蛋白质印迹法（共6篇）
蛋白质印迹法 篇1
摘要：目的 侵袭转移是恶性肿瘤最重要的生物学行为之一,也是导致死亡率增加的主要原因,而肿瘤细胞发生转移的机制一直是研究的热点。研究旨在检测富含半胱氨酸61(Cyr61)蛋白和低氧诱导因子-1α(HIF-1α)蛋白在胃癌组织中的表达水平,探讨两者与胃癌侵袭转移的关系。方法 将标本分成3组,分别为49例胃癌组、49例配对的癌旁组(距癌2 cm)和49例配对的正常组(距癌5 cm以上),用免疫组织化学和蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测Cyr61和HIF-1α的蛋白表达水平,并分析两者与胃癌的临床病理特征的关系。结果 免疫组织化学检测显示Cyr61在胃癌细胞的胞浆中表达,HIF-1α在胃癌细胞的胞浆/胞核中表达。进一步用Western blot检测结果显示,胃癌中Cyr61蛋白的表达水平(0.2767±0.02200)高于癌旁组织(0.2145±0.02209)和正常组织(0.1055±0.02082),癌旁组织高于正常组织(均P<0.01);胃癌中HIF-1α蛋白的表达水平(0.2663±0.02682)高于癌旁组织(0.2120±0.04087)和正常组织(0.1008±0.03867)(均P<0.01),癌旁组织高于正常组织(P<0.01)。Cyr61和HIF-1α蛋白表达的增强与肿瘤的分化程度、淋巴转移及TNM分期相关(均P<0.05)。SPERMAN等级相关分析证明了Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白的表达呈明显正相关(r=0.411,P<0.05)。结论 Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白在胃癌组织中呈高表达,可能与胃癌的侵袭转移有关。联合检测Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白对指导胃癌临床及判断预后有重要价值。
关键词：胃肿瘤,富含半胱氨酸61,低氧诱导因子-1α,免疫组织化学,蛋白免疫印迹法
胃癌是常见的消化道肿瘤,其发病率仅次于肺癌,居第2位,大约65%的患者确诊时已经出现局部或远处转移[1]。因此对于侵袭与转移机制的研究一直是胃癌研究的重要课题。目前认为肿瘤的侵袭转移过程涉及多分子作用机制和信号传导通路。近年来研究发现,富含半胱氨酸61(cysteine rich61,Cyr61)可通过PI3K/mTOR和MAPK依赖的信号通路促进低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducing factor-1α,HIF-1α)蛋白合成增加,而且可诱导HIF-1α的HRE(hypoxia response element,低氧反应元件)依赖的转录活性,使HIF-1α调控的侵袭相关基因纤溶酶原激活因子抑制剂-1(plasminogen activator inhibitor,PAI-1)表达上调,从而促进胃癌细胞的侵袭性[2],但目前国内外有关Cyr 61和HIF-1α与胃癌的研究鲜见报道。本研究应用免疫组织化学和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测不同胃癌组织中Cyr 61和HIF-1α蛋白的表达,并分析其与临床病理参数之间的关系,旨在进一步明确两者与胃癌侵袭的关系,为胃癌的诊断和治疗提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 标本来源
取自青岛市市立医院普外科2008年10月~2009年12月手术切除的标本共49例,标本均经病理科两位以上的资深医师证实,术前均未接受任何化疗或放疗,且均进行了局部淋巴结的清扫。
49例标本分为3组,分别为原发性胃癌组,配对癌旁组(距离边缘2 cm)及配对的手术切缘正常组(距离边缘5 cm以上),将胃癌手术切除标本均分为两部分,一部分立刻固定10%的甲醛溶液中,包埋在石蜡中,以备病理检查用;一部分手术切除的标本立即放于-70℃冰箱中冻存用于Western blot检测。
1.2 主要试剂和仪器
RIPA裂解液(碧云天生物技术有限公司),Cyr61和HIF-1α兔多克隆抗体(武汉博士德公司)、β-actin兔多克隆抗体(武汉博士德公司)为一抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(武汉博士德公司)为第2抗体。
第2抗体试剂:EnVision试剂盒购于福州迈新生物技术开发公司。染色剂:二氨基联苯胺四盐酸盐(Diamino benzidine,DAB)购于福州迈新。
1.3 实验方法和主要步骤
1.3.1 免疫组织化学检测胃癌组织中Cyr61和HIF-1α的表达
采用EnVision两步法。主要步骤如下:石蜡切片常规脱蜡水化后,浸于0.01 mol/L枸橼酸溶液(pH为6.0),微波中火4 min进行抗原修复。操作严格按说明书进行,取已知阳性切片作为阳性对照,用PBS液代替第一抗体试剂作为阴性对照。
1.3.2 Western blot法检测Cyr61和HIF-1α蛋白的表达
用RIPA裂解液裂解组织(400μl RI-PA+4μl PMSF)提取细胞总蛋白,BCA法测定蛋白浓度,取50μg蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将电泳后的蛋白转移至PVDF膜,封闭液封闭(4℃过夜),分别用Cyr 61和HIF-1α兔多克隆抗体(1∶200)和β-actin兔多克隆抗体(1∶1 000)孵育,室温轻摇180 min后,再用TBS洗涤3次(10min/次)后,再分别用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1∶2 000)室温孵育120 min,TBS洗涤3次(15 min/次)后,最后X线片曝光、显影和定影后观察结果。
1.4 结果判断
1.4.1 免疫组织化学结果判断
CRY61阳性判断标准:以胞质呈棕黄色为阳性。免疫标志的阳性标准:无阳性细胞为阴性;阳性细胞<10%为弱阳性;阳性细胞10%~50%为阳性;阳性细胞≥50%为强阳性。HIF-1α参照ZHONG等[3]的方法,以细胞核或细胞质内呈棕黄色为阳性,高倍镜下(400倍)对每张切片随机选择5个视野,每个视野计数200个细胞,共计1 000个。0分:无着色;1分:<1%的细胞核着色;2分:1%~10%的细胞核着色和(或)胞质弱着色;3分:10%~50%的细胞核着色和(或)胞质明显着色;4分:>50%的细胞核着色和(或)胞质强着色。评分结果:0~1分定为阴性,2~4分定为阳性。
1.4.2 Western blot结果分析
应用BIO-RAD图像分析软件对Western blot杂交条带进行密度扫描,以Cyr61及HIF-1α条带灰度值与β-actin条带灰度值比值表示各组织中Cyr61及HIF-1α表达水平(灰度值为条带密度值及面积值的乘积,设空白对照相对密度值为0)。
1.5 统计学处理
应用SPSS 13.0统计软件,Cyr61蛋白及HIF-1α蛋白的表达以均数±标准差(x±s)表示。组间计量资料的比较采用t检验,计数资料的比较采用χ2检验。Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白在胃癌组织中表达的相关性用Spearman进行相关性检验分析。P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 免疫组织化学方法检测Cyr61和HIF-1α的表达
2.1.1 Cyr61在各组中表达水平的比较
Cyr 61在各组中的表达情况见图1及表1。图1显示Cyr 61在胃癌细胞的胞浆中呈阳性表达。由表1可见,Cyr61在胃癌中表达的阳性率(91.8%),高于癌旁组(75.5%)和正常组(49%),差异有显著性(χ2=4.780,P<0.05;χ2=21.598,P<0.01);癌旁组与正常组比较差异有显著性(χ2=7.338,P<0.01)。
注:1)与正常组比较,P<0.01;2)与正常组比较,P<0.01;3)与癌旁组比较,P<0.05
2.1.2 HIF-1α在各组中表达水平的比较
HIF-1α在各组中的表达情况见图2及表1。图2显示Cyr61在胃癌细胞的胞浆中呈阳性表达,由表1可见,HIF-1α在胃癌中表达的阳性率(83.17%),高于癌旁组(38.8%)和正常组(0%),差异有显著性(χ2=6.186,P<0.05;χ2=70.491,P<0.01),癌旁组的表达高于正常组(χ2=23.57,P<0.01)。
注:1)与正常组比较,P<0.01;2)与癌旁组比较,P<0.01
2.2 Western blot检测各组Cyr61和HIF-1α蛋白的表达
2.2.1 Cyr61蛋白在各组表达的比较
Cyr61蛋白在胃癌组、癌旁组及正常组的表达量分别为(0.2767±0.02200)、(0.2145±0.02209)和(0.1055±0.02082)。统计学分析显示3组间比较,差异有显著性(F=785.8,P<0.01)。癌组织组的表达明显高于癌旁组和正常组(t=14.618;t=38.957,P<0.01),癌旁组的表达明显高于正常组(t=23.962,P<0.01)(图3和表2)。
2.2.2 HIF-1α蛋白表达的比较
HIF-1α蛋白在胃癌组、癌旁组及正常组的表达量分别为(0.2663±0.02682)、(0.2120±0.04087)和(0.1008±0.03867)。统计学分析显示3组间比较,差异有显著性(F=269.3,P<0.01)。癌组织组的表达明显高于癌旁组和正常组(t=7.772;t=24.619,P<0.01),癌旁组的表达明显高于正常组(t=13.837,P<0.01)(图3和表2)。
2.3 胃癌中Cyr61和HIF-1α的表达及其与胃癌临床病理参数的关系
对49例胃癌患者按照性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分期进行分组,观察Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白在胃癌组织中的表达情况(表3)。由表3可见,Cyr61和HIF-1α蛋白的表达与胃癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及肿瘤分期密切相关,差异具有显著性(均P<0.05),与胃癌患者的性别、年龄及肿瘤大小无关,差异无显著性(P>0.05)。
2.4 胃癌组织中Cyr61和HIF-1α表达的相关性
Spearman相关性检验结果表明,在胃癌组织中,Cyr61蛋白表达与HIF-1α蛋白表达呈明显正相关(r=0.411,P<0.05)。
3 讨论
Cyr61是CCN(Cyr61/CTGF/NOV)蛋白家族成员之一。人类Cyr61基因定位于染色体Ip22.3,含有5个外显子和4个内含子,编码381个氨基酸的蛋白,其中38个为保守的半胱氨酸,Cyr61的相对分子量为42 kD。Cyr61由信号肽(signal peptide,SP)及4个保守结构域组成。Cyr61可调控内皮细胞和成纤维细胞的黏附、迁移与增殖,分泌细胞外基质、诱导血管生成,参与多种重要的生理、病理过程。在多种肿瘤的发生、发展过程中发挥着不同作用。研究发现,在不同的组织细胞及肿瘤中,Cyr61的表达水平不同,其功能也不同。如Cyr61在神经胶质瘤、骨肉瘤中高表达,促进肿瘤细胞的增殖和肿瘤组织血管形成[4,5]。而Cyr61在子宫内膜癌、子宫平滑肌瘤、前列腺癌中、非小细胞肺癌中低表达,起到类似抑癌基因的作用[4,5,6,7]。
目前有关Cyr61与胃癌的研究国内外罕见报道,均采用免疫组织化学方法检测,LIN等[7]用免疫组织化学方法对81例胃癌石蜡切片研究发现,Cyr61表达与胃癌肿瘤分期、淋巴结转移及组织学分型相关。在此基础上本研究联合Western blot技术检测了49例胃癌手术患者,发现Cyr61蛋白在胃癌组织中呈高表达,明显高于配对癌旁组织及配对的正常组织,差异有显著性。同时分析Cyr61与临床病理参数的关系发现,Cyr61蛋白的表达与胃癌的分化程度、淋巴结转移及TNM分期呈正相关。提示Cyr61可用于胃癌的检测及作为胃癌侵袭转移的判断指标。
低氧诱导因子-1是由HIF-1α及HIF-1β亚单位构成的异二聚体[8]。HIF-1α是其活性调节亚单位;HIF-1β在常氧和缺氧条件下均可表达,而HIF-1α在氧浓度正常时,其表达量维持在较低水平。在常氧条件下,88%的正常人体组织中不表达HIF-1α,而53%的恶性肿瘤组织中表达HIF-1α,在相应的良性肿瘤中没有检测到HIF-1α[9]。当周围环境的氧浓度下降时HIF-1α的转录、翻译水平呈指数增加,但主要是蛋白水平的表达改变[10]。ZHONG等[9]利用HIF-1α单克隆抗体检测了HIF-1α在多种肿瘤组织中的表达,发现90%的结肠癌、肺癌及前列腺癌组织中HIF-1α表达升高,而在肿瘤附近正常组织中则不表达。关于HIF-1α在胃癌组织中表达的研究报道甚少:TAKAHASHI等[11]研究发现HIF-1α与胃癌肿瘤大小及肝转移密切相关;CHEN等[12]研究发现HIF-1α的高表达与胃癌的复发及远处转移密切相关。
本研究采用免疫组织化学和Western blot技术检测了HIF-1α蛋白水平的表达,发现HIF-1α蛋白在胃癌组织中的表达高于配对癌旁组织及配对的正常组织,癌旁组织高于正常组织,差异均有显著性。同时分析HIF-1α与临床病理参数的关系发现,HIF-1α蛋白的表达与胃癌TNM分期、肿瘤浸润深度和淋巴结转移、细胞分化程度显著相关,而与患者年龄、性别、原发肿瘤大小无关。韩冰等[13]对96例胃癌患者研究发现,HIF-1α表达阳性的患者总生存率明显低于表达阴性的患者,提示HIF-1α在胃癌患者的预后中起着重要作用。本研究显示HIF-1α的表达与胃癌的进展、浸润、转移等恶性生物学行为密切相关。HIF-1α可作为评估胃癌发展、转移及预后的参考指标。
综上所述,本研究采用免疫组织化学和Western blot技术检测了Cyr61和HIF-1α在不同胃癌组织中的表达。同时Western blot技术具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测,以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。本研究结果证实了两者与肿瘤细胞的侵袭、转移密切相关。通过相关性检验进一步证实了两者的表达呈正相关。因此联合检测Cyr61蛋白和HIF-1α蛋白对胃癌的预防、诊断、治疗和预后判断有重要意义。
蛋白质印迹法 篇2
1 材料
固相pH值梯度(Immobilized pH gradient,IPG)干胶条(pH值为3～10,7 cm)、IPG缓冲液(pH值为3～10)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、二硫苏糖醇(DTT)、硫脲(Thioourea)、十二烷基硫酸钠(SDS)、超纯脲(Ultraurea)、四甲基乙二胺(TEMED)、丙基硫酸盐(CHAPS)、碘乙酰胺(Iodoacetamide)、蛋白酶抑制剂(Protease inhibitor cocktail)、脱氧核糖核酸酶(Dnase)和核糖核酸酶(Rnase)等,美国General Electric公司生产;低分子质量蛋白标准,天根生化科技(北京)有限公司生产;辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠IgG(HRP-IgG),北京索来宝生物技术有限公司生产;聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)及ECL化学发光试剂盒,武汉博士德生物技术有限公司生产;其余试剂均为国产分析纯。
2 方法
2.1 试验虫体的来源及虫卵悬液的制备
猪带绦虫成虫,采自口服槟榔-南瓜子驱虫的四川省雅江县呷拉乡猪带绦虫病患者,新鲜虫体用生理盐水浸泡保存。虫体孕节及头节用卡红染色,制作压片,用显微镜观察证实为猪带绦虫成虫。挑开猪带绦虫后段全部孕节的子宫,用生理盐水冲洗子宫数次使虫卵溢出,收集全部冲洗液,3 000 r/min离心 15 min,收集沉淀的虫卵。取1 mL虫卵悬液进行胆汁孵育试验,用台盼蓝染色计数六钩蚴法[3]检测虫卵存活率为80%。取虫卵悬液0.1 mL,光镜下计数虫卵(重复操作6次,取平均值),计算虫卵总数。用生理盐水稀释,使虫卵悬液浓度约为10万个/mL,其中存活的虫卵数约为8万个/mL。
2.2 试验动物的感染
选择20日龄、 体重为6.5～7 kg的三元杂交乳猪3头(由贵州大学农学院动物养殖中心提供),经粪检和间接血凝试验(IHA)证实无猪囊尾蚴及其他寄生虫感染,给每头猪灌胃1 mL虫卵(8万个/mL),喂给专用膨化颗粒饲料,隔离圈养于清洁水泥地面的舍内,防止自然感染。
2.3 猪囊尾蚴的采集
家猪感染猪带绦虫卵后第40天分别处死,小心剥离家猪肌肉内寄生的囊尾蚴, -80 ℃保存,备用。
2.4 猪囊尾蚴蛋白的制备
取猪囊尾蚴50 mg,用1 mL裂解液[含7 mol/L超纯脲、2 mol/L硫脲、4% 丙基硫酸盐、40 mmol/L二硫苏糖醇、2% pH 值为3～10的固相pH梯度缓冲液,临用前加1% 复合蛋白酶抑制剂]冰浴匀浆,分装于1.5 mL离心管,加20 μg/mL脱氧核糖核酸酶和5 μg/mL核糖核酸酶,4 ℃作用15 min;于4 ℃、40 000 g离心1 h;收集上清液,用双向电泳沉淀剂(2D clean-up)试剂盒处理,考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白浓度,分装,-80 ℃保存。
2.5 猪囊尾蚴蛋白的双向电泳分析
将猪囊尾蚴总蛋白溶液于4 ℃ 融化,8 000 g离心10 min;加入上样缓冲液(含7 mol/L超纯脲、2 mol/L 硫脲、2%丙基硫酸盐、65 mmol/L二硫苏糖醇、0.5% pH值为3～10的固相pH梯度缓冲液和痕量溴酚蓝),每胶条上样300 μg(体积为 125 μL),将2根IPG胶条(7 cm)分别置于溶胀槽中重泡胀至少12 h,再转入等电聚焦仪(型号为 Ettan IPGphorⅢ ,美国General Electric公司生产)进行第一向等电聚焦(依次为 250 V 40 min, 500 V 40 min, 4 000 V 3 h, 4 000 V 20 000 vh )。胶条经2次平衡后进行12% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),其中的一块胶为制备胶,另一块胶用于Western- blotting分析。制备胶经考马斯亮蓝染色,用扫描仪(型号为UNISCAN e100, 中国清华紫光股份有限公司)进行透射扫描,用双向电泳图像分析软件(ImageMaster 2D Platinum 5.0) 对图像进行强度校正、点检测、背景消减和点匹配等。用二维校正法确定蛋白质等电点(pI)和相对分子质量(Mr)。试验重复3次。
2.6 蛋白质印迹(Western- blotting)分析
采用半干转膜技术(参照TE77 PWR半干转仪器说明书)将双向电泳凝胶蛋白转至PVDF膜(PVDF膜与凝胶同样大小,1.0 mA/cm2 室温转移1.0 h)。用5%脱脂奶粉室温封闭2 h,用TBST[含20 mmol/L Tris·HCl(pH值为7.6),140 mmol/L NaCl和0.1% Tween-20]洗3次(每次10 min,下同)。试验组一抗为自制的大鼠抗猪带绦虫LDH血清[4](1∶100)、对照组一抗为正常大鼠血清(1∶100),室温孵育3 h;用TBST洗膜3次,二抗为羊抗大鼠HRP-IgG(1∶200)室温孵育2 h;用TBST洗膜3次,干燥1～2 min。在暗室将胶片剪成与PVDF膜同样大小,用ECL化学发光试剂盒(产品编号为EK1004,中国武汉博士德生物工程有限公司生产)将PVDF膜进行胶片曝光、显影、定影,流水冲洗,干燥,扫描并保存杂交图像。比较两组杂交蛋白点的差异,确定猪囊尾蚴LDH抗原抗体阳性杂交斑点。
3 结果
3.1 试验动物感染情况
感染后第40天剖杀仔猪,肉眼观察各脏器如肝脏、心脏、脑、舌、四肢及躯干肌肉内已有大量未成熟囊尾蚴寄生 ,而肾脏、脾脏未见到囊尾蚴寄生。
3.2 猪囊尾蚴蛋白双向电泳结果
3块制备胶经考马斯亮蓝染色后用扫描仪获取图像,再用双向电泳图像分析软件进行分析,结果表明:蛋白斑点数为(207±9)个,Mr为14 400～94 000 U,pI为3.0～10.0;其中(153±4)个蛋白斑点的 pI为4.0～7.0,在极酸性(pH值为3)和极碱性(pH值为10)区域也出现少量蛋白斑点(见图1)。
M.低分子质量蛋白标准;↓.标记的蛋白点为双向电泳与 蛋白质印迹比对后的对应点。
3.3 猪囊尾蚴LDH的Western-blotting分析结果
结果表明,猪囊尾蚴 LDH抗原抗体阳性杂交斑点为1个,阴性对照未见抗原抗体阳性杂交斑点(见图2)。将Western-blotting检测的抗原抗体阳性杂交斑点与原双向电泳凝胶斑点进行比对, 找到对应蛋白斑点,经ImageMaster 2D Platinum 5.0软件分析后初步确定该蛋白斑点的pI/Mr 为7.03/35 368,与猪带绦虫LDH的理论推导值(7.09/35 461)接近。
→.双向电泳与蛋白质印迹比对后的对应点。 A.大鼠抗猪带绦虫LDH血清分析;B.正常大鼠血清分析。
4 讨论
绝大多数体内寄生虫的能量主要来源于无氧糖酵解,绦虫的成虫通过糖酵解获得能量,而成虫缺乏消化道,靠体壁吸收营养物质包括糖原[1]。成虫体壁的皮层是其能量代谢的主要场所。虫体内含有的参与糖酵解的一系列酶类都有可能是潜在的药物作用的靶标。LDH是糖代谢过程中一个非常重要的酶, 在还原型辅酶Ⅰ/辅酶(NADH/NAD+)的辅助下催化丙酮酸还原为乳酸及乳酸氧化为丙酮酸的可逆反应。既往对于寄生虫LDH的诸多研究提示该分子在寄生虫病的疫苗研究或诊治等方面具有重要意义。血吸虫和华支睾吸虫LDH分子结构与功能的研究结果提示,LDH是一跨膜蛋白,是个有潜力的诊断或疫苗候选抗原及潜在的药物作用靶标[5,6]。对亚洲带绦虫成虫LDH基因的研究结果表明,TaLDH 重组蛋白定位于成虫表膜和虫卵的胚膜, 是有潜力的疫苗候选抗原或药物的靶分子[2],并推测猪带绦虫 LDH 可能在猪带绦虫成虫的表膜上分布较多,而分布在表膜的蛋白则有可能为药物的靶分子,或是诊断抗原的候选分子。
蛋白质双向电泳技术应用于带绦虫的研究报道[7,8,9]不多。本研究运用双向电泳技术获得猪囊尾蚴的总蛋白图谱,并用自制的大鼠抗猪带绦虫LDH血清作蛋白质印迹反应,得到1个特异性抗原抗体阳性杂交斑点,阴性对照未见特异性抗原抗体阳性杂交斑点。将Western-blotting检测的抗原抗体阳性杂交斑点与原双向电泳凝胶斑点比对后找到对应蛋白斑点,经ImageMaster 2D Platinum 5.0软件分析后初步确定该蛋白斑点的pI/Mr 为7.03/35 368,与猪带绦虫LDH的 pI/Mr理论推导值接近。本研究结果表明猪囊尾蚴表达LDH,这无疑对开发相关疫苗及可能的治疗靶分子、实现对寄生虫数量和分布的控制会起到积极作用。
参考文献
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蛋白质印迹法 篇3
1 资料与方法
1.1 对象
收集郑州大学第一附属医院2013年3月1日-2013年9月30日门诊和住院患者818例, 男182例, 女636例, 年龄在8~80岁, 平均 (42.4±17.3) 岁。按照临床诊断将病例分为SLE组与非SLE组, SLE组360例, 非SLE组458例, 包括类风湿关节炎 (RA) 128例、干燥综合征42例、皮肌炎55例, 显微镜下多血管病41例, 混合结缔组织病27例, 抗磷脂抗体综合征17例, 硬皮病10例, 风湿性多肌病9例, 其他疾病129例。SLE的诊断依据1997年美国风湿病学学会修订的SLE分类标准[2], 非SLE的各类疾病均符合相应的国际分类诊断标准。采集受试者肘静脉血, 离心分离血清, 当日完成检测。
1.2 试剂和仪器
1.2.1 试剂
抗核小体抗体Ig G试剂盒 (酶联免疫吸附法) 和抗核抗体谱 (Ig G) 试剂盒 (欧盟印迹法) 均为德国EUROIMMUN公司产品。
1.2.2 仪器
芬兰雷勃Multiskan MK3型号酶标仪, XD236自动蛋白印迹仪为上海迅达医疗仪器公司产品。
1.3 方法
1.3.1 ELISA法
采用德国EUROIMMUN公司生产的抗核小体抗体Ig G试剂盒 (酶联免疫吸附法) , 方法及步骤如下:已包被核小体的微孔板中加入1∶201稀释的血清100μL, 室温孵育30 min, 冲洗3次后加入100μL酶结合物, 室温孵育30 min, 冲洗3次后加入100μL底物显色剂, 室温避光孵育10 min后每孔加入100μL终止液, 在30 min内应用酶标仪450 nm比色, 检测A值。结果判定:以20RU/m L作为Cut-off值, 结果<20 RU/m L为阴性, 结果≥20 RU/m L为阳性。
1.3.2 Western blot法
采用德国EUROIMMUN公司生产的抗核抗体谱 (Ig G) 试剂盒 (欧盟印迹法) , 方法及步骤如下:患者样本用样本缓冲液1∶101稀释, 取所需膜条用1.5 m L样本缓冲液预处理5 min, 吸去孵育槽中的液体, 加入1.5 m L已稀释的血清样本, 在摇床上室温孵育30 min, 清洗3次, 每次5 min, 加入1.5 m L稀释的酶结合物室温孵育30 min, 再清洗3次, 每次5 min, 加入1.5 m L底物液室温孵育10min, 用蒸馏水清洗膜条3次, 每次1 min, 取出膜条风干后按照膜条上条带标记位置判读结果, 与非抗原包被区比较, 阳性反应将在相应的抗原处呈现深色条带, 抗原位置出现白色条带判读为阴性。
1.4 统计学分析
采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析。ELISA与WB检测Anu A的阳性率比较采用χ2检验, 两种方法诊断SLE的准确度比较采用χ2检验, 敏感性和特异性比较采用ROC曲线分析, 曲线下面积比较采用Z检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ELISA和Western blot两种方法检测结果
ELISA与WB检测818例患者Anu A阳性率分别为35.1% (287/818) 和31.1% (254/818) , 两者差异有统计学意义 (χ2=14.4, P<0.05, 见表1) 。两种方法检测Anu A结果的总一致率为91.3%, 其不一致情况以WB阴性而ELISA阳性多见 (6.4%) 。以SLE的临床诊断为金标准, 360例SLE患者中, ELISA与WB检测Anu A阳性率分别为72.5% (261/360) 和66.1% (238/360) , 两者差异有统计学意义 (χ2=9.13, P<0.05) ;两种方法检测SLE的准确度分别为84.7%和83.1%, 差异无统计学意义 (χ2=0.766, P>0.05) ;ELISA检测Anu A诊断SLE的敏感度为72.5%, 特异度为93.2%, WB检测敏感度为66.1%, 特异度为96.5% (见表2) , 两者ROC曲线下面积分别为0.840和0.813, 差异无统计学意义 (Z=1.23, P>0.05, 见附图) 。
2.3 ELISA和Western blot检测Anu A结果分析
818例患者中, ELISA共检测出287例Anu A阳性, 其中261例为SLE患者, 19例为非SLE自身免疫病患者, 7例为其他疾病患者;WB共检测出254例Anu A阳性, 其中238例为SLE患者, 7例为非SLE自身免疫病患者, 9例为其他疾病患者。
SLE组中, ELISA检测结果<20 RU/m L的99例患者中, 84例 (84.8%) WB检测结果为阴性, 15例 (15.2%) WB检测为弱阳性;ELISA检测结果为 (20~99) RU/m L的83例患者中, 38例 (45.8%) WB检测结果为阴性, 29例 (34.9%) WB检测结果为弱阳性, 16例 (19.3%) WB检测结果为阳性;ELISA检测结果>100 RU/m L的患者中, WB检测结果均为弱阳性和阳性, 以阳性者居多 (148/178, 83.1%) (见表3) 。非SLE组中, ELISA检测结果<20 RU/m L的432例患者中, 仅4例 (0.9%) WB检测结果为弱阳性, 其余428例 (99.1%) 患者WB检测结果均为阴性;ELISA检测结果为20~99 RU/m L的19例患者中, 13例 (68.4%) WB检测结果为阴性, 其余6例 (31.6%) 检测结果为弱阳性;ELISA检测结果>100 RU/m L的7例患者中, 6例 (85.7%) WB检测结果为阳性, 仅有1例 (14.3%) 患者ELISA检测值>200 RU/m L而WB检测结果为阴性。见表4。
3 讨论
系统性红斑狼疮是一种累及多系统、多脏器的自身免疫性疾病, 其特征是患者体内可产生多种针对细胞核结构和组分的自身抗体。Anu A是以核小体为靶抗原而产生的自身抗体, 属于自身抗体的一种。近年来研究显示, Anu A比抗ds DNA抗体和抗组蛋白抗体更早出现于系统性红斑狼疮的早期[3], 特异度较高, 并且Anu A与SLE疾病活动性及狼疮性肾炎 (LN) 的发生明显相关[4,5]。
目前检测Anu A的方法较多, 有化学发光免疫分析 (CLIA) 、WB、ELISA、间接免疫荧光法 (IIF) 、胶体金免疫层析法 (CGCIA) 和酶联免疫斑点法 (ELISPOT) 等。本研究针对以上检测方法, 选择了在临床工作中应用较多的ELISA法和WB法进行比较, 并结合临床诊断对两种方法进行对比分析, 客观评价二者的试验性能。WB用于体外定性检测血清或血浆中的人抗核小体的Ig G类抗体, 操作简便, 适合基层实验室开展。张国庆等[6]人应用免疫印迹法检测Anu A, 显示在SLE中阳性率达72.4%, 敏感度72.4%, 特异度达97.7%。ELISA用于在体外定量或半定量检测人血清或血浆中抗核小体Ig G类抗体。DOSTAL等[7]应用ELISA检测Anu A在SLE中的阳性率为73%, Anu A在SLE患者、狼疮性肾炎患者及神经精神性狼疮患者体内的浓度分别为为76 IU/m L, 139 IU/m L和117 IU/m L, 远高于其他自身免疫病患者及健康对照。SULEIMAN等[8]对90位SLE患者应用ELISA法进行检测, Anu A阳性率 (52.2%) 高于抗ds-DNA抗体阳性率 (36.7%) 。秦莉[9]等对ELISA法检测Anu A进行系统评价, 结果显示Anu A对SLE的诊断平均敏感度为64.9%, 平均特异度为92.6%, 提示其漏诊率高 (34.1%) , 误诊率较低 (7.4%) ;并推荐ELISA法检测Anu A用于SLE诊断, 但也表明该方法不适合用于SLE筛查。胡学芳等[10]人应用ELISA法检测122例SLE患者, 结果显示Anu A阳性率为68.85%, 敏感性为68.85%, 特异性为90.91%, 并且Anu A在SLE合并LN的患者中阳性率为84.48%, 提示Anu A与SLE的肾损害有明显关系。
本研究结果显示, ELISA检测Anu A阳性率 (35.1%) 高于WB (阳性率31.1%) , 两者差异有统计学意义 (P<0.05) , ELISA检测值较高时WB的灰度也较深, ELISA检测值较低时WB的灰度也较浅, 多为弱阳性。ELISA检测结果阳性而WB检测结果阴性时, ELISA检测值多在20~99 RU/m L之间, ELISA检测结果阴性而WB检测结果阳性时, WB检测结果均为弱阳性, 说明两种方法检测Anu A结果的总一致率较高, 符合性较好。
在SLE的诊断方面, 两种方法对SLE诊断的敏感性和特异性比较采用ROC曲线分析。ROC曲线即受试者工作特征曲线, 是反应敏感度和特异度连续变量的综合指标, 其曲线下面积越大, 诊断准确性越高, 可用于两种诊断方法的统计学比较。ELISA与WB诊断SLE的ROC曲线下面积分别为0.840和0.813, 提示两者对SLE的诊断准确性均较高, ELISA略高于WB, 但是两者差异无统计学意义 (P>0.05) 。ELISA检测SLE的敏感度为72.5%, 特异度为93.2%, WB检测SLE的敏感度为66.1%, 特异度为96.5%, 与国内外文献基本相符[6,7,8,9,10]。
因此, ELISA与WB检测Anu A的总一致率高, 对SLE诊断的准确度较高, 敏感度和特异度均较好。目前, 在我国风湿病实验室普遍采用WB进行抗核提取物抗体谱 (ENA) 的检测, 虽然WB与ELISA检测Anu A在SLE诊断中的准确度及ROC曲线下面积差异无统计学意义, 但是ELISA可以定量检测Anu A的浓度, 可以观察血清抗体的变化与临床和实验室指标的相关性, 对疾病的监测和指导更优于WB检测方法, 不过ELISA检测试剂价格高于WB, 在基层实验室的开展也有很大的局限性。因此, 应用WB进行Anu A检测的初筛, 需要时应用ELISA进行复检, 可以提高6.4%的Anu A检测阳性率, 为临床提供更好的SLE诊断及疾病活动度的信息。
摘要：目的 比较酶联免疫吸附法 (ELISA) 和免疫印迹法 (WB) 检测抗核小体抗体 (Anu A) 的差异, 为临床工作寻找合适的检测方法。方法 收集818例临床血标本, 其中系统性红斑狼疮 (SLE) 360例, 其他自身免疫性疾病458例, 同时采用ELISA和WB两种方法检测样本血清中Anu A, 计算每种方法的敏感度、特异度、ROC曲线, 并运用SPSS 17.0进行统计学分析。结果 ELISA与WB检测Anu A的阳性率分别为35.1%和31.1%, 两者差异有统计学意义 (P<0.05) 。准确度、敏感度和特异度无差异。结论 ELISA与WB检测Anu A的总一致率高, 对SLE诊断的准确度较高, 敏感度和特异度均较好。提示临床监测时, 可应用WB进行Anu A检测的初筛, 需要时应用ELISA进行复检, 可以提高6.4%的Anu A检测阳性率, 为临床提供更好的SLE诊断及疾病活动度的信息。
关键词：酶联免疫吸附法,免疫印迹法,抗核小体抗体
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蛋白质印迹法 篇4
关键词：绿原酸,分子印迹,沉淀聚合法,正交试验
由于分子印迹聚合物(MIPs)[1,2,3,4,5,6]在制备上的预定性、识别性上的专一性等优点,其在复杂混合物体系分离制备上的潜力十分被看好。但这方面上的研究,尤其是在中药化学成分分离纯化上的应用研究还很少。更未见到有绿原酸[7,8]的分子印迹聚合物的报道。因此,进行绿原酸分子印记聚合物的合成及静态吸附性质的研究具有很好的理论意义和应用潜力。本文采用正交试验结合得到了沉淀聚合方法合成绿原酸分子印迹聚合物的最佳工艺条件,并对绿原酸分子印迹聚合物的洗脱做了初步研究,达到预期效果。
1 试验试剂及仪器
绿原酸标准品(110753-200413),中国药品生物制品检定所提供;乙腈(AR),天津福晨化学试剂厂;EDMA(1-800-ACROS-01),New Jersey.USA;MAA(AR 500),成都科龙化工试剂厂;AIBN(AR),成都科龙化工试剂厂;甲醇(AR),重庆川东化工有限公司;乙酸(AR),重庆北碚化学试剂厂。
离心机(80-2台式低速),上海医疗器械厂;超声-微波萃取仪(CW-2000),新拓微波溶样测试技术有限公司;电子天平(MP5002),上海恒平科学仪器有限公司;数字显示显微熔点测定仪(X-6),北京泰克仪器有限公司;电子恒温水浴锅(DZKW-4),北京中兴伟业仪器有限公司;电子分析天平(AR1140),梅特勒-托利多仪器(上海)公司;真空干燥箱(D2F-6020A),北京中兴伟业仪器有限公司;紫外分光光度计(UV-1100),上海美谱达仪器有限公司。
2 沉淀聚合法合成绿原酸分子印迹物
2.1 正交实验选择最佳合成空白分子印迹聚合物的条件
2.1.1 配制溶液
取30.0 mL乙睛和5.0 mL甲醇配制混合溶剂,并以此溶剂作为聚合发应溶剂。取EDMA 3.96 g溶于10.0 mL混合溶液中,得到396 mg/mL EDMA溶液;取21.0 mg AIBN溶于5.0 mL混合溶液中,得到4.2 mg/mL AIBN溶液;取43.0 mg MAA溶于5.0 mL混合溶液中,得到86 mg/mL的MAA溶液。
2.1.2 MAA、EDMA与AIBN比例及温度对聚合反应的影响
MAA(A)、AIBN(B)与EDMA(C)是合成主要因素,它们的比例对合成效果的好坏有重要作用。因温度过高会导致绿原酸分解,而温度过低又会影响合成反应,实验温度设为因素D,因此将这些因素考虑起来设计因素实验。采用L9(34)正交表设计正交实验。
以实验号1为例,依次向玻璃管中加入0.10 mL MAA溶液、2.45 mL混合溶剂,混合均匀,放室温下预聚合5 h后,加入0.32 mL EDMA溶液、0.45 mL AIBN溶液,通氮气15 min,真空下密封,用混合均匀,置于50 ℃水浴中加热,并每隔30 min取出混匀,24 h后取出。将获得的粉末状印迹聚合物,离心分离后,加入乙酸～甲醇(5:1)溶液10 mL,用以抽提模板分子,振荡成悬浊液,超声分散30 min,离心分离后,取出上清液,再次加入乙酸的甲醇溶液,重复上述过程5次,最后,将离心分离得到的聚合物沉淀放入真空干燥器(45 ℃)中真空干燥48 h,得到所需的聚合物,称重。
2.1.3 实验结果及讨论
实验结果为1～9号试管都有白色粉末出现,5号和6号明显较多,2、3、4、7、8、9号试管虽然有产品但较少。3、4、8号试管内溶液因温度较高而成微黄色,产量也降低。综合来说6号产品最优,产量最高,说明当MAA:AIBN:EDMA=0.077:0.013:1(质量比)时聚合反应产生的白色粉末状固体,符合沉淀聚合反应要求,生成的是纳米级微球形沉淀而不是块状印迹聚合物,这种方法不需要在反应体系中另加入稳定剂,所以组分简单,易于操作,而且产品较多,得到的微球聚合物粒径均一且表面干净,不需进行研磨等费力的操作步骤,减少了由这些步骤引起的聚合物的损失,再根据极差分析最佳实验条件为A2B3C1D2,刚好为实验号6,因此应按此条件制备绿原酸分子印迹物。
2.2 绿原酸分子印迹物的制备及模板分子的洗脱
2.2.1 绿原酸分子印迹物的制备
依次向10 mL具塞玻璃管中加入5 mg绿原酸标准品、0.16 mL MAA溶液、2.45 mL混合溶剂,混合均匀,放室温下预聚合5 h 后,加入0.45 mL EDMA溶液、0.55 mL AIBN溶液,通氮气15 min,真空下密封,用混合均匀,置于60 ℃水浴中加热,并每隔30 min取出混匀,24 h后取出。将获得的粉末状印迹聚合物,离心分离后,加入乙酸～甲醇(5:1)溶液10.0 mL,用以抽提模板分子,振荡成悬浊液,超声分散30 min,离心分离后,取出上清液,再次加入乙酸的甲醇溶液,重复上述过程5次,最后,将离心分离得到的聚合物沉淀放入真空干燥器(45 ℃)中真空干燥48 h,得到所需的聚合物,称重。取出的上清液,以乙酸～甲醇(5:1)为参比,测定紫外吸收(326 nm)。
2.2.2 绿原酸印迹聚合物的洗脱次数与吸光度分析
绿原酸印迹聚合物称重为0.1642 g,由此可见按照最优条件制备是正确的。绿原酸印迹聚合物的洗脱次数与吸光度分析如表4。
由印迹聚合物的洗脱曲线看出,洗脱的前3次聚合物中都含有大量的绿原酸,说明印迹聚合物对绿原酸有吸附能力,洗脱至5次左右,绿原酸基本洗脱干净,证明此次实验效果较好。如图1。
3 结 论
本文用沉淀聚合的方法合成了分子印迹聚合物,采用因素设计和正交实验,结果表明MAA:AIBN:EDMA=0.077:0.013:1(质量比)在60 ℃下聚合得到白色粉末状固体。由印迹聚合物的洗脱曲线看出,洗脱的前3次聚合物中都含有大量的绿原酸,说明印迹聚合物对绿原酸有吸附能力。研究了沉淀聚合法制备绿原酸分子印记聚合物的合成基本条件,为绿原酸分子印记聚合物的制备和应用于绿原酸的提取制备及分析打下了基础。
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蛋白质印迹法 篇5
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
CHI630A型电化学工作站 (上海辰华仪器有限公司) ;三电极系统:分子印迹膜/玻碳电极为工作电极, 铂丝电极为对电极, 饱和甘汞电极 (SCE) 为参比电极;S-3500N扫描电子显微镜 (日本Hitachi公司) 。壳聚糖 (脱乙酰度≥90%) 购自德国Sigma Aldrich有限公司;敌百虫 (Trichlorfon, AR, 99%) 、Ru (NH3) 6Cl3 (Hexaammineruthenium (III) chloride AR, 99%) 均购自北京迪科马科技有限公司。1.7mmol/L Ru (NH3) 6Cl3的0.1mol/LKCl溶液为背景溶液。
1.2 壳聚糖分子印迹电化学传感器的制备
取一定量壳聚糖固体于稀盐酸溶液中超声30min溶解, 用NaOH溶液调节pH后, 逐滴加入已在饱和KCl溶液中阴离子化16h的敌百虫溶液, 搅拌配制成含敌百虫模版分子的质子化壳聚糖电化学沉积液。将三电极系统移入上述溶液中, 在-1.4V (vs.SCE下同) 下恒电位沉积2min, 用水淋洗, 再将电极浸于2.5%戊二醛溶液中, 20min后取出, 用水迅速淋洗。此电极于0.01mol/L KCl溶液中施加+0.7V电位处理三次, 每次3min, 以除去模板分子, 则制备成壳聚糖分子印迹电化学传感器。在相同条件下, 用不含敌百虫的电化学沉积液制备非印迹电极, 用作对照。
2 结果与讨论
2.1 分子印迹沉积层的形成
如下图所示, 电沉积过程中, 随着电沉积时间的增加, 电极表面沉积层厚度增加, 电极导电能力逐渐降低, 电流响应受到抑制, i-t曲线呈逐步下降趋势。图1a为电极在含阴离子化的敌百虫的壳聚糖溶液中以-1.4V恒电位沉积2min的i-t曲线, 图1b为不含模板分子的i～t曲线。a和b进行比较, 有无模板分子存在, i～t曲线均光滑趋于平缓, 无较大不同, 因此可以推断电沉积过程中, 无电化学活性的敌百虫分子结构没有发生改变, 从而保证了印迹电极识别位点的均匀性。
(a) 包含敌百虫的溶液; (b) 不包含敌百虫的溶液
以循环伏安法 (CV) 对印迹传感器进行表征以考察沉积层的结构, 结果随着扫描圈数的增大, 循环伏安曲线逐渐向外扩张, 至一定程度信号不再增大, 200圈时已经达到稳定不再变化, 且稳定信号与裸电极相比明显降低。表明电极表面形成了相对致密的Tri--CTS沉积层在电势差的驱动下, 探针分子逐步通过膜内三维结构形成的通道和识别孔穴到达玻碳电极表面, 发生还原氧化。而层内互补孔隙的数量是有限且一定的, 故最终电流信号达到稳定值。作为对照, 沉积后电极不经交联直接进行循环伏安扫描, CV图无逐步外扩的过程, 且信号变化与裸电极相比信号变化不明显, 说明沉积后, 经过低浓度戊二醛溶液较短时间的固定化交联, 沉积中聚合物分子可能在玻碳电极表面发生了重组至一个有序网状的空间结构状态的过程, 使膜变得更加致密均匀, 性能更好。
2.2 电位诱导洗脱模板分子
为了讨论施加一定电位对模版分子的影响, 本文测试了不同电位下, 模版分子的洗脱状况。实验表明, 负电压不能将模板分子洗脱, 可能是由于负电压下引发形成的聚合物对负电位稳定。正电位则可通过改变质子化壳聚糖与阴离子化敌百虫作用的微环境而降低两者之间的结合力, 迫使阴离子化的敌百虫从大分子壳聚糖内部离开。过低的正电位洗脱速度慢耗时长;过高电压则会使聚合膜与玻碳电极之间的结合受到损坏而导致膜脱离电极表面。而实验中于工作电极上施加+0.7V电压, 以洗脱模板分子效果最佳。结果表明处理3次每次3min后, CV图基本不再变化, 模板分子已基本洗脱完全。这可能是由于一定时间内+0.7V电压不足以破坏壳聚糖膜与玻碳电极之间结合性能的, 膜的性质不改变。改变印迹分子与基体之间的作用力后, 阴离子型的敌百虫分子与水结合的驱动力显著大于与质子化的壳聚糖, Tri-溶入水中从而实现了敌百虫模板分子的洗脱。壳聚糖基体中留下了阴离子化敌百虫模板分子的孔穴。阴离子化敌百虫响应后, 识别位点被部分占据, 氯化钌六胺络合物的传质过程受到一定程度的阻碍, 表现出氧化还原电流强度的相对减弱。各电极的表面状态可如图2SEM图表征, 交联并洗脱后电极表面较之于直接晾干或者交联未洗脱的的SEM图疏松。
3 结语
结合电化学手段和分子印迹技术, 制备了可用于敌百虫检测的分子印迹电化学传感器。通过对电极沉积电位、沉积时间、交联时间和洗脱方法等制备条件的考察, 制备出的电化学传感器对目标分子敌百虫电化学响应较好。并通过对电极电化学响应的研究, 初步探讨了电极制备和响应机理。
摘要：采用电位诱导法洗脱制备壳聚糖分子印迹电化学传感器, 洗脱效果良好。
关键词：电位诱导法,壳聚糖,分子印迹,电化学传感器
参考文献
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蛋白质印迹法 篇6
1资料与方法
1.1一般资料:选择2014年1~12月在本院的同时申请检测ANA和ANAs的门诊和住院患者6121例。其中男1020例,年龄18~75岁,女5101例,年龄14~86岁。
1.2 IIF检测ANA:采用德国欧蒙公司提供的ANA(马赛克)IIF试剂盒,商品号:FA1510-1005-1,每个反应区含2种抗原复合基质:HEP-2细胞和猴肝组织。以抗体滴度≥1∶100为阳性。
1.3 LIA检测ANAs:ANAs检测采用LIA法,检测试剂盒由深圳市亚辉龙生物科技有限公司提供,其试剂条含有17个测定项目:抗ds DNA、抗核小体抗体、抗组蛋白抗体(抗histones)、抗Sm D1、抗增殖性细胞核抗原抗体(抗PCNA)、抗核糖体P蛋白抗体(抗P0)、抗SSA/Ro52kd、抗SSA/Ro60kd、抗SSB/La、抗着丝点蛋白B抗体(Cenp B)、抗硬皮病70抗体(抗Scl-70)、抗U1-sn RNP、抗线粒体M2型抗体(抗AMA-M2)、抗J0-1、抗多发性肌炎/硬皮病抗体(抗PM-Sc1)、抗Mi-2、抗Ku。将血清1∶100稀释,严格按试剂说明书操作,肉眼判断反应结果。
1.4统计学分析:统计学分析采用SPSS19.0统计软件,率的比较采用χ2检验,以P<0.05为差别有统计学意义。
2结果
2.1对2014年6121例标本同时用IIF检测ANA和LIA检测17种自身抗体,发现有IIF检测ANA阳性1200例,占19.6%,阴性4921例,占80.4%,LIA检测ANAs阳性1659例,占21.1%,阴性4462例,占70.9%。其中IIF-ANA-/LIA-ANAs+的有1107例,不一致率为22.5%。IIF-ANA+/LIA-ANAs-的有124例,不一致率为10.3%。见表1。
2.2在1107份IIF-ANA-/LIA-ANAs+标本中,中阳性率最高的前五种自身抗体是SSA/Ro60kd、SSA/Ro52kd、抗Sm D1、抗SSB抗体、抗histones,阳性率为分别为29.62%、18.32%、10.20%、9.58%、8.61%,总占76.33%,其余的占23.67%。见表2。
3讨论
抗核抗体是以细胞成分为靶抗原的器官非特异性自身抗体的总称,以Hep-2细胞为抗原基质的间接免疫荧光法(IIF)被认为是ANA检测的“金标准”[2]。而随着靶抗原的纯化技术不断提高,不断涌现自动化程度较高、易于标准化的检测方法,其中LIA是近年来研究较多的一种检测方法。但在实际检测过程中,我们会发现IIF检测ANA与LIA检测ANAs的结果不一致,笔者通过对二者不同结果进行分析,试图阐述该类标本检测自身特异性抗体的临床意义。
在对2014年6121例标本同时用IIF检测ANA和LIA检测17种自身抗体中发现,IF-ANA-/LIA-ANAs+的有1107例,不一致率为22.5%。其中阳性率最高的前五种自身抗体是SSA/Ro60kd、SSA/Ro52kd、抗Sm D1、抗SSB抗体、抗histones,阳性率为分别为29.62%、18.32%、10.20%、9.58%、8.61%,总占76.33%,其余的占23.67%,结果与周仁芳等人的报道的以SSA为主要抗体一致[3]。分析原因可能是HEP-2细胞SSA的表达丰度低以及固定过程中抗核抗原出现弥散丢失。有文献报道,如选择转染Ro60c DNA的HEp-2000细胞基质可提高检测的灵敏度[4],另外其他抗体也有不同程度的漏检,笔者认为可能是:(1)IIF中HEp-2细胞为人源的细胞,部分表达的靶抗原含量低,且不均一,不同固定方法对特定抗原可能会丢失,故容易漏检,而LIA所包被的是来源于牛的胸腺和脾脏纯化抗原,含量高且固定,当标本抗体浓度低时,也可被检测(灵敏度高)。(2)方法学上IIF一般手工操作,且操作繁琐,滴度判断需系列稀释,荧光染色不稳定,荧光类型需肉眼判断,少见的特殊类型还需经验丰富专业技术人员鉴定等;而IIF可自动化,判读方便,重复性较好。
而IIF-ANA+/LIA-ANAs-的有124例,不一致率只为10.3%,表明以Hep-2细胞作为抗原基质的IIF法能检测出绝大多数自身抗体,是目前筛选ANA的理想实验。
综上所述,IIF-ANA与LIA-ANAs的检测有其互补性,二者不相互替代。IIF-ANA具有覆盖ANA抗体面广,同时即是筛查试验又是ANA检测金标准的特点,而LIA-ANAs有较高的检测敏感性和疾病特异性,故两种方法学间存在检测敏感性和特异性的差异。如果单用任何一种方法检测都有可能造成ANA阳性结果的漏检、漏报或AID的漏诊。因此,临床应用时,尤其对AID的早期诊断、鉴别和治疗,需联合进行IIF-ANA筛查和LIA-ANAs检测,减少漏诊或误诊。
参考文献
[1]Shoenfeld Y,Gershwin ME,Maroni PL,et a1.Auto antibodies[M].Second Edition.Netherlands,2007:29-32.
[2]Ghirardello A,Bendo R,Rampudda ME,et a1,Commercial blot assays in the diagnosis of systemic rheumatic diseases[J].Autoimmun Rev,2009,8(8):645-649.
[3]周仁芳,胡朝军,张蜀澜,等.抗核抗体筛查实验与特异性抗体确认实验相关性研究[J].中华检验医学杂志,2009,32(12):1344-1348.