差异蛋白质组学（精选10篇）
差异蛋白质组学 篇1
在获得许多原核生物和真核生物的全部基因组序列后, 阐明基因或者蛋白的功能成为了生物技术上的另一个大挑战。蛋白质组是指由一个细胞或一个基因组、组织表达的所有蛋白质。蛋白质组随着环境的改变而发生变化。蛋白组学这个术语可以定义为蛋白质组上定量和定性的比较去鉴定影响生物学进程的细胞内机制[1]。
用于分析哺乳动物的蛋白质组的方法表明了蛋白质组学不仅建立在蛋白质的鉴定和定量, 同时还需要了解蛋白质的结构、定位、修饰、交互作用、活性和功能[2]。到目前为止, 还没有研究建立一种比2-D聚丙烯酰胺凝胶电泳更精确实用的分析方法, 它是一种基础的蛋白分析技术。
采用2-D凝胶电泳技术可以鉴定并分析在细胞状态改变下差异表达的蛋白, 由于没有使用一些如亲和层析和凝胶层析 (多维色谱) 的特殊方法, 常规的2-D电泳只能用于检测蛋白的表达, 不能用于蛋白-蛋白之间的交互作用以及蛋白的主要功能的分析。所以, 在进行蛋白质组学分析时, 就需要一些其他的方法在蛋白质水平上的辅助, 有利于更加广泛地理解细胞学机制。
1精子粘附因子家族 (spermadhesins)
大量的研究表明配偶子的识别和精卵融合是由糖类蛋白交互作用的模式介导的。早在之前已有研究表明哺乳动物卵母细胞的透明带是由两到四个糖蛋白家族组成的[4,5], 这些结合到透明带的精子膜蛋白, 其生物化学结构和分子量 (14KDa～90KDa) 各不相同, 随着物种改变而相应改变。
精子粘附因子, 在猪、牧马和公牛的生殖道表达, 属于一个新的分泌蛋白家族, 经研究发现与精子表面有关联[6]。精子粘附因子的功能性质上的分化是通过转录后的修饰促进的, 尤其是糖基化[7]。糖基化不仅仅是对蛋白家族结构多样性起作用, 同时, 调节精子粘附因子的配体结合能力, 即在不损伤肝素结合能力下失去了透明带结合活性[7,8]。精子粘附因子属多功能蛋白质, 有广泛的配体结合能力, 如, 糖、硫酸化糖胺聚糖、磷脂和蛋白酶抑制剂等, 说明它们作用于受精的各个阶段[5,9]。经研究证明, 猪精子粘附因子家族的所属蛋白的绝大部分是由水泡腺合成, 在某些特定情况下, 也可由附睾和睾丸网进行合成。猪精子粘附因子的结构、生物化学性质以及生理功能方面已有大量的文献进行报导。
截止目前为止, 7个精子粘附因子, PSPI, PSP-II, AQN-1, AQN-2, AQN-3, AWN和DQH已在猪精液中被鉴定, 除PSP-I外, 皆具有肝素结合能力[9,10]。在猪精液中, 精子表面蛋白 (PSP, AQN, AWN和DQH) 的聚集形式比单体形式更占优势。它们之间的交互作用可能有利于精液蛋白聚集形式的形成或者精子表面蛋白的排列和重塑。另外, 精液中聚集形式的蛋白与单个独立的蛋白的肝素结合活性只有一个区别:精子粘附因子异 (源) 二聚体PSP-I/PSP-II, 表现出连锁PSPII亚基糖结合活性[10,11]。最近研究结果表明了PSP-I/PSP-II精子粘附因子促进巨噬细胞释放嗜中性粒细胞趋化物质, 暗示着精子粘附因子异源二聚体是作为子宫免疫活性的调节子作用的[12]。
2热休克蛋白家族 (HSPs)
近来来, 已有研究表明, 冻精, 即在液氮中保存的精液, 在冷冻过程中的损伤, 主要是蛋白质等大分子的含量和功能的改变。与其他家畜相比, 猪精子对于抗冻和低温打击十分敏感。主要是因为猪精子膜上胆固醇/磷脂的比例较低, 磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂的含量较高, 胆固醇的分布不对称, 外膜的大于内膜, 使内膜对冷休克特别敏感。
Medeiro等[13]通过精子冷冻实验证明冻融过程会导致精子提前发生获能样变化, 具体表现为细胞膜通透性增强、精子质膜表面胆固醇流失、精子活率和活力降低等现象。精子的质膜也因此被认为是在低温环境中最容易受损伤的关键结构。
研究证明精子的质膜、胞器以及顶体等部位的损伤实质是改变了相应部位重要功能蛋白的质和量, 如热休克蛋白70 (HSP70) 、热休克蛋白90 (HSP90) 等与受精过程相关的功能蛋白, 谷草转氨酶 (AST) 、乳酸脱氢酶 (LDH) 、丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 等与精子代谢有关的酶类, 特异性透明质酸酶 (PH-20) 、受精抗原1 (FA-1) 、甘露糖结合蛋白 (MBP) 、顶体素 (acrosin) 等与精卵相互识别的信号蛋白, 以及一些基因表达的调节蛋白[14]。
S Vlope等在猪精子表面发现并定位了Hsp-60, Hsp-70, Hsp-90。Huang等研究表明, 温度降低至5℃时, Hsp-90开始减少, 超低温冷冻保存后Hsp-90的含量极显著降低[15]。HSP90通过调节蛋白激酶活性, 参与调节精子运动, 其水平的降低导致了三磷酸腺苷 (adenosine triphophate, ATP) 合成减少, 且冷休克后ATP的减少在后期不能得到补偿。由此推测, 降温过程中HSP90的减少是导致ATP耗竭的关键因素, 并导致了精子活力的显著降低。金一等[16]通过研究降温过程中HSP90对猪精子活力的影响, 再次证明HSP90参与ATP代谢, 冷休克造成精子ATP合成减少的不可逆转, 使精子运动能力减弱。
Garcia-Gardena等[17]报告说, HSP90可以激活一氧化氮合酶 (nitric oxide synthase, NOS) , 由L-精氨酸在一氧化氮合酶的作用下生成少量一氧化氮 (NO) , 提高精子活力、活率, 降低精子脂质过氧化, 提高精子的受精能力。
3其他猪精子蛋白
目前在人类精子表面的蛋白质研究表明, 共显示了1 397个蛋白点, 分子量为5-160 kDa, pI 4-11。Wolkowicz等还首次发现鞭毛蛋白tektin B1也位于精子表面。Wenlei Cao在鼠精子上发现鞭毛蛋白TEKT 5, 其参与精子形成过程中鞭毛的形成并介导精子活力[18]。Alfredo R.Ramírez[19]等在猪精子上发现并鉴定了多巴胺2型受体 (DRD2) , 其影响精子的活力、精子获能以及精子能动性的调节。Ollero[20]等研究指出, 冷冻后牛精子膜蛋白组成和鲜精不同, 精子膜蛋白的变化导致精子活率和活力的降低。
蛋白组学技术的应用可以帮助揭露蛋白结构, 理解其功能以及蛋白-蛋白的交互作用的不同变化, 这些有助于理解和分析调节精子的功能, 例如过度活跃, 获能以及顶体反应。
摘要：蛋白质组学对于鉴定调节雄性生殖细胞性能机制的蛋白的性质和功能的研究是至关重要的。蛋白质组学提供了一个工具区分析和理解精子与卵子之间的相互作用, 这有可能为研究精细胞表面配体与卵细胞的相互作用提供一个有用的模型。本篇综述包括了目前对于猪精子蛋白组学的研究进展以及一些基本蛋白质组学的研究技术。
关键词：蛋白质组学,猪,精子
差异蛋白质组学 篇2
2在药物研究中的应用
近年来,随着蛋白质组学的快速发展,蛋白质组学技术在药物研究领域有着越来越多的应用,为高通量、特异性、快速的进行药物相关研究提供了强有力的技术支持。
2.1靶点的发现和确认： 药物靶点是指药物在体内的.作用结合位点,包括基因位点、受体、酶、离子通道、核酸等生物大分子。筛选与确定新的药物作用靶点不仅为揭示药物的作用机理提供了重要信息,而且对新药的开发研制、建立筛选模型、发现先导化合物等也具有重要意义。
Weingarten等用二维电泳和生物质谱联用技术,对调节性T细胞进行了蛋白质组学分析,寻找与其功能相关的蛋白靶点,以期找到用于治疗多发性硬化症等免疫系统疾病的新药物靶点。Hu等对法尼基转移酶抑制剂的抗癌作用机制进行了蛋白质组学研究。他们对药物作用前后的卵巢癌细胞总蛋白进行了双向电泳以及质谱分析,发现热休克蛋白70在药物作用后表达上调,然后利用热休克蛋白抑制剂和酶联免疫吸附分析进行了后续研究,他们进一步发现热休克蛋白70能够对法尼基转移酶导致的癌细胞凋亡起到保护作用,而热休克蛋白70的抑制可能成为卵巢癌治疗的新靶点[2]。
2.2耐药相关机制研究中的应用： 在癌症、感染等疾病的治疗中,抗肿瘤、抗菌以及抗病毒等药物的耐药问题已经成为相关疾病难治疗、易复发的主要原因之一。关于耐药机制的探讨已经成为了抗菌药物领域的研究热点。利用该技术,研究人员已经发现了多种与耐药相关的蛋白,如:磷酸丙糖异构酶、HSP27、Sorcin等可能与胃癌多药耐药相关;线粒体转录因子A、组蛋白H2B、组蛋白H4、核糖体蛋白L3等可能与结肠癌5-氟尿嘧啶耐药相关; Sigma调控因子RpoD和膜孔蛋白F可能与铜绿假单胞菌多重耐药相关等。这些蛋白的鉴定为深入研究药物耐药性产生机制提供了线索,而且对进一步筛选具有潜在价值的抗多重耐药的药物治疗靶点具有参考价值。
2.3临床医药研究中的应用： 近年来,蛋白质组学技术也被广泛应用于临床研究中。蛋白质组学技术高通量、大规模的优势在临床药物研究中得以充分发挥。例如:根据不同病理过程中蛋白质的种类和数量的变化,筛选疾病特异性发生变化的蛋白质,把这些特异的与疾病相关的蛋白质作为生物标志物进行疾病筛查和分期、分型;根据不同治疗、用药阶段蛋白质表达发生变化的情况,筛选病程、药物作用相关的蛋白,利用这些蛋白标志物进行病程分析和用药时机的选择等;根据生物标志物在不同疾病中的变化,从而辨别疾病的性质和进程,对预后进行判断等。Eberini等研究了佐剂关节炎大鼠模型服用非甾体类抗炎药前后血清蛋白质表达图谱的变化,发现不同的药物对血清蛋白质表达水平的影响不同,而且血清蛋白表达水平的变化与炎症参数如关节肿胀等平行。此研究表明,通过研究用药前后蛋白质谱的变化可以判断药物的疗效,进而为临床选择用药及观察疗效提供有力依据。
3展望
蛋白质与蛋白质相互作用,交叉形成复杂的网络系统,是各项生命活动的基础。从先导化合物设计、靶点的寻找与确认,到药物疗效和毒性的评价,最终到临床个体化给药的实现,都是蛋白质组学发挥其技术的舞台。蛋白质组学技术为新药研发提供了新的思路,无疑将对药物研究起到强大的推动作用,将有良好的应用前景。
参考文献
[1]易红,杨轶轩,陈主初,等.应用蛋白质组学技术筛选胃癌耐药相关蛋白质[J].生物化学与生物物理进展, ,33(3):267-76.
差异蛋白质组学 篇3
因此，抗衰老产品在护发市场领域也渐趋重要就不奇怪了。“从内部支撑头发”“使头发看起来更年轻”或是“使其更浓密”的宣传语看起来非常熟悉，这些词语都来自面部肌肤护理领域。我们尤其可以在成熟的市场中发现人们对拥有高营养性能的洗发护发产品渐增的需求。这些产品的配方灵感往往来自护肤产品的原料。新原料开发
新护发活性物的发展同样倾向于效仿护肤研究。我们的细胞中会源源不断地产生系列不同的蛋白质，以执行多种多样的细胞功能，并构建新的蛋白质。而头发的基本构架也是蛋白质。在某个时间点上，一个细胞、一片组织，或个生物的所有蛋白质总和被称为一个蛋白质组。蛋白质组学成为研究功能与结构的种可靠方法，它使人们能够精确定性氦基酸序列和肽。
现在它也同样被应用于护发研究中。首先，在高效液相色谱法（HPLC）技术的协助下，复杂的混合物从肽上被分离出来。其次是在质谱仪（MS）中隔离单独的肽，并将其分解成更小的氦基酸序列。再次，进步的质谱分析将精确甄别不同的氦基酸序列。由此，人们便可正确解析蛋白质结构。
在化妆品活性原料的新发展中，这些成果可被用于限定仿生原料，令这些原料能够更加接近皮肤与头发的自然组成。角蛋白与类皮质层肽
头发包括被称为毛皮质层的内部结构，以及被称为毛鳞片层或表皮层的外部结构。在头发的完整结构中最常出现的蛋白质就是角蛋白，占了蛋白质总量的80%。角蛋白的构成中包括大量结构氦基酸——胱氦酸。如果由于频繁的漂洗与染色或紫外辐射而使发质遭到损害，头发就会变得脆弱，可能会显得粗糙、易断，并失去光泽。
蛋白质组学可以精确定性头发角蛋白的氨基酸序列和肽。专家们由此研发出了种新的活性物，称为Keramimic 2.0，它的肽结构吻合于表皮层和毛皮质层中的角蛋白肽结构。
这样种活性物应该可以表现出对发质结构的高度直染性，并附着于受损区域，甚至修复损伤。
头发表Ig的分析与可视化
“飞行时间二次离子质谱法（ToF SIMS）”技术使人们可以检视头发表层，并使之可视化。一次分析可以展示从发根到发梢的累积损伤。头发越长久越严重地暴露在日常不利因子中，毛鳞片层便会愈加遭到损伤。同时，头发表层的极性也将改变，受损区域将呈电荷阴性。
我们将发丝洗净，而后让其与活性Keramimic 2.0接触。从发根到发梢的累积损伤清晰可见，同时我们也可以看到活性物中肽的直接附着。
在对这些头发的应用研究中，我们另外核对了其效果。在经过相关预处理（漂白、染色、并拉直）后，欧洲、亚洲与拉丁美洲人的头发被洗净，并不与Keramimic 2 0接触。对照实验结果证明了这种仿生活性物对头发显著的、可感知的效果。头发力学验证
对于头发的感官参数，例如可梳理性、手感、柔软度和光泽度等，专家们已研究出了具有客观性、再现性、可统计分析的评估方法。
不过要如何才能验证其“摆动力”呢？尤其是受损头发护理后的摆动状态，其发质已被护发产品改变。
在布拉德福德大学的可视计算中心协作下，我们研究出了种记录并评价头发动作的评估方法。测量设备包括根用以系上头发的滑杆，以及一个用于数字化记录头发动作的高清摄像头。如果我们让滑杆以确定的速度运动，那么上面的头发就会得到推动力，开始摆动。测量系统将判定摆动的最高点，它取决于头发质量。
不同人种头发的检测系列展现出了摆动状态的明显区别。亚洲人的头发通常比欧洲人的头发摆动得更高，因为它的结构更光滑。而拉美人的自然发质因其卷曲性而摆动得更低，其发丝间的摩擦力更大。
无论如何，漂白或染色这样的破坏性处理都会影响头发的摆动状态。
在针对预处理过的发丝的
系列检测试验中，这个结论愈加鲜明。根据不同地区对头发处理的偏好，各种发丝被漂白、染色或拉直。
最终我们将关注点转向一种护发活性因子的效果，它是KeraDynHH。将这配方掺入护发基底液，用它护理过头发后再进行摆动测试。结果是用这种配方处理过的头发恢复了原始的摆动活力，而单纯的护发基底液并不能使发质有很大的改善。
这种活性因子的结构使其对头发有高度直染性，它能分别附着在每根头发上而不将发丝粘在起。头发问的摩擦力减少了，因此又变得光滑流畅。于是轻松摆动的头发展现出了青春与活力。
养发原料锁固青春弹力
如今，人们对有效抗衰老产品的需求已延伸至护发领域。如蛋白质组学这样的新检测方法不仅支持着创新活性因子的直接研发过程，并且使新产品得以定位自身。如TOF SIMS这样的新验证方法也有所帮助，可以展示这些养发配方的效果。
长发如果显得飘逸又灵动，看上去就会更显青春。如果种活性因子可被证明能使头发轻摆如初，又或是修复其活力，那就可以被看作是种抗衰老的活性因子。
差异蛋白质组学 篇4
关键词：冠心病,毒证,蛋白组学
“毒证”一般多见于温热病和外科痈疽疔疮,以红、肿、热、痛等为临床特点,在病理上常认为初起为温,温甚为热,热甚为火,火入血分则为毒,或初为湿盛,久郁化热,湿热酿毒。《毒证论》中将“毒证”的临床特征概括为: 爆发性、剧烈性、危重性、传染性、难治性、顽固性,将“毒证”的病变特征归纳为: 传递迅速、易于恶化、兼火兼热、夹瘀夹痰、入经入络、伤阴伤阳。张哲等[1]提出冠心病( CHD) 的“脉瘤”“脉痈”理论,与外科“毒证”有相似之处; 临床中也发现急性心肌梗死( AMI) 具有起病急骤、传变迅速、病势凶险等特点,类似于CHD“毒证”;且越来越多的研究表明[2,3,4,5,6],无论从临床症状
还是从实验室指标上,解毒中药对急性冠脉综合征( ACS) 均有明确疗效。但CHD“毒证”与传统“毒”中疮疡红肿热痛、舌质红绛等表象并不完全相符[7],因此,CHD“毒证”与传统意义的“毒证”有何不同? 是否有特异性的分子标记物? 本研究即通过蛋白质组学方法比较中医传统外科“毒证”和CHD“毒证”的差异蛋白,探讨冠心病“毒证”的特异蛋白表达,以期为冠心病“毒证”理论的生物学基础提供依据。
1 资料与方法
1.1诊断标准
AMI的诊断标准,参照2001 年中华医学会心血管分会“AMI诊断和治疗指南”中AMI的诊断标准[8]。外科“毒”的诊断标准,痈肿疮疖或急性扁桃体炎等具有典型红、肿、热、痛表现[9,10]。
1.2纳入标准
AMI; 年龄35 岁~ 80 岁。符合AMI诊断标准者,即具备下列三条标准中的两条: 缺血性胸痛的临床病史; 心电图的动态演变; 心肌坏死的血清心肌标记物浓度的动态改变。中医传统“毒”证[11]: 年龄18 岁~ 80 岁; 皮肤、肌肉或脏器的痈疽疔疮以高热、红肿热痛或明确细菌感染性疾病的病人,如肠痈( 急性阑尾炎) 、乳痈( 急性乳腺炎) 、肺痈( 急性肺炎) 、肝痈( 急性肝脓肿) 、丹毒( 急性蜂窝组织炎) 等; 体温≥37. 5℃或白细胞总数>10×109/ L且中性粒细胞百分比>70% 。
1.3排除标准
AMI;近1个月内有感染、发热、创伤、烧伤、手术史;严重心力衰竭,左室射血分数(LVEF)<35%者;恶性肿瘤;活动性风湿免疫性疾病、结核病;肝硬化、肾衰竭(Cr>2.0 mg/d L)或脏器移植者;严重慢阻肺,呼吸衰竭或肺心病、右心衰;严重血液系统疾病如白血病、再障;估计依从性较差或参加其他临床试验者。中医传统“毒”证,往有明确CHD病史者;痈疽疔疮已破溃,流脓已尽,属于愈合期者;肠痈、乳痈等已行手术治疗者。
1.4观察指标及血清多肽谱实验方法
根据病例报告表详细记录各组一般资料、既往史、个人史、症状、体征、辨证分型等。信息采集、录入人员均为心血管科专科医师并接受过统一培训考核,所有录入信息由课题组主要研究人员进行核查确认后,方为有效。数据录入采用双人录入,确保资料的准确可靠。中医的辨证分型由两名副高以上中西医结合心血管医师确认。同时留取空腹血清-80℃ 冻存,用于最后统一的蛋白质组学检测。采用Matrix Assisted Laser Desorption Ionization / Time-of-Flight Mass Spectroscopy ( Maldi-Tof-MS)方法对冠心病“毒证”和传统外科“毒证”两组人群的差异蛋白进行比较分析和鉴定,最终确定冠心病“毒证”的特异表达蛋白。采用Clin Pro Tool2. 1 软件进行图谱分析和统计学处理,采用Bioworks Browser 3. 3. 1SP1 进行SequestTM检索,检索数据库为International Protein Index ( IPI human v3. 45 fasta with 71983 entries) 。
1.5统计学处理
采用SPSS15. 0 软件进行统计分析。假设检验使用双侧检验,以P ≤0. 05 为有统计学意义。统计描述: 计量资料采用均数 ±标准差( ±s ) 、计数资料采用构成比进行描述。统计推断: 两组对比分析: 定性资料采用卡方检验或Wilcoxon秩和检验; 定量资料符合正态分布用t检验( 方差不齐时选用校正的t检验) ,不符合正态分布用Wilcoxon秩和检验。
2 结果
2.1一般资料分析
共入选中日友好医院急诊科冠心病“毒证”即AMI病人、中国中医科学院西苑医院外科中医传统“毒证”病人各15 例。冠心病“毒证”15例,年龄( 63. 40±8. 53) 岁,男性9 例( 60. 00% ) ,女性6例( 40. 00% ) ; 15 例传统外科“毒证”病人中,年龄( 50. 87±14. 92) 岁,男性11 例( 73. 33% ) ,女性4 例( 26. 67% ) 。年龄、高血压病史、脑卒中病史及心率有统计学意义( P <0. 05) ,但考虑到疾病本身的特点,认为这符合真实世界的状态。详见表1。
2.2 AMI与传统外科“毒证”差异蛋白的多肽谱分析
共找到4 个有明显统计学意义的蛋白多肽链。详见表2。选择组间差异最大的蛋白多肽链进行鉴定,即分子量为2 022. 61Da的多肽链。图1 中可见分子量为2 022. 61Da的蛋白多肽链两组间的峰值及峰面积差异显著; 图2 中可见CHD“毒证”组与传统外科“毒证”组比较所得到的差异蛋白多肽链能够很好地将这两组区分; 用QC方法建立的模型,分子量为2 022. 61的蛋白多肽链能够很好地与其他蛋白相结合,得到的识别率为93. 33% 。详见表2、图1、图2。
注:实线为冠心病“毒证”;虚线为传统外科“毒证”。
注:实线为CHD“毒证”;虚线为传统外科“毒证”。
2.3 CHD“毒证”与传统外科“毒证”差异蛋白鉴定(见表3)
3 讨论
本研究中CHD“毒证”组———AMI组补体C3 类似物LOC653879 表达较高。补体C3 作为天然的免疫分子,是人体最主要的补体成分之一,主要由肝脏和巨噬细胞合成,在补体C3 转化酶的作用下,裂解成C3a和C3b两个片段,在人体补体经典激活途径和旁路激活途径中发挥着重要作用,也参与人体第三条补体激活途径———甘露聚糖结合凝集素途径的启动。通过EMBL-EBI中Uniprot查找该蛋白的主要功能包括: 无论在经典激活途径还是在替代激活途径,都需要补体C3转化酶的参与,在这个过程中C3b通过活性硫酯的作用与细胞表面的碳水化合物结合形成免疫聚集物; C3a过敏毒素能够介导局部炎症反应,引起平滑肌收缩,增加血管的通透性,促进组胺的释放; 酰化作用刺激蛋白也是补体C3 裂解后的一条多肽链,与脂肪代谢有关,它能够刺激TG合成和脂肪细胞内葡萄糖的转运,调节脂肪的储存,对调节餐后TG水平起着重要作用,其促进TG合成的作用是通过激活PLC、丝裂原活化蛋白激酶( Mitogen Activated Protein Kinase,MAPK) 和蛋白激酶AKT的信号传导途径来实现的。补体C3 增高常见于某些急性炎症或者传染病早期,如急性肾小球肾炎、风湿热急性期、心肌炎、心肌梗死、关节炎等; 降低常见于: 1 补体合成能力下降,如慢性活动性肝炎、肝硬化、肝坏死等; 2 补体消耗或者丢失过多,如活动性红斑狼疮、急性肾小球肾炎晚期、基底膜增生型肾小球肾炎、严重类风湿关节炎、冷球蛋白血症、大面积烧伤等; 3 补体合成原料不足,如儿童营养不良性疾病; 4先天性补体缺乏,常可致严重感染等。
目前有研究表明补体C3 与心肌损伤、血栓形成及CHD有关[12,13,14]; 一项研究发现[15],以C3 为主的局部补体激活可以促进AMI病人血管的闭塞过程; 近来又有报道认为,女性TG-C3 组合升高提示抗炎能力和动脉保护功能的受损,可能预测糖尿病或者CHD的发生风险[16]。另外一项关于ACS病人HDL水平与炎症反应关系的研究发现[17]: ACS病人除了HDL的降低,还伴有明显的补体C3 的升高。总之炎症反应贯穿于AS、CHD始终,与ACEs的发生密切相关,而CHD和ACEs病人补体C3 水平增高可能与体内炎症-免疫机制激活有关。
在外科感染性疾病当中,马晓望等[18]的研究表明,外科局灶性感染组在感染早期、晚期C3 值均无明显变化,但重症感染组的C3 值却低于正常值,这说明当少量毒力的细菌侵入人体,机体只需启动体液内的免疫球蛋白及少量补体就可以防止感染扩散,但在重症感染时,由于大量抗原抗体复合物形成以及LPS的作用,消耗了大量的补体,同时,细菌毒素作用于机体导致各器官功能障碍,使补体合成不足,加上某些病人免疫力低下,造成补体C3 水平下降。因此在炎症初期补体C3 水平下降提示机体感染严重,病人免疫系统有不同程度的损害,如炎症后期C3 水平仍较低,提示炎症向慢性过程发展,并有复发趋势。
由此可见,在AMI病人中,局部血管炎症可激活机体免疫功能,激活补体系统,导致补体C3 水平升高;而在中医传统外科“毒证”病人中,补体消耗过量、生成不足,可造成补体C3 的显著降低。补体C3 类似物LOC653879 可能是CHD“毒证”区别于传统外科“毒证”的生物标记物之一。
差异蛋白质组学 篇5
绿色植物在生长过程中遭遇的环境胁迫包括非生物胁迫(如干旱、高温、低温、高盐、营养)和生物胁迫(如病虫,害)两大类.本文对植物响应上述逆境胁迫的比较蛋白质组学研究进展进行概述,并展望植物抗逆蛋白质组学的研究前景.
作 者：林秀琴 袁坤 王真辉 邓军 杨礼富 LIN Xiuqin YUAN Kun WANG Zhenhui DENG Jun YANG Lifu 作者单位：林秀琴,LIN Xiuqin(中国热带农业科学院橡脱胶研究所;农业部热带作培生理学重点开放实验室,海南,儋州,571737;海南大学农学院,海南,儋州,571737)
袁坤,王真辉,邓军,杨礼富,YUAN Kun,WANG Zhenhui,DENG Jun,YANG Lifu(中国热带农业科学院橡脱胶研究所;农业部热带作培生理学重点开放实验室,海南,儋州,571737)
差异蛋白质组学 篇6
蛋白质组是一种基因组所表达的全套蛋白质, 包括一种细胞或一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组的外文名 (Proteome) 源于蛋白质 (protein) 与基因组 (genome) 两个实词的重新组合, 其本质是在大规模水平上研究蛋白质的特征, 包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白之间的相互作用等。借助这种研究, 就可以探析生命活动的生理基础及其内在规律, 了解疾病发生、发展与细胞代谢过程, 在蛋白质水平上获得整体而全面的认识[1]。蛋白质组学的核心技术是双向电泳 (two-dimensional electrophoresis, 2-DE) 、质谱 (mass spectrometry) 及生物信息学 (bioinformatics) 等, 已被应用于生命科学研究的诸多领域, 受到越来越多的关注。
1 基本原理
研究正常生理个体间的蛋白质组, 同时也研究异常病理个体间的蛋白质组, 将二者进行对比、分析, 找出相同点与差异点, 就有可能发现某些疾病的特异性蛋白质分子, 以提供疾病早期诊断的分子标志。将此作为分子靶点, 设计新药物, 深入研究, 以求攻克[2]。由此可见, 蛋白质组学的研究, 能为生命活动规律提供物质基础, 也能为阐明疾病发生、发展的机理提供根据, 作为寻找解决问题的有效途径, 以利于消除这些疾病。
蛋白质组学探索, 是生命科学进入后基因时代的研究新途径, 是未来科学揭示生命奥秘的先进方向, 能与其它科学研究一样, 更好地为人类的健康事业服务, 并有可能发挥更大的社会效益, 甚或由之产生巨大的经济利益。
蛋白质组不等同于基因组, 二者之间有较大差别。蛋白质会伴随组织、环境等状态的差别而改变。在转录过程中, 一个基因可以多种信使核糖核酸 (m RNA) 形式剪接, 同一蛋白也可能以多种形式进行翻译后的修饰。在蛋白质组中, 蛋白质的数目, 有时可以超过基因组的数目。蛋白质组学不是单纯的方法学, 不是一个封闭的知识体系, 而是一个更大范围、更大规模的研究领域。蛋白质组学集中于基因调节的动态描述, 定量测定基因表达的蛋白质水平, 观察疾病对生命过程的影响, 鉴定药物对病理的作用靶点, 解释基因表达的调控机制[2]。蛋白质组学研究, 是蛋白质 (多肽) 谱研究以及基因产物图谱研究的进一步延伸。
人类基因组计划, 经过多个国家的科学工作者的团结协作和共同努力, 人类基因的全序列测定, 最终得以完成。其研究的标志性业绩是:人类基因组工作草图与初步分析结果。这些内容已经被人类基因组计划组织和美国Celera公司公布, 先后刊载于世界顶级自然科学刊物《Nature》与《Science》上。研究成果是巨大的, 其重要贡献是为人类在基因活性与疾病的相关性方面, 提供了客观证明和微观依据。现在的问题是, 不少疾病的发生, 并非全由基因的改变所引起, 还有导致多种疾病发生与发展的其它病原和影响因素。基因表达的方式多种多样, 相当复杂。如果条件不同, 或者时间不同, 即使是完全相同的基因, 也有可能起到异样作用, 会随时发生变化, 有的甚至可以发生突变、畸变, 甚至癌变, 差别非常大。关于这些方面的难题, 仅仅依靠基因组学的研究, 是不可能攻克的。因此, 后基因组学的研究, 就显示出必要性。鉴于蛋白质在人体生理病理中产生的重要作用, 科学工作者已经将探索目标转移到蛋白质功能的研究上来。尤其是蛋白质组学的研究, 更有希望解决以上难题, 也正顺应了这个发展趋向, 并突显出蛋白质组学研究在攻克人类众多疾病中的重大意义。
蛋白质组学研究是一项更为复杂、更具有挑战性的科学探索, 需要国际间的协作与配合。专门研究人类蛋白质的组织 (HUPO) 已经在美国建立, 并由此拉开了国际合作研究的序幕。世界各地的生命科学研究工作者, 广泛开展了各种生物体的蛋白质组学研究。为了避免重复, 减少浪费, 各个国家开展的蛋白质组学研究, 既有协作, 又有侧重, 以集中人力、物力、财力等方面的优势资源, 寻求重点突破。例如:人类肝脏蛋白质组学的研究计划就由中国牵头, 其它国家辅助, 互相配合, 协作攻关。余如人类血液蛋白质组学的研究计划, 则由美国科学界牵头;人类脑蛋白质组学的研究计划, 即由德国科学界牵头。在中国, 政府非常重视这一工作, 在蛋白质组学的研究工作方面, 投入了大量的优质资源, 给予人力、物力、财力等方面的鼎力支持, 已经将其列为目前到2020年的研究重点, 并收入《国家中长期科学与技术发展纲要》。在国家现阶段设立的四个重大科学研究计划中, 蛋白质组学计划就是其中之一, 成为当前国家科学研究的重点突破方向。
基因组包含的遗传信息, 经转录产生信使核糖核酸 (m RNA) , m RNA经过翻译之后, 产生相应的蛋白质。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式。在特定生理条件或病理状态下, 某一细胞表达的各种蛋白质, 构成其蛋白质组。在不同生理条件或病理过程中, 各种细胞所表达的蛋白质的种类, 有一定差别。研究蛋白质的结构、定位以及它们之间的相互作用, 将为观察和阐释生命现象, 揭示疾病发生、发展、变化的本质, 提供直接的微观的客观的证据。
二维电泳与质谱技术的巧妙结合, 形成蛋白质组学研究中的理念结合与技术佳配, 具有相辅相成的促进作用和协同效果, 为科学工作者研究蛋白质的表达规律提供了理想的可行的技术支持[3]。探索蛋白质与蛋白质之间的相互作用, 将是这一研究领域的重要方面。
蛋白质组学系基因能表达全部蛋白质, 其研究是针对不同时间和/或空间上发挥功能性的特定蛋白质群组, 探索其作用机理、功能模式及其群组内的相互作用、调节与调控, 为生理研究、病理分析、临床诊断、新药开发、药品筛选、代谢途径等, 提供客观依据, 建立理论基础[4]。蛋白质组学研究的重点目标和发展方向, 主要是为了促进分子医学的发展, 如寻找药物靶分子, 消除致病基因, 修复正常生理基因, 以利于攻克疾病, 促进机体恢复健康。
2 核心技术
2-DE是双向凝胶电泳技术。蛋白质有2个重要的理化特性, 一是等电点, 二是分子量。根据样品中的这2个蛋白质理化特性, 可以将其分离。原理:一是向基于蛋白质PI不同用等电聚焦分离, 二是按MW的不同用聚丙烯酰胺十二烷基硫酸钠凝胶电泳分离。这样, 复杂蛋白混合物中的蛋白质, 就会依据其理化特性, 在二维平面上自行分离。差异凝胶电泳, 是提取2个不同样品中的蛋白质, 分别标记以不同的荧光染料, 再将标记后的2个样品混合, 进行双向凝胶电泳。因发光波长不同, 同一块胶上2个样品的蛋白质, 可以自行分离, 并能测出其含量。因其通量高, 分辨率好, 具有可重复性, 可与质谱分析技术联用, 故成为当今最流行的蛋白质组学的研究手段, 属于最可靠的实验方法。2-DE技术, 可以广泛应用于各种蛋白质组学的研究, 成为研究结构蛋白质组与功能蛋白质组的重要方法[5], 最具有实际应用价值。在蛋白质组学研究的实验技术中, 属于不可或缺的项目, 占据着十分重要的地位。
质谱分析, 是唯一可以确定分子质量的方法。在高分辨率质谱仪中, 能够准确测定质量, 而且可以确定化合物的化学结构式, 并进行结构分析。质谱法的灵敏度极高, 鉴定的最小量可达10-10g, 检出限可达10-14g。质谱仪的种类多样, 如:有机质谱仪、无机质谱仪、同位素质谱仪等。其中有机质谱仪有气-质、液-质、富变质谱仪, 激光解吸飞行时间变质谱仪等。质谱分析是用高速电子, 撞击气态分子或原子, 将电离后的正离子加速, 导入质量分析器。试样在离子源内被气化、电离。用电子轰击法在10-5Pa高真空下, 以50-100e V能量的电子流轰击试样, 有机物常常被击出一个电子。若加速电压和磁场强度都一定时, 不同m/z的离子, 由于运动的曲线半径不同, 在质量分析器中彼此分开。在磁场中, 按质荷比 (m/z) 大小, 进行收集和记录, 得到质谱图。根据质谱峰的位置, 进行物质的定性, 作结构分析。还可根据峰的强度, 进行定量分析。其原理是受试样品, 从进样器进入离子源, 在离子源中产生正离子。正离子加速进入质量分析器, 质量分析器将离子按质荷比大小不同进行分离。分离后的离子先后进入检测器, 检测器得到离子信号, 放大器将信号放大, 并记录在读出装置上。通过正确测定蛋白质分子的质量, 进行蛋白质分子鉴定、修饰和相互作用的研究[6,7]。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱, 可检测离子, 并确定分子量, 能反映被检测样本中蛋白质的全部情况, 找到多个蛋白质标志物。
生物信息学技术, 是分子生物学与信息技术的结合体, 是利用数学、统计学、应用信息学、计算机科学等方法, 研究生物学中的问题。生物信息学的研究材料和结果就是各种各样的生物学数据, 其研究工具是计算机。研究方法, 包括对生物学数据的搜索、收集、筛选、处理, 包括编辑、整理、管理和显示, 利用、计算和模拟等。目前主要的研究有:基因识别、基因重组、基因表达、序列比对、蛋白质结构预测、蛋白质反应预测, 以及建立进化模型等。生物学技术生成大量的复杂数据, 生物信息学利用数学工具, 从大量数据中提取有用的生物学信息。生物信息学处理的问题:重新组装在霰弹枪定序法测序过程中被打散的DNA序列, 从蛋白质的氨基酸序列预测蛋白质结构, 利用m RNA微阵列或质谱仪的数据检验基因调控的假说。生物信息学技术通过蛋白质微阵列技术或高通量质谱分析, 对生物标本进行测量, 获得数据, 其中包含有大量生物标本内蛋白质的信息。生物信息学被广泛应用于这些数据的分析[8]。Michael Waterman是这方面的行家里手, 他率先将数学和计算方法引入生物学研究, 将数学、统计、计算机科学应用于各种分子生物学问题的研究中, 开辟了多个重要的研究方向, 在生物信息领域有不少创新性的贡献。他受聘于清华大学, 为清华大学的生物信息学学科发展作出了突出贡献。2013年, 他荣获了外国专家在中国从事研究工作的国际友谊奖。
相对和绝对定量同位素标记, 是一种体外同种同位素标记的相对与绝对定量技术, 利用多种同位素试剂, 标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团, 经用高精度质谱仪串联分析, 可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量, 是定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。将蛋白质裂解为肽段, 然后用试剂进行差异标记。由于试剂是等量的, 用不同同位素, 标记同一多肽后, 在第一级质谱检测, 分子量完全相同。用串联质谱方法, 对在第一级质谱检测到前体离子, 进行碰撞诱导解离, 产物离子, 通过第二级质谱进行分析。通过数据库查询和比较, 可以鉴定出相应的蛋白质前体[9]。技术特点是:定量精确、高效率样品分离、高鉴定率、适用范围广、仪器性能优良, 可获得更加准确的结果。
蛋白质芯片, 是一种高通量的蛋白功能分析技术, 用于蛋白质表达谱的分析, 研究蛋白质与蛋白质的相互作用, 筛选药物作用的蛋白靶点。蛋白质芯片技术研究的原理, 是对固相载体进行特殊的化学处理, 再将已知的蛋白分子产物, 如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等, 固定在其上面。根据这些生物分子的特性, 捕获能与其特异性结合的待测蛋白, 经洗涤、纯化, 再进行确认和生化分析。为获得重要生命信息, 如未知蛋白组分、序列, 体内表达水平, 生物学功能, 分子相互调控关系, 药物筛选, 药物靶位选择等, 提供有力的技术支持。蛋白芯片主要有三类:蛋白质微阵列、微孔板蛋白质芯片、三维凝胶块芯片。应用于基因表达的筛选、抗原抗体检测、筛选及研究、生化反应检测、药物筛选、疾病诊断等。优点是直接分析粗生物样品, 如血清、尿、体液等, 同时快速发现多个生物标记物, 小量样品, 高通量的验证能力, 发现低丰度蛋白质, 测定疏水蛋白质, 在同一系统中集发现和检测为一体, 特异性高, 减少测定蛋白质序列的工作量, 可以定量, 功能广, 可测定细胞内的抗原, 而且灵敏度高[10,11]。蛋白芯片技术与质谱技术相结合, 展现出独特的优势。
多维色谱, 是利用不同物质, 在不同相态下的选择性分布, 以流动相洗脱固定相中的混合物。在色谱分析中, 一旦遇到难分离的物质对, 首先考虑改变固定相的选择性。高度复杂混合物, 可能包含不同沸点、不同极性的化合物。更换色谱柱, 其中的部分物质分离效果就会得到改善, 其它物质的分离效果可能变差。要改善总体分离效果, 就需要采用多维气相色谱。原理是两根独立控制、极性不同的色谱柱, 通过切换手段, 将第一根色谱柱的馏分, 选择性地转移到第二根色谱柱, 进行二次分离, 以获得比单柱更强大的分离能力。多维色谱技术在峰容量方面提供了更广阔的空间, 其中多维气相色谱和多维液相色谱较为常用。根据样品组分的性质差别, 选择几种色谱分离模式组合, 对样品进行分离, 与质谱技术联合, 获得分子量信息, 用以分析蛋白质[12,13]。多维液相色谱具有高分辨率、高灵敏度和高速度等优点, 可用于分离复杂样品, 并可广泛应用于生物大分子等复杂样品的分析及分离鉴定, 是蛋白质组学研究技术中的重要方法之一。
3 临床应用
癌症的发生, 是环境与遗传等多重因素, 相互作用, 激活体内原癌基因, 导致抑癌基因失活, 或表达被抑制, 细胞失去原有的生理调节, 产生异常增生。应用蛋白质组学技术, 能系统、全面、动态地分析癌症样本蛋白质种类与含量, 结合肿瘤发生、发展过程中的分子作用网络, 阐明癌症发生机制, 寻找不同肿瘤的诊断、治疗、预后的特异性标志物, 为临床医疗提供线索与依据。为了研究肝癌的发生、发展机制, 应用蛋白质组学方法, 对患者人源性肝癌组织与正常人体肝组织之间的蛋白质进行比对分析, 发现RAS-RAF-MEK-ERK信号通路与肝癌发生、发展机制有相关性。通过对肝癌患者肝组织标本的细胞株进行蛋白质研究, 发现转移性肝癌患者, 肝组织样本的细胞株中, AGR2表达异常增高, 推测AGR2的过度表达, 可促进肝癌转移。使用液相色谱串联质谱和二维荧光差异凝胶电泳法, 检测不同分化程度的胃腺癌患者, 分析出肿瘤组织中差异表达的蛋白质。用定量聚合酶链式反应、蛋白质印迹法技术, 对结果进行验证, 确认这些因子的表达水平, 与蛋白质组学鉴定结果一致, 不同分化程度胃腺癌中的蛋白表达, 存在显著差异性, 差异蛋白质所对基因, 与胃腺癌的发生以及分化程度相关。使用定量蛋白质组学技术, 对金雀异黄素诱导蛋白在胃癌细胞中的改变与具有抗癌作用的染料木素的分子机制进行分析, 显示KIF20A在染料木黄酮的防癌作用中发挥了重要作用, 可能是胃癌药物治疗干预的分子靶点。比较MKN45胃癌细胞株和敲除了CXCR1基因的MKN45细胞, 分析二者之间的蛋白质表达谱变化, 发现CXCR1在胃癌的侵袭、增殖、转移、耐药、预后等方面, 发挥重要作用。利用液体芯片-飞行时间质谱技术, 检测健康志愿者、食管癌患者的血清, 作蛋白质组学分析, 发现患者体内细丝1、微管蛋白β链、细胞色素b-c1复合亚基、α-异构体等, 表达明显增高, 这些表达失调的蛋白质/多肽, 可能参与了食管癌的发病机制, 可作为食管鳞状细胞癌血清学诊断的生物标志物。利用蛋白质组学技术, 对外周血蛋白谱进行分析比较, 对差异表达的蛋白质, 应用MALDI-TOF-MS技术进行鉴定, 发现慢性胰腺炎患者、胰腺癌患者、胰腺癌病情得到控制的患者, 表达存在显著性差异, 用Weste Rn Blot法再次验证, 发现识别体蛋白C3可作为胰腺癌特异性血清标志物。乳腺囊性疾病是诱发乳腺癌的乳腺良性病变, 应用MALDI-TOF质谱分析法, 研究后来发展成乳腺癌的GCDB患者, 进行冻存血清分析, 发现实验组与对照组相比, C3f片段有显著增加, 认为C3f可作为预测指标, 用于健康人群和有癌前病变妇女患乳腺癌风险的评估[14,15]。
4 结语
蛋白质组学技术及其临床应用研究 篇7
1 蛋白质组和蛋白质组学的基本概念
“蛋白质组 (proteome) ”最早是由澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams在1994年提出, 并于1995年7月首次在《电泳》杂志上发表。指的是细胞或组织基因组所表达的全部蛋白质。由于同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同, 即使是同一细胞, 在不同的发育阶段、不同的生理条件甚至不同的环境影响下, 其蛋白质的存在状态也不尽相同。因此, 蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化着的整体。蛋白质组学是指根据蛋白质种类、数量、局部存在的时间、空间上的变化来研究表达于细胞、组织及个体中的全部蛋白质, 并从其结构和功能的角度应用各种技术手段综合分析生命活动的一门科学。对蛋白质组学的研究可以从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态, 了解蛋白质之间的相互作用与联系, 揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。
2 蛋白质组学的研究内容及相关技术
2.1 蛋白质组学主要涉及两方面的内容
一是对蛋白质组表达模式的研究:即表达蛋白质组学是在整体水平上研究生物体内蛋白质表达的变化。其要求对蛋白质组进行表征, 即所有蛋白质的分离、鉴定及图谱化, 其对寻找疾病的诊断标志、筛选药物靶点、毒理学研究有重要作用, 是与基因组学研究中相对应的内容;二是对蛋白质组功能模式的研究, 即功能蛋白质组学, 其主要的任务是阐明蛋白质的细胞定位和活性、蛋白质之间相互作用的连锁关系及由此实现的信号传递与调控作用, 揭示基因和蛋白质的功能及相关疾病的分子机制。
2.2 蛋白质组学的相关技术
根据不同的研究目的, 蛋白质组学的研究方法也不一样。主要可以分为蛋白质分离技术 (如双向凝胶电泳、双向高效柱层析、毛细管电泳等) 、蛋白质鉴定技术 (如质谱, 蛋白质芯片技术等) , 同时, 生物信息学技术也是蛋白质组学研究技术中不可缺少的重要部分。
2.2.1 双向凝胶电泳
双向凝胶电泳 (two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, 2-DE) 最先是由O'Farrell于1975年所提出。可对样品中复杂的蛋白质进行整体性的分离, 是蛋白质组研究的首选分离技术。其基本原理是:先根据蛋白质等电点的差异进行等电聚焦分离, 再按照其相对分子质量大小进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (sodium dodecyl sulphate-polyacryla of electrophoresis, SDS-PAGE) 再次分离, 分离后的蛋白质点经显色后可用图像扫描仪、激光光密度仪、磷光或荧光测定仪等建立双向凝胶电泳图谱而被鉴定。由于2-DE利用了蛋白质两个彼此不相关的重要性质对其进行分离, 因此分辨率非常高, 一般能分辨到1 000~3 000个蛋白质点 (spot) , 最佳可分离得到11 000个左右的蛋白质样点。
2.2.2 质谱
蛋白质鉴定质谱 (mass spectrometry, MS) 技术的发展使蛋白质鉴定更为精确、灵敏、简便和高效。其原理是使极性或带电分子产生气相离子, 再根据离子间的质/荷比 (m/z) 来分离并确定其分子量。目前用于鉴定蛋白质的质谱技术主要有基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 (matrix-assisted laser-desorptionionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS) 和电喷雾质谱 (electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS) 。前者可以得到酶解肽段的分子量, 获得蛋白质的肽质量指纹图谱 (peptide mass finger-print, MF) , 然后通过相应的数据库搜索来鉴定蛋白质, 后者采用串联质谱的方法可以进行肽的测序, 得出肽段的氨基酸序列[1]。
2.2.3 蛋白质芯片技术
蛋白质芯片 (protein array) 是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新的方法, 它类似于基因芯片, 是将蛋白质点结合到固相物质上, 然后与要检测的组织或细胞等进行“杂交” (蛋白与蛋白之间在空间构象上特异性的相互识别) , 再通过自动化仪器分析得出结果。可对蛋白质间相互作用、差异蛋白质组学和酶活性进行研究。现有的蛋白质芯片主要包括三维凝胶芯片、蛋白质微阵列和微孔蛋白质芯片。与传统的实验方法相比, 蛋白质芯片技术具有高灵敏度 (检测水平已达ng级) 、高准确性、高效率等优点。蛋白质芯片技术可以在一次实验中提供相当大的信息量, 使我们能够全面、准确地研究蛋白表达谱, 这是传统的蛋白研究方法无法做到的[2]。
由美国Ciphergen Biosystems公司发明的表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱 (surface enhanced laser desorption ionization-time of flight-mass spectroscopy, SELDI-TOF-MS) 是蛋白质芯片技术和质谱技术的结合, 主要由蛋白质芯片、芯片阅读器和生物信息学三大部分组成。SELDI-TOF-MS最大的特色在于样本无须进行精细分离, 粗样本可直接滴加到表面经过特殊修饰的芯片上, 即可同时检测几千种蛋白质, 还可以发现样本中许多被掩盖的低浓度蛋白质, 增加发现生物标志物的机会, 所以SELDI-TOF-MS技术更加适用于临床。
2.2.4 生物信息学
生物信息学 (Bioinformatics) 是随着人类基因组计划、计算机技术和网络技术的发展而诞生的一门新兴学科, 是在生命科学的研究中, 以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析的科学。生物信息学在蛋白质组研究中有两个重要应用:一是分析和构建双向凝胶电泳图谱, 二是搜索与构建数据库。各种不同类型的蛋白质组和基因组数据库既是实现已知蛋白质分析鉴定和未知蛋白质发展的前提, 也是分析蛋白质结构、性质和功能, 实现模拟和预测的基础。如通过MS发现的差异蛋白质靶点可以在数据库中进行比对, 确定其理化性质, 从而完成整个蛋白质组学的研究。目前用于蛋白质鉴定的数据库主要有以下几类:蛋白质氨基酸序列数据库, 蛋白质结构域与家族数据库, 蛋白质高级结构及分类数据库, 蛋白质双向凝胶电泳技术图谱数据库, 蛋白质相互作用数据库。蛋白质组研究中使用的软件主要有以下几类:蛋白质双向电泳图谱分析软件, 蛋白质鉴定软件, 蛋白质结构和功能预测软件[3]。
3 蛋白质组学在临床上的应用
蛋白质组学作为连接基因组与临床应用之间的桥梁, 为从整体水平研究临床疾病开辟了更广阔的前景。大多数疾病从蛋白质角度看, 都可以认为是一种蛋白质缺陷病, 在其发生发展的不同阶段, 即使在没有任何症状的早期, 在蛋白质水平上往往就已经发生了变化, 从而影响到机体的功能最终导致疾病的发生。通过蛋白质组学技术, 我们分析相关疾病患者的体液, 建立完整的蛋白质数据库, 结合各种生理病理过程, 利用与疾病相关的多种生物学标志物, 有助于各种疾病的早期发现和治疗。
3.1 蛋白质组学在常见恶性肿瘤中的应用
由于环境污染和不良生活方式的影响, 恶性肿瘤的患病人数和患病率进一步增加。恶性肿瘤的早期发现、早期诊断、早期治疗, 是提高大多数恶性肿瘤患者治疗效果的关键。恶性肿瘤的发生主要是由于相关基因发生突变, 导致蛋白质的空间构象、翻译后修饰发生改变, 造成细胞周期失控, 细胞凋亡机制紊乱, 细胞转移能力提高等方面的异常。蛋白质组学能分析、鉴定正常细胞同肿瘤细胞的蛋白差异, 给疾病的诊断、治疗、预后评估提供有用的信息。
3.1.1 肺癌
肺癌的发病率在我国男性恶性肿瘤发病率中位居榜首, 在女性恶性肿瘤发病率排名中高居第二位, 且男女恶性肿瘤死亡率最高的均为肺癌。全球统计显示, 肺癌在恶性肿瘤发病率中占第三位, 死亡率同样排名第一。数据表明, 70%~80%的肺癌患者就诊时已是中、晚期, 失去了治愈机会, 五年生存率很低, 因而肺癌的早期诊断至关重要。
肖雪媛等[4]用SELDI蛋白质芯片技术检测了30例肺癌 (其中, 15例原发癌、9例转移癌、6例化疗后) 患者的血清和12例正常人血清中的蛋白质谱。与正常人血清蛋白质谱相比, 筛选15种标志蛋白, 其中6种标志蛋白在肺癌患者血清中高表达, 9种呈低表达。用单一标志分子检测肺癌患者血清时, 其敏感度为44.82%~93.1%, 特异度为85%~94%, 其中LCLB-5 (lung cancer low expression biomarker) 在原发性肺癌中敏感性为87.75%~100%。肺癌转移和化疗后这5种标志蛋白的敏感性明显降低。
Yang等[5]应用SELDI蛋白质芯片技术对比、分析了158例肺癌患者和50例正常人血清蛋白质表达谱, 筛选出5种标志物蛋白 (分别为11.493、6.429、8.245、5.335和2.538 k U) , 由它们组成的诊断模型诊断肺癌的敏感性为86.9%, 特异性为80.0%, 阳性预测值为92.4%, 诊断Ⅰ/Ⅱ期肺癌的敏感性为79.1%, 明显优于临床上常用的肿瘤标志物如癌胚抗原 (CEA) 、细胞角蛋白19的片断 (Cyfra21-1) 及神经元烯醇化酶 (NSE) 等。
3.1.2 肝癌
原发性肝癌 (绝大部分是肝细胞癌) 在全球癌症死亡率中居第三位, 在我国为第二位的癌症死因。由于肝癌起病隐匿, 绝大部分患者就诊时已是中、晚期, 预后很差, 早期发现是提高外科干预和远期疗效的前提。甲胎蛋白 (AFP) 被认为是肝癌诊断和判断预后的标志物, 肝细胞癌 (HCC) 组织的诸多特征都与之有关, 但是高分化或分化很差的肝细胞癌组织往往不产生AFP, 而肝硬化患者中AFP也存在一定阳性率, 在临床上AFP存在假阳性和假阴性, 故不少研究者致力于探寻早期诊断HCC的标志物的蛋白质组学研究。
Feng等[6]分析正常、乙型肝炎和HCC血清各20例, 证明了AFP在不同的血清中存在差异。此外还发现, 热休克蛋白27 (HSP27) 、α-1抗胰蛋白酶等7种蛋白在3组标本中差异表达;进一步的蛋白质免疫印迹 (Westen blot) 显示, HSP27存在于90%的HCC患者中, 而正常人血清中不存在, HSP27作为潜在的标志物同AFP联合应用, 有助于肝癌的诊断。
宋森涛等[7]用SELDI-TOF-MS技术对肝癌、肝硬化、慢性乙型肝炎及健康对照组血清进行检测, 发现质荷比为11 492.92的蛋白质波峰强度仅肝癌组织明显增强, 与患者的肝功能、AFP等均无相关性。以波峰的信号噪声比 (S/N) 大于5为标准, 该蛋白质诊断肝癌的灵敏度为50.8%, 特异性为95.6%。故认为质荷比为11 492.92的蛋白质可能是肝癌的生物学标志物, 对AFP阴性患者的实验室诊断可能具有辅助作用。
Paradis等[8]用SELDI-TOF-MS技术研究了82例肝硬化患者的血清 (其中, 44例有肝癌, 38例无肝癌) , 并比较了这两组样品的蛋白质表达情况, 鉴定了一种在HCC组织表达上调、分子量为8.9 k D的蛋白, 此蛋白峰的强度与患者的年龄、性别、AFP水平等无关, 但与肿瘤的大小成正比。序列分析表明, 此蛋白为玻璃体结合蛋白 (vitronectin) 的催化片段 (catalytic fragment) , 可作为合并慢性肝病的HCC患者新的血清标志物。
3.1.3 结直肠癌
结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一, 其发病率和死亡率位居前列。结直肠癌的5年生存率随肿瘤分期的增高而显著降低, 因此, 早期诊断、及时治疗是提高结直肠癌预后的主要因素。目前, 对结直肠癌诊断尚无敏感性和特异性均较高的血清学诊断指标, 有研究者旨在通过对血清中蛋白质组的质谱分析来鉴别结直肠癌、良性疾病和正常人血清蛋白质组构型的指纹图谱。
赵光等[9]应用SELDI-TOF-MS技术, 对预测组的120例血清标本 (其中, 73例结直肠癌患者、31例正常人及16例结直肠良性疾病患者) 进行分析, 并反复分析寻找合理运算规则, 以确定能够区分癌症和非癌症的蛋白组学图谱。结果显示, 预测组中三类血清蛋白质在质荷比为4 467、8 131、8 939、9 192、9 134、8 221、5 928、8 324、11 732共9处, 含量有显著性差异, 得到计算规则, 其分类准确率为98.33% (118/120) , 敏感性为97.26% (71/73) , 特异性为100% (47/47) 。对独立的含120份双盲血清 (其中, 含73例结直肠癌患者的血清、31例正常人的血清及16例结直肠良性疾病患者的血清) 的检测组进行检测, 结果显示, 准确率为96.77% (116/120) , 敏感性和特异性分别为95.89% (70/73) 、97.87% (46/47) 。结果充分说明, 利用SELDI-TOF-MS技术对结直肠癌患者、结直肠良性疾病患者及正常人血清的比较蛋白质组学分析, 应用敏感性和特异性高的血清蛋白质组模板, 可对结直肠癌作出快速和准确的诊断。
另有多个研究小组应用SELDI-TOF-MS技术, 建立了不同的结直肠癌早期诊断模型, 其敏感性和特异性为70%~
100%[10,11]。
蛋白质组学技术可用于直肠癌手术前分子分期, 对判断结直肠癌的淋巴结转移、远处转移有重要意义。徐文鸿等[12]应用SELDI-TOF-MS, 分析了76例结直肠癌患者的血清标本, 建立并验证了分期模型。结果表明, 诊断模型I由6个蛋白质峰组合构建, 其质荷比分别为2 759.6、2 964.7、2 048.0、4 795.9、4 139.8和37 761.6, 鉴别局限性大肠癌 (Dukes A、B期) 和区域性 (Dukes C期) 大肠癌的总准确率为86.7%。诊断模型Ⅱ由3个蛋白质峰组合构建, 其质荷比分别为6 885.3、2 058.3和8 567.8, 鉴别局限区域性 (Dukes A、B、C期) 和系统性 (Dukes D期) 大肠癌的总准确率为75.0%。诊断模型Ⅲ鉴别Dukes A期和B期大肠癌的总准确率为86.2%;诊断模型Ⅳ鉴别Dukes A期和C期大肠癌的总准确率为84.6%;诊断模型V鉴别Dukes B期和C期大肠癌的总准确率为85.7%;诊断模型Ⅵ鉴别Dukes B期和D期大肠癌的总准确率为80.0%;诊断模型Ⅶ鉴别Dukes C期和D期大肠癌的总准确率为78.7%。通过SELDI-TOF-MS技术所筛选的候选肿瘤标志物可以指导大肠癌的综合治疗, 所建立的诊断模型可以辅助临床明确大肠癌的术前分期。
3.1.4 乳腺癌
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤, 死亡率占所有妇女癌症的17%, 居妇女各类恶性肿瘤死亡率的首位。主要原因是早期诊断不及时, 发现时大多数为晚期, 而乳腺原位癌基本可以治愈, Ⅰ期乳腺癌5年生存率是97%, Ⅱ期是75.9%, Ⅲ期仅为45%。因此, 发现乳腺癌早期诊断的标志物成为提高乳腺癌患者生存率和生存质量, 提高治愈率、降低死亡率的关键。
LI等[13]用SELDI-TOF-MS技术检测49例乳腺癌患者和37例非乳腺癌患者的血清蛋白质谱, 分析并筛选出相关标志物, 建立了三个诊断模型。组合构建的诊断模型Ⅰ包括6个蛋白质峰, 质荷比分别为8 611、16 827、25 711、28 931、25 485和2 437, 鉴别乳腺癌和非乳腺癌疾病的敏感性为81.6%, 特异性为78.4%。组合诊断模型Ⅱ也包括6个蛋白质峰, 其质荷比分别为4 470、10 854、19 193、3 883、2 011和7 470, 鉴别Ⅰ期乳腺癌与非乳腺癌的敏感性为80.0%, 特异性为89.2%。组合诊断模型Ⅲ包括、5个蛋白质峰, 其质荷比分别为2 726、27 014、2 247、4 477和19 333, 鉴别Ⅰ期和Ⅱ~Ⅳ期乳腺癌的敏感性为91.2%, 特异性为93.3%。
Sauter等[14]应用SELDI-TOF-MS技术对乳头吸液 (nipple aspirate fluid, NAF) 标本进行蛋白质组学分析, 结果显示, 在乳腺癌和正常乳腺的NAF中有5种差异表达蛋白质, 其分子量分别为6.5、8.0、15.9、28.1和31.8 k D, 其中6.5 k D和15.9 k D的蛋白质敏感性和特异性最好, 在乳腺癌患者中阳性率为25%~84%, 而在正常人中阳性率为0~9%。将NAF的蛋白质组学分析与乳腺X线摄影和物理检查结合可提高乳腺癌的早期诊断率。
3.1.5 白血病
白血病是血液系统的常见恶性肿瘤, 临床上分型较多, 而不同的亚型之间, 所用的治疗方案不同, 其预后结果也不相同, 所以, 对白血病的诊断, 分型显得尤为重要。
Cui等[15]为了明确急性白血病FAB分型中所涉及的关键蛋白, 对61例急性白血病患者进行筛查, 发现髓系相关蛋白8和14仅在M2和M3型中高表达。因此, 这两种标志物蛋白可以作为急性髓系白血病 (AML) 分型标志蛋白, 有利于选择正确的治疗方案。
白血病易出现化学治疗后多药耐药, 其发生原因及机制尚不清楚。而蛋白质组学的发展, 对白血病的发病机制、预后判断、化疗药物选择以及个体化治疗, 带来了重大的意义。血液蛋白质组指血液系统中所表达的全部蛋白质, 运用蛋白质组分析技术, 对白血病细胞的增殖、分化与异常转化机制、早期诊断及治疗等方面进行探索, 阐明蛋白质表达水平的变化与白血病发生发展的一些相互关系及规律, 可为进一步寻找新药和判断预后提供理论依据。因此, 将蛋白质组学应用于白血病研究, 可以为白血病的个体化治疗和预后判断提供理论基础[11]。
3.2 蛋白质组学在老年性神经系统疾病中的应用
目前, 我国已逐步进入老龄社会, 老年性神经系统疾病的发病率日趋升高, 临床上主要有阿尔茨海默症 (AD) 、帕金森病等, 严重危害老年人的健康, 影响生活质量和家庭和谐。这些疾病病因复杂, 表现多样, 目前尚无特异性的实验室诊断手段, 临床上尚未找到特效的治疗方法, 也难以抓住良好的治疗时机。AD是老年性神经系统疾病中最常见的痴呆性疾病, 是继心血管病、脑血管病和癌症之后, 成了老人健康的“第四大杀手”。其实早在出现明显的认知障碍之前, 大脑中就已发生了异常改变。Pasinetti等人利用c DNA微阵列发现AD患者大脑皮质某些基因产物的表达发生改变;后来, 他们进行的一系列平行的高通量蛋白质组研究证实了这一结果, 并发现突触活动中的蛋白质表达在AD早期也有改变。Ueno等[16]分析AD患者血浆蛋白后发现, AD相关蛋白载脂蛋白E、tau-1和早老蛋白2均可在患者血浆中检测到, 提示位于细胞器的tau-1和早老蛋白2外流到血浆中, 并且达到可检测的水平, 对这些蛋白在血浆中异构体的分析将有助于脑部疾病的诊断, 而不需要损伤脑组织。
3.3 蛋白质组学在感染性疾病中的应用
对感染性疾病的研究多集中在致病微生物引起的感染性疾病。对病原体进行蛋白质组学研究, 同时结合血清学对其进行分析, 可为感染性疾病的诊断、治疗、预防等方面的研究, 提供新的手段和依据。研究主要集中在以下几个方面: (1) 寻找新的诊断标志物, 同时为疫苗的研制寻找新的候选抗原; (2) 确定致病菌毒力、研究其新的发病机制; (3) 阐明药物抗菌作用机制、分析致病菌耐药性发生机制, 为新的抗生素的研制寻找靶点。
结核病是一种古老的疾病, 目前在全球呈回升之势, 对人类健康构成严重威胁, 其致病菌是结核分枝杆菌。结核分枝杆菌基因组测序工作的完成, 促进了结核杆菌蛋白质组学研究, 为寻找新的诊断标志物, 同时为疫苗的研制寻找新的候选抗原提供了可能。Hendrickson等[17]用蛋白质组学的方法对结核分枝杆菌进行了研究, 对分离的蛋白质结合串联质谱分析, 鉴定出结核分枝杆菌中的一种新蛋白质, 命名为Mtb81, 用它作抗原建立ELISA法检测了27例结核病患者的血清, 其中25例呈阳性反应, 阳性率为92%, 而45例健康输血员的血清全部呈阴性反应。
O'Conner等[18]对伤寒沙门菌的蛋白质组进行了研究, 他们用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 (2D-PAGE) 分离生长于不同环境条件下的、毒力不同的伤寒沙门菌包膜蛋白, 然后随机选取53种蛋白质进行测序分析, 结果发现, 有20%的蛋白质序列与当前数据库中蛋白质不同, 由此可见, 用蛋白质组学进行伤寒沙门菌毒力分析是十分有益的。
蛋白质组学在致病菌耐药性分析方面具有一定的优势。Cash等[19]对肺炎链球菌的蛋白质进行了研究, 发现抗红霉素肺炎链球菌的蛋白质双向电泳图谱有一种特殊的蛋白质 (p I 6.27, 38.5 k D) , 而对红霉素敏感的肺炎链球菌则不存在该种蛋白质, 经鉴定, 这种蛋白质是3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) 。根据等电点的不同, GAPDH又有三种不同的存在形式, 从抗红霉素的肺炎链球菌内鉴定出来的是碱性最强的GAPDH, 它可降低细胞内红霉素的水平, 其作用机制仍未明了。
4 蛋白质组学研究展望
人类红细胞蛋白质组学研究进展 篇8
1红细胞的蛋白组成
红细胞发源于骨髓造血干细胞,由于没有细胞核和内膜系统,红细胞内的蛋白主要分为膜蛋白、膜骨架及胞浆蛋白。膜蛋白分为内在蛋白和外周蛋白以及脂锚定蛋白;膜骨架蛋白是细胞膜下与膜蛋白相连的由纤维蛋白组成的网状结构,参与维持质膜性状并协助完成其多种生理功能;胞浆蛋白主要为血红蛋白(hemoglobin,Hb),其次还含有碳酸酐酶、硫氧还蛋白过氧化物酶和其它抗氧化酶。
2红细胞蛋白质组学的研究进展
研究红细胞蛋白质组学,需要了解红细胞中每种蛋白质的氨基酸序列、转录后修饰以及每个细胞内蛋白质含量及蛋白间的相互作用。现代质谱技术和生物信息学的应用,使人们对红细胞蛋白质组学有了深层次的认识。2002年之前人们对红细胞蛋白质组学的研究并未全面展开,尔后随着这一领域相关研究技术的进展,红细胞蛋白质组学的研究紧密跟进。2002年,Low等首次使用双向电泳分离红细胞膜蛋白,银染后用MALDI-TOF质谱鉴定出84种膜蛋白。之后,Kakhniashvili等利用经典的RBC分离技术,联合Shotgun蛋白质组学分析方法和ThermoF innigen LCQ DECA XP离子阱串联质谱鉴定了RBC中181种膜蛋白和胞浆蛋白,其中包括血型糖蛋白A和C及只有几百拷贝数的其他蛋白(如基细胞黏连分子B-CAM)。Neelam等[2]利用免疫共荧光和蛋白质免疫印迹证明,RBC中存在蛋白酶体亚型和完整的蛋白酶体,打破之前RBC中没有蛋白酶体降解蛋白的研究报道。2006年底,Pasina等[3]利用四极杆-飞行时间串联质谱和Thermo热电混合线性离子阱傅里叶变换质谱鉴定出RBC内566种蛋白质,包括314种膜蛋白和252种可溶性蛋白质。同时,Pasini等用乙醇和碳酸钠优化膜蛋白提取方法,对蛋白质鉴定产生实质性技术上的贡献。至此,忽略转录后修饰和蛋白水解,共鉴定出751种RBC蛋白质。随着肽配体库和质谱技术的发展,2008年,Roux-Dalvai等[4]通过快速和高通量Electron LTQ Orbitrap质谱成功鉴定出1578种RBC胞质蛋白。2010年,Proteominer技术的应用使红细胞蛋白质数量增加1 331种,达到2 082种[5]。2010年至今,红细胞蛋白质组学的进展主要集中在膜蛋白领域。van Gestel等[6]用双向蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术从524种膜蛋白中鉴定出其中67种是胞浆蛋白。最近,这项技术被拓展为四维正交凝胶系统。该系统由非变性电泳部分及变性电泳部分组成。通过非变性电泳对RBC及Raji细胞胞质蛋白的分离并结合SDS-PAGE和质谱分析,确定了六种蛋白质复合体,即蛋白酶体20S核心复合体、Hb A、Hb A2、过氧化物氧化酶-2(peroxiredoxin-2,Prx2)、碳酸酐酶-1(carbonic anhydrase-1,CA1)以及热休克蛋白60(heat shock protein 60,HSP60)复合体。从中选择四种具有不同分子量和等电点的复合体:CP、Hb A、Prx2及HSP60进行变性电泳蛋白质组学分析,结果表明,4-DES不仅适用于复杂生物样品中的蛋白质复合体及蛋白质相互作用的研究,而且可用于复杂稀释样品中完整蛋白质复合体的分离富集[7]。De Palma等[8]将完整RBC用胰蛋白酶消化后分离膜蛋白,将其用Triton X-100溶解后分离可溶部分和膜骨架,将二者再用胰蛋白酶消化,用Mud PIT技术和线性离子阱LTQ质谱对这三部分进行蛋白鉴定。结果显示,确定的299种蛋白中211种是膜蛋白。Speicher等[9]用SDS-PAGE分离红细胞膜蛋白后将凝胶分成30等份,之后用LTQ-Orbitrap XL质谱分析鉴定了842种蛋白。创新性的方法的应用,使红细胞蛋白质总数从2010年的2082上升到2 289,仅增加了207种。因此,要鉴定所有的RBC蛋白质还有很长的路要走,这有待于更高灵敏度和准确性的质谱技术进一步发展。
3红细胞蛋白相互作用的研究
蛋白质通过与其它物质(蛋白质,核酸,小分子等)相互作用而行使其功能,一旦这种有序的相互作用遭到破坏,就会导致疾病甚至死亡。因此,蛋白质与其它物质的相互作用成为人类疾病预防和治疗的重要对象,而蛋白质与蛋白质之间的相互作用又成为其中最关键的一部分。在高通量RBC及RBC膜蛋白质组数据获得后,关于RBC内蛋白质之间的相互作用主要是通过生物信息学进行预测。初步的红细胞相互作用分析是基于Uni HI数据库[9,10]。Goodman等最初基于已发现的RBC内751种蛋白建立了RBC蛋白相互作用网络,并发现751种蛋白中有279种与其它蛋白之间存在相互作用。在对红细胞蛋白质相互作用的研究中重要的发现是“损伤和修复”盒,此盒主要由蛋白酶体亚基、伴侣分子、热休克蛋白组成,对红细胞的损伤修复至关重要。Ammann和Goodman[11]用称为广泛拓扑重叠分析的方法对节点的相似性进行统计学的聚类分析。运用这样的方法发现在镰刀形红细胞贫血中“损伤和修复”盒中的蛋白酶体亚基发生改变。这之后有学者提出了VDG的概念对红细胞蛋白质之间的相互作用进行分析,认为这是一种比聚类分析更快速的分析方法[12]。
4疾病的红细胞蛋白质组学
早期对RBC蛋白质组学与疾病关系的研究是利用双向电泳来比较疾病组织与正常组织中的蛋白质含量。Jiang等[13]用这样的方法比较正常人群和2型糖尿患者之间膜蛋白的差异,在2型糖尿患者的膜蛋白中发现了27个上调点和15个下调点。经MALDI TOF质谱分析发现脂筏蛋白、Flotlin 1、精氨酸酶增加,突触融合蛋白1C减少。推测融合蛋白减少会导致2型糖尿病红细胞膜Glut 4糖尿病载体减少,推测由于精氨酸酶增加而与一氧化氮合酶竞争,从而减少一氧化氮产生。Tonge等[14]利用2D-DIGE研究纯合子镰状细胞疾病(sickle cell disease,SCD)时发现,SCD红细胞膜蛋白中有38个点增加,而纯合子SCD中有11个点增加。用Nano LC MS/MS串联质谱对44个点进行鉴定发现其中有22个有转录后修饰,而纯合子中的蛋白多数与氧化应激有关。Prabakaran等[15]用2D-DIGE对精神分裂患者的红细胞蛋白进行了研究。研究发现,Spectrinα和β-actin的改变可能会影响转录后修饰的改变,而硒绑定蛋白1可作为一种精神分裂症的生物标志物。最近对疾病与红细胞蛋白质组学的研究主要是利用蛋白质组学对疾病的分子基础、疾病进程等进行研究,疟疾、溶血性贫血、阿尔茨海默病、慢性肾病等红细胞膜蛋白组学的相关研究取得了一定的进展。
蛋白质组学在肿瘤研究中的应用 篇9
关键词：蛋白质组学,肿瘤研究,应用
随着人类基因组计划的完成, 生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代, 生命科学的主要研究对象是功能基因组学, 包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。[1]1994年澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams提出了蛋白质组 (Proteome) 的概念。[2]2001年2月, 《Nature》和《Science》杂志对蛋白质组学研究进行了述评与展望。[3,4]蛋白质组学有别于传统的单个基因或单个蛋白的研究模式, 从机体或细胞的整体水平上来阐明生物体全部蛋白质的表达、修饰、结构功能和相互作用, 以及蛋白质和核酸之间的相互作用, 对生命的复杂活动有全面和本质的认识, 在整体、动态和网络水平上对蛋白质进行研究。肿瘤是由环境和遗传因素相互作用的多基因、多蛋白质参与的疾病。蛋白质组学 (Proteomics) 可全面、动态、定量地分析比较正常与癌变标本中蛋白质种类和数量的改变, 不仅有助于肿瘤发病机制的阐明, 还能筛选和鉴定蛋白质特异性标记和特异性抗原, 在肿瘤的早期诊断、治疗和新药研制方面, 具有广阔的应用前景。[5]
一、蛋白质组学在肿瘤研究中的方法
随着后基因组时代的到来, 蛋白质组研究为尽早发现肿瘤标志物提供了可能, 各种技术方法的发展为其运用于肿瘤临床诊断创造了条件, 目前蛋白质组学技术在实验诊断与临床医学中已经得到越来越多的应用, 在蛋白质组学研究中, 蛋白质分离技术、生物质谱技术、生物信息学这三项技术对实验诊断与临床医学发展有决定性的影响, 尤其对肿瘤的早期诊断至关重要。[6]蛋白质组学在肿瘤研究中的主要方法和技术如下。
(一) 双向凝胶电泳技术 (two-dimensional gel electrophoresis , 2DE) 。
该技术主要用于分离细胞或组织蛋白质抽提物, 构建特定组织或细胞蛋白质的“二维电泳图谱”, 分析特定条件下蛋白质的表达状况, 进行蛋白质组差异比较。2DE技术凭借其高通量、高灵敏度、高分辨率和重复性好, 便于计算机进行图像分析处理, 可以很好地与质谱分析等鉴定方法匹配的优点, 已成为目前蛋白质组学研究中最常用的蛋白质分离技术。其他的蛋白质分离技术有液相色谱和毛细管电泳技术。尤其是新近发展的液相色谱技术可与质谱联用, 具有高分辨率, 可直接用于高复杂性蛋白质混合物的分析, 对低丰度蛋白的检测能力超过了2D-PAGE。[7]
(二) 质谱技术。
蛋白质组学研究中常用的质谱技术有: (1) 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS) 技术; (2) 电喷雾串联质谱 (ESI2MS/MS) 技术; (3) 表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱 (SELDI-TOF-MS) 技术等。其中SELDI-TOF-MS应用基因芯片的设计理念, 把层析、质谱等技术合理应用于蛋白芯片的检测, 不需进行蛋白质的双向电泳, 能快速、简便地从各种体液和组织中找出疾病相关蛋白质。其最大特点是快速、简便、易行、样品用量少和高通量分析, [8]有潜在的临床应用前景。近来质谱技术与液相色谱联用 (liquid chromatography/ tandem mass spectrometry.LC2MS/ MS) , 具有在高复杂性样本中鉴定低丰度蛋白质的强大功能。有高敏感性和分辨率, 具有较大的动态检测范围, 且所需时间较短, 每次操作时间不超过11h, 可用于大规模临床蛋白质组分析。[9]
(三) 蛋白质组的生物信息学。
生物信息学其在蛋白质组中的研究有两个重要应用: (1) 构建和分析双向凝胶电泳图谱; (2) 数据库的搜索与构建。在后基因组时代, 生物信息学的研究内容已经从对基因组和蛋白质组数据的高效分析, 转移到比较基因组学、代谢网络分析、基因表达谱网络分析、蛋白质结构与功能分析以及药物靶点筛选等, 分别与功能基因组、蛋白质组、结构基因组等研究领域互相配合、紧密相关, 成为目前极其热门的系统生物学研究的重要基石。[10]蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础。生物信息学的发展已给蛋白质组研究提供了更方便有效的计算机分析软件, 特别值得注意的是蛋白质质谱鉴定软件和算法发展迅速。最近发展的质谱数据直接搜寻基因数据库使得质谱数据可直接进行基因注释, 判断复杂的拼接方式。
二、蛋白质组学在肿瘤诊断中的应用
蛋白质组学技术通过比较正常细胞与疾病细胞等各类细胞间的多种差异蛋白的表达, 寻找与疾病发生发展相关的关键蛋白可深入探讨疾病的产生机制, 通过质谱分析等技术确认差异蛋白, 为疾病提供早期诊断依据。贾继辉[11]等运用固相PH梯度双向凝胶电泳等技术, 筛选出猴病毒40转化的人胃黏膜上皮GES-1, 与人胃癌细胞MGC-803间若干与肿瘤发生密切相关的差异表达蛋白质。这种差异蛋白分析有助于深入研究胃癌的发生发展机制, 进而为胃癌的早期诊断和防治提供依据。龙云铸[12]应用双向凝胶电泳和质谱技术, 分析乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌HCC癌组织与癌周肝硬化组织之间的蛋白质组差异, 鉴定其中的差异蛋白质点, 发现有表达水平存在显著差异的蛋白质点35个, 14个差异蛋白质点得到了初步鉴定, 其中癌组织凝胶中表达明显的蛋白质有8个:在癌组织中表达明显降低而在肝硬化组织中增强的蛋白质有6个。这为进一步阐明肝癌的发病机制和早期诊断, 奠定了良好的实验基础, 可能有助于癌变机制、肿瘤标记和治疗靶标的进一步研究。
三、蛋白质组学在肿瘤药物研发上的应用
(一) 发现药物作用新靶点定向合成有效药物。
疾病相关蛋白质组学可以提供一种发现和鉴定在疾病作用下表达异常蛋白质的方法。这种蛋白质可以作为药物筛选的靶点。疾病特异性蛋白的不断发现为药物设计提供了丰富的靶点:如Chen等应用蛋白质组学对MCF27乳腺癌细胞在加0.1μmol/L抗肿瘤药阿霉素2d后的蛋白质表达变化进行了研究, 结果发现热休克蛋白27 (HSP27) 变化最为显著;以HSP27作为药物靶点有可能开发出新的抗乳腺癌药物。Oda等采用蛋白质组学技术对有生物活性但未知靶点的化合物进行探测靶点研究, 成功发现了E7070类抗肿瘤药物特异结合蛋白靶点, 以此靶点为研究对象可进一步合成有效药物, 并应用于临床治疗。
(二) 药物作用机制的研究。
通过运用蛋白质组学高通量地对比分析药物作用前后蛋白质表达谱或蛋白质表达丰度的改变有助于药物的作用机制的研究。如Steiner等通过分析抑制素类降胆固醇化合物对小鼠肝脏蛋白质组的影响从药物治疗前后表达变化的蛋白质中鉴定出合成酶, 从而阐明了该类降胆固醇药物的作用机制。此外, 药物蛋白质组学的应用可使药物的子药理机制研究更快速和准确。Bruneau等应用蛋白质组学对白色念珠菌在给予吡啶类药氟康唑和伊曲康唑以及mulundcadin类药物后的基因表达的变化, 发现mulundcadin类药物作用机制为抑制3D葡聚糖合成酶的表达, 而吡啶类药的作用机制为抑制麦角固醇合成酶的表达。上述研究提示通过蛋白组学研究明确分子药理机制, 可使药物作用的关键靶点更加清晰, 为药物研制带来新的思路和途径。
(三) 药物毒理机制的研究。
蛋白质组学在药物研究上的应用使人们对药物毒理机制的认识达到了一个新高度。通过这方面的研究, 可以使许多药物的毒副作用得到准确而快速的揭示。尽管一些药物的毒性在临床上早已为人所知, 但对其机制并不完全清楚。如庆大霉素明显的毒副作用是肾毒性, Kennedy等运用蛋白质组学研究了庆大霉素治疗后的大鼠血清标本, 发现了评价庆大霉素毒性的非侵入性标志物。此外, 蛋白质组学与传统方法的有机结合在鉴定药物毒理机制上具有重要意义。如Heijne等将蛋白质组学和基因组学结合起来研究溴苯的毒性发现了溴苯诱导多个基因的表达的特性, 表明了二者相结合的重要性。
四、蛋白质组学在肿瘤治疗中的应用
蛋白质组学研究现已在多种人类肿瘤组织或细胞系如卵巢癌、子宫癌、肾癌、胃癌中开展, 并取得了一些成果。
(一) 胃癌。
胃癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤, 在高病死率的恶性肿瘤中胃癌居首位。提高胃癌患者生存率、降低病死率关键在于早发现、早诊断及早治疗, 而积极寻找敏感性和特异性较高的胃癌标记物为胃癌早诊断提供了强有力的手段。Ebert等[14]利用SELDI-TOF-MS技术对胃癌和健康人血清进行研究建立了一个包含50个决策树的分类模型, 在诊断胃癌的特异性和敏感性都达到100%。而Landuyt等[15]对胃肠道间质瘤 (GIST) 的研究发现, C-kit基因中外显子9和外显子11突变的2组肿瘤, 应用SELDI-TOF-MS检测蛋白质质谱发现有154个不同的蛋白质表达, 提示C-kit基因不同外显子突变的GIST可能具有完全不同的表现。
(二) 肺癌。
肺癌已成为本世纪发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一, 严重危害人类健康和生命。Ying等[20]利用蛋白质技术探讨肺组织癌变过程。对原代细胞R15H和经238Pu高能量α粒子照射HPV218永生化人支气管上皮细胞BEP20得到早期传代细胞R15H20, 用蛋白质技术分析, 发现两系细胞中有43个蛋白质点强度改变, R15H20与R15H相比, 21种蛋白表达增加, 22种蛋白表达减少;3种蛋白质仅在R15H细胞表达, 其中2种被确定为高移动蛋白组1;在R15H20细胞中减少的2种蛋白被确定为maspin前体。
(三) 乳腺癌。
乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤, Luftner等[16]应用蛋白质组学发现了分子量为2813KD的血清蛋白NMP66, 其对乳腺癌早期诊断 (无腋窝淋巴结转移) 的特异性达到100%, 且对导管内癌的诊断敏感性高达80%, 可作为预测导管内癌术后复发及治疗效果的重要指标。Wright等[17]也发现NMP66在健康人和乳腺纤维瘤患者以及乳腺良性疾病中均不存在。Alaiya等[18]研究发现, 在不同临床病理类型中蛋白质表达形式也有所不同, 侵袭性癌中核增殖抗原和某些膜蛋白质如HSP90、PHSP60等存在高度表达, 而在乳腺纤维腺瘤和侵袭性癌之间共有24个已知蛋白的差异表达。
(四) 宫颈癌。
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤, 近年来发病率有明显增高及年轻化的趋势, 严重威胁了广大妇女健康。Matsui等使用22DE和MALDI2TOF～MS技术在ME2180宫颈癌细胞中鉴定出IFNγ、TNF调节蛋白和三种细胞因子调节蛋白 (丙糖酸磷酸化异构酶、蛋白酶体亚单位C3及GTP连接蛋白RAN) 。Sahota等[19]使用WSQ4蛋白芯 (0220000Da) , 在50例患者 (包含宫颈癌和非癌患者) 中检测到32个蛋白峰, 它们全部出现在阳性组或对照而在另一组缺如, 说明宫颈癌组细胞的蛋白与非癌组有明显差异。
(五) 卵巢癌。
由于卵巢位于盆腔深部, 不易扪及或查出, 80%的患者就医时卵巢的恶性肿瘤都不是早期, 医学上对其至今都缺乏有效的早期诊断方法, 故卵巢癌已成为严重威胁妇女生命的肿瘤。Moshkovskii等[20]采用SELDI2TOF2MS、22DE及HPLC方法对27份卵巢癌标本中的蛋白质组进行了分析, 结果发现15份 (55.6%) 标本中出现1117kDa及11.5kDa双峰, 而对照组34份中仅有2份 (5.8%) 出现双峰现象, 同时发现11.7kDa的本质为血清淀粉A1, 11.5kDa为其N2末端缺少精氨酸的变构体, 二者皆可作为早期卵巢癌的肿瘤标志物。Yu等[21]采用SELDI2TOF2MS方法研究了32例卵巢癌肿瘤标本, 29例作为健康对照, 结果发现了5种潜在的肿瘤标志物:2085Da、5881Da、7564Da、9422Da、6044Da, 其敏感度、特异性和阳性预测值皆可达到96.7%。
五、展望
植物细胞核蛋白质组学研究进展 篇10
1 植物细胞核与核蛋白质的制备
目前的植物细胞核蛋白质组学研究,主要是从植物幼苗或悬浮培养细胞中提取细胞核。从幼苗中提取细胞核,首先在低温条件下将幼苗研磨成粉末,进而通过以Percoll为介质的密度梯度离心富集细胞核[1]。从悬浮培养细胞中提取细胞核,利用匀浆机破碎或细胞壁水解酶除去细胞壁,然后通过改变细胞内外渗透压破碎原生质体,并利用密度梯度离心富集细胞核[1]。获得细胞核以后,通常利用DAPI染色后的显微观察,或通过测定细胞核制备液中叶绿素含量等方法来评价细胞核的纯度。然后利用酚抽法或TCA丙酮沉淀法提取细胞核蛋白质。进而,以组蛋白或核仁纤维蛋白为细胞核标记蛋白质,通过免疫印迹实验来检测细胞核蛋白质的纯度,也可通过检测过氧化氢酶活性来评价细胞核蛋白质的纯度。
2 水稻细胞核蛋白质组学
水稻(O.sativa)是重要粮食作物,也是进行分子生物学研究的良好模式植物。Aki et al[2]利用蛋白质组学技术鉴定了563种水稻细胞核蛋白质,其中307种为DNA结合蛋白质。这些蛋白质中除了包括mRNA转录和剪切相关的因子外,还包括参与糖信号传递的己糖激酶,以及参与蛋白质相互作用的WD40类蛋白等。此外,Choudhary et al[3]鉴定了水稻响应干旱胁迫过程中的109种细胞核蛋白质,这些蛋白质主要参与胁迫防御、信号转导、染色质重塑、基因调控、转录调节、蛋白质合成与降解等过程。其中受干旱胁迫影响的蛋白质主要包括:参与胁迫早期应答的受体类蛋白激酶、33-kDa分泌蛋白、酪氨酸磷酸酶类蛋白质、无机焦磷酸酶,参与细胞代谢活动的氨基转移酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、甲基转移酶、硫甲基转运酶,以及参与细胞防御的超氧化物歧化酶等[3]。
3 维柯萨细胞核蛋白质组学
维柯萨(X.viscosa)是典型的复苏植物,其叶片组织相对含水量可以降低到5%,在持续干旱80 h后复水,叶片仍可以完全恢复。Abdalla et al[4]鉴定了维科萨叶片细胞核中18种干旱应答蛋白质。其中参与基因表达(如反转录酶、锌指解旋酶和内含子成熟酶)、蛋白质合成(如核糖体蛋白L28和蛋白翻译延伸因子)、蛋白质折叠(如分子伴侣)、蛋白质降解(如蛋白水解酶),以及能量代谢(如ATP合成酶α链)等蛋白质表达受到干旱诱导。这表明维柯萨通过调节特定基因表达与蛋白质折叠等应对干旱胁迫[4]。
4 洋葱细胞核蛋白质组学
洋葱(A.cepa)根分生组织具有持续或周期性分裂能力,是研究细胞周期与细胞增殖的良好材料。GonzálezCamacho et al[5]比较分析了洋葱根分生组织和非分生组织细胞核蛋白质组的差异。他们利用双向电泳技术在根分生组织中检测到384个蛋白质点,在非分生组织中检测到209个蛋白质点。其中,一些人们熟知的细胞核蛋白质,如RNA聚合酶Ⅰ、B23和类核仁蛋白NopA100在细胞增殖过程中表达量明显上升。进而,他们通过双向电泳结合Western杂交实验在分生组织样品中检测到26个NopA100的蛋白质斑点,而在非分生组织中只检测到7个蛋白质斑点。这表明,NopA100被磷酸化的程度与细胞核的活性相关,在细胞周期过程中NopA100可能被高度磷酸化。
5 拟南芥细胞核蛋白质组学
拟南芥(A.thaliana)是基因组背景清楚的模式植物,适用于细胞核蛋白质组学研究。Jones et al[6]鉴定了拟南芥悬浮培养细胞细胞核表达的345种蛋白质中的416条磷酸化多肽,极大地丰富了细胞核磷酸化蛋白质数据库。其中一些蛋白质(如转录因子、染色质重塑蛋白质、RNA沉默组分和剪切体等)磷酸化位点是新鉴定到的。这些信息为进一步研究蛋白质翻译后修饰在植物细胞中mRNA的转录、可变剪切与沉默过程中的作用提供了重要线索。Calikowski et al[7]成功分离了拟南芥悬浮培养细胞的细胞核基质,并利用双向电泳技术分离得到300个核基质蛋白质斑点。他们鉴定到了36种核基质蛋白质,主要包括核仁蛋白质IMP4、Nop56、Nop58、纤维蛋白和核仁素等,也包括核糖体蛋白质、组蛋白去乙酰化酶、翻译起始因子、热激蛋白和DnaJ等。这些为深入研究核仁甲基化作用和核仁定位等生物学功能提供了重要信息。此外,Pendle et al[8]鉴定了拟南芥悬浮培养细胞核仁中的217种蛋白质。他们对其中72种蛋白质进行了GFP融合蛋白表达,结果表明87%的蛋白质表现为核仁或核仁相关定位。他们还意外地发现6种外显子联接复合体(exonjunction complex)的组分,为深入研究植物细胞mRNA向细胞核外运输和无义介导的mRNA降解(Nonsense-mediated mRNA decay)提供了线索。
6 鹰嘴豆细胞核蛋白质组学
鹰嘴豆(C.arietinum)是豆科草本植物,也是重要的粮食作物。Pandey et al[9]利用双向电泳技术分离得到了鹰嘴豆幼苗细胞核中表达的600多个蛋白质斑点,并利用液相色谱结合质谱技术鉴定了150种蛋白质。其中,多数蛋白质参与信号转导和基因表达(占36%),以及DNA修复与转录(占17%)。这也是对基因组未知植物物种细胞核蛋白质组的首次报道。他们进一步分析了鹰嘴豆幼苗147种干旱胁迫应答细胞核蛋白质组的变化。这些蛋白质包括重要的调控蛋白质和功能蛋白质,如:各种分子伴侣,以及参与基因转录与复制、细胞信号转导、染色质重塑的蛋白质[10]。
7 大豆细胞核蛋白质组学
大豆(G.max)是重要的粮食作物和油料作物,由真菌(Phakopsora pachyrhizi)引起的大豆锈病对大豆产量有很大影响。Cooper et al[11]利用高通量液相色谱结合质谱技术比较了易染病大豆品种Williams 82与含有Rpp1抗性基因的Williams 82近等基因系叶片细胞核蛋白质组的差异。他们鉴定到了4 975种细胞核蛋白质,并发现其中847种蛋白质被磷酸化修饰,其中大量蛋白质是核调控蛋白质与转录因子。这些结果表明,真菌侵染会诱导细胞核蛋白质的表达与翻译后修饰。
8 展望
近年来的植物细胞核蛋白质组学研究为深入分析植物基因表达与调控机制提供了重要信息。但是由于受到蛋白质分离技术和质谱检测灵敏度的限制,对一些低丰度表达核蛋白质的鉴定仍然是植物细胞核蛋白质组学研究的瓶颈。今后,随着更多植物种类全基因组序列测定的完成,以及蛋白质分级与鉴定技术的完善,对更多物种细胞核蛋白质组进行研究将成为可能。同时,深入分析细胞核蛋白质的翻译后修饰与相互作用将为解析植物发育与环境应答的调控机制提供更重要的信息。
参考文献
[1]CALIKOWSKI T T,MEIER I.Isolation of nuclear proteins[M]//SANCHEZ-SERRANO J J,SALINAS J.Arabidopsis protocols:Methods in molecularbiology.Totowa New Jersey:Humana Press,2006:393-402.
[2]AKI T,YANAGISAWA S.Application of rice nuclear proteome analysisto the identification of evolutionarily conserved and glucose-responsivenuclear proteins[J].J Proteome Res,2009,8(8):3912-3924.
[3]CHOUDHARY M K,BASU D,DATTA A,et al.Dehydration-responsivenuclear proteome of rice(Oryza sativa L.)illustrates protein network,novel regulators of cellular adaptation,and evolutionary perspective[J].Mol Cell Proteomics,2009,8(7):1579-1598.
[4]ABDALLA K O,BAKER B,RAFUDEEN M S.Proteomic analysis ofnuclear proteins during dehydration of the resurrection plant Xerophytaviscose[J].Plant Growth Regul,2010(62):279-292.
[5]GONZALEZ-CAMACHO F,MEDINA F J.Identification of specific plantnucleolar phosphoproteins in a functional proteomic analysis[J].Proteo-mics,2004,4(2):407-417.
[6]JONES A M,MACLEAN D,STUDHOLME D J,et al.Phosphoproteomic analysis of nuclei-enriched fractions from Arabidopsis thaliana[J].JProteomics,2009,72(3):439-451.
[7]CALIKOWSKI T T,MEULIA T,MEIER I.A proteomic study of the Arabidopsis nuclear matrix[J].J Cell Biochem,2003,90(2):361-378.
[8]PENDLE A F,CLARK G P,BOON R,et al.Proteomic analysis of theArabidopsis nucleolus suggests novel nucleolar functions[J].Mol BiolCell,2005,16(1):260-269.
[9]PANDEY A,CHOUDHARY M K,BHUSHAN D,et al.The nuclearproteome of chickpea(Cicer arietinum L.)reveals predicted and unexp-ected proteins[J].J Proteome Res,2006,5(12):3301-3311.
[10]PANDEY A,CHAKRABORTY S,DATTA A,et al.Proteomics approachto identify dehydration responsive nuclear proteins from chickpea(Cicer arietinum L.)[J].Mol Cell Proteomics,2008,7(1):88-107.