养区域, 实现营养物质的连续更新。芯片材料多采用聚二甲基硅氧烷 (PDMS) , 该类材料具有良好的生物相容性, 对气体有一定的通透性, 有利于细胞培养过程中O2和CO2气体的交换。另外, 由于其透明, 也利于激光共聚焦显微镜等进行动态观察。并且通过软光刻技术, 可以制造复杂的微纳三维结构, 其已被广泛应用于微流控细胞培养芯片的制作。虽然以细胞为对象的微流控芯片研究起步较晚, 但近几年引起了各国科学家的广泛重视。日本东京大学的Teruo Fujii课题组研制的微流控芯片细胞培养系统, 可实现肝癌HepG2细胞株连续10 d培养;在此基础上构筑的多层PDMS芯片组成的堆栈式细胞培养装置, 可实现细胞大规模的培养[28,29]。美国伯克利大学的Luke P Lee课题组通过模拟体内环境设计了一种高通量微流控细胞培养芯片, 这种芯片可以减轻剪切力对细胞的培养[30]。国内大连化物所的林炳承课题组利用通透性水凝胶材料的微加工技术, 研制了一系列具有不同功能的二维或三维结构, 并用于细胞培养。以上这些报道的芯片设计仍然停留在对多个细胞的培养, 无法实现高通量的单细胞培养。在已有的报道主要是拘于动物和人类医学方面应用的研究, 有关植物的研究报道甚少, 在木本植物上的应用尚未见报道。与动物细胞不同, 对于植物细胞而言, 在细胞膜外还具有1层厚厚的细胞壁结构, 植物细胞在人工培养条件下, 会大量合成次生代谢物, 对培养物的微环境干扰大。由于植物细胞生物学结构特点以及在人工培养条件下容易结团、对于剪切力极敏感等固有特点, 使得研制适合于植物, 尤其是木本植物的单细胞培养芯片就显得很为重要。美国麻省理工学院的Joel Voldman曾连续报道了坝式结构和网孔状的微流控芯片可以迅速、高通量的捕获单个植物细胞 (图4) [15,31]。美国伯克利大学的Luke P Lee课题组和美国华盛顿大学的Albert Folch课题组也进行了类似的研究[32,33]。但结果表明, 他们的坝式结构的芯片无法消除培养过程中的流体剪切力对植物细胞的影响, 而网孔状结构的芯片无法实现后续的细胞原位培养。瑞士苏黎世联邦高工的Textor M课题组利用微孔状的PDMS芯片系统研究了细胞的三维培养情况[10]。韩国大学的Lee S H课题组研究了Nicotiana tabacum原生质体在PDMS微流控芯片中的培养情况, 国内的西北农林大学王进义课题组研究了tobacco mesophyⅡ原生质体在PDMS微流控芯片中的培养和细胞融合情况[11,34]。其研究结果显示:相对于传统的培养方式, 原生质体的生长、分化速度都得以提高, 这说明PDMS微环境对于原生质体培养有着有利影响。

注:左图来自文献[15], 中间图来自文献[32], 右图来自文献[33]。

笔者加工了多种不同形状微单元的PDMS芯片。并在真空下, 利用酶液 (纤维素酶、果胶酶) 溶解拟南芥叶片2 h后, 再过筛, 得到直径30μm的原生质体样品。滴加PDMS芯片表面上, 通过原生质体自然沉降, 实现对其捕获。经过大量的沉降参数优化, 发现在真空条件, 亲水处理后的圆形微孔状 (直径40μm) 、间隔40μm阵列分布的PDMS芯片可以有效地捕获原生质体 (图5) 。

3 三维细胞培养技术在植物细胞研究中应用的前景展望

目前该技术主要应用在哺乳动物细胞培养研究中, 涉及到植物细胞培养中的研究报道甚少。但是植物细胞和动物细胞有许多相通之处, 例如:原生质体 (去壁后的植物细胞) 与哺乳动物细胞有很多的相似之处, 例如可以摄入细胞器、微粒体、病毒以及DNA等大分子物质, 这就为将三维细胞培养技术引入到原生质体培养中提供了可能性。尽管也有一些类似的研究已开展, 但现在大多还处于理论探索阶段, 与农、林等生产实践相结台的应用研究也尚处于起步阶段。综合分析认为, 这种多学科的交叉融合和互相渗透无疑将成为今后研究植物细胞培养技术发展趋势。以后研究将主要集中在以下几方面。

(1) 适合植物细胞的单细胞芯片的研发。这种细胞芯片具备以下3个特点:一是可以简单、迅速、大范围的捕获单个细胞;二是可消除流体剪切力对植物细胞生长的影响, 以获得真实的生物学信息;三是便于原位培养, 同时也便于进行原位、长时间动态的跟踪观察和进行精确的高通量分析。

培养神经细胞 篇8

1 种子细胞

1.1 椎间盘细胞:

正常人类的髓核组织, 在儿童时期存在脊索细胞和髓核细胞两种细胞, 但随着年龄的增长脊索细胞持续减少, 大约超过10岁后绝大部分被髓核细胞所取代[4,5,6,7]。大部分关于脊索细胞的研究多见于动物实验中, 而对人类椎间盘髓核组织的研究而言, 髓核细胞的研究明显较脊索细胞更具有实际意义。许多需要行手术切除髓核组织的患者, 以成年人多见。但人类髓核细胞体外增殖的能力弱, 同时体外培养条件较为严格。而成人椎间盘组织内含有的髓核细胞数量少, 且容易老化。人髓核细胞来源亦成为, 现有学者以先天性脊柱侧弯患者所行的矫形手术中获得切除的椎间盘髓核组织为研究来源, 但先天性脊柱侧弯疾病发病率相对其他病种低, 病源有限。亦有学者通过对椎间盘突出患者所行的椎间盘髓核摘除术中获得髓核组织, 但此类患者的椎间盘已发生退行性变, 患者年龄往往偏大, 所获得的髓核细胞增殖能力及合成蛋白的功能不能肯定, 将此作为种子细胞应用于组织工程学研究或临床治疗可能并不恰当。笔者临床工作中发现许多人颈椎骨折患者需要行前路手术摘除髓核组织, 而摘除后的髓核组织, 最终被手术人员丢弃, 通过对人颈椎骨折患者术中摘除的髓核组织研究发现其可以培养出髓核细胞, 而此类患者具有年龄较小, 患病人数高且稳定, 取材简便的特点。因此现阶段开展髓核细胞相关研究, 应结合当地特点, 选择适宜髓核细胞的来源。髓核细胞一直缺乏统一的鉴定标准。现阶段对髓核细胞的研究多采用Ⅱ型胶原蛋白免疫组化方法结合细胞形态学特点进行鉴定。鉴于流式细胞技术在细胞实验研究的广泛, 有学者探索使用荧光抗体结合细胞表面标志物来鉴定细胞。但目前研究发现, 髓核细胞缺乏高度表达且特异性高细胞表面标志物, 使得流式细胞技术鉴定髓核细胞仍处于实验阶段, 而髓核细胞新的鉴定技术本身就是正在处于研究的课题。

1.2 干细胞:

干细胞具有分化为临近组织内其他细胞的能力, 这可能是受损组织能进行自我修复的原因。这就为老化受损的椎间盘提供了一种新的修复可能, 也为稀缺的髓核细胞提供了新的扩增方法。但最为原始干细胞的胚胎干细胞, 尽管理论上分化潜能最强, 但受伦理学及相关法律文件限制, 只能在动物实验范围内进行, 所取得的成果一般无法同样在人细胞相关领域应用。选择伦理学争议较少的干细胞进行研究, 用于椎间盘髓核细胞组织工程学相关研究是需要开展的研究领域。现阶段间充质干细胞常见于文献报道, 但间充质干细胞种类繁多, 需要大量实验开展以选则合适的干细胞用于髓核细胞相关研究。现阶段对骨髓、脂肪以及脐带等易获组织来源进行提取, 不仅是间充质干细胞易于培养, 其分化诱导能力已经逐渐被研究人员所证实。而最近人脐带血间充质干细胞因其较其他细胞分类上更为原始, 而因其科研工作者的重视。而现在此细胞的培养技术已较为成熟。从现有文献来看, 脐带血源性间充质干细胞可以被分化为内、外及中胚层的部分细胞[8]。而人髓核细胞系从内胚层分化而来。诸如脂肪细胞、神经细胞及干细胞可以由此种干细胞诱导出来。而肝脏细胞属于内胚层分化细胞, 若能存在被诱导分化为肝细胞的间充质干细胞, 将更有可能被诱导分化为椎间盘细胞。与华通胶类的组织相比, 脐带血作为血液可能更容易提取细胞。一般组织类物质需要酶消化法或组织块法进行提取, 此方法一般耗时较多。而血液源性细胞的提取, 则依靠密度差异进行离心获得, 可以省去大量操作时间。据现有文献报道, 大部分间充质干细胞用于髓核研究的多是利用骨髓或脂肪为来源。而更为原始, 分化能力可能更强, 具有向内胚层细胞分化能力的脐带血间充质干细胞则未见文献报道与诱导髓核细胞的相关研究。在品种繁多的各种间充质干细胞中, 筛选出最为适宜作为髓核细胞共培养是目前有待探索的项目。如果以治疗椎间盘退行性变为目的, 则不仅需要此类干细胞具有增加髓核细胞数量作用, 还应该具备维持细胞蛋白合成和表达的能力。现阶段通过基因扩增技术, 蛋白印记技术均可以更为准确检测出蛋白合成的变化。而细胞共培养技术又能为细胞分化、增殖和改善蛋白合成及分泌提供途径。已有研究发现骨髓造血干细胞分泌信号因子, 可以作用于共培养体系中的髓核细胞, 从而产生使髓核细胞增殖并提高蛋白表达的作用。由此可见, 细胞共培养技术是可以用于椎间盘组织工程学研究的, 它可以为细胞信号因子及细胞间接触性传代的物质提供适宜场所, 延缓髓核细胞的老化。可见, 如果能获得大量关于间充质干细胞与髓核细胞共培养的结论性信息, 应该可以为椎间盘退行性变的临床治疗提供更多特殊手段, 比如是否可以通过细胞移植的方法延缓组织老化过程等, 这些由都需要大量实验来完成对它的了解。赵晨成[9]研究发现骨髓间充质干细胞具有着向椎间盘细胞分化的能力, 而且其与髓核细胞的作用可能是相互促进的。一些间充质干细胞分泌的细胞调节因子可能作用于髓核细胞内, 使得胶原蛋白表达得以增强。这就提示我们, 即便是一些干细胞不能被诱导分化为椎间盘细胞, 也存在着临床应用治疗退变的潜在价值。而不单局限于仅靠培养出的髓核或类髓核细胞的移植来修复老化的椎间盘。现有文献可见被诱导为髓核细胞的干细胞[10,11,12]。但研究并为扩大至全部可以培养的间充质干细胞, 于海微[13]对比多种间充质干细胞发现在诱导分化能力上可能人脐带血间充质干细胞较强, 故而笔者推荐有其他间充质干细胞培养经验的科研团队, 尝试使用脐带血间充质干细胞进入髓核细胞领域的研究。只用通过更多种类的干细胞共培养才能明确适宜椎间盘修复的相关研究。另外, 除分化至内胚层源性细胞外, 脐带血间充质干细胞还有很多生物学特性与髓核细胞相类似。比如其原代贴壁时长等较慢等。凡间充质干细胞均可采用同样的流式细胞仪技术, 对其细胞膜表面的特异分子进行鉴定。故而有骨髓间充质干细胞培养经验的实验室可以更为容易地进行此类细胞的培养及鉴定。而髓核细胞与干细胞共培养, 应当扩大干细胞种类的范围, 以寻找适合椎间盘组织工程学种子细胞。

2 共培养的方式

细胞共培养是细胞生物学研究的重要方法, 通过将两种不同种类的细胞放置在同一个容器中进行培养, 通过直接或间接接触, 从而促使细胞产生特定的作用。但两种细胞以不同的比例共培养后, 结果可能有所不同。若干细胞数量较少, 可能难以分泌促进髓核细胞增殖或合成蛋白的细胞因子等物质。如果髓核细胞数量较少, 则可能不能诱导干细胞定向地往类髓核细胞方向分化。所以共培养时不同细胞所需添加的不同比例, 也是在细胞共培养时需要研究的问题。谢小波通过实验研究发现, 髓核细胞与骨髓间充质干细胞进行细胞共培养时, 当髓核细胞和骨髓间充质干细胞比例为1∶3~2∶l时, 髓核样细胞增殖能力会随髓核细胞相对数量增加而降低, 而这一比例继续增加时, 髓核样细胞增殖能力无明显提高或降低。尽管大多文献支持间充质干细胞略多于髓核细胞时, 能促进髓核细胞的增殖。但对于初次进行细胞共培养的学者来说, 常规可以选择1∶1比例培养进行尝试。

可采用不同细胞直接混合的接触式共培养, 也可采用细胞表面相互分隔的非接触式共培养实现不同细胞相互诱导作用的研究。接触式共培养是按不同比例混合细胞进行培养, 不同种类细胞可以直接接触, 通过细胞分泌的细胞因子或直接接触相互作用。通过接触式共培养, 不同种类的细胞可以获得更大的接触面积, 诱导作用可能更为显著。由于接触式共培养, 细胞间物质传递距离较短, 诱导作用的发生也可能较早。而非接触共培养则将细胞种植于通过具有微小空隙的共培养容器或材料中, 使不同种类的细胞隔开。不同细胞旁分泌出的细胞信号因子释放入共培养中共用的培养液, 但不同种类的细胞彼此不直接接触。细胞因子再通过穿梭于容器或材料中的微小的空隙, 作用于共培养容器或材料中的不同种类的细胞。现阶段研究表明, 接触式共培养更利于髓核细胞对间充质干细胞发挥诱导分化的作用[14], 由于接触式共培养体系下, 髓核细胞与间充质干细胞可以充分接触, 诱导机制可以通过旁分泌细胞信号因子和直接细胞膜接触等多种方式进行。但非接触共培养由于有微孔材料的分隔开, 对实验结果的后期处理较接触式共培养容易。非接触共培养用的Transwell培养板的培养孔内由聚碳酸酯膜分隔成两层, 孔径大小一般可在微米水平范围内选择。因此可以将不同种类的细胞分别种植于Transwell培养板的不同隔层进行共培养。由于细胞没有直接混合在一起, 需要单独分析间充质干细胞或者髓核细胞时, Transwell培养板可以通过酶消化获得。亦有学者使用藻酸钠微球来实现细胞共培养。藻酸钠微球通过藻酸盐溶液与氯化钙混合形成, 共培养结束后, 可以通过柠檬酸钠溶液溶解微球获得微球内的细胞[15]。而若共培养方式采用直接接触式, 则需要预先对某一种细胞进行特异性的荧光标记, 以便在共培养结束后通过流式细胞仪的筛选, 恢复原先细胞所在的种类。由于细胞对不同材料亲和力, 选择何种材料利于种子细胞生长亦成为组织工程学研究的方向之一, 李长青通过对髓核细胞在不同支架上培养研究, 证实由壳聚糖联合藻酸盐凝胶所制作的支架利于髓核细胞的培养[16]。

3 生长因子

最近研究发现, 在细胞因子的诱导下, 细胞的生长速度、分化方向等都可能发生改变。在脂肪间充质干细胞与髓核细胞细胞用Transwell培养板共培养时, 转化生长因子β1/胰岛素样生长因子1具有促进脂肪间充质干细胞分化为髓核细胞的趋势[17]。满孝旭认为肝细胞生长因子对髓核细胞是否也有促进增殖作用, 且能在联合应用胰岛素样生长因子1下促进增殖作用增强[18]。在已知能促进细胞增殖以及具有增加细胞蛋白表达的各种细胞信号因子中, 筛选出能有效作用于髓核细胞促进其增殖, 或者增加其诱导干细胞向类髓核细胞分化上的作用是必要的。

4 小结

髓核细胞与干细胞共培养是椎间盘组织工程学研究的重要途径, 科研范围较为广阔。随着国内外研究的进展, 髓核细胞与干细胞共培养技术将为椎间盘组织工程学提供更多的思路和方法, 远期也将推动椎间盘退行性变的新的治疗技术的进步。

摘要：讨论开展髓核细胞与干细胞共培养相关研究现状进展。通过对种子细胞、共培养方式、生长因子等方面国内外研究进展进行讨论。通过椎间盘组织细胞与干细胞共培养增加细胞数量或诱导干细胞分化为髓核细胞可能是一种增加椎间盘细胞较为适当的方法。通过细胞共培养技术可能分泌延缓退行性变在组织细胞中发生发展提供新的途径, 也是目前研究的热点。基础研究及临床应用有着广阔科研前景。

培养神经细胞 篇9

关键词：诱导分化,人羊膜上皮细胞,腺泡细胞

放射性口干症是头颈癌放疗的常见并发症,可导致唾液腺分泌功能的减弱或丧失,引起口干、继发龋、长期慢性黏膜炎症、吞咽困难以及营养不良等症状[1]。本课题采用双室共培养系统,将人羊膜上皮细胞(human amniotic epithelial cells,hAECs)与SD大鼠下颌下腺腺泡细胞(submandibular gland acinar cells, SMGCs)进行体外共培养,研究hAECs的诱导分化,为唾液腺功能障碍性疾病的干细胞治疗寻找细胞来源。

1 材料和方法

1.1 材料

无菌采集经产妇本人知情同意的健康足月剖宫产胎盘; 8 d龄SD大鼠;DMEM/F12培养基、LG- DMEM培养基、胎牛血清(FBS)(Gibco,美国),表皮生长因子(EGF),Transwell (Corning Inc, cat NO.3450),小鼠抗大鼠角蛋白单克隆抗体(keratin19 Ab- 1) (NeoMarkers),小鼠抗人CK19单克隆抗体(Gene Tech,China),小鼠抗人淀粉酶单克隆抗体(Amylase- G10)(Santa Cruz,USA),两步法抗小鼠或兔通用型免疫组化试剂盒(Dako Cytomation),Total RNA提取试剂盒、SYBR Primescipt RT- PCR Kit(宝生物工程有限公司)。

1.2 SD大鼠下颌下腺细胞的分离、培养[2,3,4]、鉴定

取8 d龄SD大鼠原代培养SMGCs,常规传代、鉴定。取第2代生长状态良好的SMGCs用于下一步共培养实验。

1.3 人羊膜上皮细胞的分离、培养[5,6]、鉴定

机械法剥离胎盘上的羊膜组织,清除表面的血迹,0.05%的胰蛋白酶-0.02% EDTA- 2Na 37 ℃消化3 次,每次30 min。加血清终止胰酶反应,合并3 次收集的细胞悬液筛网(200 目)过滤后低速离心,弃上清,收获细胞沉淀即为hAECs。上述分离的hAECs加入培养基(LG- DMEM, 10% FBS, 2 mmol/L L- 谷氨酰胺,10 ng/ml EGF,100 U/ml青霉素,0.1 mg/ml链霉素),按5×105/cm2的细胞密度接种,置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养,及时传代。免疫荧光法检测后取第2代状态良好的hAECs用于下一步共培养实验。

1.4 人羊膜上皮细胞与大鼠下颌下腺细胞的共培养

选用微孔膜孔径为0.4 μm的6 孔Transwell培养板(图 1),每板4 孔为实验组,其余2 孔为对照组。首先将第2代的hAECs以2×104 /孔接种于Transwell下层,贴壁24 h 后,将SMGCs以8×104 /孔接种于Transwell上层的生物膜上,共培养采用腺细胞专用培养基(DMEM/F12, 10% FBS,2 mmol/L- 谷氨酰胺,10 ng/ml EGF, 100 U/ml青霉素,0.1 mg/ml链霉素)。对照组上下2 层均为hAECs。上下2 种细胞间不能接触,但共用培养基,分泌的细胞因子可相互影响。37 ℃、 5%CO2、 饱和湿度条件下培养,每隔3 d换液1 次。

1.5 共培养系统的评价

1.5.1 共培养前后的形态学观察

共培养开始后,于倒置显微镜下观察细胞的形态变化。

1.5.2 免疫细胞化学检测

分别于共培养后1、2周,按照试剂盒说明书进行各组细胞的抗淀粉酶免疫细胞化学检测。

1.5.3 实时荧光定量RT-

PCR检测 按试剂盒说明书提取共培养1、2 周的人羊膜上皮细胞总RNA。按逆转录试剂盒说明书合成cDNA。α- 淀粉酶引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司设计合成,上游引物:5'- CATAAGGATGAGCAAGCATAAATC- 3',下游引物:5'- TCGCAAGTGGAATGGAGAG- 3', 扩增产物大小203 bp;内参GAPDH的引物序列由TaKaRa生物公司设计合成,上游引物:5'- GCACCGTCAAGGCTGAGAAC- 3', 下游引物:5'- TGGTGAAGACGCCAGTGG- 3',扩增产物大小138bp。反应体系如下:SYBR Premix Ex Taq TM (2×)10 μl,上游引物F (10 μmol/L) 1 μl,下游引物R (10 μmol/L) 1 μl,cDNA 2 μl,ddH2O 6 μl。反应条件为: 95 ℃ 10 s预变性,然后95 ℃ 5 s, 60.2 ℃ 20 s重复40 个循环, 55 ℃ 10 s 84 个循环。反应结束仪器自动生成CT值及熔解曲线图。每个样本设4 个重复管。将PCR 产物作熔解曲线分析,并进行1%琼脂糖凝胶电泳,确定产物特异性。

1.6 统计学处理

使用SPSS 13.0 软件,采用单因素方差分析,数据用undefined表示,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 SD大鼠下颌下腺细胞的鉴定

2.1.1 SD大鼠下颌下腺细胞形态学特征

原代培养第5天可见组织块周围有典型的上皮细胞游出,第8天细胞较多,显微镜下观察呈圆形或椭圆形,鹅卵石样排列(图 2A)。

2.1.2 SD大鼠下颌下腺细胞免疫学表型

免疫细胞化学结果显示,第2代SD大鼠SMGCs表达CK19(图 2B)、α- 淀粉酶(图 2C),不表达波形蛋白。

2.2 人羊膜上皮细胞的鉴定

2.2.1 人羊膜上皮细胞形态学特征

hAECs原代培养48 h后,有少量细胞贴壁,第3天以后贴壁细胞数量迅速增多,形态多为卵圆形和三角形,传代培养的hAECs形态变化不大,呈铺路石样排列(图 3A)。

2.2.2 人羊膜上皮细胞免疫学表型

免疫荧光染色结果显示,第2代的hAECs表达CK19(图 3B),不表达波形蛋白(图 3C),对照组结果阴性。

2.3 共培养系统的评价

2.3.1 共培养后的人羊膜上皮细胞形态学特征

共培养后显微镜下观察显示hAECs胞质中分泌颗粒逐渐增多,而对照组未见明显变化(图 4)。

2.3.2 共培养前后人羊膜上皮细胞α-

淀粉酶表达 免疫细胞化学结果显示,共培养前后hAECs均表达α- 淀粉酶,共培养后胞质中α- 淀粉酶阳性信号表达增强(图 5A、B),对照组未见明显变化,用PBS替代一抗的对照组未见阳性信号(图 5C)。

2.3.3 共培养前后hAECs中α-

淀粉酶mRNA表达量 共培养前后hAECs中α- 淀粉酶基因和内参基因GAPDH的mRNA表达均以CT值表示,各组α- 淀粉酶基因的mRNA相对表达量为2^- △△CT。单因素方差分析结果显示:共培养1、 2 周后hAECs中α- 淀粉酶mRNA相对表达量均高于共培养前,其表达量分别增加至共培养前的3.38 倍、6.60 倍(P<0.05)(图 6)。

3 讨 论

唾液腺功能障碍性疾病是口腔颌面部的多发病,目前临床上对这类疾病还缺乏有效的治疗方法。近年来,随着人们对干细胞增殖及分化过程、机制的认识和研究的不断深入,干细胞可能会在涎腺组织工程方面有较大的应用前景。有学者将SD大鼠的骨髓间充质干细胞与SMGCs 共培养,成功将骨髓间充质干细胞诱导分化为表达淀粉酶的细胞,初步具备了唾液腺腺泡细胞的功能[3,7]。但其不易获取和数量有限,难以满足临床需要。

A: 共培养前; B: 共培养2 周; C: 对照组

A: Before co- culture; B: Co- culture for 2 weeks; C: Control group

本实验通过有效分离、培养获得较高纯度的人羊膜上皮细胞及SD大鼠下颌下腺细胞。人羊膜细胞是一种具有多分化潜能的干细胞,具有胚胎干细胞的表型特征,具有干细胞可塑性,在特定的体外诱导培养条件下,可分化成来自3 个胚层的所有细胞,包括神经细胞、心肌细胞、成骨和软骨细胞、胰腺细胞等[8,9]。最近,国外报道hAECs在体外诱导培养条件下可分化为肝细胞样细胞。涎腺与肝脏、胰腺一样,均来自于内胚层,其发育过程与形态功能均有相似:从结构的角度来看,涎腺组织也由腺泡细胞和导管上皮细胞组成,与胰腺组织相类似;从功能上说,涎腺组织与胰腺组织一样分泌淀粉酶到消化道,具有相同的外分泌系统。本文对其分化为唾液腺腺泡样细胞的可能性进行了初步探索。

在分离hAECs过程中胰蛋白酶浓度以0.05%为宜,过高或过低均会导致消化分离过度或不足,造成目标细胞活力减弱,纯度下降;低速旋转消化是必要的环节,否则分离效果差;EGF对hAECs的生长增殖是必需的,本实验中加有EGF,原代或传代的hAECs均快速增殖,并形成铺路石样的上皮细胞层[8]。涎腺细胞是高度分化的上皮细胞,在体外培养条件下保持其功能并进行传代培养非常困难[7]。因为表皮生长因子有助于涎腺上皮的增殖,本实验在培养基中加入表皮生长因子,使得体外培养的SMGCs 一直具有良好的形态。选第2代的hAECs及SMGCs进行下一步共培养,是因为传至2～4 代的上皮细胞增殖速率较快,活力较好,适宜作诱导分化实验。实验中尝试应用更加类似人体微环境的Transwell装置将二者进行共培养,诱导人羊膜上皮细胞向腺泡样细胞分化。结果显示,随着诱导时间的增加,共培养1、2 周时α- 淀粉酶mRNA表达量分别为共培养前的3.38 倍和6.6 倍。而对照组均未见明显变化。本研究中hAECs和SD大鼠SMGCs 共培养所使用的培养基为适合腺细胞生长的专用培养基,对照组细胞使用该培养基则未发现明显的变化。说明并非培养基导致了hAECs的转化,很可能是共培养过程中SD大鼠下颌下腺细胞分泌了一些诱导人羊膜上皮细胞分化的物质,其提供的微环境对人羊膜上皮细胞分化具有促进作用。对进一步优化唾液腺腺泡样细胞诱导方案具有重要意义,并为相关实验提供了一个可供选择的诱导方案。

我们的研究结果证明hAECs具有向腺泡样细胞分化的潜能,这说明人羊膜细胞可能成为唾液腺功能障碍性疾病细胞治疗的理想干细胞来源。

参考文献

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培养神经细胞 篇10

在生殖系统细胞培养方面,基础培养液主要用M199培养液或DMEM培养液。DMEM培养基 (Dulbcco's Modifed Eagle Medium)含L-谷氨酰胺,不含碳酸氢铵、丙酮酸钠,2~8℃保存。DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基,DMEM细胞培养基是在MEM培养基的基础上研制的。与MEM比较增加了各种成分用量,同时又分为高糖型(低于4 500 g/L)和低糖型(低于1 000 g/L)。高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长,适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等。 这种培养基的特点:①氨基酸含量为依格尔培养基的2倍,且含有非必需氨基酸,如甘氨酸等; ②维生素含量为依格尔培养基的4倍; ③含有糖酵解途径中的重要物质——丙酮酸;④含有微量的铁离子。该类培养基广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养;如:A9、3T6、BALB/3T3、COS-1、COS-3、COS-7、L6、WEHI-3b等细胞系的培养。

M199培养液含Earle’s salts 和 Hank’s salts。 Media 199可促使鸡胚成纤维细胞在无血清条件下生长。与配入血清可用于各种细胞的培养。Earle’s salts组成碳酸盐缓冲液,可维持在CO2培养箱中的pH值,在大气环境下会使培养液pH值迅速上升。Hank’s salts的盐溶液用于均衡大气,在CO2培养箱中使用会使培养液pH值迅速下降。

1 卵母细胞体外培养液成分

目前, 卵母细胞成熟液大部分采用稳定性较好的TCM199 作为基础培养液。在牛上, TCM199 添加10 %血清、促性腺激素和雌激素,卵母细胞成熟率可达到90 %;在猪上,卵母细胞成熟液除用TCM199 外,NCSU223 也被较多使用,但成熟率差别不大。由于在使用TCM199 时需加入成分比较复杂的血清,这使得在研究中难以明确找出影响卵母细胞成熟的因素及其程度。许多学者通过研究,寻找一些成分明确的培养液。研究结果表明,合成培养液(如SOFM、KSOM) 中用BSA 或PVA 及氨基酸代替血清,作为成熟培养液,可使卵母细胞成熟,并能进行受精后的发育( Eckert 等,1995)。用复合输卵管合成液(cSOFMaa) 培养成熟的牛卵母细胞发育到囊胚的能力与TCM199 + NCS培养成熟的卵母细胞相同(Wat son 等,1999) 。

1.1 激素

目前,绝大多数研究者在卵母细胞的体外成熟培养中,都添加促性腺激素或类固醇激素或两者的混合物,但它们对卵母细胞成熟、受精和早期发育的作用及作用机理尚未完全了解清楚。在猪的卵母细胞体外成熟液中加PMSG培养,成熟率为67.7 %,而不加的仅为17.8 %,可见生殖激素对促进卵母细胞成熟有明显作用(秦鹏春等,1995)。大量研究结果表明,FSH 可使卵丘细胞扩散达100 %,并且卵丘细胞的扩散程度随着FSH 浓度的增加而提高(Choi 等,2001)。0.05IU ree2hFSH添加到COCGs 的培养液中,导致卵母细胞胚泡破裂,COCGs 直径增加(Van 等,1996) ,2 ×10 - 3 IU/ mL FSH能够刺激腔前卵泡的生长及腔的形成,并且抑制颗粒细胞的凋亡(Mao 等,2002)。在无FSH 的培养中卵母细胞成熟率显著降低,且退化量达36%(Bottcher等,1991)。但也有学者认为,在含有血清的成熟液中添加FSH ,既没有提高卵母细胞形成第一极体的比例,也没有显著影响体外受精和核移植后的发育( Keefer 等,1993)。Brackett (1989)研究结果表明,卵母细胞体外成熟培养基中加入LH能促进卵母细胞发育,并有利于随后的体外受精和体外培养,而Fukui 等(1989)则认为LH无这一作用。江金益等(1989)添加人绒毛膜促性腺激素、促卵泡素,奶牛卵母细胞成熟率为83.5 % ,效果都很明显。类固醇激素对哺乳动物的作用仍有争论,在卵泡培养过程中,类固醇合成的抑制剂对卵母细胞成熟后的受精和发育能力有不良影响。Singh 等(1993)报道猪卵母细胞体外成熟在雌二醇和FSH 存在时,胚泡损伤率下降。

1.2 血清

血清中含有蛋白质、维生素、脂肪、激素、氨基酸等营养物质和多肽类生长因子,可防止透明带硬化和促进受精的发生。因此,体外成熟卵母细胞的大多数试验均添加一定浓度的血清,能有效提高卵母细胞的体外成熟率。试验结果表明,对于牛卵母细胞的体外成熟,发情牛血清和犊牛血清均优于BSA。已有研究结果表明,血清中可能存在不利于胚胎发育的成分,造成胎儿体重过大、流产等综合症,且血清质量和产地等的影响,使试验结果有大的误差。鉴于由血清培养产生的种种问题,人们在卵母细胞体外成熟液中常添加血清替代物,如:牛血清白蛋白、聚乙烯醇、氨基酸和非离子型表面活性剂Twin 280等。

1.3 生长因子和细胞因子

在基础培养基中添加各种生长因子和细胞因子,如胰岛素、EGF 、IGF21 、白血病抑制因子、转化生长因子、重组牛生长激素(rbGH)等,对卵母细胞的生长、成熟起重要调节作用。EGF是一种卵泡卵母细胞成熟的诱导剂,能促进卵母细胞的体外成熟。I m 等(1995)发现,30 μg/L 的EGF有利于牛卵泡卵母细胞的体外成熟,使达到第2 次减数分裂中期的卵母细胞达97%。

1.4 卵泡液

卵泡液是卵母细胞体外发育的介质,含有大量来自血清的生长因子和卵母细胞及卵泡细胞的分泌因子。卵泡液所含的这些因子在体内随体内分泌状态的变化而变化,用于体外培养时会表现出对卵母细胞成熟的促进和抑制两种相反的作用。卵泡液的促进作用主要表现在提高卵母细胞质成熟的质量,增加胚胎的发育能力。控制卵泡液在培养液中添加的浓度,可以清除其对核成熟的抑制作用(石德顺等,1994)。另据报道,成熟的抑制作用与所采卵泡的大小有关,来自小卵泡(<3 mm)和中卵泡(3~8 mm)的卵泡液抑制卵母细胞核成熟,大卵泡(>8 mm)对核成熟没有抑制作用[1]。

1.5 抗氧化物质和维生素

卵母细胞体外成熟过程中,特别在20%氧气的气相环境中,产生许多对卵母细胞成熟和胚胎发育有害的ROS ,它能导致线粒体功能障碍,损害DNA 、RNA 和蛋白质,抑制精卵结合,是引起细胞死亡的一个重要原因,谷胱甘肽(GSH)能清除不利于细胞发育的过氧化物,细胞本身能合成GSH ,且不同的发育时期,细胞内GSH含量不同,这在小鼠、仓鼠、牛和猪已得到证实。外源性GSH、半胱胺、β2巯基乙醇、半胱胺酸和胱胺酸等已在不同物种的成熟体系中被添加。在低氧(5% 或7%氧气)条件下,卵母细胞体外成熟液中是否需要添加抗氧化物质,还有待进一步研究。Bormann等(2003)在山羊卵母细胞的体外成熟液中添加维生素,促进胚胎的发育,研究结果证明,维生素是卵母细胞培养液中一种重要成分[2]。

王国华等(2007)采用无血清培养液,其成熟液OM的基础成份为:9.5 g/L M199(Gibico)+10 mmol/L Hepes+1 mmol/L 丙酮酸钠+25 mmol/L 谷氨酰胺+0.075 U/mL 尿促性腺激素(HMG)(Sereno) +1 μg/mL 17β雌二醇(17β-E2) 。根据实验设计在OM 液中添加不同物质配成0.3% BSA(m/V)、1% PVA(m/V)、1% ITS(V/V) 和5% FBS(V/V)( Gibco)。培养液的pH 控制在7.2~7.4,用前置于CO2 培养箱中预先平衡2 h[3]。

2 颗粒细胞体外培养液成分

颗粒细胞培养采集的牦牛卵巢用PBS反复冲洗几次后,用注射器从2~6 mm的卵泡中抽吸卵泡液。取0.5 mL卵泡液加入灭菌离心管,再加入2 mL/ L透明质酸酶1 mL,摇匀,于38.5℃置5 min,然后加入3 mL BO液,立即离心5min (1 500 r/ min),弃去上清液;再加入约3 mL M199 + 200 mL/ L FBS培养液,离心5 min (1 500 r/min),弃去上清液;给沉淀( 颗粒细胞) 加入适量的M199 + 200 mL/ LFBS ,将其浓度稀释成0.5 ×107 个/ mL 。吸取10μL颗粒细胞悬液,注入已在CO2 培养箱平衡2 h的成熟培养液滴内(50 μL/滴)或培养孔内,待颗粒细胞扩散后,吸弃大块的凝聚物。最后将颗粒细胞液滴放入培养箱培养,备用(颗粒细胞的最终浓度约为106 个/mL)[4]。王妍等(2007)采用D/F12 培养基+ 100 U/ mL青霉素+ 100 μg/mL链霉素+ 0.5 μg/ mL两性霉素2B +体积分数10 % FBS[5]。

3 输卵管上皮细胞体外培养液成分

输卵管上皮细胞体外培养液成分组成为:M 199+8%血清+HEPPES+NaHCO3+牛磺酸+丙酮酸钠+乳酸钠[6]。王益兵等(2007)采用的是DMEM/F12[7]。

4 子宫内膜细胞体外培养液成分

子宫内膜细胞体外培养液成分组成为:DMEM、10%胎牛血清、HEPES缓冲液、两性霉素B、青霉素、链霉素等[8]。李幼飞等(2007)采用20%胎牛血清的DMEM培养液[9]。

5 滋养层细胞体外培养液成分

李珍等(2005)的滋养层细胞体外培养液成分组成为:含100 mL/L胎牛血清的DMEM。蒋立艳等(2007)采用DMEM/F12[10]。其中,F12为Ham’s F12 nutrient medium。是动物细胞培养基,成分复杂,含有多种微量元素,最初设计用于克隆二倍体的中国地鼠卵巢细胞。起初是作为一种无血清配方设计的,现在常补加血清用于支持各种正常的和转化细胞的增殖。F12常和DMEM以1∶1结合,称为DME/F12培养基(DME/F12medium),作为开发无血清配方的基础,以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分的优点。综上所述,各培养液总的来说有如下特点:①DMEM、M199使用最多的基础培养液;②比较而言,卵母细胞的培养液成分最复杂,在基础培养液中还需加入许多其他成分;③无血清培养液,有利于对培养过程中的影响因素的研究,故将会是以后研究的重点所在。

参考文献

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[9]李幼飞,李力,俞丽丽.早孕绒毛滋养层细胞体外培养方法的改良[J].重庆医学,2007,36(14):1389-1390.

培养神经细胞 篇11

关键词：神经内科住院医师 临床培养

神经病学具有专科特色强、多学科交叉以及个体化特点,因此神经科住院医师综合素质的培养应有较高的要求。作为国家级神经科教学基地,我院神经内科在临床和教学工作中积累了多年的经验,而神经科住院医师综合素质的培养则是临床教学的重点和基础,现将我科具体实施的办法总结如下。

一、规范主治医师查房制度,保证和监督住院医师临床工作质量

主治医师作为三级查房制度中的中间环节,具有承上启下的作用。对其基本要求至少有以下三个方面:①临床分析及解决疑难病症的能力;②对病人、住院医师及病历质量的综合管理能力;③对下级医师的带教能力。在具体工作中,主治医师要求住院医师询问病史应详尽准确,查体手法规范,内容全面;在查房过程中,要求住院医师详细汇报新入病人的病史、体格检查及相关辅助检查,并要求其首先通过询问病史及查体,对患者作出初步定位及定性诊断,之后再通过影像资料印证;在读片过程中,要求住院医师先看胶片进行判断,再看报告并与放射科医师的结论进行比较;对于已查病人,则要求住院医师汇报病例准确且简明扼要,要有自己的初步判断并能及时提出问题。通过每一个案例,住院医师得以自我锻炼和考核,使其临床能力得到迅速提升。

另外,主治医师及主任医师针对某几个典型病例或个别疑难病例,结合目前国内外的最新进展进行简洁评述,引导和启发住院医师拓展思路、与时俱进。病历书写要求规范、及时、准确和真实。在较为详细反映病情演变及诊治过程的基础上,我们强调病情分析的重要性,应突出临床逻辑分析及合理处置的过程,强调个例的特殊性与治疗基本原则相结合,既要突出循证医学的指导作用,同时强调个体化即因人而异的重要性。在早期的临床工作中,生物医学模式在保护人类健康、推进医学发展等方面发挥了重大作用。然而由于该模式对疾病认识的局限性,造成医务人员在临床工作中只注意疾病的生物因素,而忽视了疾病许多重要的心理因素及社会因素的主导中介作用。因此,我们强调,对疾病的认识已不限于生物医学模式,而发展成为生物-心理-社会医学模式,尤其对某些重要疾患,如脑卒中、某些神经系统变性病(如帕金森氏病、运动神经元病)、慢性神经系统免疫性疾病(多发性硬化、重症肌无力)以及慢性发作性疾病(如癫痫、周期性麻痹)等的心理学及社会学干预。我们在强调生物学因素的同时,开始积极关注患者精神、心理状况及社会背景,指导住院医师制定出符合患者个体特点的诊治方案,从而实现生物-心理-社会模式的综合效果。

二、加强教学查房,锻炼住院医师综合能力

为了加强住院医师综合能力的培养,我们每隔2周由各专业组组长轮流选择各病区有代表性的病例,组织科内住院医师查房,以住院医师为主体,讨论、分析病例,并做出诊断及鉴别诊断,制定相应的诊疗计划,最后由专业组长点评。整个过程我们以调动每个住院医师的主观能动性为目的,一改过去“大学学堂”模式—以教师为主体,学生被动接受的授课方式。充分调动住院医师的主观能动性,锻炼其独立思考能力和综合能力,培养其组织能力和表达能力。我们借鉴了PBL教学模式,与传统的医学教育模式即“以授课为基础的学习”相比,在设计理念、实施方式、评估体系、实际效果等方面均有着根本区别。

三、多种形式的学术交流,扩大住院医师的视野

作为国家级神经科教学基地,我院神经科学科内部、科室之间以及国内外同行之间学术交流已蔚然成风。每月一次的科报告会由八个专业组轮流主持,为各专业组提供一个展示最新研究成果和交流经验的平台,交流的内容包括了神经科各个领域的最新进展以及我科专业组相应领域的当前研究动态。去年一年内我们共进行了11次交流,内容涉及癫痫、脑血管病、神经科危重症、痴呆、中西医结合、神经免疫以及神经影像及电生理等各主要学科。不定期的科室之间以及国际学术交流,在促进科研合作的同时,拓展了广大住院医师以及进修医师的知识面,并激发了他们积极参与科学研究和临床实践的兴趣。同时,在完成规范化临床培训的基础上,多数住院医师要参加某专业组的科研工作,在具体的科研实践中培养严肃的科学态度、严密的科学方法和严谨的科学作风,同时团队协作精神及沟通能力亦得到锻炼。

四、注重创新教育,素质教育的核心创造力

作为当代人才综合素质的灵魂,愈来愈受到重视。其内涵包括创新意识、创新精神和创新能力,它主要是后天培养和教育的结果。因此,在住院医师综合素质培养过程中,我们特别强调创新教育。我们在强调继承的同时,更强调神经科学的复杂性和未知性。由于诸多未知领域尚待开拓,年轻医师的创新能力将很大程度上决定了他们的发展潜力。我们在以上培养策略中,强调青年医师的主观能动性。在主治医师查房过程中,鼓励下级医师提出问题,并以讨论的方式答疑,对尚不能及时明确的问题,责任到人,争取在下次查房时再次讨论明确,并引导他们以辩证的态度对待前人的研究,避免本本主义和经验主义。教学查房的目的在于抛砖引玉,通过典型病例和疾病,启发青年医师思考问题、解决问题的方法。在多种学术交流过程中,拓展了青年医师的知识面,同时加深了其对某些医学难题和热点的理解,避免闭门造车的弊端。

培养神经细胞 篇12

关键词：神经生长因子,葛根素,脑缺血,神经胶质细胞,细胞培养

神经生长因子 (nerve growth factor, NGF) 是发现最早、最典型、研究最多的一种神经营养因子[1], 具有明显促进神经元发育生长的作用。20世纪80年代之前, 人们对NGF与外周神经系统的关系已了解较多。近年来, NGF与脑缺血的关系备受关注[2]。NGF是由神经元或胶质细胞产生、分泌, 主要为胶质细胞产生。神经胶质细胞是中枢神经系统重要的细胞, 其数目大约是神经元的10倍。脑缺血损伤时, 神经胶质细胞大量合成分泌NGF, 对缺血损伤神经元的再生修复起到重要作用[3]。葛根素 (Puerarin, Pue) 由豆科植物野葛干燥根中提取物制成, 自1959年柴田承二等分离得到葛根素以来, 对它的研究日渐增多, 作为改善心脑血管循环的药物, 葛根素因其毒性低、安全范围广、疗效好而广泛运用于治疗心肌梗死和缺血性中风[4]。目前众多Pue神经保护作用的研究是通过酶学或形态学、免疫组化等方法获得的。现将对缺血培养神经胶质细胞分泌NGF及葛根素对其影响进行的观察分析如下。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂

Wistar大乳鼠, 出生后7 d, 遵义医学院珠海校区动物中心提供。Pue由海南斯达制药有限公司生产, 批号: 31105029;NGF试剂盒:帮定公司分装, 美国Sant Crus公司产品;常规试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 神经胶质细胞的培养

取出生7 d的Wistar大乳鼠, 用75% 乙醇消毒, 在无菌条件下断头、取脑, 分离出双侧海马和皮质, 置于一消毒平皿中, 用少许解剖液 (葡萄糖 3 g/L, 氯化钠18.0 g/L, 氯化钾 0.4 s/L, NaHPO4·7H2O 0.18 s/L, KH2PO4 0.03 g/L) 冲洗脑组织。用手术刀片切成的碎块组织。用热处理过的粗吸管吸脑组织于另一小平皿内, 加入适量的解剖液和胰酶, 使胰酶的浓度为0.25%。37 ℃CO2培养箱中消化30 min。将消化后的组织块吸入盛有适量种植培养液 (含20%胎牛血清, 80%DMEM, 10 mg/L谷氨酰胺) 的两支试管中, 用尖吸管吹散, 1 000 r/min离心使细胞下沉。除去上清。吸入10 mL接种液, 用尖吸管吹散至单个细胞。静置, 取以200目筛网过滤, 去除未消化的组织残渣。用血球计数板计数细胞, 0.4%台盼蓝镜检存活率大于95%。用种植培养液调节细胞密度为5×105/mL

1) 为珠海市科技计划基金项目 (No.PC20041029) , 珠海市医学重点专科建设资助项目

密度, 接种于涂有0.1% 多聚赖氨酸的24孔培养板中, 每孔500 μL, 置培养板于37 ℃, 5%CO2培养箱中, 24 h后吸掉种植培养液, 根据实验需要进行分组处理。

1.2.2 细胞的分组与处理

将培养的神经胶质细胞分为正常组、缺血组、Pue组。正常组加入含10% 牛血清的培养基0.5 mL, 缺血组加入无血清的培养基0.5 mL, Pue组每孔分别加入含Pue 1 μL/mL的培养基0.5 mL。继续培养72 h。作用时间完成后, 将上清移入无菌Eppendof小管, -20 ℃冷藏待测;同时将每孔细胞消化下来, 计算其细胞总数。

1.3 NGF的定量测定

培养基质中NGF含量采用双向ELISA法定量检测。用酶标仪于450 nm处以阴性对照凋零后测定每孔的光密度 (OD) 值, 根据NGF标准品和其对应OD值, 先得出标准曲线, 再求出回归方程, 然后依回归方程得出每孔样品的NGF含量, 最后NGF分泌量以72 h的“pg/105细胞”表示。

1.4 统计学处理

采用SPSS 10.0软件中ONE ANOVA程序进行方差检验。

2 结 果

缺血组神经胶质细胞NGF分泌量为 (13.18±1.91) pg/105, 与正常组的 (9.24±3.12) pg/105比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 说明缺血损伤可使神经胶质细胞NGF分泌量增加。Pue组神经胶质细胞分泌NGF的量为 (16.83±1.89) pg/105, 较缺血组明显增多 (P<0.05) , 说明Pue可上调缺血损伤导致的神经胶质细胞分泌NGF。

3 讨 论

NGF由118个氨基酸组成, 相对分子质量约为14×103, 是由神经元或胶质细胞产生、分泌, 主要为胶质细胞产生;主要通过酪氨酸激酶受体trkA自磷酸化进行信号转导, 发挥其生物学效应。NGF在脑内含量虽微, 但对神经细胞的发育成熟及存活起着极为重要的作用。神经元在发育过程中对NGF的有限供应存在着竞争关系, 能获取NGF的细胞存活, 反之则死亡[5]。病理情况下, NGF能保护神经元避免损伤, 提高存活。细胞培养研究 (用未成熟细胞) 表明, 当神经元暴露于兴奋毒性或刺激性缺血性应激时, NGF可产生保护作用[6]。

近年来, 众多报道表明, 脑缺血无论是短暂缺血或较长时间缺血, 均可出现NGF表达增加, 对脑缺血损伤有保护和治疗作用[7]。本实验研究发现脑缺血损伤后, 神经生长因子的分泌明显增加, 与上述研究相一致。NGF对脑缺血的神经保护机制可能包括:①提高自由基清除剂的活性。脑缺血损害时, 正常神经元的细胞膜受到破坏, 脑内氧自由基和脂质过氧化物明显增多。有实验显示, NGF能增加过氧化氢酶、超氧化物歧化酶 (SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶等自由基清除剂的活性[8]。②拮抗兴奋性氨基酸的神经毒性。如预先向脑室内注入NGF可防止鹅膏氨酸 (ibotenic acid) 对大鼠脑组织的不可逆损伤[9]。③稳定细胞内Ca2+浓度。自由基与兴奋性氨基酸损伤均可引起Ca2+超载。Ca2+超载预示着细胞破坏和死亡。NGF稳定细胞内Ca2+浓度的机制在于诱导钙结合蛋白的表达、影响Ca2+通道与Ca2+排出系统的表达与活化, 从而稳定细胞内Ca2+浓度。