基质干细胞

基质干细胞（共10篇）

基质干细胞 篇1

牙周疾病造成的牙周附着丧失和牙槽骨缺损是临床急需解决的一个重要问题,而组织工程学理论和应用的迅速发展为促进牙周组织再生提供了新的思路。骨髓基质细胞(bone marrow stromal stem cells, BMSCs)具有多向分化潜能,在体外诱导因子的作用下可向成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、神经细胞等方向分化[1,2],目前已成为牙周组织工程理想的种子细胞来源。近年来研究表明,釉基质蛋白(enamel matrix proteins, EMPs)能够促进牙周组织再生[3]。但目前还未见到有关EMPs对人BMSCs作用的报道。因此,本实验初步研究了EMPs对人BMSCs细胞周期和碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂、仪器

EMPs 从猪的牙胚中提取[4],并制成冻干粉备用;DMEM细胞培养基(Gibco,美国),胎牛血清(Hyclone, 加拿大),MTT(Amersco, 美国), CO2培养箱(Thermo Life sciences, 美国),倒置相差显微镜(Leica,德国),DMSO(宜兴市达华化工有限公司,江苏),流式细胞仪(FACSalibur, Becton Dickinsan),碱性磷酸酶试剂盒(上海仁宝医用试剂研究有限公司)。

1.2 人BMSCs的培养

采用全骨髓法培养人BMSCs。无菌条件下,用肝素化骨髓穿刺针于健康成年志愿者髂后上棘抽取骨髓,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液(含10%胎牛血清, L-谷氨酰胺 0.3 g/L, 100 U /ml青霉素及100 U /ml 链霉素),接种于培养皿中培养。3 d后半量换液,1 周后全量换液,去除悬浮红细胞及未贴壁细胞。此后每周换液2 次,倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。至细胞达到80%～90%左右的汇合后,进行传代培养。取第3代细胞用于实验研究。

1.3 细胞周期分析

选择增殖实验[5]中的EMPs作用人骨髓基质细胞最佳浓度200 μg/ml进行分析,以不加EMPs为空白对照。用流式细胞仪检测EMPs 对人BMSCs细胞周期的影响。

1.4 碱性磷酸酶染色

以矿化诱导液培养细胞(DMEM培养液加地塞米松10-8 mol/L,维生素C 50 mg/L,β-甘油磷酸钠10 mmol/L)。以200 μg/ml EMPs作用于细胞为实验组,以不加EMPs为对照组。培养2、5 d后,取细胞爬片按照试剂盒说明进行碱性磷酸酶染色。用图像分析系统测量平均灰度值。

1.5 统计学分析

采用SAS6.12软件对所得数据行统计学分析,检验水准为α=0.05。

2 结 果

2.1 人骨髓基质细胞的体外培养

接种后最初3 d内,培养皿中含有大量造血干细胞及悬浮细胞(包括血细胞及未贴壁单核细胞),无法观察到细胞贴壁情况。7 d时全量换液后,造血细胞成分基本消失,可见贴壁细胞呈细胞集落,其形态、大小和密度各不相同,大部分细胞呈梭形或三角形,少数呈多角形,细胞体积较大,细胞核较大,呈扁圆形。随着不断培养、换液,集落中的细胞逐渐扩增,呈放射状,细胞呈片状汇合。12～14 d后,细胞基本汇合成单层,长满整个培养皿底可进行传代(图 1)。传代后的细胞生长明显加快,4～6 h大部分细胞贴壁,细胞逐渐伸展为梭形、三角形或多角形,表面颗粒少;48 h后,可见细胞开始分裂增殖、聚集。5～6 d后即可见细胞汇合,长满培养皿底。

2.2 细胞周期分析

流式细胞仪测得细胞周期的分布情况见图 2及表 1。细胞周期的分布情况表现为EMPs组S期细胞数目较多,为19.48%,而对照组S期细胞数目为9.89%;对照组G1期细胞数目比例为89.46%,高于EMPs组的77.59%;说明 EMPs作用下的骨髓基质细胞具有较强的增殖能力。

2.3 碱性磷酸酶(ALP)染色

矿化诱导液培养2 d时,对照组和实验组均有少量阳性细胞,无明显区别(图 3);培养5 d时,可见实验组阳性细胞数明显增多,呈条索状、片状,而对照组阳性细胞数较少,稀疏(图 4)。经图像分析系统测定平均灰度值,2 d时,实验组0.18±0.02与对照组0.16±0.01无显著性差异(P>0.05);5 d时,实验组0.25±0.02与对照组0.21±0.03有显著性差异(P<0.05)。

3 讨 论

随着组织工程技术的发展,牙周组织再生的理论不断丰富,利用组织工程技术重建牙周组织成为可能。骨髓基质细胞是牙周组织工程中极有潜力的种子细胞。EMPs可以促进牙周组织再生已得到证实,而关于釉基质蛋白对骨髓基质细胞生物学作用的国内外报道甚少,并多为鼠、兔、猪等动物细胞的研究,因此该组织工程技术距临床应用尚有很大距离。本研究观察釉基质蛋白对人BMSCs生物学特性的影响,试图进一步了解EMPs促进牙周组织再生的机制。

目前常用的骨髓基质细胞的分离培养方法有2 种[6]:全骨髓培养法和密度梯度离心法。全骨髓培养法是一种保留造血干细胞和其他各种细胞混合培养的方法,将骨髓稀释后反复抽吸制成单细胞基液,利用BMSCs贴壁生长的特性将其分离纯化,由于维持了BMSCs原始的生活环境,有利于BMSCs的分化。本实验选择无血液疾病的健康成年人,利用全骨髓培养法成功培养了人骨髓基质细胞,体外培养的成人BMSCs 适应能力较强,接种成活率高,增殖速度较快,这可能是保留的血细胞成分中含有部分生长因子或促进贴壁的物质有关,而且全骨髓培养法维持了BMSCs原始的生活环境,更接近将来体内移植研究的要求。因此,利用BMSCs进行骨组织工程学的研究具有良好的应用前景。

目前评估细胞生长和增殖状况的方法主要有3 种: 3H-TDR 掺入法、MTT 比色法和流式细胞仪细胞周期检测法[7]。MTT 法检测细胞增殖结果显示,EMPs作用于人BMSCs 3 d时,200 μg/ml EMPs组与对照组相比差异即有显著性,说明该浓度有促增殖作用[5]。这与EMPs对兔BMSCs和鼠BMSCs增殖的结果不尽相同,虽然EMPs均能促进鼠[8]、兔BMSCs的增殖,但作用的浓度不同。结果不同的原因可能是由于细胞培养过程中,不同种属细胞分裂增殖活动恢复的快慢不同;其次可能与提取获得的EMPs的纯度和效价不同有关,当然也可能与不同实验室所用培养液的成分不完全相同有关。我们在用MTT法检测细胞增殖的基础上,进一步采用流式细胞仪检测EMPs对人BMSCs细胞周期的影响。结果显示,加入EMPs培养5 d的人BMSCs,G1期DNA含量减少,而S期DNA含量增高,表明EMPs可以增加人骨髓基质细胞DNA含量,具有促进BMSCs早期DNA合成,使细胞从G0/G1期进入S期的作用,从而促进细胞增殖。

碱性磷酸酶(ALP)的表达是成骨细胞分化的主要特征之一。我们观察了EMPs对人BMSCs的ALP活性的影响,发现5 d时,在EMPs条件下,ALP阳性细胞数明显增多,呈条索状、片状。表明BMSCs可在矿化诱导液培养下,向成骨细胞方向分化,并可被EMPs所增强。诱导的细胞能够产生ALP, 也表明BMSCs具有矿化能力,已具备成骨细胞的生物学特性,而且应用矿化诱导液联合EMPs诱导5 d后即明显表达成骨细胞表型,说明联合应用矿化液和EMPs能在较短时间内有效诱导BMSCs分化为成骨细胞。

本实验以成人骨髓为培养材料建立的成人BMSCs的培养方法和成骨诱导途径,为该组织工程技术的临床应用打下了基础,但组织工程技术应用于牙周病学临床还需更多的深入研究。

摘要：目的:观察釉基质蛋白(enamelmatrix proteins,EMPs)对人骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)细胞周期和碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。方法:体外培养人骨髓基质细胞,以200μg/ml EMPs作用于细胞为实验组,以不加EMPs为对照组。流式细胞仪检测EMPs对BMSCs细胞周期的影响,碱性磷酸酶试剂盒检测ALP的活性。结果:体外培养的人BMSCs生长良好,200μg/ml浓度的EMPs能提高细胞的ALP活性;影响细胞周期变化,EMPs组S期细胞数目较多,为19.48%,而对照组S期细胞数目为9.89%。结论:釉基质蛋白可促进人骨髓基质细胞的分化,影响细胞周期变化。

关键词：釉基质蛋白,骨髓基质细胞,增殖,矿化,细胞周期

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基质干细胞 篇2

人绒毛外细胞滋养层细胞与蜕膜基质细胞共培养模型的建立

目的模拟体内环境,建立可保持绒毛外细胞滋养层细胞(EVCT)与蜕膜基质细胞(DSC)生物学特性的共培养细胞模型,应用于研究滋养细胞的侵袭行为.方法利用胰酶消化和BSA、Percoll梯度沉降,收集纯化人早孕绒毛组织的EVCT和DSC,分别放入Transwell的上下小室,观察该模型下细胞形态变化及侵袭特性,免疫组化、免疫荧光染色检测细胞的纯度.结果免疫组化显示EVCT的细胞角蛋白7阳性表达的细胞数占95%以上,阳性表达转化生长因子β2的细胞数占95%以上,DSC泌乳素阳性表达的.细胞数也超过95%,证实共培养系统中EVCT和DSC纯度均在95%以上,且生物学特性得以维持.上室中的EVCT保持了其侵袭能力,在Matrigel包被的滤膜上EVCT的侵袭指数为3.22±0.04.结论适当的培养方法可获得高纯度的EVCT和DSC,并使其维持特有的生物学活性,成功地建立了共培养系统模型,便于研究滋养细胞侵袭和胚胎着床的机制.

作 者：秦立S 陈士岭 张曦倩 王炎秋 QIN Li-yun CHEN Shi-ling ZHANG Xi-qian WANG Yan-qiu 作者单位：南方医科大学南方医院妇产科生殖医学中心,广东,广州,510515刊 名：南方医科大学学报 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF SOUTHERN MEDICAL UNIVERSITY年，卷(期)：200626(7)分类号：Q492.5关键词：绒毛外细胞滋养层细胞 蜕膜基质细胞 共培养 侵袭 Transwell

基质干细胞 篇3

摘要：以雄性Wistar大鼠为研究对象，进行“一次性大强度离心运动”，一次性离心运动实验为16°下坡跑台跑，定量大负荷间歇性运动，跑速为26.8 m/min，运动5 min×10组，组间歇1 min。离心运动后不同时段取大鼠后肢腓肠肌外侧头进行分析大强度离心运动后大鼠骨骼肌细胞骨架蛋白含量的变化特点；与延迟性骨骼肌损伤时血清酶升高的关系；探讨细胞骨架蛋白在骨骼肌纤维中存在的特点和作用。

关键词：离心运动；细胞外基质蛋白；骨骼肌微损伤；膜完整性

中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1007-3612(2008)05-0618-05

骨骼肌细胞膜连接了细胞内骨架与细胞外基质（ECM），在维持骨骼肌细胞的结构和功能中发挥了重要作用。在骨骼肌中基膜（细胞外基质）—肌细胞膜—细胞骨架中的一些连接蛋白的缺失导致了骨骼肌疾病从而使人们对它们连接的重要生物作用有了认识［1］。细胞外基质（ECM）决定组织的形态和结构，ECM不同成分之间相互作用形成立体骨架结构，对细胞起着支持作用。细胞只有通过ECM连接才构成组织，ECM决定组织的牵张强度。细胞外基质蛋白在维持肌细胞的结构以及力的传导过程中发挥了重要作用。

对于运动后骨骼肌微损伤的发生及恢复过程中肌细胞的细胞内骨架、肌细胞膜在结构、功能方面的变化的研究已经相对比较成熟，但对于骨骼肌细胞外基质在运动后结构、功能方面变化的研究目前还较少，因此本研究的目的是探讨运动后骨骼肌微损伤后ECM中的重要蛋白laminin-2，collagenIV蛋白含量的异同及离心方式运动对其影响；探讨损伤发生过程中基质蛋白laminin-2基因表达的变化特征，为今后能够更加深入全面的研究运动后骨骼肌微损伤发生的机制提供理论基础和依据。

1研究方法

1.1实验对象与分组雄性Wistar大鼠42只，分为7组，每组6只，体重300～360 g，由北京维通过利华实验动物技术有限公司提供，国家标准啮齿类动物饲料，分笼饲养，自由饮食，室温17～23℃，相对湿度60%～75%，保持12 h光照。

正式实验前3 d，所有动物进行5～10 min跑台运动，以熟悉跑台，速度为5～10 m/min，坡度为0°。大鼠跑台为杭州段氏制作BCPT-98型。

一次性离心运动的实验大鼠采用Armstrong(1983)［2］、田野［3］所设计的-16°下坡跑台跑，模型略有改进，以更适合模拟离心方式运动造成的损伤。定量大负荷间歇性运动，跑速为26.8 m/min，相当于最大摄氧量的80％～90%［4］，运动5 min，间歇1 min，共进行10组。给以少量声、光、电刺激，以激励大鼠运动。

实验组在一次性离心运动后即刻、运动后4 h、12 h、24 h、48 h、72 h，取材为每组6只，分别取大鼠后肢腓肠肌外侧头进行分析。安静对照组取材与实验组相同部位。

1.2测试样本的采集与处理1） 大鼠血清的采集：大鼠称重后，用20%的乌来糖(或称乌拉坦)按0.01 mL/g体重腹腔注射麻醉，心脏取血置于离心管中，倾斜静置2～3 h后进行常规血清分离（2 000转/min，15 min），-20℃冰箱保存待测。

2） 用于匀浆的样本采集：取血后速取左侧腓肠肌外侧头,切约为4 min×4 min×4 mm3，用锡纸包好、标记后放入液氮中冰冻保存，留做匀浆用。

3） 用于冷冻切片的样本采集：大鼠称重后，颈椎脱位法处死，取血后小心剪取约3 min×3 min×5 mm的腓肠肌（切勿牵拉）投入用液氮预冷的装有正已烷（-70℃）的小烧杯中速冻，之后用锡纸包好放入液氮中保存，用于冷冻切片。

4） 组织匀浆总蛋白测试：10%匀浆，总蛋白（TP）的测试采用Bradford法［5］（即考马斯亮蓝法）法。

5） 血清CK、LDH的测试方法：测试采用酶动力法，试剂盒购自北京北控中生生物科技股份有限公司，测试严格按照操作步骤进行，仪器为MD-100半自动生化分析仪。

6） 羟脯氨酸（hydroxyproline）测试。原理：羟脯氨酸在胶元蛋白中占13.4%,在弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中均不存在，因此羟脯氨酸能反映胶元代谢情况。羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色，根据其呈色的深浅可推算出其含量。

试剂盒购自南京建成生物制品公司，测试严格按照操作步骤进行，仪器为721分光光度计。

7） laminin-2原位杂交测试。大鼠Laminin-2基因的寡核苷酸探针序列设计参考Maher,J.J等［6］，用Blast在NCBI的RGD（Rat Genome Database）中验证其定位，使用Oligo 6.0验证其不含稳定的二聚体和发夹结构。其序列为： 5' AGGAGGTTGTCAGCAACAGCGGTCTTGACATGGACAACGA 3' ，由北京奥科生物技术有限公司合成，3'端地高辛标记。

8） 组织切片的图像分析。组织切片染色后，显微镜观察，通过Panasonic WV-CP410/G摄像头和BOSER BS602A图像采集卡进行图像采集，之后用Scion Image (National Institutes of Health, USA)进行分析。用Scion Image分别测量不同类型肌细胞膜染色的光密度，以此反映其含量。每样本测量上、下、左、右、中部5个视野。

9） 肌肉匀浆方法：秤取腓肠肌肉样品，迅速剪碎后放入玻璃匀浆器中，以1:10的比例加入匀浆液进行匀浆。

10） 冷冻切片：在SLEE冷冻切片机上进行切片，厚度为15μm，切片恒温-20℃。将实验组贴于一张切片上，以便于比较［7］。

1.3指标测试与方法11） 肌肉匀浆测SOD、MDA方法：SOD的测试采用黄嘌呤氧化酶法，MDA的测试采用硫代巴比妥酸（TBA）法，试剂盒均购自南京建成生物制品公司，测试严格按照操作步骤进行，仪器为721分光光度计。

冷冻切片。固定：切片自然干燥，浸入新鲜配制的4%多聚甲醛中2 min。消化：胃蛋白酶，一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30～180 min，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。

1.4数据统计方法对观察分析结果用统计学分析软件SPSS11.5进行ANOVA单因素方差分析。

2结果

2.1离心方式运动后血清CK、LDH 以及羟脯氨酸的变化┎馐越峁见表1。

血清CK、LDH的变化呈现相似的趋势，在离心运动后即刻最高随后呈现下降的趋势到12 h后达到最底点，然后呈现上升的趋势到48 h后又呈现下降趋势(图1)。ANOVA分析表明：运动后即刻CK与其它各时段均有非常显著性差异，玃<0.01;LDH除24 h外的各时段和即刻组均有显著性差异,玃<0.05;CK 4 h组高于12 h组、72 h组，差异显著，玃<0.05;12 h最低，与除24 h外的各段均有显著差异，玃<0.05；肌组织中SOD值从离心运动后即刻开始升高，到12 h达最高，48 h又有一次高峰，随后下降。运动后肌组织SOD含量，在12 h显著高于安静对照、72 h含量，玃＜0.05(表2)。

肌组织中MDA变化规律与SOD相似(表2，图3)，在运动后即刻开始升高，12 h达最高，在48 h又有一次高峰趋势，其后下降。其中12 h肌组织MDA含量与安静对照、运动后48 h、72 h差异显著，玃＜0.05。图3，肌组织MDA扩大十倍显示。

2.2运动后细胞外基质蛋白含量变化与骨骼肌内容物泄漏及自由基代谢变化的相关分析(表3，图4)。

图5，图6。测量每张切片中5个视野（左上、左下、中、右上、右下）的蓝紫色颗粒的光密度值，结果见表4和图7。

离心运动即刻laminin-2基因表达水平明显下降与对照组差异显著，玃＜0.05；随后逐渐升高，在48 h达到最大，在4 h后直至72 h均处于较高水平，对照组与4 h组至72 h组差异显著玃＜0.05(图7)；

腓肠肌外侧头，冷冻切片，15 μm厚；寡核苷酸探针，地高辛标记，碱性磷酸酶系统显色，杂交阳性信号为蓝紫色颗粒(图8)。

腓肠肌外侧头，冷冻切片，15μm厚；寡核苷酸探针，地高辛标记，碱性磷酸酶系统显色，杂交阳性信号为蓝紫色颗粒(图9)。

3分析与讨论

3.1离心运动后大鼠肌纤维中细胞外基质蛋白laminin-2,cllagenIV含量的变化根据对腓肠肌组织切片的观察来看，我们观察到离心运动后腓肠肌更为明显。ECM的量受到身体活动的影响，一定形式的慢性负荷练习可以增加胶元的含量，只不过是胶元合成的类型以及胶元合成的程度情况不同。这些变化可以改变组织的粘弹性以及机械特性，使组织更易抗拉。［8-9］在laminin-2基因缺失大鼠的研究中发现［10-11］，伴随着laminin-2的减少而CollagenIV含量呈增加趋势，而本研究却发现离心运动后laminin-2含量增加伴随着CollagenIV含量的减少，laminin-2蛋白和CollagenIV之间是否存在着动态平衡，二者之间的增加和减少是否存在着因果关系？需要进一步研究的证实。

3.2运动后骨骼肌内容物泄漏、羟脯氨酸、自由基代谢变化以及骨架蛋白含量变化的相关分析羟脯氨酸是胶元蛋白的一种主要氨基酸，是反映体内胶元代谢的生化标志物，在胶元蛋白中占13.4%,在弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中均不存在，因此羟脯氨酸能反映胶元代谢情况。血清羟脯氨酸与血清LDH呈负相关；而血清羟脯氨酸与collagenIV没有相关性，可能和collagenIV本身的特殊性有关系，collagenIV作为细胞外基质蛋白的一种，在细胞外基质中含量很少并且是基膜的框架结构，也是基膜特有的胶原，在组织中细胞排列和骨骼肌中维持力的稳定性中发挥着重要的作用［12-13］，在运动过程中可能没有对胶元的代谢产物羟脯氨酸的增加作出贡献有关,本研究证实了这一点，即羟脯氨酸虽然是胶元的代谢产物但主要是I、III型胶元的代谢产物，也有相关文献报道羟脯氨酸主要是I、III型胶元的代谢产物［14］；肌组织中MDA水平与SOD水平相关；肌组织中SOD与血清LDH水平负相关；

本研究发现细胞外基质蛋白collagenIV与血清CK呈正相关；而Mackey, Donnell y（2004）［15］在以人为研究对象进行一次性离心运动后也同样发现了collagenIV与血清CK的明显的相关关系提示可能骨骼肌的离心收缩影响了IV型胶元的代谢更新。

3.3研究骨骼肌在损伤过程中laminin-2基因表达的变化特征细胞外基质蛋白laminin-2基因mRNA的原位杂交结果代表了laminin-2基因表达水平。如图10所示，离心运动即刻laminin-2基因表达水平明显下降与对照组差异显著玃＜0.05，随后逐渐升高，在48 h达到最大，在4 h后直至72 h均处于较高水平，对照组与4 h组至72 h组差异显著；本研究观察到了即刻laminin-2基因水平的降低但是没有观察到蛋白水平的下降，可能和实际蛋白水平有下降的趋势但是没有设置相应的时相观察到相应的实验结果，也有可能离心运动后即刻laminin-2基因表达水平的下降激活了laminin-2基因的调控过程使得laminini-2基因表达水平提高从而增加laminin-2蛋白的合成，laminin-2蛋白的升高也有可能和其本身就有较强的修复能力有关，从图11我们可以看到laminin-2基因和蛋白变化有大致相同的趋势。

4结论

1） 离心运动后基质蛋白laminin-2在24 h处于最高水平，24 h与其它各组组差异显著,其它组间的变化无显著性差异,说明了laminin-2是有较强调整和修复能力的蛋白，其变化有可能是因为其相邻蛋白的减少而代偿性的增加以维持机体的功能。

2） 本实验发现肌细胞外基质蛋白含量collagenIV的变化与血清CK相关，提示可能骨骼肌的离心收缩影响了collagenIV的代谢更新；

3） 离心运动即刻laminin-2基因表达水平明显下降与对照组差异显著；随后逐渐升高，在48 h达到最大，laminin-2基因和蛋白的表现了基本相同的变化趋势。

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基质干细胞 篇4

1 材料与方法

1.1 细胞、菌株及载体

细胞株与质粒 MEPE cDNA质粒由美国EMORY大学王亚教授馈赠。293T细胞株购自上海中国科学院细胞研究所。质粒 pLEGFP-N1为BD Biosciences Clontech公司产品,大肠杆菌E.coli DH5α由本室保存。

1.2 主要试剂

PCR产物纯化采用BIO101公司提供的Geneclean II 试剂盒(Cat# 1001-400);质粒提取采用Qiagen公司QIAprep质粒提取试剂盒;限制性内切酶及T4 DNA连接酶购自Takara生物公司。

1.3 PCR扩增、表达质粒的构建及序列测定

由质粒上扩增出MEPE cDNA全长,所用扩增引物为:上游引物:5′-CATATGAAGC TGAATGAAGAT-3′,下游引物:3′-GGATCCTTA CATTTGGGGGAGATG-3′,PCR扩增的目的基因经Nde I与BamH I双酶切后,克隆到经过同样酶切处理的pLEGFP-N1载体上,得到融合表达质粒,转化感受态大肠杆菌DH5α挑取单克隆进行PCR筛选,选1～2个阳性克隆进行测序,鉴定序列及读码框架是否正确。

1.4 稳定转染细胞株构建

在细胞生长状态良好,融合率达90%～95%时进行转染。按照Lipofectamin2000操作手册转染六孔板内细胞。转染48h后消化、重悬细胞,10倍稀释后铺96孔板,每孔分别加入800μg/mL G418完全培养基进行克隆筛选,4周后选择阳性细胞克隆进行鉴定、扩增培养冻存。

1.5 MTT检测增殖能力

将生长密度达80%的293T细胞,常规胰酶消化、计数,以5×103密度的细胞200μL接种于96孔板。目的基因组、空载体组,每组3个复孔。置于37℃、5% CO2培养箱中培养。细胞培养1、3、5及7d后,每孔吸出100μL培养基后每孔再加入10μL MTT(5mg/mL),培养箱中继续孵育。4h后,吸去孔内液体,每孔加入200μL二甲基亚砜溶解沉淀。选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值并记录结果。

1.6 RT-PCR检测

按照北京华大蛋白质研发中心有限公司总RNA提取试剂的说明书,用Trizol提取细胞总RNA。所用的实验器具使用前均需用DEPC水浸泡过夜,去除RNA酶。RT-PCR检测转染细胞中p53基因的表达。p53引物上游:TCAACAAGATGTTTTGCCAACTG,下游:ATGTGCTGTGACTGC-TTGTAGATG。

2 结果

2.1 稳定转染细胞株检测结果

提取稳定转染细胞株总RNA,进行RT-PCR,电泳结果显示两组细胞87bp左右均可见GAPDH扩增条带出现;转染目的基因细胞在110bp处见扩增条带;空载体组在110bp处无扩增条带出现,证明转染成功,细胞可用于后续试验。见图1。

1:DL500DNAmarker;2-3:转染目的基因及空载体细胞中GAPDH表达;4:转染MEPE质粒细胞中MEPE表达;5:转染EGFP细胞中MEPE表达。

2.2 MTT检测细胞增殖结果

MEPE转染细胞和EGFP空载体转染组细胞铺96孔板,并分别于1d、3d、5d、7d用MTT法测细胞增殖。从统计结果可知转染MEPE的293T细胞其增殖指数是转染EGFP空载体组细胞增殖指数的1.30倍。见表1,图2。

2.3 RT-PCR检测增殖与迁移相关因子表达情况

p53基因高表达细胞可表现出黏附、增殖、迁移侵袭等方面的生物学行为,实验通过实时荧光定量PCR,检测转染MEPE蛋白与转染空载体细胞中三种基因的表达,从PCR产物电泳图及实时荧光扩增曲线两方面比较三种基因在两种细胞中的不同表达。

1.DL500DNAmarker;2.转染MEPE细胞中p53表达;3.转染空载体细胞中p53表达;4.DL500DNAmarker;5.转染MEPE细胞中GAPDH表达;6.转染空载体细胞中GAPDH表达。

3 讨论

MEPE是小型N端连接整合素家族蛋白成员,近几年来,越来越多的报道显示SIBLING家族成员与肿瘤发展的各个阶段包括增殖、侵袭、转移、血管生成相关。Lee JL等[4]人发现骨桥蛋白(OPN)与细胞表面受体蛋白CD44相结合,可以使结肠癌HT29细胞加速增殖并提高转移潜能。Sharp JA等[5]人发现骨唾液蛋白(BSP)可以在体外促进乳腺癌MDA-MB231细胞增殖,转染IBSP基因的乳腺癌细胞注射裸鼠后肿瘤形成速度加快。Khodavirdi AC等[6]人在两株前列腺癌细胞中提高OPN蛋白的表达水平,发现OPN有增加细胞侵袭的能力,在小鼠成瘤模型中观察到高表达OPN的前列腺癌细胞侵入血管的能力增强。对大量的实验结果分析,我们可以发现SIBLING蛋白家族成员在许多肿瘤细胞中高表达,作为可溶性分泌性蛋白因子主要分布在细胞基质中,通过与细胞表面受体蛋白CD44、整合素受体、金属蛋白酶相互作用参与调节细胞信号传导,在肿瘤细胞的黏附性、趋化性、抗凋亡、侵袭、迁移、不依赖支持物生长等恶性生物学特性中具有重要作用,并与肿瘤转移以及预后不良相关。

在SBLING家族中对于MEPE在肿瘤发生发展中所起到的作用研究较少,与其他家族成员在结构上高度同源的MEPE是否也对肿瘤细胞的增殖侵袭有影响,需要进一步实验验证。近年来研究表明,许多肿瘤在发展过程中伴有MEPE蛋白的高表达,而且发现这些高表达MEPE蛋白的肿瘤同时也表现出高的转移倾向,且其抗电离辐射等抵抗DNA损伤诱导能力与MEPE蛋白的表达量呈正相关。本实验结果证明提高MEPE蛋白表达水平可影响细胞增殖等生物学特性,并进一步证实其作用机制是通过P53蛋白信号通路实现的。因此临床检测MEPE表达可对恶性肿瘤的发生、转移做出预测,为恶性肿瘤基因治疗奠定基础。而且检测MEPE的表达水平还可监测肿瘤治疗的预后,为肿瘤基因基因治疗提供新的靶点。虽然目前基因治疗尚未临床普及,但其具有良好的潜在应用前景,在人类攻克癌症,提高肿瘤患者生存率及生活质量上有望发挥重要作用。

参考文献

[1]Rowe PS,De Zoysa PA, Dong R,et al.MEPE, a new gene expressed in bone marrow and tumors causing osteomalacia[J].Genomics,2000,67(1):54-68

[2]Bellahcene A, Castronovo V,Ogbureke KE,et al. Small integrin-binding N-linked Glycoproteins(SIBILINGs):multifunctional protein in cancer[J].Nat Rev Cancer,2011,8(3):212-226

[3]Fisher LW, Fedarko NS. Six genes expressed in bones and teeth encode the current members of the SIBLING family of proteins[J].Connect Tissue Res, 2009, 44(Suppl 1):33-40

[4]Lee JL. Osteopontin promotes integrin activation through outside-in and inside-out mechanisms:OPN-CD44V interaction enhances survival in gastrointestinal cancer cells[J].Cancer Res,2007,67:2089-2097

[5]Zhiyong Mi, Hongtao Guo and Paul C Kuo. Identification of osteopontin-dependent signaling pathways in a mouse model of human breast cancer[J].BMC Research Notes,2009,2:119-127

基质干细胞 篇5

IL-10、IFN-γ调控早孕蜕膜基质细胞活性IL-10受体表达

研究IL-10、IFN-γ对人早孕蜕膜基质细胞活性及IL-10受体表达的影响.MTT法检测蜕膜基质细胞活性,选择两种不同作用浓度的IL-10、IFN-γ作用蜕膜基质细胞,处理15min、30min、45min、60min分别检测细胞IL-10受体R1、R2基因表达.高浓度IL-10(10-100ng/ml)促进蜕膜基质细胞活性(P＜0.05),低浓度IL-10(0.10-1ng/ml)则无明显促进作用(P＞0.05);高浓度IFN-γ(1000ng/ml)抑制蜕膜基质细胞活性(P＜0.01),低浓度IFN-γ(10ng/ml)反而起促进作用(P＜0.05).较高浓度IL-10(10ng/ml)作用15min即见IL-10R1高表达,30min明显减弱,45min表达消失;较低浓度IL-10(1ng/ml)作用60min内未见IL-10R1表达.IFN-γ(100ng/ml)作用45min见IL-10R1短暂低表达;较低浓度IFN-γ(10ng/ml)作用30min诱导IL-10R1中表达,45min表达减弱,60min消失.上述细胞因子作用前后IL-10R2表达差异无显著性(P＞0.05).因此,我们认为,早孕IL-10、IFN-γ可能通过影响蜕膜基质细胞IL-10R1表达及细胞活性,发挥免疫调节作用.

作 者：邢长英 归绥琪 XING Chang Ying GUI Sui Qi  作者单位：复旦大学附属妇产科医院,上海,11 刊 名：分子细胞生物学报  ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF MOLECULAR CELL BIOLOGY 年，卷(期)： 39(2) 分类号：Q2 关键词：IL-10   IFN-γ   蜕膜基质细胞   IL-10受体  

基质干细胞 篇6

1.1 实验动物

材料及仪器:新西兰大白兔90只, 雌雄不限, 5~7周龄, 体重2.5kg左右, 其中3只用于提供BMCS以及关节滑液来源, 其余用于研究防止肌腱粘连。

1.2 研究方法

MSCs的诱导分化:将MSCs移入含地塞米松1×10-7mol/L、关节滑液1×10-7mol/L、bFGF-23ng/mL、维生素C100mg/L的胎牛血清DMEM, 诱导MSCs向滑膜细胞分化, 通过离心、纯化后鉴定 (光镜、透射电镜以及免疫组化等鉴定) 。然后培养扩增备用。

滑膜样细胞移植:选用84只大白兔, 每只兔的右后肢作为实验组, 左后肢为对照组。将诱导分化的细胞悬液移植入大白兔右后肢损伤的跟腱处, 术后用管形石膏将下肢固定于膝关节屈曲15°, 踝关节背伸l5°, 足趾自然位。

检测指标:术后l、2、4、8周取材。第1周每组各3只动物6条跟腱进行大体标本粘连等级评定、组织学观察 (包括光镜和透射电镜观察) ;后3周每组各6只动物12条跟腱, 随机取6条跟腱进行生物力学测试, 6条进行大体标本粘连等级评定及组织学观察。

统计学分析:所有计量资料均以均数±标准差 (x±s) 表示, 采用SPSS 11.5软件进行统计学分析, P<0.05则表示有统计学意义。计量资料采用t-test, 计数资料采用等级资料的秩和检验。

2 结果

2.1 滑膜样细胞的鉴定

BMSCs传代培养初期可见大量悬浮细胞, 48h后可见有散在纺锤形贴壁细胞, 经多次半量换液后, 未贴壁细胞逐渐被去除。4d后可见成簇、贴壁的纺锤形细胞逐渐增多, 但仍存在混杂细胞。经多次传代后, 细胞逐渐纯化, 并且细胞初期多以集落形式增长, 第6代后细胞呈形态均一的纺锤形, 分布均匀。

在bFGF-2、关节滑液等诱导条件下, BMSCs逐渐向滑膜样细胞形态分化。于4d后散在个别细胞逐渐呈梭型生长。7d后梭型细胞较前增多, 细胞间较少见紧密联接。10d时梭型细胞约占2/3。随细胞数量增加而逐渐紊乱, 无明确的方向性排列特征。14d时长满培养皿底, 细胞形态以梭形为主, 两极胞突细长, 末端多与邻近细胞连接并交织成网状。网间散布有较多小星形或多边形细胞, 与梭形细胞紧密连接。

贴壁法纯化后, 扩增培养, 将纯化的梭型细胞用0.25%胰蛋白酶消化并吹打制成单细胞悬液, 传代培养。传代细胞在48h内贴壁, 并很快铺展。

2.2 大体标本屈肌腱粘连等级评定

Hitchcock[1]粘连分度法评估结果显示, 随着愈合的发展, 对照组肌腱粘连逐渐加重, 实验组各时相粘连等级基本相当。同一时相点实验组同对照组相比粘连明显减轻 (P<0.05, 见表1) 。

2.3 跟腱生物力学测定

断裂载荷测试结果显示, 实验组与对照组比较, 断裂载荷有显著差异 (P<0.05) , 但与正常屈肌腱的断裂载荷比较, 实验组和对照组均明显降低 (P<0.05, 见表2) 。

3 讨论

3.1 骨髓基质干细胞向滑膜样细胞的分化

骨髓基质干细胞是一种可多向分化的细胞, 在特定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞和神经细胞等多种细胞。本研究表明, 骨髓基质干细胞在关节滑液和FGF-2诱导下可以分化为滑膜样细胞, 其具有成纤维细胞样滑膜细胞的组织学及超微结构特征, 并且分化细胞免疫组化染色Vimentin阳性, CD68阴性。由于巨噬细胞样滑膜细胞不具有增殖能力, 可通过多次传代去除巨噬细胞样滑膜细胞而获得较纯的成纤维样滑膜细胞[2]。这可能也是本实验中获得较纯的成纤维样滑膜细胞的原因。Vimentin (波形蛋白) 是中胚层组织的特征性蛋白, 主要存在于成纤维细胞和来自胚胎间充质的细胞。CD68是巨噬细胞的表面标志, 我们用Vimentin及CD68单抗对培养的第三代滑膜细胞进行了鉴定, 结果与上述文献相符。

3.2 滑膜样细胞移植预防肌腱粘连

早在1963年, Potenza[3]通过实验研究认识到保持肌腱滑膜鞘的完整, 有利于减轻肌腱愈合过程中的粘连。实验组与对照组的跟腱粘连程度相比, 实验组粘连程度较小, 而且从观察时相开始到结束粘连程度相当, 各时相点比较无统计学差异 (P>0.05) 。此说明移植的细胞可有效防止肌腱粘连, 并且可以促使滑膜形成及愈合, 在光镜及扫描电镜下可以在肌腱周围形成一薄层交织成网状的滑膜样细胞层。国内张正治等[4]将取自兔的趾腱鞘内的滑膜细胞经原代和传代培养后, 制成滑膜细胞悬液, 再与自体无滑膜肌腱段联合培养。经扫描电镜观察, 培养后的肌腱表面变得光滑经免疫组化染色vimemtin阳性, 说明肌腱表面有滑膜细胞覆盖, 使之具有滑膜肌腱的形态学特征。这是与本实验相吻合的。

3.3 滑膜样细胞移植对肌腱强度的影响

虽然可以预防粘连, 但肌腱达不到一定的抗张强度, 也是万万不行的。滑膜样细胞移植后, 肌腱的断裂载荷测试结果显示, 实验组与对照组各时相数值比较, 断裂载荷有显著差异, 说明实验组肌腱愈合后生物力学强度较高。但与正常屈肌腱的断裂载荷比较, 实验组和对照组均明显降低。虽然滑膜化肌腱抗张强度仍然达不到正常水平, 但相比无滑膜肌腱有了很大提高。其中肌腱表面之滑膜在一定程度上增强了肌腱的抗张强度, 而且滑膜分泌的滑液有营养作用, 较之对照组促进了肌腱的更快愈合, 也增强了肌腱的抗张强度。

参考文献

[1]Hitchcock TF, Light TR, Bunch WH, et a1.The effect of immedi-ate constrained digital motion on the strength of flexor tendon repairs in chickens[J].Hand Surg (Am) , 1987, 12 (4) :590～595.

[2]Tomita T, Nakase T, Kanekom, et al.Expression of extracellular matrix met lop proteins inducer and enhancement of the preduction of matrix metal lop roteinases in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum, 2002, 46 (2) :373～378.

[3]Potenza AD.Critical evaluation of flexor-tendon healing and ad-hesion formation within artificial digital sheath[J].J Bone Joint Surg (Am) , 1963, 45 (6) :1217～1233.

基质干细胞 篇7

根据世界卫生组织的报道,角膜疾患是视力丧失和致盲的主要原因之一,其重要性仅次于白内障[1]。角膜盲使全世界超过一千万的个体受累(由美国眼库的视力同享协会估算),唯一被广泛接受的治疗是人类供体组织的移植[2]。尽管传统的同种异体角膜移植有超过80%的成功率[3],由于人口老龄化和预期寿命的延长,角膜供体库相对于不断增加的需求呈现逐步缩减(因为老年人更有可能需要移植物,而老年人的角膜往往不容易被受体接受)。感染性疾病(艾滋病,肝炎等)不断增长的发病率和屈光手术的逐步普及共同造成了这种不足,因为这些经过外科手术的角膜是不可接受的供体组织。供体移植物的另一个选择是用人工替代物置换被破坏的角膜。目前,还没有可利用的替代物被广泛接受[4]。目前已发明了很多角膜假体,但是没有一个可以没有痕迹的与受体组织融为一体[4]。人们逐渐关注异种移植,排斥是异种移植中的重要问题,脱细胞角膜基质由于没有细胞组织,免疫排斥应较单纯异种移植要小得多。本实验进行脱细胞组织的制备,研究其超微结构,并利用异种脱细胞角膜基质新西兰白兔进行角膜囊袋内移植,评价生物相容性,为下一步临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

新西兰白兔9只,雌雄兼有,体重2～2.5 kg,眼部无明显异常。由北京大学第三临床医院实验动物中心提供。

1.2 脱基质狗角膜基质植片的制备

取新鲜实验动物狗眼球冲洗后,置于0.1%庆大霉素PBS液中1 min,沿角巩膜缘取下角膜。实验狗眼由北京大学第一临床医院动物实验室提供。取新鲜狗角膜植片后,马上固定于包含于PBS的2%甲醛中约2 h,蒸馏水对其洗涤几次后,放于1.5 N的氢氧化钠中进行4℃～60℃孵育,从而除去固定组织中细胞,蒸馏水洗涤30 min后,置于0.5%天门冬氨酸中孵育以消除残余的游离固定剂并降低pH至7.4,单独置于无菌包装内。

1.3 透明脱细胞基质植片的制备

手术前依次置于15%,30%,50%甘油中各10min,植片变为透明,PBS冲洗后备手术用。(甘油:厦门鱼肝油厂)

1.4 板层囊袋内移植

取新西兰白兔9只,雌雄兼有,体重2.0～2.5kg。30 mg/kg盐酸氯胺酮,5 mg/kg盐酸塞拉嗪肌肉注射麻醉动物,局部用0.5%盐酸丙美卡因后开睑。分别在近角膜缘及角膜中央区1/3基质内做一直径7 mm的囊袋在囊袋内剪除约1/3厚度角膜基质,然后,将一直径约4 mm,厚约200μm无菌脱细胞狗角膜基质放入囊袋内做间断缝合将囊袋口封闭。所有手术移植白兔术前及术后均未给予全身或局部任何抗生素或免疫抑制剂。

1.5 临床观察

1.5.1 脱细胞基质的大体性状观察

脱细胞基质及其脱水处理后大体观对比,HE染色及扫描电镜观察。

1.5.2 角膜术后各组临床眼表观察评定

兔角膜每天进行日常观察,每周两次裂隙灯照像观察角膜透明度,血管生长情况,眼内反应情况。

1.6 组织学观察

于术后7、30及90 d不同时间点处死术后兔子,过量水合氯醛麻醉处死,取角膜,4%多聚甲醛4℃固定24 h,O.C.T包埋,行HE染色。脱细胞基质分别进行HE染色,扫描和透射电镜观察其结构及细胞情况。

2 实验结果

2.1 脱细胞角膜基质大体观察和组织学观察

脱细胞角膜基质大体呈灰白色,半透明,其后经甘油脱水处理后的脱细胞基质呈完全透明,组织结构与未脱水的相比没有明显区别,见图1。HE染色光镜下脱细胞角膜基质经脱细胞后未观察到蓝染细胞核及细胞碎片残留,胶原组织排列规则疏松,可以保持理想的三维网状结构,同时也未见其他微生物污染,见图2。

扫描电镜下可见脱细胞角膜基质胶原组织排列好,呈三维网状结构,未见细胞成分。低倍下可观察到胶原板层清晰,结构完整,板层厚度均匀,层间致密,板层内胶原纤维束纵行排列,粗细均匀,互相平行似波浪状,高倍下可观察到胶原纤维束内胶原纤维互相构织成网状,网眼大小略不同,但网眼内未见任何微生物,见图3。

2.2 生物相容性

板层间囊袋内植入脱水处理后的脱细胞基质HE染色结果,见图4。狗脱细胞角膜基质植入兔眼角膜基质板层囊袋内,术后第14天术眼角膜基质囊袋内脱细胞角膜基质和周围受体角膜基质间紧贴无炎症细胞和新生血管侵入,可见少量角膜基质细胞进入脱细胞角膜基质。

2.3 临床观察

术后植入处角膜水肿,呈半透明状:角膜移植术后1周左右,植片基本透明,与缝线处水肿,中央区透明,可以清晰观察到前房内情况,前房内无明显炎症反应,前房维持好。术后第2～3天水肿消失,观察兔子行动自如,无明显分泌物。至术后1个月角膜仍可保持透明,前房内无明显炎症反应。术后近3个月逐渐出现新生血管,这种新生血管常累计创口及缝线周围,见图5。

A:脱细胞狗角膜基质脱水之前角膜基质呈混浊状;B:甘油脱水后角膜基质透明清晰可见下方英文字母;C:塑料皿做对照;D:复水1小时后角膜透明度下降

狗脱细胞角膜基,全层均未见蓝染细胞核,HE染色左图:×100;右图:×400

左图:狗脱细胞角膜基质植入兔眼角膜基质板层囊袋内。(HE染色×400)右图为正常兔角膜。(HE染色×100)

左图:脱细胞狗角膜基质植入术后第一天,角膜植入物仍有轻水肿;右图:裂隙光下可见基质中央植入区水肿

3 讨论

由于不断增长的角膜供体需求的增长,寻找或重建角膜移植替代物成为当今研究的热点。理想的角膜支架材料应具备下列特点:(1)良好的生物相容性。自身及其降解产物对机体无毒性,不引起排斥反应和炎性反应,不致畸变。(2)材料携带具有生物诱导性的多种角膜细胞生长因子,可诱导自体多种角膜细胞沿材料支架生长繁殖。(3)支架材料的降解速率与植入角膜细胞形成组织器官的速率相匹配,在支架完成为角膜组织提供模板功能后,可被完全降解吸收、或成为与新生组织相互融和的组成部分。(4)可按角膜组织的特点和缺损情况进行塑形,形成一定的曲率,达到完善的形态修复。(5)具有一定的坚韧性和与人体角膜相似的各种物理和化学性能,可加工成型,能形成三维立体结构,为细胞在支架中生长和物质代谢提供足够的空间[5,6,7,8,9]。

作为细胞生长的基质,羊膜是现今研究的热点,然而它并不能替代较深层的角膜基质,移植后很快溶解,并不是理想的角膜替代物,笔者准备选用经组织工程脱细胞处理的异种角膜作为组织支架,这项技术已应用于口腔科和皮科,但少用于眼科。

经过多步骤脱细胞处理,组织中的可溶性蛋白及细胞成分被去除,保留下来的是具有完整外观形态和组织学超微结构的不溶性基质成分,主要包括胶原、弹性蛋白、非胶原糖蛋白、蛋白多糖和糖胺多糖。脱细胞基质基本上保持了细胞外基质的主要成分和结构。现采用除垢剂-酶消化法和酶-冰冻法等对牛和兔角膜进行适当的脱细胞处理,将处理后的角膜与正常角膜比较,组织学超微结构有胶原蛋白多糖和糖蛋白,肉眼观察和正常角膜无明显变化。保留基质及网状结构,有良好的细胞相容性和组织相容性,可作为组织缺损材料及组织工程的角膜支架材料。同时具有角膜的透明性,这是其他支架所没有的优点。

脱细胞处理并不仅仅去除组织中的细胞成分的作用,笔者通过制备一个完好保留的细胞外基质,目前大量的研究已经证明了细胞外基质对与其相接触的细胞的各种行为起着非常重要的调节作用,围绕在细胞外的基质是一种相对很稳定的结构物质,但是只认为围绕在细胞外的基质对于细胞仅仅起着惰性的支持和框架的作用,新观点认为构成细胞外基质的每一种成份对于与它相接触的细胞的生长,分化都有着特殊的功能,由他们结合而构成的三维立体空间的细胞外基质,对于细胞的生长,分化,代谢,调节都起着不可替代的作用,反过来由于这些细胞外基质是由细胞所产生,所以细胞对于围绕在起周围的细胞外基质起着这样或那样的作用和影响,其空间结构对于细胞的代谢,形态生长分化有着密切相关的作用。因此,对于通过该技术特殊处理过的组织,由于所有能够被宿主识别出对宿主表达组织免疫抗原性的细胞物质被去除,而完整保留下来的细胞外基质其形态,组织结构,超微结构,定位和耐受性等都与原有组织的基质一样。

生物相容性是该活性角膜基质能否应用于临床的先决条件,笔者将脱细胞角膜基质进行角膜板层囊袋内移植,研究发现可以长期存留,保持透明性,未诱导出现特异性变态反应,这是因为基质层在角膜3层中免疫原性最低,仅占角膜总免疫原性的1.62%和6.12%,材料经处理后,免疫原性进一步降低[7]。直接将脱细胞基质埋在宿主角膜层间可直接观察角膜载体移植后的炎症反应,组织愈合,材料转归等组织相容情况,本实验中观察期内角膜修复较透明,无明显的炎症反应及排斥反应,宿主基质细胞可以很快移行进入植片内,提示其具有成为细胞载体的潜能,对于脱细胞基质对诱导宿主角膜各种细胞的影响,胶原组织代谢,在角膜重构中的作用在本实验尚缺乏相关的实验跟踪研究。

与以往的脱细胞基质相比,笔者的脱细胞处理方法可以有效的脱净细胞,并保持角膜三维结构,和透明性,植片生物相容性好。

异种来源的生物组织用于临床可能仍需要很长的道路,因为存在伦理学的争论,同时人们担心异种移植可能带来动物源性逆转录病毒与人类细胞的整合从而出现新的致病因素,尽管如此,由于移植器官的缺乏,人们仍在尝试各种方法使之成为可能,异种脱细胞角膜基质因为没有细胞的存在而大大降低了此种可能性,同时由于角膜部位属于相对免疫赦免器官,进行移植的成功率和可能性大大超过其他器官[10,11,12,13,14]。尽管异种脱细胞角膜基质为基础作为角膜移植替代物仍需更多更深入的研究,异种脱细胞角膜基质具有角膜组织的三维结构和透明性,组织内胶原分布均匀,良好的生物相容性这些均是其他生物材料所不能比拟的,宿主细胞可以在脱细胞基质内的移行和良好生长为进一步以其为载体体外构建生物工程角膜提供了良好的基础与前景。

摘要：目的探讨异种角膜脱细胞基质的制备方法,观察异种脱细胞角膜基质的超微结构。方法取新鲜狗角膜进行脱细胞处理,用光学显微镜和扫描电镜观察植片的形态学改变。从一脱细胞狗角膜基质取1mm厚组织片,植入兔角膜囊袋中,分别于术后不同时间点对其进行临床观察及组织切片看形态学改变,及其与受体组织融合情况。结果脱细胞后的狗角膜组织呈现无细胞的三维网状,肉眼观察为灰白色半透明组织,经脱水处理后呈透明状,组织切片中未见蓝染的细胞核结构,扫描电镜示基质纤维完好,呈有序的平行结构排列的透明结构。植入囊袋中可见局部水肿不明显,呈半透明状,术后1个月可见有新生血管长入。结论脱细胞处理方法可以有效的脱净细胞,并保持角膜三维结构和透明性,宿主细胞可以长入异种脱细胞角膜基质植片中并在植片中增殖,与其他方法处理的脱细胞基质相比,组织的生物相容性更好。

基质干细胞 篇8

1 资料与方法

1.1 一般资料

选用荧光定量PCR试剂盒、胎牛血清、乌龙茶、胰蛋白酶RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒以及青-链霉素溶液作为主要试剂, 并选用倒置荧光显微镜、CO2培养箱、PCR仪以及荧光定量PCR仪作为试验的主要仪器。

1.2 方法

1.2.1 对乌龙茶中茶多酚进行提取

应用定量秤称取5kg茶叶, 将茶叶磨碎后与浓度为60%的100mL乙醇溶液相混合, 然后在70℃水浴中浸泡30min, 重复此操作步骤3次, 将滤液合并, 将其真空抽空后再过滤。对乙酸乙酯进行萃取, 然后滤液, 3次后将萃取液合并, 旋转蒸发仪后使其浓缩, 然后在真空冷冻条件下将浓缩所得制剂干燥化, 将茶多酚提取物取出, 最后应用DMSO溶液对茶多酚进行稀释, 所得溶液于零下20℃的环境中保存。

1.2.2 对hbMSCs进行分离与培养

试验必须在无菌条件下进行, 将抽取的5mL患者骨髓放入装有ACD抗凝液的离心管中调匀, 再将5mL生理盐水加入其中, 打散其中的细胞, 将细胞悬液以渐进性速度加入淋巴细胞分离液中 (容量为10mL) , 采取离心、分层, 从骨髓干细胞层中抽取淡黄色液层, 将淡黄色液按1∶1比例置入生理盐水中, 摇匀后在培养瓶中进行接种, 然后放入37℃的环境中, 在浓度为5%的CO2培养箱中进行培养, 两天后初次换液, 之后每3天更换1次, 当细胞融合至90%时, 应用浓度为0.25%的胰酶进行传代[1]。

1.2.3 茶多酚EGCG在hbMSCs试验中的作用

取出传代至第3代的hbMSCs, 将其按密度为105M接种于含有六孔的培养板中, 将应用浓度为10-5M以及10-6M的茶多酚EGCG作用于人骨髓基质干细胞3周后相关基因的表达变化与DMSO阴性空白对照后进行对比, 细胞融合至90%时, 将茶多酚培养液置入其中, 设置组别为空白对照组 (DMSO阴性组) 、10-5M茶多酚组、10-6M茶多酚组[2]。

1.2.4 对RNA进行提取与逆转录

细胞培养21天后, 应用PBS对细胞进行冲洗, 二次后得到提取物hbMSCs, 然后对RNA进行提取, 应用Trizol提取方法, 最后实施逆转录反应。提取菌株, 并应用PCR荧光定量分析法制备标准品, 观察菌株特异性引物的PCR检测过程中的反应, 对产物进行切胶与回收, 提取其DNA片段, 并将其作为定量的标准品。

1.3 统计学分析

选用SPSS17.0软件进行数据分析, 采用卡方检验进行计数资料的对比, 应用Student t检测方法进行计量资料的对比, 最后检测P值, P<0.05表明数据存在差异性, 具有统计学意义。

2 结果

应用荧光定量PCR法测定三组人骨髓基质干细胞基因表达的结果, 见表1。

(±s)

对BMP-2基因的表达水平进行总结, 其中DMSO对照组浓度低于10-6M的茶多酚EGCG<浓度为10-5M的茶多酚EGCG。而ALK以及RUNX2基因在三组间的表达无显著变化, 因而不具有统计学意义 (P>0.05) 。

3 讨论

本研究结果显示, 采用荧光定量PCR测定法对ALK、RUNX2、COLIAI以及BMP-2等基质干细胞向成骨分化过程中产生重要作用的基因, 能分化激活骨髓基质干细胞, 并提高骨细胞成熟率, 而在逆转录以及成骨分化过程中, 具有重要意义[3,4]。骨细胞中含量最为丰富的两种成分为ALK、COLIAI, 其中ALK具有水解作用, 能水解为有机磷酸酶, 使局部磷酸根浓度得以提高, 在钙的作用下实现钙化;CO-LIAI中含有的胶原蛋白具有特异性, 茶多酚对骨分化基因中的COLIAI、ALK以及RUNX2具有较小影响[5,6]。

综上所述, EGCG在骨分化bmp-2的基因表达水平中具有重要的促进作用, 而骨形态蛋白作为骨髓基质干细胞成骨分化基因的重要部分起到了诱导性作用, BMP-2不仅对未分化的细胞有促进分裂作用, 对BMSC也有骨细胞分化的转化作用, 同时有利于其实现钙化, 因此BMP-2基因表达一旦达到相应阈值就能起到很好的诱导性作用。茶多酚EGCG对人骨髓基质干细胞成骨分化基因的BMP-2的表达水平具有促进作用, 有利于研究的进一步开展。

摘要：目的:观察并探讨茶多酚EGCG对人骨髓基质干细胞成骨分化基因中有关成分表达的影响。方法:应用浓度为10-5 M以及10-6 M的茶多酚EGCG作用于人骨髓基质干细胞, 3周后对比分析相关基因的表达变化, 并与DMSO阴性对照, 总结茶多酚EGCG对人骨髓基质干细胞成骨分化基因的相关影响。结果:DMSO对照组浓度低于10-6 M的茶多酚EGCG<浓度为10-5 M的茶多酚EGCG。结论:茶多酚EGCG对人骨髓基质干细胞成骨分化基因BMP-2的表达水平有促进作用。

关键词：骨质疏松症,茶多酚EGCG,人骨髓基质肝细胞,成骨分化基因

参考文献

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基质干细胞 篇9

脱细胞真皮基质(ADM)除去了真皮中的细胞成分(如成纤维细胞、内皮细胞、皮脂腺、汗腺等),只保留了胶原纤维支架,是良好的生物医用材料。它具有独特的三维网状结构、良好的物理力学性能、优异的生物学性能等,且猪皮来源丰富、价格低廉。近年来,在烧伤整形、神经外科、头颈外科、牙周病等多个领域均得到了广泛应用,效果较好。但在使用过程中依旧有诸多不足需要改善,其中,抗感染能力弱,严重影响了伤口的修复愈合,使临床应用成功率大大降低。因此,具有一定抗菌抑菌性能的脱细胞猪真皮基质成为研究的重点之一。

目前使用较多的抗菌抑菌性改性材料有硝酸银、纳米银等,经过含银材料改性后,赋予了脱细胞真皮基质一定的抗感染能力,具有较强的局部抗菌作用[1,2,3]。然而,含银抗菌材料也存在一些缺陷:如银离子浓度过高会对身体产生毒性、含银敷料暴露在空气中容易变色、使电解质紊乱引发患者不适等。因此,寻找更适合的抗菌材料成为必然。目前,季铵盐类材料是市面上广泛使用的抗菌抑菌剂之一,它在织物、塑料以及其他生物医用材料上的应用也启示了将其应用在脱细胞猪真皮基质上的可能性。基于以前的研究工作[4],本文采用季铵盐改性脱细胞猪真皮基质,以期研制出抗菌性能优良的生物敷料。

2 实验材料和仪器

脱细胞猪真皮基质(pADM),江阴奔翔生物科技有限公司;十二烷基三甲基氯化铵(DTAC),AR,成都科龙试剂厂;蛋白胨,BR,成都长寿生物制剂有限公司;琼脂粉,BC,天津科密欧化学试剂有限公司;牛肉浸膏,BR,成都长寿生物制剂有限公司;其他试剂均为分析纯。视频接触角测量仪,OCAHZOO,德国DataPhysics。

3 实验方法

3.1 季铵盐型脱细胞猪真皮基质的制备

称取2 g pADM(干基)置于盛有100 m L蒸馏水的锥形瓶中,分别加入1%、5%、10%的十二烷基三甲基氯化铵,37℃下恒温水浴震荡72 h,加入少量NH4Cl处理30 min,调节pH为6.5~7.5,冷冻干燥,保存备用。

3.2 静态接触角的测定

将DTAC改性p ADM制成1.5 cm×7 cm大小的薄片,采取坐滴法,以6μL煮沸冷却的蒸馏水液滴滴于材料表面上,记录液滴与材料表面接触瞬间的图像,利用软件测得接触角。每个样品选5次测定的平均值。

3.3 吸湿率、溶胀率以及毛细管吸水率的测定

将DTAC改性pADM制成2cm×2 cm大小的薄片,在室温、65%相对湿度下平衡24 h。测定材料的质量后,将其放置于一定体积的蒸馏水中,培养皿(Φ9 cm)中37℃下静置24 h,用洁净的镊子夹住材料的一角于空中悬挂30 s,测定材料湿重,平行3组。再用滤纸吸干材料表面水分,称重,记录为,最后将材料置于离心管中,10 000r/min下脱水15 min后,称重,记录为。吸湿率、溶胀率以及毛细管吸水率分别按式1、式2和式3计算。

3.4 抗菌性能评价

将灭菌后的牛肉浸膏蛋白胨培养基趁热(40~60℃)倒入无菌培养皿(Φ9 cm)中,每个皿12~15 g,置于无菌室冷却凝固。用无菌移液器取200μL制好的菌悬液(大肠杆菌或金黄色葡萄球菌)于无菌平板中,并用无菌涂布器涂布均匀,制成带菌平板。再将紫外灭菌的季铵盐型p ADM(直径25 mm)圆片置于带菌平板中央,轻压,使其紧贴平板,每组5个平板,最后将平板置于37℃恒温培养箱中培养48h,测量并记录抑菌圈直径,计算平均值。

4 结果与讨论

4.1 接触角

作为敷料,材料的表面性能对于其应用有非常重要意义,一定的亲水性有助于细胞在材料表面的贴附与增殖,有益于伤口愈合。从图1明显看出,随着DTAC用量的增加,接触角逐渐减小。接触角越小,材料表面的亲水性越好。十二烷基三甲基氯化铵属于季铵盐,具有良好亲水性,用它浸渍后,增加了材料表面的亲水基团,提高了材料的亲水性。创伤修复的“湿法疗法”认为[5],湿润的微环境比干燥环境更有利于伤口的愈合。因此,亲水性的提高将有利于伤口的愈合。

4.2 吸湿率、溶胀率以及毛细管吸水率

由图2可知,吸湿率呈现出先升高后下降的趋势,其中DTAC用量5%时,吸湿率最高。可能是在一定浓度范围内,处理后的脱细胞猪真皮基质材料表面及纤维内部吸附了十二烷基三甲基氯化铵,此季铵盐抗菌剂有较好的亲水性,即对水的吸附作用;但用量再增大后,大量十二烷基三甲基氯化铵材料浸入脱细胞猪真皮基质材料的纤维间隙内,并且其渗透速度随浓度的增大而增大,使DTAC与胶原结合减慢,加之空间位阻的影响,在一定程度上出现了阻碍水进入的可能,因此10%的吸附水率又降低。溶胀率是吸去表面水分后所剩余的充盈于材料间隙之间的自由水含量,5%用量时溶胀率最高,其次是1%、10%,进一步显示了当DTAC超过某一用量范围时,用量越大,自由水浸入纤维内部的机会越少。在生物医用材料使用的过程中,挤压、粘贴等会使得吸附于材料表面或材料之间的水分被挤出。从毛细管吸水率可见,在高速离心作用下,各用量DTAC改性的pADM的毛细管吸水率基本一致,都比未改性的高,证明季铵盐抗菌材料的引入,增加了极性基团,且其氨基与胶原纤维上的羧基基团可能发生反应,使得纤维间隙缩短,毛细管效应增大,可固定更多的结合水。在敷料的使用过程中,结合水的存在可起到湿润伤口,加速伤口愈合的作用,同时此种抗菌剂的引入又可减少伤口感染。

4.3 抗菌性能

在敷料的使用过程中,细菌感染引发炎症往往是伤口愈合的极大阻碍之一,也是众多研究者渴望解决的问题之一。由图3可以看出,随着DTAC用量的增加,抑菌圈的直径也随之增加。可见DTAC改性pADM对于常见的革阴氏和革阳氏两种细菌都有较好的抗菌作用。图4、图5分别为用量1%、5%、10%的十二烷基三甲基氯化铵改性pADM材料对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑菌圈的图片。有研究[6,7]指出季铵盐材料抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的机理与过程是,季铵盐具有N+官能团,带正电荷,而大肠杆菌细胞和金黄色葡萄球菌均表面带负电荷,依靠静电作用将细菌吸附在材料表面。由于菌的呼吸链存在于细胞膜上,被吸附后,使得呼吸链上的酶受到限制,同时氧和其它小分子营养物质的渗透也受到影响,随着时间的延长,季铵盐单体扰乱细胞膜的双层结构,影响膜的渗透性,破坏菌体内外的渗透压平衡,促使细胞内物质泄漏,从而导致细胞变性以至于完全被破坏死亡。简单总结为静电吸引、抑制活性和破坏等杀菌过程。对于本研究,可能是由于处理后的pADM表面的DTAC材料在一定条件下有溶出,使得培养基周围均匀分散了一定量的抗菌材料,带正电荷的季铵盐材料通过静电作用与细菌迅速结合,季铵盐再进一步破坏细菌的细胞膜双层结构,从而逐步使细菌死亡。随DTAC用量的增大,溶出率也增大,从而抑菌圈也增大。

5 结论

脱细胞猪真皮基质(pADM)经过季铵盐型抗菌剂DTAC改性后,接触角明显减小,亲水性增大。随DTAC用量的增加,改性后p ADM的吸湿率、溶胀率及毛细管吸水率有先上升后减小的趋势;对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用,且抑菌圈均随着DTAC用量的增大而增大。季铵盐型抗菌剂有望成功应用于脱细胞猪真皮基质或其他相似的生物医用材料,但若作为植入材料使用,则需要更进一步考察其细胞毒性、生物相容性等。自主合成的多功能季铵盐型抗菌剂以及相关抗菌型生物材料的研究将会是此领域今后的发展方向。

摘要：采用不同用量(1%、5%、10%)的十二烷基三甲基氯化铵(DTAC)浸渍脱细胞猪真皮基质(pADM),测定了改性后pADM的接触角、吸湿率、溶胀率、毛细管吸水率以及对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌性能。结果显示:通过DTAC处理后的pADM,接触角随DTAC用量的增大而减小,吸湿率、溶胀率与毛细管吸水率随DTAC用量的增加呈现先升高后减小的趋势。随着DTAC用量的增大,抑菌圈直径也增大,抑菌性能增强。

关键词：季铵盐,脱细胞真皮基质,抗菌

参考文献

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基质干细胞 篇10

1 骨髓干细胞治疗脑梗死的研究现状

目前临床上利用干细胞技术治疗脑梗死有两类方法。一种是通过药物激活位于大脑室管膜下区或骨髓等区域的内源性干细胞, 使其迁移至脑组织受损部位, 发挥替代作用;另一方法是将来源于胚胎或新生儿脐带血和脐带的间充质干细胞, 通过静脉、腰穿或直接移植到脑受损的部位, 发挥治疗作用[4,5]。骨髓干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的原始骨髓细胞, 至少含有三种干细胞, 即造血干细胞 (hematopoietic stem cell, HSC) 、间充质干细胞 (mesenchymal stem cell, MSC) 和内皮祖细胞 (endothelial precursor cell, EPC) 等。在某些环境下[6,7,8,9], 骨髓干细胞可以被诱导分化成神经干细胞、神经元样细胞、心肌细胞及肝、肺、骨、血管内皮等多种组织细胞。局部损伤后在多种细胞黏附分子、生长因子和趋化因子的作用下, 骨髓干细胞可定向迁移至损伤部位或者其邻近部位, 以对受损组织行结构修复和功能重塑[10]。在骨髓干细胞治疗脑梗死的过程中, 无论干细胞是否发生定向分化, 它们首先必须募集并在受损部位停留, 以发挥它们的治疗作用。

2 SDF-1/CXCR4轴在干细胞治疗脑梗死中的作用

2.1 SDF-1/CXCR4的结构与分布

趋化因子是一组相对分子质量为8×103～14×103的具有趋化活性的细胞因子, 是一类分泌型小分子多肽, 一般由70个～90个氨基酸组成。根据半胱氨酸的数量和位置在氨基酸序列中的不同, 将其分为 CXC、CC、C和 CX3C 四个亚族。1994年Nagasawa等在小鼠骨髓基质细胞系pA6分泌的细胞因子中发现SDF-1, 根据其结构和功能属性, 将其归为趋化因子CXC亚族, 并被命名为CXCL12[11]。SDF-1有SDF-1α、SDF-1β和 SDF-1γ三个亚型, 其中SDF-1α基因编码89个氨基酸, SDF-1β基因编码93个氨基酸。人的SDF-1种群间保守性极强, 人源性SDF-1和鼠源性SDF-1高度同源, 仅相差1个氨基酸, 同源性高达99%。SDF-1在骨髓、大脑、心、肺、脾、肝、肾、胸腺等器官中持续表达。SDF-1的特异性受体CXCR4是通过功能性的cDNA克隆技术获得的趋化因子受体, 又称为融合素 (fusin) , 由352个氨基酸组成α螺旋7次跨膜结构, 分胞外区、跨膜区和胞内区。主要在造血干细胞、神经干细胞、一些组织前体细胞、原精细胞、骨骼肌卫星前体细胞、视网膜色素上皮前体、鼠类胚胎干细胞表面表达。

2.2 SDF-1/CXCR4的细胞内信号转导途径

SDF-1与CXCR4的特异性结合能产生跨膜信号, 进一步实现其生物学功能。可通过调控PI3K-MAPK及PI-PLC途径从而改变骨髓干细胞的迁移能力, 其中又以PI-PLC途径为主, 而SDF-1/CXCR4介导的骨髓干细胞迁移与PI3K-MAPK途径下游所激活的基质金属蛋白酶 (MMP) 有关。SDF-1的趋化活性与其他趋化因子相同, 可以被百日咳毒素阻断, 提示CXCR4受体通过Gi蛋白转导信号[12]。PTX处理过的造血干细胞归巢能力显著下降[13], 说明SDF-1/CXCR4调节信号的跨膜传递, 偶联PTX敏感的Gi蛋白受体家族。SDF-1只有与CXCR4的第2胞外环ECL2结合后才能启动下游信号途径, 主要包括激活钙流、激活黏着斑元件 (如衔接蛋白、黏着斑激酶等) 、激活丝裂酶原活化蛋白激酶途径、激活PI-3K-AKT-NF-κB途径、激活JAK-STAT途径等, 将趋化、生长、增殖或分化信号传递至细胞核。

Stokman等[14]研究发现, SDF-1/CXCR4结合后可提升环磷腺苷 (cAMP) 并激活PKA, PKA再通过Ser-188磷酸化而阻断Rho与Rho激酶的相互作用, 或者在细胞毒素T细胞中改变其从胞膜到胞质溶胶的定位使Rho失活, 再介导其下游一系列磷酸化/脱磷酸化反应。众多研究表明, SDF-1/CXCR4轴的趋化作用是通过几个互补的信号通路相互作用而不是激活某个单一的信号通路而实现的。

2.3 SDF-1/CXCR4的生物学效应和脑梗死治疗

随着实验者对SDF-1/CXCR4轴的生物学功能研究不断深入, 现已知其功能主要有调控干细胞迁移;介导免疫及炎症反应;与艾滋病 (HIV) 病毒感染有关;参与胚胎发育过程;介导恶性肿瘤的生长、浸润和转移等[15]。SDF-1与CXCR4结合后对骨髓干细胞在体内的募集和归巢的影响, 主要包括趋化作用、黏附作用和促分泌作用等。目前尚无研究证明SDF-1能否影响干细胞的存活。

2.3.1 SDF-1/CXCR4轴与干细胞的趋化

在缺血、缺氧、损伤或者病理微环境中, SDF-1在细胞表面整合素激酶、低氧诱导因子-1 (hypoxia inducible factor-1, HIF-1) 的作用下表达释放增加[16]。CXCR4在正常时几乎无表达, 而在局部缺血时表达明显增加。Imitola等通过研究发现, 在神经干细胞迁移到脑梗死损伤区进行修复的过程中, 病灶区残存或者边缘区来源的组织内皮细胞和星形胶质细胞SDF-1的表达上调, 进而激活神经干细胞表面的受体CXCR4, 形成SDF-1/CXCR4轴效应, 调控神经干细胞向梗死区迁移[17]。组织器官损伤后产生的炎症因子可刺激骨髓间充质干细胞内部的CXCR4转移到细胞表面[18], 趋化因子SDF-1对骨髓间充质干细胞表面的CXCR4具有极强的化学吸引作用, 其与CXCR4的特异结合介导骨髓间充质干细胞的定向迁移和归巢。申明琪等[19]的体外实验证明, 骨髓间充质干细胞向梗死后脑组织上清液发生明显细胞迁移, 用ELISA法检测出梗死后脑组织上清液中SDF-1水平显著提高, 同时骨髓间充质干细胞表面的CXCR4表达明显上调。说明骨髓间充质干细胞具有向缺血缺氧脑损伤组织趋化迁移能力, SDF-1/CXCR4轴在该定向迁移过程中可能发挥重要作用。张志坚等[20]体内移植研究显示, 将骨髓间充质干细胞移植到脑梗死大鼠体内2周后, 干细胞集中分布于大脑梗死灶周围, 而用AMD3100阻断CXCR4后, 迁移到梗死灶周围的骨髓间充质干细胞大大减少。此结果说明, 在体内骨髓间充质干细胞的迁移行为受 CXCR4 阻断的影响, 同时提示脑梗死后损伤组织的SDF-1分泌很可能增加。此外, 骨髓与外周血之间、外周血与损伤组织之间存在的SDF-1浓度梯度可以诱导造血干细胞的迁移[21]。

2.3.2 SDF-1/CXCR4轴与干细胞的黏附

内皮细胞表面表达的SDF-1不仅能捕获迁移中的骨髓干细胞, 同时通过SDF-1/轴CXCR4轴介导的细胞反应, 激活干细胞穿越内皮细胞层的迁移运动。SDF-1不但是化学趋化因子, 还能使干细胞“滞留”在血管周边[22]。这些作用的实现都需要黏附分子的参与。SDF-1通过活化干细胞表面的多种黏附分子, 调节细胞与纤维蛋白原、纤维连接蛋白、间质细胞及内皮细胞的黏附。SDF-1启动了细胞间黏附分子-1 (ICAM-1) /淋巴细胞功能相关抗原-1 (LFA-1) 以及血管细胞黏附分子-1 (VCAM-1) /超延迟抗原-4 (VLA-4) 之间的黏附;并引起细胞极性改变和促使干细胞透过内膜下胞外基质跨血管壁运动, 若阻断VLA-4或VCAM-1, 干细胞归巢能力将至少下降90%。SDF-1也通过影响细胞内骨架蛋白的重排, 增加丝状肌动蛋白束的数量和厚度来提高细胞的运动能力。在大鼠脑损伤后骨髓间充质干细胞的体外迁移试验中, 选择性趋化因子单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1) 、人巨噬细胞炎性蛋白1α (MIP-1α) 和白细胞介素-8 (IL-8) 也有表达, 但这些黏附分子的具体作用机制尚不清楚[23]。

2.3.3 SDF-1/CXCR4轴与干细胞的分泌

CXCR4与SDF-1结合并活化核转录因子NF-κB后, 可激活干细胞分泌基质金属蛋白酶-2 (MMP-2) 、基质金属蛋白酶-9 (MMP-9) 、NO以及某些细胞因子、生长因子等, 调节干细胞的部分自/旁分泌作用。Son等[24]研究显示, 造血干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血干细胞均可分泌活性的MMP-2、胞膜1型-MMP (MT1-MMP) 。在缺氧环境下, 干细胞分泌MMP-2、MMP-9和MT1-MMP增加, 与干细胞趋化和毛细血管形成密切相关。同时, SDF-1能促进CD34+细胞内的钙离子浓度的增高, 且AKT的活化可以使第二信使NO的产生增加, NO能增强SDF-1诱导的骨髓干细胞的趋化性。

2.3.4 SDF-1/CXCR4的其他作用

有研究发现, 脑损伤后SDF-1α mRNA表达和SDF-1α蛋白合成没有增加, 但1 d～3 d后在脑皮层弥散分布, 且CXCR4 mRNA以及蛋白合成的增加有显著性差异, 同时Nestin阳性细胞的分布也增加, 说明SDF-1α/CXCR4系统能够促进神经干细胞在脑损伤后的脑区表达[25]。SDF-1在小脑中可以调节突触的传递[26];离体实验证实SDF-1能够通过抑制Rho激酶的活性来促进神经元轴突的延伸[27];Salvucci等[28]实验证明SDF-1能促进内皮细胞表达VEGF, 而VEGF等够诱导内皮细胞表达CXCR4。若阻断SDF-1/CXCR4轴的功能, 可抑制VEGF依赖的血管形成。说明SDF-1能调节内皮细胞迁移及血管新生。

此外, SDF-1α/CXCR-4可作为糖尿病视网膜病变预测指标, 阻断SDF-1α/CXCR-4轴可能可以延缓或阻止糖尿病视网膜病变的发生发展[29];区文超等[13]通过实验证明, 增加CD34+细胞CXCR4的表达有助于宫内移植HSC的归巢, HSC宫内移植归巢过程依赖CXCR4受体;王轶英[30]的研究结果提示, SDF-1及CXCR4在正常妊娠的不同时期均发挥着重要作用, SDF-1及CXCR4在孕早期表达较强, 峰值持续至孕中期, 随着妊娠的继续, 表达逐渐减弱。

3 展 望

就目前的研究认为, SDF-1/CXCR4 轴在骨髓干细胞迁移的各个环节均起重要作用。然而, 干细胞的归巢受到多种因素的影响。除SDF-1/CXCR4轴外, 脑源性生长因子、肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子等对干细胞的迁移可能都有一定调控作用[31]。

脑组织损伤后修复是一个多因素多环节的过程。由于干细胞领域基础研究的迅速发展, 骨髓干细胞的临床应用逐渐成为治疗缺血性脑血管病变有效方法之一。近几年来关于SDF-1及其受体CXCR4的研究取得越来越多有价值的成果, SDF-1的作用也日益受到重视, SDF-1/CXCR4轴的生物学效应被视为骨髓干细胞治疗脑梗死的过程中的关键环节。随着SDF-1/CXCR4轴作用机制研究的不断深入, 调控SDF-1/CXCR4轴, 增加干细胞的治疗效果, 将成为治疗缺血性脑血管病的一个全新的干预靶点。

摘要：脑组织损伤后修复是一个复杂的过程。随着干细胞领域基础研究的迅速发展, 外源性骨髓干细胞移植和内源性骨髓干细胞动员的临床应用逐渐成为治疗缺血性脑血管疾病有效方法之一。基质细胞衍生因子-1 (stromal cell-derived factor-1, SDF-1) 及其特异性受体CXCR4 (CXC chemokine receptor 4) 结合后形成的SDF-1/CXCR4轴, 在脑梗死时骨髓干细胞的迁移、募集过程中起着关键作用。通过调控SDF-1/CXCR4轴, 增加干细胞的治疗效果, 将成为治疗缺血性脑血管病一个新的干预靶点。本文就脑梗死的干细胞治疗, 以及SDF-1/CXCR4轴在骨髓干细胞的迁移、募集和脑梗死修复过程中的作用作一综述。