基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（精选2篇）
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 篇1
拓展基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪的检测范围
选用多壁碳纳米管(CNT)作为基质辅助激光解吸电离化飞行时间(Matrix-assisted laser desorption ionization/ time of flight,MALDI-TOF)质谱仪的基质,对分子量小于0.8 ku的小分子化合物进行检测,克服了MALDI-TOF MS 中的基体干扰,适合进行小分子分析.实验先在正离子模式下检测氨基酸及其衍生物,在正电场条件下清晰地观察到样品的.碱金属加合峰[M+K]+和[M+Na]+分子离子峰,几乎看不到加氢的离子峰[M+H]+.又在负离子模式下以CNT作为基质对氨基酸样品进行质谱分析,得到单一[M-H]-负的分子离子峰,所得到的谱图几乎没有背景干扰,信噪比高.结果证实在负离子模式下可以方便快捷地进行氨基酸检测,从而拓宽了MALDI-TOF MS的应用范围.
作 者：陈晋安 黄慧英 黄河清 CHEN Jin-an HUANG Hui-ying HUANG He-qing 作者单位：厦门大学生命科学学院分析测试中心,福建,厦门,361005刊 名：厦门大学学报(自然科学版) ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF XIAMEN UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE)年，卷(期)：46(6)分类号：O657关键词：MALDI-TOF MS 基质 小分子化合物 负离子模式
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 篇2
1资料与方法
1.1一般资料
选自2013年5月 -2014年2月因胆囊结石在贵阳医学院附属医院行保胆取石术患者30例,选取其肉眼观典型的结石样本,其中胆固醇结石20例, 胆色素结石10例(见图1)。所有患者签属知情同意书。应用三酰甘油检测试剂盒(GPO-PAP)测定胆固醇含量,对选取的胆囊结石样本进行鉴定。胆固醇含量≥70%为胆固醇型结石,胆固醇含量≤30%为胆色素型结石[16]。胆囊结石取出后均立即用4℃ PBS水冲洗,37℃干燥6 h后,置于 -80℃冰箱冷冻备用。
1.2试剂
总胆固醇(total cholesterol,T-CHO)试剂盒购自南京建成生物工程研究所,BCA蛋白定量分析试剂盒购自美国Thermo公司,氯仿、甲醇、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)、组织裂解液 (radio-immunoprecipitation assay,RIPA)、考马斯亮蓝R-250、硝酸银、冰醋酸、乙醇、氨水、醋酸钠、戊二醛、硫代硫酸钠、碳酸钠、乙二胺四乙酸二钠购自上海生工生物工程有限公司
1.3仪器
Victor 3V多功能酶 标仪 、4800 Plus MALDI TOF/TOFTMAnalyzer购自美国ABI公司,电泳仪购自美国Bio-Rad公司,电热恒温水浴箱、水平脱色摇床购自厦门合力信仪器仪表有限公司,Power Pac系列Bio-Rad电泳仪购自美国Bio-Rad公司,Mini Protean 3 Cell小型垂直电泳槽购自美国Bio-Rad公司,Geno Sens 1860凝胶成像系统购自上海勤翔科学仪器有限公司。
1.3方法
1.3.1胆囊结石的胆固醇提取切取部分胆结石放入预冷的研钵中磨成粉末,每个样本精确称取10 mg, 盛于15 ml离心管中,加入氯仿、甲醇混合液(体积比2∶1)14 ml,充分振摇1~2 min后,避光常温室内存放20 min,再振摇1~2 min后,6 000 r/min离心10 min,取上清液,按照T-CHO试剂盒说明书,采用单试剂GPO-PAP法测定胆固醇含量。
1.3.2 RIPA法提取胆囊结石蛋白每份取等量的胆固醇结石和胆色素充分混合后,分别称取100 mg的胆固醇和胆色素结石粉末转入1.5 ml离心管。每管分别加入400μl组织裂解液(radio-immunoprecipitation assay,RIPA),4℃冰箱孵育1 h,12 000 g, 4℃离心30 min,上清液即为提取的蛋白,转上清液于新管中置于 -80℃冰箱冷冻保存。按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行操作,测定蛋白浓度。
1.3.3 SDS-PAGE电泳分离蛋白将胆固醇和胆色素结石蛋白,加入6×loading buffer,95℃,5 min。 两种结石分别取600、300、120和100 ng,上样。采用5%的聚丙烯酰胺浓缩胶和15%的聚丙烯酰胺分离胶进行电泳,分离蛋白。
1.3.4蛋白质考马斯染色和银染并质谱鉴定考马斯染色:采用考马斯亮蓝R-250染色液染色15 min后再用考马斯脱色液脱色4次,每次10 min,最后一次脱色过夜。蛋白质银染:把胶片置于无菌的盘中, 25 ml固定液固定30 min,25 ml左右增敏液孵育30 min,去离子水洗脱3次,每次10 min,硝酸银染色液25 ml染色40 min,25 ml的显影液显影15 min, 25 ml左右的终止液终止10 min,去离子水洗3次, 每次5 min,采用Geno Sens 1860凝胶成像系统成像 (见图3)。将染色后清晰出现的蛋白质条带切割下来,进行胶内酶解提取肽段,并采用MALDI-TOFTOF对样品条带进行分析,激光源为355 nm波长的Nd:YAG激光器,加速电压为2 k V,采用正离子模式和自动获取数据模式采集数据,PMF质量扫描范围800~4 000 Da,选择信噪比 >50的母离子进行二级质谱(MS/MS)分析,每个样品点上选择8个母离子, 二级MS/MS激光激发2 500次,碰撞能量2 k V,CID关闭。
1.3.5生物信息学分析采用在线数据分析软件Mascot数据库(http://www.matrixscience.com)进行二级质谱离子(MS/MS Ions Search)检索分析对应的蛋白质信息,Mascot数据库打分算法是分子量检索 (molecular weight search,MOWSE)算法的改进,基于非冗余蛋白质数据库中肽分布频率及可能性对所得数据进行综合打分。所用检索条件见表1,最终得出的蛋白质进一步进行基因本体 (gene ontology, GO)、京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析。
2结果
2.1胆囊结石类型
应用GPO-PAP法测定肉眼选取的30例胆囊结石的胆固醇含量,其中胆固醇结石20例(66.7%), 胆色素结石10例(33.3%)。见图1和表2。
2.2胆固醇和胆色素结石中的蛋白质
对比两种凝胶染色方法发现,两种染色的蛋白谱大体类似,银染灵敏度较高,能显示更多的条带, 两种类型结石中所含蛋白大小基本相同,含量最大的蛋白都出现于70 k D左右,所不同的是固醇型结石40 k D出现明显蛋白条带,而色素型结石却不存在。 其余蛋白条带分别出现在55、35、25和15 k D附近。见图2。
A:考马斯染色(M:Marker;1~4:胆囊结石上样蛋白);B:银染, (M:Marker;1~4:胆固醇结石上样蛋白;5~8:胆色素结石上样蛋白)
2.3质谱鉴定及生物信息学分析
SDS-PAGE胶上蛋白条带经过质谱鉴定得到优质的肽段质量指纹图谱,以70 k D为例 (见图3A),对70 k D条带中肽段RHPDYSVVLLLR(分子量1 467.833 1)进行二级质谱分析(见图3B),结果y离子全序列匹配,得到较高分数鉴定结果。将所得肽段分子量数据导入Mascot数据库进行分析,并根据SDS-PAGE胶上蛋白条带所显示的分子量最终分析这些蛋白结果(见表3)。SDS-PAGE胶上蛋白条带所对应的蛋白分别为转铁蛋白前体蛋白(sero transferrin precursor,TRFE)、白蛋白(albumin,ALB)、 抗胰蛋白酶1(alpha-1-antitrypsin,SERPINA1)、免疫球蛋白 γ-1(ig gamma-1 chain C region,IGHG1)、 α 血红蛋白(hemoglobin subunit alpha,HBA1)和 β 血红蛋白(hemoglobin subunit β,HBB)。一般认为当搜索结果匹配分数(score)≥55分时,待测蛋白质的氨基酸序列与数据库中某种已知蛋白质的氨基酸序列覆盖率较高,认为匹配的可能性很大,差异有统计学意义(P <0.05)[17]。结果中除TRFE外其余匹配分数 >55分。
2.4生物信息学分析
用DAVID数据库(http://david.abcc.ncifcrf.gov/) 对质谱鉴定的基因进行GO注释描述和分类,使用KEGG公共数据库(http://www.genome.jp/)对这些基因进行GO和KEGG信号通路富集分析。GO分析得知这些蛋白免疫先关蛋白,抑制酶类蛋白。KEGG表明,SERPINA1参与补体和凝血级联反应,其不仅是一种代谢酶类抑制剂,同时还参与先天免疫的调控 (见图4)。
A:70 k D 蛋白条带一级肽段指纹图谱;B:肽段 1 467.833 1 的二级肽段指纹图谱
3讨论
人体胆结石的主要成分为黏蛋白、胆固醇、胆色素、钙离子。胆石症常可引起严重的并发症,因此,必须从根本上研究胆石症的成石原因,为预防和治疗胆石症提供理论基础,而对胆结石的形态、结构、成分、含量等进行确切的分析是认识胆结石形成的重要基础。目前,研究表明某些蛋白通过调控胆固醇代谢在胆结石的形成中发挥重要作用。但最近胆结石发病机理制的研究一直局限于胆汁和胆囊组织及黏膜中蛋白的研究,这些蛋白可能仅仅只是胆结石在胆囊内形成后的一种的反应,并不能准确地反映胆结石形成的机制。更令人感兴趣的是,这些蛋白是否存在于结石本身呢,这些蛋白到底是什么蛋白, 其在胆囊结石的形成中扮演什么样的角色,是促进胆囊结石的形成还是抑制形成?这些都是未知的。 早期LEE等[13,14]研究证明,胆结石中存在蛋白质,同时推测这些蛋白质可能反映胆结石在胆囊内形成时胆囊胆汁的理化状态,但并没有给出这些蛋白的具体信息。因此,鉴定这些蛋白质会使人们更加深入地理解胆囊结石形成的发病机制。
MURRAY等[15]利用高效液相色谱法证明胆固醇结石中不仅有黏蛋白,而且还含有非黏蛋白,其主要成分可能是人血清ALB。但是常见的胆色素结石并没有纳入研究中,而且这种方法存在着一定的局限性,其只能根据标准品分子量大小来推测可能的蛋白质。目前,质谱MALDI-TOF/TOF技术以其操作简便、分析速度快、敏感度高及丰富的数据库资源等优点成为蛋白质组学研究中强有力的工具之一。 其依靠蛋白质分子量和氨基酸与蛋白质的匹配率来精确鉴定蛋白质。对于串联质谱检索,蛋白得分并不是严格意义的统计学结果,只是对蛋白质匹配排序的依据。当得分 <55分时,匹配的可能性较小,此时有3种可能:1可能是该蛋白类似物;2与该蛋白c DNA同源,但为不成熟蛋白;3可能是某种新的未知蛋白或不成熟蛋白。虽然TRFE得分仅39分,但是TRFE为血清TRFE,其在核糖体内尚未装配和修饰完善,属不成熟蛋白,因此并不表示胆结石中不存在该蛋白,需要进一步验证。与MURRAY不同的是, 实验发现人血清ALB不但存在于胆固醇结石中,而且存在于胆色素结石,与此同时,笔者还发现IGHG1、 SERPINA1、TRFE、HBA1、HBB等蛋白同样存在于两种胆囊结石中。人血清ALB中钙离子、脂肪酸、胆红素等有良好的结合能力,其大量存在很可能与胆结石组成有重要联系[15]。另外,KEUL-EMANS等[18]发现,人血清ALB、免疫球蛋白、氨肽酶N和黏蛋白在36%的胆固醇结石患者的胆汁标本中升高,并认为局部炎症导致黏蛋白、免疫球蛋白的产生,再通过疏水性作用俘获ALB。KEGG是基因组破译方面的数据库,后基因时代一个重大挑战是如何通过计算机完整地表达和演绎细胞和有机体,利用基因信息对更高层次和更复杂的细胞活动和生物体行为做出推测,建立一个网络推测工具。其可以对蛋白质交互网络在各种细胞活动中起的作用做出预测,通过GO分析可知IGHG1、HBB是免疫相关蛋白,而胆结石形成又与炎症互为因果,因此这两种蛋白很可能通过参与炎症反应调控胆结石的形成与发展。另外SDS-PAGE银染结果显示,固醇型结石比色素型结石多出一条蛋白条带,经鉴定该蛋白是IGHG1, 表明固醇型结石很可能与炎症反应有关。可见IGHG1蛋白或其对应基因是参与不同胆结石类型成因的重要元素及生物标志物。深入研究该蛋白将对胆囊结石的预防和治疗带来极大的帮助。SERPINA1和胆固醇脂质有关,且是代谢酶类的抑制分子,那么其很可能以某种机制通过调节胆固醇代谢参与胆囊结石的形成。
总之,胆囊结石的成因是多因素且复杂的,进一步在胆囊组织或者胆汁中研究这些蛋白的起源及其在胆囊结石形成中的作用,可能为胆囊结石形成的发病机制提供新线索。本研究为进一步实验提供技术和理论支持。
摘要：目的 探讨胆固醇结石和胆色素结石中是否存在非黏性蛋白并鉴定蛋白质的组成。方法 选取30例行保胆取石术患者的胆囊结石,男性11例,女性19例。采用肉眼观察并结合三酰甘油检测试剂盒(GPO-PAP)测定胆固醇含量的方法对胆结石进行分类,分为20例胆固醇型和10例胆色素型。应用组织裂解法(RIPA)提取胆囊结石蛋白,并用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与基质辅助激光解析电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-TOF)分析相结合的方法对该蛋白进行鉴定分析。通过DAVID工具对上述基因进行基因本体(GO)功能富集分析本图及京都基因、基因组百科全书(KEGG)信号转导通路富集分析。结果 胆固醇结石和胆色素结石中出现特异性蛋白,经质谱鉴定为转铁蛋白前体蛋白(TRFE)、白蛋白(ALB)、抗胰蛋白酶1(SERPINA1)、免疫球蛋白γ-1(IGHG1)、α血红蛋白(HBA1)、β血红蛋白(HBB),其中IGHG1不存在于胆色素结石中。结论 TRFE、ALB、SERPINA1、HBA1、HBB等蛋白共同存在于胆固醇和胆色素结石中,而IGHG1只存在于胆固醇结石中,可见IGHG1蛋白或其对应基因是参与不同胆结石类型成因的重要元素及生物标志物。KEGG分析结果表明,SERPINA1参与补体和凝血级联反应。鉴定和分析胆囊结石中非黏性蛋白的成分及利用资料库的模拟对阐明胆囊结石的发病机制有重要的意义。