基质细胞（精选10篇）
基质细胞 篇1
牙周疾病造成的牙周附着丧失和牙槽骨缺损是临床急需解决的一个重要问题,而组织工程学理论和应用的迅速发展为促进牙周组织再生提供了新的思路。骨髓基质细胞(bone marrow stromal stem cells, BMSCs)具有多向分化潜能,在体外诱导因子的作用下可向成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、神经细胞等方向分化[1,2],目前已成为牙周组织工程理想的种子细胞来源。近年来研究表明,釉基质蛋白(enamel matrix proteins, EMPs)能够促进牙周组织再生[3]。但目前还未见到有关EMPs对人BMSCs作用的报道。因此,本实验初步研究了EMPs对人BMSCs细胞周期和碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。
1 材料和方法
1.1 主要试剂、仪器
EMPs 从猪的牙胚中提取[4],并制成冻干粉备用;DMEM细胞培养基(Gibco,美国),胎牛血清(Hyclone, 加拿大),MTT(Amersco, 美国), CO2培养箱(Thermo Life sciences, 美国),倒置相差显微镜(Leica,德国),DMSO(宜兴市达华化工有限公司,江苏),流式细胞仪(FACSalibur, Becton Dickinsan),碱性磷酸酶试剂盒(上海仁宝医用试剂研究有限公司)。
1.2 人BMSCs的培养
采用全骨髓法培养人BMSCs。无菌条件下,用肝素化骨髓穿刺针于健康成年志愿者髂后上棘抽取骨髓,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液(含10%胎牛血清, L-谷氨酰胺 0.3 g/L, 100 U /ml青霉素及100 U /ml 链霉素),接种于培养皿中培养。3 d后半量换液,1 周后全量换液,去除悬浮红细胞及未贴壁细胞。此后每周换液2 次,倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。至细胞达到80%～90%左右的汇合后,进行传代培养。取第3代细胞用于实验研究。
1.3 细胞周期分析
选择增殖实验[5]中的EMPs作用人骨髓基质细胞最佳浓度200 μg/ml进行分析,以不加EMPs为空白对照。用流式细胞仪检测EMPs 对人BMSCs细胞周期的影响。
1.4 碱性磷酸酶染色
以矿化诱导液培养细胞(DMEM培养液加地塞米松10-8 mol/L,维生素C 50 mg/L,β-甘油磷酸钠10 mmol/L)。以200 μg/ml EMPs作用于细胞为实验组,以不加EMPs为对照组。培养2、5 d后,取细胞爬片按照试剂盒说明进行碱性磷酸酶染色。用图像分析系统测量平均灰度值。
1.5 统计学分析
采用SAS6.12软件对所得数据行统计学分析,检验水准为α=0.05。
2 结 果
2.1 人骨髓基质细胞的体外培养
接种后最初3 d内,培养皿中含有大量造血干细胞及悬浮细胞(包括血细胞及未贴壁单核细胞),无法观察到细胞贴壁情况。7 d时全量换液后,造血细胞成分基本消失,可见贴壁细胞呈细胞集落,其形态、大小和密度各不相同,大部分细胞呈梭形或三角形,少数呈多角形,细胞体积较大,细胞核较大,呈扁圆形。随着不断培养、换液,集落中的细胞逐渐扩增,呈放射状,细胞呈片状汇合。12～14 d后,细胞基本汇合成单层,长满整个培养皿底可进行传代(图 1)。传代后的细胞生长明显加快,4～6 h大部分细胞贴壁,细胞逐渐伸展为梭形、三角形或多角形,表面颗粒少;48 h后,可见细胞开始分裂增殖、聚集。5～6 d后即可见细胞汇合,长满培养皿底。
2.2 细胞周期分析
流式细胞仪测得细胞周期的分布情况见图 2及表 1。细胞周期的分布情况表现为EMPs组S期细胞数目较多,为19.48%,而对照组S期细胞数目为9.89%;对照组G1期细胞数目比例为89.46%,高于EMPs组的77.59%;说明 EMPs作用下的骨髓基质细胞具有较强的增殖能力。
2.3 碱性磷酸酶(ALP)染色
矿化诱导液培养2 d时,对照组和实验组均有少量阳性细胞,无明显区别(图 3);培养5 d时,可见实验组阳性细胞数明显增多,呈条索状、片状,而对照组阳性细胞数较少,稀疏(图 4)。经图像分析系统测定平均灰度值,2 d时,实验组0.18±0.02与对照组0.16±0.01无显著性差异(P>0.05);5 d时,实验组0.25±0.02与对照组0.21±0.03有显著性差异(P<0.05)。
3 讨 论
随着组织工程技术的发展,牙周组织再生的理论不断丰富,利用组织工程技术重建牙周组织成为可能。骨髓基质细胞是牙周组织工程中极有潜力的种子细胞。EMPs可以促进牙周组织再生已得到证实,而关于釉基质蛋白对骨髓基质细胞生物学作用的国内外报道甚少,并多为鼠、兔、猪等动物细胞的研究,因此该组织工程技术距临床应用尚有很大距离。本研究观察釉基质蛋白对人BMSCs生物学特性的影响,试图进一步了解EMPs促进牙周组织再生的机制。
目前常用的骨髓基质细胞的分离培养方法有2 种[6]:全骨髓培养法和密度梯度离心法。全骨髓培养法是一种保留造血干细胞和其他各种细胞混合培养的方法,将骨髓稀释后反复抽吸制成单细胞基液,利用BMSCs贴壁生长的特性将其分离纯化,由于维持了BMSCs原始的生活环境,有利于BMSCs的分化。本实验选择无血液疾病的健康成年人,利用全骨髓培养法成功培养了人骨髓基质细胞,体外培养的成人BMSCs 适应能力较强,接种成活率高,增殖速度较快,这可能是保留的血细胞成分中含有部分生长因子或促进贴壁的物质有关,而且全骨髓培养法维持了BMSCs原始的生活环境,更接近将来体内移植研究的要求。因此,利用BMSCs进行骨组织工程学的研究具有良好的应用前景。
目前评估细胞生长和增殖状况的方法主要有3 种: 3H-TDR 掺入法、MTT 比色法和流式细胞仪细胞周期检测法[7]。MTT 法检测细胞增殖结果显示,EMPs作用于人BMSCs 3 d时,200 μg/ml EMPs组与对照组相比差异即有显著性,说明该浓度有促增殖作用[5]。这与EMPs对兔BMSCs和鼠BMSCs增殖的结果不尽相同,虽然EMPs均能促进鼠[8]、兔BMSCs的增殖,但作用的浓度不同。结果不同的原因可能是由于细胞培养过程中,不同种属细胞分裂增殖活动恢复的快慢不同;其次可能与提取获得的EMPs的纯度和效价不同有关,当然也可能与不同实验室所用培养液的成分不完全相同有关。我们在用MTT法检测细胞增殖的基础上,进一步采用流式细胞仪检测EMPs对人BMSCs细胞周期的影响。结果显示,加入EMPs培养5 d的人BMSCs,G1期DNA含量减少,而S期DNA含量增高,表明EMPs可以增加人骨髓基质细胞DNA含量,具有促进BMSCs早期DNA合成,使细胞从G0/G1期进入S期的作用,从而促进细胞增殖。
碱性磷酸酶(ALP)的表达是成骨细胞分化的主要特征之一。我们观察了EMPs对人BMSCs的ALP活性的影响,发现5 d时,在EMPs条件下,ALP阳性细胞数明显增多,呈条索状、片状。表明BMSCs可在矿化诱导液培养下,向成骨细胞方向分化,并可被EMPs所增强。诱导的细胞能够产生ALP, 也表明BMSCs具有矿化能力,已具备成骨细胞的生物学特性,而且应用矿化诱导液联合EMPs诱导5 d后即明显表达成骨细胞表型,说明联合应用矿化液和EMPs能在较短时间内有效诱导BMSCs分化为成骨细胞。
本实验以成人骨髓为培养材料建立的成人BMSCs的培养方法和成骨诱导途径,为该组织工程技术的临床应用打下了基础,但组织工程技术应用于牙周病学临床还需更多的深入研究。
摘要：目的:观察釉基质蛋白(enamelmatrix proteins,EMPs)对人骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)细胞周期和碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。方法:体外培养人骨髓基质细胞,以200μg/ml EMPs作用于细胞为实验组,以不加EMPs为对照组。流式细胞仪检测EMPs对BMSCs细胞周期的影响,碱性磷酸酶试剂盒检测ALP的活性。结果:体外培养的人BMSCs生长良好,200μg/ml浓度的EMPs能提高细胞的ALP活性;影响细胞周期变化,EMPs组S期细胞数目较多,为19.48%,而对照组S期细胞数目为9.89%。结论:釉基质蛋白可促进人骨髓基质细胞的分化,影响细胞周期变化。
关键词：釉基质蛋白,骨髓基质细胞,增殖,矿化,细胞周期
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基质细胞 篇2
目的.研究恒河猴骨髓基质细胞(BMSCs)在体外向神经细胞诱导分化过程中神经递质分泌和神经细胞抗原表型表达情况.方法无菌条件下密度梯度法分离猴BMSCs,在体外应用神经干细胞培养液进行体外培养和诱导分化,分阶段用高效液相色谱法检测培养基中单胺类生物活性物质的含量,免疫细胞化学方法检测神经细胞抗原表型.结果高效液相检测神经干细胞培养基未测到单胺类生物活性物质,而经体外培养增殖10 d、14 d、30 d的细胞培养基可检测到去甲肾上腺素(NE)和多巴胺(DA).Asp方差分析显示:随着BMSCs培养天数的增加,培养基中所含的NE和DA无显著性差异(P>0.05).同期细胞免疫组化检测出酪氨酸羟化酶(TH)、巢蛋白抗体(nestin)、β-微管蛋白(β-tublin)、胶质原性纤维酸性蛋白抗体(GFAP)和神经元特异烯醇化酶(NSE)抗原表达.结论恒河猴BMSCs能在体外增殖,在适宜条件下能分化成神经元样细胞,并合成、分泌NE和DA;部分细胞表达神经干细胞、成熟神经元、胶质细胞和DA能神经元的抗原表型,提示在一定条件下,诱导分化的BMSCs经过神经干细胞阶段可向成熟神经组织细胞分化.
作 者：徐强 徐如祥 姜晓丹 潘力 陈剑荣 蔡颖谦 张世忠 XU Qiang XU Ru-xiang JIANG Xiao-dan PAN Li CHEN Jian-rong CAI Ying-qian ZHANG Shi-zhong 作者单位：徐强,潘力,XU Qiang,PAN Li(200040,上海,复旦大学华山医院神经外科)
徐如祥,姜晓丹,陈剑荣,蔡颖谦,张世忠,XU Ru-xiang,JIANG Xiao-dan,CHEN Jian-rong,CAI Ying-qian,ZHANG Shi-zhong(510282,广州,南方医科大学珠江医院神经外科)
基质细胞 篇3
摘要：以雄性Wistar大鼠为研究对象，进行“一次性大强度离心运动”，一次性离心运动实验为16°下坡跑台跑，定量大负荷间歇性运动，跑速为26.8 m/min，运动5 min×10组，组间歇1 min。离心运动后不同时段取大鼠后肢腓肠肌外侧头进行分析大强度离心运动后大鼠骨骼肌细胞骨架蛋白含量的变化特点；与延迟性骨骼肌损伤时血清酶升高的关系；探讨细胞骨架蛋白在骨骼肌纤维中存在的特点和作用。
关键词：离心运动；细胞外基质蛋白；骨骼肌微损伤；膜完整性
中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1007-3612(2008)05-0618-05
骨骼肌细胞膜连接了细胞内骨架与细胞外基质（ECM），在维持骨骼肌细胞的结构和功能中发挥了重要作用。在骨骼肌中基膜（细胞外基质）—肌细胞膜—细胞骨架中的一些连接蛋白的缺失导致了骨骼肌疾病从而使人们对它们连接的重要生物作用有了认识［1］。细胞外基质（ECM）决定组织的形态和结构，ECM不同成分之间相互作用形成立体骨架结构，对细胞起着支持作用。细胞只有通过ECM连接才构成组织，ECM决定组织的牵张强度。细胞外基质蛋白在维持肌细胞的结构以及力的传导过程中发挥了重要作用。
对于运动后骨骼肌微损伤的发生及恢复过程中肌细胞的细胞内骨架、肌细胞膜在结构、功能方面的变化的研究已经相对比较成熟，但对于骨骼肌细胞外基质在运动后结构、功能方面变化的研究目前还较少，因此本研究的目的是探讨运动后骨骼肌微损伤后ECM中的重要蛋白laminin-2，collagenIV蛋白含量的异同及离心方式运动对其影响；探讨损伤发生过程中基质蛋白laminin-2基因表达的变化特征，为今后能够更加深入全面的研究运动后骨骼肌微损伤发生的机制提供理论基础和依据。
1研究方法
1.1实验对象与分组雄性Wistar大鼠42只，分为7组，每组6只，体重300～360 g，由北京维通过利华实验动物技术有限公司提供，国家标准啮齿类动物饲料，分笼饲养，自由饮食，室温17～23℃，相对湿度60%～75%，保持12 h光照。
正式实验前3 d，所有动物进行5～10 min跑台运动，以熟悉跑台，速度为5～10 m/min，坡度为0°。大鼠跑台为杭州段氏制作BCPT-98型。
一次性离心运动的实验大鼠采用Armstrong(1983)［2］、田野［3］所设计的-16°下坡跑台跑，模型略有改进，以更适合模拟离心方式运动造成的损伤。定量大负荷间歇性运动，跑速为26.8 m/min，相当于最大摄氧量的80％～90%［4］，运动5 min，间歇1 min，共进行10组。给以少量声、光、电刺激，以激励大鼠运动。
实验组在一次性离心运动后即刻、运动后4 h、12 h、24 h、48 h、72 h，取材为每组6只，分别取大鼠后肢腓肠肌外侧头进行分析。安静对照组取材与实验组相同部位。
1.2测试样本的采集与处理1） 大鼠血清的采集：大鼠称重后，用20%的乌来糖(或称乌拉坦)按0.01 mL/g体重腹腔注射麻醉，心脏取血置于离心管中，倾斜静置2～3 h后进行常规血清分离（2 000转/min，15 min），-20℃冰箱保存待测。
2） 用于匀浆的样本采集：取血后速取左侧腓肠肌外侧头,切约为4 min×4 min×4 mm3，用锡纸包好、标记后放入液氮中冰冻保存，留做匀浆用。
3） 用于冷冻切片的样本采集：大鼠称重后，颈椎脱位法处死，取血后小心剪取约3 min×3 min×5 mm的腓肠肌（切勿牵拉）投入用液氮预冷的装有正已烷（-70℃）的小烧杯中速冻，之后用锡纸包好放入液氮中保存，用于冷冻切片。
4） 组织匀浆总蛋白测试：10%匀浆，总蛋白（TP）的测试采用Bradford法［5］（即考马斯亮蓝法）法。
5） 血清CK、LDH的测试方法：测试采用酶动力法，试剂盒购自北京北控中生生物科技股份有限公司，测试严格按照操作步骤进行，仪器为MD-100半自动生化分析仪。
6） 羟脯氨酸（hydroxyproline）测试。原理：羟脯氨酸在胶元蛋白中占13.4%,在弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中均不存在，因此羟脯氨酸能反映胶元代谢情况。羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色，根据其呈色的深浅可推算出其含量。
试剂盒购自南京建成生物制品公司，测试严格按照操作步骤进行，仪器为721分光光度计。
7） laminin-2原位杂交测试。大鼠Laminin-2基因的寡核苷酸探针序列设计参考Maher,J.J等［6］，用Blast在NCBI的RGD（Rat Genome Database）中验证其定位，使用Oligo 6.0验证其不含稳定的二聚体和发夹结构。其序列为： 5' AGGAGGTTGTCAGCAACAGCGGTCTTGACATGGACAACGA 3' ，由北京奥科生物技术有限公司合成，3'端地高辛标记。
8） 组织切片的图像分析。组织切片染色后，显微镜观察，通过Panasonic WV-CP410/G摄像头和BOSER BS602A图像采集卡进行图像采集，之后用Scion Image (National Institutes of Health, USA)进行分析。用Scion Image分别测量不同类型肌细胞膜染色的光密度，以此反映其含量。每样本测量上、下、左、右、中部5个视野。
9） 肌肉匀浆方法：秤取腓肠肌肉样品，迅速剪碎后放入玻璃匀浆器中，以1:10的比例加入匀浆液进行匀浆。
10） 冷冻切片：在SLEE冷冻切片机上进行切片，厚度为15μm，切片恒温-20℃。将实验组贴于一张切片上，以便于比较［7］。
1.3指标测试与方法11） 肌肉匀浆测SOD、MDA方法：SOD的测试采用黄嘌呤氧化酶法，MDA的测试采用硫代巴比妥酸（TBA）法，试剂盒均购自南京建成生物制品公司，测试严格按照操作步骤进行，仪器为721分光光度计。
冷冻切片。固定：切片自然干燥，浸入新鲜配制的4%多聚甲醛中2 min。消化：胃蛋白酶，一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30～180 min，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。
1.4数据统计方法对观察分析结果用统计学分析软件SPSS11.5进行ANOVA单因素方差分析。
2结果
2.1离心方式运动后血清CK、LDH 以及羟脯氨酸的变化┎馐越峁见表1。
血清CK、LDH的变化呈现相似的趋势，在离心运动后即刻最高随后呈现下降的趋势到12 h后达到最底点，然后呈现上升的趋势到48 h后又呈现下降趋势(图1)。ANOVA分析表明：运动后即刻CK与其它各时段均有非常显著性差异，玃<0.01;LDH除24 h外的各时段和即刻组均有显著性差异,玃<0.05;CK 4 h组高于12 h组、72 h组，差异显著，玃<0.05;12 h最低，与除24 h外的各段均有显著差异，玃<0.05；肌组织中SOD值从离心运动后即刻开始升高，到12 h达最高，48 h又有一次高峰，随后下降。运动后肌组织SOD含量，在12 h显著高于安静对照、72 h含量，玃＜0.05(表2)。
肌组织中MDA变化规律与SOD相似(表2，图3)，在运动后即刻开始升高，12 h达最高，在48 h又有一次高峰趋势，其后下降。其中12 h肌组织MDA含量与安静对照、运动后48 h、72 h差异显著，玃＜0.05。图3，肌组织MDA扩大十倍显示。
2.2运动后细胞外基质蛋白含量变化与骨骼肌内容物泄漏及自由基代谢变化的相关分析(表3，图4)。
图5，图6。测量每张切片中5个视野（左上、左下、中、右上、右下）的蓝紫色颗粒的光密度值，结果见表4和图7。
离心运动即刻laminin-2基因表达水平明显下降与对照组差异显著，玃＜0.05；随后逐渐升高，在48 h达到最大，在4 h后直至72 h均处于较高水平，对照组与4 h组至72 h组差异显著玃＜0.05(图7)；
腓肠肌外侧头，冷冻切片，15 μm厚；寡核苷酸探针，地高辛标记，碱性磷酸酶系统显色，杂交阳性信号为蓝紫色颗粒(图8)。
腓肠肌外侧头，冷冻切片，15μm厚；寡核苷酸探针，地高辛标记，碱性磷酸酶系统显色，杂交阳性信号为蓝紫色颗粒(图9)。
3分析与讨论
3.1离心运动后大鼠肌纤维中细胞外基质蛋白laminin-2,cllagenIV含量的变化根据对腓肠肌组织切片的观察来看，我们观察到离心运动后腓肠肌更为明显。ECM的量受到身体活动的影响，一定形式的慢性负荷练习可以增加胶元的含量，只不过是胶元合成的类型以及胶元合成的程度情况不同。这些变化可以改变组织的粘弹性以及机械特性，使组织更易抗拉。［8-9］在laminin-2基因缺失大鼠的研究中发现［10-11］，伴随着laminin-2的减少而CollagenIV含量呈增加趋势，而本研究却发现离心运动后laminin-2含量增加伴随着CollagenIV含量的减少，laminin-2蛋白和CollagenIV之间是否存在着动态平衡，二者之间的增加和减少是否存在着因果关系？需要进一步研究的证实。
3.2运动后骨骼肌内容物泄漏、羟脯氨酸、自由基代谢变化以及骨架蛋白含量变化的相关分析羟脯氨酸是胶元蛋白的一种主要氨基酸，是反映体内胶元代谢的生化标志物，在胶元蛋白中占13.4%,在弹性蛋白中占极少量，其他蛋白中均不存在，因此羟脯氨酸能反映胶元代谢情况。血清羟脯氨酸与血清LDH呈负相关；而血清羟脯氨酸与collagenIV没有相关性，可能和collagenIV本身的特殊性有关系，collagenIV作为细胞外基质蛋白的一种，在细胞外基质中含量很少并且是基膜的框架结构，也是基膜特有的胶原，在组织中细胞排列和骨骼肌中维持力的稳定性中发挥着重要的作用［12-13］，在运动过程中可能没有对胶元的代谢产物羟脯氨酸的增加作出贡献有关,本研究证实了这一点，即羟脯氨酸虽然是胶元的代谢产物但主要是I、III型胶元的代谢产物，也有相关文献报道羟脯氨酸主要是I、III型胶元的代谢产物［14］；肌组织中MDA水平与SOD水平相关；肌组织中SOD与血清LDH水平负相关；
本研究发现细胞外基质蛋白collagenIV与血清CK呈正相关；而Mackey, Donnell y（2004）［15］在以人为研究对象进行一次性离心运动后也同样发现了collagenIV与血清CK的明显的相关关系提示可能骨骼肌的离心收缩影响了IV型胶元的代谢更新。
3.3研究骨骼肌在损伤过程中laminin-2基因表达的变化特征细胞外基质蛋白laminin-2基因mRNA的原位杂交结果代表了laminin-2基因表达水平。如图10所示，离心运动即刻laminin-2基因表达水平明显下降与对照组差异显著玃＜0.05，随后逐渐升高，在48 h达到最大，在4 h后直至72 h均处于较高水平，对照组与4 h组至72 h组差异显著；本研究观察到了即刻laminin-2基因水平的降低但是没有观察到蛋白水平的下降，可能和实际蛋白水平有下降的趋势但是没有设置相应的时相观察到相应的实验结果，也有可能离心运动后即刻laminin-2基因表达水平的下降激活了laminin-2基因的调控过程使得laminini-2基因表达水平提高从而增加laminin-2蛋白的合成，laminin-2蛋白的升高也有可能和其本身就有较强的修复能力有关，从图11我们可以看到laminin-2基因和蛋白变化有大致相同的趋势。
4结论
1） 离心运动后基质蛋白laminin-2在24 h处于最高水平，24 h与其它各组组差异显著,其它组间的变化无显著性差异,说明了laminin-2是有较强调整和修复能力的蛋白，其变化有可能是因为其相邻蛋白的减少而代偿性的增加以维持机体的功能。
2） 本实验发现肌细胞外基质蛋白含量collagenIV的变化与血清CK相关，提示可能骨骼肌的离心收缩影响了collagenIV的代谢更新；
3） 离心运动即刻laminin-2基因表达水平明显下降与对照组差异显著；随后逐渐升高，在48 h达到最大，laminin-2基因和蛋白的表现了基本相同的变化趋势。
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基质细胞 篇4
1 材料与方法
1.1 细胞、菌株及载体
细胞株与质粒 MEPE cDNA质粒由美国EMORY大学王亚教授馈赠。293T细胞株购自上海中国科学院细胞研究所。质粒 pLEGFP-N1为BD Biosciences Clontech公司产品,大肠杆菌E.coli DH5α由本室保存。
1.2 主要试剂
PCR产物纯化采用BIO101公司提供的Geneclean II 试剂盒(Cat# 1001-400);质粒提取采用Qiagen公司QIAprep质粒提取试剂盒;限制性内切酶及T4 DNA连接酶购自Takara生物公司。
1.3 PCR扩增、表达质粒的构建及序列测定
由质粒上扩增出MEPE cDNA全长,所用扩增引物为:上游引物:5′-CATATGAAGC TGAATGAAGAT-3′,下游引物:3′-GGATCCTTA CATTTGGGGGAGATG-3′,PCR扩增的目的基因经Nde I与BamH I双酶切后,克隆到经过同样酶切处理的pLEGFP-N1载体上,得到融合表达质粒,转化感受态大肠杆菌DH5α挑取单克隆进行PCR筛选,选1～2个阳性克隆进行测序,鉴定序列及读码框架是否正确。
1.4 稳定转染细胞株构建
在细胞生长状态良好,融合率达90%～95%时进行转染。按照Lipofectamin2000操作手册转染六孔板内细胞。转染48h后消化、重悬细胞,10倍稀释后铺96孔板,每孔分别加入800μg/mL G418完全培养基进行克隆筛选,4周后选择阳性细胞克隆进行鉴定、扩增培养冻存。
1.5 MTT检测增殖能力
将生长密度达80%的293T细胞,常规胰酶消化、计数,以5×103密度的细胞200μL接种于96孔板。目的基因组、空载体组,每组3个复孔。置于37℃、5% CO2培养箱中培养。细胞培养1、3、5及7d后,每孔吸出100μL培养基后每孔再加入10μL MTT(5mg/mL),培养箱中继续孵育。4h后,吸去孔内液体,每孔加入200μL二甲基亚砜溶解沉淀。选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值并记录结果。
1.6 RT-PCR检测
按照北京华大蛋白质研发中心有限公司总RNA提取试剂的说明书,用Trizol提取细胞总RNA。所用的实验器具使用前均需用DEPC水浸泡过夜,去除RNA酶。RT-PCR检测转染细胞中p53基因的表达。p53引物上游:TCAACAAGATGTTTTGCCAACTG,下游:ATGTGCTGTGACTGC-TTGTAGATG。
2 结果
2.1 稳定转染细胞株检测结果
提取稳定转染细胞株总RNA,进行RT-PCR,电泳结果显示两组细胞87bp左右均可见GAPDH扩增条带出现;转染目的基因细胞在110bp处见扩增条带;空载体组在110bp处无扩增条带出现,证明转染成功,细胞可用于后续试验。见图1。
1:DL500DNAmarker;2-3:转染目的基因及空载体细胞中GAPDH表达;4:转染MEPE质粒细胞中MEPE表达;5:转染EGFP细胞中MEPE表达。
2.2 MTT检测细胞增殖结果
MEPE转染细胞和EGFP空载体转染组细胞铺96孔板,并分别于1d、3d、5d、7d用MTT法测细胞增殖。从统计结果可知转染MEPE的293T细胞其增殖指数是转染EGFP空载体组细胞增殖指数的1.30倍。见表1,图2。
2.3 RT-PCR检测增殖与迁移相关因子表达情况
p53基因高表达细胞可表现出黏附、增殖、迁移侵袭等方面的生物学行为,实验通过实时荧光定量PCR,检测转染MEPE蛋白与转染空载体细胞中三种基因的表达,从PCR产物电泳图及实时荧光扩增曲线两方面比较三种基因在两种细胞中的不同表达。
1.DL500DNAmarker;2.转染MEPE细胞中p53表达;3.转染空载体细胞中p53表达;4.DL500DNAmarker;5.转染MEPE细胞中GAPDH表达;6.转染空载体细胞中GAPDH表达。
3 讨论
MEPE是小型N端连接整合素家族蛋白成员,近几年来,越来越多的报道显示SIBLING家族成员与肿瘤发展的各个阶段包括增殖、侵袭、转移、血管生成相关。Lee JL等[4]人发现骨桥蛋白(OPN)与细胞表面受体蛋白CD44相结合,可以使结肠癌HT29细胞加速增殖并提高转移潜能。Sharp JA等[5]人发现骨唾液蛋白(BSP)可以在体外促进乳腺癌MDA-MB231细胞增殖,转染IBSP基因的乳腺癌细胞注射裸鼠后肿瘤形成速度加快。Khodavirdi AC等[6]人在两株前列腺癌细胞中提高OPN蛋白的表达水平,发现OPN有增加细胞侵袭的能力,在小鼠成瘤模型中观察到高表达OPN的前列腺癌细胞侵入血管的能力增强。对大量的实验结果分析,我们可以发现SIBLING蛋白家族成员在许多肿瘤细胞中高表达,作为可溶性分泌性蛋白因子主要分布在细胞基质中,通过与细胞表面受体蛋白CD44、整合素受体、金属蛋白酶相互作用参与调节细胞信号传导,在肿瘤细胞的黏附性、趋化性、抗凋亡、侵袭、迁移、不依赖支持物生长等恶性生物学特性中具有重要作用,并与肿瘤转移以及预后不良相关。
在SBLING家族中对于MEPE在肿瘤发生发展中所起到的作用研究较少,与其他家族成员在结构上高度同源的MEPE是否也对肿瘤细胞的增殖侵袭有影响,需要进一步实验验证。近年来研究表明,许多肿瘤在发展过程中伴有MEPE蛋白的高表达,而且发现这些高表达MEPE蛋白的肿瘤同时也表现出高的转移倾向,且其抗电离辐射等抵抗DNA损伤诱导能力与MEPE蛋白的表达量呈正相关。本实验结果证明提高MEPE蛋白表达水平可影响细胞增殖等生物学特性,并进一步证实其作用机制是通过P53蛋白信号通路实现的。因此临床检测MEPE表达可对恶性肿瘤的发生、转移做出预测,为恶性肿瘤基因治疗奠定基础。而且检测MEPE的表达水平还可监测肿瘤治疗的预后,为肿瘤基因基因治疗提供新的靶点。虽然目前基因治疗尚未临床普及,但其具有良好的潜在应用前景,在人类攻克癌症,提高肿瘤患者生存率及生活质量上有望发挥重要作用。
参考文献
[1]Rowe PS,De Zoysa PA, Dong R,et al.MEPE, a new gene expressed in bone marrow and tumors causing osteomalacia[J].Genomics,2000,67(1):54-68
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[4]Lee JL. Osteopontin promotes integrin activation through outside-in and inside-out mechanisms:OPN-CD44V interaction enhances survival in gastrointestinal cancer cells[J].Cancer Res,2007,67:2089-2097
[5]Zhiyong Mi, Hongtao Guo and Paul C Kuo. Identification of osteopontin-dependent signaling pathways in a mouse model of human breast cancer[J].BMC Research Notes,2009,2:119-127
基质细胞 篇5
IGF-1基因转染对骨髓基质细胞分泌IGF-1、ON和Ⅰ型胶原的影响
目的:观察胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因转染的骨髓基质细胞(MSCs)合成IGF-1、骨粘连素(osteone-ctin,ON)和Ⅰ型胶原(Collagen-Ⅰ)的变化,进一步了解基因转染骨髓基质细胞的生物学特性.方法:将含有IGF-1基因的真核质粒转染入大鼠骨髓基质细胞(MSCs)中,以正常培养的.MSCs为对照组,分别于1、3、5、7 d对MSCs进行IGF-1、ON和Collagen-Ⅰ免疫组化观察.通过图像分析检测IGF-1基因转染对MSCs合成IGF-1、ON和Collagen-Ⅰ的影响.结果:IGF-1基因转染后可促进MSCs合成IGF-1、ON和Collagen-Ⅰ(p＜0.05),第3 d合成IGF-1、ON和Collage-Ⅰ作用最明显.结论:IGF-1基因转染的MSCs较未转染细胞合成IGF-1、ON和Collagen-Ⅰ显著增加.
作 者：朱国强 吴织芬 王勤涛 李袁飞 ZHU Guo-qiang WU Zhi-fen WANG Qin-tao LI Yuan-fei 作者单位：朱国强,李袁飞,ZHU Guo-qiang,LI Yuan-fei(解放军264医院,山西,太原,030001)吴织芬,王勤涛,WU Zhi-fen,WANG Qin-tao(第四军医大学口腔医院)
刊 名：临床口腔医学杂志 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF CLINICAL STOMATOLOGY 年，卷(期)：2007 23(10) 分类号：Q813 关键词：基因转染 骨髓基质细胞 胰岛素样生长因子-1 骨粘连素 Ⅰ型胶原脱细胞角膜基质制备方法研究进展 篇6
1 物理制备方法
1.1 反复冻融法
反复冻融法是利用低温下细胞内部会产生冰晶, 剩余的细胞液由于盐浓度增高而引起溶胀, 再室温融解, 反复多次即可使细胞结构破碎, 从而使细胞内物质释放出来。单纯使用该方法, 脱细胞效果并不理想, 因此常联合其它脱细胞方法。
1.2 高静压技术
高静压技术 (HHP) 的主要机理是使组织中细胞的细胞膜损伤, 并影响细胞内酶活力及细胞内营养物质和废弃物的运输从而使细胞裂解。利用高静压技术对猪角膜进行脱细胞处理, 能够有效去除细胞, 并且保持了胶原纤维的排列结构, 同时减少糖胺聚糖 (GAG) 的损失。此外, HHP技术在处理过程中不添加去污剂, 没有细胞毒性脱细胞的同时去除了角膜中的细菌和病毒。然而这项技术需要昂贵的专业设备, 制备成本高, 因而限制了其引用和发展。
2 化学制备方法
2.1 去污剂处理法
离子型去污剂能够破坏蛋白与蛋白之间的连接结构, 从而使得蛋白质发生变性作用。最常用的离子型去污剂是十二烷基磺酸钠 (SDS) , 其作为生物膜的溶解剂, 能够有效去除组织中的细胞成分。Du等[1]研究表明0.5%~1%SDS能够有效去除细胞, 且不破坏ECM的天然组织结构。然而, SDS处理会降低GAG的总含量, 损伤基底膜, 并且造成胶原结构松散。
非离子型去污剂不破坏蛋白与蛋白之间的连接, 而只是破坏脂质与脂质之间和脂质与蛋白之间的结构, 且作用温和, 已被广泛应用于脱细胞研究中。其中最常用的非离子型去污剂是Triton X-100。陈苹等[2]研究发现1%Triton X-100能够有效去除角膜基质中的细胞成分, 并且能够维持胶原纤维结构。但也有研究报道浓度为5%的Triton X-100对角膜的脱细胞效果不佳[1]。
两性离子型去污剂能够增溶膜蛋白并破坏蛋白-蛋白之间的相互作用, 具有离子型及非离子型去污剂的双重特性。其中最常用的两性离子去污剂为CHAPS。但Du等[1]利用该去污剂处理猪角膜, 发现去除角膜细胞的效果较差, 角膜基质中常会残留细胞碎片。
2.2 酸、碱处理法
酸、碱通常与去污剂和醇类结合使用, 能够引起或是促进生物分子的水解。Ponce Márquez等[3]使用过氧乙酸联合乙醇对牛角膜进行脱细胞处理, 但是脱细胞效果并不理想, 组织边缘仍有细胞残留, 说明该方法仍有待改进。
2.3 高渗溶液、低渗溶液处理法
利用高渗和低渗溶液能够使细胞内的渗透压发生变化, 如使用去离子水、低离子强度的溶液导致组织的细胞松解和细胞膜的破裂, 从而达到脱细胞的目的。该方法操作简便, 对组织的形态结构破坏不明显, 但是脱细胞效果不佳, 且所需时间较长, 故很少单独应用。
3 酶消化法
酶消化法主要用于对去污剂未去除干净的细胞成分进行进一步清除, 主要包括蛋白酶和核酸酶。最常用的蛋白酶主要有胰蛋白酶和中性蛋白酶。胰蛋白酶能够溶解变性的蛋白质, 从而破坏细胞的结构。在多项研究中, 胰蛋白酶被用于分散角膜的EC M结构, 以利于之后的脱细胞试剂渗透进入角膜内部。此外, 磷脂酶A2能够水解细胞的磷脂成分, 因而也被应用于脱细胞处理, 并取得了良好的脱细胞效果, 但是角膜处理后GAG含量会显著降低。
4 血清处理法
血清中含有核酸酶, 能够降解DNA和RNA。Shao等[4]首先提出单纯用人血清对猪角膜进行脱细胞处理。之后, 其改进了方法, 将人血清处理与电泳法相结合。先将猪角膜在无菌的100%人血清中孵育1天, 之后对角膜进行电泳。该方法能够完全去除细胞, 并且保持了角膜的透明度。
5 结语
脱细胞角膜基质是构建组织工程角膜理想的生物材料, 具有优良的生物相容性和组织相容性。要获得比较理想的脱细胞效果, 同时最大程度地保留原有组织结构, 通常需要多种脱细胞方法联合应用。建议应用最温和的方法进行处理, 从而将脱细胞过程对ECM的结构、功能产生的影响降低到最小程度。一般先在高渗或低渗溶液浸泡, 随后用去污剂处理, 从而获得理想的脱细胞角膜基质。
参考文献
[1]Du L, Wu X.Development and char-acterization of a full-thickness acellu-lar porcine cornea matrix for tissueengineering[J].Artif Organs, 2011, 35 (7) :691-705.
[2]陈苹, 傅瑶, 范先群.猪角膜脱细胞基质的制备及生物相容性的实验研究[J].眼科研究, 2006, 24 (4) :367-370.
[3]Ponc e Márqu ez S, Mar tínez VS, Mc Intosh Ambrose W, et al.Decellularization of bovine corneas fortissue engineering applications[J].ActaB io mater.2009, 5:1839-1847.
基质细胞 篇7
脱细胞真皮基质(ADM)除去了真皮中的细胞成分(如成纤维细胞、内皮细胞、皮脂腺、汗腺等),只保留了胶原纤维支架,是良好的生物医用材料。它具有独特的三维网状结构、良好的物理力学性能、优异的生物学性能等,且猪皮来源丰富、价格低廉。近年来,在烧伤整形、神经外科、头颈外科、牙周病等多个领域均得到了广泛应用,效果较好。但在使用过程中依旧有诸多不足需要改善,其中,抗感染能力弱,严重影响了伤口的修复愈合,使临床应用成功率大大降低。因此,具有一定抗菌抑菌性能的脱细胞猪真皮基质成为研究的重点之一。
目前使用较多的抗菌抑菌性改性材料有硝酸银、纳米银等,经过含银材料改性后,赋予了脱细胞真皮基质一定的抗感染能力,具有较强的局部抗菌作用[1,2,3]。然而,含银抗菌材料也存在一些缺陷:如银离子浓度过高会对身体产生毒性、含银敷料暴露在空气中容易变色、使电解质紊乱引发患者不适等。因此,寻找更适合的抗菌材料成为必然。目前,季铵盐类材料是市面上广泛使用的抗菌抑菌剂之一,它在织物、塑料以及其他生物医用材料上的应用也启示了将其应用在脱细胞猪真皮基质上的可能性。基于以前的研究工作[4],本文采用季铵盐改性脱细胞猪真皮基质,以期研制出抗菌性能优良的生物敷料。
2 实验材料和仪器
脱细胞猪真皮基质(pADM),江阴奔翔生物科技有限公司;十二烷基三甲基氯化铵(DTAC),AR,成都科龙试剂厂;蛋白胨,BR,成都长寿生物制剂有限公司;琼脂粉,BC,天津科密欧化学试剂有限公司;牛肉浸膏,BR,成都长寿生物制剂有限公司;其他试剂均为分析纯。视频接触角测量仪,OCAHZOO,德国DataPhysics。
3 实验方法
3.1 季铵盐型脱细胞猪真皮基质的制备
称取2 g pADM(干基)置于盛有100 m L蒸馏水的锥形瓶中,分别加入1%、5%、10%的十二烷基三甲基氯化铵,37℃下恒温水浴震荡72 h,加入少量NH4Cl处理30 min,调节pH为6.5~7.5,冷冻干燥,保存备用。
3.2 静态接触角的测定
将DTAC改性p ADM制成1.5 cm×7 cm大小的薄片,采取坐滴法,以6μL煮沸冷却的蒸馏水液滴滴于材料表面上,记录液滴与材料表面接触瞬间的图像,利用软件测得接触角。每个样品选5次测定的平均值。
3.3 吸湿率、溶胀率以及毛细管吸水率的测定
将DTAC改性pADM制成2cm×2 cm大小的薄片,在室温、65%相对湿度下平衡24 h。测定材料的质量后,将其放置于一定体积的蒸馏水中,培养皿(Φ9 cm)中37℃下静置24 h,用洁净的镊子夹住材料的一角于空中悬挂30 s,测定材料湿重,平行3组。再用滤纸吸干材料表面水分,称重,记录为,最后将材料置于离心管中,10 000r/min下脱水15 min后,称重,记录为。吸湿率、溶胀率以及毛细管吸水率分别按式1、式2和式3计算。
3.4 抗菌性能评价
将灭菌后的牛肉浸膏蛋白胨培养基趁热(40~60℃)倒入无菌培养皿(Φ9 cm)中,每个皿12~15 g,置于无菌室冷却凝固。用无菌移液器取200μL制好的菌悬液(大肠杆菌或金黄色葡萄球菌)于无菌平板中,并用无菌涂布器涂布均匀,制成带菌平板。再将紫外灭菌的季铵盐型p ADM(直径25 mm)圆片置于带菌平板中央,轻压,使其紧贴平板,每组5个平板,最后将平板置于37℃恒温培养箱中培养48h,测量并记录抑菌圈直径,计算平均值。
4 结果与讨论
4.1 接触角
作为敷料,材料的表面性能对于其应用有非常重要意义,一定的亲水性有助于细胞在材料表面的贴附与增殖,有益于伤口愈合。从图1明显看出,随着DTAC用量的增加,接触角逐渐减小。接触角越小,材料表面的亲水性越好。十二烷基三甲基氯化铵属于季铵盐,具有良好亲水性,用它浸渍后,增加了材料表面的亲水基团,提高了材料的亲水性。创伤修复的“湿法疗法”认为[5],湿润的微环境比干燥环境更有利于伤口的愈合。因此,亲水性的提高将有利于伤口的愈合。
4.2 吸湿率、溶胀率以及毛细管吸水率
由图2可知,吸湿率呈现出先升高后下降的趋势,其中DTAC用量5%时,吸湿率最高。可能是在一定浓度范围内,处理后的脱细胞猪真皮基质材料表面及纤维内部吸附了十二烷基三甲基氯化铵,此季铵盐抗菌剂有较好的亲水性,即对水的吸附作用;但用量再增大后,大量十二烷基三甲基氯化铵材料浸入脱细胞猪真皮基质材料的纤维间隙内,并且其渗透速度随浓度的增大而增大,使DTAC与胶原结合减慢,加之空间位阻的影响,在一定程度上出现了阻碍水进入的可能,因此10%的吸附水率又降低。溶胀率是吸去表面水分后所剩余的充盈于材料间隙之间的自由水含量,5%用量时溶胀率最高,其次是1%、10%,进一步显示了当DTAC超过某一用量范围时,用量越大,自由水浸入纤维内部的机会越少。在生物医用材料使用的过程中,挤压、粘贴等会使得吸附于材料表面或材料之间的水分被挤出。从毛细管吸水率可见,在高速离心作用下,各用量DTAC改性的pADM的毛细管吸水率基本一致,都比未改性的高,证明季铵盐抗菌材料的引入,增加了极性基团,且其氨基与胶原纤维上的羧基基团可能发生反应,使得纤维间隙缩短,毛细管效应增大,可固定更多的结合水。在敷料的使用过程中,结合水的存在可起到湿润伤口,加速伤口愈合的作用,同时此种抗菌剂的引入又可减少伤口感染。
4.3 抗菌性能
在敷料的使用过程中,细菌感染引发炎症往往是伤口愈合的极大阻碍之一,也是众多研究者渴望解决的问题之一。由图3可以看出,随着DTAC用量的增加,抑菌圈的直径也随之增加。可见DTAC改性pADM对于常见的革阴氏和革阳氏两种细菌都有较好的抗菌作用。图4、图5分别为用量1%、5%、10%的十二烷基三甲基氯化铵改性pADM材料对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑菌圈的图片。有研究[6,7]指出季铵盐材料抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的机理与过程是,季铵盐具有N+官能团,带正电荷,而大肠杆菌细胞和金黄色葡萄球菌均表面带负电荷,依靠静电作用将细菌吸附在材料表面。由于菌的呼吸链存在于细胞膜上,被吸附后,使得呼吸链上的酶受到限制,同时氧和其它小分子营养物质的渗透也受到影响,随着时间的延长,季铵盐单体扰乱细胞膜的双层结构,影响膜的渗透性,破坏菌体内外的渗透压平衡,促使细胞内物质泄漏,从而导致细胞变性以至于完全被破坏死亡。简单总结为静电吸引、抑制活性和破坏等杀菌过程。对于本研究,可能是由于处理后的pADM表面的DTAC材料在一定条件下有溶出,使得培养基周围均匀分散了一定量的抗菌材料,带正电荷的季铵盐材料通过静电作用与细菌迅速结合,季铵盐再进一步破坏细菌的细胞膜双层结构,从而逐步使细菌死亡。随DTAC用量的增大,溶出率也增大,从而抑菌圈也增大。
5 结论
脱细胞猪真皮基质(pADM)经过季铵盐型抗菌剂DTAC改性后,接触角明显减小,亲水性增大。随DTAC用量的增加,改性后p ADM的吸湿率、溶胀率及毛细管吸水率有先上升后减小的趋势;对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用,且抑菌圈均随着DTAC用量的增大而增大。季铵盐型抗菌剂有望成功应用于脱细胞猪真皮基质或其他相似的生物医用材料,但若作为植入材料使用,则需要更进一步考察其细胞毒性、生物相容性等。自主合成的多功能季铵盐型抗菌剂以及相关抗菌型生物材料的研究将会是此领域今后的发展方向。
摘要：采用不同用量(1%、5%、10%)的十二烷基三甲基氯化铵(DTAC)浸渍脱细胞猪真皮基质(pADM),测定了改性后pADM的接触角、吸湿率、溶胀率、毛细管吸水率以及对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌性能。结果显示:通过DTAC处理后的pADM,接触角随DTAC用量的增大而减小,吸湿率、溶胀率与毛细管吸水率随DTAC用量的增加呈现先升高后减小的趋势。随着DTAC用量的增大,抑菌圈直径也增大,抑菌性能增强。
关键词：季铵盐,脱细胞真皮基质,抗菌
参考文献
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基质细胞 篇8
色胺酮是一种吲哚喹唑啉类生物碱,存在于多种植物中。有研究报道,色胺酮有抗炎症、抗过敏等药理学功能[11,12,13]。因此,笔者猜测色胺酮对过敏性皮炎有一定的治疗作用。笔者通过对TSLP信号通路中MDM2、P53、TSLPR等进行验证,初步探讨色胺酮在过敏性皮炎中的药理机制,为色胺酮治疗肥大细胞相关过敏性皮炎提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验仪器和试剂
1.1.1 实验仪器
蛋白免疫印迹法(Western blot)设备电泳仪、转膜仪、玻璃胶版等(美国Bio-rad公司),聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪(美国Bio-rad公司),实时荧光定量PCR系统(美国ABI公司),倒置显微镜(日本Olympus公司),冷冻离心机、酶标仪、Nano Drop分光光度计(美国Thermo公司)。
1.1.2 实验试剂
色胺酮(Tryptanthrin,TR)(美国Sigma公司,纯度≥98%,SML0310),二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解稀释色胺酮,置于-20℃冰箱冷冻保存,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxy Uridine,Brd U)(美国Sigma公司),重组TSLP(美国RD Systems公司),胎牛血清、伊思考夫改良杜尔贝可细胞培养基(iscove's modified dulbecco's medium,IMDM)(美国Gibco公司),Brd U、MDM2、P53、PARP、半胱天冬酶-3、β-actin抗体(美国Santa公司),人源肥大细胞系-1(human mast cell line,HMC-1)细胞来自美国菌种保藏中心细胞库。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养
含10%胎牛血清的IMDM(加青霉素和链霉素)培养HMC-1细胞,置于孵箱37℃、5%二氧化碳CO2,平均2~3 d传代1次,取对数生长期细胞进行实验。
1.2.2 细胞处理和分组
色胺酮由DMSO稀释于-20℃冰箱冷冻备用,TSLP蛋白经转染试剂处理进入肥大细胞。实验细胞主要分为3组:空白对照组为DMSO空白和空载质粒转染;TSLP刺激组为转染重组TSLP蛋白处理;色胺酮处理组为TSLP刺激合并转染重组TSLP蛋白后,加入不同浓度色胺酮处理。
1.2.3溴脱氧尿苷渗入试验
采用台盼蓝细胞计数方法,各处理组细胞1×104个,设置3次重复,加入Brdu作用3 h,磷酸缓冲盐溶液冲洗1次,经固定、解链、封闭后,一抗4℃孵育过夜,二抗孵育1 h。通过免疫比色法比较各组细胞增殖情况。
1.2.4 噻唑蓝[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]比色法
MTT比色法检测细胞活力,计数生长对数期的肥大细胞约1×105个/L,传入96孔板,分为空白处理组、0.1、1.0和10.0μmol共4组,每组8个复孔,并与MTT溶液(5 mg/ml)37℃孵育4 h。终止培养后,每孔加入200μl DMSO,溶解甲瓒结晶。酶标仪检测各孔在540 nm处的吸光度值。
1.2.5 Western blot检测
收集各处理组的肥大细胞,RIPA裂解液4℃裂解30min,最大转速离心5 min,收集蛋白,并进行蛋白定量。5×loading加入蛋白液中95℃煮10 min,视定量结果加入样品,经10%分离胶分离90 min,100 V恒压转膜100 min。5%的脱脂牛奶封闭1 h,4℃过夜孵育蛋白一抗。第2天,TBST溶液洗膜3遍,5 min/次,室温孵育二抗1 h,洗膜3遍,7 min/次;加入A、B发光液后,暗室操作曝光。随机选取曝光蛋白条带3处位置进行蛋白灰度分析,进行各处理组蛋白水平比较。
1.2.6 实时荧光定量PCR反应
采用Trizol抽提RNA的方法进行总RNA的提取,RNA提取在通风厨中进行。各处理组细胞经1 ml Trizol处理后,将裂解物吸置于离心管中,加入200μl氯仿,颠倒震荡数10下。4℃、12 000 r/min离心10 min,缓慢吸出400μl上清液放置于新的离心管中。加入等体积的异丙醇充分混合后,4℃、最大转速离心10 min。弃上清,加入75%乙醇1ml,洗涤沉淀,4℃、12 000 r/min离心5 min。弃上清液,吸净酒精,并在通风厨中放置,待残留的酒精液体完全挥发后,视沉淀加适量的无RNA酶H2O,70℃煮10 min。测定RNA浓度,取2μg RNA进行反转录PCR反应。各处理组设置3重复,采用2-△△CT方法对数据进行分析,GAPDH为内参蛋白。见表1。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0统计软件进行数据分析,计量资料均采用数±标准差(±s)表示,组间的比较用单因素方差分析,两两比较用LSD-t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 色胺酮对HMC-1肥大细胞活力和增殖的影响
MTT比色法结果显示,0.1、1.0和10.0μmol的色胺酮分别处理HMC-1细胞后,各组OD值比较,经单因素方差分析,差异无统计学意义(F=0.785,P=0.512),细胞活力未受到影响。见表2。
溴脱氧尿苷实验结果显示,TSLP刺激组与空白对照组渗入Brd U的细胞含量比较,经t检验,差异有统计学意义(t=8.557,P=0.001),TSLP刺激组比空白对照组含量高;10.0μmol色胺酮单独处理后,色胺酮刺激组和对照组比较,经t检验,差异无统计学意义(P>0.05);在TSLP刺激后,并于1.0和10.0μmol色胺酮处理组中,色胺酮处理组和TSLP刺激组渗入Brd U的细胞含量比较,经t检验,差异有统计学意义(t=6.532和9.910,P=0.003和0.001),0.1μmol色胺酮处理后,差异无统计学意义(P>0.05),1.0和10.0μmol色胺酮处理组中渗入Brd U的细胞含量高于TSLP刺激组。见图1A。
Ki-67m RNA检测结果显示,TSLP刺激组与空白对照组比较,经t检验,相对Ki-67m RNA水平,差异有统计学意义(t=68.663,P=0.000),TSLP刺激组水平高于空白对照组;经0.1、1.0和10.0μmol色胺酮再次处理后,各组与TSLP刺激组相对Ki-67m RNA水平比较,经t检验,差异有统计学意义[t=9.390、18.164和42.819,P=0.001、0.000和0.000],经色胺酮处理后,细胞中相对Ki-67 m RNA水平升高。见图1B~D。
2.2 色胺酮抑制HMC-1细胞中MDM2和P53蛋白水平的表达
Western blot结果表明,在TSLP刺激后,HMC-1细胞中MDM2和P53蛋白水平升高,经0.1、1.0和10.0μmol色胺酮处理后,MDM2蛋白水平降低,P53蛋白水平升高,且浓度越高,变化越大。蛋白灰度结果显示,TSLP刺激组与空白对照组MDM2和P53蛋白水平比较,经t检验,差异有统计学意义(t=36.947和55.118,P=0.000),TSLP刺激后MDM2和P53蛋白水平降低;经0.1、1.0和10.0μmol色胺酮处理后,与TSLP刺激组比较,经t检验,差异有统计学意义(MDM2蛋白:t=52.693、57.034和57.808,P=0.000;P53蛋白:t=42.866、9.550和16.977,P=0.000、0.001和0.000),MDM2蛋白水平受到抑制,P53蛋白水平升高。见图2。
1)与空白对照组比较,P<0.05;2)与TSLP刺激组比较,P<0.05
2.3 HMC-1细胞中凋亡标志蛋白半胱天冬酶-3和PARP剪切蛋白在色胺酮的作用下的表达
Western blot结果表明,半胱天冬酶-3和PARP剪切蛋白水平在TSLP的刺激后降低,经0.1、1.0和10.0μmol色胺酮处理后,蛋白水平回升。蛋白灰度分析显示,与空白对照组半胱天冬酶-3和PARP剪切蛋白水平比较,经t检验,差异有统计学意义(t=8.033和27.587,P=0.001和0.000),半胱天冬酶-3和PARP剪切蛋白在TSLP刺激后水平降低;经0.1、1.0和10.0μmol色胺酮处理后,与TSLP刺激组半胱天冬酶-3和PARP剪切蛋白水平比较,经t检验,差异有统计学意义(半胱天冬酶-3:t=8.379、9.273和18.864,P=0.001、0.001和0.000;PARP剪切蛋白:t=13.629、31.576和21.330,P=0.000),半胱天冬酶-3和PARP剪切蛋白水平升高。见图3。
2.4 色胺酮降低TSLP上游信号通路中IL-7Rα和TSLPR m RNA水平
实时荧光定量PCR结果显示,TSLP刺激组与空白对照组m RNA水平比较,经t检验,差异有统计学意义(t=6.307和9.874,P=0.003和0.001),TSLP上游信号蛋白IL-7Rα和TSLPR m RNA水平在TSLP刺激后均升高;经0.1、1.0和10.0μmol色胺酮处理后,色胺酮处理组与TSLP刺激组m RNA水平比较,经t检验,差异有统计学意义(IL-7Rα:t=3.141、6.563和5.529,P=0.035、0.003和0.005;TSLPR m RNA:t=2.948、8.017和7.626,P=0.042、0.001和0.002),两者m RNA水平均降低。见图4。
1)与空白对照组比较,P<0.05;2)与TSLP刺激组比较,P<0.05
1)与空白对照组比较,P<0.05;2)与TSLP刺激组比较,P<0.05
1)与空白对照组比较,P<0.05;2)与TSLP刺激组比较,P<0.05
3 讨论
肥大细胞与过敏性皮炎密切相关,在皮肤损伤部位,肥大细胞不断聚集,最终导致皮肤炎症[14,15,16];有报道称TSLP在过敏性皮炎患者皮肤损伤部位高度表达[17],近年来,更有研究发现,TSLP可调控肥大细胞增殖,加剧肥大细胞调节的疾病,如过敏性皮炎[8]。色胺酮具有潜在的抗过敏药效,因此,笔者对色胺酮在TSLP促肥大细胞增殖进程中发挥的药理机制进行探索,以期为色胺酮治疗过敏性皮炎提供理论依据。本研究结果证实,色胺酮可抑制TSLP促HMC-1肥大细胞的增殖,初步结果表明,色胺酮可通过抑制MDM2蛋白表达,提高P53蛋白水平,进而引起凋亡标志蛋白半胱天冬酶-3和PARP剪切蛋白水平升高,激活细胞凋亡;另外,通过对TSLP上游信号通路的检测发现,IL-7Rα和TSLPR m RNA水平在色胺酮的作用下降低。
Brd U是一种胸腺嘧啶的衍生物,在DNA合成S期,可代替胸腺嘧啶参与DNA新链合成,并稳定存在细胞核内,供于检测。本研究发现,色胺酮抑制Brd U嵌入TSLP刺激的肥大细胞。研究报道,Ki-67m RNA水平的检测可作为细胞增殖活性的一个标志[18],而笔者对Ki-67水平的检测同样证实色胺酮可抑制TSLP促肥大细胞增殖。
MDM2参与P53蛋白的降解,并在P53蛋白稳态中发挥关键作用[19]。相关研究结果证实,MDM2和P53通路调节细胞增殖和凋亡[20]。本实验结果显示,色胺酮抑制MDM2、P53蛋白水平升高,表明色胺酮在MDM2和P53通路中发挥作用。
半胱天冬酶在调控细胞凋亡进展中发挥关键作用[21],在细胞凋亡发生时,半胱天冬酶-3将113 k D的PARP蛋白分别剪切至89和24 k D片段大小[22],另外,半胱天冬酶-3和PARP剪切蛋白也被报道参与过敏反应[23,24];近年来,色胺酮被报道在白血病细胞中发挥抑制细胞增殖并引发细胞凋亡的作用[25]。本实验通过对半胱天冬酶-3和PARP剪切蛋白的表达水平检测发现,在HMC-1肥大细胞中,色胺酮处理后两者蛋白水平升高,提示色胺酮可加速在肥大细胞中的凋亡进展。
IL-7Rα和TSLPR在TSLP上游信号通路形成异质二聚体复合物,促使TSLP发挥作用[6],为进一步探索色胺酮在肥大细胞中的药理机制,笔者检测两者m RNA水平表达,实时荧光定量PCR结果显示,m RNA水平降低,提示色胺酮可抑制两者在转录水平上的表达。
值得注意的是,实验过程中0.1μmol色胺酮处理组与TSLP刺激组TSLPR m RNA水平比较,差异无统计学意义。其原因可能为:①实验操作误差;②低浓度色胺酮药力低效,提示在临床上对色胺酮的使用浓度需谨慎。
基质细胞 篇9
1.1 实验动物
材料及仪器:新西兰大白兔90只, 雌雄不限, 5~7周龄, 体重2.5kg左右, 其中3只用于提供BMCS以及关节滑液来源, 其余用于研究防止肌腱粘连。
1.2 研究方法
MSCs的诱导分化:将MSCs移入含地塞米松1×10-7mol/L、关节滑液1×10-7mol/L、bFGF-23ng/mL、维生素C100mg/L的胎牛血清DMEM, 诱导MSCs向滑膜细胞分化, 通过离心、纯化后鉴定 (光镜、透射电镜以及免疫组化等鉴定) 。然后培养扩增备用。
滑膜样细胞移植:选用84只大白兔, 每只兔的右后肢作为实验组, 左后肢为对照组。将诱导分化的细胞悬液移植入大白兔右后肢损伤的跟腱处, 术后用管形石膏将下肢固定于膝关节屈曲15°, 踝关节背伸l5°, 足趾自然位。
检测指标:术后l、2、4、8周取材。第1周每组各3只动物6条跟腱进行大体标本粘连等级评定、组织学观察 (包括光镜和透射电镜观察) ;后3周每组各6只动物12条跟腱, 随机取6条跟腱进行生物力学测试, 6条进行大体标本粘连等级评定及组织学观察。
统计学分析:所有计量资料均以均数±标准差 (x±s) 表示, 采用SPSS 11.5软件进行统计学分析, P<0.05则表示有统计学意义。计量资料采用t-test, 计数资料采用等级资料的秩和检验。
2 结果
2.1 滑膜样细胞的鉴定
BMSCs传代培养初期可见大量悬浮细胞, 48h后可见有散在纺锤形贴壁细胞, 经多次半量换液后, 未贴壁细胞逐渐被去除。4d后可见成簇、贴壁的纺锤形细胞逐渐增多, 但仍存在混杂细胞。经多次传代后, 细胞逐渐纯化, 并且细胞初期多以集落形式增长, 第6代后细胞呈形态均一的纺锤形, 分布均匀。
在bFGF-2、关节滑液等诱导条件下, BMSCs逐渐向滑膜样细胞形态分化。于4d后散在个别细胞逐渐呈梭型生长。7d后梭型细胞较前增多, 细胞间较少见紧密联接。10d时梭型细胞约占2/3。随细胞数量增加而逐渐紊乱, 无明确的方向性排列特征。14d时长满培养皿底, 细胞形态以梭形为主, 两极胞突细长, 末端多与邻近细胞连接并交织成网状。网间散布有较多小星形或多边形细胞, 与梭形细胞紧密连接。
贴壁法纯化后, 扩增培养, 将纯化的梭型细胞用0.25%胰蛋白酶消化并吹打制成单细胞悬液, 传代培养。传代细胞在48h内贴壁, 并很快铺展。
2.2 大体标本屈肌腱粘连等级评定
Hitchcock[1]粘连分度法评估结果显示, 随着愈合的发展, 对照组肌腱粘连逐渐加重, 实验组各时相粘连等级基本相当。同一时相点实验组同对照组相比粘连明显减轻 (P<0.05, 见表1) 。
2.3 跟腱生物力学测定
断裂载荷测试结果显示, 实验组与对照组比较, 断裂载荷有显著差异 (P<0.05) , 但与正常屈肌腱的断裂载荷比较, 实验组和对照组均明显降低 (P<0.05, 见表2) 。
3 讨论
3.1 骨髓基质干细胞向滑膜样细胞的分化
骨髓基质干细胞是一种可多向分化的细胞, 在特定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞和神经细胞等多种细胞。本研究表明, 骨髓基质干细胞在关节滑液和FGF-2诱导下可以分化为滑膜样细胞, 其具有成纤维细胞样滑膜细胞的组织学及超微结构特征, 并且分化细胞免疫组化染色Vimentin阳性, CD68阴性。由于巨噬细胞样滑膜细胞不具有增殖能力, 可通过多次传代去除巨噬细胞样滑膜细胞而获得较纯的成纤维样滑膜细胞[2]。这可能也是本实验中获得较纯的成纤维样滑膜细胞的原因。Vimentin (波形蛋白) 是中胚层组织的特征性蛋白, 主要存在于成纤维细胞和来自胚胎间充质的细胞。CD68是巨噬细胞的表面标志, 我们用Vimentin及CD68单抗对培养的第三代滑膜细胞进行了鉴定, 结果与上述文献相符。
3.2 滑膜样细胞移植预防肌腱粘连
早在1963年, Potenza[3]通过实验研究认识到保持肌腱滑膜鞘的完整, 有利于减轻肌腱愈合过程中的粘连。实验组与对照组的跟腱粘连程度相比, 实验组粘连程度较小, 而且从观察时相开始到结束粘连程度相当, 各时相点比较无统计学差异 (P>0.05) 。此说明移植的细胞可有效防止肌腱粘连, 并且可以促使滑膜形成及愈合, 在光镜及扫描电镜下可以在肌腱周围形成一薄层交织成网状的滑膜样细胞层。国内张正治等[4]将取自兔的趾腱鞘内的滑膜细胞经原代和传代培养后, 制成滑膜细胞悬液, 再与自体无滑膜肌腱段联合培养。经扫描电镜观察, 培养后的肌腱表面变得光滑经免疫组化染色vimemtin阳性, 说明肌腱表面有滑膜细胞覆盖, 使之具有滑膜肌腱的形态学特征。这是与本实验相吻合的。
3.3 滑膜样细胞移植对肌腱强度的影响
虽然可以预防粘连, 但肌腱达不到一定的抗张强度, 也是万万不行的。滑膜样细胞移植后, 肌腱的断裂载荷测试结果显示, 实验组与对照组各时相数值比较, 断裂载荷有显著差异, 说明实验组肌腱愈合后生物力学强度较高。但与正常屈肌腱的断裂载荷比较, 实验组和对照组均明显降低。虽然滑膜化肌腱抗张强度仍然达不到正常水平, 但相比无滑膜肌腱有了很大提高。其中肌腱表面之滑膜在一定程度上增强了肌腱的抗张强度, 而且滑膜分泌的滑液有营养作用, 较之对照组促进了肌腱的更快愈合, 也增强了肌腱的抗张强度。
参考文献
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[3]Potenza AD.Critical evaluation of flexor-tendon healing and ad-hesion formation within artificial digital sheath[J].J Bone Joint Surg (Am) , 1963, 45 (6) :1217～1233.
基质细胞 篇10
1 材料与方法
1.1 材料
选择兰州大学第二医院神经外科2007年3月至2008年7月临床手术并经病理证实的垂体腺瘤患者共63例, 其中男39例, 女24例, 年龄17~71岁, 平均年龄 (41.48±12.25) 岁。63例垂体腺瘤患者中, 微腺瘤1例, 大腺瘤62例。大腺瘤中直径11~20 mm者27例, 直径21~30 mm者20例, 直径>30 mm者 (巨腺瘤) 15例。按内分泌激素免疫组化分类:ACTH型5例, 混合型10例, PRL型13例, GH型16例, 无功能型19例。根据影像学表现、术中所见、术后病理及免疫组化检测结果, 按Wilson改良的Hardy分类法, 确定侵袭性垂体腺瘤30例, 非侵袭性垂体腺瘤33例。标本均经10%的福尔马林固定, 石蜡包埋, 4μm厚连续切片, 行免疫组化染色。对10例侵袭性垂体腺瘤和14例非侵袭性垂体腺瘤新鲜标本进行逆转录聚合酶链式反应 (RT-PCR) 检测。
1.2 SDF-1蛋白的免疫组化检测
采用亲合素—生物素—过氧化酶复合物技术 (avidin-biotinperoxidase-complex-technique, ABC) 检测。兔抗人SDF-1单克隆抗体购于美国USCNLIFE公司, 设阳性对照, 用磷酸缓冲液 (phosphate buffer solution, PBS) 代替一抗作阴性对照。SDF-1一抗工作浓度为1∶50。结果判定标准:SDF-1蛋白阳性染色以细胞核出现棕褐色染色为阳性细胞。光镜下取5个细胞密集的高倍视野 (×400倍) , 计数500个肿瘤细胞, 计算阳性细胞的百分率。按其阳性率分4级:<25% (-) , 25%~50% (+) , 51%~75% (++) , 76%~100% (+++) 。其中, +~++为弱阳性, +++为强阳性。
1.3 SDF-1 m RNA的RT-PCR检测
用Trizol提取细胞总RNA, 用逆转录试剂盒将RNA逆转录为c DNA。根据基因库中CXCR 4基因序列设计引物, F:5′-AATCTTCCTGCC CACCAT-3′, R:5′-ATCCAGACGCCAA CATAG-3′, 扩增产物大小为367 bp。同时以人GAPDH为对照, 上游:5′-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3′, 下游:5′-CCTG CTTCACCACC-TTCTTG-3′, 扩增产物为372 bp, 均由上海赛百盛有限公司合成。RT-PCR产物采用Image Master图像分析仪进行灰度扫描。
1.4 统计学处理
应用SPSS 10.0软件行χ2检验, 检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 免疫组化检测结果
(1) SDF-1在侵袭性垂体腺瘤和非侵袭性垂体腺瘤中均有阳性表达, 表达位于细胞核内, 表现为细胞核被染成棕褐色。
(2) SDF-1在30例侵袭性垂体腺瘤中的阳性表达率为60.00%, 在33例非侵袭性垂体腺瘤中的阳性表达率为24.24%。χ2检验分析表明, 侵袭性垂体腺瘤组织中SDF-1的阳性表达率明显高于其在非侵袭性垂体腺瘤中的阳性表达率 (χ2=9.042, P=0.029) (见图1~3) 。
2.2 RT-PCR检测结果
侵袭性垂体腺瘤组SDF-1m RNA的表达水平为 (3.845±0.426) , 非侵袭性垂体腺瘤组SDF-1m RNA的表达水平为 (2.281±0.235) , 两者相比, 差异有显著性 (P=0.004) 。
GH型侵袭性腺瘤中SDF-1m RNA的表达水平高于GH型非侵袭性腺瘤;PRL型侵袭性腺瘤中SDF-1m RNA的表达水平高于PRL型非侵袭性腺瘤;混合型侵袭性腺瘤中SDF-1m RNA表达水平高于混合型非侵袭性腺瘤;ACTH型侵袭性腺瘤中SDF-1m RNA的表达水平高于ACTH型非侵袭性腺瘤。同一内分泌型垂体腺瘤中SDF-1m RNA的表达水平, 侵袭性腺瘤高于非侵袭性腺瘤, 且二者差异有显著性。GH型侵袭性腺瘤中SDF-1m RNA的表达水平最高。无功能型侵袭性腺瘤中SDF-1m RNA的表达水平与非侵袭性腺瘤比较, 差异无显著性。
3 讨论
垂体腺瘤呈膨胀性生长, 有假包膜, 侵袭性垂体腺瘤有向周围结构侵袭生长的特点, 但其在组织学和生物学行为上仍属良性肿瘤。目前对垂体腺瘤侵袭性的诊断多依靠影像学检查其有无肿瘤破坏骨质, 侵犯海绵窦、蝶窦及包绕颈内动脉等, 并结合术中观察有无肿瘤组织侵犯硬脑膜、海绵窦、骨质、视神经、颈内动脉等, 以及术中取硬脑膜送病理学检查。其中最常用的是用Wilson改良的Hardy分类法[2]中Ⅲ~Ⅳ级或C、D、E期的肿瘤归为侵袭性肿瘤, 但这些方法存在较多的局限性。我们通过分析SDF-1在垂体腺瘤中的表达与垂体腺瘤侵袭性的关系, 试图找到一种判断垂体腺瘤侵袭性的有用指标, 以便更好地了解肿瘤本身固有的生物学侵袭性, 为术后检测与辅助治疗提供理论依据。
注:a表示与非侵袭组相比, P<0.05;b表示与非侵袭组相比, P<0.05;c表示与非侵袭组相比, P>0.05;d表示与非侵袭组相比, P<0.05:e表示与非侵袭组相比, P<0.05
SDF-1是骨髓基质细胞产生的CXC类趋化蛋白, 系统命名CXCL12。SDF-1是从鼠骨髓细胞表面克隆而来的一个CXC亚族, 作为前体B细胞的刺激因素的一种化学刺激因子, 有α、β、γ3个形式, 脑组织中SDF-1α占绝大多数。人类和鼠类化学刺激因子只有一个氨基酸序列不同, 现在认为这个序列起重要作用。SDF-1的作用是通过一个G蛋白偶联受体亚家族成员CXCR4起作用。CXCR4不仅表达于免疫细胞造血干细胞, 还表达于神经上皮细胞、内皮细胞、成熟神经细胞、胶质细胞[3]。趋化因子通过控制白细胞的活化和趋化作用, 淋巴细胞的增殖免疫作用, 对免疫系统的调控起作用。Angela等[4]研究证实, SDF-1在促进人类肝癌细胞的生长、扩散和转移中有重要作用。Michelle等[5]的研究认为, SDF-1通过血红蛋白加氧酶依赖机制促进血管增殖, 在血管损伤局部的血管增殖和免疫细胞活化反应中起重要作用。陈琼等[6]研究认为, SDF-1α通过其受体CXCR4介导信号通路影响细胞生物学行为, 主要包括生长、迁移、形态学改变。SDF-1α和CXCR4的相互作用与肿瘤细胞迁移、侵袭等有关, 对一些肿瘤向特定器官特定方向转移起密切相关的作用[7]。Kato等[8]发现, 乳腺癌淋巴转移中伴随着CXCR4局灶性高表达。Brand等[9]发现, 在临床前列腺癌标本中CXCR4 m RNA呈高表达。
本研究分别用免疫组化法和RT-PCR分析检测SDF-1在垂体腺瘤中的表达。结果表明, SDF-1在垂体腺瘤中均有阳性表达, 表达位于细胞核内, 阳性着色表现为细胞核被染成棕褐色。侵袭性垂体腺瘤组织中SDF-1蛋白质和m RNA表达水平较非侵袭性垂体腺瘤明显增高。进一步分析显示, 除无功能型垂体腺瘤外, GH、ACTH、混合型垂体腺瘤中, 侵袭性腺瘤的SDF-1m RNA表达水平均较非侵袭性腺瘤显著增高。其机制可能因SDF-1生物学轴与多种肿瘤的生长、侵袭都有密切关系。故SDF-1是判断垂体腺瘤是否有侵袭性的指标, 对于判断垂体腺瘤的侵袭性和复发有重要意义, 为术后检测与辅助治疗提供理论依据。因此, 要充分利用SDF-1的这一特征, 使其发挥抗肿瘤增殖、抑制肿瘤侵袭性的作用。
摘要：目的 检测基质细胞衍生因子-1 (Stromal cell-derived factor-1, SDF-1) 在垂体腺瘤中的表达情况, 了解SDF-1与垂体腺瘤侵袭性的关系。方法 手术切除垂体腺瘤标本63例, 采用Wilson改良的Hardy分类法将其分为侵袭性垂体腺瘤和非侵袭性垂体腺瘤, 分别应用免疫组织化法 (Immunohistochemistry, IHC) 和逆转录聚合酶链式反应 (Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) 检测侵袭性垂体腺瘤 (30例) 和非侵袭性垂体腺瘤 (33例) 中的SDF-1蛋白和mRNA的表达情况。然后进一步比较SDF-1在各种不同内分泌类型的垂体腺瘤之间以及侵袭性与非侵袭性垂体腺瘤之间表达情况的差异。结果 (1) SDF-1蛋白主要分布于细胞核, 在30例侵袭性垂体腺瘤中的阳性表达率为60.00%, 在33例非侵袭性垂体腺瘤中的阳性表达率为24.24%。χ2检验分析表明有显著性差异 (χ2=9.042, P<0.05) 。 (2) SDF-1mRNA在侵袭性垂体腺瘤中的阳性表达率明显高于非侵袭性垂体腺瘤。结论 SDF-1是判断垂体腺瘤是否有侵袭性的指标, 对于垂体腺瘤的侵袭性和复发的评价有重要意义, 为临床治疗侵袭性垂体腺瘤提供新的靶点。
关键词：基质细胞衍生因子-1,垂体腺瘤,侵袭性
参考文献
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