金属基质蛋白酶9

金属基质蛋白酶9（通用7篇）

金属基质蛋白酶9 篇1

卵巢上皮性癌(epithelial ovarian carcinoma,EOC)是妇科中常见的恶性肿瘤[1],因其发病隐匿,大多数的患者明确诊断时已属于癌症晚期,其病死率已位居女性生殖系统恶性肿瘤的首位。新生血管不仅仅为肿瘤细胞的增殖提供养分,同时是肿瘤细胞进一步侵袭的重要的途径,为肿瘤的生长及转移创造有利的条件[2]。近年来研究[3]表明,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteins,MMPs)在肿瘤血管的生成中起重要作用。本研究采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(streptavidin-perosidase,SP)检测60例卵巢上皮性癌、16例良性卵巢肿瘤组织和10例正常卵巢组织中MMP-2及MMP-9的表达,探讨与局部血管生成的关系,为临床上深入地了解卵巢上皮性癌中肿瘤血管的生成提供临床参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取本院2007年2月~2010年9月诊治的60例EOC患者初次切除后的卵巢石蜡包埋组织标本,年龄33~67岁,平均年龄(47.5±13.3)岁;根据国际妇产科联盟(Intemational Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)标准进行临床分期及病理组织学的分级,其中临床分期Ⅰ~Ⅱ期24例,Ⅲ~Ⅳ期36例;高分化~中分化程度35例,低分化程度25例;术后对60例EOC患者进行随访2~6年。并取同期因子宫良性疾病手术而切除卵巢的患者的石蜡包埋组织标本其中正常卵巢组织10例,患者年龄35~64岁,平均年龄(47.2±12.4)岁,术前未做任何的化疗及放疗;良性卵巢肿瘤组织16例,年龄34~68岁,平均年龄(48.9±15.1)岁。对数据进行分析比较。

1.2 方法

1.2.1 实验试剂

即用型鼠抗人MMP-2、MMP-9、CD34单克隆抗体及SP免疫组织化学超敏染色试剂盒和二氨基联苯氨(diaminobenzidin,DAB),均由美国Maxim公司生产,购于迈新生物技术有限公司。

1.2.2 方法

标本取材后采用5.0%的甲醛缓冲液固定,进行常规脱水和石蜡包埋,切取5.0μm石蜡切片,放置于54℃烘箱中。MMP-2、MMP-9和CD34表达情况的检测采用免疫组织化学SP法,按照MMP-2、MMP-9、CD34鼠抗人的单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒和DBA显色液试剂盒中各自的说明进行操作,每组染色均以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 观察标准

显微镜下观察细胞的染色情况,细胞浆或细胞核中出现黄色或棕黄色颗粒作为阳性判定的标准。按照5.0%以上细胞浆或细胞核呈棕黄色染色为表达阳性,<5.0%的细胞着色或细胞与背景一致不着色定位阴性(-),5.0%~30.0%的细胞阳性染色定为(+),30%~50.0%的细胞阳性染色定为(++),阳性细胞>50.0%定为强阳性(+++)。微血管密度(microvessel density,MVD)的计数:先在40倍镜下全面观察用免疫组织化学SP法进行CD34染色的切片,确定MVD的最高点;然后在200倍镜下记录5个视野内的微血管数,取其平均值作为该病例的MVD值。

1.3 统计学处理

采用SPSS11.5统计学软件对数据进行处理分析,各组MMP-2、MMP-9与临床病理特征的关系采用χ2检验,MVD与临床病理特征的关系采用t检验,MMP-2和MMP-9与MVD的相关性应用Spearman分析,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 MVD在3种组织中的表达

CD34呈棕黄色细颗粒状,在卵巢肿瘤组织间质血管内皮细胞胞浆呈阳性表达,EOC、良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织的MVD分别为(41.25±32.12)、(14.27±9.58)和(7.43±5.47),EOC组中的MVD与卵巢良性肿瘤组比较显著升高(P<0.05)。

2.2 MMP-2和MMP-9在3种组织中的表达

MMP-2和MMP-9免疫组织化学的阳性产物均呈棕黄色细颗粒状,主要定位于肿瘤细胞的胞浆和胞核。60例EOC中MMP-2和MMP-9的阳性率分别为67.45%和72.41%,显著高于卵巢良性肿瘤组及正常组(P<0.05)。

2.3 EOC中MMP-2和MMP-9的表达与临床病理特征的关系

EOC中MMP-2和MMP-9的表达与肿瘤大小无关(P>0.05),与细胞的分化程度、转移和肿瘤分期具有相关性(P<0.05),结果见附表。

2.4 卵巢上皮性癌中MMP-2、MMP-9与MVD表达的相关性分析

MMP-2和MMP-9的表达均与MVD表达呈正相关,相关系数为(r=0.254,r=0.246,P<0.05)

3 讨论

MMPs是蛋白水解酶中较为重要的一类。资料显示[4,5],肿瘤细胞除了能分泌MMPs外,还能分泌血管生成因子,如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),诱导内皮细胞产生MMPs。降解细胞外基质和基底膜[6,7],进一步促进肿瘤新生血管的生成。

据资料,MMP-9在EOC的表达与局部肿瘤血管生成的关系的报道较少,本文通过研究,将正常卵巢组织与卵巢上皮性癌组织进行对比分析,结果显示卵巢上皮性癌中MMP-9的阳性表达率显著升高(P<0.05),这与王喜梅[8]的报道相一致,从而证实了MMP-9在卵巢上皮性癌中过度表达,促进肿瘤血管的生成。MMP-2是分子量为72 kD的Ⅳ型胶原酶,主要的作用底物为4、5型胶原,主要由肿瘤细胞、成纤维细胞以及炎性细胞分泌,研究[9]表明,其在肿瘤介导的细胞外基质降解中发挥着重要的作用,基质膜和基质的降解对血管生成所必需的内皮细胞极为重要,MMP-2被认为是肿瘤血管生成关键因素之一。通过本次研究结果显示,MMP-2及MMP-9的表达率高的EOC患者,其肿瘤血管生成的能力越强[10],因此,卵巢上皮性癌中MMP-2和MMP-9表达的增强,可能与卵巢上皮性癌的发生发展具有相关性(r=0.254,r=0.246,P<0.05)。检测EOC中MMP-2及MMP-9的表达有助于进一步了解肿瘤血管的生成情况。

综上所述,MMP-2及MMP-9与EOC的血管生成显著相关,是EOC相关的一种癌蛋白,在EOC的发生和发展中发挥着重要的作用,对蛋白的表达有正向的调节作用,进而可以影响EOC血管的生成。

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金属基质蛋白酶9 篇2

关键词：肺纤维化,基质金属蛋白酶-2,基质金属蛋白酶-9

肺纤维化是多种慢性肺疾病的共同结局, 表现为肺间质细胞大量增殖、细胞外基质 (ECM) 异常增生及肺组织结构的重构, 疾病早期表现为弥漫性肺泡炎, 肺泡结构破坏, 肺泡上皮细胞和基底膜的损伤是肺间质纤维化病理过程的特征性改变, MMP-2和MMP-9可以降解肺泡壁基底膜的重要成分Ⅳ型胶原, 因此, MMP-2和MMP-9在肺纤维化的发生过程中起着重要的作用。清肺化痰通络方是全国名老中医邱幸凡教授的临床经验方, 在临床应用中取得了较好疗效。本实验借鉴博莱霉素A5 (BLMA5) 诱发的大鼠肺纤维化模型, 利用免疫组化法检测肺内MMP-2和MMP-9的表达, 以探讨清肺化痰通络方防治肺纤维化的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雌性Wistar大鼠72只, SPF级, 体重 (200±20) g, 购于武汉大学试验动物中心。

1.2 试验药物

清肺化痰通络方由黄芩、瓜蒌、桃仁、地龙、黄芪、当归、鱼腥草 (购于湖北省中医院) 组成;常规水煎后, 水浴浓缩药液至每1 m L含生药2 g, 4℃保存。将BLMA5 (8 mg/支, 天津太和制药有限公司, 批号:030705) 制成5 mg/m L的生理盐水溶液。MMP-2单克隆抗体 (产品编号:ZM-0330) 、MMP-9单克隆抗体 (产品编号:ZM-0335) 及Sp试剂盒 (产品编号:SP-9000) 由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。

1.3 肺纤维化模型制作

参照文献[1], 将大鼠麻醉, 趁动物吸气瞬间, 在额镜的直视下迅速将焊锡制成圆头的12号腰穿针头, 通过声带插入气管约3~4 cm, 缓慢注入BLMA5生理盐水溶液1 m L/kg。立即将大鼠直立旋转。

1.4 动物分组及处理方法

将72只大鼠随机分为三组: (1) 模型组 (24只) :造模2 h后, 生理盐水灌胃, 15 m L/ (kg·d) ; (2) 干预组 (24只) :造模2 h后, 清肺化痰通络方水煎剂灌胃, 15 m L/ (kg·d) ; (3) 对照组 (24只) :不造模, 生理盐水灌胃, 15m L/ (kg·d) , 灌胃前禁食4 h, 不禁水。以上各组动物分别在实验第3、7、14、28天各处死6只。

1.5 标本采集及处理

经0.5%戊巴比妥钠溶液腹腔内注射麻醉后, 称重;颈动脉放血处死, 10%甲醛溶液固定右肺上叶, 制作石蜡切片, 用于HE染色和Masson染色及肺组织MMP-2和MMP-9表达检测。

1.6 指标检测

1.6.1病理染色分析依据Szapiel等[2]方法, 确定肺泡炎及肺纤维化程度。 (1) 肺泡炎分级, 0分:无明显病变;1分:轻度肺泡炎, 病变占全肺20%以下;2分:中度肺泡炎, 病变局限在全肺20%~50%;3分:弥漫性肺泡炎, 病变范围超过50%。 (2) 肺间质纤维化分级, 0分:无肺间质纤维化;1分:轻度肺间质纤维化, 病变范围局限在全肺20%以下;2分:中度肺间质纤维化, 病变范围占全肺20%~50%;3分:重度肺间质纤维化, 病变范围超过50%, 肺泡结构消失, 肺组织结构紊乱。

1.6.2免疫组织化学分析Sp法测定肺组织的MMP-2和MMP-9表达, 采用HUMIAS-2000医学图文分析系统, 对免疫组织化学结果定量分析。每张切片在高倍视野 (×400) 下随机选择不相重叠的5个视野, 细胞核为蓝色, MMP-2和MMP-9阳性细胞为棕黄色, 阴性对照片以PBS替代MMP-2和MMP-9。测定阳性细胞的积分光密度, 观察MMP-2和MMP-9免疫阳性细胞的分布, 以反映各组肺组织中MMP-2和MMP-9表达的变化。

1.7 统计学方法

采用SPSS 12.0统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差 (x±s) 表示, 三组间比较采用单因素方差分析, 用q检验进行不同组间的两两比较, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 清肺化痰通络方对肺纤维化大鼠肺组织的影响

2.1.1肉眼观察对照组可见大鼠肺呈粉红色, 表面光滑, 弹性良好。模型组第3、7天可见大鼠双肺呈鲜红色, 有数个的散在出血点, 体积增大, 第14天双肺可见暗红色陈旧出血, 第28天时双肺苍白、表面凸凹不平、体积缩小、弹性较差, 硬度增加。干预组与模型组病变基本一致, 但程度稍轻, 肺体积略增大, 弹性稍差。

2.1.2镜下观察对照组大鼠肺组织结构清晰, 肺泡壁完整, 肺泡上皮细胞形态正常, 均未见明显病变。模型组第3天时肺内出现肺泡间隔增宽、炎性细胞浸润等急性肺泡炎改变;第7天时炎症表现更明显, 镜下见大片炎性细胞浸润, 成纤维细胞开始增殖;第14天时肺泡炎持续加重, 纤维组织开始增生;第28天肺泡炎较前有所减轻, 部分肺泡腔消失, 被大量成纤维细胞、增生的胶原纤维所取代, 已基本呈现肺纤维化改变。干预组大鼠肺部病理表现的变化规律与模型组基本一致。三组间同时段的肺泡炎程度, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;干预组和模型组同时段肺泡炎程度差异有统计学意义 (P<0.05) , 特别是第7天和第14天干预组肺泡炎程度较模型组轻, 两组间差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。干预组和模型组在第3天肺纤维化程度差异无统计学意义 (P>0.05) , 三组在第7、14、28天的肺纤维化程度, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;第28天干预组肺纤维化程度较模型组轻, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。见表1。

2.2 三组MMP-2和MMP-9蛋白表达比较

对照组肺组织中可见MMP-2少量阳性表达, 主要分布在肺泡巨噬细胞、肺泡上皮细胞、成纤维细胞和气道上皮细胞胞浆内。模型组、干预组第3天时, 肺内MMP-2阳性表达细胞均多于对照组, 肺泡间隔内可见少量成纤维细胞呈阳性反应, 血管、支气管周围及肺泡腔镜下内可见大量单核巨噬细胞呈强阳性反应, 三组间比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;第7天模型组和干预组MMP-2表达明显增强, 可见大量肺泡巨噬细胞和间质内的成纤维细胞呈阳性表达;第14天模型组和干预组肺内阳性细胞表达最强, 与第3、7、28天比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;第28天时, 模型组和干预组阳性细胞较同组第14天时明显减少, 但仍高于对照组。见表2。

对照组肺内可见MMP-9少量弱阳性表达, 表达主要分布于肺胞巨噬细胞和支气管上皮细胞。第3天时模型组、干预组大鼠肺内血管、支气管周围及肺泡腔内的单核巨噬细胞呈强阳性反应, 与对照组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;第7天模型组和干预组肺内MMP-9表达增强, 除支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞外, 还见大量间质内的成纤维细胞和肺泡巨噬细胞呈阳性表达, 与同组第3、14、28天比较, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) ;第14天模型组和干预组肺内阳性细胞略有减少;第28天模型组和干预组MMP-9表达较第7天时明显减弱, 但仍高于对照组 (P<0.05) 。干预组阳性细胞明显少于同时段模型组, 两组间差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。

3 讨论

现代医家根据肺纤维化临床表现及病机变化将其归为咳嗽、肺胀、喘证、气短、肺痿、肺痹、痰饮等范畴, 正气亏虚为本, 血瘀内阻为标, 正虚邪实为其基本病机, 其中, 痰阻肺络、肺阴不足、瘀血阻滞、内闭喘脱为临床多见的病变类型。消肿化痰通络方中黄芩、瓜蒌为君药, 黄芩味苦寒主入肺经, 可泻火解毒, 治肺热所致咳吐黄痰;瓜蒌药味甘、微苦, 性寒, 归肺、胃、大肠经, 清热化痰, 宽胸散结、痛疮肿毒, 两者相伍则肺之热清痰化而气机调畅;鱼腥草味辛, 性微寒, 归肺经具有清热解毒、消痈排脓功效, 肺萎之人久咳入络, 必兼气虚血瘀, 故以地龙、桃仁活血化瘀、通络, 且地龙性寒味咸, 善下行可平抑上逆之肺气而止咳平喘;佐以黄芪、当归养血补气, 与君药相配, 苦寒、甘温并用, 使肺热得清而不伤肺津, 共奏清热化痰、止咳平喘、活血益气之功。

实验结果显示, 造模大鼠均有不同程度的耸毛、活动减少、嗜睡, 少吃等症状。造模初期可见大鼠体重明显下降, 约3 d后逐渐缓解, 其中, 干预组体重恢复较快, 第28天时体重已与空白对照组相近, 而模型组体重恢复较慢, 第28天时仍明显低于对照组。通过HE光镜观察模型组早期即出现肺泡炎, 14 d后以肺纤维化病变为主, 28 d出现典型的肺纤维化改变, 符合肺纤维化的病理改变过程[3], 提示造模成功。干预组肺泡炎程度明显的轻于模型组, 提示清肺化痰通络方可以减轻早期肺泡炎的改变, 第14、28天干预组肺纤维化程度轻于同时段的模型组。提示清肺化痰通络方可以减轻模型动物的症状, 并在肺组织结构上减轻和延缓纤维化的发生。

组织纤维化的发生是由于ECM代谢失衡, 打破了脏器原有的组织结构, 纤维结缔组织大量增生的结果[4]。ECM包括纤维性成分、连接蛋白和间质成分, 主要为糖胺聚糖等, 其对细胞增殖和分化发挥重要调控作用, 合成和降解这些蛋白质的ECM代谢酶可分为基质金属蛋白酶类 (MMPs) 和基质金属蛋白酶组织抑制物 (TIMP) 。MMPs的明胶酶 (MMP-2、MMP-9) 主要降解Ⅳ胶原纤维、纤维连接蛋白、肺基膜等成分, 由于肺基膜及结构支架的损伤与肺纤维化密切相关, 因此, MMPs在肺纤维化发生中的作用日益受到重视[5]。有报道MMP抑制剂巴马司他等能降低MMP-9活性, 抑制TNF-α和TGF-β1释放, 减轻动物模型的肺纤维化[6,7]。Lemjabbar等[8]测定了肺间质纤维化患者支气管肺泡灌洗液中蛋白和MMP-2 m RNA的表达, 显示激素及免疫抑制剂治疗可以降低肺内MMP-2表达。上述研究均表明损伤肺组织可能通过持续性高表达MMPs, 使基膜不可逆性损伤断裂, 阻碍新生上皮组织重构正常肺泡腔, 最终导致肺纤维化。

本实验研究显示, 第3天开始模型组和干预组肺内MMP-2、MMP-9的表达均开始增加, 模型组和干预组MMP-9在第7天时已经达到高峰, 然后干预组快速下降, 到第28天时MMP-9水平基本接近正常, 模型组在第7天出现MMP-9表达高峰, 第14、28天也出现明显的下降, 但是28天时MMP-9的水平仍高于对照组。肺纤维化大鼠在造模的第3~14天以肺泡炎的病理改变为主, 提示MMP-9可能与早期上皮基底膜损伤有关, 参与了细胞外基质和基底膜的降解。干预组的MMP-9明显下降, 且在第14天时MMP-9的表达明显低于模型组, 推测清肺化痰通络方可能是通过抑制MMP-9表达, 从而延缓、减轻早期肺泡炎的发生。模型组和干预组MMP-2在第14天时达到高峰, 然后缓慢下降, 第28天时, 模型组和干预组仍高于对照组。第14、28天时以肺纤维化为主要病变, 提示MMP-2则可能在肺泡上皮细胞的再生与肺组织的异常修复中起重要作用。第14、28天MMP-2在干预组的表达低于模型组, 且干预组肺纤维化程度比模型组轻, 提示清肺化痰通络方通过延缓或者抑制MMP-2表达, 达到延缓以及抑制肺纤维化的目的。

综上所述, 本实验结果提示, BLMA5诱导的肺纤维化模型在不同时期MMPs的表达不同, 早期病变肺组织以MMP-9的增加为主, 晚期则以MMP-2增加为主, 与有关报道一致[9]。清肺化痰通络方可能通过抑制MMP-9在肺纤维化大鼠肺内的表达, 减轻早期的肺泡炎, 抑制MMP-2的表达, 延缓和抑制后期肺纤维化的发生。

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金属基质蛋白酶9 篇3

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源

本组研究中宫颈组织石蜡标本均取自2002年6月~2008年12月在我院妇科门诊进行宫颈活检、住院患者手术切除的组织,慢性宫颈炎20例、CINⅠ级15例,CINⅡ级15例,CINⅢ级15例,宫颈癌42例。宫颈癌临床分期采用FIGO标准,其中宫颈癌Ⅰ期14例,Ⅱ期21例,Ⅲ期7例,全部病例在术前均未接受放疗、化疗。所选病例无高血压、糖尿病等合并症。

1.1.2 试剂

MMP-2和MMP-9均为兔抗人单克隆抗体,购自北京中杉金桥生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学染色

按免疫组织化学二步法进行,石蜡切片经二甲苯脱蜡、酒精水化后,微波炉中修复抗原,用1︰50 MMP-2一抗及MMP-9一抗作用过夜,生物素二抗孵育,链亲和素-生物素过氧化合物酶复合物作用后经DAB显色封片观察。每批实验以扁桃体为阳性对照,以PBS代替第一抗体作为阴性对照。

1.2.2 结果判定标准

用低倍和高倍镜观察全片,MMP-2及MMP-9阳性染色为在细胞浆内出现棕黄色颗粒,根据阳性细胞数所占比例及染色强度分为以下几级:无染色细胞(-);阳性染色细胞数<20%(+),染色淡黄,个别可黄至棕黄色;阳性染色细胞数20%~50%(++),染色黄色:阳性染色数>50%(+++),强度黄至棕黄色,少数为淡黄色。对CIN及宫颈癌病例,进行病变部位MMP-2和MMP-9测定。

1.3 统计学方法

采用等级资料中多个样本比较的秩和检验,及列联表资料的χ2检验,检验水准α=0.05。

2 结果

2.1.1 MMP-2在慢性宫颈炎、各级CIN、宫颈癌组织中的表达

MMP-2主要表达于宫颈上皮细胞胞浆内,从下表显示:在慢性宫颈炎,MMP-2的阳性细胞率表达很低,仅为5%,在各级CIN、宫颈浸润癌阳性表达高,其阳性表达强度随CIN级别增高而增强,至宫颈癌表达强度最高,差异有显著性,见表1。

注:H=64.34,P<0.005

2.1.2 MMP-2在各级宫颈癌组织中的表达

MMP-2在宫颈癌上皮细胞中表达阳性率达100%,但宫颈癌的临床分期与MMP-2的表达强度差异无显著性,见表2。

例

注:χ2=7.02,0.1

2.2.1 MMP-9在慢性宫颈炎、各级CIN、宫颈癌组织中的表达

MMP-9主要表达于宫颈上皮细胞胞浆内,从下表显示:在慢性宫颈炎,MMP-9的阳性细胞率表达很低,在各级CIN、宫颈浸润癌阳性表达高,其阳性表达强度随CIN级别增高而增强,至宫颈癌表达强度最高,并差异有显著性,见表3。

例

注:H=57.19,P<0.005

2.2.2 MMP-9在各级宫颈癌组织中的表达

MMP-9在宫颈癌上皮细胞中表达阳性率达100%,宫颈癌的临床分期与MMP-9的表达强度差异有显著性,见表4。

例

注:χ2=11.83,0.01

3 讨论

细胞外基质(extracellular matrix,ECM)有间质性基质和基底膜两种形式,恶性肿瘤侵袭正常组织及转移必须突破ECM,尤其是基底膜,基底膜的主要成分为Ⅳ型、Ⅴ型胶原、弹力蛋白等。ECM的降解主要依靠蛋白水解酶,基质金属蛋白是其中最为重要的一类,几乎能降解ECM的所有成分。明胶酶MMP-2、MMP-9的降解底物为Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原、纤维蛋白、弹力蛋白等,由此推论:组织中明胶酶的改变与肿瘤的侵袭、转移有关。

肿瘤转移是一个多步骤过程[1],MMP-2和MMP-9降解ECM的能力从各个方面影响肿瘤进展,主要分为以下两个方面:(1)肿瘤血管形成及肿瘤生长。血管形成是肿瘤生长的前提条件,MMP-9被认为是形成新生血管的关键因素,在人神经母细胞瘤异种移植模型中,MMP-9缺乏可导致血管形成减少,以及肿瘤微血管覆盖的外周细胞不连贯[2]。将B16-BL6黑色素瘤细胞种植入MMP-2缺乏的鼠体内,可观察到血管形成减少。(2)转移。肿瘤的转移仍依赖于其血管的形成。在鼠肉瘤模型,MMP-9的抑制可阻断肿瘤的转移[3]。大量的研究显示MMP-2、MMP-9与恶性肿瘤的的进展有关[4]。

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤,宫颈上皮瘤样变是其癌前病变。从该研究来看,MMP-2和MMP-9在慢性宫颈炎组织中的表达极低,而CIN各级组织中的表达率高,随着CIN级别增高,其表达强度逐渐增强,至宫颈癌表达强度最高,并差异有显著性。与GAIOTTO等[5]的研究结论相似。表明MMP-2和MMP-9与从宫颈癌前病变发展至宫颈癌这一过程相关。

ZHAI等[6]使用原位杂交技术测定正常宫颈、低度CIN、高度CIN及浸润癌组织中膜型基质金属蛋白酶(membertype-matrixmetalloproteinase,MT-MMP)的表达,结果显示随着宫颈病变的进展,MT-MMP的表达逐渐增强,而MT-MMP能激活MMP-2酶原,推断MT-MMP的表达增强导致MMP-2的水平增高。

ARGUELB-RAMIREZ等[7]的研究表明MMP-2和MMP-9的表达与宫颈癌的临床分期密切相关。但笔者在测定不同临床分期宫颈癌组织中的MMP-2和MMP-9水平时发现:虽然这两种明胶酶在宫颈癌组织中的表达很高,但MMP-2的表达强度与宫颈癌的临床分期无关,MMP-9与其临床分期差异有显著性,说明MMP-2在宫颈癌的形成中是一个早期事件,在宫颈癌的进展中,MMP-9起着更重要的作用。有研究显示,MMP-9主要在浸润性癌组织中表达,在原位癌中表达弱,在许多恶性肿瘤,血清可溶性MMP-9的水平能反映肿瘤的转移与否,通常被认为是恶性肿瘤的一项预后指标[8]。MEYER等[9]报道,对于远处转移的肿瘤细胞,MMP-9还有保护性抗凋亡的作用。

综上所述,表明MMP-2和MMP-9在从宫颈癌前病变进展至宫颈癌这一过程中起着重要作用,其表达增强与CIN的分级有关,MMP-9还与宫颈癌的临床分期相关。由此推论,对于宫颈炎、CIN、怀疑宫颈癌的宫颈活检组织进行MMP测定,有助明确诊断,并有助于判定预后。

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金属基质蛋白酶9 篇4

1 MMPs及MMP-9生理功能

MMPs是自然进化中高度保守的一类内源性锌依赖性蛋白酶家族,广泛分布于植物、脊椎动物、无脊椎动物中。目前已经发现100多个成员,其中人源MMPs24种,根据其作用底物不同,MMPs可以分为胶原酶(Collagennases)、明胶酶(Gelatinase)、间质溶解素(Stromelysin)、基质溶解因子(Matrilysins)、膜型MMP(MT-MMP)及其他MMPs 6大类[3]。MMPs主要的生理作用是降解ECM成分,如胶原、明胶、弹性蛋白、纤连蛋白和蛋白聚糖等[4],参与胚胎发育、康复、关节炎、心血管疾病、中风、多发性硬化症、神经退行性疾病、过敏、癌症等一系列生理和病理过程。其中MMP-9属于明胶酶,复杂程度较高,主要参与降解IV、V、VII、X、XI型胶原和明胶、纤维连接蛋白、弹性蛋白等。因此,MMP-9对于血管再生、炎性反应、动脉硬化斑块的形成及其发展进程中起重要作用。

在正常稳定状态组织中MMPs表达量极少,而在上述病理、生理过程中表达量上升。对MMPs表达和激活程度及对其分解底物过程的调控,主要通过以下3个不同水平实现:(1)转录水平的调控:多种激素、生长因子、癌基因以及细胞周期等可影响MMPs基因的转录。(2)MMP酶原活化的调控:MMPs是以无活性的酶原形式分泌的。通过逐级活化、被细胞表面膜型MMP(MT-MMP)激活和细胞内活化3种形式,MMPs可以被不同程度地激活。(3)MMP酶原激活后内源性组织特异性抑制剂(tissue inhibitor of etalloproteinase,TIMP)对其活性的调控。TIMP是一组能抑制MMP活性的多功能因子,可在肿瘤组织与间质细胞中表达[5]。它可以抑制MMPs,从而调节细胞外基质重构及其他各种病理过程。目前发现有TIMP-1、2、3、4,可在多个环节抑制MMP的活性,如抑制酶原活化以及与活化的MMPs结合而抑制其活性,亦可抑制新生血管形成的作用,如阻碍MMPs介导的内皮细胞移动、抑制基质中促血管生成因子的释放及防止ECM降解等。

2 MMP-9与动脉硬化危险因素的关系

动脉粥样硬化是冠心病的主要病因,而动脉壁的炎性反应被认为是动脉硬化症的主要原因。MMPs通过降解细胞外基质、导致心血管重构在其进程中发挥了重要的作用。除转录、酶促和TIMPs可以调节这些效应,炎症反应和细胞因子亦可以影响这个过程。动物实验和临床研究都表明MMPs的促进作用、TIMPs的抑制作用之间的平衡对于血管狭窄和动脉瘤的形成具有决定性作用。个体间基因多态性的不同可能是冠心病易感性不同的原因。开发针对MMPs的特异性治疗药物可能会延缓动脉硬化损伤、斑块破裂或者再狭窄[6]。

很多冠心病传统危险因素如糖尿病、高脂血症、吸烟、生活方式等与MMP-9的关系成为研究对象。对健康人的研究发现其MMP-9与白细胞计数呈显著正相关,血清MMP-9可以作为有价值的炎症反应标记物,因为其与白细胞计数相关并且与血脂水平无关[7]。形态学研究发现血管壁的主要病变在ECM。还有研究[8]发现MMP-9、Hcy与斑块的不稳定性密切相关,64层螺旋CT冠脉斑块检查联合血清同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)、MMP-9水平检测可提高其作为冠脉斑块不稳定性的预测指标的准确性。然而并非所有研究均与ACS)、稳定冠心病(SCHD)患者基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的变化及其与血脂水平的关系研究中发现,MMP-9与甘油三酯呈正相关、与高密度脂蛋白胆固醇呈负相关[9]。纤溶酶原在尿激酶-纤溶酶原活化剂或组织纤溶酶原活化剂的催化作用下变成纤溶酶,后者可部分激活间质胶原酶和基质胶原酶原[10]。因此,凝血系统与MMPs亦有一定相关。

糖尿病是冠心病的主要危险因素之一,MMPs在动脉硬化相关细胞外基质重构中起重要作用。研究发现糖尿病患者MMP-1抗原水平明显升高,其升高程度与糖尿病是否合并冠心病呈正相关,2G/2G多态性在糖尿病合并冠心病患者中发生频率明显升高,提示其与MMP-1高水平相关,A/G多样性中的G等位基因亦如此,因此提示2型糖尿病患者MMP-1水平升高,其启动子基因多样性可能与冠心病相关[11]。有研究[12]比较了MMP-2和9在健康人、糖尿病以及ACS患者中的表达。研究者选取165名对照组、181名糖尿病患者、78例ACS核46例合并糖尿病的ACS患者。发现相比对照组,MMP-9在糖尿病组、ACS组以及合并糖尿病的ACS患者中明显增加,相比糖尿病患者,ACS、DACS组MMP-9下降。研究者认为在糖尿病ACS发生时,MMP-2、9可以反映细胞外基质代谢异常。

作为冠心病重要的传统危险因素之一,研究发现吸烟者的MMP-9水平明显升高、TIMP-1在陈旧心梗患者中下降提示MMPs在心血管系统疾病发展中的重要性。在现有人群中饮食干预和/或n-3 PUFA(多不饱和脂肪酸)补充不能影响MMP-9、TIMP-1或者PAPP-A水平[13]。另有研究显示MMP-9与吸烟、部分炎性因子及凝血标记物相关,与年龄、BMI、血压、血脂无关。MMP-9水平前三分之一与后三分之一相比,经过年龄调整后的冠心病发病率风险比为1.37(95%CI 1.04-1.82),而经过调整传统危险因素(特别是吸烟)之后,风险比则下降到分界线附近OR 1.28(95%CI 0.95-1.74),进一步调整IL-6、CRP之后,OR则更加弱化到1.13(0.82-1.56)。因此,研究者认为对于普通人群,在不独立于吸烟、广泛炎症反应等危险因素的情况下,MMP-9相对于冠心病只有中等强度的相关,作为临床有效的冠心病生物学标记物价值有限,但是仍然在冠心病发病过程中起到一定作用[14]。

3 MMP-9对ACS的影响

急性冠脉综合征(ACS)是冠心病的严重临床表现形式,包括不稳定型心绞痛(unstable angina pectoris,UAP)、急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)和心源性猝死(sudden cardiac death,SCD)。其发生机制主要与冠状动脉粥样硬化基础上的斑块破裂或表面破损、血管收缩及血栓形成有关,导致冠状动脉血流急剧减少或中断,从而引起以上临床症状。而冠状动脉斑块的形态学特征和生物学特性与其稳定性密切相关,从而影响ACS的发生,脂质核心大、表面纤维帽薄的斑块性质不稳定,易于破裂。此外,病变局部炎症反应在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)发生、发展及斑块破裂过程中也发挥重要作用。许多研究显示,在AS斑块周围存在大量炎症细胞浸润,如巨噬细胞和T淋巴细胞,同时多种细胞因子表达增加,故有人将AS看成一种慢性炎症过程。而MMPs在ACS中可能发挥2种作用:(1)促进动脉粥样硬化斑块的发展和破裂;(2)梗死后心肌重构,导致心衰。

多数关于MMP-9与冠心病(CHD)关系的研究表明,MMP-9在ACS中升高,SCHD和正常对照组则不升高。一项基于63例ACS和20例正常对照组的研究[15]显示,AMI组、UAP组尿酸、MMP-9、hsCRP、IL-6的浓度均显著高于正常对照组(P<0.01),AMI组MMP-9、hs-CRP、IL-6的浓度显著高于UAP组(P<0.01),AMI组与UAP组尿的浓度在单支病变组、双支病变组及三支病变组逐级增高,差别有统计学意义(P<0.01),尿酸水平在双支病变组与单支病变组无统计学差异(P>0.05);ACS组尿酸、MMP-9、hs-CRP、IL-6之间皆具明显相关性(P<0.01)。该研究提示:(1)急性冠脉综合征患者血清尿酸、MMP-9、hsCRP、IL-6水平明显升高,四指标之间均具呈正相关,其升高有助于临床对急性冠脉综合征的检测和诊断,尤其是MMP-9、hs-CRP、IL-6水平。(2)MMP-9、hs-CRP、IL-6水平与多支病变有关,可用于预测冠状动脉粥样硬化病变的严重程度,尿酸只在病变程度严重时有意义。此外,尚有研究显示ACS患者血清s CD40L和MMP-9水平升高明显,可作为预测粥样斑块稳定性的参考指标[16];血清CRP及MMP-1、MMP-3、MMP-9水平变化与心肌梗死病变程度和预后显著相关[17]。部分研究与上述结果并不完全一致,如研究发现MMP-1在ACS患者中升高,但其与IL-6单支、双支、三支病变之间差异并无统计学意义(P>0.05),因此认为MMP-1只能反映冠脉病变的不稳定性,并不反映冠脉病变的程度[18]。

然而临床研究中亦有不同的研究结果。一项关于稳定性冠心病(SCHD)患者的冠脉造影研究[19]发现,相比于对照人群,冠心病患者血浆MMP-9(P=0.0099)、TIMP-2(P=0.0019)和s CD40L(P<0.001)升高,TIMP-1(P=0.463)无明显升高。其中MMP-9和hs CRP女性升高程度显著高于男性。只有MMP-9与白细胞总数相关(r=0.274,P=0.002)。Logistic回归也显示,心血管危险因素中只有白细胞总数与MMP-9相关(P=0.02)。所以,稳定性冠心病具有异常的MMP-9,TIMP-2,和s CD40L,不与冠脉或者侧枝病变的严重程度有关,性别差异可能提供冠脉病变病理方面的差异,并且将来深入研究可能探索其中潜在联系。

有研究[20]探索MMP-9/TIMP-1的比值与冠心病进程的联系。研究者选取18例稳定性心绞痛(SAP)、14例不稳定心绞痛或NSTE-MI、14例STEMI患者以及16例正常对照者。采用实时PCR和酶联免疫法检测CD14+细胞中MMP-9和TIMP,酶谱法检测MMP-9的活性。结果发现UAP/NSTEMI与STEMI组患者MMP-9的m RNA表达较对照组和SAP组患者明显升高。相比之下,TIMP-1在STEMI组明显低于其他3组。表达程度的变化与血浆中MMP-9、TIMP-1活性相关。MMP-9活性与单核细胞中MMP-9/TIMP-1比值相关(r=0.82,P<0.02)。因此,MMP-9/TIMP-1比值的升高可以促进冠心病的发展。另一个通过冠状动脉造影对于斑块的形态学研究[21]发现,ACS组MMP-9/TIMP-1比例明显高于对照组(0.22+/-0.10 vs 0.11+/-0.03;P<0.001),多因素Logistic回归分析显示MMP-9/TIMP-1(P=0.044)是ACS独立的预测因子,并且MMP-9/TIMP-1(P=0.013)对于复杂斑块形态具有更高的预测价值。因此,MMP-9/TIMP-1是冠状动脉动脉硬化斑块稳定程度和严重程度的独立预测因子。

局部血液和组织中MMP-9的升高可能更加明确地说明其与ACS之间的关系。在一项基于20例PCI操作后ACS患者的研究[22]中,从主动脉根部、罪犯血管和外周静脉,分别在术前、术中、术后采取标本,发现术中罪犯血管部位MMP-9与IL-6、ox-LDL同样升高(P分别<0.001、0.01和=0.01)。因此研究者认为这个研究提示从局部血液标本可能作为分析冠状动脉斑块及其不稳定性的生物学标记。MMP-9是一个可能的标记物,与IL-6、甚至ox-LDL一样都是从斑块中释放出来的。另一项研究[23]收集血管中斑块碎片进行PCR(稳定性心绞痛,SA,16;经PCI的ACS,16),同时评价血浆中MMP-2、9活性,并与健康人对照。结果发现MMP-2在ACS和SA中表达相仿,MMP-9在ACS组较SA组中表达高(P=0.011),TIMP没有类似表现。2组中MMP-2与9呈现负相关(r=0.07,P<0.004)。酶谱法分析亦有差异。因此,研究者认为是MMP-9而不是MMP-2或者TIMP在斑块中的过度表达导致急性冠脉综合症。

在一项评估血浆MMP-9及TIMP是否可以预警支架内再狭窄(in-stent restenosis,ISR)的研究[24]中,纳入了158例发生过ISR的患者和128例无症状患者。收集患者的血浆标本、详细危险因素历史,检测MMP-9、TIMP-1以及冠脉病变程度,发现冠脉病变指数、数量、直径、支架总长度、血浆高密度脂蛋白胆固醇与ISR的发生有关,血浆活化MMP-9(OR=1.96,95%CI:1.43-2.69)成为ISR独立危险因素,多部位ISR患者MMP-9水平明显高于单部位ISR或没有发生ISR的患者。因此,MMP-9可以作为裸金属支架再狭窄的独立预测因子。

文献综述[25]认为MMP-9促进板块不稳定和破裂,并且MMP-9可能作为ACS的诊断标记物以及ACS和慢性冠心病的鉴别标记物。MMP-9可以通过治疗而下降,并作为治疗效果判断的替代标记物。然而,仍然需要大型的以终点事件为研究目标的临床研究来确认MMP-9的下降与改善结果之间的独立于传统危险因素(如低密度脂蛋白胆固醇)之间的关系。抑制MMP-9可能提高斑块的稳定性从而降低心血管事件的发生。当然,MMPs抑制剂的安全性和有效性应当在临床前进行动物模型的研究。

金属基质蛋白酶9 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料

本文将选取我院自2012年1月1日至2012年12月31日前来就诊的60例子宫内膜异位症患者进行临床分析, 所有患者均确诊为子宫内膜异位症疾病, 并进行妇产科手术治疗。按照患者病变类型分为异位内膜组与在位内膜组, 每组患者30例。异位内膜组30例子宫内膜异位症患者中所有患者均为女性, 年龄在26~53岁, 平均年龄为 (37.34±1.33) 岁;在位内膜组30例子宫内膜异位症患者中所有患者均为女性, 年龄在26~52岁, 平均年龄为 (37.02±1.38) 岁。另选取30例同期由于患有单纯肌壁间子宫肌瘤疾病进行手术治疗患者作为对照组, 所有患者均为女性, 年龄在25~51岁, 平均年龄为 (36.98±1.41) 岁。在位内膜组、异位内膜组、对照组患者在性别、年龄、例数、教育背景以及社会经历等方面无显著性差异, 且P>0.05, 三组患者一般资料具有临床可比性。

1.2 方法

三组患者均实施手术治疗, 之后将其术中脱落子宫内膜组织应用浓度为10%甲醛溶液进行固定, 将固定完成的子宫内膜组织进行石蜡包埋, 4μm连续切片, 应用HE染色法对其进行染色后在显微镜下进行观察, 若能够观察到明显子宫内膜组织, 则进行下一步研究, 反之应重新选取。①骨桥蛋白测定方法:将上述子宫内膜组织蜡块进行连续切片、脱蜡处理, 之后使用浓度为3%过氧化氢溶液对其进行内源性酶灭活处理, 持续灭活15min, 灭活完成后将其放入微波炉中加热15min, 此举目的在于将子宫内膜组织中的抗原进行修复, 待其自然冷却后, 将非免疫性羊血清滴入子宫内膜组织, 从而达到阻断子宫内膜组织中非特异性结合的效果。依次将一抗 (骨桥蛋白鼠抗人单抗, 美国COMICON公司生产) , 二抗 (羊抗鼠Ig G) 、SP液 (中国福建迈新生物技术有限公司生产) 、DAB (二氨基联苯胺) 加入其中, 进行3~5min显色, 之后使用苏木素对其进行复染、脱水以及透明处理。使用中性树胶对标本进行封片, 放入显微镜下观察。②基质金属蛋白酶9测定方法:采用免疫组化法SP对子宫内膜中基质金属蛋白酶9进行检测, 一抗为即用型鼠抗 (MMP-9) 或单克隆抗体, 试剂为美国Maxin Bioteeh公司生产, SP试剂盒为中国福建迈新生物技术有限公司生产。

1.3 结果判定

使用病理图文分析系统对子宫内膜中的骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9进行图像分析处理。处理时所使用的仪器为澳大利亚Wei Niyand公司生产的彩色图像分析仪。子宫内膜中的细胞质内出现黄色颗粒即为阳性细胞, 并对显示为阳性细胞的面积、灰度等方面进行扫描, 其中平均灰度=总灰度/扫描所知黄色区域面积, 即骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9的表达强度。每一切片均选择四个不同视野完成扫描, 并且对每个视野测定三次后取平均值作为最终结果。三组子宫内膜患者进行扫描时均为同一位具有丰富经验的临床检验医师使用同一台设备检测定完成。对三组患者检测结果进行统计学分析, 得出结论。

1.4 统计学方法

所有数据均使用SPSS13.0软件包进行统计学分析, 对于计量资料用±s表示, 采用t检验, 计数资料采用χ2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

异位内膜组、在位内膜组以及对照组患者子宫内膜组织中骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9表达情况对比分析, 具体结果见表1。

由表1可知, 异位内膜组子宫内膜异位症患者体内子宫内膜组织中骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9表达强度均高于在位内膜组子宫内膜异位症患者以及对照组患者, 在位内膜组子宫内膜异位症患者体内子宫内膜组织中骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9表达强度均高于对照组患者, 且P<0.05, 三组患者对比结果具有统计学意义。

3 讨论

子宫内膜异位症, 即Endometriosis, 简称EM, 是临床常见的妇科疾病之一, 可导致患者盆腔疼痛, 甚至出现不孕, 对患者身心均造成严重影响, 降低患者生活质量[1]。随着近年来人们生活习惯的改变, 子宫内膜异位症临床发病率呈现出显著上升趋势, 已引起广大医务工作者高度重视。

骨桥蛋白, 即Osteopontin, 简称OPN, 是一种分泌型磷酸化糖蛋白, 其中富含唾液酸, 在人体中发生的细胞粘附、迁移、炎症反应、组织修复、信号转导以及细胞凋亡中起到至关重要的作用[2]。临床研究表明, 人体生理组织中若发生相关病变, 如炎症, 则生理组织中将发生不同程度的骨桥蛋白表达[3]。本文研究可知, 发生子宫内膜病变患者体内子宫内膜组织中骨桥蛋白表达强度明显增加, 且异位内膜患者表达强度高于在位内膜患者, 因此可知骨桥蛋白可能在患者出现异位子宫内膜粘附、种植等过程中发挥重要作用。

基质金属蛋白酶9, 即Matrix metall-oprteinases 9, 简称MMP-9, 是广泛分布在人体各种组织器官中的蛋白水解酶, 能够对细胞外基质进行降解, 对人体中正常月经周期子宫内膜细胞的生长、分化以及月经来潮的发生情况均能够起到重要的调节作用[4]。基质金属蛋白酶9能够对人体内血管内皮细胞生长起到有效的促进作用, 形成新生血管, 同时能够与整合素进行相互活化, 从而达到加强细胞与细胞之间黏附作用的目的[5]。本文研究可知, 子宫内膜异位症患者中异位内膜组基质金属蛋白酶9的表达强度明显高于在位内膜组以及对照组, 因此, 基质金属蛋白酶9在人体发生子宫内膜细胞种植、异位黏附、生长过程中起到重要作用。

综上所述, 骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9在子宫内膜病变中表达强度均升高, 因此, 患者发生子宫内膜病变与骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9表达变化密不可分, 临床应根据这一特点对子宫内膜病变进行深入研究, 从而探讨更为有效的治疗疾病方法, 提高患者生活质量。

摘要：目的 本文将选取子宫内膜异位症患者进行临床分析, 从而探讨骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9在子宫内膜病变中的表达特点, 为提高子宫内膜病变患者的治疗效果与生活质量提供可靠依据。方法 对在位内膜组、异位内膜组以及对照组患者手术完成后由其体内剥离的子宫内膜进行骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9检测, 并对检测结果进行统计学分析, 得出结论。结果 异位内膜组子宫内膜异位症患者体内子宫内膜组织中骨桥蛋白与基质金属蛋白酶表达强度均高于在位内膜组子宫内膜异位症患者以及对照组患者, 在位内膜组子宫内膜异位症患者体内子宫内膜组织中骨桥蛋白与基质金属蛋白酶表达强度均高于对照组患者, 且P<0.05, 三组患者对比结果 具有统计学意义。结论 骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9在子宫内膜病变中表达强度均升高, 因此, 患者发生子宫内膜病变与骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9表达变化密不可分, 临床应根据这一特点对子宫内膜病变进行深入研究, 从而探讨更为有效的治疗疾病方法, 提高患者生活质量。

关键词：骨桥蛋白,基质金属蛋白酶9,子宫内膜病变,临床表达研究

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金属基质蛋白酶9 篇6

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)是基底膜及细胞外间质的蛋白水解酶,能促进恶性肿瘤浸润和转移[2]。其中,MMP家族成员中的MMP9主要降解Ⅳ型胶原,使基底膜破坏,启动肿瘤细胞侵袭的起始阶段[3]。虽然有研究发现,人鼻咽癌组织中MMP9高表达可能与鼻咽癌侵袭和转移相关[4,5,6],但具体机制尚不清楚。为进一步明确鼻咽癌细胞中MMP9基因在体内和体外表达有无差别,以及这种差别与鼻咽癌的侵袭有何关系,本文采用RT-PCR、Western blot和免疫组织化学技术对鼻咽癌细胞株CNE1、CNE2、HNE1、HNE2和SUNE1及CNE2、HNE1裸鼠成瘤瘤块中MMP9基因的表达进行了检测,结果报道如下:

1 材料与方法

1.1 材料

鼻咽癌细胞株:CNE1、CNE2、HNE2均购自中山大学北校区实验动物中心细胞库,HNE1购自中南大学湘雅医学院细胞库,SUNE1购自南方医科大学肿瘤研究所。

Trizol购自Invitrogen公司,Taq酶及逆转录试剂盒(K1621)购自Fermentas公司。浓缩型MMP9鼠抗人单克隆抗体购自Abcam公司。SABC试剂盒、羊抗鼠IgG及DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。HRP标记羊抗鼠IgG购自KPL公司。蛋白裂解液购自PIERCE公司。免疫印迹(Western Blot)试剂盒ECL购自Amersham公司。硝酸纤维素膜及低分子量蛋白质标志物购自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人鼻咽癌细胞培养于10%新生牛血清的RPMI1640培养液中,37℃、5%二氧化碳培养至细胞长满培养瓶底部70%～80%时,用含0.02%EDTA的胰蛋白酶消化传代,取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 鼻咽癌细胞株中的MMP9蛋白表达的检测

培养瓶内放入盖玻片,待细胞爬片融合到95%～100%时,以4%多聚甲醛固定20～30 min,采用SABC法进行细胞免疫组织化学染色,一抗为浓缩型MMP9鼠抗人单克隆抗体,1∶100稀释,具体染色步骤参照说明书进行。用PBS代替一抗作阴性对照。细胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色。

取对数生长期CNE1、CNE2、HNE1、HNE2、SUNE1细胞,1×107个/m L(约50 m L培养瓶),蛋白提取:用预冷的PBS洗细胞3次,加入细胞裂解液400μL裂解细胞,冰盒上刮下细胞,4℃、10 000r/min离心10 min,收集上清,-20℃保存。Bradford比色法测定蛋白浓度定量,调节蛋白浓度一致后,行SDS-PAGE电泳。转移至硝酸纤维素膜上,用5%脱脂奶粉37℃封闭1h,与鼠抗人MMP9一抗(1∶500稀释)4℃孵育过夜,用TBST洗涤3次,每次15min,然后加入HRP标记羊抗鼠IgG(1∶5 000稀释),37℃孵育1 h后,用增强型化学发光法检测蛋白质表达,胶片扫描保存。

1.2.3 鼻咽癌细胞株中的MMP9 mR NA表达的检测

收获对数生长期的鼻咽癌细胞,用Trizol试剂从细胞中提取总RNA,逆转录成c DNA。全部引物采用Primer3软件设计,由上海生工生物工程公司合成。引物序列和产物大小见表1。基因扩增反应体系为:2.5μL的10×PCR缓冲液,2μL c DNA,1μL dNTPs(2.5 mmol/L),上下游引物各0.5μL(10pmol/L),Taq聚合酶0.25μL(5U/μL),用RNase Free dH2O加至25μL。PCR循环参数为:94℃预变性4 min;然后94℃变性30 s,61℃(MMP9)/55℃(β-actin)复性30 s,72℃延伸30 s,30个循环;最后72℃延伸5 min终止反应。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,EB染色,紫外灯观察并照相。

1.2.4 HNE1和CNE2细胞裸鼠成瘤瘤块组织中MMP9的表达

5～7周龄BALB/c nu裸小鼠10只,在SPF环境(中山大学实验动物中心动物实验部)中饲养,将对数生长期的人鼻咽癌HNE1和CNE2细胞分别以10×107个/m L及5×107个/m L的密度接种于裸鼠腋后背部皮下,每组5只,每只接种剂量0.2 m L。待瘤块长至直径10 mm左右后处死裸鼠,迅速解剖剥离肿瘤,以4%多聚甲醛液固定24h,梯度酒精脱水、透明,石蜡包埋连续切片,SABC法检测组织中MMP9的表达。

2 结果

2.1 5株鼻咽癌细胞MMP9免疫组化检测结果

HNE1和SUNE1细胞中MMP9蛋白呈阳性表达,CNE1、CNE2及HNE2中未见到细胞MMP9蛋白的表达。结果见图1。

2.2 鼻咽癌细胞系中MMP9 mRNA的表达

以β-actin为内对照,应用RT-PCR方法检测了鼻咽癌细胞系CNE1、CNE2、HNE1、HNE2及SUNE1中MMP9 m RNA的表达。结果如图2所示,5株鼻咽癌细胞均有MMP9 m RNA表达,以HNE1和SUNE1表达较强,后者与免疫组织化学检测结果一致。

2.3 鼻咽癌细胞系中MMP9蛋白的表达

Western Blot检测结果如图3所示。HNE1和SUNE1细胞中MMP9蛋白高表达,分别在92KD和83KD处检测到酶原及酶的条带。CNE1、CNE2及HNE2细胞中无明显MMP9蛋白表达。

2.4 鼻咽癌细胞株裸鼠成瘤瘤块MMP9的免疫组化结果

HNE1及CNE2细胞各5只裸鼠种瘤均成功,瘤块组织中MMP9均呈强阳性表达。结果见图4。

3 讨论

鼻咽癌是我国常见的一种恶性肿瘤,临床上易早期发生组织侵袭和淋巴结转移,探讨鼻咽癌浸润和转移机制具有非常重要的临床和理论意义。

肿瘤细胞降解基底膜和侵入下层的结缔组织是上皮性恶性肿瘤局部浸润和远处转移的关键步骤,而MMP在此过程中起重要作用。MMP是一组具有许多共同生化性质的可降解细胞外基质的酶类,其活性异常与肿瘤侵袭能力和转移发生密切相关,恶性肿瘤细胞阳性表达者其侵袭周围组织能力明显增强,且更易发生淋巴结和血道转移,预后明显较差。在MMP家族成员中,MMP9主要降解Ⅳ型胶原。其中,Ⅳ型胶原是构成BM的主要支架和成分,肿瘤细胞的浸润和转移首先须发生BM的降解,即Ⅳ型胶原破坏就意味着肿瘤细胞的浸润或即将发生浸润。已有研究发现,MMP9在多种恶性肿瘤中具有高表达,与肿瘤侵袭转移密切相关[7,8]。

国内外学者研究认为,MMP9有促进鼻咽癌细胞侵袭转移的能力,可引起颈部淋巴结转移[3,4,5,6]。近来已有学者发现,MMP9与鼻咽癌颅内侵犯密切相关[9]。

然而,MMP9在鼻咽癌细胞系中表达尚无文献报道。本文采用细胞免疫组化、Western Blot和RT-PCR方法,检测了MMP9在鼻咽癌细胞系中MMP9的表达。结果显示,在鼻咽癌细胞系中,有HNE1及SUNE1多株细胞MMP9较强表达。

通过不同的鼻咽癌细胞HNE1和CNE2裸鼠成瘤研究我们还发现,HNE1细胞在体内外MMP9蛋白表达均较强。CNE2细胞MMP9蛋白表达阴性,而该细胞裸鼠成瘤后表达强阳性,推测与体内外环境改变有关。通常在科研工作中,选择各种细胞进行蛋白质水平的实验是很常见的工作。但研究发现,细胞表型受到周围微环境,特别是周围细胞的细胞相互作用的影响,培养细胞可能因微环境改变或失去周围细胞的相互作用而使基因表型发生改变。在细胞水平获得的结果并不能完全代表体内的情况,所以在细胞水平取得的结果,如果能在组织中获得进一步的验证,其结果将更为可靠。本文通过MMP9蛋白表达较强的HNE1细胞和MMP9蛋白表达阴性的CNE2细胞裸鼠体内成瘤瘤块免疫组化方法发现,两者均有MMP9的强表达,进一步说明MMP9在鼻咽癌细胞系中的表达,可能在鼻咽癌浸润转移中起着重要的作用。

综上,本文初步研究得出MMP9在鼻咽癌细胞系中具有高表达,其可能参与鼻咽癌的侵袭转移等恶性生物学行为。通过探讨鼻咽癌细胞系MMP9的表达及其改变与鼻咽癌成瘤性侵袭转移等生物学行为的关系研究,为今后研究鼻咽癌的发生及侵袭转移等机制并进行干预打下基础。

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金属基质蛋白酶9 篇7

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013 年12 月-2014 年12 月在本院特诊呼吸科住院的COPD患者80 例, 所有入选对象均按照《慢性阻塞性肺疾病指南》标准[2], 入组前均签署知情同意书。按患者入院时病情轻重分为急性发作期 (AECOPD) 、临床缓解期, 其中急性加重期40 例, 临床缓解期40 例;男46 例, 女34 例, 平均年龄 (72.00±11.00) 岁。同时选取同期健康体检对象45 例作为健康对照组。详细采集所有入选对象的一般资料及既往病史 (性别、年龄、吸烟史、家族史) , 行心电图、肺CT、肺功能、肝功、肾功能、心彩等检查。排除标准:急性心、脑血管疾病、急性肺栓塞、风湿结缔组织疾病、严重肝肾功能不全以及其他呼吸系统疾病以及恶性肿瘤等疾病患者。根据肺功能检查结果, FEV1占预计值的百分比将临床缓解期40 例患者分为4 组。轻度组, FEV1% pred ≥ 80%, 共5 例, 平均年龄 (65.56±8.23) 岁; 中度组, 50% ≤ FEV1%pred<80%, 共18 例, 平均年龄 (68.30±9.18) 岁;重度组, 30% ≤ FEV1% pred<50%, 共11 例, 平均年龄 (72.66±9.34) 岁。 极重度组, FEV1%pred<30%, 共6 例, 平均年龄 (75.12±8.54) 岁。健康对照组45 例, 平均年龄 (61.24±9.54) 岁。COPD组与对照组的年龄、性别、高血压、吸烟、体重等基线资料比较差异均无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 方法 所有研究对象于入院24 h内抽取静脉血3 mL, 2000 r/min离心20 min收集上层血清, 采用双抗体夹心ELISA法测定血清MMP-2、MMP-9、MMP-12 含量。检测试剂盒由上海酶联生物技术有限公司提供, 严格按照试剂盒操作进行。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0 软件对所得数据进行统计分析, 计量资料用 (±s) 表示, 比较采用t检验, 两因素之间相关性分析采用Pearson直线相关性分析, 以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 COPD组与对照组血清MMP-2、MMP-9、MMP-12 水平比较 COPD组患者血清MMP-2、MMP-9、MMP-12 水平均明显高于对照组, 差异均有统计学意义 (P<0.05 或P<0.01) , AECOPD组患者血清MMP-2、MMP-9、MMP-12 水平均显著高于临床缓解期组, 差异均有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。

2.2 血清MMP-2、MMP-9、MMP-12 水平与FEV1相关性分析 稳定期COPD患者血清MMP-2、MMP-9、MMP-12 水平与FEV1成负相关 (r=-0.529, P<0.01;r=-0.385, P<0.05;r=-0.627, P<0.01) , 见表2。

3 讨论

COPD是以ECM破坏、组织纤维化为特点的慢性炎症性疾病, 其发病率及致残率高, 严重影响患者生活质量, 全球死因居于第四位。1992 年在我国北部和中部地区对102 230 名农村成年人进行调查, COPD患病率为3%;近年来对我国地区20 245 名成年人进行调查, COPD的患病率占40 岁以上人群的8.2%, 预计到2020 年时COPD将占世界疾病经济负担的第五位[3]。目前COPD发病机制主要为炎症反应、氧化应激、自主神经功能失调、蛋白酶—抗蛋白酶失衡。Montagnana等[4]认为肺泡壁基底膜断裂, 而分泌细胞通过断裂的基底膜侵入肺泡, 导致肺泡细支气管化, 促进肺气肿形成。现已证明, 破坏肺泡壁基底膜的蛋白酶有中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶、MMPs、基质金属蛋白酶组织抑制剂 (TIMPs) 等。MMPs是一个大家族, 因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名。MMPs有26 个成员, 编号分别为MMP1~26。根据作用底物以及片断同源性, 将MMPs分为6 类, 分别为胶原酶、明胶酶、弹性蛋白酶类、间质溶解素、模型蛋白酶类和其他型。它们主要由中性粒细胞 (PMN) 、肺泡巨噬细胞 (AM) 和呼吸道上皮细胞产生, 能够降解肺实质ECM的所有成分, 包括弹性蛋白、胶原蛋白、蛋白多糖、层粘连蛋白和纤维连接蛋白等[5]。胶原酶包括MMP-2、MMP-9, 作用底物为基底膜Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ胶原酶, 纤维粘连蛋白、明胶等。MMP-12 属于弹性蛋白酶类, 作用底物为弹性纤维、纤维粘连蛋白等。MMP-2、MMP-9 及MMP-12在降解ECM占主要地位[6]。

MMP-9 在正常肺组织中并不产生, 当受到各种因素刺激时, 支气管上皮细胞、肺泡Ⅱ型细胞、成纤维细胞及内皮细胞等均可产生。MMP-9 加速呼吸道壁ECM和基底膜崩解, 使气道壁失去正常结构, 还能促进炎症细胞积聚于气道壁, 并释放炎症因子, 加重呼吸道的炎性反应[7]。它还能刺激并激活生长因子, 促进血管生成、成纤维细胞增生, 引起气道重塑, 导致肺组织的破坏。Calikoglu等[8]研究发现稳定期COPD患者血清MMP-9 水平高于正常对照组, 发现大部分COPD患者的血液、痰液以及肺组织活检中MMP-9 的水平与活性均较高。Papakonstantinou等[9]纳入97 例COPD患者进行试验, 其中44 例为AECOPD, 测定COPD患者MMP9、TIMP-1、TIMP-2 含量、 结构, AECOPD患者支气管肺泡灌洗液中上述指标均显著升高, 且与肺功能呈负相关。Linder等[10]入选594 例COPD患者进行研究, 对照组为948 例健康者, 结果COPD组MMP-9 中位数535 ng/m L, 对照组为505 ng/m L (P=0.017) 。校正年龄、性别、吸烟量等后, 发现MMP-9 水平与FEV1% 显著相关 (P=0.033) 。 吸烟是COPD发病中最主要的危险因素, 研究表明80%~90% 的COPD患者有吸烟史, 而MMP-9 与吸烟的相关性也得到证实:吸烟在COPD的发病机制中作为直接刺激因素, 有可能导致蛋白酶增多及活性增强。Aviles等[11]报道, COPD患者痰液中MMP-9 的浓度显著高于健康吸烟者, 健康吸烟者痰液中MMP-9 浓度高于健康非吸烟者, 且该浓度与他们吸烟量有一定相关性。MMP-2 在正常肺组织中表达极少, 主要来源于中性粒细胞、肿瘤细胞、单核细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞等[12], 其在降解细胞间基质成分及基底膜的Ⅳ型胶原中有“钻头”的作用。MMP-2 在所有MMPs中分布最广泛, 当组织受损或细胞恶变时MMP-2 表达增加, 其表达增加同时伴有蛋白水解酶活性增强, 而后者加速了肺泡壁的破坏。Chen等[13]报道健康人与COPD0、Ⅰ、ⅡA、ⅡB及Ⅲ级五组MMP-2 水平分别为 (0.7±0.4) 、 (4.0±0.9) 、 (4.5±1.5) 、 (7.7±3.1) 、 (11.9±3.5) 、 (18.5±5.0) microg/L (P<0.01) 。王小莉等[14]研究表明, 被动吸烟大鼠支气管肺泡灌洗液MMP-2 的活性和表达明显增加 (P<0.01) 。孔英君等[15]研究MMP-2、MMP-9 与COPD气流阻塞的关系, 结果COPD组MMP-2、MMP-9 m RNA均显著高于对照组 (P<0.01) 。MMP-2、MMP-9 蛋白广泛表达在支气管肺泡组织, 而对照组表达非常弱;肺组织MMP-2mRNA及蛋白表达与FEV1占预计值%、FEV1/FVC均呈负相关。

MMP-12 又被称为人巨噬细胞弹性蛋白酶, 体内许多细胞因子 (如白介素-4、粒细胞集落刺激因子、低密度脂蛋白) 均能诱导或刺激MMP-12 在转录水平的表达, 其具体激活机制目前还不清楚。1993 年Shapiro等[16]成功在吸烟者的肺泡巨噬细胞中克隆出MMP-12 的cDNA序列。MMP-12 不仅能够降解富含于肺及动脉壁的细胞外基质的大多数成分, 还能激活其他MMPs, 使蛋白水解的作用放大[17]。1975 年Werb等[18]首次在小鼠腹膜巨噬细胞中发现MMP-12 基因;敲掉该小鼠的MMP12 基因则能够阻止吸烟小鼠的肺气肿模型形成, 认为MMP-12 在动物COPD发生发展过程中起重要作用。Hunninghake等[19]报道MMP-12 与吸烟者的COPD发病有关, 且与COPD患者FEV1下降存在一定关系。Demedts等[20]发现肺功能轻到中度的COPD患者痰液中MMP-12 浓度及活性明显高于对照组 (包括吸烟者、不吸烟者以及既往吸烟者) 。Yu等[21]的试验通过对1751 例COPD患者及2472 例健康者研究发现, MMP12 rs652438 基因为COPD发生的危险因素, MMP12 基因多态性与COPD发生密切相关。

综上所述, MMPs作为细胞外弹性蛋白和胶原蛋白的内切酶, 与COPD的发生有密切关系。通过本试验验证了MMP-2、MMP-9、MMP-12 在COPD患者中显著升高, 其升高水平与肺功能严重程度成正相关。TIMPs与MMPs基因多态性在COPD发生发展过程中又起到怎样的作用, 尚需要大量的临床研究来证实, 从而为COPD的防治提供理论基础及临床依据。而TIMPs有望成为延缓COPD进展的有效手段之一[6]。

摘要：目的:探讨慢性阻塞性肺疾病 (COPD) 与血清基质金属蛋白酶2 (MMP-2) 、基质金属蛋白酶9 (MMP-9) 、基质金属蛋白酶12 (MMP-12) 的相关性。方法:选取COPD患者80例, 其中急性加重期 (AECOPD) 40例, 临床缓解期40例, 健康对照者45例, 采用双抗夹心ELISA法测定所有研究对象的血清MMP-2、MMP-9、MMP-12含量, 并做统计学分析。结果:COPD患者血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平均明显高于健康对照者, 差异均有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) ;且AECOPD患者血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平显著高于临床缓解期患者 (P<0.01) 。稳定期COPD患者血清MMP-2、MMP-9、MMP-12水平与第1秒用力呼气容积 (FEV1) 成负相关 (r=-0.529, P<0.01;r=-0.385, P<0.05;r=-0.627, P<0.01) 。结论:COPD患者血清MMP-2、MMP9、MMP-12水平均明显升高, 且与疾病严重程度成正相关。