蛋白质电泳（共9篇）
蛋白质电泳 篇1
摘要：双向电泳技术和质谱技术是蛋白质组学的两大核心技术。借助于大规模高通量分离和分析技术的迅猛发展, 蛋白质组学的相关技术也得到了迅速的发展。本文对蛋白质组学双向电泳技术和质谱技术及进展作了简要的综述。
关键词：蛋白质组学,双向电泳,质谱技术
随着后基因组时代的到来, 蛋白质组学应运而生。1994年澳大利亚Macquarie大学的科学家Marc Wilkins提出了蛋白质组 (Proteome) 的概念, “Proteome”是由“PROTEin”和“gen OME”两个词首尾拼接而成的一个新词, 指的是一个基因组编码的全部蛋白质[1]。这个概念一提出就得到学界的普遍认可, 蛋白质组学 (Proteomics) 也随之诞生, 即以蛋白质组为研究对象的研究领域, 从蛋白质组的水平进一步认识生命活动的机理和疾病发生的分子机制。蛋白质组研究是对基因组学局限性的重要补充, 它是对生物体在蛋白质水平定量、动态、整体性的研究。蛋白质组学研究的主要技术包括分离技术和鉴定技术。
1 蛋白质组分离技术
双向电泳技术是由OF'arrell等人于1975年建立。第一向为等电聚焦 (载体两性电解质p H梯度或固相p H梯度) , 根据蛋白质等电点的不同而分离;第二向为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) , 根据蛋白质亚基分子量的不同进行分离, 第一向等电聚焦完成后, 将凝胶包埋在SDS-PAGE凝胶板上端, 在垂直或水平方向进行SDS-PAGE第二次分离, 结果是形成了分离的蛋白质点[2,3], 所得蛋白质双维图谱中每个点代表样本中的一个或数个蛋白质, 而蛋白质的等电点、分子量和在样本中的含量也可显现出来[4]。
根据第一向等电聚焦条件的不同, 可将双向电泳分为三种系统:
1.1 第一种系统是ISO-DALT, 以O'Farrell技术为基础。
首先将载体两性电解质添加在丙烯酰胺凝胶中, 凝胶聚合后在电场作用下形成连续的p H值梯度, 两性电解质以游离的形式分布于聚丙烯酰胺凝胶的网孔中。其主要缺点是:蛋白质溶解性差, 上样量低, 负极部分碱性蛋白可能丢失;随着聚焦时间的延长, p H梯度不稳定, 易产生阴极漂移;两性电解质在凝胶中容易扩散, 因此分辨率较低;与第二向凝胶拼接困难, 重复性差, 不利于不同实验室间进行图谱比较。
1.2 第二种系统是固相p H梯度等电聚焦电泳 (IPG-DALT) , 发展于20世纪80年代早期。
如果第一向电泳使用丙烯酰胺和Immobilines共聚, 形成具p H梯度的凝胶, 即为IPG-DALT系统, 该系统p H梯度稳定, 不依赖于外加电场, 基本上克服了ISO-DALT的主要缺点, 具有高度的重复性[2]。目前可以精确制作线性、渐进性和S型曲线, 范围或宽或窄的p H梯度。p H3~p H5、p H6~p H11与p H4~p H7的IPG梯度凝胶联合使用可形成蛋白质组重叠群 (proteomic contigs) 从而有效分离蛋白质。
该方法的优势表现在: (1) p H梯度是由Immobiline共价结合到凝胶中, 在凝胶聚合时形成的, 因而不受脱水、泡胀、电场因素影响, p H梯度稳定, 聚焦准确, 精度高, 分离结果的重复性好, 并且有多种p H梯度范围的胶条可供选择; (2) 无阴极漂移及碱性蛋白丢失的现象; (3) 蛋白上样量大, 平衡时不易被洗脱, 易于转移到第二向胶。可以提高低丰度成分的分辨效果; (4) 样品中盐的干扰少, 无边缘效应。目前世界上越来越多的实验室选择IPG-DALT系统双向电泳技术。
1.3 第三种系统是非平衡p H梯度凝胶电泳 (NEPh GE) , 主要用于分离碱性蛋白质 (p H>7.
0) , 但是电泳展开时间相对比较短。如果
聚焦达到平衡状态, 碱性蛋白会离开凝胶基质而丢失。鉴于分辨率、重复性的限制和IPG-DALT分离碱性蛋白的优势, NEPh GE电泳已不是分离碱性蛋白的优选方法[5]。
2 蛋白质组鉴定技术
蛋白质组的鉴定技术主要有质谱技术、生物信息学、Edamn降解测序法、氨基酸组成性分析等技术。重点介绍质谱技术。基本原理是样品分子击碎为带电的原子或基团, 根据不同离子质荷比的差异来分离并确定其分子质量。常用的质谱分析技术主要有四种, 分别是:飞行时间质谱、四级杆质谱、离子阱质谱和傅立叶变换离子回旋共振质谱。而在蛋白质组学当中, 目前最常用的两种质谱为电喷雾质谱 (Electrospray Ionization Mass Spectrometry, ESI-MS) 和基质辅助激光解析电离质谱 (Matrix Assisted Laster Desorption Ionization Mass Spectrometry, MALDI-MS) 。
2.1 电喷雾质谱。
电喷雾质谱主要采用一种“软电离”的方式, 以液相形式上样, 液相的样品会流经一根极细的进样针, 由于进样针的喷雾口处有高电压, 流经此处的样品液滴在高压作用下会雾化为微小的带电液滴, 随着液滴逐渐被蒸发, 其表面积越来越小, 从而表面电荷的密度会越来越大, 当达到某一临界点时, 样品分子就会离子化, 并从液滴表面蒸发出来进入质量分析器。
2.2 基质辅助激光解析电离质谱。
基质辅助激光解析电离质谱的电离方式是由Karas等人在1988年提出的, 其基本原理是:将样品分子均匀地包埋在固体基质分子当中, 当用激光照射后, 基质就会通过吸收激光的能量而蒸发, 从而可以把一部分的能量传递给样品分子, 使得样品分子离子化。离子化后的样品先在一个加速电场中飞行, 获得动能, 之后再进入一个无电场的真空管道飞行, 由于离子飞行时间和质荷比的平方根成正比, 所以可以根据离子到达检测器的时间不同来确定分子的质量。
蛋白质组学研究具有非常重要的意义, 有助于人们最终从分子水平揭开生命活动的本质。其研究技术具有快速化、多样化、组合化、自动化的发展趋势, 将随着科学技术的进步而得到改进与提高, 如蛋白质芯片结合SELDI-MS等技术的应用, 蛋白组学必将进一步发展, 并在疾病的发病机制、诊断和治疗方面发挥重要作用。
参考文献
[1]Wilkins MR, Sanchez JC, Humphery-Smith I, et al.Progress withproteome projects:why all proteins expressed by a genome shouldbe identified and how to do it[J].Biotechnol Genet Eng Rev, 1996, 13:19-50.[1]Wilkins MR, Sanchez JC, Humphery-Smith I, et al.Progress withproteome projects:why all proteins expressed by a genome shouldbe identified and how to do it[J].Biotechnol Genet Eng Rev, 1996, 13:19-50.
[2]刘上峰, 傅俊江.双向电泳技术原理及其应用[J].国外医学.生理、病理科学与临床分册, 2002, 22 (2) :197-199.[2]刘上峰, 傅俊江.双向电泳技术原理及其应用[J].国外医学.生理、病理科学与临床分册, 2002, 22 (2) :197-199.
[3]李义良, 朱华清, 张红锋.双向电泳技术[J].生物学教学, 2004, 29 (4) :64.[3]李义良, 朱华清, 张红锋.双向电泳技术[J].生物学教学, 2004, 29 (4) :64.
[4]杜鹏.蛋白质组双向电泳技术研究进展[J].卫生研究, 2005, 34 (2) :238-239.[4]杜鹏.蛋白质组双向电泳技术研究进展[J].卫生研究, 2005, 34 (2) :238-239.
[5]张国庆, 廖杰, 于力方.双向电泳技术在蛋白质组研究中的应用[J].标记免疫分析与临床, 2003, 10 (3) :171-173.[5]张国庆, 廖杰, 于力方.双向电泳技术在蛋白质组研究中的应用[J].标记免疫分析与临床, 2003, 10 (3) :171-173.
蛋白质电泳 篇2
大鼠脊神经蛋白质组研究中双向电泳技术的建立
目的 探讨双向凝胶电泳技术在大鼠脊神经组织蛋白质组研究中的.应用.方法 应用高蛋白溶解度裂解液提取正常大鼠脊神经组织蛋白质,以固相pH梯度等电聚焦电泳和垂直板SDS-PAGE电泳结合的方法进行蛋白质的分离,使用银染和考马斯亮蓝两种方法分别对凝胶进行染色.结果 正常大鼠脊神经组织样品在18 cm pH 3～10非线性固相pH梯度干胶条,12.5%的Acr-Bis PAGE的胶上可分离到900个左右蛋白点,不同凝胶间蛋白点平均匹配率为80%.结论 实验所采用的高离液剂体系的裂解液,及对第一向和第二向电泳过程中各个因素及环节的把握,是获得大鼠脊神经组织蛋白质双向电泳图谱的关键.
作 者：韩晓敏 肖传国 李兵 陈朝晖 作者单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院泌尿外科,武汉,430022刊 名：华中科技大学学报(医学版) ISTIC PKU英文刊名：ACTA MEDICINAE UNIVERSITATIS SCIENTIAE ET TECHNOLOGIAE HUAZHONG年，卷(期)：35(4)分类号：Q5关键词：脊神经 蛋白质组 双向电泳
蛋白质电泳 篇3
关键词： 玉米种子；苏玉20；盐溶蛋白；SSR标记；纯度鉴定
中图分类号： S513.037 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）03-0072-02
盐溶蛋白电泳一直是种子企业鉴定玉米种子纯度的主要方法之一。该方法简单、便于操作，对技术人员和检验设备要求不高，一般的种子企业检验室都可开展该项工作，因此在实际检验工作中被广泛应用。包和平等利用玉米盐溶蛋白PAGE法和田间小区种植鉴定法对吉林省生产商应用的16个杂交玉米种子纯度进行测定，试验表明，同一样品种子纯度田间小区鉴定普遍高于蛋白PAGE法鉴定纯度值，纯度越高2种方法所测值偏差越小[1]。郭景伦等将玉米杂交种子纯度室内鉴定结果与田间种植鉴定结果进行了对比研究，结果表明，2种方法鉴定结果较吻合，一般相差在5.0%以内，并且玉米种子纯度越高，室内鉴定结果和田间鉴定结果相差越小；纯度越低，2个结果差异越大[2]。
但盐溶蛋白PAGE法有一定的局限性，有些品种双亲蛋白质水平上的差异较小，难以鉴定；鉴定大批量玉米种子纯度时，药品配制量大且步骤繁琐，有些试剂容易失效；另外盐溶蛋白的电泳谱带分辨率低，有时会出现误读或谱带难以辨别，因此对结果判定有一定的影响。近几年来随着SSR分子标记的发展和应用，表现其独特的优越性。孟庆长等以苏玉20杂交种及其亲本为材料，筛选出在苏玉20双亲之间多态性明显、重复性较好的4对引物bnlg1306、phi065、bnlg2291和umc1590用于苏玉20鉴定[3]。此标记特异性好，田间鉴定与利用SSR标记鉴定结果高度一致。本试验利用孟庆长等筛选的4对引物，结合盐溶蛋白电泳法对苏玉20种子纯度进行鉴定，并比较分析，验证2种试验结果的相关性，以便建立一套适应苏玉20品种纯度准确、快速鉴定的试验方法。
1 材料与方法
1.1 材料
苏玉20杂交种及其亲本苏951和苏651种子均由江苏明天种业科技有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 盐溶蛋白电泳法 参照NY/T 449—2001《玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法》。
1.2.2 SSR分子标记 切取少量胚乳，利用碱煮法[4]提取玉米基因组DNA。利用文献[3]中提供的4对引物（表1）用于苏玉20纯度鉴定，所用引物由上海英俊生物工程有限公司合成。PCR反应体系：DNA模板1.0 μL，Super Taq Mix 5.0 μL（上海浦迪生物科技有限公司），ddH2O 3.0 μL，上下游引物（2.0 μmol/L）各0.5 μL。PCR扩增程序为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR反应在BIO-RAD 5808R型PCR仪上进行。
PCR反应产物在30%的聚丙烯酰胺凝胶电泳（N，N-亚甲基二丙烯酰胺 ∶丙烯酰胺=1 ∶29）分离1.5 h后，经0.2% AgNO3银染后显色，拍照观察并记录。
2 结果与分析
2.1 盐溶蛋白及SSR分子标记电泳结果参照农业行业标准NY/T 449—2001《玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法》，将待检批次的苏玉20及其父、母本蛋白质上样，电泳并分析（图1）。结果表明：苏玉20及其亲本自交系间存在差异，且杂交种F1代和双亲谱带互补。图1中，有1个泳道的谱带呈偏母本型，可能是母本接受外来花粉造成的混杂，可以确定为非杂交种。这表明盐溶蛋白电泳可用于苏玉20品种纯度鉴定。
利用孟庆长等筛选出的4对引物[3]对苏玉20杂交种及亲本进行扩增，其中引物umc1590经PCR扩增后，F1代图谱出现3条互补带，因此不建议作为区分此品种的首选引物。而引物bnlg1306、phi065、bnlg2291经PCR扩增后父母本各为1条带，杂交种为双亲的2条互补带，可很好地区分（图2）。
2.2 2种方法的结果比较
对10个不同批次种子同时用2种方法进行对比（表2），研究发现，同一批次种子，蛋白电泳纯度数值比SSR分子标记数值高平均0.78百分点，差异范围在-0.8～3.1百分点。2种方法数值有一定的相关性，种子纯度越高，2种方法数值越接近，如果纯度越低，SSR分子标记数值相对越低。
为进一步验证筛选出的3对引物能否很好地鉴定品种纯度，每一粒种子经玉米单粒磨碎仪研磨后，取少许胚乳做DNA模板，对应的种胚做盐溶蛋白电泳。经比较，2种方法的纯度结果基本吻合（表3）。另外研究发现，152个检测样品，4个母本自交系种子在不同引物标记及蛋白电泳检测中表现均一致，而经phi065检测显示为父本的个体在其他方法中显示为F1代，经bnlg1306和蛋白电泳检测显示为杂株的个体在其他检测方法中显示为F1代。这种现象可能和玉米种子在不同发育时期蛋白表达不同有关。同时也说明在实际工作中，应结合该批种子是自交苗、回交苗、其他类型杂株还是遗传不稳定因素，根据实际情况，选择合适的引物对，对各单株检测结果进行综合判定，确定待测杂交种的纯度。
3 讨论与结论
刘宏魁等利用盐溶蛋白PAGE法和SSR分子标记对先玉335和泽玉11指纹图谱进行了分析，研究发现，盐溶蛋白法可大批量用于纯度检测，对于难以鉴定的品种可用SSR分子标记法作为辅助手段进行鉴定[5]。本试验以同一玉米种子为材料，提取不同取样部位的基因组DNA，利用SSR分子标记法和盐溶蛋白电泳法对苏玉20纯度进行了鉴定，结果表明2种方法均可区分亲本自交系和杂交种。这说明碱煮法适于苏玉20的提取，盐溶蛋白电泳法也可以用于此品种的纯度鉴定。
试验中利用3对SSR引物和蛋白电泳进行比较（表3），研究发现2种方法结果比较吻合。但各个引物的SSR标记图谱和蛋白电泳图谱个别个体表现并非一一对应，这正解释了SSR标记作为一种随机DNA标记，个体在不同引物间存在一定差异，而SSR 标记和盐溶蛋白法个体的差异表现正说明蛋白质电泳图谱易受种子（或幼苗）发育阶段及表达器官的影响，不够稳定从而影响了鉴定结果的准确性。这和赵久然的研究结果[6]是一致的。
参考文献：
[1]包和平，曹丽娟，杨 光. 用盐溶蛋白PAGE法检测杂交玉米种子纯度[J]. 中国种业，2006（6）：36-37.
[2]郭景伦，赵久然，王风格，等. 玉米杂交种纯度室内与田间鉴定结果比较研究[J]. 种子世界，2004（7）：22-24.
[3]孟庆长，陈艳萍，杨兴华，等. 利用SSR技术鉴定苏玉20的纯度[J]. 江苏农业学报，2009，25（3）：508-512.
[4]王建华，田宝华，杨丽维，等. 玉米单粒播种子质量评价与检测技术手册[M]. 北京：中国农业大学种子科学与技术研究中心，46-52.
[5]刘宏魁，闫洪朗，原亚萍. 应用盐溶蛋白电泳和SSR分子標记鉴定玉米种子纯度的研究[J]. 安徽农业科学，2011，39（19）：11396-11398.
[6]赵久然. 玉米种子真实性和品种纯度鉴定新方法[J]. 北京农业科学，1999（3）：25-40.
蛋白质电泳 篇4
1 样品提取
1.1 取样不具代表性:随机取样, 抽取霉烂、变质、虫蛀或病粒种子, 造成误检。
1.2 样品损失或污染:在样品粉碎时存在损失或粒间交叉污染。
1.3 提取不完全:
提取液加入后没有充分摇匀, 提取期间至少摇匀两次。样品提取时间不宜太长, 一般不超过4 h。
2 凝胶制备
2.1 粘板:玻璃板没有洗净、擦干, 造成粘板。
2.2 凝胶不匀:灌胶时没有充分摇匀且慢, 应迅速从一端灌入, 避免产生气泡和凝胶不匀。
2.3 胶面不平:封分离胶时动作要轻, 样品梳要插平, 拔出时要小心轻拔以免冲坏胶面, 造成胶面不平。
3 点样
3.1 取样量不准:取样量一般以15μL较好, 各槽加样量要一致。太多谱带不清, 太少可能丢失谱带。
3.2 样液污染:点样前没有清洗点样器。每点一样要清洗点样器二三次, 防止交叉污染。
4 电泳
4.1 电泳槽不通电:电板接反。一般阳离子电泳是正极接上槽 (短板) , 负极接下槽 (长板) 。
4.2 甲基绿指示剂不移动:
电压设定不合适, 应调节电压为500 V;也可能室内温度不适宜, 电泳温度一般在15～20℃下进行较好。
5 染色
5.1 粘板:取胶时粘板严重, 原因是玻璃板没洗干净或玻璃板需要更换。
5.2 染色速度慢:
可能原因是染色温度低, 正常染色温度可在室温进行, 若希望染色速度加快可适当提高温度。
6 谱带鉴定 (分析)
蛋白质电泳谱带的异常情况:大多数杂交种电泳谱带是一致的, 但有些杂交种个别籽粒会出现一些异常情况。
6.1 新谱带型出现。
某粒杂交种出现一条该杂交种所不具有的谱带 (这称为新谱带型) , 而其它谱带和该杂交种完全一致。此情况可能是由于制种时某些籽粒发生突变或自交系中有突变体造成的 (亲本是二环系或混合体的杂交种易出现) , 应按杂交种计算。
6.2 丢失某些谱带的现象。
杂交种中有多条互补带出现时, 其中某粒可能有一条谱带不出现互补而呈偏亲型谱带出现, 其它互补带仍然出现。我们认为该籽粒为杂交种, 只是杂交不完全或发生突变。
7 结果保存 (谱带保存)
7.1 湿法保存:保存时间短。应将凝胶板浸入7%乙酸溶液中, 放入塑料袋中, 可保存半年以上。
7.2 干法保存:
胶片不理想。制干胶片应将玻璃板充分洗净, 在其上面平铺一层已经甘油水溶液 (30%) 浸透的玻璃纸, 然后将胶片洗净, 放在玻璃纸上, 再盖上一层已经甘油水溶液浸透的玻璃纸, 四周压实, 贴上标签, 自然干躁或放烘箱中 (<40℃) 缓慢烘干。
蛋白质电泳 篇5
关键词：芋螺毒管,蛋白质组,双向电泳,条件优化
双向电泳(2-dimensiona gel electrophoresis,2-DE)是蛋白组学研究的经典技术,是目前惟一可在一块胶上同时分离成千上万个蛋白质组分的方法,通过双向电泳图谱可以对蛋白质的表达谱进行定性或定量分析,从整体水平研究和分析特定生理状态下蛋白质组成、表达水平与修饰状态,以及蛋白质-蛋白质相互作用,对于研究生物的生长发育、揭示疾病的发病机理等具有广阔的应用前景[1]。
肉食性海洋软体动物芋螺产生的毒液是富含具有生物活性小肽的宝库,每种芋螺毒液中有约2 000种不同的芋螺毒素。芋螺毒素化学结构新颖,展示出对于不同离子通道亚型极高的专一性结合能力,使之成为解开神经系统奥秘的强有力的工具和新药开发的新来源[2]。目前,利用2-DE技术对分泌毒素的蛇[3]、蜘蛛[4]、蝎子[5]等生物的蛋白质组学研究已做了大量工作,而利用该技术对芋螺的蛋白质组学研究还未见报道。
桶形芋螺主要分布于中国的南海,属于食虫类芋螺。食虫芋螺毒素对多种蠕虫有选择性的麻痹和致死作用,在多肽杀虫剂开发领域具有广阔的应用前景。本实验以海南产桶形芋螺毒管蛋白为研究对象,对其双向电泳的条件进行优化,以期获取分辨率高、重现性好的双向电泳图谱,为后续桶形芋螺毒管蛋白质组学研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料:
桶形芋螺(Conus betulinus Linnaeus)活体,从海南岛、西沙群岛沿海采集,液氮速冻后,-80℃保存。
1.1.2 试剂:
IPG(immobilized p H gradient)预制干胶条、3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸(CHAPS)、超纯脲等主要试剂购于美国Bio-Rad公司。其它试剂均为分析纯,购自宝生物工程(大连)有限公司。
1.1.3 仪器:
Bio-Rad公司固相p H梯度等电聚焦电泳仪、垂直板电泳仪等;Sonics超声波破碎仪;Alpha Imager 5500型凝胶成像系统等。
1.2 方法
1.2.1 毒管蛋白的提取
从-80℃冰箱取螺10只,解冻,取毒管,捣碎备用。采用3种方法提取毒管蛋白:1)乙腈提取法:取毒管1g,加入0.1%三氟乙酸(TFA)40%乙腈(ACN)溶液,冰浴下超声提取,离心10min,上清冷冻干燥后,所得蛋白干粉于-80℃保存。2)乙酸提取法:取毒管1g,加入6%乙酸溶液,超声波破碎,离心10min,上清冷冻干燥后,所得蛋白干粉,-80℃保存。3)TCA-丙酮沉淀法:取毒管1g,液氮研磨,加入预冷的10%TCA丙酮液,-20℃沉淀蛋白,冷冻干燥,得蛋白干粉,-80℃保存。
1.2.2 蛋白样品定量
取蛋白干粉10 mg,加0.5 m L裂解液,漩涡震荡后离心10min,取上清;采用Bradford法[6]对样品蛋白进行定量。
1.2.3 双向电泳
采用p H 3~10、17cm IPG胶条,参照Bio-Rad双向电泳实验指南进行。
1.2.4 染色及图像分析
电泳结束后迅速剥胶,进行银染,至蛋白点清晰为止。染色后的凝胶经过Alpha5500型凝胶成像系统拍照后保存图像,图像采用PDQuest 8.0软件进行分析。
2 结果与分析
2.1 毒管蛋白提取方法的优化
按照1.2.1中的3种方法分别提取毒管总蛋白,在条件一致的情况下进行双向电泳(上样量为1.0mg,聚焦70 000Vhr,第二向凝胶浓度采用18%),2-DE图谱见图1。从图1可以看出,TCA-丙酮沉淀法(图1-A)所得2-DE图谱,蛋白点没有有效分离,样品点多集中于凝胶的上部,横纹多;乙腈提取法(图1-C)所得2-DE图谱分离效果优于TCA-丙酮沉淀法,样品点分布较为均匀,但高丰度的蛋白点未完全分开;而乙酸提取法(图1-B)电泳图谱显示,蛋白点分离效果最好,所得蛋白点最多,约850个,清晰,横纹少。因此,对于桶形芋螺毒管蛋白双向电泳而言,蛋白样品的提取宜采用乙酸提取法。
2.2 上样量对双向电泳结果的影响
在上样量对双向电泳的影响实验中,毒管蛋白提取均采用乙酸提取法,上样量分别为0.375 mg、0.75mg,在条件一致的情况下进行蛋白质双向电泳(聚焦70 000Vhr,第二向凝胶浓度采用12.5%),实验结果见图2。从图2可以看出,当上样量为0.375mg时(图2-A),所得2-DE图谱蛋白点偏少,约610个;而当上样量为0.75 mg时(图2-B),所得2-DE图谱蛋白点增加明显,约980个,整个凝胶图上的大部分蛋白点分布较均匀,一些低丰度蛋白清晰可见。因此,上样量对芋螺毒管蛋白质双向电泳结果影响较大,当毒管蛋白上样量为0.75mg时,有利于获取完整的双向电泳图谱。
2.3 SDS-PAGE凝胶浓度对双向电泳结果的影响
在第二向SDS-PAGE中,重点比较凝胶浓度对双向电泳结果的影响。样品蛋白提取均采用乙酸提取法,上样量均为0.75mg,第一向IEF聚焦70 000Vhr,第二向凝胶浓度分别选取12.5%和15%进行双向电泳,实验结果见图3。
从图3可以看出,采用12.5%的凝胶浓度(图3-A)所得2-DE图谱,蛋白质Marker中的14.4kD的标准蛋白带已接近胶的前沿,提示低于14.4kD的蛋白点部分已跑出了凝胶;而采用15%的凝胶浓度(图3-B)所得2-DE图谱,14.4kD的标准蛋白带在胶中位置适中,低于14.4kD的蛋白点都清晰的显示在凝胶上。图3-B所得蛋白点较之图3-A所得蛋白点多,且分布均匀。因此,在桶形芋螺毒管蛋白双向电泳中,第二向SDS-PAGE凝胶浓度应选用15%。
3 讨论
蛋白质的提取是双向电泳中最关键的环节。芋螺毒管蛋白常用的提取方法是乙腈提取法和乙酸提取法[7,8]。LunaRamírez KS等[7]用乙腈提取法提取毒管粗毒用于后续RP-HPLC纯化,成功获取新颖的毒素肽;本实验结果显示,用该法提取的毒管蛋白进行2-DE结果并不理想;且该法所用试剂TFA和ACN毒性大,因此该法不适于双向电泳毒管蛋白的提取。Yuan DD等[8]采用乙酸提取毒管蛋白用于后续毒素肽HPLC分离,本实验结果显示该法用于双向电泳样品制备,操作简便,试剂便宜,且所得2-DE图谱清晰;因此适宜于毒管蛋白的提取。TCA-丙酮沉淀法较适宜于植物蛋白的提取[9],本实验中发现该法用于毒管蛋白提取耗时长,效果不理想。
上样量的高低直接影响蛋白点的分辨率。梁文裕等[10]对发菜蛋白质组双向电泳的研究表明,采用p H 4~7、24cm的IPG胶条,上样量为1.5mg,考染时得到清晰的2-DE图谱,而本实验证实采用p H 3~10、17cm的IPG胶条,上样量为0.75mg,银染时得到的2-DE图谱蛋白点多,低丰度蛋白清晰,完全满足进行蛋白质组分析的要求。因此,上样量的选择,要综合考虑实验材料、胶条长度、p H范围及染色方法等因素。
第二向SDS-PAGE凝胶浓度的选择,目前的研究多认为12.5%最合适[11]。本实验结果显示15%的凝胶浓度,可增加14.4kD以下低分子量区蛋白的分离效果,而芋螺毒液富含的芋螺毒素分子量多低于14.4kD。因此,在芋螺毒管蛋白双向电泳中,选择适宜的凝胶浓度,更好地分离这部分低分子量蛋白,就为新型毒素肽的分离和后续的质谱鉴定提供可能。
通过对IEF-SDS-PAGE条件的优化,建立了桶形芋螺毒管蛋白质组双向电泳技术体系。对于p H 3~10的IPG胶条,采用乙酸提取法提取毒管蛋白,上样量0.75 mg,聚焦70000Vhr,第二向SDS-PAGE凝胶浓度为15%的条件下进行双向电泳,所得2-DE图谱蛋白点约1 003个,蛋白点清晰,14.4kD以下低分子量区蛋白分离度好,分辨率高,重现性好,该优化条件用于其它芋螺毒管蛋白双向电泳分离也取得好的实验结果,为后续桶形芋螺毒管蛋白质组定量、定性分析打下了基础。
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蛋白质电泳 篇6
关键词：蛋白质组,可溶性蛋白,双向电泳,实验教学
随着时代技术的发展进步,大学实验教学也迎来了自身的变革,许多在以前看来较为复杂的实验技术,现在已经开始纳入本科实验教学的范畴。为了培养学生综合实验能力和创新能力,双向电泳(T w o Dimensional Electrophoresis,2-DE)技术作为蛋白质组学最基本最常用的实验技术引入了本科实验教学,丰富了本科生实验的内容,促进了高校实验教学体系的建设。
蛋白质组学是一种基因组所表达的全套蛋白质,是目前生命科学研究中的一个热点。2-DE技术作为蛋白质组学3大关键核心技术之一,包括蛋白质的提取、等电聚焦(Isoelectrofocusing,IEF)、SDS-PAGE和凝胶染色等步骤,它是唯一能同时将上千种蛋白质同时分离和展示的方法,也是目前分析复杂组份蛋白质分辨率最高的工具,是蛋白组学研究中主要的分离技术,为蛋白质的纯化、分离、鉴定提供可靠的保障。建立和完善各种组织细胞在不同生理、病理条件下的2-DE条件,是进行蛋白质组研究的前提。通过对大肠杆菌的可溶性蛋白进行2-DE分离,对电泳条件进行筛选和优化,将之成功地用于了本科实验教学中,同时也为其蛋白质组学的研究提供有益的参考资料,为差异性表达蛋白的筛选、克隆和功能研究奠定基础。
一、实验材料与实验方法
1. 实验材料
主要试剂包括两性电解质B i o-l y t e3-10、等电聚焦胶条(7cm,pH3-10)(Bio-rad)、低熔点琼脂糖,其他试剂均为分析纯。
主要仪器包括Bio-rad双向电泳仪、垂直板电泳槽和Bio-rad PDQest分析软件。
2. 实验方法
(1)提取可溶性蛋白
37℃,180r p m培养大肠杆菌B L21D E3过夜,6000r p m离心15m i n,收集菌体沉淀,超纯水快速冲洗菌体沉淀,用裂解液(8M尿素、4%CHAPS、2%BioLyte、40mM DTT)裂解,室温放置20min,超生破碎(功率1200W,超声2秒,间隔10秒,超声40次),12000rpm离心20min,收集上清,透析与超滤浓缩,Bradford法测定蛋白质浓度大约10mg/ml,-20℃冰箱保存备用。
(2)样品处理
将蛋白质样品100µl与400µl水化上样缓冲液(8M尿素、4%CHAPS、65mM DTT、0.2%(w/v)Bio-Lyte、0.001%溴酚蓝)混合,上样体积150µl,上样量为300µg。
(3)IEF电泳
从-20℃冰箱取出冷冻保存的IPG(Immobilized PH Gradient、7cm,pH 3-10)预制胶条于室温放置10分钟。沿着水化盘中槽的边缘至左而右加入样品。当所有的蛋白质样品都已经加入到水化盘中后,用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层。分清胶条的正负极,轻轻地将I P G胶条胶面朝下置于水化盘中样品溶液上,使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极。确保胶条与电极紧密接触。在每根胶条上覆盖2-3m l矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发。对好正、负极,盖上盖子。设置等电聚焦程序如下。
水化50V 12小时(17℃)主动水化
S1 250V线性30分钟除盐
S2 500V快速30分钟除盐
S3 4000V线性3小时升压
S4 4000V快速20,000伏小时聚焦
S5 500V快速任意时间保持
选择所放置的胶条数。
设置每根胶条的极限电流。(30-50μA/根)
设置等电聚焦时的温度。(17℃)
等点聚焦结束后,取出胶条,立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳,否则将胶条置于样品水化盘中,-20℃冰箱保存。
(4)平衡
电泳完毕后取出胶条,用M i l l i Q水浸湿的滤纸轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品,将胶条置于平衡缓冲液I(37.5mM Tris-HCl pH8.8、20%甘油、6M尿素、2%S D S、2%D T T)中,水平摇床上缓慢摇晃15m i n。第一次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用滤纸吸取多余的平衡液。再加入胶条平衡缓冲液II(37.5mM TrisHCl pH8.8、20%甘油、6M尿素、2%SDS、2.5%碘乙酰胺),继续在水平摇床上缓慢摇晃15min。
(5)第二向SDS-PAGE垂直板电泳
主要根据蛋白质的分子量分离蛋白质。浓缩胶浓度为4%,分离胶浓度为12%。将已平衡好的一向胶条置于二向凝胶的上端,用低熔点琼脂糖封胶液(0.5%低熔点琼脂糖、25m M Tris、192mM甘氨酸、0.1%SDS、0.001%溴酚蓝)封固胶条。低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后,将凝胶转移至电泳槽中,加入电泳缓冲液(25mM Tris、192mM甘氨酸、0.1%SDS),电泳5mA/g e l/7c m,待样品完全走出I P G胶条,浓缩成一条线后,调至电流20-30mA/gel/7cm,待溴酚蓝指示剂达到凝胶底部边缘时停止电泳。
(6)染色与实验结果分析
电泳完毕后的凝胶进行考马斯亮蓝G250染色、脱色,扫描图像,应用PDQest软件分析电泳结果。
二、结果与讨论
1. 结果
我们对大肠杆菌可溶性蛋白采用不同条件进行2-D E,优化电泳条件,获得了比较满意的电泳图谱(见图1)。应用PDQest软件初步分析,蛋白质上样量为300µg,pI3~10时,对7cm线性胶条进行蛋白点检测,获得80多个蛋白质斑点,由图1可知B L21菌种蛋白质集中在pI值3.5~7.20。
在相同实验条件及参数设置情况下,4个本科生班级的学生2-DE实验结果图谱非常相近,图谱的重复性较好。
2. 讨论
本实验以B L21大肠杆菌总蛋白为研究对象进行2-DE分析,并对实验过程中样品制备、电泳条件等进行了筛选和优化。
(1)样品制备
样品制备和溶解是2-DE最为关键的问题。对不同类型的蛋白质进行样品制备时需要采用不同的方法和条件,如果样品制备过程出现问题将直接影响2-DE的结果与分析。首先样品提取过程中应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性,因此在蛋白的制备过程中应选择合适的增溶试剂、表面活性剂和还原剂。其次要注意尽量避免核酸、多糖、盐类、脂类等分子对蛋白质的干扰,同时应加入适当的蛋白酶抑制剂等。蛋白质容易受温度所影响,所以样品制备过程应在低温下进行,以免造成蛋白质的降解,同时防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀,保证蛋白质样品与第一向电泳的相容性。在整个电泳过程中,要始终保持蛋白质的溶解状态。有效的可重复的样品制备方法是双向电泳成功的关键。我们经过反复试验,最后所用到的细胞裂解液配方和超声破碎的方法使蛋白可以更好的释放和溶解,但是由于破碎过程可能产生热量,所以要注意对破碎功率的控制,同时要使破碎过程处于冰浴环境中。
(2)上样量
上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些,这样每个点才有足够的量被检测到。一般的全细胞裂解体系,上样量大概在100µg(银染)到500µg(考染)之间。本次实验我们的上样量为300µg,结果中的蛋白点较清晰,可辨别的点也很多,达到了较满意的效果。如果样品蛋白浓度很低,就需要进行浓缩。浓缩的方法很多,大致有超滤法,沉淀法和透析法。超滤比较温和,对蛋白质不会有修饰和改变,蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量可能会减少。另外超滤对样品的要求比较高。甘油,去垢剂都会堵塞滤膜,影响超滤的效果。沉淀法比较快速,容易操作,对盐,甘油,去垢剂的耐受性好。缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来。我们采用了透析法和超滤法联用,先把样品透析到一个比较干净的环境,再进行超滤,既浓缩了样品,又起到脱盐的目的。
(3)不同聚焦时间对2-DE结果的影响
2-DE运行参数的选择直接影响2-DE图谱的质量,选择不适合的电泳参数会导致双向电泳图谱上出现横向或纵向条纹、蛋白点的拖尾及不规则的蛋白质点,使几个蛋白点连在一起或成线状,导致蛋白点的等电点难以确定,因此2-DE参数至关重要。理论上讲,要获得最好的图谱质量和重复性所需最佳时间是I E F分离达到稳定态所需的时间。如果聚焦时间短,容易在靠近阳极端的胶条上产生蛋白沉淀,在第二向电泳后的凝胶上形成纵条纹;如果等电聚焦不完全,在凝胶上容易产生水平条纹。过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移,但会因为活性水转运而导致过多水在I P G胶表面渗出(电渗)而造成蛋白图谱变形,在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失,影响电泳结果,因此最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。经过反复实验发现采用电压4000伏(7cm胶条)、20000伏小时效果较好。由于我们的样品中含盐量较少,选用线性升压,节省了聚焦时间。实验中还发现在聚焦盘的两端电极处搭上盐桥(帮助除盐)和选择适宜的总伏时等参数可以有效地减少2-DE凝胶中常见的横、纵纹现象。
(4)关于染色
目前实验室最常用的显色方法是考马斯亮蓝染色和银染。其中考马斯亮蓝染色灵敏度较低,但价格低廉、易于操作、无毒性、重复性好。银染法是非放射性染色方法中最灵敏的,灵敏度比考马斯亮蓝染色高100倍,但银离子对质谱仪干扰严重,脱银的方法复杂,不易于掌握,所以银染一般用于分析。我们在上样量相同的情况下,分别进行了考马斯亮蓝染色与银染,结果表明,银染比考马斯亮蓝染色检测到相对较多的点,但由于银染过程较为繁琐、重复性较差,而且银染的图像背景较为模糊,可能会对软件分析造成影响,在实验过程中要尽量避免人为的因素,所以从教学的角度综合考虑,在学生实验中选用了考染,得到的结果也较清晰。
三、结束语
目前2-DE是蛋白质组学研究的主要技术,这项技术本身仍然存在着局限性,如对于低表达量蛋白、膜蛋白的分离还较为困难等。研究建立了大肠杆菌可溶性蛋白质2-DE技术,获得了分辨度高、重复性可靠的双向电泳图谱,在完成了可溶性蛋白质组的分离、分析与鉴定后,可以进一步进行细胞核蛋白及各个细胞器蛋白2-DE条件的摸索,一方面有望分离鉴定出更多的新蛋白、新基因,完善大肠杆菌细胞蛋白质组,另一方面可以充分调动学生的积极性,培养学生的创新精神和实践能力。这也是教师在教学过程中不断探索的动力和源泉。
总之,在本科实验教学中,双向电泳技术作为一门新引入的实验技术为培养创新人才提供了更高、更广的教学平台,而且有利于促进教师自身知识、能力的提高,促进学校整体教学水平的提高,促进实验室建设的发展。
参考文献
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蛋白质电泳 篇7
1 材料
固相pH值梯度(Immobilized pH gradient,IPG)干胶条(pH值为3～10,7 cm)、IPG缓冲液(pH值为3～10)、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、二硫苏糖醇(DTT)、硫脲(Thioourea)、十二烷基硫酸钠(SDS)、超纯脲(Ultraurea)、四甲基乙二胺(TEMED)、丙基硫酸盐(CHAPS)、碘乙酰胺(Iodoacetamide)、蛋白酶抑制剂(Protease inhibitor cocktail)、脱氧核糖核酸酶(Dnase)和核糖核酸酶(Rnase)等,美国General Electric公司生产;低分子质量蛋白标准,天根生化科技(北京)有限公司生产;辣根过氧化物酶标记的羊抗大鼠IgG(HRP-IgG),北京索来宝生物技术有限公司生产;聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)及ECL化学发光试剂盒,武汉博士德生物技术有限公司生产;其余试剂均为国产分析纯。
2 方法
2.1 试验虫体的来源及虫卵悬液的制备
猪带绦虫成虫,采自口服槟榔-南瓜子驱虫的四川省雅江县呷拉乡猪带绦虫病患者,新鲜虫体用生理盐水浸泡保存。虫体孕节及头节用卡红染色,制作压片,用显微镜观察证实为猪带绦虫成虫。挑开猪带绦虫后段全部孕节的子宫,用生理盐水冲洗子宫数次使虫卵溢出,收集全部冲洗液,3 000 r/min离心 15 min,收集沉淀的虫卵。取1 mL虫卵悬液进行胆汁孵育试验,用台盼蓝染色计数六钩蚴法[3]检测虫卵存活率为80%。取虫卵悬液0.1 mL,光镜下计数虫卵(重复操作6次,取平均值),计算虫卵总数。用生理盐水稀释,使虫卵悬液浓度约为10万个/mL,其中存活的虫卵数约为8万个/mL。
2.2 试验动物的感染
选择20日龄、 体重为6.5～7 kg的三元杂交乳猪3头(由贵州大学农学院动物养殖中心提供),经粪检和间接血凝试验(IHA)证实无猪囊尾蚴及其他寄生虫感染,给每头猪灌胃1 mL虫卵(8万个/mL),喂给专用膨化颗粒饲料,隔离圈养于清洁水泥地面的舍内,防止自然感染。
2.3 猪囊尾蚴的采集
家猪感染猪带绦虫卵后第40天分别处死,小心剥离家猪肌肉内寄生的囊尾蚴, -80 ℃保存,备用。
2.4 猪囊尾蚴蛋白的制备
取猪囊尾蚴50 mg,用1 mL裂解液[含7 mol/L超纯脲、2 mol/L硫脲、4% 丙基硫酸盐、40 mmol/L二硫苏糖醇、2% pH 值为3～10的固相pH梯度缓冲液,临用前加1% 复合蛋白酶抑制剂]冰浴匀浆,分装于1.5 mL离心管,加20 μg/mL脱氧核糖核酸酶和5 μg/mL核糖核酸酶,4 ℃作用15 min;于4 ℃、40 000 g离心1 h;收集上清液,用双向电泳沉淀剂(2D clean-up)试剂盒处理,考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白浓度,分装,-80 ℃保存。
2.5 猪囊尾蚴蛋白的双向电泳分析
将猪囊尾蚴总蛋白溶液于4 ℃ 融化,8 000 g离心10 min;加入上样缓冲液(含7 mol/L超纯脲、2 mol/L 硫脲、2%丙基硫酸盐、65 mmol/L二硫苏糖醇、0.5% pH值为3～10的固相pH梯度缓冲液和痕量溴酚蓝),每胶条上样300 μg(体积为 125 μL),将2根IPG胶条(7 cm)分别置于溶胀槽中重泡胀至少12 h,再转入等电聚焦仪(型号为 Ettan IPGphorⅢ ,美国General Electric公司生产)进行第一向等电聚焦(依次为 250 V 40 min, 500 V 40 min, 4 000 V 3 h, 4 000 V 20 000 vh )。胶条经2次平衡后进行12% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),其中的一块胶为制备胶,另一块胶用于Western- blotting分析。制备胶经考马斯亮蓝染色,用扫描仪(型号为UNISCAN e100, 中国清华紫光股份有限公司)进行透射扫描,用双向电泳图像分析软件(ImageMaster 2D Platinum 5.0) 对图像进行强度校正、点检测、背景消减和点匹配等。用二维校正法确定蛋白质等电点(pI)和相对分子质量(Mr)。试验重复3次。
2.6 蛋白质印迹(Western- blotting)分析
采用半干转膜技术(参照TE77 PWR半干转仪器说明书)将双向电泳凝胶蛋白转至PVDF膜(PVDF膜与凝胶同样大小,1.0 mA/cm2 室温转移1.0 h)。用5%脱脂奶粉室温封闭2 h,用TBST[含20 mmol/L Tris·HCl(pH值为7.6),140 mmol/L NaCl和0.1% Tween-20]洗3次(每次10 min,下同)。试验组一抗为自制的大鼠抗猪带绦虫LDH血清[4](1∶100)、对照组一抗为正常大鼠血清(1∶100),室温孵育3 h;用TBST洗膜3次,二抗为羊抗大鼠HRP-IgG(1∶200)室温孵育2 h;用TBST洗膜3次,干燥1～2 min。在暗室将胶片剪成与PVDF膜同样大小,用ECL化学发光试剂盒(产品编号为EK1004,中国武汉博士德生物工程有限公司生产)将PVDF膜进行胶片曝光、显影、定影,流水冲洗,干燥,扫描并保存杂交图像。比较两组杂交蛋白点的差异,确定猪囊尾蚴LDH抗原抗体阳性杂交斑点。
3 结果
3.1 试验动物感染情况
感染后第40天剖杀仔猪,肉眼观察各脏器如肝脏、心脏、脑、舌、四肢及躯干肌肉内已有大量未成熟囊尾蚴寄生 ,而肾脏、脾脏未见到囊尾蚴寄生。
3.2 猪囊尾蚴蛋白双向电泳结果
3块制备胶经考马斯亮蓝染色后用扫描仪获取图像,再用双向电泳图像分析软件进行分析,结果表明:蛋白斑点数为(207±9)个,Mr为14 400～94 000 U,pI为3.0～10.0;其中(153±4)个蛋白斑点的 pI为4.0～7.0,在极酸性(pH值为3)和极碱性(pH值为10)区域也出现少量蛋白斑点(见图1)。
M.低分子质量蛋白标准;↓.标记的蛋白点为双向电泳与 蛋白质印迹比对后的对应点。
3.3 猪囊尾蚴LDH的Western-blotting分析结果
结果表明,猪囊尾蚴 LDH抗原抗体阳性杂交斑点为1个,阴性对照未见抗原抗体阳性杂交斑点(见图2)。将Western-blotting检测的抗原抗体阳性杂交斑点与原双向电泳凝胶斑点进行比对, 找到对应蛋白斑点,经ImageMaster 2D Platinum 5.0软件分析后初步确定该蛋白斑点的pI/Mr 为7.03/35 368,与猪带绦虫LDH的理论推导值(7.09/35 461)接近。
→.双向电泳与蛋白质印迹比对后的对应点。 A.大鼠抗猪带绦虫LDH血清分析;B.正常大鼠血清分析。
4 讨论
绝大多数体内寄生虫的能量主要来源于无氧糖酵解,绦虫的成虫通过糖酵解获得能量,而成虫缺乏消化道,靠体壁吸收营养物质包括糖原[1]。成虫体壁的皮层是其能量代谢的主要场所。虫体内含有的参与糖酵解的一系列酶类都有可能是潜在的药物作用的靶标。LDH是糖代谢过程中一个非常重要的酶, 在还原型辅酶Ⅰ/辅酶(NADH/NAD+)的辅助下催化丙酮酸还原为乳酸及乳酸氧化为丙酮酸的可逆反应。既往对于寄生虫LDH的诸多研究提示该分子在寄生虫病的疫苗研究或诊治等方面具有重要意义。血吸虫和华支睾吸虫LDH分子结构与功能的研究结果提示,LDH是一跨膜蛋白,是个有潜力的诊断或疫苗候选抗原及潜在的药物作用靶标[5,6]。对亚洲带绦虫成虫LDH基因的研究结果表明,TaLDH 重组蛋白定位于成虫表膜和虫卵的胚膜, 是有潜力的疫苗候选抗原或药物的靶分子[2],并推测猪带绦虫 LDH 可能在猪带绦虫成虫的表膜上分布较多,而分布在表膜的蛋白则有可能为药物的靶分子,或是诊断抗原的候选分子。
蛋白质双向电泳技术应用于带绦虫的研究报道[7,8,9]不多。本研究运用双向电泳技术获得猪囊尾蚴的总蛋白图谱,并用自制的大鼠抗猪带绦虫LDH血清作蛋白质印迹反应,得到1个特异性抗原抗体阳性杂交斑点,阴性对照未见特异性抗原抗体阳性杂交斑点。将Western-blotting检测的抗原抗体阳性杂交斑点与原双向电泳凝胶斑点比对后找到对应蛋白斑点,经ImageMaster 2D Platinum 5.0软件分析后初步确定该蛋白斑点的pI/Mr 为7.03/35 368,与猪带绦虫LDH的 pI/Mr理论推导值接近。本研究结果表明猪囊尾蚴表达LDH,这无疑对开发相关疫苗及可能的治疗靶分子、实现对寄生虫数量和分布的控制会起到积极作用。
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蛋白质电泳 篇8
关键词：结直肠癌,双向凝胶电泳,血清蛋白质组
结直肠癌(colorectal carcinoma,CRC)是消化系统常见恶性肿瘤之一,多发生于中年男性,目前绝大多数研究是针对肿瘤发生过程中的遗传学改变、癌基因的突变及抑癌基因失活等方面,但具体的分子机制尚不清楚。蛋白质组学概念的提出和研究技术的迅猛发展,使人们从蛋白质整体水平对结直肠癌进行研究成为可能。
双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)是目前蛋白质组学研究首选的蛋白质分离技术,已经被成功地应用于结直肠癌细胞系和肿瘤组织水平筛选潜在的肿瘤标志物。在前期研究中,我们采用蛋白质组学技术分析了不同转移潜能结直肠癌细胞系SW480和SW620的蛋白质表达谱差异[1],并在组织水平研究了结直肠癌发生、发展相关蛋白[2,3],为阐明结直肠癌发生机制奠定了理论基础,为结直肠癌患者临床治疗提供了潜在的靶标。
1 材料与方法
1.1 标本
血清标本取自南方医院普外科。采血后室温凝血30 min,2 000 g离心10 min后取上清,等质量混合结直肠癌组个体血清标本,同方法混合正常人血清标本,分别将混合后的两组标本保存于-80℃冰箱备用。
1.2 试剂
17 cm p H3~10NL和p H4~7的IPG干胶条和p H3~10 IEF buffer购自Bio-Rad公司;尿素、DTT、CHAPS、SDS、Tricine、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、矿物油和甘油购自Sigma公司;硫脲为Fluka产品;其他试剂均为分析纯。所有缓冲液均为Milli-Q水(Millipore)配制。
1.3 仪器
Protean IEF cell等电聚焦仪和ProteanⅡx cell电泳仪购自Bio-Rad公司;Power Look 1100透射扫描仪为UMax公司产品。
1.4 2-DE
取6.25μL血清与10μL含10%SDS和2.3%DTT的缓冲液混合,在95℃下加热5 min,待冷却后用500μL缓冲液稀释[4]。用17 cm IPG干胶条采取被动泡涨16 h,等电聚焦条件为250 V 1 h,500 V 1h,1 000 V 1 h,5 000 V 2 h,10 000 V 60 k V h。聚焦完毕后分别在含有2%DTT和2.5%碘乙酰铵的平衡液中平衡15 min,将平衡后的胶条移至1 mm厚浓度为13%的均一SDS-PAGE胶上端进行二向电泳,条件为12 m A/胶30 min,24 m A/胶恒流,直至溴酚蓝达胶底线。卸胶进行硝酸银染色,Power Look1100扫描仪获取图像后PDQuest 7.0.7软件包分析。
2 结果
2.1 血清2-DE图谱的建立
通过已优化的实验条件,能得到分辨率高的结直肠癌和正常人血清蛋白质2-DE图谱,采用3~10NL胶条分离结直肠癌患者和正常人血清平均蛋白质点数约(321±16)个和(336±11)个,而采用相对窄p H范围的4~7胶条分离得到血清平均蛋白质点数约(476±25)个和(486±22)个。
2.2 p H3~10NL胶条分离结直肠癌患者和正常人血清蛋白质图谱的差异分析
两组的差异蛋白质点共17个,结直肠癌组表达量上调的蛋白质点7个,表达量下调的蛋白质点7个,两组差异蛋白质点在2-DE图谱中的分布情况见图1。
2.3 p H4~7胶条分离结直肠癌患者和正常人血清蛋白质图谱的差异分析
两组的差异蛋白质点共13个,结直肠癌组表达量上调的蛋白质点8个,表达量下调的蛋白质点5个,两组差异蛋白质点在2-DE图谱中的分布情况见图2。
3 讨论
血清是一种复杂的体液,含有各种各样的蛋白。已有研究表明人类血清汇总存在上万种蛋白,有许多都是在细胞生理或病理过程中被分泌到血液中[5]。蛋白质组的飞速发展使寻找生物标志物改进许多疾病的诊断和临床分类成为可能[6]。由于血清流经全身各个器官,因此是寻找肿瘤标志物的极好资源。然而,血清内各种蛋白浓度差异明显,从皮克级到微克级不等,这给血清蛋白质组学研究带来极大的困难[7,8]。另外,不同个体的血清蛋白存在各种各样的蛋白修饰[9]。尽管如此,血清仍是临床诊断的潜在资源。近5年来,血清蛋白质组研究不断发展[5],这其中多数文章发表于3种蛋白质组学权威杂志上[7,10,11]。这些研究表明了血清/血浆蛋白质组学研究的巨大潜力,到目前为止已有1 500中差异蛋白成功鉴定。其中血清蛋白质电泳广泛运用于临床实验研究,尤其是验证肝脏及肾脏疾病相关的蛋白质检测与鉴定。
目前已有研究涉及结直肠癌的血清蛋白质组学研究,EDWARDS等[12]采用SELDI-TOF-MS技术研究结直肠癌血清蛋白质组,证实补体C3a、α-抗胰蛋白酶和转铁蛋白是结直肠癌患者临床诊断的潜在标志物。然而该技术无法定量分析、假阳性率高、重复性差和非特异峰等缺陷阻碍了该技术在研究中的应用[13,14,15]。基于2-D的比较蛋白质组学研究策略作为分离疾病特异蛋白质的新技术已经成功地应用于结直肠癌细胞和组织水平潜在标志物的筛选[1,2,3,16,17,18]。
目前血清蛋白质组学研究多采用去除高丰度蛋白白蛋白和Ig G以显示更多低丰度蛋白,然而绝大多数去除高丰度蛋白试剂盒都存在非特异吸附的问题,为了避免亲和柱本身吸附能力和特性造成的去除效果的差异,本研究直接采用全血清进行2-DE电泳,采用优化的条件和样品制备技术,加大上样量,从而尽量显示更多的低丰度蛋白。如热SDS法处理样品结合两性去污剂的使用能有效地去除血清中的脂质和盐类,可检测90%的可溶性蛋白,且重复性好[19],而标本混合的方案可以有效地降低个体差异所造成分析上的复杂性,综合提高2-DE的重复性,提高差异分析的准确性和通量[20]。本研究利用2-DE分离结直肠癌患者和正常人血清蛋白质,发现结直肠癌组表达量上调或下调的蛋白质点,其中上调的蛋白质可能是肿瘤组织细胞分泌、释放或者由于肿瘤影响而引起的其他器官组织异常分泌的蛋白质,而表达下调的蛋白质可能是一些抑癌基因作用的结果,或者是一些对肿瘤生长或转移起到调节作用的蛋白质。这些差异蛋白质有可能是结直肠癌发病或者病程进展的重要相关蛋白质,也可能是结直肠癌新的标志性蛋白,最终有可能应用于结直肠癌的临床诊断、病程检测、治疗等方面。
蛋白质电泳 篇9
松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是国际上公认的重要检疫性有害生物,能引起松材线虫病(Pine wilt disease),使感病植株快速死亡,且传播蔓延极快,一旦发病将造成极为严重的损失,被称为“无烟的森林火灾”[1]。目前该病的致病机理尚不清楚[2,3,4]。蛋白质是生物体行使其功能的基本单位,基因组中的大多数基因最终都是通过蛋白质的表达、修饰和相互作用来实现其功能的。因此,对蛋白质的分析已经成为生命科学研究的重要内容之一,这对解析生命现象的分子机制至关重要[5]。目前,国内外对松材线虫的蛋白质组的研究仅处于起步阶段,相关报道较少[6],高质量的蛋白样品是开展松材线虫蛋白质研究的前提条件。本研究以松材线虫为材料,分别用TCA/丙酮法和2-D Clean Up Kit提取松材线虫全蛋白,并对其双向凝胶电泳(2-DE)体系进行优化,通过比较2-DE图谱,建立适合松材线虫全蛋白提取方法,获取其蛋白最优2-DE体系,为从蛋白质组学水平上揭示松材线虫的致病机理、采取有效的防治措施奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
供试松材线虫为本实验室从安徽省病死松木上分离保存。培养前先接种灰葡萄孢(Botrytis cinerca)于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA) 平板上,25℃和无光照条件下培养至灰葡萄孢菌丝长满平板后接入松材线虫,继续培养至灰葡萄孢菌丝消失,采用贝尔曼漏斗法收集线虫,液氮中速冻后于-80℃超低温冰箱中保存备用。
1.1.2 试剂
CHAPS、碘乙酰胺(IAA)、载体两性电解质IPG-buffer、pH 4～7、pH 5～8的干胶条、尿素、二硫苏糖醇(DTT)、覆盖油(Mineral-oil)购于美国GE;过硫酸铵(AP)、TEMED、Tris-base为Sigma公司产品;甲醇、乙醇、冰乙酸、甘油、三氯乙酸(TCA)等均为国产分析纯。溶液的配制及稀释均为Milli-Q超纯水。
1.1.3 仪器
GE HealthCare公司第二代双向电泳系统Ettan DALTsix、扫描仪;美国Beckmen64R高速低温离心机;UNICO UV2000紫外分光光度计;Millipore超纯水系统。
1.1.4 培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA):200g/L马铃薯浸汁1 000mL,葡萄糖20 g,琼脂15～20 g,自然pH,1×105 Pa灭菌30 min。
1.2 方法
1.2.1 蛋白质提取方法
1.2.1.1 三氯乙酸/丙酮法
参考Chang-Xia Du等[7]的方法,略作改进。用10% TCA-丙酮溶液抽提研磨后的松材线虫,加入10 mmol/L DTT悬浮,-20℃下静置2 h后,离心20 min(4℃、20 000 r/min),弃上清;再用90%预冷丙酮溶液沉淀样品,加入10 mmol/L DTT重悬浮,离心20 min(4℃、20 000 r/min),弃上清,重复多次至上清清亮。所得沉淀风干后,用蛋白水化液溶解,离心取上清,即为待分析的松材线虫全蛋白溶液。
1.2.1.2 2-D Clean Up Kit (Amersham Biosciences, made in USA)
将研磨后的松材线虫样品转移至离心管中,蛋白提取步骤按2-D Clean Up Kit说明书要求进行。
1.2.2 蛋白质浓度测定
采用2-D Quant Kit 对所提取的松材线虫全蛋白进行定量,并分装至Eppendorf管中置于-80℃超低温冰箱中备用。
1.2.3 双向凝胶电泳
第一向等电聚焦凝胶电泳(IEF)分别采用13 cm、pH 4～7 和24 cm、pH 5～8 的IPG胶条,水化和等电聚焦处理在20℃下进行。上样总体积为450 μl,其中松材线虫蛋白上样量为分别为80 μg 、120μg 、160μg和200μg。等电聚焦电压设置程序按仪器要求进行。等电聚焦后的IPG胶条在平衡缓冲液A[6 mol/L尿素、75 mmol/L Tris-HCl、29.3% 甘油(V/V)、2% SDS(W/V)、0.002% 溴酚蓝储液(W/V)、1%DTT]中平衡15 min后,转移至平衡缓冲液B[6 mol/L尿素、75 mmol/L Tris-HCl、29.3% 甘油(V/V)、2% SDS(W/V)、0.002% 溴酚蓝储液(W/V)、3% 碘乙酰胺]中再平衡15 min,最后将胶条转移至12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶上端,并用热的琼脂糖密封液(75℃)封固胶条后,将凝胶转移至Ettan DALTsix 电泳槽中进行二向电泳。电泳条件为:每根胶条2w恒功率电泳30 min后,再加大功率至17w直至溴酚蓝距胶底部1 cm左右停止电泳。采用快速银染法进行染色。
1.2.4 图像采集
使用扫描仪(分辨率600 dPi,型号为Image ScannerⅢ)对松材线虫全蛋白的凝胶图像进行扫描数字化,比例为1:1。
2 结果与分析
2.1 两种提取方法所得松材线虫全蛋白的定量
采用2-D Quant Kit法对松材线虫全蛋白进行定量,三氯乙酸/丙酮法和2-D Clean Up Kit提取的蛋白浓度分别是2.18μg/μl和0.56μg/μl,达到双向凝胶电泳上样标准,可用于后续试验的研究。
2.2 不同提取方法获得松材线虫全蛋白2-DE图谱效果的比较
利用双向电泳对松材线虫全蛋白进行分离,结果如图1所示。2-D Clean Up Kit提取的松材线虫全蛋白2-DE图谱酸性端背景较为模糊,分离到的蛋白点较少(图1B);TCA-丙酮沉淀法提取的蛋白2-DE图谱的酸性端背景干净,蛋白点性状规则,清晰可见(图1A)。故在后续实验中采用TCA-丙酮沉淀法进行松材线虫全蛋白的提取。
A.TCA-丙酮沉淀法;B.2-D Clean Up Kit。
A.Method of TCA/acetone precipitation;B.2-D Clean Up Kit.
2.3 IPG胶条长度的确定
分别采用了13 cm和24 cm的IPG干胶条对松材线虫全蛋白进行分离,结果表明:24 cm的IPG干胶条分离所得到的2-DE图谱上蛋白点较多,并且分布比较均匀,分离效果较好(图2)。故后续研究选用24 cm IPG胶条。
A.13 cm IPG胶条;B.24 cm IPG胶条。
A.13 cm IPG strip;B.24 cm IPG strip.
2.4 IPG胶条最适pH范围的确定
采用24 cm pH 4～7和pH 5～8 两种胶条对松材线虫全蛋白进行分离,结果如图3所示,两种胶条所得到的凝胶图谱背景都较清晰,但pH 5～8胶条上分离到的蛋白点更清晰,且数量明显多于pH 4～7胶条。另外,pH 4～7胶条上分离到的蛋白点在酸性端分布较少,碱性端较多且有成片现象;而pH 5～8胶条上分离到的蛋白点分布比较均匀。为了获得较大的分辨率和较多的斑点数,在后续试验中采用24cm、pH 5～8的IPG胶条来分离松材线虫的全蛋白质。
A.80 μg /IPG;B.120 μg /IPG;C.160μg /IPG;D.200μg /IPG。 A.80μg /IPG;B.120μg /IPG;C.160μg /IPG;D.200μg /IPG.
2.5 松材线虫全蛋白上样量的确定
比较不同上样量的2-DE图谱,可以发现,上样量为80μg /IPG胶条时,所得到的蛋白点较少且颜色较浅(图4A);上样量为120g /IPG胶条时,与80μg /IPG胶条的上样量相比,蛋白点较多并且形状规则、清晰,而且低丰度蛋白点的数量明显增加(图4B);当上样量达到160μg /IPG胶条和200μg /IPG胶条时,蛋白点虽然有所增加,但背景较重,横条纹明显(图4C, D),不利于后续的蛋白质质谱分析。因此,120μg /IPG胶条的上样量能够较准确地反映出松材线虫蛋白质组的基本情况(蛋白点数量达到2 000个左右),可满足后续质谱测序的需要,为较佳上样量。
3 讨论
近年来,蛋白质组学研究在方法学上取得很大进展,如基质增强激光解析离子化-飞行时间-质谱(MALD-TOF-MS)、液相色谱和串联质谱联用(LC-MS/MS)技术和鸟枪测序法[8]等,而采用双向凝胶电泳及质谱技术来分离和鉴定蛋白质,依然是最基本和最主要的技术[9]。高质量的2-DE图谱的获得不仅需要合适的蛋白提取方法,最优电泳体系也是必不可少的[10],它们会对2-DE图谱的分辨率和重复性造成直接的影响[11]。所以,蛋白质样品的制备及最佳的电泳体系是双向电泳成功与否的关键步骤[12]。此外,IPG干胶条长度和pH梯度对蛋白质的双向电泳分离结果有着很大的影响[13,14],因此IPG干胶条长度和pH梯度的选择等细节问题也是不可忽视的。所以在进行蛋白质组研究工作中,要求对相应物种的蛋白样品制备及双向电泳的体系进行摸索[15,16,17,18,19]。
本研究应用双向电泳技术,分别采用TCA-丙酮法和2D clean up kit试剂盒法提取了松材线虫全蛋白并用2-DE对其进行分离,发现TCA-丙酮法能够获得较为理想的松材线虫全蛋白,经双向电泳分离可以得到背景清晰、分辨率较高、含有丰富的蛋白质信息量的2-DE图谱。此外,研究发现TCA-丙酮法提取蛋白质时,过多的操作步骤不仅会使蛋白损失增加,也会造成整个蛋白提取时间的延长,故洗涤次数一般不会超过2次。要使蛋白质样品成功地得到分离,IPG胶条长度的选择很重要。本实验发现24cm胶条检测出的蛋白点较多,优于13cm胶条,利于后期蛋白质点的选取和鉴别。此外,IPG胶条的pH值对2-DE图谱的质量也起着很关键的作用[22]。本研究结果表明:pH 5～8 胶条能使蛋白质得到较好分离,蛋白信息量比较丰富,且蛋白点能够较均匀地分布在整个胶面上。上样量的大小会对双向电泳的分辨率造成很大的影响。上样量过低,不利于低丰度蛋白点的检测;但上样量过高会致使高丰度蛋白质点太大而掩盖了一些比较重要的低丰度蛋白质点[14];并且上样量太大,样品中含有的盐离子浓度也会增大,会直接影响到等电聚焦的效果,进而影响2-DE图谱的质量[9]。所以本实验对松材线虫全蛋白的最佳上样量进行了摸索,用TCA-丙酮法提取的松材线虫全蛋白,在其它条件都一致的条件,在上样量分别为80μg、120μg、160μg、200μg时进行双向电泳分离,研究发现:上样量为120μg时经双向电泳分离可得到背景清晰、分辨率较高的2-DE图谱,含有丰富的蛋白信息量,可以满足后续质谱测序的要求,为最佳上样量。另外,有些学者在进行蛋白质组的研究时运用了超声破碎技术[15,21]。在本实验中, TCA-丙酮法沉淀的蛋白沉淀较难溶于蛋白水化液中,在后续试验中可考虑在低温条件下辅助以超声破碎蛋白沉淀的方法来提高蛋白得率。