蛋白印迹

蛋白印迹（精选3篇）

蛋白印迹 篇1

实验室特异性检测是艾滋病病毒感染者(HIV)和艾滋病病人(AIDS)的重要诊断依据,其检测结果的准确性不仅影响到受检者本人,还涉及到其家属及社会的稳定。目前常用的HIV感染的标准诊断仍沿用免疫学方法检测HIV抗体。HIV抗体免疫印迹试验(Westernblot,WB)由于一次试验既可测得各类HIV抗体综合指标,有很高的敏感性和特异性,因此是目前HIV抗体检测最为广泛应用的确认方法[1]。但近年来,无偿献血工作在全国取得了快速发展,大量人群献血都要进行抗-HIV检测;加之艾滋病知识的普及,重点人群的大面积筛查,检测基数逐年增加,带型不足以确认阳性者越来越多,按照《全国艾滋病检测技术规范》(2004年版)符合HIV抗体不确定判断标准的,每3个月随访复检1次,连续2次,共6个月,这给工作带来不便。

为了解无偿献血者中HIV抗体检测情况,探求HIV抗体筛查阳性标本ELISA的S/CO与WB确认结果的关系,评估WB方法在确认过程中的必要性和可行性,对两种方法检测结果进行了对比分析,结果报告如下。

1材料与方法

1.1标本

来自1997年1月至2007年10月全部无偿献血者标本,共计326 568份,初筛阳性111份(111份标本为10年多HIV抗体ELISA试剂检测阳性的标本,这些年,国内外的HIV抗体ELISA试剂在质量上有了很大发展,灵敏度和特异性明显提高,所以,这些曾经初筛阳性的标本,在本次ELISA试剂检测中,并不一定都是阳性)。

2.2试剂

初检试剂为HIV-1/2国产北京金豪有限公司和上海实业科华有限公司试剂,复检试剂为生物梅里埃公司HIV-1/2酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂,本次ELISA检测使用梅里埃试剂;确认试剂为澳亚生物技术有限公司生产的人类免疫缺陷病毒抗体确认试剂盒(Immunoblot Kit for Antibody to Human Immunodeficiency Virus),新药证书:国药证字(1998)S-22号;批准文号:国药准字S20010010。

1.3方法

按照GB18467要求,对无偿献血者进行HIV抗体初、复检,两种试剂为阴性结果判断为阴性,阳性结果的用同种试剂做双孔复试,有一种试剂阳性既可定为初筛阳性。初筛阳性的标本再用WB进行确认,将结果分为阳性、阴性、不确定三组,比较三组标本的ELISA检测结果及S/CO值。采用sars10.0统计软件处理,t检验方法。用各种试剂均在有效期内使用,严格按照说明书操作和判读结果。

1.4随访

不确定结果按《全国艾滋病检测技术规范》(2004年版)要求,每3个月随访一次,共两次,阴性或带型没有变化的判断为阴性。

2结果

2.1初复检结果

初复检共326 568份,初筛阳性111份(初复检测一次阳性既为初筛阳性),占3.4/万。

2.2确认实验结果

111份HIV抗体初筛阳性标本,经WB确认后,HIV抗体阳性20份,占18.02%;HIV抗体阴性82份,占73.87%;HIV抗体不确定9份,占8.11%。

2.3ELISA试验与确认实验结果比较

2.3.1 ELISA与WB结果的一致性

ELISA与WB结果的一致的标本为79份,一致性71.17%[(20+59)/111];ELISA与WB的阳性结果一致的标本为20份,阳性符合率为48.78%[20/(41+0)];阴性结果一致的标本为69份,ELISA与WB的阴性符合率为83.13%[69/(70+13)];已确认结果为金标准,确认的阴性或阳性为真阴性或真阳性,得出ELISA检测HIV抗体试剂的敏感性为100%[20/(20+0)],特异性为84.15%[69/(69+13)](表1)。

2.3.2 三组确认结果间ELISA检测S/CO值的比较

20份WB确认为HIV抗体阳性,ELISA检测全部为阳性;82份WB确认为HIV抗体阴性,ELISA检测13份为阳性,69份为阴性;9份为WB确认为不确定,ELISA检测8份为阳性,1份为阴性。不确定结果,出现P24条带8份,P17条带1份。

WB确认的20份阳性标本中,ELISA检测全部为阳性,ELISA检测的平均OD值平均为2.698,cutoff值平均为0.167,S/CO平均为15.764,WB确认出现多条条带,符合判断为阳性的标准。

WB确认的9份不确定标本中,ELISA检测8份为阳性,1份为阴性,ELISA检测的平均OD值为0.356,cutoff值平均为0.172,S/CO平均为2.095,WB确认出现条带不足以判断为阳性,出现P24 8份,P17 1份。符合判断为不确定的标准。

WB确认的82份阴性标本中,ELISA检测13份为阳性,69份为阴性,ELISA检测的平均OD值为0.030,cutoff值平均为0.169,S/CO平均为0.250,WB确认均无条带出现,符合判断为阴性的标准。

2.3.3 WB不同确认结果与ELISA方法S/CO值统计分析(表2、表3)。

用SAS10.0统计软件分析三组S/CO值是否存在差异。阳性组与阴性组分析,t=15.21,P<0.001,显示阳性和阴性组间S/CO值存在显著差异;阳性组与不确定组分析,t=13.07, P<0.001,显示阳性和不确定组间S/CO值存在显著差异;不确定组与ELISA假阳性(WB确认阴性而ELISA阳性)的13例标本分析,t=2.13, P>0. 05,无统计学差异,提示WB不确定结果可能是假阳性。

2.3.4 初筛阳性标本S/CO的分布

初筛阳性标本S/CO值的分布情况见表4。

20份确认阳性的标本的S/CO值全部大于5。确认阴性与不确定的91份标本中,S/CO低于1的占71份,在1～2.999之间19份。较高的S/CO值预示HIV抗体阳性的可能性大,而低于2.999时,预示阳性可能性小[2,3],多为其它抗体干扰,其中包括类风湿因子、抗核抗体对HIV检测试剂的影响较大。

2.4随访结果

6个月后随访9名不确定可疑HIV抗体阳性者,带型无变化,全部被诊断为阴性。

3讨 论

按照我国相关法律、法规的规定,血液要经过HIV抗体初、复检,结果阴性的发往临床,阳性的定为初筛阳性,送疾控中心做确认实验,不确定的,6个月后复查。本试验共检测无偿献血者标本326 865份,初筛阳性共111份。经WB确认阳性20份,阴性82份,不确定9份。ELISA与WB的阳性符合率48.78%,ELISA检测HIV抗体的敏感性为100%,特异性为84.15%。可以看出,ELISA与WB对阳性标本检测结果基本相符,主要的区别还是ELISA方法存在一定的非特异性。WB方法可以进一步证实初筛结果,排除ELISA的非特异性结果,所以WB确认的HIV抗体阳性较准确。

从ELISA的检测结果与WB确认比较经过统计学处理显示,确认阳性的标本的S/CO均在5以上,甚至达到20,可见ELISA检测中高S/CO,HIV抗体阳性机率大;阴性和不确定标本S/CO值较低,在1～2.999之间,阳性可能性较小,因此,在WB确认前,我们日常采供血工作中要注意保密,不要外泄检验信息,对工作人员也要保密,在信息系统中实行单一条码制非常必要,以防止非受权人员接触供血者信息。

不确定结果多为P24,这与国内外报道一致。HIV抗体阳性有假阳性及抗体不确定原因很多,包括HIV新感染不久出现的血清转换期、HIV疫苗接种、自身免疫性疾病和某些疾病的急性期和过敏期[4,5,6,7,8]。机制可能是gp41表位交叉反应导致多条蛋白印迹阳性反应,这种交叉反应可伴随对P24或其它HIV蛋白的非特异交叉反应[9,10,11]。确认实验中,9例不确定结果,8例阳性出现P24条带的进口的ELISA试剂检测为阳性,1例P17 ELISA检测为阴性。P24抗原是感染HIV后最早出现的抗原,所以在包被时加入P24来检测HIV抗体对提高ELISA试剂的灵敏度、缩短“窗口期”十分重要,但抗原的提纯和包被工艺也很重要,否则容易引起假阳性。

WB方法操作简单、方便、经济是确认的首选方法,结果分为三种:阳性、阴性、不确定。但是,不得不注意WB方法总有不确定结果出现,与ELISA假阳性标本的S/CO值经统计学处理分析无明显差异,这表明一方面WB试验总确认阴性和阳性标本较准确,另一方面也提示WB确认为不确定的结果可能是阴性。对于不确定标准,我国的CDC按WHO的国际通用标准,就是每3个月随访复检1次,连续2次,共6个月,再根据结果判断阴阳性,这正是实际工作中WB方法的缺陷。在实际检测工作中,WB方法常常出现可疑条带,为什么一些未感染HIV的个体会出现特异性带型,目前尚不清楚,可能与某些抗体存在交叉反应有关。但是这一现象不能被忽视,因为随着HIV抗体检测标本的增加,不确定结果数量也在上升,本次实验检测了111个初筛阳性标本,就有9个不确定,占8.1%。不确定结果带来很多危害,一是给工作带来许多困难,初筛阳性而WB确认不确定的标本要跟踪随访,对于当今这个流动性极强的社会往往是不可能的,特别是无偿献血者,多为学生、打工的流动人员,很难找到,给艾滋病防治人员工作带来难度;二是给受检者带来巨大的心理压力,受检者被告知初筛阳性后,往往把自己想象成HIV抗体阳性,而要再确认得等到6个月后,在这段时间内,受检测者承受着漫长的恐惧和压力,无偿献血者是无私奉献,献血救人,承受这无端的痛苦是不应该的。从本实验中的9例标本来看,6个月后带型没有变化,应判断为阴性。三是对于我们采血机构而言,无偿献血是安全输血、遏制经血传播疾病的重要手段,但保护好献血者不受到伤害同样重要,包括身体上和精神上,这也是保护血液资源,防止血源流失的重要举措。四是WB的不确定结果,经常给采血机构带来纠纷,因为血站有义务把检测结果告知本人,对本人和家庭及工作环境造成的6个月的影响,血站工作人员无法解释,无偿献血者也是无法接受的,由此引起的法律纠纷在全国各家采血机构均有发生,这与WB确认方法本身的局限性是相关的。

在初筛试验中,ELISA方法存在假阳性,HIV感染的诊断还要以WB确认实验为依据,判断阳性和阴性结果较理想,对于不确定结果的标本,本方法存在一定的局限性,跟踪随访6个月带来许多不便,期待一种新的、有效的、方便的方法,能及时出据准确的结果。随着PCR技术的不断发展和成熟,它的特异性和灵敏度都有了很大提高,可以考虑从作为辅助诊断依据提升到主要诊断依据之一。

参考文献

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蛋白印迹 篇2

关键词：胃肿瘤,富含半胱氨酸61,低氧诱导因子-1α,免疫组织化学,蛋白免疫印迹法

胃癌是常见的消化道肿瘤,其发病率仅次于肺癌,居第2位,大约65%的患者确诊时已经出现局部或远处转移[1]。因此对于侵袭与转移机制的研究一直是胃癌研究的重要课题。目前认为肿瘤的侵袭转移过程涉及多分子作用机制和信号传导通路。近年来研究发现,富含半胱氨酸61(cysteine rich61,Cyr61)可通过PI3K/mTOR和MAPK依赖的信号通路促进低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducing factor-1α,HIF-1α)蛋白合成增加,而且可诱导HIF-1α的HRE(hypoxia response element,低氧反应元件)依赖的转录活性,使HIF-1α调控的侵袭相关基因纤溶酶原激活因子抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor,PAI-1)表达上调,从而促进胃癌细胞的侵袭性[2],但目前国内外有关Cyr 61和HIF-1α与胃癌的研究鲜见报道。本研究应用免疫组织化学和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测不同胃癌组织中Cyr 61和HIF-1α蛋白的表达,并分析其与临床病理参数之间的关系,旨在进一步明确两者与胃癌侵袭的关系,为胃癌的诊断和治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 标本来源

取自青岛市市立医院普外科2008年10月~2009年12月手术切除的标本共49例,标本均经病理科两位以上的资深医师证实,术前均未接受任何化疗或放疗,且均进行了局部淋巴结的清扫。

49例标本分为3组,分别为原发性胃癌组,配对癌旁组(距离边缘2 cm)及配对的手术切缘正常组(距离边缘5 cm以上),将胃癌手术切除标本均分为两部分,一部分立刻固定10%的甲醛溶液中,包埋在石蜡中,以备病理检查用;一部分手术切除的标本立即放于-70℃冰箱中冻存用于Western blot检测。

1.2 主要试剂和仪器

RIPA裂解液(碧云天生物技术有限公司),Cyr61和HIF-1α兔多克隆抗体(武汉博士德公司)、β-actin兔多克隆抗体(武汉博士德公司)为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(武汉博士德公司)为第2抗体。

第2抗体试剂:EnVision试剂盒购于福州迈新生物技术开发公司。染色剂:二氨基联苯胺四盐酸盐(Diamino benzidine,DAB)购于福州迈新。

1.3 实验方法和主要步骤

1.3.1 免疫组织化学检测胃癌组织中Cyr61和HIF-1α的表达

采用EnVision两步法。主要步骤如下:石蜡切片常规脱蜡水化后,浸于0.01 mol/L枸橼酸溶液(pH为6.0),微波中火4 min进行抗原修复。操作严格按说明书进行,取已知阳性切片作为阳性对照,用PBS液代替第一抗体试剂作为阴性对照。

1.3.2 Western blot法检测Cyr61和HIF-1α蛋白的表达

用RIPA裂解液裂解组织(400μl RI-PA+4μl PMSF)提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,取50μg蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将电泳后的蛋白转移至PVDF膜,封闭液封闭(4℃过夜),分别用Cyr 61和HIF-1α兔多克隆抗体(1∶200)和β-actin兔多克隆抗体(1∶1 000)孵育,室温轻摇180 min后,再用TBS洗涤3次(10min/次)后,再分别用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶2 000)室温孵育120 min,TBS洗涤3次(15 min/次)后,最后X线片曝光、显影和定影后观察结果。

1.4 结果判断

1.4.1 免疫组织化学结果判断

CRY61阳性判断标准:以胞质呈棕黄色为阳性。免疫标志的阳性标准:无阳性细胞为阴性;阳性细胞<10%为弱阳性;阳性细胞10%~50%为阳性;阳性细胞≥50%为强阳性。HIF-1α参照ZHONG等[3]的方法,以细胞核或细胞质内呈棕黄色为阳性,高倍镜下(400倍)对每张切片随机选择5个视野,每个视野计数200个细胞,共计1 000个。0分:无着色;1分:<1%的细胞核着色;2分:1%~10%的细胞核着色和(或)胞质弱着色;3分:10%~50%的细胞核着色和(或)胞质明显着色;4分:>50%的细胞核着色和(或)胞质强着色。评分结果:0~1分定为阴性,2~4分定为阳性。

1.4.2 Western blot结果分析

应用BIO-RAD图像分析软件对Western blot杂交条带进行密度扫描,以Cyr61及HIF-1α条带灰度值与β-actin条带灰度值比值表示各组织中Cyr61及HIF-1α表达水平(灰度值为条带密度值及面积值的乘积,设空白对照相对密度值为0)。

1.5 统计学处理

应用SPSS 13.0统计软件,Cyr61蛋白及HIF-1α蛋白的表达以均数±标准差(x±s)表示。组间计量资料的比较采用t检验,计数资料的比较采用χ2检验。Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白在胃癌组织中表达的相关性用Spearman进行相关性检验分析。P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 免疫组织化学方法检测Cyr61和HIF-1α的表达

2.1.1 Cyr61在各组中表达水平的比较

Cyr 61在各组中的表达情况见图1及表1。图1显示Cyr 61在胃癌细胞的胞浆中呈阳性表达。由表1可见,Cyr61在胃癌中表达的阳性率(91.8%),高于癌旁组(75.5%)和正常组(49%),差异有显著性(χ2=4.780,P<0.05;χ2=21.598,P<0.01);癌旁组与正常组比较差异有显著性(χ2=7.338,P<0.01)。

注:1)与正常组比较,P<0.01;2)与正常组比较,P<0.01;3)与癌旁组比较,P<0.05

2.1.2 HIF-1α在各组中表达水平的比较

HIF-1α在各组中的表达情况见图2及表1。图2显示Cyr61在胃癌细胞的胞浆中呈阳性表达,由表1可见,HIF-1α在胃癌中表达的阳性率(83.17%),高于癌旁组(38.8%)和正常组(0%),差异有显著性(χ2=6.186,P<0.05;χ2=70.491,P<0.01),癌旁组的表达高于正常组(χ2=23.57,P<0.01)。

注:1)与正常组比较,P<0.01;2)与癌旁组比较,P<0.01

2.2 Western blot检测各组Cyr61和HIF-1α蛋白的表达

2.2.1 Cyr61蛋白在各组表达的比较

Cyr61蛋白在胃癌组、癌旁组及正常组的表达量分别为(0.2767±0.02200)、(0.2145±0.02209)和(0.1055±0.02082)。统计学分析显示3组间比较,差异有显著性(F=785.8,P<0.01)。癌组织组的表达明显高于癌旁组和正常组(t=14.618;t=38.957,P<0.01),癌旁组的表达明显高于正常组(t=23.962,P<0.01)(图3和表2)。

2.2.2 HIF-1α蛋白表达的比较

HIF-1α蛋白在胃癌组、癌旁组及正常组的表达量分别为(0.2663±0.02682)、(0.2120±0.04087)和(0.1008±0.03867)。统计学分析显示3组间比较,差异有显著性(F=269.3,P<0.01)。癌组织组的表达明显高于癌旁组和正常组(t=7.772;t=24.619,P<0.01),癌旁组的表达明显高于正常组(t=13.837,P<0.01)(图3和表2)。

2.3 胃癌中Cyr61和HIF-1α的表达及其与胃癌临床病理参数的关系

对49例胃癌患者按照性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分期进行分组,观察Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白在胃癌组织中的表达情况(表3)。由表3可见,Cyr61和HIF-1α蛋白的表达与胃癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分期密切相关,差异具有显著性(均P<0.05),与胃癌患者的性别、年龄及肿瘤大小无关,差异无显著性(P>0.05)。

2.4 胃癌组织中Cyr61和HIF-1α表达的相关性

Spearman相关性检验结果表明,在胃癌组织中,Cyr61蛋白表达与HIF-1α蛋白表达呈明显正相关(r=0.411,P<0.05)。

3 讨论

Cyr61是CCN(Cyr61/CTGF/NOV)蛋白家族成员之一。人类Cyr61基因定位于染色体Ip22.3,含有5个外显子和4个内含子,编码381个氨基酸的蛋白,其中38个为保守的半胱氨酸,Cyr61的相对分子量为42 kD。Cyr61由信号肽(signal peptide,SP)及4个保守结构域组成。Cyr61可调控内皮细胞和成纤维细胞的黏附、迁移与增殖,分泌细胞外基质、诱导血管生成,参与多种重要的生理、病理过程。在多种肿瘤的发生、发展过程中发挥着不同作用。研究发现,在不同的组织细胞及肿瘤中,Cyr61的表达水平不同,其功能也不同。如Cyr61在神经胶质瘤、骨肉瘤中高表达,促进肿瘤细胞的增殖和肿瘤组织血管形成[4,5]。而Cyr61在子宫内膜癌、子宫平滑肌瘤、前列腺癌中、非小细胞肺癌中低表达,起到类似抑癌基因的作用[4,5,6,7]。

目前有关Cyr61与胃癌的研究国内外罕见报道,均采用免疫组织化学方法检测,LIN等[7]用免疫组织化学方法对81例胃癌石蜡切片研究发现,Cyr61表达与胃癌肿瘤分期、淋巴结转移及组织学分型相关。在此基础上本研究联合Western blot技术检测了49例胃癌手术患者,发现Cyr61蛋白在胃癌组织中呈高表达,明显高于配对癌旁组织及配对的正常组织,差异有显著性。同时分析Cyr61与临床病理参数的关系发现,Cyr61蛋白的表达与胃癌的分化程度、淋巴结转移及TNM分期呈正相关。提示Cyr61可用于胃癌的检测及作为胃癌侵袭转移的判断指标。

低氧诱导因子-1是由HIF-1α及HIF-1β亚单位构成的异二聚体[8]。HIF-1α是其活性调节亚单位;HIF-1β在常氧和缺氧条件下均可表达,而HIF-1α在氧浓度正常时,其表达量维持在较低水平。在常氧条件下,88%的正常人体组织中不表达HIF-1α,而53%的恶性肿瘤组织中表达HIF-1α,在相应的良性肿瘤中没有检测到HIF-1α[9]。当周围环境的氧浓度下降时HIF-1α的转录、翻译水平呈指数增加,但主要是蛋白水平的表达改变[10]。ZHONG等[9]利用HIF-1α单克隆抗体检测了HIF-1α在多种肿瘤组织中的表达,发现90%的结肠癌、肺癌及前列腺癌组织中HIF-1α表达升高,而在肿瘤附近正常组织中则不表达。关于HIF-1α在胃癌组织中表达的研究报道甚少:TAKAHASHI等[11]研究发现HIF-1α与胃癌肿瘤大小及肝转移密切相关;CHEN等[12]研究发现HIF-1α的高表达与胃癌的复发及远处转移密切相关。

本研究采用免疫组织化学和Western blot技术检测了HIF-1α蛋白水平的表达,发现HIF-1α蛋白在胃癌组织中的表达高于配对癌旁组织及配对的正常组织,癌旁组织高于正常组织,差异均有显著性。同时分析HIF-1α与临床病理参数的关系发现,HIF-1α蛋白的表达与胃癌TNM分期、肿瘤浸润深度和淋巴结转移、细胞分化程度显著相关,而与患者年龄、性别、原发肿瘤大小无关。韩冰等[13]对96例胃癌患者研究发现,HIF-1α表达阳性的患者总生存率明显低于表达阴性的患者,提示HIF-1α在胃癌患者的预后中起着重要作用。本研究显示HIF-1α的表达与胃癌的进展、浸润、转移等恶性生物学行为密切相关。HIF-1α可作为评估胃癌发展、转移及预后的参考指标。

蛋白印迹 篇3

本实验以苯酚为印迹分子,以2-乙烯基吡啶(2-VP)为功能单体,然后采用正交试验设计法,优

化了功能单体的用量,交联剂的用量和致孔溶剂的种类等制备条件,制备了9个苯酚分子印迹聚合物(MIP1-9),并对制备的印迹聚合物的吸附性能进行了研究。在此基础上制备了苯酚分子印迹膜(MIM),考察了其选择性透过性能。结果表明,实验制备的MIP4及MIM具有一定的选择性分离富集苯酚的性能,这为分子印迹技术用于复杂体系中苯酚的分离分析提供了研究基础。

1实验部分

1.1主要仪器和试剂

UV-2401型紫外可见分光光度计(日本岛津);THZ-C恒温振荡器(江苏太仓实验设备厂);Agilent S1200高效液相色谱仪,Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6×250 mm,5 μm)。

苯酚(分析纯,天津市化学试剂三厂);2-乙烯基吡啶(2-VP,分析纯)为美国Acrosorganics公司产品;偶氮二异丁腈(AIBN,分析纯,上海试剂四厂);二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA,分析纯,江州安利化工厂),使用前减压蒸馏除出去阻聚剂;

尼龙微孔滤膜(Nylon-6)购于上海亚东核级树脂有限公司,孔径0.45 μm;色谱纯甲醇(美国Fisher公司)。实验用其它试剂均为分析纯,水为艾柯纯水器UP级水。

1.2分子印迹聚合物及印迹膜的制备

1.2.1正交设计苯酚分子印迹聚合物(MIP)的制备

采用正交试验设计,对苯酚分子印迹聚合物的聚合条件包括功能单体用量、交联剂EGDMA 用量和致孔溶剂种类3个因素各取3个水平,采用L9(34)正交试验设计表进行实验设计,见表1。

*在所有印迹聚合物的合成中,模板分子苯酚的加入量均为1 mmol,致孔溶剂的用量为10 mL,引发剂为AIBN,其用量为功能单体和交联剂物质的量之和的5%。**MIP4为正交优化得到的最佳聚合物。

分别按照表1所确定的聚合反应中需要加入的各物质的种类和数量制备得到苯酚分子印迹聚合物MIP1-9。准确称取一定量的苯酚并分别溶解在30 mL甲醇中,加入功能单体2-VP后,室温下搅拌3 h,使苯酚与2-VP充分作用,再加入适量交联剂EGDMA 和引发剂AIBN。将该混合液转入100 mL的安瓿瓶中,通N2脱氧5～10 min。然后在无氧条件下密封并放入60℃的恒温振荡器中反应24 h,得到固体聚合物。经粉碎、研磨,过0.125 mm(120目)分样筛。用1∶9(体积比)冰乙酸-甲醇溶液索氏提取所得聚合物至馏出液中检测不到印迹分子苯酚,再用甲醇洗至中性,除去过量的H+,最后在真空干燥器中干燥48 h,得到苯酚分子印迹聚合物MIP1-9。

非印迹聚合物(NMIP1-9)的制备,除不加印迹分子苯酚外,制备及处理方法与其相应的MIP一致。

1.2.2苯酚分子印迹膜(MIM)的制备

取1 mmol苯酚溶于10 mL甲醇中,加入6 mmol功能单体2-VP,室温下搅拌反应3 h,再加入40 mmol的EGDMA和20 mg AIBN,超声脱气10 min后,放入载体膜(Nylon-6),浸泡3 min后将该膜放在两块玻璃板之间,60℃下反应24 h,然后除去聚合膜中的模板分子,再用甲醇洗至中性,得到苯酚印迹复合膜MIM,将膜保存于甲醇中备用。非印迹聚合物(NIM)的制备,除不加印迹分子苯酚外,合成及处理方法与其相应的MIM一致。

1.3印迹聚合物的平衡吸附实验

分别称取各印迹聚合物(MIP1-9)和非印迹聚合物(NMIP1-9)20.0 mg于具塞的磨口锥形瓶中,加入10 mL的苯酚溶液(溶于聚合物的相应致孔溶剂中),在恒温振荡器中于室温下振荡5 h,然后过滤,在紫外-可见分光光度计上测定其吸光度,并计算聚合物的平衡吸附量Q和MIP相对于NMIP的印迹因子α[10,11,12]。

1.4印迹膜的渗透实验

将制备的印迹膜置于用塑料制作的且具有螺纹的接口固定于两个完全相同的70 mL的L型玻璃池中间,组成H型透过装置。膜传输横截面的有效直径为1.13 cm,用硅胶垫圈密封保证两池没有渗漏。一池中加入50 mL的含酚工业废水溶液(云南开远解化厂),另一池中加入50 mL纯甲醇,在搅拌器搅拌下每隔1 h取样,HPLC法测定底物中苯酚透过印迹膜的量。

2结果与讨论

2.1印迹聚合物制备条件的正交试验优化

非共价印迹聚合物的印迹程度取决于聚合体系中印迹分子与功能单体分子间的结合程度及聚合后所形成的网状空穴,这与聚合物合成的条件密切相关[13]。本实验通过正交试验设计合成了9个印迹聚合物(MIP1-9)及其相应的非印迹聚合物(NMIP1-9),并进行了平衡吸附实验,测得了各聚合物的平衡吸附量Q及印迹因子α,结果见表2。

*平衡吸收实验条件为:苯酚浓度6×10-4 mol/L,聚合物20.0 mg,吸附液溶剂为相应聚合物的致孔溶剂,总体积10 mL,温度25 ℃,吸附时间5 h。**MIP4为正交优化得到的最佳聚合物。

考虑到印迹因子和吸附量是衡量印迹聚合物性能的主要指标,因此,分别采用选择因子和吸附量为评价指标,用极差分析法对正交试验结果进行了分析,结果见表3和表4。

致孔溶剂不仅影响功能单体与模板分子间非共价键结合的强度,同时也影响到聚合物的形态、吸附性能、稳定性和膨胀性能。由实验结果可见,致孔溶剂种类是影响印迹聚合物印迹因子和吸附量的最主要因素。对于印迹因子而言,最佳的致孔溶剂是体积比为1∶1的氯仿乙腈混合溶剂;对于吸附量而言,最佳的致孔溶剂是氯仿。但以氯仿乙腈混合溶剂作为致孔溶剂时,聚合物的吸附量很小,仅约为其他溶剂体系的15%,而吸附容量过小将影响研究结果的应用价值和可行性。所以实验最终选择氯仿为致孔溶剂。

功能单体用量不足时,难于与印迹分子形成稳定的复合物,而当其用量过多时,则会在聚合物中形成大量的非特异性结合位点,从而降低聚合物的识别能力和选择性。实验结果表明,对于印迹聚合物的印迹因子与吸附量而言,最佳的功能单体用量都是4 mmol。实验选择了模板分子与功能单体的加入物质的量比为1∶4。

交联剂的用量将影响聚合物的网状结构,从而影响聚合物的吸附性能。交联剂用量对印迹因子的影响程度大于对吸附量的影响程度。考虑到在保证一定吸附量的基础上,以印迹聚合物印迹因子作为主要评价标准,因此选择了模板分子与交联剂的加入物质的量比为1∶30。

综上所述,优化得到的苯酚印迹聚合物MIP4具有相对较好的印迹因子和较大的吸附量,其制备条件为:选用2-VP为功能单体,以氯仿为致孔溶剂,模板分子与功能单体以及交联剂EGDMA的加入物质的量比为1∶4∶30。

2.2 MIP4的吸附特性

参照文献[10,11,12],采用Scatchard方程:Q/C=Qmax/Kd-Q/Kd分析研究了印迹聚合物MIP4与底物的结合特征。按照Scatchard方程,以Q/C对Q作图,得到Scatchard曲线,如图1。可见在整个范围内,聚合物的Scatchard曲线是非线性的,但是将曲线分为两部分后,每部分却有很好的线形关系,这表明在所研究的底物浓度范围内,聚合物主要形成特异性吸附和非特异性吸附两种不同的结合位点,这是大多数印迹聚合物的共同特点[10,11,12]。

平衡吸收实验条件为:聚合物20.0 mg,吸附液溶剂氯仿,总体积10 mL,温度25 ℃,吸附时间5 h。

将图1中的曲线分段按Scatchard方程进行线性拟合,相应的线性拟合方程分别为Q/C=8.71+308.46Q(浓度0.05～0.20 mmol/L,R=0.9873)和Q/C=0.125+0.4178Q(浓度0.20～1.60 mmol/L,R=0.9929)。根据Scatchard方程的斜率和截距分别求得其高亲和及低亲和结合位点的离解常数Kd分别为3.24×10-3 mol/L和2.39 mol/L,最大表观结合位点数Qmax分别为0.028 mg/g和0.30 mg/g。

为了研究印迹聚合物MIP4的吸附平衡时间,在0～6 h范围内研究了吸附平衡时间t对MIP4及NMIP4对苯酚的平衡吸附量Q的影响,得到了其吸附动力学曲线如图2所示。在前3 h内,印迹聚合物的吸附量迅速增加,此后吸附量增加渐缓,3 h后基本达到平衡,这是因为MIP中有大量由苯酚分子印迹所生成的孔穴,有利于苯酚分子从液相迁移到固相,因此吸附实验开始阶段呈现出很快的吸附速度,但随着时间的增加,模板分子的表面空穴被逐渐结合饱和,由于其要向MIP内部传质有一定的位阻,使吸附速度下降,从而吸附量增加渐缓至达到平衡。而NMIP4中没有与模板分子结构相对应的孔穴,因此其吸附作用主要存在非印迹聚合物表面的非特异性吸附,所以很快就达到吸附平衡。

平衡吸收实验条件为:苯酚浓度6×10-4 mol/L,聚合物20.0 mg,吸附液溶剂氯仿,总体积10 mL,温度25 ℃。

2.3MIM的渗透实验

MIM和NIM对含有苯酚的工业废水的渗透动力学实验表明:浑浊的含苯酚废水原液经MIM渗透后,透过液颜色明显变浅,说明大量非苯酚物质未能迅速透过膜,从HPLC图(图3)可见,透过液中苯酚的所占的比例明显上升,显示了一定分离富集苯酚的能力。其渗透动力学曲线与其印迹聚合物的吸附动力学曲线类似,MIM及NIM对苯酚的渗透通量都随着渗透时间的增加逐渐上升,但MIM的渗透通量大于NIM。这是因为非印迹膜中没有模板分子与功能单体形成的预结合体系参与合成,不存在利于苯酚分子通过的印迹通道。而印迹膜在模板分子与功能单体的预聚合作用的影响下,在载体膜表面及内部形成了规则而且与模板分子大小空间相匹配的印迹通道,这样就有助于模板分子渗透通过印迹膜,从而能有效地选择性透过模板分子,达到分离富集目标物的目的。实验结果表明,苯酚印迹复合膜具有从复杂体系中分离富集苯酚的潜能,具有一定的实际意义。

3结论