神经白细胞素（精选10篇）
神经白细胞素 篇1
摘要：目的观察葛根素对培养大鼠缺血损伤神经胶质细胞分泌神经生长因子 (NGF) 的影响。方法使用出生7 d的Wistar鼠大脑皮层神经细胞进行神经胶质细胞的培养, 实验分为正常组、缺血组和葛根素组, 采用双向ELISA法定量检测培养基质中NGF含量。结果缺血组神经胶质细胞NGF分泌量较正常组明显增多 (P<0.05) , 葛根素组神经胶质细胞分泌NGF的量较正常组、缺血组明显增多 (P<0.05或P<0.01) 。结论进一步证实缺血损伤可使神经胶质细胞NGF分泌量增加。葛根素的神经保护作用可能与上调缺血损伤导致的神经胶质细胞分泌的NGF有关。
关键词：神经生长因子,葛根素,脑缺血,神经胶质细胞,细胞培养
神经生长因子 (nerve growth factor, NGF) 是发现最早、最典型、研究最多的一种神经营养因子[1], 具有明显促进神经元发育生长的作用。20世纪80年代之前, 人们对NGF与外周神经系统的关系已了解较多。近年来, NGF与脑缺血的关系备受关注[2]。NGF是由神经元或胶质细胞产生、分泌, 主要为胶质细胞产生。神经胶质细胞是中枢神经系统重要的细胞, 其数目大约是神经元的10倍。脑缺血损伤时, 神经胶质细胞大量合成分泌NGF, 对缺血损伤神经元的再生修复起到重要作用[3]。葛根素 (Puerarin, Pue) 由豆科植物野葛干燥根中提取物制成, 自1959年柴田承二等分离得到葛根素以来, 对它的研究日渐增多, 作为改善心脑血管循环的药物, 葛根素因其毒性低、安全范围广、疗效好而广泛运用于治疗心肌梗死和缺血性中风[4]。目前众多Pue神经保护作用的研究是通过酶学或形态学、免疫组化等方法获得的。现将对缺血培养神经胶质细胞分泌NGF及葛根素对其影响进行的观察分析如下。
1 材料与方法
1.1 动物及试剂
Wistar大乳鼠, 出生后7 d, 遵义医学院珠海校区动物中心提供。Pue由海南斯达制药有限公司生产, 批号: 31105029;NGF试剂盒:帮定公司分装, 美国Sant Crus公司产品;常规试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 神经胶质细胞的培养
取出生7 d的Wistar大乳鼠, 用75% 乙醇消毒, 在无菌条件下断头、取脑, 分离出双侧海马和皮质, 置于一消毒平皿中, 用少许解剖液 (葡萄糖 3 g/L, 氯化钠18.0 g/L, 氯化钾 0.4 s/L, NaHPO4·7H2O 0.18 s/L, KH2PO4 0.03 g/L) 冲洗脑组织。用手术刀片切成的碎块组织。用热处理过的粗吸管吸脑组织于另一小平皿内, 加入适量的解剖液和胰酶, 使胰酶的浓度为0.25%。37 ℃CO2培养箱中消化30 min。将消化后的组织块吸入盛有适量种植培养液 (含20%胎牛血清, 80%DMEM, 10 mg/L谷氨酰胺) 的两支试管中, 用尖吸管吹散, 1 000 r/min离心使细胞下沉。除去上清。吸入10 mL接种液, 用尖吸管吹散至单个细胞。静置, 取以200目筛网过滤, 去除未消化的组织残渣。用血球计数板计数细胞, 0.4%台盼蓝镜检存活率大于95%。用种植培养液调节细胞密度为5×105/mL
1) 为珠海市科技计划基金项目 (No.PC20041029) , 珠海市医学重点专科建设资助项目
密度, 接种于涂有0.1% 多聚赖氨酸的24孔培养板中, 每孔500 μL, 置培养板于37 ℃, 5%CO2培养箱中, 24 h后吸掉种植培养液, 根据实验需要进行分组处理。
1.2.2 细胞的分组与处理
将培养的神经胶质细胞分为正常组、缺血组、Pue组。正常组加入含10% 牛血清的培养基0.5 mL, 缺血组加入无血清的培养基0.5 mL, Pue组每孔分别加入含Pue 1 μL/mL的培养基0.5 mL。继续培养72 h。作用时间完成后, 将上清移入无菌Eppendof小管, -20 ℃冷藏待测;同时将每孔细胞消化下来, 计算其细胞总数。
1.3 NGF的定量测定
培养基质中NGF含量采用双向ELISA法定量检测。用酶标仪于450 nm处以阴性对照凋零后测定每孔的光密度 (OD) 值, 根据NGF标准品和其对应OD值, 先得出标准曲线, 再求出回归方程, 然后依回归方程得出每孔样品的NGF含量, 最后NGF分泌量以72 h的“pg/105细胞”表示。
1.4 统计学处理
采用SPSS 10.0软件中ONE ANOVA程序进行方差检验。
2 结 果
缺血组神经胶质细胞NGF分泌量为 (13.18±1.91) pg/105, 与正常组的 (9.24±3.12) pg/105比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 说明缺血损伤可使神经胶质细胞NGF分泌量增加。Pue组神经胶质细胞分泌NGF的量为 (16.83±1.89) pg/105, 较缺血组明显增多 (P<0.05) , 说明Pue可上调缺血损伤导致的神经胶质细胞分泌NGF。
3 讨 论
NGF由118个氨基酸组成, 相对分子质量约为14×103, 是由神经元或胶质细胞产生、分泌, 主要为胶质细胞产生;主要通过酪氨酸激酶受体trkA自磷酸化进行信号转导, 发挥其生物学效应。NGF在脑内含量虽微, 但对神经细胞的发育成熟及存活起着极为重要的作用。神经元在发育过程中对NGF的有限供应存在着竞争关系, 能获取NGF的细胞存活, 反之则死亡[5]。病理情况下, NGF能保护神经元避免损伤, 提高存活。细胞培养研究 (用未成熟细胞) 表明, 当神经元暴露于兴奋毒性或刺激性缺血性应激时, NGF可产生保护作用[6]。
近年来, 众多报道表明, 脑缺血无论是短暂缺血或较长时间缺血, 均可出现NGF表达增加, 对脑缺血损伤有保护和治疗作用[7]。本实验研究发现脑缺血损伤后, 神经生长因子的分泌明显增加, 与上述研究相一致。NGF对脑缺血的神经保护机制可能包括:①提高自由基清除剂的活性。脑缺血损害时, 正常神经元的细胞膜受到破坏, 脑内氧自由基和脂质过氧化物明显增多。有实验显示, NGF能增加过氧化氢酶、超氧化物歧化酶 (SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶等自由基清除剂的活性[8]。②拮抗兴奋性氨基酸的神经毒性。如预先向脑室内注入NGF可防止鹅膏氨酸 (ibotenic acid) 对大鼠脑组织的不可逆损伤[9]。③稳定细胞内Ca2+浓度。自由基与兴奋性氨基酸损伤均可引起Ca2+超载。Ca2+超载预示着细胞破坏和死亡。NGF稳定细胞内Ca2+浓度的机制在于诱导钙结合蛋白的表达、影响Ca2+通道与Ca2+排出系统的表达与活化, 从而稳定细胞内Ca2+浓度。
但是, 脑缺血损害后引起NGF表达增加的时程很短, 表达水平也很有限, 很难对受损神经元起到全面持久的保护作用。而且, 它的治疗应用还受到血脑屏障的限制[10]。有研究表明[11], 给予大剂量的外源性NGF或植入某些能持续高水平分泌NGF的转基因细胞或其他成分时, 其神经保护作用方得以充分体现。从本实验结果来看, Pue可提高缺血损伤后神经胶质细胞分泌NGF的量, 这可能是Pue神经保护的机制之一。
神经白细胞素 篇2
【摘 要】 目的：研究芹菜素诱导人膀胱癌5637细胞凋亡的作用机制。方法：采用25～100μmol/L芹菜素处理膀胱癌5637细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡情况；采用Western blotting检测细胞凋亡相关信号分子Bax、Bcl-2和PARP蛋白的表达水平。结果：芹菜素处理使细胞Bcl-2蛋白表达降低且呈浓度依赖性，并使Bax的表达增加和导致PARP蛋白发生切割且呈浓度依赖性。结论：芹菜素能够抑制人膀胱癌5637细胞的增殖，诱导细胞凋亡，其机制可能与下调Bcl-2并上调Bax表达，导致Bcl-2/Bax比值下降，PARP活化有关。
【关键词】 芹菜素；膀胱癌；细胞凋亡；机制
【中图分类号】R285.5 【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）14-0025-04
Abstract：Objective To study the mechanism of apigenin on the apoptosis of human bladder cancer cell line 5637. Methods 5637 cells were cultured with different concentrations of apigenin， and MTT assay was used to evaluate the cell inhibition rates. The expressions of apoptosis-related proteins Bax， Bcl-2 and PARP were analyzed by Western blotting. Results Apigenin causes concentration -dependent inhibition of the proliferation of bladder cancer 5637 cells. Western blotting demonstrated that apigenin increased the protein levels of Bax and PARP cleavage and reduced the protein expression of Bcl-2. Conclusion Apigenin can inhibit the proliferation and induce apoptosis of 5637 cells possibly by up-regulating the Bax expression， enhancing PARP cleavage， downregulating the Bcl-2 expression and resulting in the Bcl-2/Bax ratio decreased.
Keywords：Apigenin； Bladder cancer； Apoptosis； Mechanism
膀胱癌的全球发病率在全身恶性肿瘤中占第9位。而在我国，膀胱癌是泌尿系统中最高发的一种恶性肿瘤。临床上根据分期可分为非肌层浸润性膀胱癌和肌层浸润性膀胱癌[1]。其中非肌层浸润性膀胱癌占发病率70%，其主要治疗方法为经尿道膀胱肿瘤电切术（transurethral resection of bladder tumor， TUR-Bt）加术后膀胱灌注化疗，膀胱灌注化疗常用药物包括表柔比星、丝裂霉素、吡柔比星、阿霉素、羟基喜树碱等[2]，虽经过严格术后灌注方案，仍有20%左右的肿瘤患者术后仍会复发。而肌层浸润性膀胱癌中有一部分患者的治疗主要需采用以顺铂为主的化疗方案[3]，顺铂的化疗方案疗效虽然敏感，但不能持久，患者5年生存率仅为20%～40%。而且，目前常用的化疗药物存在不同程度的全身或局部毒副反应，包括骨髓抑制、过敏反应以及膀胱刺激征等。这些方法虽然在一定程度上取得一定的疗效，但是通常给患者带来不可逆转的系统毒性以及严重的膀胱局部刺激，例如出血性膀胱炎等[4]。因此，寻求无毒副作用且有效的膀胱癌治疗药物十分迫切。
芹菜素（5，7，4′-三羟基黄酮），是一种广泛存在于果蔬中的一种黄酮类化合物，具有多种药理活性[5-6]，其中以抗肿瘤活性研究较多。研究表明芹菜素在体外能够显著抑制多种类型的肿瘤细胞的生长增殖和诱导其凋亡，包括：人胃癌细胞[7]、人卵巢癌[8]、人结肠癌细胞[9]、人乳腺癌MDA-MB-231细胞[10]、人肝癌Hep G2细胞[11]、HeLa细胞[12]等，而其对膀胱癌细胞的作用机制研究鲜有报道。本实验观察了芹菜素对人膀胱癌5637细胞的生长抑制以及诱导凋亡作用，探讨其促进细胞凋亡的作用机制。
1 实验材料
1.1 试剂 芹菜素（质量分数≥98%，批号：22806）购自阿拉丁公司；MTT，低熔点琼脂糖、二甲基亚砜（DMSO），蛋白酶抑制剂购自Sigma；RPMI1640培养基，胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）均购自GIBCO公司；人抗兔Bax，Bcl-2，PARP抗体购自Santa Cruz，GAPDH抗体购自Abcam，BCA蛋白定量试剂盒和羊抗兔/鼠二抗购自Pierce；PVDF膜Millipore；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 细胞株及细胞培养 人膀胱癌细胞株5637购自中国科学院上海细胞库；培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，于37℃、5% CO2、95% O2细胞培养箱内常规传代培养，取对数生长期细胞用于实验。
2 实验方法
2.1 MTT法检测芹菜素对膀胱癌细胞5637增殖的影响 将5637细胞以3×103/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后每孔分别加入100μL不同浓度的芹菜素（25、50、75和100μmol/L），每个浓度设4个重复，同时设立空白对照组（加同体积的DMSO），细胞培养72h后，向每孔加入20μL 5.0 g/L的MTT后继续培养4h，弃上清，向每孔中加入200μL DMSO溶解结晶紫，置于摇床振荡30min，至蓝紫色颗粒完全溶解后，于酶标仪490nm波长处测定每孔吸光度值（A），并计算细胞增殖率（%）=（药物处理孔A值-空白孔A值）/（对照孔A值-空白孔A值）×100%。实验重复3次。
2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡率 将5637细胞以2×106/孔接种于6孔板中，待细胞贴壁后分别加入不同浓度的芹菜素（50、75、100μmol/L），处理24h后收集细胞，并调整细胞数至1×106/mL，用预冷PBS 洗涤细胞2次，弃上清液。加入100μL染料结合缓冲液重悬后，加入10μL AnnexinV-FITC 染色，混匀后室温避光静置15min，然后加入200μL的染料结合缓冲液和5μL PI染液（50mg/L），静置5min，立即进行流式细胞仪分析。
2.3 Western blotting检测Bax、Bcl-2和PARP蛋白表达 将5637细胞以2×105/孔接种于6孔板中，以75、100μmol/L芹菜素作用细胞24h后，收集细胞，在每管细胞中加入100μL的蛋白裂解液后，BCA法进行总蛋白定量，每泳道上样量为40μg总蛋白，经10% SDS-PAGE电泳后转移至PVDF膜上。一抗稀释浓度分别为：Bax（1∶3000）、Bcl- 2（1∶2000）、PARP（1∶2000）、GAPDH（1∶10000）。羊抗兔/鼠二抗为1∶5000稀释。ECL化学发光液，X光片暗室曝光、显影及定影。采用WO-9413B型凝胶成像。实验重复3次。
2.4 统计学分析 采用SPSS 11.0统计软件进行数据处理，实验数据均以均数±标准差表示，组间差异显著性比较采用t检验，以P< 0.05表示差异具有统计学意义。
3 实验结果
3.1 芹菜素对5637细胞增殖的抑制作用 为了研究芹菜素对膀胱癌细胞增值的作用，采用不同浓度芹菜素（25、50、75和100μmol/L）处理膀胱癌5637细胞48 h后，采用MTT法检测各个组细胞增值效率，研究结果显示，不同浓度芹菜素处理的细胞的增殖均受到不同程度的抑制，与空白对照组相比具有显著性差异（P< 0.05，图1）。芹菜素对5637细胞增殖的抑制作用呈一定的浓度依赖性，采用不同浓度（25、50、75和100μmol/L）芹菜素处理后，随着处理浓度的增加，其抑制效果更明显。芹菜素对5637细胞的抑制呈现浓度依赖的特征。
3.2 Annexin V/PI 双染法流式细胞仪检测芹菜素诱导5637细胞的凋亡率为了研究芹菜素对膀胱癌细胞的诱导凋亡的作用，根据MTT实验结果，采用不同浓度芹菜素（50、75和100μmol/L）处理膀胱癌5637细胞24 h后，采用Annexin V/PI 双染法流式细胞仪检测各个组细胞的凋亡效率，研究结果显示（图2和图3），0、50、75和100 μmol/L芹菜素处理组细胞凋亡率分别为（2.3±0.8）%、（14.3±2.9）%、（20.0±5.9）%和（63.8±6.2）%，与对照组相比差异显著（P<0.05）。随着芹菜素处理浓度的增加，其诱导膀胱癌5637细胞凋亡效率效果更明显，提示芹菜素对5637细胞的凋亡诱导效应具有剂量依赖性。
3.3 芹菜素对Bax、Bcl-2和PARP蛋白表达的影响 为了探讨芹菜素对膀胱癌细胞的诱导凋亡的作用机制，采用不同浓度芹菜素（75和100 μmol/L）处理膀胱癌5637细胞24h后，采用Western-blotting检测各个组细胞的凋亡相关蛋白的表达，研究结果显示，75和100μmol/L芹菜素芹菜素处理5637细胞24h后，进行蛋白检测。检测结果表明，随着浓度增加，Bax蛋白表达逐渐增加，PARP蛋白的切割水解亦逐渐增加，而Bcl-2蛋白表达逐渐降低，因此Bcl-2/Bax比值逐渐下降（图4）。随着芹菜素处理浓度的增加，膀胱癌5637细胞中，Bcl-2与剪切的PARP蛋白表达量逐渐降低，Bax蛋白表达量逐渐增高，结合以上实验结果，提示芹菜素对5637细胞的凋亡可能是通过上调Bax和下调Bcl-2蛋白表达，激活PARP的活性，从而诱导5637细胞的凋亡，并且这种诱导效应具有剂量依赖性。
4 讨论
芹菜素是具有多种生物活性的黄酮类化合物，多项研究结果已经证实， 芹菜素对体内、外多种癌细胞具有杀伤作用， 其作用机制可能是通过对细胞凋亡的基因调控实现的，主要通过如Rb、p53及周期蛋白依赖性激酶抑制因子如p15、p16、p21等[13]。抗癌活性是芹菜素的主要活性之一， 细胞凋亡是基因调控细胞程序性死亡的过程， 凋亡异常与肿瘤发生发展有密切关系。细胞凋亡敏感性主要取决于于多种凋亡相关基因表达产物的水平及相互作用， 存在着多种控制细胞凋亡的复杂的调控系统。
体内肿瘤细胞生长主要是由于对机体正常调控机制的逃逸来实现的， 细胞正常的凋亡调控机制受到严格的控制。对多种肿瘤细胞株， 芹菜素以浓度及时间依赖性的方式诱导出现细胞皱缩、染色体凝集及DNA碎裂等特征性凋亡检测标志。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。AnnexinV是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。本研究采用Annexin-V荧光与PI双染色技术在5637细胞中也获得同样结论。芹菜素能抑制人膀胱癌5637细胞生长， 诱发细胞凋亡。
Bcl-2和Bax基因家族在细胞凋亡过程中起着重要的调节作用[14]，Bcl-2和Bax蛋白之间的比例影响着细胞对各种凋亡诱导分子的敏感性，直接决定下游Caspases活化与否，从而决定凋亡是否发生。PARP正是Caspase的切割底物，切割过的PARP不能正常发挥功能，引起DNA的断裂[15]。PARP切割降解是细胞凋亡的标志之一。通过Western blotting 检测发现75、100μmol/L芹菜素处理后，PARP的切割增加，并且这种增加是浓度依赖性的。Bcl-2表达量多，细胞易于存活，而当Bax表达量过多时，容易形成Bax同源二聚体，导致细胞容易发生凋亡。通过Western blotting 检测发现75、100 μmol/L芹菜素可降低Bcl-2蛋白的表达，同时增加Bax的表达，且随着浓度的增加增加/抑制的效果更加明显。实验结果显示芹菜素诱导膀胱癌5637细胞凋亡的机制可能与上调Bax和下调Bcl-2的表达，导致Bcl-2/Bax比值下降，从而诱导细胞凋亡。
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神经白细胞素 篇3
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组
10周龄成年Wistar大鼠30只和孕期为14d Wistar大鼠1只, 体重 (230±10) g, SPF级;所有大鼠均由佳木斯大学实验动物中心提供和饲养, 实验过程符合我国相关伦理学规定。30只大鼠随机分为:细胞移植组、对照组、AD模型组, 每组各10只。
1.2 试剂及仪器
主要试剂:DMEM/F12 (北京康为世纪) 、胰蛋白酶 (北京中杉) ;多克隆兔抗突触素I抗体 (Santa Cruz) , 辣根过氧化物酶标记的抗兔Ig G抗体 (Santa Cruz) 、β-actin鼠单克隆抗体 (北京康为世纪) 、HRP标记抗山羊Ig G (武汉博士德) ;Aβ1-42 (美国Sigma公司) 主要仪器:CO2恒温培养箱 (Thermo Forma公司) , Y型电迷宫 (张家港生物医学仪器厂) , 大鼠立体定向仪SN2型 (日本东京成茂科学器械研究所) , 垂直电泳槽 (北京六一仪器厂) , 转膜仪 (德国GE公司) 。
1.3 AD动物模型制备、神经干细胞培养及移植
1.3.1 AD动物模型制备
采用β-淀粉样蛋白 (Aβ1-42) 诱导方法制备AD模型[4]:在无菌操作下把Aβ1-42溶于生理盐水中, 置于37℃孵育7d以上, 使其形成聚集状态的Aβ备用;大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉成功后, 将其固定在立体定位仪上, 术区常规消毒, 参照包新民等[5]的《大鼠脑立体定位图谱》, 选择双侧海马区作为注射靶区, 位置距前囟向后3.0mm、中线侧开2.2mm处, 用微型钻头钻开颅骨, 垂直于大脑表面用微量进样器进针2.8mm, 然后将5μL呈聚集状态的Aβ以每分钟1μL速度缓慢注入, 留针时间不少于10min。逐层缝合切口, 术后每天腹腔注射抗生素, 饲养7d后行Y迷宫测试, 学习和记忆认知能力降低则表明制模成功。
1.3.2 神经干细胞体外培养
NSCs培养方法参照文献[6]:取孕2周的Wistar大鼠腹腔麻醉后断颈处死, 在无菌操作下行剖宫取出胚胎, 分离得到全脑组织后用HBSS液反复冲洗;用无菌剪刀将全脑剪成小块组织, 加入0.25%胰酶消化后, 用巴氏吸管反复多次吹打, 使其成为单细胞悬液, 转入含有b FGF和EG培养基的培养瓶中, 放置在温度为37℃恒温条件下5%CO2培养箱中培养。每天取样镜检观察细胞形态, 形成原代克隆球后, 在次机械分离使其形成单细胞悬液, 按上述条件继续培养进行传代培养 (1:2或1:3比例) , 5~7d传代一次, 方法同上。
1.3.3 神经干细胞移植
取传代培养至4代的神经干细胞球配置成细胞浓度为1×104/μL细胞悬液;对照组大鼠只麻醉不做处理;细胞移植组大鼠按照制备AD模型的方法进入海马区, 注入上述细胞悬液5μL注射;AD模型组则注射5μL的生理盐水做对照。术后麻醉清醒后分笼饲养28d后行Y迷宫测试行为学观察。
1.4 Western blot法检测大鼠海马组织内突触素Ⅰ的表达
大鼠饲养28d后断颈处死取海马组织, 经裂解、离心、8%SDS-PAGE分离、转膜 (PVDF膜) 后分别加入一抗 (稀释1:1000) , 4℃湿盒孵育过夜, TTBS洗膜4次时间为5min, 再加入二抗 (稀释1:3000) , 20℃孵育2h, 再次TTBS洗膜4次时间为10min, 最后将膜放在含Super Signal West Pico底物工作液中孵育5min, 吸干残留试剂。曝光显色拍照后利用Visionworks 6.3.3图像检测各条带灰度值与GAP-DH条带灰度值作比值, 得出各样品相对蛋白含量。
1.5 统计学方法
采用SPSS21.0统计分析软件进行处理, 数据均以均数±标准差 (±s) 表示, 组间比较采用独立样本t检验 (P<0.05) 为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠行为学检测
Y迷宫测试:实验前所有大鼠测试结果均为正常未见明显差异 (P>0.05) ;术后饲养28d大鼠行Y迷宫测试结果:与对照组比较, AD模型组和细胞移植组大鼠学习和记忆均低, 且统计学有差异 (P<0.05) ;与AD模型组比较, 细胞移植组大鼠学习和记忆能力, 差异有统计学意义 (P<0.05) 见表1。
注:与对照组比较, aP<0.05;与AD模型组比较bP<0.05。
2.2 Western blot检测海马组织内Synapsin I表达
Western结果显示:对照组大鼠海马组织中Synapsin I蛋白条带宽而颜色深;与对照组比较, 模型组和细胞移植组Synapsin I蛋白条带均明显变细颜色变浅;细胞移植组与AD模型组比较, 细胞移植组Synapsin I蛋白条带较AD模型组条带宽且颜色深, 即细胞移植组海马内Synapsin I蛋白的表达明显高于AD模型组, 见图1。
注:1泳道为对照组;2泳道为细胞移植组;3泳道为AD模型组
Synapsin I/GAPDH相对灰度值结果显示:与对照组比较, 细胞移植组和AD模型组Synapsin I光密度值明显降低, 则Synapsin I蛋白表达量明显减少, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 这表明AD大鼠下调了海马组织中神经细胞膜上Synapsin I的表达;与AD模型组比较, 细胞移植组Synapsin I光密度值明显增加, 则Synapsin I蛋白表达量较高, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 这表明移植NSCs的上调了AD大鼠海马组织中神经细胞膜上Synapsin I的表达, 见图2。
3 讨论
突触是两个神经细胞传递神经递质信号的重要结构。有研究表明, 在阿尔茨海默病早期, 突触可出现快速的退行性改变, 其退变可遍布包括海马组织在内几乎所有的新皮质[7]。突触素I (Synapsin I) 是突触素家族最早发现的位于突触囊泡膜上的一种特异性磷酸化神经蛋白质, 它在突触可塑性和神经信号传导过程中发挥了重要的作用, 它的表达与突触的再生、延伸与其功能的恢复有关[2]。突触连接是神经元细胞间信息传递的重要结构, 也是生物学习及记忆的神经生物基础;Synapsin I分布可间接的反应突触连接的数量及密度, Synapsin I的变化情况能准确的映射出神经元突触的改变, 是突触重塑的理想标志[3]。本实验选用2周龄大鼠胚胎全脑组织分离培养NSCs, 经原代及传代培养后, 经证实将具有自我增殖能力的第4代NSCs采用立体定位法移植到AD模型大鼠海马组织内, 饲养28d后通过Y迷宫检测实验大鼠的学习和记忆能力, 结果显示实验前各组大鼠学习记忆未见明显差异 (P>0.05) ;饲养28d后AD模型组和细胞移植组大鼠学习记忆均低于对照组, 且差异有统计学意义 (P<0.05) ;与AD模型组比较, 细胞移植组大鼠学习记忆能力高于AD模型组, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 这验证了李京凤等[8]人的研究结果。Western blot结果显示, 饲养28d后AD模型组和细胞移植组大鼠海马组织Synapsin I蛋白表达量均低于对照组, 与AD模型组比较, 细胞移植组大鼠海马组织Synapsin I蛋白表达量高于AD模型组, 张冰清等[9]人研究发现血管性痴呆大鼠海马组织中Synapsin I较正常大鼠表达含量低、分布少, 这也间接提示突触结构数量减少;这与本文研究的结果基本一致。因此, 移植的NSCs可以改善AD模型大鼠的学习、记忆能力, 这提示移植的NSCs可以促进海马组织中神经元的恢复;这可能是移植的NSCs影响了海马中神经元合成Synapsin I的能力, 促进了轴浆运输或抑制了神经元的衰老或促进新蛋白质的合成, 最终增加了Synapsin I在突触终末的含量。Synapsin I含量的上升活跃了突触结构中信息的传递, 继而增强了海马学习记忆能力。
本实验采用NSCs立体定位法移植AD模型大鼠后, 上调例海马组织内Synapsin I蛋白表达, 这可能是由于移植的NSCs改善了海马组织局部的微环境, 增加突触的形成及神经递质的释放, 增强了神经元细胞信息传递功能, 继而改善了AD大鼠学习和记忆能力。所以AD大鼠海马组织微环境中Synapsin I蛋白表达上调可能是NSCs改善AD大鼠学习和记忆功能的机制之一;为将来NSCs运用于临床治疗阿尔茨海默病提供实验依据。
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神经白细胞素 篇4
【关键词】肝细胞损伤；酒精性；葛根素
基金项目：湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目（湘教通[2013]36号/432）
酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是一种由于长期大量饮酒导致肝脏功能和结构出现异常所导致的肝脏疾病。ALD不经治疗最终会走向不可逆的肝纤维化。酒精在人体内主要经肝脏代谢，通过酒精脱氢酶和过氧化氢酶氧化为乙醛，对肝细胞有明显的毒性作用，可使肝细胞代谢紊乱，导致肝细胞变性和坏死，可引起轻症酒精性肝病（alcohol minimal lesion，AML）、脂肪肝
（alcoholic fatty liver，AFL）、酒精性肝炎（alcoholic hePtatis，AH）、肝纤维化（alcoholic hePatic fibrosis，AF）、肝硬化（alco-holic
cirrhosis，AC）和肝细胞癌（hePato cellular carci-noma，HCC）等。各种原因导致的肝细胞损伤可表现为血清天冬氨酸氨基转移酶
（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、γ一谷氨酰转肽酶（GGT）、总胆红素（TBil）、凝血酶原时间（PT）、平均红细胞容积（MCV）等指标变化，其中AST、ALT、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、血清透明质酸（HA）、III型前胶原（PCIII）、层黏连蛋白（LN）等与酒精性肝损伤关系较为密切。
一、葛根药理成分
葛根的主要成分为异黄酮类、葛根苷类、三帖皂苷类、生物碱及其他化合物4类，葛根苷类和异黄酮类为其有效成分。葛根苷类系二氢查尔酮的衍生物，与葛根保肝作用有一定关系]。而异黄酮类因其调节血压；提高SOD活性，降低
MDA活性；改善循环、调节纤溶系统；解酒[9]等作用，广泛用于辅助治疗心脑血管病，酒精性肝病等疾病的治疗。
二、保肝药理研究
1.改善转氨酶活性作用
AST、ALT评价肝细胞损伤的敏感指标，其升高反应肝细胞受损情况。田维毅[给正常对照组、模型对照组、葛根散水煎剂组（高、中、低20，10，5 g/kg）以0.2ml葛根散水煎剂灌胃（正常、模型对照组代以等体积蒸馏水）30min后，模型对照组和各给药组以56%白酒15mL/kg灌胃（正常对照组代以等体积蒸馏水），每天1次，连续10d后，测得正常对照、模型对照、葛根散组高、中、低剂量组ALT、AST（U/L）分别为：64.71±7.98、78.11±11.36；207.07±12.86、162.35±16.20；91.19±10.22、91.61±12.06；104±14.05、101.34±11.92；140.52±14.91、153.61±14.22（p<0.01）。王思为将雄性小鼠分为正常对照组、酒精性肝损伤模型组、阳性对照组和葛根复合胶囊（CCPL）低、中、高剂量组，适应性喂养7d后，阳性对照组按800mg/kg灌胃给予护肝片水混悬液；葛根复合胶囊组分别按100，300，500mg/kg灌胃给予葛根复合胶囊水溶液（10mL/kg），其余（除空白对照组）各组小鼠在给药后1h，50%酒精12mL/kg灌胃；6周后测定正常组，模型组，阳性对照组， CCPL低、中、高剂量组ALT、AST（U/L）分别为：41.60±9.57、94.50±19.24；65.30±13.52、140.70±26.35；49.58±8.37、112.53±19.68；60.20±11.95、128.50±27.12；57.80±10.87、121.10±24.68；50.60±10.13、109.60±21.99（p<0.01）。综上可见葛根素可一定程度改善转氨酶活性，但其保肝效果与剂量呈相关性。
2.抗氧化护肝作用
研究表明，当机体受到内外环境刺激时，可不断产生对机体有一定影响的自由基如O-2、过氧化氢（H2O2）等，为保护机体免受损伤，机体自身可产生如SOD、GSH-Px等抗氧化物质，一定程度上对抗自由基。而葛根素可逆转SOD、GSH的降低，增加氧自由基的清除，从而起到保肝的作用。冯琴以酒精造模全程8周，葛根素灌胃干预5周，测得对照组、酒精模型组、葛根素组SOD（U/mg prot）分别为：133±11；99±12；127±6（p<0.05），发现葛根组的肝组织SOD活性显著高于模型组并接近正常水平，表明葛根素逆转SOD降低，对抗自由基保护肝细胞。王思为]以采用灌胃50%酒精（12mL/kg）的方式建立小鼠急性酒精性肝损伤模型，以不同剂量（100，300，500mg/kg）葛根复合胶囊（CCPL）灌胃6周后，测得正常组，模型组，阳性对照组，CCPL低、中、高剂量组GSH-Px（U/mg prot）分别为：65.2±10.60；43.80±6.89；55.92±9.76；47.10±9.35；51.30±9.22；56.70±10.80。表明葛根素可以定程度上逆转GSH降低，对抗自由基氧化作用，从而保护肝细胞。
3.抗纤维化护肝作用
肝纤维化（AF）是酒精性肝损伤后期最常见的病变，而血清HA、PCⅢ及LN能反映AF的程度。葛根素可一定程度上对抗肝纤维化，延缓肝损伤病情进展。曲智威以正常对照组：玉米油组（玉米油+50%葡萄糖20ml/kg.d）、模型组（玉米油+40%乙醇8g/kg.d），持续造模16周，引起慢性肝损伤，葛根素组（40%乙醇
8g/kg.d+10mg/kg.d葛根素）腹腔注射16周后，测得型组、葛根素组，对照组的血清HA、PCIII、LN分别为167.6±16.6、190.5±11.1、92.7±11.2；91.6±10.9、16.7±12.9、78.5±9.2；46.9±10.8、85.3±10.2、38.9±8（P<0.05）。可以看出葛根素能降低肝硬化血清HA、PCⅢ及LN水平，延缓肝细胞纤维化，保护肝细胞。
小结
综上，葛根素通过改善转氨酶活性、对抗自由基氧化损伤，抗纤维化一定程度上保护肝细胞已被广大学者所证实。但仍有许多问题有待改善。1、葛根素的护肝作用与剂量有一定的相关性，治疗剂量范围仍不确定。2、葛根素长期治疗肝损伤的案例较少，其作用效果仍有待证实。3、葛根素对于晚期肝损伤的治疗效果的报道较少，其效果仍有待继续探索。
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作者简介：刘永强（1992-），男，湖南省郴州市人，长沙医学院本科在读。
神经白细胞素 篇5
1 材料与方法
1.1 动物及试剂 出生1 d～3 d Sprague-Dawley大鼠,河北医科大学实验动物中心提供,清洁级,质量许可证号:SCXK(冀)2008-1-003,雌雄不限;DMEM培养基(Gibco公司,美国),AngⅡ(Sigma公司,美国),胰蛋白酶(Sigma公司,美国),胶原酶Ⅱ(Invitrogen公司,美国),ERK1/2抗体(购自武汉博士德公司),姜黄素(北京博奥森生物技术有限公司生产,纯度大于95.5%),其他试剂为分析纯产品。
1.2 新生大鼠心肌细胞培养 取1 d～3 d新生Sprague-Dawley大鼠,在超净工作台上常规手术取心室肌组织,用4 ℃ D-Hanks液洗净残血,将心室肌剪碎,用0.1%胰蛋白酶加0.04%胶原酶Ⅱ连续消化成单细胞悬液,所有心肌细胞原液经200钼细胞筛过滤,差速贴壁1.5 h,将未贴壁的心肌细胞用含10%胎牛血清及青霉素、链霉素DMEM培养液稀释成1×108/L,并加入0.1 mmol/L Brdu抑制非心肌细胞增殖,然后将细胞均匀地接种于6孔培养板,每孔2 mL,置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养2 d,然后换无血清培养液。
1.3 实验分组 乳鼠心肌细胞于无血清DMEM继续培养24 h后,分成3组,对照组、AngⅡ组(10-6 mol/L)、姜黄素组(AngⅡ 10-6 mol/L+姜黄素2.5×10-8 g/L)。
1.4 心肌细胞蛋白合成速率测定 心肌细胞在无血清培养液中培养24 h后,加入各种干预因素和18.3 kBq[3H]-亮氨酸继续培养24 h。弃培养液,PBS冲洗3遍,用0.1%胰蛋白酶消化后收集细胞于玻璃纤维素膜上,用10%的三氯乙酸固定,滤膜烘干后用LS-3810液体闪烁仪测定掺入量。
1.5 心肌细胞蛋白的提取 终止细胞培养,将培养板中的培养液吸出,用预冷PBS洗培养物3次,弃去PBS。用细胞刮棒刮培养孔底部,将贴壁细胞刮下来用冰PBS收集以1 500 r/min～3 000 r/min离心6 min～10 min,去上清。向沉淀加入心肌细胞裂解液100 μL和PMSF 1 μL,冰上裂解30 min,每10 min吹打一次。12 000 r/min离心15 min,移上清于1 mL的EP管中,-80 ℃冰箱保存。
1.6 免疫印迹法(Western blot)检测ERK1/2蛋白表达 用Bio-Rad的蛋白定量试剂盒测蛋白浓度,完毕后将之加入5×SDS加样缓冲液中煮沸5 min,以使蛋白质样品变性,然后置于-80 ℃冻存备用。用12%十二磺基硫酸钠/聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞蛋白,用电转移方式将蛋白转移至硝酸纤维膜上,用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h,加入一抗(1∶1 000),4 ℃过夜,次日用TBST洗3次后,加入二抗(1∶2 000),孵育1 h,TBST洗3次,ECL发光,压胶片曝光,对所得条带进行扫描。
1.7 统计学处理 应用SPSS 11.0软件,数据以均数±标准差
2 结 果
2.1 各组心肌细胞蛋白合成速率
AngⅡ组(2 282.32 cpm±245.48 cpm)较对照组(1 313.64 cpm±202.58 cpm)显著增加(P<0.01),姜黄素组(1 761.62 cpm±212.44 cpm)较AngⅡ组显著降低(q=48.42,P<0.01)。
2.2 各组心肌细胞ERK1/2的表达
AngⅡ组ERK1/2(456.5±83.3)表达较对照组显著增加(190.5±25.3,θ=35.14,P<0.01),而姜黄素组较AngⅡ组显著降低(216.2±19.6,θ=19.64,P<0.01)。
3 讨 论
血管紧张素Ⅱ作为一个重要的神经内分泌因子,不仅能够控制心血管系统的生理功能,对心肌肥大或心力衰竭的病理生理过程也能起到至关重要的作用。MAPK通路是一条重要的胞内信号转导通路,参与AngⅡ诱导的心肌肥大反应[5]。它主要包括ERK、应激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase/c-Jun N-terminal kinase,SAPK/JNK) 、p38MAPK 3种;ERK途径是细胞生长、分化与存活等过程的重要信号转导机制,其中ERK1/2与心肌细胞肥大关系最为密切[6],ERK主要由Raf通过Ras激活,磷酸化ERK是其活化形式。其活化后转位到核内,作用于下游的转录因子ELK、AP-1、NF-κB等,调节引起心肌肥大相关的基因(如c-fos、c-myc、c-jun)的转录。研究发现AngⅡ可诱导ERK磷酸化,从而活化ERK通路引起心肌肥大反应的发生。延缓由细胞外信号引起的肥大进程是任何控制肥大的治疗措施的关键[7]。姜黄素是从植物姜黄、郁金、莪术等植物根茎中提取的一种生物多酚化合物。具有行气破血、消积止痛、清心解郁等功效。具有抗氧化和清除自由基、抗血小板、调节血脂、抗动脉粥样硬化、抗炎、抑制血栓形成等广泛的药理作用,并且具有肝脏及肾脏保护功能,毒副反应小。姜黄素还可改善压力超负荷兔的心功能[8]。因而推测姜黄素在治疗心力衰竭等心血管疾病方面有着广泛的应用前景。
本研究结果显示,AngⅡ可显著增加新生大鼠心肌细胞蛋白合成速率,而姜黄素可显著抑制心肌细胞蛋白合成速率,说明姜黄素可抑制AngⅡ所致的心肌细胞肥大。AngⅡ可显著增加心肌细胞ERK1/2的表达,姜黄素使ERK1/2表达显著降低,说明姜黄素可能通过降低胞内信号转导分子ERK1/2的表达,实现防止心肌细胞肥大的作用。下一步研究要着重于姜黄素对ERK信号通路的上下游分子的影响,进一步阐明姜黄素抗心肌肥厚的机制,为其在临床用于心肌肥厚的防治提供实验依据。
姜黄素可抑制AngⅡ诱导的心肌细胞核内信息分子ERK1/2的表达,这可能是姜黄素抗心肌肥大的重要机制之一。
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神经白细胞素 篇6
1 资料与方法
1.1 一般资料
100例血管神经性头痛的患者, 纳入标准:均符合2004年国际头痛学会制定的《头痛疾病国际分类诊断标准》, 并经脑电图、经颅多普勒 (TCD) 、头颅CT等确诊, 提示“脑血管痉挛”及“脑动脉供血不足者”;所有患者言语交流功能正常;心、肝、肺、肾等重要脏器功能良好;均同意治疗方案;近期内未服用过抗癫痫、抗精神病、钙通道阻滞剂、β-受体阻滞剂等药物。排除标准:继发性头痛患者;有颅脑外伤、颅脑占位性病变或其他疾病所致头痛病史;孕妇或哺乳期妇女;精神病史;对抗头痛药物成瘾或依赖者;重症肝肾疾患者。入组患者均需签署知情同意书。将该组患者采用抽签的方法随机分为观察组和对照组, 每组50例。观察组中男27例, 女23例, 年龄45~74岁, 平均年龄 (58.3±16.5) 岁。病程10~14 d, 平均病程 (12.5±2.5) d。对照组中男26例, 女24例, 年龄44~75岁, 平均病程 (57.2±17.3) 岁。病程8~15 d, 平均病程 (13.2±3.2) d。两组的一般资料方面比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。
1.2 治疗方法
两组的治疗原则均给活血、营养神经、抗血小板等治疗。①对照组:盐酸氟桂利嗪口服5 mg/次, 每晚1次。阿司匹林, 口服0.1 mg, 1次/d。②观察组:在对照组的基础上采用天麻素注射液 (昆明制药有限公司, 国药准字H20013046) 治疗, 天麻素注射液600 mg加入5%葡萄糖注射液250 ml中静脉滴注。两组均以10 d为1个疗程。1个疗程后进行疗效及安全性的评价。
1.3 观察指标
1.3.1 疗效的判定标准[2]
对患者头痛发作的情况进行评分, 总分0~10分, 其中0~1分为无头痛;2~4分为:头痛发作次数<15次/月, 轻度头痛, 每次发作持续时间24 h以内;5~7分为:发作次数15~30次/月, 中度头痛, 每次发作持续时间24 h以上;8~10分为:重度头痛, 每天持续发作。其中治愈:头痛及其他伴随情况消失, 随访3个月有复发。显效:症状明显好转, 评分降低50%以上。有效:症状有所改善, 评分降低21%~50%。无效:未达到以上标准。总有效率= (治愈+显效+有效) /总例数×100%。
1.3.2 安全性评价治疗前后进行一次血尿常规、肝肾功能检查、详细询问患者的不良反应, 包括不良反应的种类、程度, 是否需要停药或特殊方法处理等。
1.4 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件对数据进行处理。计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 采用t检验;计数资料以率 (%) 形式表示, 实施χ2检验。检验水准α=0.05, P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者治疗效果比较
观察组治愈20例, 显效18例, 有效8例;对照组治愈9例, 显效17例, 有效10例。观察组总有效率为92.0%高于对照组的72.0%, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。
2.2 两组患者的不良反应及复发率比较
两组患者治疗期间均未见明显不良反应出现, 均为轻中度反应, 未影响正常治疗。观察组中有口周麻木1例, 厌食、恶心1例, 嗜睡2例, 不良反应的发生了为8.0% (4/50) 。对照组中有厌食、恶心1例, 皮疹1例, 不良反应的发生率为4.0% (2/50) 。两组治疗期间不良反应的发生率比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。两组均随访6个月, 观察组的复发率为14.0%低于对照组的28.0%, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。
组别例数不良反应复发率
注:与对照组比较, aP<0.05
3 讨论
目前, 血管神经性头痛的致病原因尚不清楚, 可能是由于大脑皮层功能失调以及血管舒缩功能障碍所致。该病易反复发作, 迁延不愈。血管神经性头痛属于中医学的“厥头痛”范畴, 多见于老年人, 主要病机为寒、湿、痰、火、虚等致病因素致使气血运行失畅[2]。天麻具有平肝潜阳熄风作用, 天麻素为兰科植物天麻的干燥根块提取, 是治疗神经衰弱、失眠、头痛症状有等疾病的主要药物, 它主要含有香荚兰醇、香荚兰醛、苷类和生物碱类物质, 对中枢神经系统作用突出, 具有明显的镇静催眠作用, 并能对抗咖啡因的中枢兴奋作用, 可扩张血管, 抗血小板聚集和改善微循环[2]。有研究发现, 天麻素联合氟桂利嗪能够减少血管神经性头痛的发作频率、头痛持续时间及头痛程度, 而且安全性较好[3]。本研究的结果也表明, 观察组的患者疗效高, 复发率低, 均优于对照组。而且天麻素的使用并未增加患者的不良反应。
综上所述, 天麻素能够提高血管神经性头痛的治疗效果, 且不良反应少, 值得临床推广。
参考文献
[1]郭兵, 沈艳.天麻素注射液治疗眩晕81例临床观察.中国当代医药, 2010, 17 (4) :78.
[2]潘金山, 乔钦增, 张永红.天麻醒脑胶囊联合氟桂利嗪治疗血管神经性头痛的临床研究.世界中西医结合杂志, 2013, 8 (7) :693-695.
神经白细胞素 篇7
白杨素是一种在多种植物中广泛存在的黄酮类化合物,具有抑制CK2和抗肿瘤作用[5,6]。新近的研究提供证据表明,白杨素类似物即8- 溴 -7- 甲氧基白杨素具有逆转宫颈癌干细胞样细胞上皮 - 间充质转化和抑制肝癌干细胞自我更新作用[7]。本文检测白杨素是否抑制人肺癌H1299细胞系干细胞样细胞肿瘤球形成,并探讨其作用机制是否涉及CK2α、Notch1和CD44蛋白表达下调。
1材料与方法
1.1细胞培养
人非小细胞肺癌H1299细胞系细胞购自中国科学院细胞库(中国上海市),细胞用添加10%热灭活胎牛 血清 , 青霉素 (100μg/m L) 和链霉素 (100μg/m L)的DMEM/F12培养基,在含5%二氧化碳CO2的37℃增湿培养箱中培养和扩增。
1.2细胞成球培养
为了获得H1299细胞系球形成细胞,用添加20 ng/m L碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor, b FGF) (Pepro Tech公司)、20 ng/m L表皮生长因子 (epidermal growth factor, EGF)(Pepro Tech公司)、5μg/m L胰岛素 (Sigma-Aldrich公司)、0.4%牛血清清蛋白 (BSA,Invitrogen公司)和0.02×B27添加物(Invitrogen公司)的无血清DMEM/F 12培养基接种于超低黏附6孔板悬浮培养细胞,细胞密度为105个 /m L。每3天补充培养液1.0 m L。培养9 d,收集球形成细胞,分散成单细胞悬液并再悬浮于新鲜干细胞条件培养基中进行传代培养。
1.3肿瘤球形成率测定
为了测定白杨素(美国Sigma公司)对肿瘤球形成率的影响,细胞以1 000个 /m L的密度接种于超低黏附24孔培养板,每孔1 m L。培养9 d,计数肿瘤球数。肿瘤球形成率(%)= 每孔肿瘤球均数 / 每孔接种活细胞数(1000)×100%。
1.4siRNA转染
CK2α si RNA与对照si RNA为美国Thermo Scientific公司(Waltham,MA)产品。按照厂商的说明 , 使用阳离 子脂质体RNAi MAX(Invitrogen, Carlsbad,CA)用50 nmol/L si RNA转染细胞。Western blot分析确证si RNA敲除效率。
1.5Westernblot分析
参照文献[7]的方法,用裂解缓冲液 (50 m M Tris-HCl (p H 7.4)、150 m M Na Cl、0.2 m M EDTA、 0.2% NP-40、10% 甘油、1 M β-Me、1μg/m L抑肽酶、0.1 m M Na3VO4、0.5 m M 4NPP、0.5 m M Na F和蛋白酶抑制剂)裂解细胞。Bradford法测定蛋白含量。 10% SDS- 聚丙烯凝胶电泳分离蛋白并转移至聚偏氟乙烯膜 (PVDF)。用含5%脱脂牛奶PBST封闭PVDF膜,抗 -CK2α(Millipore公司)、抗 - 活化型Notch1和抗 -CD44 (Cell Signaling,Beverly,MA)以及抗 -β-actin(Sigma公司)抗体作为一抗,在4℃、 轻微震动条件下孵育PVDF膜过夜。然后,用过氧化物酶连接二抗孵育膜1 h,根据厂商说明书的操作步骤,用增强化学发光仪(Amersham Biosciences)检测信号。
1.6统计学方法
数据以均数±标准差(±s)表示。应用SPSS 13.0 Windows软件系统(SPSS Inc,Chicago,IL)分析所有数据。Student’s t- 检验用于比较各组间的差异。P <0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1肺癌H1299细胞系球形成细胞具有自我更新特性
干细胞条件培养基悬浮培养法结果显示: H1299细胞系能形成非粘附性肿瘤球(图1A),称为球形成细胞。球形成细胞传代培养结果证明:分散的单个细胞能形成新肿瘤球,以第3代球细胞的肿瘤球形成率最高(图1B)。提示:H1299细胞系球形成细胞具有自我更新能力。因此,在后续试验研究中,我们以H1299细胞系第3代球形成细胞作为肺癌干细胞样细胞模型。
2.2白杨素有效减弱H1299细胞系球形成细胞自我更新能力
肿瘤球形成率检测结果证实:Ch R (5、10和20μM) 处理H1299细胞系第3代球形成细胞72 h,肿瘤球形成率以浓度依赖降低(图2)。说明:Ch R有效减弱H1299细胞系球形成细胞自我更新能力。
2.3白杨素抑 制H1299细胞系球 形成细胞CK2α、Notch1和CD44蛋白表达
Western blot分析结果表明:Ch R浓度依赖性下调H1299球形成细胞CK2α、Notch1和CD44蛋白表达(图3)。
2.4CK2α沉默下调Notch1及其靶基因蛋白表达
Western blot分析结果 发现 :CK2α 特异性si RNA转染H1299细胞系球形成细胞导致CK2α 蛋白水平明显下调(图4,上泳道);Notch1和CD44蛋白水平下降(图4,中泳道和下泳道)。
2.5CK2α抑制增强白杨素抑制Notch1及其靶基因蛋白表达作用
Western blot检测发现:与对照si RNA转染细胞相比。CK2α si RNA转染与10μM Ch R合用导致H1299细胞系球形成细胞CK2α、Notch1和CD44蛋白表达水平进一步下降(图5)。
2.6CK2α抑制协同白杨素降低肿瘤球形成率
肿瘤球形成法检测结果表明:CK2α si RNA转染导致H1299球形成细胞的肿瘤球形成率下降(图6),并显著增强Ch R(10 μM)降低H1299球形成细胞肿瘤球形成率作用(图6)。
3讨论
本文的实验结果显示:在人肺癌H1299细胞系球形成细胞,多功能蛋白激酶CK2为Notch1信号正性调节因子。其证据包括:首先,CK2α si RNA转染抑制CK2α 导致Notch1蛋白水平下降。其次, CK2α 敲除引起Notch1信号靶基因(CD44)产物表达下调。第三,CK2α 敲除导致人肺癌H1299细胞系球形成细胞的肿瘤球形成率降低。
已有研究报道称Notch1能被CK2在丝氨酸1901处磷酸化并且这种磷酸化负性调节Notch1转录活性[8]。CK2磷酸化Notch1第2个丝氨酸位点 (S847) 有可能增强Notch1蛋白稳定性[8]。ZHANG等[4]通过CK2α si RNA处理后的蛋白降解试验证明, CK2α 沉默缩短A549细胞Notch1蛋白半衰期;说明这种CK2对Notch1的正性调节作用部分归因于减少蛋白降解。然而,CK2正性调节Notch1信号精确分子机制尚待深入研究。
已有研究报道,在非小细胞肺癌H1299细胞系,球形成细胞富集表达CD44干细胞样细胞[9]。本文的研究结果亦证实,H1299球形成细胞具有自我更新特性,并高表达干细胞标志物CD44蛋白。特别值得注意的是,来源丰富的黄酮类化合物白杨素显著抑制H1299细胞系球形成细胞自我更新能力,并与CK2α si RNA转染协同性下调CK2α、Notch1和CD44蛋白表达。这些结果为应用小分子CK2α 抑制剂调控Notch信号靶向抑制肺癌干细胞样细胞特性治疗人非小细胞肺癌提供了合理性解释。
摘要：目的 观察白杨素是否抑制人肺癌H1299细胞系干细胞样细胞肿瘤球形成能力,并探讨其作用机制是否涉及CK2α表达和Notch1信号。方法 干细胞条件培养基悬浮培养与扩增H1299细胞系球形成细胞作为肺癌干细胞样细胞。不同浓度白杨素处理,肿瘤球形成法检测H1299球形成细胞的肿瘤球形成率;Western blot分析CK2α、Notch1和CD44蛋白表达。CK2αsi RNA转染探讨白杨素作用机制。结果 白杨素(5、10和20μM)处理H1299球形成细胞72 h,肿瘤球形成率以浓度依赖方式降低;CK2α、Notch1和CD44蛋白表达下调。CK2αsi RNA转染H1299球形成细胞导致Notch1信号抑制,并协同白杨素抑制肿瘤球形成。结论 白杨素具有抑制肺癌干细胞样细胞肿瘤球形成作用,其作用机制涉及下调CK2α表达抑制Notch1信号传导。
神经白细胞素 篇8
1 IAPs凋亡抑制蛋白
现已鉴定的人类IAPs家族成员有8种:XIAP、cIAP1、cIAP2、NIAP、Apollon、ML-IAP、Survivin和ILP-2。IAPs的功能不仅局限在对Caspase的抑制作用上, 在细胞周期调节、蛋白降解和Caspase非依赖的信号转导过程中起着重要的作用。IAPs主要受三方面机制的调控:转录水平、转录后翻译水平、翻译后加工。在转录方面, Survivin的产生有细胞周期依赖性, 在正常细胞中产生于G2/M期, cIAP和XIAP受核转录因子NF-kB的调控, 在大多数情况下, NF-kB的激活能产生生存信号, 其原因之一就是通过NF-kB的激活, 促进凋亡蛋白的基因转录, 这些基因有cIAP2、XIAP和Bcl-2家族的几个成员。
2 Bcl-2蛋白家族
在肿瘤细胞凋亡的过程中, Bcl-2家族蛋白是凋亡的关键调控者, 按照其结构和功能可将Bcl-2家族分为3个亚家族:①促凋亡BH3only亚家族, 主要包括Bim、Bad、Puma、Bik、Bmf和Noxa;②促凋亡Bak亚家族, 主要包括Bax、Bok和Bak;③抗凋亡Bcl-2亚家族, 主要包括Bcl-2、Mcl-1和Bcl-xl, 该家族蛋白主要分布于线粒体外膜、核膜和内质网膜上。Bcl-2家族蛋白主要通过两种机制在线粒体上发挥作用:一是Bcl-2家族蛋白成员精确地改变线粒体膜的通透性;二是通过感受从内质网中释放出来的钙离子, 诱导产生线粒体的PT通道, 导致细胞凋亡[1]。BH3only蛋白的活性可在凋亡信号刺激下受各种机制调节, 包括转录和翻译后调控, Hrk、Bim、Noxa和Puma主要受转录控制, 而Bad主要通过14-3-3蛋白使其磷酸化, Bid则被Caspase-8水解产生活性截短产物tBid。
3 p53
p53是一种抑癌基因, 它的生物学功能是在G期监视DNA的完整性, 当细胞有损伤时, 它会抑制细胞增殖, 直到DNA修复完成, 如果DNA不能修复, 则诱导其凋亡。p53通过调节Bcl-2家族促凋亡分子的转录来调节细胞色素C的释放进行诱导细胞凋亡, 也可以通过转录非依赖机制来诱导细胞凋亡, p53诱导的线粒体凋亡非依赖转录机制有三方面:① p53能与Bax结合, 使其激活和多聚化;② p53能直接与Bcl-2和Bcl-XL结合, 从而阻断其与Bcl-2家族促凋亡分子的结合;③ p53与Bak结合, 阻断Bak与Bcl-2家族的抗凋亡分子Mcl-1结合并导致凋亡[2]。p53的清除率非常高, 通常在细胞中有很少的活性蛋白, p53内在的结构点是决定其活性和稳定性的关键。此外, p53蛋白的活性和水平也受调控蛋白的调节, 其中蛋白激酶、分子伴侣HSP90和功能颉颃剂Mdm2对调节p53的活性和稳定性起重要作用。
4 Caspase家族蛋白
经典的凋亡过程包括线粒体途径和死亡受体途径, 它们通过激活一系列蛋白酶来促进凋亡的发生。在此过程中, Caspase在凋亡过程中发挥重要的作用, 这些蛋白酶是引起细胞凋亡的关键酶, 一旦被信号途径激活, 便能迅速将细胞内的蛋白质降解, 使细胞迅速凋亡。Caspase以无活性的酶原形式存在于体内, 活性较低, 在凋亡过程中, Caspase通过蛋白的水解切割使之由无活性的酶原转变为有活性的酶[3]。
5 肿瘤细胞凋亡的途径
虽然姜黄素能够诱导多种肿瘤细胞凋亡, 但是对其凋亡机制的研究甚少, 作用机制不是十分明确, 姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的途径可能有以下几种。
5.1 阻遏细胞周期
细胞周期与细胞癌变不是独立事件, 细胞周期的失控在肿瘤发病中极为重要。标准的细胞周期按G1-S-G2-M的顺序进行。在细胞周期中存在着G1/S和G2/M检测点, 当机体生长条件不适应或内外因素对细胞基因组DNA的完整性造成损害时, 细胞通过G1/S和G2/M检测点时受阻, 但可通过修复受损基因组越过检测点继续发育, 完成增殖周期, 同时能启动凋亡系统清除受损细胞。Hanif R等的研究表明, 姜黄素能呈剂量依赖性降低结肠癌细胞HT-29的增殖率, 将细胞阻滞在G2/M期, 但未发生凋亡。Aggarwal S等研究发现, 姜黄素抑制头颈鳞状细胞癌MDA686LN细胞的增殖, 出现G1/S期停滞。Chen H W等研究发现, 姜黄素处理鼠血管平滑肌细胞A7r5可发生G0/G1期停滞。
5.2 影响肿瘤细胞凋亡相关基因的表达
姜黄素通过改变104种凋亡相关基因的表达 (其中明显上调的基因22种, 下调的基因17种) , 诱发乳腺癌MCF-7细胞的凋亡。Mukhopadhyay A等研究了姜黄素诱导人前列腺癌激素非依赖型DU145细胞及激素依赖型细胞LNCaP, 结果表明其凋亡与Bcl-2和Bcl-XL有关。Jee S H等研究发现, 姜黄素可以诱导人基底细胞癌凋亡, 作用12 h时观察到p53的上调, 24 h达到峰值。而Mehta K等[4]人的研究表明姜黄素对多株乳腺癌细胞的生长抑制与凋亡相关基因Bcl-2、p53、cyclin B及谷氨酰胺转移酶无关。Bush J A等[5]用姜黄素处理多种人黑色素细胞株后发现有8种细胞株诱导了凋亡, 但并不是通过诱导p53来实现的。
5.3 下调NF-κB活性
研究表明, 姜黄素可有效地抑制肿瘤坏死因子 (TNF) 和血小板-单核细胞聚合体 (PMA) 诱导的NF-κB的活化。姜黄素抑制NF-κB活化的机制可能是抑制诱导IκBα磷酸化的激酶活性。Nagai S等[6]研究表明, 姜黄素通过抑制NF-κB的活性来抑制5种恶性星形细胞瘤的生长。Tomita M等研究发现, 姜黄素通过下调NF-κB的活性抑制IKappaB的磷酸化, 从而抑制了人类T淋巴细胞白血病病毒感染的T淋巴细胞的生长。Collett G P等[7]人的研究表明, 姜黄素诱导人结肠癌HCT116细胞凋亡是通过抑制NF-κB的活化来实现的。Bharti等研究表明, NF-κB及STAT3在来源于多发骨髓瘤的CD138+细胞中呈活化状态, 姜黄素通过阻制核转录因子NF-κB的活性抑制细胞的生长, 发挥抗癌作用。
5.4 抑制COX-2的表达
环氧合酶 (COX) 是催化花生四烯酸转化为重要活性物质前列腺素初始步骤的关键限速酶。该酶有COX-1和COX-2两种亚型。近年来大量研究表明, COX-2除参与炎症反应外, 其过度表达与多种肿瘤的发生、发展关系密切。Goel A等[8]发现姜黄素可抑制人类结肠癌HT29细胞的生长, 抑制作用呈时间、剂量效应关系, 并能抑制COX-2 mRNA和蛋白的表达, 却不影响COX-1的表达水平。Tunstall R G等通过给患有家族性腺瘤息肉病的小鼠喂饲姜黄素14周, 结果表明姜黄素抑制了小鼠腺瘤的生长。小鼠腺瘤组织Western-blot分析结果表明, 姜黄素抑制了COX-2蛋白表达, 抑制率为66%。Takada Y等研究表明, 姜黄素可以抑制肿瘤坏死因子诱导的NF-κB激活, 进而抑制COX-2和细胞周期蛋白D1表达, 抑制作用呈剂量依赖性, 最终达到抗肿瘤细胞增殖的作用。
6 前景与展望
虽然现在对姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的研究取得了一定的进展, 了解了其诱导凋亡的作用机制, 但由于受科技发展水平的限制, 要弄清姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制还需要时间。总之, 研究姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡将会为临床各种癌症的治疗提供理论依据, 也会为中药的发展夯实基础, 因此研究姜黄素诱导肿瘤细胞凋亡具有广阔的发展前景。
参考文献
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神经白细胞素 篇9
1 脑梗死中医证型的相关性研究
缺血性中风证候的研究也一直得到众多医家的关注。杨利等在研究急性缺血中风的证候分布时发现,风痰瘀血痹阻脉络证型及气虚血瘀证型较为常见,分别占49.6%和17.3%,缺血中风的证型以阴类证为多。郦永平研究发现缺血中风证型分布呈极度偏态,大多集中在风痰阻络,约占75.3%。关少侠等从血浆内皮素(ET)的角度探讨其与急性缺血性中风始发状态风证的关系时发现脑梗塞后脑血流量不同程度的下降与血浆内皮素(ET)显著升高有关。马聪敏等发现ET及β-EP水平在肝阳暴亢、痰热腑实及风痰阻络三个实证中明显高于阴虚风动、气虚血瘀两个虚证。杜凯音等发现血清IL-6含量在气虚血瘀、阴虚风动组与风痰瘀血、痹阻脉络组大于肝阳暴亢、风火上扰组与痰热腑实、风痰上扰组,认为瘀证、虚证的血清IL-6含量要高于实证。李保东等[7]发现中风患者的血浆TXB2值与其虚、实辨证相关,而血浆6-keto-PGF1α值与中风病的辨证分型无相关性。
2 现代西医对脑梗死的认识
2.1 CRP与缺血性脑血管病:C-反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是机体组织损伤或炎症急性期在血清中出现的一种反应物。是肝脏在肿瘤坏死因子、白细胞介素-1(IL-1)以及白细胞介素-6 (IL-6)等细胞因子的作用下合成的五聚蛋白,在一定程度上代表炎性因子的变化。CRP最早于20世纪30年代初在急性感染性疾病患者的血清中被发现,由于它能与肺炎球菌细胞壁上的C-多糖起沉淀反应,故而称之为C-反应蛋白。正常健康人体中CRP含量极微,但在严重感染、物理损伤、动脉粥样硬化、血管损伤、缺血和坏死等情况下其血中CRP浓度可升高至正常值的1000倍。
研究发现,动脉粥样硬化作为缺血性卒中的基础病变,不仅指脂质聚积,而且是一个慢性炎症过程,粥样硬化斑块的炎症反应是斑块破裂的重要促发因素。而CRP是炎症的一种敏感性指标,CRP本身可以促进单核细胞释放组织因子,这势必会加强局部血栓形成,加重缺血。故CRP可作为观察动脉粥样硬化疾病发生的微观指标。Dirnagl等[11]通过研究发现CRP水平可反映缺血性脑卒中病理相关的炎性反应程度,较强的炎性反应也可以加速梗死区半暗带的恶化,加重脑损伤。还有,Framingham发现CRP水平高者发生缺血性脑血管病的危险性男性要高2倍,女性高3倍。郭毅等发现并不是每一个脑卒中患者都会导致全面的炎性反应,引起CRP水平的升高,只有那些脑卒中后有较强炎性反应的患者,其预后较差,死亡率也较高。目前认为,CRP作为脑卒中预后的一个较有价值的标志物,可以独立预测脑卒中的死亡率及其心血管病变的发生率,其可能的机制有:①CRP能增加动脉粥样硬化的危险性;②凝血纤溶系统及血小板功能的激活与CRP水平升高患者卒中的发生部分有关;③CRP可激活补体系统,参与炎症反应和组织损伤,促进血栓形成。
CRP与动脉粥样硬化的危险因素也有一定的相关性,目前认为CRP与甘油三酯水平的内在联系与细胞因子的作用有关,特别是白细胞介素-6,它不仅可以调节CRP产生,还可增加肝脏合成甘油三酯;Heilbroon等报道CRP与肥胖也有一定的关系,体重下降7.9㎏,CRP水平可下降26%;Yudkin等发现C反应蛋白水平升高还与胰岛素抵抗及内皮功能不良有关,这些都有助于动脉粥样硬化的发生及发展。还有学者发现CRP与脑卒中后抑郁的发生及其严重程度呈正相关。
2.2 纤溶系统与缺血性脑血管:人体的纤溶系统主要包括纤溶酶原、纤溶酶、纤溶酶原激活剂(plasminogen activator,PA)和纤溶酶原激活剂抑制剂(plasminogen activator inhibitor,PAI)。纤溶酶的转化主要依赖于血浆中游离的t-PA和PAI-1的活性。组织型纤溶酶原激活剂(tissue type plasminogen activator,t-PA)是由血管内皮细胞合成的一种丝氨酸蛋白酶,多在肝脏中灭活。它包括527个氨基酸、三条糖链,可被纤溶酶、激肽释放酶或凝血因子X所激活。t-PA不仅能激活纤溶酶原使之转变为纤溶酶,从而激活纤溶系统;同时还能特异性的结合在纤维蛋白凝块上,加强纤溶效应。纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI)是一单链糖蛋白,可分为多种,以纤溶酶原激活剂抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)为主。成熟的PAI-1含379个氨基酸,多在肝脏中灭活。PAI-1是t-PA的抑制剂,血管内皮细胞、平滑肌细胞与血小板等均能合成PAI-1。血管内皮细胞合成和释放的纤溶酶原激活剂(PA)和纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI)间的动态平衡发生障碍是血液纤溶系统活性降低的重要原因。纤溶系统活性降低或血液凝固性增高,凝血产物就容易堆积在血管中,使脑血管受阻或中断,临床上的可以发生缺血性脑血管病。
2.3 炎症与纤溶系统:有研究发现脑梗死急性期的炎症与纤溶系统活性存在一定的关系。炎症反应始终贯穿脑梗死发生发展的全过程。作为炎症标志物的CRP可促使动脉的内皮细胞产生较高水平的纤溶酶原抑制剂-1(PAI-1),从而引起动脉内膜的损伤,最终导致板块和血栓形成。卒中患者的纤溶系统及血小板功能的激活与CRP水平升高有部分相关,CRP水平的增高可以通过组织因子的表达影响凝血机制,凝血因子的激活可以使脑卒中患者的死亡率增加。Tohgi等的研究表明缺血性卒中急性期(24h内)CRP升高的患者凝血纤溶系统活性比CRP水平正常的患者和对照组明显增高,凝血酶-抗凝血酶复合物浓度较后两者分别高4倍和8倍,提示缺血性卒中患者的凝血纤溶系统及血小板功能的激活至少部分是通过增高的CRP实现的。
3 结语
综上所述,目前对缺血性中风的临床和实验研究均已取得了一定的进展。现代中医历来提倡辨证论治,随着现代科学的发展,祖国医学从微观世界不断地寻找新的出发点,以便提高脑梗死急性期辨证论治。但是,直到目前为止,我们对微观指标的研究仍然不够,尚未能全面地将这些微观指标推广运用到临床上,从而指导临床辨证论治。今后,我们应当注意加大研究的样本量,使研究的结果更接近临床,这对于临床及时有效的进行选方用药提供有力的依据,从而也促进了中医药在急性脑梗死领域的研究应用。
神经白细胞素 篇10
关键词：心肌梗死,肾上腺素能神经,葛根素,神经生长因子
在心源性猝死的发生机制中,心脏植物神经支配的改变是主要因素之一。其中,神经丛缺失最显著的改变就见于心肌梗死。若在心肌梗死早期有效地应用神经保护促进剂,有可能减少或延迟神经的变性和坏死,促进神经的再生和功能恢复,从而减少心肌梗死后的猝死事件。神经生长因子(nerve growth factor,NGF)能促进心脏交感神经的生长[1,2,3];葛根素(puerarin,Pue)能显著减少患者和大鼠心肌梗死面积[4,5]。本实验应用免疫组织化学技术,在大鼠心肌梗死后联合应用NGF和Pue注射液,观察其梗死区及周围区存活心肌中肾上腺素能神经纤维的分布密度,并比较各组间差异,从而探讨NGF和Pue联合用药是否能够明显减缓心肌梗死后的去肾上腺素能神经支配,保护心肌肾上腺素能神经,为中西药结合治疗心肌梗死提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物分组与模型建立
正常成年雄性Wister大鼠160只,由哈尔滨医科大学动物实验中心提供,体重(230±15)g。随机分为4组,每组40只,分别为假手术对照组、心肌梗死模型组、神经生长因子组和联合用药组。各组动物均以0.5%戊巴比妥钠6～8 m L/kg腹腔注射麻醉,开胸前描记肢体导联心电图。麻醉后在胸骨左缘0.5 cm处做一弧形切口,弓背向左上,挤出心脏,于肺动脉圆锥与左心耳之间高位结扎左冠状动脉前降支(LAD),将心脏迅速放回胸腔,闭合胸腔。假手术组挤出心脏后不予结扎前降支,直接放回胸腔。描记术后心电图,以I、II、AVL导联ST段弓背向上抬高为有急性左室前壁心肌梗死形成的标志。联合用药组术后同时给予Pue注射液(100 mg/kg)和NGF注射液(0.3μg/kg),1次/d。NGF组术后给予NGF注射液(0.3μg/kg),1次/d。心肌梗死模型组和假手术组术后不给予任何药物。
1.1.2 取材
各组分别于术后6 h、2、4、7和14 d取材,每个时间段组取8只。取材前描记肢体导联心电图,取材部位为左心室前壁梗死区以及梗死周围区的游离壁,假手术组取左心室游离壁,置于干冰-丙酮饱和溶液中速冻。
1.1.3 试剂
葛根素注射液,沪港新亚药业有限公司提供,批号20057407,每支100 mg;注射用鼠神经生长因子,厦门北大之路生物工程有限公司,批号20060802,每支4μg;兔抗鼠TH(Tyrosine Hydroxylase)多克隆抗体,SP试剂盒和DAB显色剂均由武汉博士德生物工程有限公司提供;其他为常规试剂。
1.2 方法
1.2.1 心肌肾上腺素能神经(TH阳性纤维)的测定
组织块做冷冻切片,厚10μm,每隔10片取1片,期间取4μm切片5片。10μm切片采用免疫组织化学SP法,兔抗鼠TH多克隆抗体,稀释浓度为1∶200。用PBS液代替一抗作阴性对照,将已知TH阳性切片作阳性对照。进行肾上腺素能纤维染色,结果在光镜下观察。4μm切片进行HE染色,作为镜下对照观察。
1.2.2 光镜观察和图像分析
光镜观察梗死区及梗死周围区肾上腺素能神经的分布,应用多功能真彩色病理图像分析系统(CMIAS)分析肾上腺素能神经的分布。
1.3 统计学处理
计量数据均以均数±标准差表示,应用简明统计软件10.1进行分析,组间比较采用方差分析的S-N-K检验,以P<0.05为差异具有显著性。
2 结果
通过免疫组织化学法染色,可见TH阳性纤维呈黄褐色点状或线状(点状居多,线状稀少)。假手术组左心室心肌纤维排列密集,于心肌纤维间沿长轴分布着黄褐色点状或线状的肾上腺素能神经纤维,其中沿血管分布最多。主要由散在的终末纤维及终末前纤维组成,可见少量的神经束及神经干。心肌梗死模型组术后6 h、2、4、7和14 d时,左心室心肌纤维排列疏松、紊乱,梗死区TH阳性纤维分布密度均比假手术组明显降低(P<0.01)。神经生长因子组术后7 d和14 d时,梗死区内显示有较多的TH阳性纤维分布,较心肌梗死模型组明显升高(P<0.01),与假手术组比较差异无显著性(P>0.05),且有较多炎性细胞浸润。联合用药组术后7 d和14d时,梗死区内显示有较多TH阳性纤维分布,与心肌梗死模型组梗死区TH阳性纤维密度比较差异有显著性(P<0.01);与NGF组及假手术组比较差异无显著性(P>0.05)。联合用药组和NGF组梗死周围区存活心肌中虽然还能见到TH阳性纤维分布较少的小区,但区分已不十分明显;NGF组梗死周围区TH阳性纤维分布明显增多;心肌梗死模型组梗死周围区TH阳性纤维呈局灶性分布,即在交界处有明显的分布降低区还有分布正常区,与假手术组比较差异有显著性。见附表和附图。
注:1)与假手术组比较,P>0.05;2)与假手术组比较,P>0.05;3)与假手术组比较,P<0.01;4)与心肌梗死模型组比较,P<0.01;5)与心肌梗死模型组比较,P<0.01;6)与NGF组比较,P>0.05
3 讨论
近年来,中西药结合治疗心肌梗死越来越受到临床医生的重视。目前,临床上对心肌梗死的患者给予葛根素主要是基于它能扩张冠状动脉血管,改善心脏缺血区的血流和改善缺血再灌流引起的心功能损害;改善心肌代谢,保护缺血心肌,促进侧支循环的建立[6,7]。神经生长因子是迄今为止研究得最清楚的神经营养因子之一。急性心肌梗死后,心肌缺血致心脏自主神经功能在空间及透壁分布的不均匀性,不同区域的受体的功能受到不同的影响致心肌细胞动作电位时程异常紊乱,心电极不稳定,QTD明显有利于折反环的形成,进而易发生心律失常[8]。在心肌损伤的早期对交感神经去支配进行干预,避免后继的交感神经增生和过度支配[9],可减少不良事件的发生。本研究在心肌梗死后早期联合应用葛根素和神经生长因子注射液,通过免疫组织化学方法显示,联合用药组梗死区7 d和14 d时心肌肾上腺素能神经分布密度较心肌梗死模型组明显升高,但与假手术组和神经生长因子组比较差异无显著性。本实验结果证明,Pue与NGF联合用药后确实能够明显减缓心肌梗死后的去肾上腺素能神经支配,有效地降低猝死率,其作用机制可能通过如下两个过程完成:(1)在心肌梗死后早期联合应用Pue与NGF,可有效、及时地建立正常的神经突触传递,改善缺血心肌组织及神经组织的血液供应和氧的供应,从而有效地促进功能损伤的神经的修复。(2)Pue与NGF共同作用于损伤或坏死的肾上腺素能神经,促进神经元胞体和突起的发育,加速神经元内许多亚细胞结构的形成,维持神经元生长和发育。
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