神经嵴干细胞

神经嵴干细胞（共4篇）

神经嵴干细胞 篇1

1 NSCs概述

1.1 NSCs的定义

Reynolds[1]等于1992年从小鼠纹状体分离出能在体外不断分裂增殖并具有多种分化潜能的细胞群, 第一次提出了神经干细胞的概念。1997年McKay[2]正式将神经干细胞的概念总结为:一类具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力, 能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞。

1.2 NSCs的来源

1.2.1 胚胎干细胞

胚胎干细胞是指当受精卵分离发育成囊胚时内细胞团的细胞, 它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。1981年, Evans和Kaufman[3]首次成功分离小鼠胚胎干细胞, 而后国内外研究人员进行了大量的研究, 而且证明在体外, 胚胎干细胞能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型, 为胚胎干细胞向神经干细胞的诱导分化打下了基础。目前, 胚胎干细胞向神经细胞的诱导分化的方法主要有以下几种: (1) Bain[4]等在维甲酸或生长因子处理下, 悬浮培养形成胚状体, 由此得到神经前体细胞或者神经细胞。然后用免疫细胞化学方法证实其是神经细胞, 并且在基因转录水平也同样检测证实。另外, 有研究表明将胚胎干细胞通过该方法诱导分化得到的神经干细胞移植到视网膜下腔后, 神经干细胞进一步分化为神经元网络结构和神经胶质细胞[5]。该方法的缺点是神经干细胞的产物中可能并存其他细胞谱系。 (2) 胚胎干细胞与中胚层来源的基质细胞共培养系统。Nakayama[6]等将鼠胚胎干细胞与神经胶质细胞共同培养, 得到大量的神经干细胞。 (3) 利用碱性成纤维细胞生长因子选择性扩增神经前体细胞的培养体系。碱性成纤维细胞生长因子能够促进早期神经前体细胞的增殖, Okabe[7]等根据这一特性建立利用碱性成纤维细胞生长因子选择性扩增神经前体细胞的培养体系。该方法解决了Bain方法的缺点, 是目前胚胎干细胞诱导分化为神经干细胞公认的方法。胚胎干细胞因受伦理道德、法律、潜在致瘤性和组织相容性等问题困扰, 限制了胚胎干细胞的来源和应用。

1.2.2 成体神经组织来源的神经干细胞

成体神经干细胞存在于成人中枢神经系统内, 如海马齿状回的颗粒下层、侧脑室的室管膜下区、纹状体等部位。来自侧脑室室管膜下区的新生神经元可以远距离迁徙到达嗅球形成嘴侧迁移流[8,9]。成体神经干细胞在不同因素的刺激下, 可分化为不同类型的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。不同部位来源的细胞进行增殖和分化需要的条件也不相同。如来自脑皮质的神经干/祖细胞在体外增殖、分化为神经元需要碱性成纤维细胞生长因子;而来自视网膜的神经干/祖细胞则不需要任何丝裂原。

1.2.3 成体非神经组织来源的神经干细胞

间充质干细胞具有分化成间质起源的任意组织的潜能, 包括向神经元样细胞、软骨、造血基质及骨等分化成熟的特征[10,11]。间充质干细胞不仅存在于骨髓中, 也可以从脐血、外周血中分离[12], 有研究者从脐带静脉内皮下层也分离出间充质干细胞[13]。Miller[14]等应用表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子2培养基, 从新生鼠和成年鼠的真皮细胞层内成功培养出NSCs。但是间充质干细胞定向诱导分化为神经干细胞缺点是:需要较高的条件, 往往分化为神经干细胞的比例很低, 脑内表达为神经细胞的数量较少, 致使间充质干细胞的研究仍只限于动物实验。优点是:其来源广泛, 不受伦理等问题的束缚, 所以仍是目前研究的热点。

1.3 NSCs的生物特性

NSCs的主要生物特性包括: (1) 多向分化潜能:神经干细胞可以向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。 (2) 自我更新:神经干细胞具有对称分裂及不对称分裂两种分裂方式。通过对称分裂产生两个干细胞或者2个祖细胞, 通过不对称分裂产生一个新的干细胞和一个祖细胞。 (3) 低免疫源性:神经干细胞是未分化的原始细胞, 不表达成熟的细胞抗原, 不被免疫系统识别。 (4) 组织融合性好:可以与宿主的神经组织良好融合, 并在宿主体内长期存活。

1.3 神经干细胞体内分化调控机制

目前绝大多数研究者认为NSCs的分化调控机制主要有两种:自身基因调控和外源性信号调控。基因调控是指NSCs自身的转录因子及其他功能蛋白对其发育的调控。许多转录因子参与了NSCs的增殖、分化过程。如bHLH (basic helix-loop-helix) 转录因子家族[15], 其中家族中的MASH-1 (mammalian aehaete-scute homolog-1) 基因的表达使干细胞向神经元前体细胞分化;Ngn1和Ngn2基因促使干细胞向神经元方向分化;Olig基因决定少突胶质细胞的分化;该家族还包括Mash1、NeuroD等因子。除此以外, 转录抑制因子N-coR (the nuclear receptor Co-repressor) 能抑制神经干细胞向胶质细胞分化[16];Notch基因抑制干细胞向神经元方向分化;Wnt[17]基因在NSCs增殖分化中也起重要调节作用。

外源性信号调控指微环境对NSCs发育的调控, 包括细胞因子、骨形态形成蛋白 (BMPs) 、微环境等多个方面。大量实验表明, 细胞因子如表皮生长因子 (EGF) 和成纤维细胞生长因子 (FGF) 都能维持神经干细胞的自我更新能力。其他神经因子如血小板生长因子 (PDGF) 、脑源性神经营养因子 (BDNF) 、白细胞介素 (IL-1) 、淋巴细胞抑制因子 (LIF) 均起协同调节作用。另一种就是骨形态形成蛋白 (BMPs) , BMPs在神经系统发育过程中发挥多种作用, 并对神经营养因子的作用产生影响。在胚胎早期, 可抑制细胞增生;在后期, 低浓度的BMPs促进神经细胞和星形胶质细胞的增生, 但在发育的所有时期, BMPs抑制少突胶质细胞的产生[18]。微环境指能对NSCs分化产生影响的周围结构成分。人们发现:促进血管内皮细胞增殖的因素可以促进神经元的增殖, 提示NSCs的发生与内皮细胞的发生也有一定关系;同时神经元的发生亦受到其他神经细胞的影响, 如来源于成人海马区的星形胶质细胞可以促进NSCs的增殖和分化[19];而来源于脊髓的星形胶质细胞并不能促进神经的发生, 进一步证明局部的微环境对NSCs的影响。自身基因调控和外源性信号调控相互作用, 共同调节控制干细胞的增殖和分化。

2 神经干细胞移植

2.1 神经干细胞移植的可行性

神经干细胞能够应用于研究视网膜缺血再灌注损伤, 主要与眼球的局部特点密不可分。 (1) 眼球的解剖结构清晰, 屈光物质透明, 眼球体积小、组织结构严密、与体循环相对分离等特点, 有利于操作、定位和观察。 (2) 眼球具有免疫赦免机制, 能诱导免疫偏离, 产生免疫耐受。眼球的免疫赦免使得视网膜下腔和玻璃体腔对外来基质的相对无反应状态都为神经干细胞移植治疗视网膜缺血再灌注损伤提供了免疫学基础。但是, 眼球的免疫赦免是相对的, 在移植过程中, 视网膜色素上皮细胞、小胶质细胞以及视网膜微血管内皮细胞等相关APC均参与了免疫排斥反应。使用免疫抑制剂和免疫耐受状态的产生可以有效地降低细胞移植后免疫排斥反应的发生[20]。

2.2 神经干细胞移植方式

目前, 神经干细胞移植视网膜主要通过两条途径实现:一是玻璃体腔移植, 一般将带有玻璃微型针头的微量注射器在角膜巩膜缘扁平部插入玻璃体腔, 抽出1.5μL左右的玻璃体, 再注入等体积的神经干细胞悬液。另一种方法是视网膜下腔移植, 通常是在光学显微镜下, 使用微型刀片在视网膜赤道部做一个小切口, 然后用带30号针头的微量注射器穿巩膜、脉络膜进入视网膜下腔, 注入3~4μL细胞悬液。由于移植的干细胞具有迁移整合能力, 通过上述两种方法, 细胞均可整合入视网膜, 但实验观察到视网膜下腔注射损伤较大, 且容易造成视网膜脱离。

2.3 神经干细胞移植后的作用

Nishida[21]等将大鼠海马来源的神经干细胞移植入机械性损伤的大鼠玻璃体腔内, 分别于1、2、4周做组织化学检查, 发现移植细胞已长入宿主视网膜, 并表达Map2ab、Map5、GFAP, 结果表明神经干细胞移植有助于修复损伤的视网膜。Suzuki[22]等将海马来源的神经干细胞移植入新生小鼠眼内, 发现移植细胞整合到宿主的神经节细胞层、内丛状层和内核层。免疫组化显示多数细胞能表达巢蛋白, 并表现出微管相关蛋白的免疫活性。证明神经干细胞能向神经元和星形胶质细胞分化, 同时也发现脑衍生神经生长因子 (BDNF) 能促进神经干细胞的分化和提高其成活率。Wang等[23]将NGF基因修饰的神经前体细胞移植到玻璃体腔和视网膜下腔, 观察其对视神经轴浆流中断视神经病变的治疗作用, 发现:NGF基因修饰的神经前体细胞注入玻璃体腔和视网膜下腔, 均能够表达NGF, 最长时间达1个月之久。在7d和15d分泌神经营养因子对损伤下的视网膜节细胞起到明显的保护作用。Dong等[24]用转化生长因子β3诱导海马来源的NSCs后移植入视网膜后发现部分细胞可表达成熟视网膜细胞标志。最近有学者将加强绿色荧光蛋白表达的海马祖细胞 (AHPCs) 通过玻璃体腔内注射移植到高压损伤眼, 免疫组织化学分析AHPCs在损伤的视网膜环境中存活并分化, 表达神经元和神经胶质标志。但是瞳孔对光反射和视网膜电流图分析在受体眼中未见分化出功能性产物。Tropepe等发现成年小鼠视网膜内存在NSCs, 打破了认为哺乳动物视网膜内不存在NSCs的传统观点。Chacko等[25]向出生2周大鼠视网膜下腔移植培养的来源于视网膜的NPC, 发现移植的细胞能与视网膜整合并表达感光细胞的标志物Opsin和Arrestin。较其他用于视网膜移植的干细胞而言, 来源于视网膜的NSCs一直处于视网膜的生长、发育环境中, 具有更大的向视网膜细胞分化的潜能。在国内, 柳浩然[26]等观察了神经干细胞移植能促进视神经损伤大鼠视网膜表达脑源性神经营养因子以及神经干细胞移植入视神经损伤大鼠玻璃体腔后可提高视网膜神经节细胞的存活率、对受损的节细胞具有一定的保护作用。同时研究发现NSCs移植入视神经损伤大鼠视网膜后作闪光视觉诱发电位显示, P1波幅显著下降, 1周内下降速度较快, 2周至4周下降幅度渐趋于平缓;P1波峰潜时逐步上升, 到4周时显示回落趋势, 说明髓鞘功能有开始恢复的迹象。闪光视觉诱发电位反映里视神经损伤及NSCs移植后的视神经传导功能的变化, 发现NSCs早期移植可减缓视网膜节细胞的凋亡, 有效促进损伤视神经传导功能的修复。最近Wang[27]等从人胚胎大脑皮层分离获得神经干细胞, 然后移植入出生后21d大鼠的玻璃体腔内, 并在出生后不同时间点检测大鼠的空间频率敏感度和亮度阈值。空间频率敏感度显示在出生后90d为 (0.54±0.04) 周期/度, 这个数字可以达到正常值的90% (0.6周期/度) , 亮度阈值为3.0对数单位;而未植入神经干细胞的大鼠在出生后90d仅为 (0.16±0.05) 周期/度, 亮度阈值仅0.6对数单位。在出生后150d和270d也空间频率敏感度可以达到 (0.49±0.05) 和 (0.22±0.02) 周期/度, 分别是正常值的82%和37%。实验证实人胚胎大脑皮层来源的神经干细胞能够有效地延缓大鼠视力的进一步恶化, 并且这种持续治疗作用可以达6个月。

3 问题及展望

神经干细胞的自我更新、多向分化潜能, 使其非常适合进行细胞移植, 而机体内广泛存在的神经干细胞加上体外培养扩增技术为移植提供了充足的细胞源。大量的动物实验证实了神经干细胞移植到视网膜下腔或者玻璃体腔后能够在宿主视网膜内迁移、分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞, 并能够整合到视网膜内, 建立广泛的细胞连接。然而, 目前所进行的研究主要是动物实验, 缺乏临床实验数据;而且神经干细胞在移植到体内后如何分化为目的细胞, 分化调控机制还不是很明确, 在防止可能出现的肿瘤性分化等方面仍然需要进一步的研究。随着神经干细胞基础理论的研究深入, 神经干细胞移植必将能为视神经损伤的治疗做出突出的贡献。

神经嵴干细胞 篇2

细胞疗法的目标是要在体内形成新的细胞以治疗疾病。两年前, 隆德大学的研究人员就对人类皮肤细胞 (成纤维细胞) 进行重编程, 使其直接变身为可产生多巴胺的神经细胞, 从而绕过了干细胞这一中间阶段, 当时这在世界上尚属首次。现在, 该小组又证实, 皮肤细胞和支持细胞都有可能直接在大脑中重编程为神经细胞。

研究人员使用一种被设计过的基因, 可通过药物激活或使其失活。这种基因被插入两种类型的人类细胞中:成纤维细胞和神经胶质细胞, 后者是自然存在于大脑中的支持细胞。随后, 研究人员将细胞移植进大鼠的大脑, 并在大鼠的饮用水中加入药物将基因激活。结果发现, 这些细胞开始向神经细胞转化。

在另一项实验中, 研究人员向小鼠大脑内注入同样的基因后, 也成功将小鼠自身的神经胶质细胞重新编程成为神经细胞。“这一发现是首个表明其他细胞有可能在大脑内经过重编程而转化为神经细胞的重要证据。”研究小组负责人马林·帕尔马说。

他表示:“研究结果有望开辟一条途径, 为将来的细胞疗法植入物找到替代品, 从而扫除以前遭遇的研究障碍, 比如难以让大脑接受外来细胞, 以及易形成肿瘤的风险等。”在大脑中直接对细胞重编程的新技术开启了新的可能性, 为更有效地替换帕金森氏症等患者已经死亡的脑细胞创造了条件。

“我们正在对这项技术进行开发, 以便用它来创建新的神经细胞, 取代受损细胞的功能。能够在体内进行重新编程也就意味着可以设想, 未来我们可以直接在人类大脑中形成新的细胞, 而无需绕行细胞培养和移植这条弯路。”帕尔马说。

这项研究让人们展开想象:其他细胞可以重新编程直接转化为神经细胞, 那么是否也可以转化为肌肉细胞、肝细胞等其他细胞?既然细胞可以实现转化, 那么转化细胞能否形成组织, 继而组成器官?尽管想象难以在短时间内成为现实, 但积跬步以至千里, 我们相信对细胞这一生命基本单位的这类研究必将成为揭开生命奥秘、改造生命和征服疾病的关键。

神经嵴干细胞 篇3

是具有高度自我更新能力并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经前体细胞, 能自我更新并能提供足够数量的神经细胞以供机体功能所需[1]。

自从1992年Reynolds和Weiss以及Ricbards 等先后从成年小鼠的纹状体和海马中分离出NSCs后, 彻底颠覆了以往认为成年哺乳动物C N S不再具有自我更新潜能的传统观念。NSCs移植为CNS损伤和神经退行性疾病的治疗提供了新的方向。因此, 对NSCs增殖和分化调控的研究显得尤其重要。

在对人胚胎期N S C s的研究中, 已先后从大脑皮质、海马、纹状体、嗅球、侧脑室、室管膜下层、小脑和脊髓等区域分离出NSCs[2]。成体哺乳动物脑内存在2个NSCs聚集区:位于侧脑室壁的室下区 (subven tricu lar zone, SVZ) 和海马齿状回的颗粒下层 (subgranular zone, SGZ) 。

2 神经营养素家族 (N G F家族)

包括:神经生长因子 (N G F) 、脑源性神经生长因子 (BDNF) 、神经营养素-3 (N T-3) 、神经营养素-4/5 (N T-4/5) 以及神经营养素-6 (N T-6) 。它们各自通过高亲和力受体酪氨酸激酶 (T r k-A、T r k-B和T r k-C) 和低亲和力受体g p 7 5起作用。其中, T r k-A优先结合N G F, Trk-B优先结合B D N F和N T-4/5, Trk C优先结合NT-3;而gp75能结合上述所有5种神经营养因子而发挥生物学效应。

2.1 神经生长因子 (NGF)

2.1.1 1NGF的特性和分布

NGF来源于中枢神经系统及外周神经系统的神经元、神经胶质细胞, 作为靶源性逆向营养因子而发挥作用。

2.1.2 NGF对NSCs分化的作用

有学者利用新生SD大鼠的脑组织进行单细胞悬液制备和原代培养, 经过分化培养后均能产生神经元特异烯醇化酶与胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞[3]。而在无血清的系统中, 利用单细胞克隆技术对小鼠胚胎纹状体组织进行分离和培养发现, NGF的干预可以诱导并增加神经前体细胞表达神经元标志物神经丝蛋白 (neurofialm ent protein, NF) 和星形胶质细胞标志物:胶质纤维酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein, GFAP) , 但没有少突角质细胞标志物 (oligodendrocyte marker) 。以上结果表明, NGF可促进体外培养的神经元前体细胞分化为成熟的神经元和成熟神经胶质细胞[4]。

还有研究表明, 对于利用无血清培养技术从胚鼠脑内获得的NSCs, 加入不同剂量的NGF后, 观察胆碱乙酰转移酶 (cholineacetyltransferase, CHAT) 阳性细胞分化的情况, 证实NGF还具有诱导NSCs向胆碱能神经元分化的作用[5]。而在体内, NGF亦可诱导NSCs向胆碱能神经元分化, 有学者给基底前脑胆碱能神经元受损的大鼠侧脑室注射EGF和b-FGF 14d后, 再改用NGF注射14d, 发现海马等处有较多的NSCs被诱导分化为胆碱能神经元[6]。

但NGF不能使人类中枢神经系统干细胞子代分化为神经元的细胞数量增加, 这与T r k-A在人类间脑干细胞的微弱表达是一致的, 表明N G F在人类间脑系统中对神经元分化没有起到积极的作用[7]。

2.2 脑源性神经生长因子 (BDNF)

2.2.1 BDNF的特性和分布

BDNF是一种具有防止神经元死亡功能的蛋白质。BDNF-mRNA广泛地存在于中枢神经系统和外周组织内。在中枢, 其广泛分布在大部分脑区, 上丘、大脑皮层和海马。在外周, 主要在肌肉组织中高表达, 而在心脏和肺组织中表达水平较低[8]。

2.2.2 BDNF对NSCs分化的作用

BDNF在体外可保持NSCs的活行和促进其向神经元分化。有研究表明, 应用出生2~3d大鼠脑皮质的神经干细胞, 通过免疫荧光技术分别观察BDNF组和对照组中β-tubulin阳性神经元数目, 结果发现BDNF组的阳性细胞数目明显多于对照组, 神经元的突起明显较对照组长[9]。且Wachs等研究认为, 当BDNF浓度为200ug/L时, 神经干细胞分化为神经元的比例最高[10、11]。

Vicario、Abejon等将中海马中分离细胞先培养在b-F G F中1 3-1 8 d, 再移B D N F中并检测神经元标志物微管相关蛋白-2 (microtublule associated protein-2, MAP-2) 、钙结合蛋白和突触蛋白, 发现M A P-2阳性细胞的数量增加2倍, 钙结合蛋白阳性细胞的数目增加3倍[12]。

Shimazaki 等亦发现, 只要将神经前体细胞暴露在BDNF中2h即可诱导完全的神经元分化, β-微管蛋白阳性细胞数目明显增多, 表明B D N F能促使有丝分裂后神经前体细胞向神经元样表型终末细胞分化[13]。体内实验亦获得了相同的结果, 将B D N F注入侧脑室, 不仅在注入侧的S V Z, 而且在沿侧脑室和第三脑室排列的特殊皮质结构, 如纹状体、下丘脑和海马中, 发现5-溴脱氧尿核苷 (5-bromod-eoxyuridine, 5-Brd U) 阳性细胞数目明显增多, 还能增加对吻侧迁移流和嗅球中新生神经元的数量, 表达神经元特异性标志物MAP-2和微管蛋白[14]。

2.3 神经营养素-3 (N T-3)

2.3.1 N T-3的特性和分布

NT-3是一种小分子量的碱性蛋白质, 与NGF和BDNF具有相似的一级结构。主要分布于海马、脑、脊神经节、脑干和脊髓等。

2.3.2 NT-3对NSCs分化的作用

体外研究表明, N T-3对交感神经元、感觉神经元、大脑皮层的上运动神经元、脊髓前角运动神经元以及大脑基底部的乙酰胆碱能神经元等均有维持存活的生物学作用。在体内, N T-3可以诱导神经干细胞分化, 调节其他神经营养因子的功能。

2.4 NT-4/5与NSCs分化的关系

神经营养素4/5 (neurotrophin-4/5, N T-4/5) 在中枢和外周分布很广, 对运动神经元、基底前脑的胆碱能神经元, 以及海马、下丘脑、延髓等处的神经元的生长、分化具有促进作用[15]。

3 NSCs的应用前景

3.1 细胞移植治疗

细胞移植技术用修复脑组织就是在体外培养和扩增NSCs或诱导其分化为定向祖细胞, 再移植到脑内, 以替代因疾病而丢失或缺损的神经细胞。应用于临床疾病如帕金森病 (parkinsonism disease, PD) , 亨廷顿病 (Huntington disease, HD) 以及阿尔茨海默病 (a1zheimer's disease, AD) 等[16]。

3.2 基因或药物治疗载体

动物实验表明, 经过基因修饰而携带有外源基因的NSCs移植到脑内后能迁移并整合于病变部位, 长时间表达外源基因产物。另外, 由于NSCs具有固有的迁移特性, 可用于中枢神经系统的肿瘤治疗。

4 问题及展望

对于NSCs的研究目前还处于起步阶段, 但随着分子生物学和细胞生物学技术的不断发展, 经过科学工作者几十年的努力研究, 在NSCs增殖分化的机制及应用等发面已经取得了初步成果, 但仍有一些问题尚待解决:

(1) 如何能够实现对NSCs准确的人工增殖和分化调控;

(2) 如何在脑损伤后创造内源性NSCs增殖和分化的内部条件;

(3) NSCs抑制后是否有肿瘤产生的可能等将影响NSCs增殖分化的影响因素彻底研究清楚后, NSCs必将会有一个广阔的应用前景。

摘要：神经干细胞 (NSCs) 是具有高度自我更新能力并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经前体细胞, 具有广阔的临床应用前景。神经营养素家族对神经干细胞的分化有一定影响。其包括:神经生长因子 (NGF) 、脑源性神经生长因子 (BDNF) 、神经营养素-3 (NT-3) 、神经营养素-4/5 (NT-4/5) 以及神经营养素-6 (NT-6) 。本文就目前神经营养素家族对NSCs分化的影响的研究现状进行综述。

神经嵴干细胞 篇4

自从神经干细胞的概念被提出之后, 人们的传统观念才发生了彻底的转变, 越来越多的学者把研究焦点集中到神经干细胞上。通过神经干细胞的移植来改善TBI患者的预后及生活质量, 已经成为当前研究的热点。作者对神经干细胞移植治疗颅脑损伤后神经功能缺失方面的研究作一综述。

1 神经干细胞研究的发展历史

1992年, Reynold等[3]将剪碎的脑组织在碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor, b-FGF) 和b-FGF和表皮生长因子 (epidermal growth factor, EGF) EGF中悬浮培养后发现了悬浮生长的神经球。将这些神经球继续培养, 又发现了神经元、星形胶质细胞、少突细胞的生长。此后, 人们对神经组织的再生才有了新的认识, 越来越多的学者就此展开了对神经干细胞的研究。之后, Eriksson等[4]用相同的方法从成年动物脑中分离出神经干细胞, 证明了神经干细胞不仅存在于胚胎动物的脑内, 而且在成年动物的脑内也是存在的。此外, kuhn等[5]通过使用BrdU标记脑组织, 从而发现了侧脑室壁的脑室下层 (sub ventricular zone, SVZ) 和海马齿状回的颗粒下层 (subgranular zone, SGZ) 有新生的细胞产生, 并可以分化为成熟的神经元。1998年, Eriksson 等[6]通过研究5例经过BrdU静脉注射的成年癌症晚期患者的脑组织, 发现了这些患者脑组织内均存在有BrdU的阳性细胞, 从而证实了成年人类的脑内同样存在有神经干细胞。2000年, Kawasaki等[7]描述了一种经基质细胞诱导胚胎干细胞 (embryonic stem cell, ESCs) 分化为特异的神经细胞的方法, 即基质细胞来源的诱导活性作用 (stromal cell-derived inducing activity, SDIA) , 将胚胎干细胞与小鼠骨髓来源基质细胞PA6细胞单层共培养后, 得到了大量酪氨酸羟化酶 (tyrosine hydroxylase, TH) 阳性细胞。酪氨酸羟化酶是多巴胺生物合成的限速酶, 因此可以作为多巴胺能神经元的一个较好的分子标志。2006年, Takahashi等[8]将Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc转录因子导入小鼠皮肤成纤维细胞后, 成功获得了与胚胎干细胞类似的多能干细胞 (induced pluripotent stem cell, iPS) 。2007年, Takahashi等[9]发现了人类诱导式多能性干细胞, 在他发表其研究成果的那一天, 威斯康星-麦迪逊大学的Yu[10]也独立地发表了相似的结果。从此以后, 神经再生科学的领域开始飞速发展。

2 创伤性颅脑损伤后的病理生理变化

颅脑损伤发生后, 脑内可出现一系列病理生理改变。首先, 颅脑外伤可引起硬膜外血肿、硬膜下血肿、脑内血肿、弥漫性轴索损伤以及脑挫裂伤等。其中, 血肿可以直接对脑组织产生压迫, 导致脑血流灌注障碍。脑组织缺血、缺氧后, 无氧酵解增加, 产生过多的乳酸, 形成乳酸堆积, 继而产生缺氧性酸中毒, 脑组织代谢受到抑制, 线粒体肿胀、崩解, 细胞内钠、氯、钙离子超载, 脑组织肿胀、坏死, 肿胀、坏死的脑组织进一步使颅内压力增高, 脑灌注压力 (CPP) 降低, 加重脑组织缺血、缺氧, 形成恶性循环。弥漫性轴索损伤及脑挫裂伤时, 脑织直接遭到破坏, 神经轴索发生肿胀、断裂、崩解, 神经细胞大片变性、崩解、坏死, 脑肿胀形成, 亦加重脑组织缺血、缺氧, 恶性循环形成。不同部位的脑组织受损可有不同的临床表现, 通常可引起意识障碍、智力障碍、记忆功能障碍、言语障碍、运动功能障碍及感觉功能障碍等等。

3 神经干细胞移植的可行性

(1) 神经干细胞属于未分化的原始细胞, 它不表达成熟的细胞抗原, 免疫原性弱, 因此, 与其他组织及细胞不同, 神经干细胞移植后较少发生免疫排斥反应, 即使是异体移植, 也极少发生免疫排斥现象而致使移植失败。 (2) 具有趋化性, 移植入体内以后, 能够在微环境的诱导下向病灶处迁移、增殖, 这种现象可能与细胞外基质 (ECM) 有密切关系。 (3) 具有多向分化潜能, 分裂能力强, 干细胞向病灶处迁移后, 在局部微环境作用下, 可诱导分化为病变部位所需的各种神经细胞。 (4) 具有体外诱导分化潜能。由于神经干细胞具有多向分化潜能, 并且体外诱导操作方便, 故可以在移植前予以诱导剂进行体外诱导和操作, 使其分化为所需神经细胞后, 再予以移植。 (5) 神经干细胞易于获取, 可以在丝裂原信号影响下发生有丝分裂并不断增值, 为中枢移植提供大量的细胞来源, 且分裂后仍保留干细胞特性。

4 移植方法与途径

4.1 局部注射移植

局部注射移植是目前基础研究及部分临床研究采用较多的一种神经干细胞移植方法, 通过立体定向技术, 将特定剂量的干细胞准确地注射至脑内的特定部位。该方法具有操作时间短、定位准确等优点, 可以直接将干细胞注射至病灶及其周边的神经组织, 使其发挥作用, 从而使神经功能得到迅速、直接的改善, 尤其适用于病灶比较局限的疾病, 例如帕金森病、阿尔茨海默病、脑出血后遗症、颅脑损伤后遗症、脑梗死等。但是, 由于直接将神经干细胞移植入脑内, 具有占位效应, 受空间限制, 过度移植时易引起移植周边区域的脑组织受压。此外, 颅脑损伤后的病变部位脑组织可发生水肿、神经元细胞死亡及炎症反应等, 植入的神经干细胞可被激活的小胶质细胞、巨噬细胞等清除, 从而导致移植成功率降低。脑内移植还可以使神经干细胞在局部过度聚集, 影响神经干细胞的增值、分化。再者, 局部注射移植易出现移植部位出血、感染等风险, 临床上尚不易被患者接受。

4.2 经脑脊液途径移植

目前临床上多采用腰椎穿刺的方式, 将神经干细胞注入蛛网膜下腔, 使之随着脑脊液循环, 到达病灶处, 尤其适用于病变范围较广泛的中枢神经系统病变, 如脑内多发性梗死、多发脑挫裂伤等。该方法植入的神经干细胞较少受空间的制约, 增加了植入细胞的数量;治疗过程中患者所受创伤小, 操作过程相对安全。但是, 由于植入的神经干细胞需要经过脑脊液循环才能到达病灶处, 在整个循环过程中, 干细胞数量被脑脊液稀释, 加之迁移路径较长及脑脊液—脑屏障的存在, 故细胞迁移的特异性较差, 数量损失较多, 较少细胞能到达病灶处。另外干细胞直接进入脑脊液中, 其所处微环境不同于体外培养时的微环境, 干细胞存活的数量仍存在疑问。除腰椎穿刺外, 经脑脊液移植途径移植方法还有脑室穿刺注射移植以及枕大池穿刺移植, 这两种方法多见于基础研究, 临床上较少有报道。

4.3 外周血液循环移植

该移植方法分为动脉移植与静脉移植两种, 其移植方式几乎不受空间的制约, 因此可以将足够数量的干细胞植入体内。但由于循环路径较长及血—脑屏障的存在, 仅有极少数量的神经干细胞进入中枢并发挥作用。Jeong等[11]利用神经干细胞具有向病灶部位迁移的特性, 将神经干细胞经尾静脉移植入大鼠体内, 并证实了所进入脑内的神经干细胞中, 有10%分化为神经元, 并且与周围正常的神经元建立了突触联系。

5 神经干细胞来源

5.1 中枢来源

早期人们发现了在胚胎时期的哺乳动物中, 神经干细胞广泛存在于大脑皮质、脑室及脑室下区、室管膜及室管膜下区、海马、海马齿状回、纹状体等处。随着神经干细胞研究的不断深入, 已有不少实验证据表明, 在成年哺乳动物, 甚至成年人中枢神经系统内的某些特定部位, 如室管膜下区、海马颗粒下层等也有神经干细胞存在。在颅脑外伤、脑出血发生后, 可使上述部位的神经干细胞被激活, 在SLIT蛋白的诱导下, 向受损部位迁移、分化[12], 即内源性修复, 但其干细胞数量有限, 修复效果不明显, 在重型颅脑损伤时, 几乎无法发挥作用。人们通过获取脑源性神经干细胞, 经体外培养、诱导、分化, 然后将其植入宿主体内。现今已有不少基础研究表明, 该移植方式可取得显著疗效, 但在临床上, 由于取材困难、伦理因素等限制, 目前仍鲜有报道。

5.2 外周来源

取脑组织进行体外培养治疗神经系统疾病的治疗方案, 由于组织采取难度大, 本身可造成脑组织损伤, 风险大, 在临床上尚不可行。因此, 神经干细胞的取材, 由中枢逐渐发展到了外周。1988年, Broxmyer等[13]首先发现了人脐带血中含有丰富的干细胞。随后, 也有大量研究证明了脐血间充质细胞在一定的条件下可以分化、发育成特定的神经细胞, 从而用于治疗神经系统疾病。骨髓基质细胞是成体骨髓中的一种多能干细胞, 在一定条件下, 它可以分化成为成骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞甚至神经细胞。临床上多通过骨髓穿刺获得, 取材方便, 不受伦理因素制约, 可自体移植, 避免了免疫排斥反应, 是当今临床上治疗中枢系统神经损伤的热点。Éva等[14]将骨髓细胞移植到特定的小鼠模型体内, 发现这些被移植的骨髓细胞可以迁移到小鼠的脑组织中, 并且表达神经特异性抗原, 因此证明了骨髓细胞具有分化成为神经细胞的能力。随后, Mezey等[15]通过提取人的骨髓基质细胞, 并将其移植到成年哺乳动物脑内之后, 在嗅球内发现了来自于骨髓细胞的神经元, 他们认为, 骨髓基质干细胞具有能够迁移到受损脑组织区域并分化成为不同的脑组织的能力。Qu等[16]将骨髓基质干细胞通过静脉注射的方式移植入颅脑损伤小鼠模型脑内, 研究发现, 实验组较对照组在空间学习方面有更明显的恢复, 四肢运动功能也较对照组有明显的改善, 并且在脑组织内, 实验组较对照组有更密集的新生血管。

近日, Bonilla等[17]将骨髓基质干细胞移植到不同程度颅脑损伤大鼠模型中, 发现轻型及中型颅脑损伤大鼠在移植后神经功能恢复显著, 而在重型颅脑损伤组神经功能恢复与对照组无显著性差异, 推测是由于原发性重型颅脑损伤后, 可产生继发性颅脑损伤, 包括有氧化应激损伤、炎症反应、细胞凋亡基质被激活等。因此, 更多的学者开始致力于神经干细胞的联合移植, 以求达到更好的疗效。

自Yamanaka等发现了诱导多能干细胞后, 不少学者也开始从事多能干细胞的研究。近日, Oki等[18]将诱导多能干细胞植入中风小鼠模型脑内, 发现其向神经细胞分化, 并且具有电生理特性;且在诱导多能干细胞植入后, 宿主的行为学有明显改善, 从而证明了将诱导多能干细胞进行中枢移植, 可以很好地为受损伤的脑组织提供新的神经元, 并且在促进神经功能恢复方面安全且有效。

6 创伤性颅脑损伤后对干细胞移植的影响因素

6.1 移植局部环境

在颅脑损伤发生早期, 损伤部位脑组织出现水肿、血供减少, 使局部组织缺血缺氧、代谢受到抑制, 导致脑组织内环境失衡, 加之损伤部位的缺血再灌注损伤、氧化应激损伤、炎症介质等多种细胞因子的表达与释放, 促使胶质细胞增生, 胶质瘢痕形成。因此, 植入的神经干细胞在这种不利的微环境下, 难以存活, 导致移植成功率低下。

6.2 移植入干细胞的数量

实验表明, 移植细胞的数量与神经功能的改善有一定依赖性, Saporta等[19]分别将0, 5, 10, 20, 40, 80, 160×103数量的hNT (human neuroteratocarcinoma) 神经元通过局部注射方式移植入脑缺血大鼠模型的脑内, 结果发现, 植入细胞数量为40, 80, 160×103的大鼠行为功能的改善随着细胞数量的增多而明显, 而其他组大鼠的行为功能改善与对照组无显著性差异。此外, 研究还发现, 40×103移植组有5%的细胞存活, 80×103移植组有12%的细胞存活, 160×103移植组有15%的细胞存活, 而低于40×103数量的移植组, 存活细胞数量少, 甚至没有细胞存活。Ostenfeld等[20]将不同数量的神经干细胞移植入啮齿动物脑内, 结果发现移植数量越多, 越易引起免疫排斥反应, 移植效果差, 而移植数量较少时, 虽不易引起免疫排斥反应, 但是细胞生存能力低下, 因此认为中等量的神经干细胞移植效果较好。近日, 国内亦有学者将不同数量的神经干细胞移植入脑梗死大鼠模型脑内, 研究发现, 脑梗死后移植不同数量神经干细胞可改善因脑梗死造成的功能障碍, 但中等数量神经干细胞移植时, 能够以较少的数量的细胞, 带来最佳的移植效果。

6.3 移植方式、时机、部位

前已叙述, 病灶处直接局部注射移植、腰椎穿刺蛛网膜下腔移植、外周血液循环移植均可对移植效果产生不同的影响。不同实验室对于颅脑损伤后干细胞移植时间的选择有很大差异, 大多数研究人员认为外伤后的24 h内脑组织内环境不利于植入后的细胞存活, 故选择颅脑损伤数天后再进行移植, 此时的脑组织内环境较前稳定, 有利于植入细胞的存活。SHEAR等[21]通过实验证明了颅脑损伤后的2至7 d是最佳移植时间窗, 且病灶同侧移植较病灶对侧移植有更好的疗效。现大多数实验亦采取病灶处直接移植。

6.4 单一移植与联合移植

所谓单一移植, 即仅将骨髓基质干细胞、脐血干细胞、神经干细胞等单一地移植入宿主体内, 而不再植入其他细胞或药物, 而联合移植是将多种类型的细胞或药物与干细胞共同植入宿主体内, 或者在移植时合并其他治疗方案等。目前已有不少研究表明, 在治疗神经系统疾病方面, 如脑梗死[22]、颅脑损伤[23]、帕金森病[24]、脊髓损伤等[25]联合移植较单一移植效果更好。

近日, 亦有学者[26]提出, 在神经干细胞移植时, 联合亚低温治疗, 可提高植入干细胞的存活率, 并可使颅脑损伤后神经功能缺失症状得到明显的改善。Zhao等[27]提出, 骨髓基质干细胞脑内局部注射移植对缺血损伤的脑组织具有一定保证作用, 但是由于移植细胞数量有限, 作用效果不能在前实验的基础上得以明显提高, 而使用阿魏酸钠联合骨髓基质干细胞共移植治疗缺血性脑损伤时, 可明显减轻因缺血所引起的脑组织受损程度, 并对缺血性脑损伤后神经功能的恢复产生有益作用。

7 问题与展望

目前, 随着人们对神经干细胞研究的不断深入, 运用神经干细胞移植治疗颅脑损伤后遗症, 在基础研究方面已取得了很大进展, 甚至在临床治疗方面, 也有相应的报道。但是, 在临床应用中, 还存在着一些问题, 尚未解决。

首先, 神经干细胞移植对颅脑损伤的治疗效果有待进一步考证。迄今为止, 国内外尚未有一个统一的用于评价疗效的标准, 亦无大量的临床研究数据来考证神经干细胞移植的成功率及神经功能改善情况。此外, 神经干细胞移植尚未有统一的治疗方案及临床路径, 如治疗指征、移植途径、移植时间、移植数量等。

其次, 神经干细胞移植存在致瘤性的可能。Rubio等[28]将神经干细胞进行体外连续培养, 发现培养6至8周时, 神经干细胞仍可以稳定地进行增值, 并未发现有细胞瘤变;而培养4至5个月时, 发现培养基中出现了肿瘤细胞。Zhou等[29]将鼠源性骨髓基质干细胞进行体外培养、扩增后, 移植入免疫缺陷的小鼠体内, 发现了肿瘤细胞的形成。亦有学者提出, 神经干细胞在植入体内之前, 需经过分离、培养、鉴定的过程, 然后再进行体外诱导培养、扩增, 在整个过程中, 由于干细胞离开了原本生长的微环境, 加之以外界多因素的干扰, 干细胞遗传稳定性遭到破坏, 因此有可能产生致瘤性。

再者, 采用何种细胞进行移植, 如神经干细胞、骨髓基质干细胞、脐血干细胞等, 目前国内外尚无明确的定论。倘若采取骨髓基质干细胞或者是其他细胞进行移植时, 是否需先进行体外诱导其向神经细胞分化, 目前亦无明确定论。如何对这些细胞进行有效地体外培养、扩增, 以及如何保证移植物的植入活性及宿主的安全, 尚待进一步研究。

相信以上这些问题, 随着研究的深入, 都将得到不同程度上的解决。

摘要：神经干细胞 (neural stem cells, NSCs) 是指一类能够进行自我复制、自我更新, 并能够通过对称或者不对称的分裂方式向神经元、星形胶质细胞以及少突胶质细胞等分化的具有多向分化潜能的母细胞。已有不少实验研究表明, 神经干细胞移植可能作为颅脑损伤后遗症的治疗方法之一, 移植入的神经干细胞不仅可以在脑内存活, 而且能够促进神经功能恢复。作者对神经干细胞移植治疗颅脑损伤后神经功能缺失方面的研究作一综述。