核基质蛋白（精选7篇）
核基质蛋白 篇1
1996年,A.Renz等[1]首先克隆了核基质结合因子SAFB(scaffold attachment factor B),这是因为SAFB能够结合到富含AG的核基质结合区域。1997年,S.Oesterreich等[2]克隆了HET,是因为HET能够结合到热休克蛋白27的启动子上。F.Weighardt等[3]于1999年发现了HAP,后期证明SAFB、HET和HAP是同一种物质。2003年,在Gen Bank中又发现了SAFB的同源物,因此定义最早发现的SAFB为SAFB1,后期发现的叫做SAFB2[4]。2007年,C.Chan等[5]又发现了本家族中的另一个成员SLTM[(scaffold attachment factor)-like transcription modulator)]。SAFB是一种核基质结合因子,定位于核基质中,属于一个核蛋白家族,在人类和小鼠组织中广泛表达。现已证实,SAFB参与了包括转录调节、RNA剪接、细胞增殖和凋亡、生长发育和繁殖等多种生物学进程[6]。本文主要对SAFB蛋白家族的结构和生物学功能进行论述,以期为SAFB蛋白在生物医学领域研究中提供新的方向和思路。
1 SAFB蛋白的结构
三种SAFB蛋白在结构上都有一些重要的功能域,包括N端DNA结合域(SAF-Box),中部含有RRM(RNA recognition motif),主要用于结合RNA或单链DNA;C端富含Glu/Arg-和Gly,经常卷入蛋白质和蛋白质之间的相互作用。SAFB1和SAFB2分别由两条独立的基因所编码,在人类的基因组上,这两条基因都位于19号染色体19p13.3,但编码的方向不同[7],在氨基酸和核酸水平,二者相似度分别达到74%和75%[8],在重要的功能域上SAF-Box和RRM相似度更高,为98%。相比于SAFB1和SAFB2超过70%的相似度,SLTM与SAFB1和SAFB2的相似度分别为34%和36%。但在两个重要的功能域———SAP和RRM上,SLTM与SAFB1的相似度分别可达60%和70%。
2 SAFB的生物学功能
SAFB包括一个N端的DNA结合域(SAP/SAF-Box),SAF-box在连接到富含AT碱基的S/MAR中起到重要作用,在蛋白质参与的多种细胞进程中都有发现,如RNA转录、DNA修复等[2];核定位信号区,中心RNA识别序列RRM,连接到RNA或者一个单链DNA,或者一个NLS;一个C端抑制区域[3],富含谷氨酸、精氨酸,甘氨酸的蛋白质相互作用区域,经常参与蛋白质的相互作用。此外,C端还包括一个强有力的可转移的转录抑制区域[5]。这些结构表明,SAFB参与了多种生物学进程。由于目前的研究主要集中于SAFB1,因此在接下来的介绍中以SAFB1为主。
2.1 SAFB在RNA剪接中的作用
SAFB1有一个RNA识别入口,存在于一些RNA加工蛋白质复合物中,有可能直接与目标RNA作用。SAFB1与RNA聚合酶Ⅱ的C端区域连接并抑制其活性,增加SRrp86(一种RNA剪切因子)效应,与组织特异性因子SLM-1相互作用[9,10]。通过酵母双杂交试验还证明SAFB1可以与很多RNA剪接调节子相互作用,如hnRNP A1、hnRNP D、YT521B等[3,11]。此外,SAFB1还能够和一些蛋白质激酶调节子相互作用,如SRPK1和CLK2[12]。SAFB1可以改变E1A微基因的拼接位点选择,并抑制由Tra2调节的外显子拼接[13,14]。SAFB2同样在RNA剪切中具有重要作用[15],同时也能调节丝氨酸/精氨酸蛋白激酶[16]。
2.2 SAFB在染色质组织中的作用
SAFB1通过连接到S/MARs区域和不成对碱基区域(BURs)对染色质组织作用,从而调节基因表达。SAFB1可以与染色质重塑蛋白质CHD1相互作用,CHD1蛋白质家族的共同特征是其染色质重塑需要ATP提供能量,而且它们还优先连接到富含AT碱基的DNA链[17]。CHD1也与NCoR相互作用,SAFB1可与二者形成复合物,因此CHD1-SAFB1-NCoR复合物可以对SAFB1目的基因进行调控[6]。
2.3 SAFB在细胞生长和凋亡中的作用
SAFB1过度表达造成生长停滞和细胞分裂障碍,表明其在细胞增殖和分裂中发挥作用。Debril等人研究早期脂肪细胞和成熟期肠上皮细胞时发现,SAFB1在细胞分化中起作用[18]。SAFB1的破坏导致TBX2上调、P19ARF诱导和细胞衰老的缺失、细胞无限增殖[19]。在乳腺癌患者染色体中,SAFB1被安置到一个杂合性丢失频率较高的位点上,并且在进行微切割后的乳腺肿瘤组织中发现了SAFB1,但是在周围正常组织中没有。研究表明,小鼠胚胎成纤维细胞SAFB1的基因缺失导致细胞自发的无限增殖,无限增殖中两种蛋白质表达异常,不再衰老,其中P19ARF表达水平降低,TBX2表达增强。SAFB1缺失只是抑制P19ARF表达,并不是完全使其表达消失,这种抑制作用并不是直接发生的,而是通过增加TBX2的表达间接作用。TBX2会抑制P19ARF启动子活性,并且TBX2的超表达会导致细胞无限增殖。SAFB1缺失还能造成细胞接触抑制作用消失,增加集落形成的概率,诱导肿瘤基因的锚定非依赖生长。这些研究表明,SAFB1在细胞无限增殖和转化中是一种重要的参与者[19]。
Y.B.Lee等[20]用十字孢碱(STA)诱导细胞凋亡,结果发现,未经STA处理时SAFB1只分布在除核仁以外的细胞核中,经过STA处理后SAFB1分布在核仁区和核仁周围的环状区域。出现在核仁周围的环状结构依赖于RNA的完整性,然而SAFB1在细胞核中的分布并不依赖于RRM或者SAF-box,而是C端蛋白质之间的相互作用区域。SAFB1不仅在细胞凋亡的初级阶段发挥作用,也在细胞凋亡的最后阶段起作用,可能与后期阶段的DNA切割有关,或者在转录的准备阶段即DNA解旋成单链的过程中[20]。STLM也可以诱发细胞凋亡,这与染色质凝聚和细胞色素c释放产生的变化有关[5]。然而,关于本家族中的另一位成员SAFB2对细胞凋亡的影响则未见报道,在今后的研究工作中可以尝试研究SAFB2在细胞凋亡中的作用。
2.4 SAFB在生长发育和繁殖方面的作用
2005年,M.Ivanova等[21]在小鼠胚胎干细胞中敲除了SAFB1基因,用于观察SAFB1在小鼠生长发育和繁殖中的功能,结果表明,SAFB1-/-的小鼠生长受到了严重抑制,比对照组个体短小得多,这可能与SAFB1基因敲除后导致血清中IGF1水平较低有关[21]。除生长受到抑制外,在生殖系统的发育和功能上同样产生了很大影响。雄性小鼠由于睾丸较小,生殖上皮细胞退化,睾酮分泌量低而不能生殖,造成生殖细胞凋亡,睾丸间质畸形生长;雌性小鼠生殖力降低甚至不育,部分原因是输卵管运输功能障碍,早期卵泡数量减少[21]。对生殖系统产生的重要影响可能与SAFB可以作为雌激素受体ERα的辅阻遏物有关,SAFB通过调节ERα对雌激素的反应,进而影响生殖系统的发育。在敲除SAFB1后,生殖系统发育受阻,这说明SAFB1的作用并不能通过SAFB2的作用所弥补,二者间还有不同分工。而缺失SAFB2是否会造成生殖系统发育不正常尚不清楚。
2.5 SAFB在转录抑制中的作用
SAFB1研究得最透彻的功能就是转录抑制,最开始是对ERα的抑制,与ERα相互作用而抑制其转录活性[22]。研究表明,SAFB1可以调节其他细胞核受体,还有可能调节其他非受体蛋白质。SAFB1和许多核受体相互作用,如法尼酯X受体α、过氧化物酶体增殖物激活受体、维生素D受体[18]。SAFB1还可以与几个核激素受体包括紧密连接蛋白ZO2、DNA连接蛋白CHD1相互作用。另外,SAFB1还可以抑制其他核受体的转录活性,如PPARa、PPARb、VDR、SF1、LRH-1等。这也表明,SAFB1影响多个靶点,其活性消失可能导致许多通路的信号异常。SAFB1包含一个固有的和可转移的C端抑制区域,使得转录抑制不依赖于与核受体的联系。此外,SAFB1与其他重要的转录抑制蛋白质如NCoR和HDAC3相互作用。最近又有研究表明,SAFB1调节转录活动并非依赖于与核受体的相互作用,SAFB1可以调节黄嘌呤氧化还原酶(XOR)和SREBP-1c的表达[23,24]。
3 展望
SAFB是一种具有多种功能的蛋白质,它不仅参与细胞增殖和分化、细胞凋亡等细胞进程,在分子角度,它还参与RNA剪接,作为特定受体的辅阻遏物影响转录活性,进而控制某些生物学进程和疾病的发生。但是,人类对SAFB的研究还停留在初级阶段,还有许多问题需要进一步研究。除了已知的SAFB1、SAFB2、SLTM外,SAFB家族是否还有其他成员尚不清楚,而且目前研究较多的为SAFB1,对SAFB2和SLTM的了解很少,三者具有相似的蛋白结构,但功能上有相近也有不同的地方,三者之间的关系也需要进一步阐明。目前开展的研究仅限于人类和小鼠,在其他生物中的功能怎样也尚需大量试验进行检验。近年来,随着新的研究思路及新的分子生物技术研究方法不断成熟,SAFB的其他功能也将逐渐被揭示,但仍有很多工作需要进一步开展。
核基质蛋白 篇2
1 DMP1的分子生物学特征
不同的物种中DMP1基因结构基本类似。牛DMP1基因包括[1]:5'端92bp的非编码区;1530bp构成的开放读框, 共编码510个氨基酸;3'端非编码区长1379bp, 包括一个多聚腺苷酸化信号和Poly (A+) 尾;等电点3.95;分子量56KD。1997年, MacDougall等成功克隆了人[2]和小鼠[3]DMP1基因。人DMP1基因包括:5'端99bp的非编码区;1539bp组成的开放读框编码513个氨基酸残基的强酸性蛋白, 主要为丝氨酸 (21.4%) 、谷氨酸 (15.6%) 和天门冬氨酸 (12.1%) ;3'端有1041 bp非编码区, 包括一个多聚腺苷酸化信号。小鼠DMP1长2820 bp, 其中1509 bp构成的开放读框编码503个氨基酸, 包括一个多聚腺苷酸化信号。小鼠和大鼠均有一15个氨基酸的插入片段, 经基因组DNA分析为DMP1的外显子, 是DMP1的替换剪切版本。人、牛、小鼠、大鼠DMP1基因具有高度同源性, 并有一些高度保守区, 如疏水的16氨基酸残基信号肽, 与细胞粘附有关的RGD序列, 数个可能是酪蛋白激酶Ⅰ、Ⅱ磷酸化位点的丝氨基酸残基。由于DMP1的谷氨酸含量很高, 与OPN和BSP相似, 故DMP1的生物学特性可能介于牙本质磷蛋白之间。
2 DMP1理化性质
DMP1蛋白是一种富含丝氨酸的亲水性蛋白。DMP1的氨基酸组成中, 有1/3为天门冬氨酸和谷氨酸。由于绝大多数丝氨酸以磷酸化的形式存在, 使得DMP1成为等电点3.68的强酸性蛋白。由此推测DMP1是牙本质矿化过程中的一种重要蛋白质。由大鼠DMP1 c DNA推测的分子量为53KD, 翻译后的磷酸化和糖基化可使其分子量增为60-66KD。George等[4]通过E.Coli表达出的大鼠重组DMP1分子量为90-95KD, 这种差异可能是蛋白质在表达过程中发生折叠造成的。DMP1还含有一个共有序列 (Asn-Thr-Ser) 作为N-糖基化位点, 数个Ser-Thr-Glu序列作为O-糖基化位点, 以及一个与细胞粘附功能有关的RGD (Arg-Gly-Asp) 序列。DMP1的氨基酸序列与骨酸性糖蛋白-75 (BAG-75) 高度同源, 与骨桥蛋白 (OPN) 部分同源。DMP1中的许多肽段含有4个以上连续的天门冬氨酸或谷氨酸残基, 这些残基中通常含有丝氨酸。这些区域与转录后的酪蛋白激酶磷酸化所需的序列一致。DMP1中, 总共有107个丝氨基酸残基, 55个位于与酪蛋白激酶Ⅰ、Ⅱ磷酸化有关的序列中。从组织中提取的DMP1为磷酸化蛋白。在生理过程中, 磷酸化的氨基酸末端可以与多价的阳离子如Ca2+结合, 调节硬组织的形成。Qin[5]等比较了四种从大鼠骨中和牙本质提取的富含涎酸的蛋白OPN、BSP、BAG-75、DMP1, 认为DMP1特性应介于OPN与BAG-75之间。对不同组织中提取的DMP1进行染色发现:牙本质提取物显色清晰, 骨组织则未显色, 表明牙本质DMP1的量明显高于骨组织, 这种量的区别可能与骨和牙本质的矿化程度不同有关。牙本质矿化程度较高, 在其矿化过程中需要大量强酸性蛋白, 促进矿物离子的沉积。由此推测DMP1与牙本质的矿化有关。
3 DMP1的分布
George等[2]用Northern印记法发现大鼠DMP1只在牙齿中表达, 而在皮肤、脑、肝脏、颅盖骨、胫骨中未见表达;原位杂交显示DMP1的m RNA仅在成熟分泌的成牙本质细胞中表达, 而在前成牙本质细胞和牙髓细胞中未见表达。D'Souza等[6]用RT-PCR研究发现DMPlmRNA出现在牙胚发育的蕾状后期, 在整个牙本质发生过程中均有表达, 在矿化期的早期牙本质细胞中也有表达, 但在矿化后的分泌性成牙本质细胞中表达量降低。原位杂交显示DMP1仅见于矿化前的年轻成牙本质细胞, 出现矿化后表达量显著降低。DMP1在成釉细胞分化成熟过程中也有表达。Hirst等[5]用Northern印记法发现牛DMP1在成牙本质细胞、脑和骨中均有表达, 而牙槽骨、肝脏、皮肤和成釉细胞中未见表达。MacDougall等[7]通过原位杂交发现DMP1在小鼠成牙本质细胞、成釉细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞中均有表达。Septier[7]等对体外培养的小鼠牙胚进行研究, 发现DMP1在成牙本质细胞和分泌性成釉细胞有表达, 在成牙本质细胞突、牙髓、前期牙本质、牙本质、前期和早期成釉细胞未见表达而培养基中加入6硫化肌醇 (一种酪蛋白激酶抑制剂) 的牙胚, 则仅在牙尖区成牙本质细胞有表达。
4 DMP1的功能
到目前为止, 尽管没有直接的实验证实DMP1的确切功能, 但基于其理化性质、生物合成等方面的特征, 推测DMP1可能参与牙本质矿化的启动和调节。同时, 也可能充当信号转导分子。
DMP1中有与细胞粘附有关的RGD序列。Kulkrni等[8]采用将RGD序列基因进行定点诱变, 使RGD序列 (Arg-Gly-Asp) 转变为RGE (Arg-Glu-Glu) 序列;将RGD序列从DMP1中删除这两种方法研究大鼠DMP1 RGD序列的功能, 发现含RGD序列的DMP1可以迅速与细胞小鼠胚胎颅骨细胞 (MC3T3-E1) 和牙髓细胞 (RPC-C2A) 结合, 并促进细胞之间的粘附, 而诱变后的两种新蛋白则与细胞结合速率较慢、促粘附功能较低。三种蛋白均与中国仓鼠卵细胞不结合。他们用含有RGD序列的肽段封闭细胞表面整合素受体后, 发现DMP1与细胞结合速率下降、细胞间粘附降低。由此提示DMP1可能介导细胞之间以及细胞与胞外非胶原性基质之间的细胞信号转导。
Narayanan[9]等通过建立对表达DMP1基因的稳定传染细胞系和腺病毒传染细胞系来研究DMP1的生物学功能。当C3H10T1/2、MC3T3-E1和RPC-C2A等具备多分化潜能、中胚层来源的细胞表达DMP1基因时, 均可向成牙本质样细胞分化, 并形成功能性成牙本质样细胞。在这些细胞分化过程中, 碱磷酸、骨桥素、骨钙素和骨粘结素等细胞外基质形成早期的标志物, 以及DMP2和DSP等成牙本质细胞分化末期的标志物均可被检测到。而且随着DMP1表达量的增加, DMP2和DSP的表达量也增加。而用酪蛋白激酶Ⅱ的抑制剂阻断DMP1的磷酸化, DMP2、DSP、OCN等的表达未见明显变化。体外过表达DMP1基因的细胞分化并形成功能性成牙本质样细胞后, 细胞体内可形成矿化结节并增大, 最终形成矿化基质。由此可推测, 体内DMP1在未分化间充质细胞向成牙本质细胞分化过程中起着非常重要的作用。
上述研究表面, 对于DMP1在牙齿或组织中的时空表达有相互矛盾之处, 它的确切功能仍不清楚。虽然DMP1基因能够促进未分化间充质细胞向成牙本质细胞样细胞分化, 并促成成牙本质样细胞内矿化结节的形成和增长, 但是DMP1如何调节成牙本质细胞的分化, 在此过程中有哪些转录因子发挥作用, 其信号途径是什么, 仍有待进一步研究。它是否利用RGD序列介导细胞信号转导;是否参与细胞移动、细胞与细胞外基质的粘附过程;是否能够干扰胚胎发育中器官特别是牙胚的发生;如何参与牙本质和骨的矿化过程等仍不清楚, 均有待我们进行更深入的研究。
参考文献
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核基质蛋白 篇3
1 材料和方法
1.1 主要试剂、仪器
EMPs 从猪的牙胚中提取[4],并制成冻干粉备用;DMEM细胞培养基(Gibco,美国),胎牛血清(Hyclone, 加拿大),MTT(Amersco, 美国), CO2培养箱(Thermo Life sciences, 美国),倒置相差显微镜(Leica,德国),DMSO(宜兴市达华化工有限公司,江苏),流式细胞仪(FACSalibur, Becton Dickinsan),碱性磷酸酶试剂盒(上海仁宝医用试剂研究有限公司)。
1.2 人BMSCs的培养
采用全骨髓法培养人BMSCs。无菌条件下,用肝素化骨髓穿刺针于健康成年志愿者髂后上棘抽取骨髓,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液(含10%胎牛血清, L-谷氨酰胺 0.3 g/L, 100 U /ml青霉素及100 U /ml 链霉素),接种于培养皿中培养。3 d后半量换液,1 周后全量换液,去除悬浮红细胞及未贴壁细胞。此后每周换液2 次,倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。至细胞达到80%～90%左右的汇合后,进行传代培养。取第3代细胞用于实验研究。
1.3 细胞周期分析
选择增殖实验[5]中的EMPs作用人骨髓基质细胞最佳浓度200 μg/ml进行分析,以不加EMPs为空白对照。用流式细胞仪检测EMPs 对人BMSCs细胞周期的影响。
1.4 碱性磷酸酶染色
以矿化诱导液培养细胞(DMEM培养液加地塞米松10-8 mol/L,维生素C 50 mg/L,β-甘油磷酸钠10 mmol/L)。以200 μg/ml EMPs作用于细胞为实验组,以不加EMPs为对照组。培养2、5 d后,取细胞爬片按照试剂盒说明进行碱性磷酸酶染色。用图像分析系统测量平均灰度值。
1.5 统计学分析
采用SAS6.12软件对所得数据行统计学分析,检验水准为α=0.05。
2 结 果
2.1 人骨髓基质细胞的体外培养
接种后最初3 d内,培养皿中含有大量造血干细胞及悬浮细胞(包括血细胞及未贴壁单核细胞),无法观察到细胞贴壁情况。7 d时全量换液后,造血细胞成分基本消失,可见贴壁细胞呈细胞集落,其形态、大小和密度各不相同,大部分细胞呈梭形或三角形,少数呈多角形,细胞体积较大,细胞核较大,呈扁圆形。随着不断培养、换液,集落中的细胞逐渐扩增,呈放射状,细胞呈片状汇合。12～14 d后,细胞基本汇合成单层,长满整个培养皿底可进行传代(图 1)。传代后的细胞生长明显加快,4～6 h大部分细胞贴壁,细胞逐渐伸展为梭形、三角形或多角形,表面颗粒少;48 h后,可见细胞开始分裂增殖、聚集。5～6 d后即可见细胞汇合,长满培养皿底。
2.2 细胞周期分析
流式细胞仪测得细胞周期的分布情况见图 2及表 1。细胞周期的分布情况表现为EMPs组S期细胞数目较多,为19.48%,而对照组S期细胞数目为9.89%;对照组G1期细胞数目比例为89.46%,高于EMPs组的77.59%;说明 EMPs作用下的骨髓基质细胞具有较强的增殖能力。
2.3 碱性磷酸酶(ALP)染色
矿化诱导液培养2 d时,对照组和实验组均有少量阳性细胞,无明显区别(图 3);培养5 d时,可见实验组阳性细胞数明显增多,呈条索状、片状,而对照组阳性细胞数较少,稀疏(图 4)。经图像分析系统测定平均灰度值,2 d时,实验组0.18±0.02与对照组0.16±0.01无显著性差异(P>0.05);5 d时,实验组0.25±0.02与对照组0.21±0.03有显著性差异(P<0.05)。
3 讨 论
随着组织工程技术的发展,牙周组织再生的理论不断丰富,利用组织工程技术重建牙周组织成为可能。骨髓基质细胞是牙周组织工程中极有潜力的种子细胞。EMPs可以促进牙周组织再生已得到证实,而关于釉基质蛋白对骨髓基质细胞生物学作用的国内外报道甚少,并多为鼠、兔、猪等动物细胞的研究,因此该组织工程技术距临床应用尚有很大距离。本研究观察釉基质蛋白对人BMSCs生物学特性的影响,试图进一步了解EMPs促进牙周组织再生的机制。
目前常用的骨髓基质细胞的分离培养方法有2 种[6]:全骨髓培养法和密度梯度离心法。全骨髓培养法是一种保留造血干细胞和其他各种细胞混合培养的方法,将骨髓稀释后反复抽吸制成单细胞基液,利用BMSCs贴壁生长的特性将其分离纯化,由于维持了BMSCs原始的生活环境,有利于BMSCs的分化。本实验选择无血液疾病的健康成年人,利用全骨髓培养法成功培养了人骨髓基质细胞,体外培养的成人BMSCs 适应能力较强,接种成活率高,增殖速度较快,这可能是保留的血细胞成分中含有部分生长因子或促进贴壁的物质有关,而且全骨髓培养法维持了BMSCs原始的生活环境,更接近将来体内移植研究的要求。因此,利用BMSCs进行骨组织工程学的研究具有良好的应用前景。
目前评估细胞生长和增殖状况的方法主要有3 种: 3H-TDR 掺入法、MTT 比色法和流式细胞仪细胞周期检测法[7]。MTT 法检测细胞增殖结果显示,EMPs作用于人BMSCs 3 d时,200 μg/ml EMPs组与对照组相比差异即有显著性,说明该浓度有促增殖作用[5]。这与EMPs对兔BMSCs和鼠BMSCs增殖的结果不尽相同,虽然EMPs均能促进鼠[8]、兔BMSCs的增殖,但作用的浓度不同。结果不同的原因可能是由于细胞培养过程中,不同种属细胞分裂增殖活动恢复的快慢不同;其次可能与提取获得的EMPs的纯度和效价不同有关,当然也可能与不同实验室所用培养液的成分不完全相同有关。我们在用MTT法检测细胞增殖的基础上,进一步采用流式细胞仪检测EMPs对人BMSCs细胞周期的影响。结果显示,加入EMPs培养5 d的人BMSCs,G1期DNA含量减少,而S期DNA含量增高,表明EMPs可以增加人骨髓基质细胞DNA含量,具有促进BMSCs早期DNA合成,使细胞从G0/G1期进入S期的作用,从而促进细胞增殖。
碱性磷酸酶(ALP)的表达是成骨细胞分化的主要特征之一。我们观察了EMPs对人BMSCs的ALP活性的影响,发现5 d时,在EMPs条件下,ALP阳性细胞数明显增多,呈条索状、片状。表明BMSCs可在矿化诱导液培养下,向成骨细胞方向分化,并可被EMPs所增强。诱导的细胞能够产生ALP, 也表明BMSCs具有矿化能力,已具备成骨细胞的生物学特性,而且应用矿化诱导液联合EMPs诱导5 d后即明显表达成骨细胞表型,说明联合应用矿化液和EMPs能在较短时间内有效诱导BMSCs分化为成骨细胞。
本实验以成人骨髓为培养材料建立的成人BMSCs的培养方法和成骨诱导途径,为该组织工程技术的临床应用打下了基础,但组织工程技术应用于牙周病学临床还需更多的深入研究。
摘要：目的:观察釉基质蛋白(enamelmatrix proteins,EMPs)对人骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)细胞周期和碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。方法:体外培养人骨髓基质细胞,以200μg/ml EMPs作用于细胞为实验组,以不加EMPs为对照组。流式细胞仪检测EMPs对BMSCs细胞周期的影响,碱性磷酸酶试剂盒检测ALP的活性。结果:体外培养的人BMSCs生长良好,200μg/ml浓度的EMPs能提高细胞的ALP活性;影响细胞周期变化,EMPs组S期细胞数目较多,为19.48%,而对照组S期细胞数目为9.89%。结论:釉基质蛋白可促进人骨髓基质细胞的分化,影响细胞周期变化。
关键词：釉基质蛋白,骨髓基质细胞,增殖,矿化,细胞周期
参考文献
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血清总蛋白测定的基质效应评价 篇4
1 资料与方法
1.1 仪器
OLYMPUS AU 5400 (日本),BECKMAN COUL-TER DU800紫外/可见光分光光度计(美国),Eppendorf Research单道可调量程移液器(德国)。
1.2 材料
选取20份新鲜混合人血清样品,各浓度分布均匀。经混匀、离心(3000 rpm,10 min)后分装,-20℃保存,1周内检测完毕。14份室间质评(EQA)材料(2009年度全国室间质量评价计划)批号分别为200911～200915、200921～200925、200931～200934。
质控血清(三个浓度水平)(Bio-Rad,美国,批号45581、45582、45583)。
1.3 方法
按照EP-14A[1]的要求,将17种制备物穿插在20份新鲜混合血清中,分别用比对方法(AACC推荐的参考方法[2])和待评方法(4种市售试剂盒)进行测定,重复3次,每次均需重新定标。
1.4 数据处理
1.4.1 作图
以待评方法测定值为Y轴,比对方法测定值为x轴,将20份新鲜血清样本的均值绘制成散点图。
1.4.2 线性回归分析
若待评方法和比对方法呈明显线性关系,回归直线周围各点的Y轴上的数值基本恒定,则按线性回归模型分析,以待评方法结果的均值为y值,比对方法结果的均值为x值。
1.4.3 多项式回归分析
多项式回归模型可以得到最小的预测区间,以及最佳的基质效应检测能力。若最适模型为一阶多项式y=a0+a1x+a2x2,其中y值为待评方法结果的均值,x为比对方法结果的均值。其偏回归系数a2经检验不为0(如t检验,P<0.05),则使用二阶多项式模型,反之则使用一阶多项式,即线性回归模型分析。
1.4.4 预测区间的计算
使用下列公式计算新鲜患者样本对于给定的x值,其y值均值的双侧95%预测区间:
其中代表xi在回归曲线上y的预测值。n为新鲜患者血清样本的例数,本研究中n=20。对于线性回归模型而言g=2;对于二阶多项式回归模型g=3。Sy·x表示回归模型的标准误,计算公式为。为第i个样本在x轴(比对方法)上对应的数值。为第i个样本在y轴(比对方法)上对应的数值。为比对方法所有数据的均值。
1.4.5 基质效应评价
以比对方法为X轴,待评方法为Y轴,将17种制备物的测定结果绘制成散点图。若对于给定的X值(比对方法测定结果),其Y值(待评方法测定结果)包含于95%预测区间内,则此制备物在该测定系统上无基质效应;若Y值超过预测区间的上限,则此制备物在该测定系统上显示正基质效应;若Y值小于预测区间的下限,则此制备物在该测定系统上显示负基质效应。
1.5 统计学处理
对计量资料进行正态性检验,数据处理依据CLIS EP-14A2文件,数据分析采用EXCEL 2003。
2 结果
以参考方法测定值为X轴,待评方法测定值为Y轴,分别绘制4种检测系统新鲜人血清和17种制备物的散点图,血清样本的回归曲线及其±95%预测区间,见图1。
注:◇新鲜人血清总蛋白测定值,+制备物总蛋白测定值,——为新鲜人血清样本测定的回归曲线,---为其±95%预测区间系统A-D分别代表:A:柏定生物工程股份有限公司,奥林巴斯AU5400B:上海科华生物工程股份有限公司,奥林巴斯AU5400C:利德曼生化股份有限公司,奥林巴斯AU5400D:奥林巴斯生命与材料科学欧洲股份有限公司,奥林巴斯AU5400
根据EP14-A2[1]对于基质效应的评价标准,17种制备物的基质效应评价结果见表1。结果显示,制备物A、B、E、F、G、I、J、L、P在各系统上均无基质效应,制备物C仅在B系统上存在正基质效应,制备物D在A、B、D三个系统上存在基质效应,制备物H在四个系统上都存在负基质效应,制备物K仅在A系统上存在负基质效应,制备物M仅在C系统上存在正基质效应,制备物N和Q在A、B系统上存在负基质效应,制备物O在A、B系统上存在负基质效应,在C、D系统上存在正基质效应。
注:“无”表示无基质效应,“正”表示正基质效应,“负”表示负基质效应系统A～D分别代表:A:柏定生物工程股份有限公司,奥林巴斯AU5400B:上海科华生物工程股份有限公司,奥林巴斯AU5400C:利德曼生化股份有限公司,奥林巴斯AU5400D:奥林巴斯生命与材料科学欧洲股份有限公司,奥林巴斯AU5400制备物A～Q分别代表:A:2009年卫生部临床检验中心全国常规化学室间质评用质控品(EQA/PT),批号200911B:同上,EQA/PT批号200912C:同上,EQA/PT批号200913D:同上,EQA/PT批号200914E:同上,EQA/PT批号200915F:同上,EQA/PT批号200921G:同上,EQA/PT批号200922H:同上,EQA/PT批号200923I:同上,EQA/PT批号200924J:同上,EQA/PT批号200925K:同上,EQA/PT批号200931L:同上,EQA/PT批号200932M:同上,EQA/PT批号200933N:同上,EQA/PT批号200934O:BIO-RAD,QC1,批号45581P:BIO-RAD,QC2,批号45582Q:BIO-RAD,QC3,批号45583
3 讨论
总蛋白作为监测机体营养状态的常用指标,其检测方法的研究已有近百年的历史。近年来,尽管量值溯源的概念已逐步被我国的临床实验室所接受,但相较欧洲和美国而言,我国的量值溯源系统仍不完善。2002年国际计量委员会(CIPM)、IFCC和国际实验室认可合作组织(ILAC)联合成立了检验医学溯源联合委员会(JCTLM),为促进和指导医学检验等效测量以及临床检验量值溯源提供全球平台。虽然我国的临床生化检验标准化和参考方法研究活动起步较晚,但在国家和地方科研基金的大力支持下已取得了一定进展。
基质效应(matrix effect)一词所描述的是参考物质与新鲜样品的性质差异,近年来逐渐被互通性一词所替代。这里所说的参考物质不仅是指有证标准物质,还包括各种校准物和质控物。虽然这些物质在制备过程中会尽量减少基质效应的产生,如选用与被测物基质相同的原料等,但有时为了达到某一特定浓度,会向原料中添加外源性物质。为了易于储存和运输,也会对原料进行加工,如冻干等。这些都会导致参考物质与实际样品的结果产生差异[3]。
在量值溯源的过程中,参考物质的基质效应是一个不容忽视的问题。对于临床而言,基质效应会影响到室间质量评价(EQA)中靶值的确定和非配套系统校准品的选用。在EQA中,基质效应的存在使得检测结果的靶值不宜采用总体均值来表示[4],这时不论以何种方式分组(按检测系统或检测原理)都无法达到满意的效果。仍以临床生化检测为例,由于各实验室所选用的系统相对分散,有的实验室同时使用几种系统,而有的系统可能只在几家实验室中使用。同样的,一种检测原理也可能同时被多种系统采用。这些都会影响EQA的有效性。对于使用非配套校准物的临床实验室而言,由于校准物的专用性,直接使用标称的靶值,更可能导致'检测结果出现偏差。
本实验应用CLSI EP-14A方案[1],对于17种制备物在4个检测系统中的基质效应进行了评价。结果发现,其中9种制备物在各系统上均无基质效应,其余各制备物都存在不同程度的基质效应。这种基质效应不仅存在于血清总蛋白的测定中,包括脂类和各种小分子物质在内,现已证实几乎所有临床化学的检测结果都会受到基质效应的影响[5,6,7]。
不仅如此,基质效应的存在也使得某些参考物质的使用受到限制。一项针对血清尿素的研究发现,不仅EQA材料和市售校准品、质控品存在基质效应,有证标准物质SRM909水平Ⅱ在7种尿素检测系统中也出现了不同程度的基质效应[7]。这也正说明,即使理论上溯源链应尽可能短,但并不意味着可以直接使用有证参考物质对临床检测的结果进行溯源[8]。当然,目前的技术手段上不能完全避免基质效应的存在,临床实验室在使用中应注意其对检测结果量值溯源的影响。
参考文献
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核基质蛋白 篇5
关键词：肺纤维化,基质金属蛋白酶-2,基质金属蛋白酶-9
肺纤维化是多种慢性肺疾病的共同结局, 表现为肺间质细胞大量增殖、细胞外基质 (ECM) 异常增生及肺组织结构的重构, 疾病早期表现为弥漫性肺泡炎, 肺泡结构破坏, 肺泡上皮细胞和基底膜的损伤是肺间质纤维化病理过程的特征性改变, MMP-2和MMP-9可以降解肺泡壁基底膜的重要成分Ⅳ型胶原, 因此, MMP-2和MMP-9在肺纤维化的发生过程中起着重要的作用。清肺化痰通络方是全国名老中医邱幸凡教授的临床经验方, 在临床应用中取得了较好疗效。本实验借鉴博莱霉素A5 (BLMA5) 诱发的大鼠肺纤维化模型, 利用免疫组化法检测肺内MMP-2和MMP-9的表达, 以探讨清肺化痰通络方防治肺纤维化的作用及可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雌性Wistar大鼠72只, SPF级, 体重 (200±20) g, 购于武汉大学试验动物中心。
1.2 试验药物
清肺化痰通络方由黄芩、瓜蒌、桃仁、地龙、黄芪、当归、鱼腥草 (购于湖北省中医院) 组成;常规水煎后, 水浴浓缩药液至每1 m L含生药2 g, 4℃保存。将BLMA5 (8 mg/支, 天津太和制药有限公司, 批号:030705) 制成5 mg/m L的生理盐水溶液。MMP-2单克隆抗体 (产品编号:ZM-0330) 、MMP-9单克隆抗体 (产品编号:ZM-0335) 及Sp试剂盒 (产品编号:SP-9000) 由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。
1.3 肺纤维化模型制作
参照文献[1], 将大鼠麻醉, 趁动物吸气瞬间, 在额镜的直视下迅速将焊锡制成圆头的12号腰穿针头, 通过声带插入气管约3~4 cm, 缓慢注入BLMA5生理盐水溶液1 m L/kg。立即将大鼠直立旋转。
1.4 动物分组及处理方法
将72只大鼠随机分为三组: (1) 模型组 (24只) :造模2 h后, 生理盐水灌胃, 15 m L/ (kg·d) ; (2) 干预组 (24只) :造模2 h后, 清肺化痰通络方水煎剂灌胃, 15 m L/ (kg·d) ; (3) 对照组 (24只) :不造模, 生理盐水灌胃, 15m L/ (kg·d) , 灌胃前禁食4 h, 不禁水。以上各组动物分别在实验第3、7、14、28天各处死6只。
1.5 标本采集及处理
经0.5%戊巴比妥钠溶液腹腔内注射麻醉后, 称重;颈动脉放血处死, 10%甲醛溶液固定右肺上叶, 制作石蜡切片, 用于HE染色和Masson染色及肺组织MMP-2和MMP-9表达检测。
1.6 指标检测
1.6.1病理染色分析依据Szapiel等[2]方法, 确定肺泡炎及肺纤维化程度。 (1) 肺泡炎分级, 0分:无明显病变;1分:轻度肺泡炎, 病变占全肺20%以下;2分:中度肺泡炎, 病变局限在全肺20%~50%;3分:弥漫性肺泡炎, 病变范围超过50%。 (2) 肺间质纤维化分级, 0分:无肺间质纤维化;1分:轻度肺间质纤维化, 病变范围局限在全肺20%以下;2分:中度肺间质纤维化, 病变范围占全肺20%~50%;3分:重度肺间质纤维化, 病变范围超过50%, 肺泡结构消失, 肺组织结构紊乱。
1.6.2免疫组织化学分析Sp法测定肺组织的MMP-2和MMP-9表达, 采用HUMIAS-2000医学图文分析系统, 对免疫组织化学结果定量分析。每张切片在高倍视野 (×400) 下随机选择不相重叠的5个视野, 细胞核为蓝色, MMP-2和MMP-9阳性细胞为棕黄色, 阴性对照片以PBS替代MMP-2和MMP-9。测定阳性细胞的积分光密度, 观察MMP-2和MMP-9免疫阳性细胞的分布, 以反映各组肺组织中MMP-2和MMP-9表达的变化。
1.7 统计学方法
采用SPSS 12.0统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差 (x±s) 表示, 三组间比较采用单因素方差分析, 用q检验进行不同组间的两两比较, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 清肺化痰通络方对肺纤维化大鼠肺组织的影响
2.1.1肉眼观察对照组可见大鼠肺呈粉红色, 表面光滑, 弹性良好。模型组第3、7天可见大鼠双肺呈鲜红色, 有数个的散在出血点, 体积增大, 第14天双肺可见暗红色陈旧出血, 第28天时双肺苍白、表面凸凹不平、体积缩小、弹性较差, 硬度增加。干预组与模型组病变基本一致, 但程度稍轻, 肺体积略增大, 弹性稍差。
2.1.2镜下观察对照组大鼠肺组织结构清晰, 肺泡壁完整, 肺泡上皮细胞形态正常, 均未见明显病变。模型组第3天时肺内出现肺泡间隔增宽、炎性细胞浸润等急性肺泡炎改变;第7天时炎症表现更明显, 镜下见大片炎性细胞浸润, 成纤维细胞开始增殖;第14天时肺泡炎持续加重, 纤维组织开始增生;第28天肺泡炎较前有所减轻, 部分肺泡腔消失, 被大量成纤维细胞、增生的胶原纤维所取代, 已基本呈现肺纤维化改变。干预组大鼠肺部病理表现的变化规律与模型组基本一致。三组间同时段的肺泡炎程度, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;干预组和模型组同时段肺泡炎程度差异有统计学意义 (P<0.05) , 特别是第7天和第14天干预组肺泡炎程度较模型组轻, 两组间差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。干预组和模型组在第3天肺纤维化程度差异无统计学意义 (P>0.05) , 三组在第7、14、28天的肺纤维化程度, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;第28天干预组肺纤维化程度较模型组轻, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。见表1。
2.2 三组MMP-2和MMP-9蛋白表达比较
对照组肺组织中可见MMP-2少量阳性表达, 主要分布在肺泡巨噬细胞、肺泡上皮细胞、成纤维细胞和气道上皮细胞胞浆内。模型组、干预组第3天时, 肺内MMP-2阳性表达细胞均多于对照组, 肺泡间隔内可见少量成纤维细胞呈阳性反应, 血管、支气管周围及肺泡腔镜下内可见大量单核巨噬细胞呈强阳性反应, 三组间比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;第7天模型组和干预组MMP-2表达明显增强, 可见大量肺泡巨噬细胞和间质内的成纤维细胞呈阳性表达;第14天模型组和干预组肺内阳性细胞表达最强, 与第3、7、28天比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;第28天时, 模型组和干预组阳性细胞较同组第14天时明显减少, 但仍高于对照组。见表2。
对照组肺内可见MMP-9少量弱阳性表达, 表达主要分布于肺胞巨噬细胞和支气管上皮细胞。第3天时模型组、干预组大鼠肺内血管、支气管周围及肺泡腔内的单核巨噬细胞呈强阳性反应, 与对照组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;第7天模型组和干预组肺内MMP-9表达增强, 除支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞外, 还见大量间质内的成纤维细胞和肺泡巨噬细胞呈阳性表达, 与同组第3、14、28天比较, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) ;第14天模型组和干预组肺内阳性细胞略有减少;第28天模型组和干预组MMP-9表达较第7天时明显减弱, 但仍高于对照组 (P<0.05) 。干预组阳性细胞明显少于同时段模型组, 两组间差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。
3 讨论
现代医家根据肺纤维化临床表现及病机变化将其归为咳嗽、肺胀、喘证、气短、肺痿、肺痹、痰饮等范畴, 正气亏虚为本, 血瘀内阻为标, 正虚邪实为其基本病机, 其中, 痰阻肺络、肺阴不足、瘀血阻滞、内闭喘脱为临床多见的病变类型。消肿化痰通络方中黄芩、瓜蒌为君药, 黄芩味苦寒主入肺经, 可泻火解毒, 治肺热所致咳吐黄痰;瓜蒌药味甘、微苦, 性寒, 归肺、胃、大肠经, 清热化痰, 宽胸散结、痛疮肿毒, 两者相伍则肺之热清痰化而气机调畅;鱼腥草味辛, 性微寒, 归肺经具有清热解毒、消痈排脓功效, 肺萎之人久咳入络, 必兼气虚血瘀, 故以地龙、桃仁活血化瘀、通络, 且地龙性寒味咸, 善下行可平抑上逆之肺气而止咳平喘;佐以黄芪、当归养血补气, 与君药相配, 苦寒、甘温并用, 使肺热得清而不伤肺津, 共奏清热化痰、止咳平喘、活血益气之功。
实验结果显示, 造模大鼠均有不同程度的耸毛、活动减少、嗜睡, 少吃等症状。造模初期可见大鼠体重明显下降, 约3 d后逐渐缓解, 其中, 干预组体重恢复较快, 第28天时体重已与空白对照组相近, 而模型组体重恢复较慢, 第28天时仍明显低于对照组。通过HE光镜观察模型组早期即出现肺泡炎, 14 d后以肺纤维化病变为主, 28 d出现典型的肺纤维化改变, 符合肺纤维化的病理改变过程[3], 提示造模成功。干预组肺泡炎程度明显的轻于模型组, 提示清肺化痰通络方可以减轻早期肺泡炎的改变, 第14、28天干预组肺纤维化程度轻于同时段的模型组。提示清肺化痰通络方可以减轻模型动物的症状, 并在肺组织结构上减轻和延缓纤维化的发生。
组织纤维化的发生是由于ECM代谢失衡, 打破了脏器原有的组织结构, 纤维结缔组织大量增生的结果[4]。ECM包括纤维性成分、连接蛋白和间质成分, 主要为糖胺聚糖等, 其对细胞增殖和分化发挥重要调控作用, 合成和降解这些蛋白质的ECM代谢酶可分为基质金属蛋白酶类 (MMPs) 和基质金属蛋白酶组织抑制物 (TIMP) 。MMPs的明胶酶 (MMP-2、MMP-9) 主要降解Ⅳ胶原纤维、纤维连接蛋白、肺基膜等成分, 由于肺基膜及结构支架的损伤与肺纤维化密切相关, 因此, MMPs在肺纤维化发生中的作用日益受到重视[5]。有报道MMP抑制剂巴马司他等能降低MMP-9活性, 抑制TNF-α和TGF-β1释放, 减轻动物模型的肺纤维化[6,7]。Lemjabbar等[8]测定了肺间质纤维化患者支气管肺泡灌洗液中蛋白和MMP-2 m RNA的表达, 显示激素及免疫抑制剂治疗可以降低肺内MMP-2表达。上述研究均表明损伤肺组织可能通过持续性高表达MMPs, 使基膜不可逆性损伤断裂, 阻碍新生上皮组织重构正常肺泡腔, 最终导致肺纤维化。
本实验研究显示, 第3天开始模型组和干预组肺内MMP-2、MMP-9的表达均开始增加, 模型组和干预组MMP-9在第7天时已经达到高峰, 然后干预组快速下降, 到第28天时MMP-9水平基本接近正常, 模型组在第7天出现MMP-9表达高峰, 第14、28天也出现明显的下降, 但是28天时MMP-9的水平仍高于对照组。肺纤维化大鼠在造模的第3~14天以肺泡炎的病理改变为主, 提示MMP-9可能与早期上皮基底膜损伤有关, 参与了细胞外基质和基底膜的降解。干预组的MMP-9明显下降, 且在第14天时MMP-9的表达明显低于模型组, 推测清肺化痰通络方可能是通过抑制MMP-9表达, 从而延缓、减轻早期肺泡炎的发生。模型组和干预组MMP-2在第14天时达到高峰, 然后缓慢下降, 第28天时, 模型组和干预组仍高于对照组。第14、28天时以肺纤维化为主要病变, 提示MMP-2则可能在肺泡上皮细胞的再生与肺组织的异常修复中起重要作用。第14、28天MMP-2在干预组的表达低于模型组, 且干预组肺纤维化程度比模型组轻, 提示清肺化痰通络方通过延缓或者抑制MMP-2表达, 达到延缓以及抑制肺纤维化的目的。
综上所述, 本实验结果提示, BLMA5诱导的肺纤维化模型在不同时期MMPs的表达不同, 早期病变肺组织以MMP-9的增加为主, 晚期则以MMP-2增加为主, 与有关报道一致[9]。清肺化痰通络方可能通过抑制MMP-9在肺纤维化大鼠肺内的表达, 减轻早期的肺泡炎, 抑制MMP-2的表达, 延缓和抑制后期肺纤维化的发生。
参考文献
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核基质蛋白 篇6
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源
本组研究中宫颈组织石蜡标本均取自2002年6月~2008年12月在我院妇科门诊进行宫颈活检、住院患者手术切除的组织,慢性宫颈炎20例、CINⅠ级15例,CINⅡ级15例,CINⅢ级15例,宫颈癌42例。宫颈癌临床分期采用FIGO标准,其中宫颈癌Ⅰ期14例,Ⅱ期21例,Ⅲ期7例,全部病例在术前均未接受放疗、化疗。所选病例无高血压、糖尿病等合并症。
1.1.2 试剂
MMP-2和MMP-9均为兔抗人单克隆抗体,购自北京中杉金桥生物技术公司。
1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学染色
按免疫组织化学二步法进行,石蜡切片经二甲苯脱蜡、酒精水化后,微波炉中修复抗原,用1︰50 MMP-2一抗及MMP-9一抗作用过夜,生物素二抗孵育,链亲和素-生物素过氧化合物酶复合物作用后经DAB显色封片观察。每批实验以扁桃体为阳性对照,以PBS代替第一抗体作为阴性对照。
1.2.2 结果判定标准
用低倍和高倍镜观察全片,MMP-2及MMP-9阳性染色为在细胞浆内出现棕黄色颗粒,根据阳性细胞数所占比例及染色强度分为以下几级:无染色细胞(-);阳性染色细胞数<20%(+),染色淡黄,个别可黄至棕黄色;阳性染色细胞数20%~50%(++),染色黄色:阳性染色数>50%(+++),强度黄至棕黄色,少数为淡黄色。对CIN及宫颈癌病例,进行病变部位MMP-2和MMP-9测定。
1.3 统计学方法
采用等级资料中多个样本比较的秩和检验,及列联表资料的χ2检验,检验水准α=0.05。
2 结果
2.1.1 MMP-2在慢性宫颈炎、各级CIN、宫颈癌组织中的表达
MMP-2主要表达于宫颈上皮细胞胞浆内,从下表显示:在慢性宫颈炎,MMP-2的阳性细胞率表达很低,仅为5%,在各级CIN、宫颈浸润癌阳性表达高,其阳性表达强度随CIN级别增高而增强,至宫颈癌表达强度最高,差异有显著性,见表1。
注:H=64.34,P<0.005
2.1.2 MMP-2在各级宫颈癌组织中的表达
MMP-2在宫颈癌上皮细胞中表达阳性率达100%,但宫颈癌的临床分期与MMP-2的表达强度差异无显著性,见表2。
例
注:χ2=7.02,0.1
2.2.1 MMP-9在慢性宫颈炎、各级CIN、宫颈癌组织中的表达
MMP-9主要表达于宫颈上皮细胞胞浆内,从下表显示:在慢性宫颈炎,MMP-9的阳性细胞率表达很低,在各级CIN、宫颈浸润癌阳性表达高,其阳性表达强度随CIN级别增高而增强,至宫颈癌表达强度最高,并差异有显著性,见表3。
例
注:H=57.19,P<0.005
2.2.2 MMP-9在各级宫颈癌组织中的表达
MMP-9在宫颈癌上皮细胞中表达阳性率达100%,宫颈癌的临床分期与MMP-9的表达强度差异有显著性,见表4。
例
注:χ2=11.83,0.01
3 讨论
细胞外基质(extracellular matrix,ECM)有间质性基质和基底膜两种形式,恶性肿瘤侵袭正常组织及转移必须突破ECM,尤其是基底膜,基底膜的主要成分为Ⅳ型、Ⅴ型胶原、弹力蛋白等。ECM的降解主要依靠蛋白水解酶,基质金属蛋白是其中最为重要的一类,几乎能降解ECM的所有成分。明胶酶MMP-2、MMP-9的降解底物为Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原、纤维蛋白、弹力蛋白等,由此推论:组织中明胶酶的改变与肿瘤的侵袭、转移有关。
肿瘤转移是一个多步骤过程[1],MMP-2和MMP-9降解ECM的能力从各个方面影响肿瘤进展,主要分为以下两个方面:(1)肿瘤血管形成及肿瘤生长。血管形成是肿瘤生长的前提条件,MMP-9被认为是形成新生血管的关键因素,在人神经母细胞瘤异种移植模型中,MMP-9缺乏可导致血管形成减少,以及肿瘤微血管覆盖的外周细胞不连贯[2]。将B16-BL6黑色素瘤细胞种植入MMP-2缺乏的鼠体内,可观察到血管形成减少。(2)转移。肿瘤的转移仍依赖于其血管的形成。在鼠肉瘤模型,MMP-9的抑制可阻断肿瘤的转移[3]。大量的研究显示MMP-2、MMP-9与恶性肿瘤的的进展有关[4]。
宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤,宫颈上皮瘤样变是其癌前病变。从该研究来看,MMP-2和MMP-9在慢性宫颈炎组织中的表达极低,而CIN各级组织中的表达率高,随着CIN级别增高,其表达强度逐渐增强,至宫颈癌表达强度最高,并差异有显著性。与GAIOTTO等[5]的研究结论相似。表明MMP-2和MMP-9与从宫颈癌前病变发展至宫颈癌这一过程相关。
ZHAI等[6]使用原位杂交技术测定正常宫颈、低度CIN、高度CIN及浸润癌组织中膜型基质金属蛋白酶(membertype-matrixmetalloproteinase,MT-MMP)的表达,结果显示随着宫颈病变的进展,MT-MMP的表达逐渐增强,而MT-MMP能激活MMP-2酶原,推断MT-MMP的表达增强导致MMP-2的水平增高。
ARGUELB-RAMIREZ等[7]的研究表明MMP-2和MMP-9的表达与宫颈癌的临床分期密切相关。但笔者在测定不同临床分期宫颈癌组织中的MMP-2和MMP-9水平时发现:虽然这两种明胶酶在宫颈癌组织中的表达很高,但MMP-2的表达强度与宫颈癌的临床分期无关,MMP-9与其临床分期差异有显著性,说明MMP-2在宫颈癌的形成中是一个早期事件,在宫颈癌的进展中,MMP-9起着更重要的作用。有研究显示,MMP-9主要在浸润性癌组织中表达,在原位癌中表达弱,在许多恶性肿瘤,血清可溶性MMP-9的水平能反映肿瘤的转移与否,通常被认为是恶性肿瘤的一项预后指标[8]。MEYER等[9]报道,对于远处转移的肿瘤细胞,MMP-9还有保护性抗凋亡的作用。
综上所述,表明MMP-2和MMP-9在从宫颈癌前病变进展至宫颈癌这一过程中起着重要作用,其表达增强与CIN的分级有关,MMP-9还与宫颈癌的临床分期相关。由此推论,对于宫颈炎、CIN、怀疑宫颈癌的宫颈活检组织进行MMP测定,有助明确诊断,并有助于判定预后。
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[7]ARGUELB-RAMIREZ J,PEREZ-CARDENAS E,DELGA-DO-CHAVEZ R,et al.Matrix metalloproteinases-2,-3and-9secreted by explants of benign and malignant lesions of the u-terine cervix[J].Int J Gynecol Cancer,2004,14(2):333-340.
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核基质蛋白 篇7
1 资料与方法
1.1 一般资料
本文将选取我院自2012年1月1日至2012年12月31日前来就诊的60例子宫内膜异位症患者进行临床分析, 所有患者均确诊为子宫内膜异位症疾病, 并进行妇产科手术治疗。按照患者病变类型分为异位内膜组与在位内膜组, 每组患者30例。异位内膜组30例子宫内膜异位症患者中所有患者均为女性, 年龄在26~53岁, 平均年龄为 (37.34±1.33) 岁;在位内膜组30例子宫内膜异位症患者中所有患者均为女性, 年龄在26~52岁, 平均年龄为 (37.02±1.38) 岁。另选取30例同期由于患有单纯肌壁间子宫肌瘤疾病进行手术治疗患者作为对照组, 所有患者均为女性, 年龄在25~51岁, 平均年龄为 (36.98±1.41) 岁。在位内膜组、异位内膜组、对照组患者在性别、年龄、例数、教育背景以及社会经历等方面无显著性差异, 且P>0.05, 三组患者一般资料具有临床可比性。
1.2 方法
三组患者均实施手术治疗, 之后将其术中脱落子宫内膜组织应用浓度为10%甲醛溶液进行固定, 将固定完成的子宫内膜组织进行石蜡包埋, 4μm连续切片, 应用HE染色法对其进行染色后在显微镜下进行观察, 若能够观察到明显子宫内膜组织, 则进行下一步研究, 反之应重新选取。①骨桥蛋白测定方法:将上述子宫内膜组织蜡块进行连续切片、脱蜡处理, 之后使用浓度为3%过氧化氢溶液对其进行内源性酶灭活处理, 持续灭活15min, 灭活完成后将其放入微波炉中加热15min, 此举目的在于将子宫内膜组织中的抗原进行修复, 待其自然冷却后, 将非免疫性羊血清滴入子宫内膜组织, 从而达到阻断子宫内膜组织中非特异性结合的效果。依次将一抗 (骨桥蛋白鼠抗人单抗, 美国COMICON公司生产) , 二抗 (羊抗鼠Ig G) 、SP液 (中国福建迈新生物技术有限公司生产) 、DAB (二氨基联苯胺) 加入其中, 进行3~5min显色, 之后使用苏木素对其进行复染、脱水以及透明处理。使用中性树胶对标本进行封片, 放入显微镜下观察。②基质金属蛋白酶9测定方法:采用免疫组化法SP对子宫内膜中基质金属蛋白酶9进行检测, 一抗为即用型鼠抗 (MMP-9) 或单克隆抗体, 试剂为美国Maxin Bioteeh公司生产, SP试剂盒为中国福建迈新生物技术有限公司生产。
1.3 结果判定
使用病理图文分析系统对子宫内膜中的骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9进行图像分析处理。处理时所使用的仪器为澳大利亚Wei Niyand公司生产的彩色图像分析仪。子宫内膜中的细胞质内出现黄色颗粒即为阳性细胞, 并对显示为阳性细胞的面积、灰度等方面进行扫描, 其中平均灰度=总灰度/扫描所知黄色区域面积, 即骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9的表达强度。每一切片均选择四个不同视野完成扫描, 并且对每个视野测定三次后取平均值作为最终结果。三组子宫内膜患者进行扫描时均为同一位具有丰富经验的临床检验医师使用同一台设备检测定完成。对三组患者检测结果进行统计学分析, 得出结论。
1.4 统计学方法
所有数据均使用SPSS13.0软件包进行统计学分析, 对于计量资料用±s表示, 采用t检验, 计数资料采用χ2检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
异位内膜组、在位内膜组以及对照组患者子宫内膜组织中骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9表达情况对比分析, 具体结果见表1。
由表1可知, 异位内膜组子宫内膜异位症患者体内子宫内膜组织中骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9表达强度均高于在位内膜组子宫内膜异位症患者以及对照组患者, 在位内膜组子宫内膜异位症患者体内子宫内膜组织中骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9表达强度均高于对照组患者, 且P<0.05, 三组患者对比结果具有统计学意义。
3 讨论
子宫内膜异位症, 即Endometriosis, 简称EM, 是临床常见的妇科疾病之一, 可导致患者盆腔疼痛, 甚至出现不孕, 对患者身心均造成严重影响, 降低患者生活质量[1]。随着近年来人们生活习惯的改变, 子宫内膜异位症临床发病率呈现出显著上升趋势, 已引起广大医务工作者高度重视。
骨桥蛋白, 即Osteopontin, 简称OPN, 是一种分泌型磷酸化糖蛋白, 其中富含唾液酸, 在人体中发生的细胞粘附、迁移、炎症反应、组织修复、信号转导以及细胞凋亡中起到至关重要的作用[2]。临床研究表明, 人体生理组织中若发生相关病变, 如炎症, 则生理组织中将发生不同程度的骨桥蛋白表达[3]。本文研究可知, 发生子宫内膜病变患者体内子宫内膜组织中骨桥蛋白表达强度明显增加, 且异位内膜患者表达强度高于在位内膜患者, 因此可知骨桥蛋白可能在患者出现异位子宫内膜粘附、种植等过程中发挥重要作用。
基质金属蛋白酶9, 即Matrix metall-oprteinases 9, 简称MMP-9, 是广泛分布在人体各种组织器官中的蛋白水解酶, 能够对细胞外基质进行降解, 对人体中正常月经周期子宫内膜细胞的生长、分化以及月经来潮的发生情况均能够起到重要的调节作用[4]。基质金属蛋白酶9能够对人体内血管内皮细胞生长起到有效的促进作用, 形成新生血管, 同时能够与整合素进行相互活化, 从而达到加强细胞与细胞之间黏附作用的目的[5]。本文研究可知, 子宫内膜异位症患者中异位内膜组基质金属蛋白酶9的表达强度明显高于在位内膜组以及对照组, 因此, 基质金属蛋白酶9在人体发生子宫内膜细胞种植、异位黏附、生长过程中起到重要作用。
综上所述, 骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9在子宫内膜病变中表达强度均升高, 因此, 患者发生子宫内膜病变与骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9表达变化密不可分, 临床应根据这一特点对子宫内膜病变进行深入研究, 从而探讨更为有效的治疗疾病方法, 提高患者生活质量。
摘要：目的 本文将选取子宫内膜异位症患者进行临床分析, 从而探讨骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9在子宫内膜病变中的表达特点, 为提高子宫内膜病变患者的治疗效果与生活质量提供可靠依据。方法 对在位内膜组、异位内膜组以及对照组患者手术完成后由其体内剥离的子宫内膜进行骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9检测, 并对检测结果进行统计学分析, 得出结论。结果 异位内膜组子宫内膜异位症患者体内子宫内膜组织中骨桥蛋白与基质金属蛋白酶表达强度均高于在位内膜组子宫内膜异位症患者以及对照组患者, 在位内膜组子宫内膜异位症患者体内子宫内膜组织中骨桥蛋白与基质金属蛋白酶表达强度均高于对照组患者, 且P<0.05, 三组患者对比结果 具有统计学意义。结论 骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9在子宫内膜病变中表达强度均升高, 因此, 患者发生子宫内膜病变与骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9表达变化密不可分, 临床应根据这一特点对子宫内膜病变进行深入研究, 从而探讨更为有效的治疗疾病方法, 提高患者生活质量。
关键词：骨桥蛋白,基质金属蛋白酶9,子宫内膜病变,临床表达研究
参考文献
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