蛋白质复合体（精选11篇）
蛋白质复合体 篇1
皮肤具有保护机体内环境并维持其稳定的作用和功能,皮肤烧、创伤后治疗的最终目标就是促进创面愈合,重建或恢复皮肤屏障功能。创面愈合的基本过程包括止血、炎症反应、细胞增殖、伤口收缩、组织的重塑等[1],上述过程都需要符合细胞生长的微环境,任何影响这些过程和环境的因素都会影响创面的愈合。性能优良的生物敷料既可暂时起到皮肤屏障功能的部分作用,保护伤口,防止水分与体液从创面蒸发和流失,防止污染,同时又可加速皮肤附件形成的再生上皮化过程,有效减轻患者的疼痛,为新皮生长提供一个有利于创面愈合的环境。因此寻找和制造理想的生物敷料是创伤修复研究的重要任务之一。本实验将胶原蛋白-壳聚糖(8:2)、明胶-透明质酸(9:1)复合纳米纤维膜作为一种生物敷料用于SD大鼠背部全层皮肤缺损创面修复,进行蛋白质-多糖复合纳米生物材料促进皮肤缺损的动物实验研究。
(A:胶原蛋白-壳多糖复合纳米纤维膜组;B:明胶-透明质酸复合纳米纤维膜组;C:对照组)
1 材料与方法
胶原蛋白-壳聚糖(8:2)复合纳米纤维膜[1,2,3,4]、明胶-透明质酸(9:1)复合纳米纤维膜[5,6]均来自东华大学化学工程学与生物工程学院生物材料与组织工程学实验室,经环氧乙烷灭菌,灭菌后室温放置[7]。动物实验前将生物材料放置在适量生理盐水中软化、剪切成2×1.5 cm2备用。
实验动物为60 d大小的雌性SD大鼠45只,约200g/只,随机分成三组,每组15只,即胶原蛋白-壳多糖复合纳米纤维膜组(A)、明胶-透明质酸复合纳米纤维膜组(B)、对照组(C)。将SD大鼠麻醉(10%水合氯醛, 0.3mL/100g)、固定后,在其颈胸交界背部造成2.0×1.5 cm2全层皮肤缺损区域;实验组A、实验组B分别用胶原蛋白-壳聚糖复合纳米纤维膜、明胶-透明质酸复合纳米纤维膜覆盖后,用油纱及干纱布包扎并创缘外缝线打包固定;对照组仅用油纱及干纱布包扎并创缘外打包固定。术后SD大鼠分笼饲养,分别于第3天、第7天、第14天在每组中随机抽取5只SD大鼠观察创面情况,并取背部创面组织标本行HE切片染色观察(普通光学显微镜Olympus显微镜,日本)。
(A:胶原蛋白-壳多糖复合纳米纤维膜组;B:明胶-透明质酸复合纳米纤维膜组;C:对照组)
2 结果
2.1 第3天各组实验动物创面大体情况及创面组织HE切片染色情况
第3天各组实验动物健康状况良好;可见实验各组动物创面红润,渗出较多,渗出液颜色淡红,外被纱布辅料被浸湿,创缘略收缩;材料方面:A组材料较完整,与创面粘合紧密;B组材料破碎,点状脱落;对照组创面干净,渗出较少,创缘收缩不明显。HE切片染色后显微镜下见有少量坏死组织,毛细血管增多、扩张,毛细血管内充血,大量炎性细胞浸润,以中性粒细胞为主,各组的炎症反应无明显差别(图1)。
2.2 术后7 d各组实验动物创面大体情况及创面组织HE切片染色结果
术后7 d各组实验动物健康状况良好;实验各组动物创面红润,渗出较多,渗出液淡红,有感染迹象;A组材料大多比较完整, B组材料多脱落,两实验组创面面积与第3天相比有缩小;对照组创面结痂,创面收缩较明显。HE切片染色后显微镜下见创缘有大量上皮细胞向创面中心爬行,毛细血管扩张、充血,大量纤维蛋白渗出,炎性细胞浸润明显,以中性粒细胞、淋巴细胞为主(图2)。
2.3 术后14 d各组实验动物创面大体情况及修复组织HE切片染色结果
术后14d各组实验动物健康状况良好;创面干净,干痂,无渗出,创缘收缩明显,创无感染迹象; A组在切取的创面标本中能见创面上方有材料残留;B组材料大多于术后早期脱落,对照组创面修复情况较实验组差(图3)。HE切片染色显微镜下见毛细血管扩张、充血明显,毛细血管数量较前期有减少,代之以纤维含量增多,排列较整齐,炎性细胞浸润较前期减少,以淋巴细胞、中性粒细胞等为主,对照组炎性细胞浸润尤甚(图4)。
(A:胶原蛋白-壳多糖复合纳米纤维膜组;B:明胶-透明质酸复合纳米纤维膜组;C:对照组)
(A:胶原蛋白-壳多糖复合纳米纤维膜组;B:明胶-透明质酸复合纳米纤维膜组;C:对照组)
3 实验结论
纳米生物技术是国际生物技术领域的前沿和热点问题,纳米复合生物材料以其优良的组织细胞相容性、力学性能、适当的孔径在生物医学工程领域得到了广泛的应用[8]。理想的创伤敷料应当具有以下特点: ①良好的生物相容性;②良好的亲和性,能均匀、紧密地粘附在创面上;③形成良好的透水、透气功能,使伤口保持高湿、微酸、低氧环境;④阻止细菌侵入和抑菌;⑤控制和吸收创面渗液;⑥保持、促进肉芽和上皮组织正常生长,促使创面愈合,不留瘢痕;⑦具有一定的机械强度、柔软、不产生变形[9]。胶原是哺乳动物体内含量最多的蛋白质,它具有生物相容性好、易降解、低抗原性的特性,是组织工程支架中广泛使用的一种生物材料[10]。然而单纯的胶原降解速度快、机械强度小,不能很好的促进受损组织的再生。壳聚糖由在自然界广泛分布的甲壳素经脱乙酞化处理制得,属于天然生物可降解材料,具有良好的生物相容性和生物安全性等特点[11,12]。还可通过早期诱导胶原合成而抑制创面收缩[13]。但壳聚糖成膜后降解时间较长,为了缩短降解时间,将壳聚糖与生物相容性好,易降解的胶原按一定比例混合,可在一定程度上改善其性能,弥补其各自的缺点[14,15]。再通过胶联处理,制备的胶原-壳聚糖多孔材料,微观下成蜂窝状的多孔结构,结构较为均一,孔径在80～150um范围之内,研究表明,此种生物材料适合表皮细胞、真皮成纤维细胞的迁移和生长,可以作为一种构建组织工程皮肤的良好支架材料[16,17]。明胶是胶原经温和断裂后的产物, 它与胶原具有相同的化学组成, 保留了胶原大部分的优良理化性能, 且又由于降解赋予了它新的性能。与生物组织具有良好的亲和性,有促进细胞粘附和生长的性能,但由于明胶膜质脆、力学性能差, 限制其广泛使用[18,19]。透明质酸广泛分布于动物和人体结缔组织细胞外基质中,在眼玻璃体、脐带、皮肤、软骨和滑液中含量较高,透明质酸分子内不含硫酸基团,也不与蛋白质共价结合,能以自由链形式在体内游离存在[20]。透明质酸与其他硫酸化粘多糖和胶原蛋白、弹性蛋白等纤维状蛋白质共同组成含大量水分的细胞外基质,共同形成细胞外空间,为细胞提供信息,有利于营养物质的供应和代谢物的排放[21]。 将不同浓度的透明质酸溶液与明胶溶液共混制备的明胶-透明质酸薄膜材料明显提高了薄膜的亲水性和柔韧性[22]。透明质酸的加入改变了明胶薄膜表面的亲疏水性、表面自由能、荷电特性与化学结构等理化性能,这些都会影响到细胞的黏附和生长增殖行为,而这些因素之间又会相互影响相互制约。所以与单独的透明质酸溶液相比,透明质酸在明胶-透明质酸混膜中对成纤维细胞的黏附和生长增殖的作用是很明显的[23]。本次实验将纳米高分子材料胶原蛋白-壳聚糖(8:2)、明胶-透明质酸(9:1)按照这样的比例共混合成纳米复合生物材料作为促进创伤修复、愈合的生物敷料。通过对各组实验动物的大体情况和创面组织HE染色观察,表明胶原蛋白-壳聚糖(8:2)复合生物材料生物相容性较好,粘附性好,力学性能优越,适合表皮细胞生长和爬行,对SD大鼠创伤修复有明显的促进作用;而明胶-透明质酸(9:1)复合生物材料由于其明胶含量较多,两种材料不能很好的互补其性能而质脆易碎,多在创伤修复早期脱落,不能很好的发挥其促进创伤愈合的功能;对照组由于仅有纱布敷料覆盖,多在早期结痂,创面渗出物积于痂下,有感染迹象,影响了创面的修复,HE切片染色于术后14 d还能见到大量的炎性细胞浸润。最后对实验组动物创伤修复综合情况与对照组相比,胶原蛋白-壳聚糖(8:2)复合纳米纤维膜作为一种新型生物敷料在促进创伤愈合方面表现出了更强劲的优势。由此可见,胶原蛋白-壳聚糖(8:2)复合纳米纤维膜不仅可以作为一种良好的生物敷料在皮肤烧、创伤中应用,作为构建组织工程器官的支架、药物缓释的载体等方面也有着广阔的科学研究和临床应用前景。
摘要：目的 通过动物实验的方法评价由胶原蛋白-壳聚糖(两者比例为8:2)、明胶-透明质酸(两者比例为9:1)复合纳米纤维膜对于SD大鼠背部全层皮肤缺损创面修复的作用。方法用胶原蛋白-壳聚糖、明胶-透明质酸复合纳米纤维膜覆盖雌性SD大鼠皮肤缺损创面,两组各用大鼠15只;对照组仅覆盖油纱和纱布敷料,用大鼠15只。实验组和对照组大鼠背部皮肤缺损的面积均为2×1.5 cm2。分别于术后第3、7、14天观察SD大鼠大体情况、创面情况,并在第3、7、14天分别取创面组织行H-E染色对比观察。结果与对照组相比,实验组创面修复情况较对照组好,其中尤以胶原蛋白-壳聚糖复合生物材料的促创伤修复作用更明显。结论胶原蛋白-壳聚糖(8:2)复合纳米纤维膜较普通纱布敷料和明胶-透明质酸(9:1)复合纳米纤维膜能更好的促进创伤修复、愈合,有着较好的科研和临床应用前景。
关键词：蛋白质-多糖复合纳米纤维膜,胶原蛋白-壳聚糖,明胶-透明质酸,复合纳米纤维膜,皮肤缺损修复
蛋白质复合体 篇2
依据最新NDB数据库中蛋白质-DNA复合物晶体结构数据,考虑DNA结构的序列依赖特性,对10个二联体和36个约化的.四联体计算了DNA动力学结构模型中的关键参数--力常数矩阵,矩阵中的非对角项反映了结构参数间的关联.利用改进的DNA结构动力学模型,可以方便地计算给定序列的结构动力学特性.
作 者：毛爱华 陈斯云 蔡禄 MAO Ai-hua CHEN Si-yun CAI Lu 作者单位：毛爱华,MAO Ai-hua(内蒙古科技大学理学院,包头,014010)
陈斯云,蔡禄,CHEN Si-yun,CAI Lu(内蒙古科技大学生物与化学工程学院,包头,014010)
蛋白质复合体 篇3
关键词 根尖诱导成形术 骨形成蛋白 羟基磷灰石 氢氧化钙 根管充填
资料与方法
材料：本实验所用骨形成蛋白（BMP）是由第四军医大学分子生物教研室提供的重组人BMP-2(recombinant human BMP-2,rhBMP-2)。实验前用100μg rhBMP-2进行小鼠大腿肌肉注射，1周后处死，取材，HE染色，组织学观查发现小鼠骨骼肌中有软骨细胞出现，证明BMP-2有成骨活性。
羟基磷灰石（HA）为中国科学院上海生物化学研究所产品。BMP与HA按1∶[KG-*2]20加以复合。加入8%甲硝唑，消毒后4℃冷藏备用，使用时用盐水调和。
氢氧化钙糊剂为韩国生产的成品METAPEX。
选未成年3个月左右健康杂种犬2只，雄性，体重分别为：10kg、12kg。选择上前牙4颗，下前牙4颗，共16颗牙。将其左、右牙齿依A、B区顺序分为两组。A区为对照牙，B区为实验牙，每组用牙8颗。
方法：术前拍X线片，此时狗前牙为未发育完成的喇叭口状 。术中用2.5%硫贲妥钠（按25mg/kg给药）腹腔注射。乙醇消毒，铺巾，3%双氧水清洗口腔，牙面用2%碘酊消毒，高速气涡轮机在蒸馏水冲洗冷却下备洞。在牙齿舌面中央开髓，去全髓，扩挫根管至40#，生理盐水充分冲洗，消毒棉捻止血、擦干。分别用两组调好的材料根充，磷酸锌粘固粉垫底、银汞充填。整个过程遵循无菌操作原则。术后2个月处死动物，离断上下颌骨，取实验牙及牙根周牙槽骨做标本。经固定、包埋、切片、HE染色、光镜观察。
结 果
全部动物存活至取材时间，手术之牙齿无松动、脱落、补料完整、根尖无瘘管，牙龈正常。有个别标本切片制备不佳，每组所有标本的观察结果均相同。
氢氧化钙（CH）组：根尖可见大量筛状钙化团快，结构紊乱、蓝染，部分处可见钙化牙骨质，形态各异，小梁间血管、有灶状炎症细胞浸润。
骨形成蛋白组(BMP)组：根尖可见大量新生、完整的骨样牙骨质及牙骨质，周边排列着多量梭形、立方或扁平细胞，间质纤维组织增生，有充血，炎症反应轻微。
讨 论
随着生物医学的发展，人们对口腔材料性能的评价不止局限于材料的物理、化学、力学性能。由于口腔材料的临床应用同时都直接或间接地与人体组织相接触，对人必须无毒无刺激，具有良好的生物安全性和生物相容性。BMP及其复合材料是目前最引人注目的骨移植替代材料之一。
骨形成蛋白（BMP）是一种广泛分布于各种动物骨组织中的酸性多肽，是一类高效的骨中统生长因子，具有一种同源形、可扩散［１］，但由于BMP产量低、价格高，在体内吸收快，不能持续发挥作用，且不能为修复物提供支架等缺点，限制了它的广泛应用［2］。羟基磷灰石是骨组织和牙体组织的主要无机成分，其优良的生物性能近年来成为生物材料科学的研究热点。多年的研究证实该材料具有良好的生物相容性，将其植入体内后，在局部不发生炎症反应，无致畸作用和致癌作用［3］。但本身无成骨性，只具有引导活性。用HA填入根管，在根尖区可形成一个屏障作为硬组织沉积的支架，沉积类似牙骨质的硬组织，使牙根继续发育。牙骨质样组织可通过根尖孔长入根管将根尖封闭。BMP与羟基磷灰石的复合应用可以避免各自的不足，成为一种缓慢释放系统，持续发挥BMP的作用，大大提高其骨诱导能力。BMP与HA的比例为1∶[KG-*2]20，并且加入对BMP活性无拮抗作用的甲硝唑，其浓度为8%。
氢氧化钙是一传统的，但就目前来讲仍是首选的牙髓治疗剂，呈强碱性，可抑制细菌的生长及中和炎症区的酸性产物，可促进碱性磷酸酶的活性和根尖周结缔组织的分化，使根管侧壁沉积类牙骨质和类骨质，延长牙根、封闭根尖孔。但是，临床应用有一定困难，它难以充填至根尖或难以充填密合。而且氢氧化钙是容易吸收的制剂，若尖周炎症未能控制，吸收后炎性结缔组织进入根管，反而影响正常的根尖修复。氢氧化钙作为根尖屏障材料是不适当的，因为它的颗粒太小，对根尖压力几无抵抗作用，大多数颗粒被挤入根尖周组织。
本实验的组织学观察表明，BMP/HA组根管充填后，根尖可见大量新生、完整的骨样牙骨质及牙骨质，充血及炎症反应轻微。证实了BMP与HA结合使用具有较好的生物相容性及较强的诱导活性，比氢氧化钙更能促进矿物化的形成，并可促进细胞分化、成熟，加速组织修复。
复合骨形成蛋白用于根尖诱导，在已查到的文献中未见报道，本实验对此进行了初步尝试。随着基因重组BMP的研制成功，进一步研究与BMP相配的具有良好生物相容性载体材料和不影响BMP生物活性又能控制炎症反应的抗菌药物，研究一种以BMP为主要成分的生物诱导性牙髓治疗材料将是可行的。
参考文献
1 杨连甲.骨形成蛋白的实验研究. 实用口腔医学杂志,1987,3(2):78.
2 何国华.粉末型羟基磷灰石陶瓷盖髓的实验病理学研究. 实用口腔医学杂志,1989,5(4):235.
绿豆与黑豆复合蛋白饮料的研制 篇4
黑豆是种皮为黑色的大豆,蛋白质含量高达50% ,居豆类之首［3］。蛋白质含量高,质量好,且含有较多的丙氨酸、精氨酸等氨基酸,必需氨基酸占氨基酸总量的40% 以上［4］。黑豆中含有丰富的维生素、微量元素、粗纤维和磷脂等营养成分,其降血压、降血脂、补肾、美容养颜食用保健功效已被广泛报道［5］,还有增强胃肠蠕动、抗氧化、防止便秘的功效,对养发、乌发也有益处［6］。黑豆是极具开发潜力的植物蛋白资源。
以绿豆和黑豆为原料,开发出色、香、味俱佳,具有一定保健功能的复合蛋白饮料,可方便人们食用绿豆和黑豆,并可获得较好的食用保健效果,具有较高的市场开发价值。
1 材料与方法
1. 1 试验材料与仪器
1. 1. 1 试验材料
柠檬酸,潍坊英轩实业有限公司; 乙基麦芽酚,上海乐香生物科技有限公司; 黄原胶,内蒙古阜丰生物科技有限公司;羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、分子蒸馏单甘脂,上海申光食用化学品有限公司; 蔗糖脂肪酸酯,广州嘉德乐生化科技有限公司; 绿豆、黑豆、白砂糖,市售。
1. 1. 2 试验仪器
GJJ - 0. 03 /70 均质机,上海台驰轻工装备有限公司; JML- 50 胶体磨,上海台驰轻工装备有限公司; QSSJG杀菌锅,江苏轻石科技有限公司; MJ -12 磨浆机,广州凯圣机械设备公司。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 绿豆黑豆复合饮料制作方法
1. 2. 1. 1 工艺流程［5］
1. 2. 1. 2 工艺操作方法
选用籽粒饱满、无霉烂、无出芽、无碎瓣的优质绿豆和黑豆,采用筛选、风选、磁选等方法分别除去绿豆和黑豆中的各种杂质,将纯净的绿豆和黑豆分别置入干料3 倍量的室温水中浸泡8 ~ 12 h,待豆粒充分吸水膨胀后捞出,再在流水中清洗,分别洗去绿豆和黑豆的皮层。将去皮后的绿豆与黑豆按湿重的1∶1 比例混合,加入干料重量8 倍的清水后用磨浆机进行磨浆两次,用120 目筛过滤,滤液置入夹层锅锅内加热煮沸5 min。向沸腾的浆液中加入干料重量2 倍的清水,再趁热加入白砂糖、黄原胶、羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、分子蒸馏单甘脂、蔗糖脂肪酸酯等进行调配,调匀后用胶体磨处理2 次。再将料液在预热至80 ℃ ,用高压均质机于23 MPa条件下进行2 次均质处理［7］。处理后的料液灌装到已灭菌的玻璃瓶中,真空脱气后立即封口,再置入高压锅内于121 ℃ 条件下杀菌15 min［5］。
1. 2. 2 试验设计
1. 2. 2. 1 绿豆黑豆复合蛋白饮料的风味调配试验
试验研究时采用固定的1∶10 加水比( 即绿豆和黑豆的干重与加水量的质量比) ,确保成品饮料的蛋白质含量远高于国标规定。采用3 因素3 水平正交试验确定绿豆与黑豆复合蛋白饮料的甜味剂( 白砂糖) 、酸味剂( 柠檬酸) 、增香剂( 乙基麦芽酚) 3 个因素不用用量对饮料感官性状的影响,并确定三者的最佳用量。试验研究时对各试验产品从色泽、气味、口感、组织状态4 个方面进行感官质量评定,计算各试验品的平均得分。试验设计见表1。
1. 2. 2. 2 绿豆与黑豆复合蛋白饮料稳定剂种类与用量调配试验
为更好的提高饮料中蛋白质和脂肪均匀分散的稳定性,参考他人的研究成果,选用两种以上的稳定剂可起到增效作用。在加水比、白糖、柠檬酸和乙基麦芽酚用量不变的情况下,选择羧甲基纤维素钠( CMC) 、海藻酸钠( SA) 、分子蒸馏单甘脂( DM) 和蔗糖脂肪酸酯( SE) 四者做稳定剂( 前两者为增稠剂,后两者为乳化剂,增稠剂和乳化剂要同时使用) ,从中选择合适的种类, 并确定最佳用量。 分别用0. 10% 、0. 11% 、0. 12% 、0. 14% 、0. 14% 、0. 15% 、0. 16% 、0. 17% 和0. 18%浓度的CMC + DM、SA + DM、CMC + SE、SA + SE、CMC + SA+ SE、CMC + SA + DM、CMC + DM + SE、SA + DM + SE以及CMC + SA + DM + SE,各浓度下的稳定剂按均等比例分配,考察不同浓度下各组合方式对饮料的稳定情况。准备若干个相同规格的、带刻度的离心管,分别标号、称重。分别取不同浓度、不同稳定剂组合的饮料样品10 m L加入到离心管中,再称重。将装入样品的离心管于3000 r/min条件下离心30 min,分别称量每支试管底部沉淀物的质量和上部浮层的体积,计算沉淀含量和浮层含量［7 － 8］,以沉淀和浮层均少者为佳。计算方法如下:
1. 2. 3 饮料成品检验
对绿豆与黑豆复合蛋白饮料进行感官检验、理化检验和微生物学检验等三方面的检验。感官检验包括产品色泽、口感、气味、组织状态等指标。理化检验包括总固形物含量、碳水化合物含量、蛋白质含量、脂肪含量等检验项目。总固形物按GB / T31326 - 2014 方法测定; 碳水化合物采用减差计算法测定; 蛋白质测定采用GB5009. 5 - 2010 方法; 脂肪测定采用GB5413. 3 - 2010 方法。微生物学检验包括菌落总数和致病菌检验,菌落总数采用GB 4789. 2 - 2010 方法,致病菌检验采用GB29921 - 2013 方法。
2 结果与分析
2. 1 绿豆与黑豆复合蛋白饮料风味调配试验结果
制作绿豆与黑豆复合蛋白饮料时以白砂糖、柠檬酸和乙基麦芽酚为因素,每因素各取3 个水平,进行正交试验的结果见表2。
从表2 可知,影响复合蛋白饮料风味的因素大小为B > C >A,即柠檬酸> 乙基麦芽酚> 白砂糖。柠檬酸对复合蛋白饮料风味的影响最大,但其浓度不能太高,否则会降低复合蛋白饮料的稳定性。最佳风味组合为A2B1C3,即白砂糖7% 、柠檬酸0. 1% 、乙基麦芽酚0. 06% 。按最佳组合方式重新制作绿豆与黑豆复合蛋白饮料,经感官评定小组综合评价后其平均得分为95 分,高于正交试验中的最高得分,说明最佳组合方式是合理的。
2. 2 确定绿豆与黑豆复合蛋白饮料最佳稳定剂种类与用量的试验结果
对绿豆与黑豆复合蛋白饮料进行稳定剂的不同组合使用方式和不同使用浓度试验后,各试验的稳定情况不同,饮料经离心处理后其浮层含量情况见表3,沉淀含量见表4。
( %)
( %)
由表3 和表4 可知,复合蛋白饮料中的沉淀生成量和浮层生成量都随稳定剂用量的增加而随之减少,复合饮料的稳定性逐步增强。饮料中沉淀的产生主要是蛋白质微粒和其他粒子凝集而成,通过添加稳定剂可有效抑制蛋白质的凝集沉淀。浮层物的产生源自饮料中油脂的凝集上浮,通过使用乳化剂可有效增强油水的均匀分散性。通过两种以上的稳定剂的复配,可减少稳定剂的使用量。从表3 和表4 中数据可以看出,0. 15% 的CMC + SA + SE组合使用时饮料的沉淀量和浮层量均最少,故确定绿豆与黑豆复合蛋白饮料的最佳稳定剂是羧甲基纤维素钠( CMC) 、海藻酸钠( SA) 和蔗糖脂肪酸酯( SE) ,三者按1∶1∶1 比例使用,总用量为0. 15% 。
2. 3 复合蛋白饮料的产品质量检验情况
2. 3. 1 感官方面
绿豆与黑豆复合蛋白饮料呈均匀一致灰白色; 豆香味浓郁,无不良异味; 口感细腻,酸甜适口; 无肉眼可见杂质。
2. 3. 2 理化方面
总固形物含量为12. 28% ,碳水化合物含量为7. 91% ,脂肪含量为1. 02% ,蛋白质含量为1. 63% 。
2. 3. 3 微生物学方面
菌落总数≤100 个/m L,无致病菌检出。
3 结论
蛋白质复合体 篇5
第一；不断创新，创造自己的品牌
济南健之源生物科技有限公司自创立以来，一直走着自己的品牌之路。围绕“产品、质量、营销”三大品牌成长支点，使得企业不断在竞争中超越自己，从创新中寻找突破！
一流的设备，一流的科研，一流的管理，一流的产品再加上一流的销售团队，使得“欣易康达”牌营养健康品快速切入市场，给国人带来了健康和希望。同时赢得了广大消费者和代理商朋友的称赞，并在行业内树立了良好的企业形象和品牌知名度。“欣易康达”牌荣获“中国著名品牌”，企业荣获“全国重点推广首选单位”。
第二；产品至上，代理商利润的保障
济南健之源公司始终坚持选好原料做好产品，一直以专业的人才，严格的管理作为后盾，通过专业的配方，先进的生产工艺，良好的卫生控制，完善而专业的技术服务，致力于为广大消费者和客户提供安全、健康、品质高、能效强的营养健康品。
例如济南健之源生产的（欣易康达牌复合蛋白锌+欣易康达牌复合锌硒片）纯正的蛋白锌，是蛋白粉、富锌酵母、富硒酵母等为主要原料制成的新一代生物制品，主要成份为蛋白锌、蛋白硒。活性高、吸收好，无任何副作用，每片含蛋白锌0.5mg，蛋白硒2ug.含量也是同类产品中最高的。含量太低，没办法起到治疗效果。零售价68我们的产品每瓶能吃十天左右，而其他产品的成人用量每瓶差不多能吃三到四天，所以我们的性价比更高效果好。
第三；想代理商所想急代理商所及，维护代理商利益
代理商最痛恨的就是串货问题，自己辛苦打开的市场，最后竹篮子打水一场空，白忙活。
为此济南健之源公司市场保护严格，代理商可享受区域内独家代理，一个地区只放一个代理商，一个产品一个号，杜绝串货，最大程度的维护代理商利益。为此济南健之源公司还为代理商提供国内顶尖级专业培训的机会，提供广告和促销支持。在节日或者纪念日，厂家会联合代理商搞促销活动，促销礼物都是由厂家提供。促销的利润都是代理商的，其实增加利润就是省下成本。
产品口碑好，需求大，市场保护又好，就不愁没有销路了。
蛋白质复合体 篇6
【关键词】 转染技术；丝素蛋白；牙周组织工程；支架材料
牙周组织工程是将体外培养的高浓度的种子细胞种植于具有良好生物相容性和降解的支架材料上，并由生长因子介入，经过特定的培养，植入机体病损部位，实现牙周组织的功能再生[2]。
目前，牙周组织工程的首选是种子细胞是具有多向分化潜能的牙周组织前体细胞-牙周膜细胞。而适宜支架材料的选择仍是研究的热点。结合当前组织工程支架材料的研究热点与本课题组近年来在组织工程与牙周病治疗方面的研究实践，本课题应用转染种子细胞-牙周膜细胞拟构建一种新型的牙周组织支架—壳聚糖—丝素蛋白—磷酸三钙多孔复合体。在复合支架内使用转染后的种子细胞从而达到最为理想支架的性能要求。
1 材料及方法
1.1 实验动物 1-2龄比格犬2只，体重15kg，雌雄不限（由山西医科大学动物实验中心提供）。
1.2 实验材料及仪器 壳聚糖-磷酸三钙（孔径150-200nm，孔隙率90%）；丝素蛋白粉末（湖州新天丝生物技术有限公司）；狗牙周膜细胞（山西医科大学动物实验中心提供）；DMEM/F12培养基；胰蛋白酶；胎牛血清；万分之一天平（TN托盘式扭力天平，上海第二天平仪器厂），COz恒温培养箱；倒置相差光学显微镜（BH-2Olympus显微镜，日本）；细胞计数板。
1.3 丝素蛋白-磷酸三钙-壳聚糖多孔复合材料的制备 在50mL的聚丙烯离心管中加入30-40mL1.5c2SBF和1.5Tas2SBF，将再生丝素蛋多孔材料浸渍在模拟体液中并在37摄氏度下恒温1-4周，制备丝素蛋白-壳聚糖-磷酸三钙复合材料。
1.4 细胞培养
1.4.1 比格犬牙周膜细胞提取 将比格犬麻醉后静置5分钟，用75%酒精泡口腔2-3秒钟，再用碘酒消毒口腔，置比格犬带入超净台内。
用小刀从牙根周部慢慢刮取牙周膜，将牙周膜转移到另一装有PBS的平皿中，用手术剪将其剪成小块（1mm3），再用PBS液洗三次，转移至小青霉素瓶。将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。37℃静置3-5小时，轻轻转动培养瓶，使组织移入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养]。
1.4.2 牙周膜细胞传代及提取 一周后，原代细胞开始繁殖，本实验取第4代细胞为种子细胞。
1.5 转染细胞的培养
1.5.1 慢病毒的制备 在2个1.5ml的EP管中混合下列溶液：a管，按照4：3：2混合重组载体质粒FUGW或FUAmW，包装质粒CMV△R8.2，包膜质粒VSV-G，2×HEPES溶液；b管，PEI溶液，2×HEPES溶液。将a、b管混合后，加入DMEM培养液中培养2-4h换液，36-48h收集病毒上清。
1.5.2 感染后PDLC hAm 基因表达 转染72h后，倒置显微镜下可见293T细胞及PDLCs细胞生长密集相同视野荧光显微镜下可见明亮的绿色荧光。
2 实验过程
2.1 本实验分三组进行。在两只比格犬上进行研究。
2.1.1 实验组 以转染后的牙周膜细胞为种子细胞植入丝素蛋白-壳聚糖-磷酸三钙复合支架中。
2.1.2 对照组（一） 以比格犬第4代牙周细胞为种子细胞植入丝素蛋白-壳聚糖-磷酸三钙复合支架中。
2.1.3 对照组（二） 单纯以丝素蛋白-壳聚糖-磷酸三钙复合支架为骨修复材料。
2.2 犬牙周水平缺损模型建立 在比格犬下颌右侧制造骨缺损模型：把比格犬麻醉后，对其进行口腔内消毒，带入无菌室内。对其进行下颌右侧翻瓣手术。先检验麻醉是否到位，用手术刀在比格犬下颌右侧从2的位置下方切开一个约10cmX5cm的创口，用剥离器把粘膜组织充分剥离，充分暴露下颌骨区域，用高速手机在三个部位上取下三块狗自体骨大小约0.5cm×1cm×0.5cm。位置约为2-4，3-5，4-6，前后呈梯队排列，使之人为形成骨缺损。不宜离太近，是缺损区域至少有5mm的间隔，防止在骨愈合时形成融合，不易于观察。
2.3 植入三组丝素蛋白-壳聚糖-磷酸三钙复合支架 在骨缺损部位分别植入三组复合支架材料并标记。在2-4位上放置实验组转染后的牙周膜细胞为种子细胞植入丝素蛋白-壳聚糖-磷酸三钙复合支架。在3-5位放置对照组（一）以比格犬第4代牙周细胞为种子细胞植入丝素蛋白-壳聚糖-磷酸三钙复合支架。在4-6位上放置对照组（二）单纯以丝素蛋白-壳聚糖-磷酸三钙复合支架为骨修复材料。把比格犬上取下的自体骨，均匀地挂出一层，厚约0.2cm左右，覆盖在原缺损部位，把复合材料封入缺损区域，用缝合线把软组织严密缝合。
2.4 术后观察 比格犬麻醉效果过去以后观察一周，确保无任何术后不良反应后。即可对实验结果开始观察。
3 结 果
高倍显微镜下观察：每隔一个月，对实验比格犬进行手术，从三个骨缺损区域提取切片，置入200倍高倍显微镜下观察。
术后三个月后，实验组区域密度略微增强，对照（一）对照（二）组无明显变化。
术后四个月后，实验组区域密度增强，对照（一）骨密度略微增强，对照（二）无明显变化。
术后五个月后，实验组区域密度增强，对照（一）骨密度增强，对照（二）略为增强。
术后六个月后，实验组区域密度增强，对照（一）骨密度增强，对照（二）略为增强。
术后七个月后，同术后6个月。骨密度已经稳定
4 讨 论
组织工程中所采用的种子细胞必须具有形成新组织结构的能力。基因转染后的种子细胞是否其诱导性能优于未转染的种子细胞是摆在我们面前的一个新课题。此实验应用转染种子细胞所形成的支架材料对比未转的种子细胞支架材料从而获取相關数据。转染后的种子细胞引导的支架材料在损伤修复后，前期变化不明显，三个月后出现明显变化，转染的牙周膜细胞为种子细胞的实验组，骨愈合情况优于对照组，骨形成情况也优于对照组，骨密度增强，说明转染后的牙周膜细胞可以使支架更快更好的与骨组织融合。具有更好的生物相容性。从而为病毒转染种子细胞的理论提供了实验依据。
5 结 论
综上所述，本实验成功构建了含有慢病毒载体质粒感染PDLCs，使釉原蛋白基因在该细胞中表达，为今后釉原蛋白基因强化种子细胞在牙周组织工程修复中的应用奠定了基础。随着转染技术在高新技术应用领域的不断拓宽，它将有更广阔的应用前景。
参考文献
[1] 张红珊，方建培，苏浩彬，杨旻.大鼠骨髓间充质干细胞体外培养与慢病毒转染方法的建立[J].中国实验血液学杂志，2011（06）.
蛋白质复合体 篇7
1 资料与方法
1.1 研究对象
2009年1月～2010年6月在住院部或门诊就诊的贫血患儿312例,经分子生物学方法诊断为东南亚缺失型(αα/--SEA)α地贫患儿。男162例,女150例;年龄1.8～13.7岁,平均(5.44±1.37)岁。健康对照组为2009年4～9月保健科体检并排除贫血等各类疾病的健康儿童50例,其中男28例,女22例。
1.2 方法
1.2.1 东南亚缺失型α地贫基因的诊断
采用单管四重GAP-PCR法进行检测,具体操作见文献[4]。
1.2.2 Hb高效液相色谱分析
取EDTA-K2抗凝血2 m L(BD抗凝管),无须制备溶血直接上高效液相色谱仪(VARIANTⅡ,美国Bio-Rad公司)分析。使用厂家配套的试剂,严格按照仪器说明书操作,血红蛋白各成份定量约6～7 min后由HPLC分析仪自动分析计算。
1.2.3 常规血液学检查
红细胞计数(RBC)、血红蛋白量(Hb)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白量(MCH)及平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)均在日本Sysmex XE-5000血细胞分析仪上测定。
1.2.4 HbCS的诊断
应用反向点杂交(reverse dot blot,RDB)技术进行分析,具体操作见文献[5]。
1.3 诊断标准
张之南《血液病诊断和疗效标准》见文献[6]。
1.4 统计学分析
利用SPSS 11.0 for Windows统计学软件进行统计分析,计数资料采用直接计数法计算,计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用t检验,检验水准α=0.05。
2 结果
在笔者研究的HPLC方法中,HbH的出峰时间为(0.45±0.05)min,HbCS的出峰时间为(5.05±0.02)min,正常对照儿童均未见此两种异常峰(图1),HbCS/HbH病既见HbH峰,又见HbCS峰(图2),312例东南亚缺失型α地贫病患儿中,23例(7.37%)患儿诊断为HbCS复合HbH病;采用RDB方法检出24例(7.69%)患儿有HbCS基因突变。HPLC方法对HbCS复合HbH病诊断的灵敏度为95.8%,特异度为99.6%,与分子生物学方法检查结果一致率为99.7%。
注:均P<0.01
312例α地贫患儿均表现出小细胞低色素性贫血,24例HbCS复合HbH病(αCSα/--SEA)患儿的血液学表现较其余288例东南亚缺失型(αα/--SEA)α地贫患儿明显严重,具体结果见附表。
3 讨论
东南亚缺失型(αα/--SEA)是我国最常见的α地中海贫血缺失类型,它是所有最严重的α地贫(HbBart’s胎儿水肿综合征和HbH病)的分子基础,对于在能生存下来的α地贫个体中,HbH病是最严重的一种。血红蛋白H病(HbH病)是由于4个α基因中有3个缺失或缺陷,导致α链的合成严重不足,相对过剩的β链自行聚合为4聚体(β4)即HbH,HbH的性质不稳定,易形成包涵体,沉积于红细胞内,使红细胞的变形性和通透性发生改变,红细胞在通过脾脏时易于被破坏,出现贫血等临床症状。HbH病从分子水平上分为缺失型与非缺失型两类,我国目前已知的非缺失型HbH病以HbCS复合HbH病居多[7]。HbCS复合HbH病的临床表现与重型β地贫相似,明显影响生存质量。
血红蛋白电泳是检测HbCS复合HbH病的常用方法,但其操作较繁琐,虽然近年来一直在不断改进,但仍需对标本进行前处理等一系列操作,过程不易进行质控,造成准确性、重复性不佳的缺点。HPLC具有快速高效、自动化程序高、准确性和重复性良好等优点,目前,HPLC是地贫非基因检测手段中最经典的方法[8,9,10]。HPLC是一种以物理化学原理为主的分离分析方法,分离率高,可以把理化性质相差不大的混合物通过简单的分离技术,使微小差异的各组成分通过几百次甚至几千次的重复累积为大的差异而达到分离。在分离的同时,根据出峰位置可以定性,根据峰面积可以定量。HPLC试剂已经商品化,如定标液、质控液、稀释液均经过严格的标准化生产,并且进行严格的抽样检查,定标,操作上采用的是全血标本,无需前处理,所需标本量少,操作简单,只需将全血标本直接上机,便能实现血红蛋白的析出、检测等,能最大限度地消除人为误差,而且数分钟即可出结果,可满足快速诊断的要求。笔者的HPLC检测中,HbH的出峰时间为(0.45±0.05)min,HbCS的出峰时间为(5.05±0.02)min,能根据其出峰时间准确判断血红蛋白的性质,HbCS复合HbH病的患儿检测的图谱既见HbH峰,又见HbCS峰,可根据图谱快速诊断HbCS复合HbH病。由于HPLC完全的自动化、标准化,检测结果可信,重复性强,因此,HPLC对HbCS复合HbH病诊断的敏感性要远高于电泳的方法[11]。
分子生物学方法是检测HbCS复合HbH病的金标准,虽然准确,但是其对实验室条件要求高,对技术人员要求严格,实验过程较复杂,不易进行质控,且价格昂贵,耗时繁琐,作为常规方法广泛用于临床检测有一定的困难。由于我国α地贫95%以上为缺失型,已有报道95%以上的α地贫缺失类型是--SEA,且该缺失型在人群中的基因携带率约为4%[12],因此许多医院仅开展对3种常见缺失型α地贫(αα/--SEA、-3.7、-4.2)的检测,这就容易漏诊临床表现较重而且严重影响生存质量的HbCS复合HbH病。广东省是α地贫的高发地区,HbCS复合HbH病约占广东地区HbH病的36%[13],为临床提供快速、准确、低廉的检测诊断HbCS复合HbH病,对指导其治疗与预后判断显得尤为重要。笔者的研究发现,如果仅检测3种常见缺失型α地贫基因,312例贫血患儿诊断为东南亚缺失型α地贫(αα/--SEA),但经HPLC检测后发现,其中23例患儿同时出现HbH峰和HbCS峰,诊断为HbCS复合HbH病。而应用反向点杂交(reverse dot blot,RDB)技术分析此312例患儿发现,其中24例患儿标本有HbCS突变,比例高达7.69%。笔者采用的HPLC方法漏诊1例(4.2%)HbCS复合HbH病。由于HbCS属于不稳定血红蛋白,量微,易于降解,考虑有可能是标本放置时间过长造成HbCS降解后而漏诊,如果标本采集后及时检测应该可以进一步避免漏诊,笔者研究未发现误诊病例。以分子生物学方法作为参考方法,HPLC对HbCS复合HbH病诊断的灵敏度为95.8%,特异度为99.6%,与分子生物学方法检查结果一致率为99.7%,由此表明HPLC检测结果与分子生物学检查结果具有良好的符合性。
α地贫患者由于α肽链基因缺失或缺陷,α肽链合成受到抑制,血红蛋白合成减少,导致小细胞低色素性贫血。笔者研究的血液学指标显示,312例α地贫患儿均表现出小细胞低色素性贫血,24例HbCS复合HbH病患儿均较其余288例东南亚缺失型α地贫患儿严重(均P<0.01)。从临床资料得知,24例HbCS复合HbH病患儿大多因持续发热并发感染、黄疸和贫血呈进行性加重而入院,并有不同程度的肝脾肿大。根据报道,非缺失型α地贫的突变大多位于功能较强的α2珠蛋白基因,故非缺失型HbH病患者的临床表现更为严重[1]。HbCS复合HbH病的病情较重的主要原因:一方面可归咎于高水平的HbH;另一方面则可能与不稳定的Hb本身密切有关。HbH水平与RBC计数呈负相关,同时它还是引起组织缺氧的原因。许多研究结果显示,HbCS比所预知的更有害的作用在于它不仅下调α-珠蛋白基因的表达,而且还减少Hb的产量[14]。无效的造血和RBC寿命的缩短在HbH病的病理生理过程中也起着重要的作用。加之αCS链极不稳定且易被氧化,其产物会与红细胞膜及其骨架蛋白作用,从而导致红细胞膜脆性增加、变形能力降低和水化改变等不良后果,使HbCS复合HbH病有更严重的临床表现。因此,对于东南亚缺失型α地贫患儿特别是临床表现较为严重的患儿的检测不应止步于此,应积极展开进一步检查,看是否存在HbCS突变以防漏诊,在未开展基因分析的情况下,HPLC不失为一个简易、准确的方法。
蛋白质复合体 篇8
关键词：酪蛋白磷酸肽钙磷复合体,发酵乳杆菌,生长,防龋
酪蛋白磷酸肽 (casein phosphopetides, CPPs) 是以牛奶酪蛋白为原料, 经酶水解、分离纯化而成的一种富含磷酸丝氨酸的生物活性肽。研究发现, 与无定型磷酸钙 (amorphic calcium phosphat, ACP) 结合形成酪蛋白磷酸肽钙磷复合体 (CPP- ACP) , 可以在牙釉质表面保持一种过饱和状态, 给牙齿提供一个钙离子和磷酸根离子的储库, 促进脱矿牙体组织的再矿化, 具有防龋作用[1]。我们研究发现CPP- ACP可以抑制致龋菌变形链球菌的生长、产酸以及对牙面的黏附, 对发酵乳杆菌的产酸也具有抑制作用[2,3], 但对其生长是否有影响还未见报道。本研究通过检测不同浓度CPP- ACP对发酵乳杆菌生长的影响, 为进一步研究和应用CPP- ACP提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 CPP- ACP的制备
将CPP溶解于360 mmol/L磷酸钠缓冲液 (pH值7.0) 中, 置于电磁力搅拌器上搅拌, 逐滴加入1.0 mol/L的CaCl2溶液, 用KOH维持pH值不变, 在加入所需的CaCl2后, 用去离子水调整溶液体积, 最后达到一份含5.0% (W/V) CPP、300 mmol/L CaCl2、180 mmol/L磷酸钠 (pH值7.0) 的CPP- ACP溶液[4]。再用去离子水稀释原液, 得到以0.5%为间隔, 终浓度为0.5%～5.0% (W/V) 的CPP- ACP溶液。
1.2 实验菌株及培养
发酵乳杆菌分离株413, 由四川大学华西口腔医学院教育部口腔生物医学工程重点实验室提供。将复苏48 h的菌种接种于BHI液体培养基中, 在37 ℃、80% N2、20% CO2厌氧培养18 h, 涂片检查为纯培养后, 将菌液在4 ℃、以3 000 r/min离心15 min, 收集细菌, 无菌生理盐水洗菌2 次, 用无菌生理盐水调整为A540 nm=1.0的菌悬液。
实验分11 组, 在实验组中加入浓度分别为0.5%～5.0% (W/V) 的CPP- ACP溶液100 μl, 对照组中加入100 μl生理盐水, 对照组及实验组中分别接种100 μl实验菌液, 每组设平行管4 个, 37 ℃ 80% N2、20% CO2厌氧培养48 h[5]。
1.3 MTT法检测CPP- ACP对发酵乳杆菌生长的影响
培养48 h后, 对照组及各实验组在4 ℃下以3 000 r/min离心15 min, 收集细菌, 去上清后加200 μl生理盐水, 再加入20 μl MTT溶液 (含0.9 g/L NaCl配置滤过除菌, 质量浓度5 mg/ml) , 继续37 ℃孵育4 h, 12 000 r/min离心10 min, 去上清后加入150 μl二甲亚砜, 振荡混匀溶解结晶后, 12 000 r/min离心10 min, 吸上清于微孔板中, 采用酶标仪测量550 nm处的吸光度值 (A) 。
1.4 统计学方法
结果以undefined表示, 采用SPSS 14.0统计软件中的单因素方差分析对吸光度的变化值进行统计分析, α=0.05。
2 结 果
结果见表 1。从表 1中可以看出, 发酵乳杆菌A值随CPP- ACP浓度的增加而降低。对各CPP- ACP浓度组与对照组之间总的差异用SPSS 14.0统计软件进行单因素方差分析, F=1 134.474, P<0.01, 各组间总的差异具有统计学意义。各实验组两两比较, 当CPP- ACP浓度小于2.5%时, P<0.05, 各组间差异均有显著性, 且发酵乳杆菌的吸光度值随CPP- ACP浓度的升高而降低;当CPP- ACP浓度达到2.5%后, P>0.05, 差异无统计学意义, 吸光度A值处于一个相对稳定的较低水平。
两两比较, ① P<0.05, ② P>0.05
3 讨 论
CPPs是从天然蛋白中提取的无细胞毒性[6]的生物活性肽, 能与钙磷结合形成可溶性复合物CPP- ACP, 是运送钙、磷、氟至牙齿的良好载体, 在牙釉质表面保持一种过饱和状态, 促进脱矿牙齿的再矿化[7,8]。本实验通过MTT法检测CPP- ACP对发酵乳杆菌生长的影响, 结果显示, 发酵乳杆菌A值随CPP- ACP浓度增大而降低, 表明CPP- ACP对发酵乳杆菌的生长具有抑制作用, 抑制作用随浓度的升高而增强。当CPP- ACP浓度大于2.5%, A值处于一个稳定的较低水平, 差异不再具有显著性, 可能是CPP- ACP通过维持菌斑内高游离钙离子浓度, 使致龋菌细胞一直处于高钙环境, 随着CPP- ACP浓度的提高, 溶液中游离的钙离子浓度随之升高, 细胞膜上的钙泵难以应付高负荷的钙转运, 直至使细菌细胞膜裂解, 从而产生间接抑菌、杀菌作用[9]。本实验结果表明CPP- ACP有作为抗龋生物制剂的潜力, 但其抑制发酵乳杆菌生长的具体机制尚不清楚, 能否作为单独的抗龋成分而应用于临床仍需进一步研究。
参考文献
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[2]刘兴容, 徐皑, 李艳萍.酪蛋白磷酸肽钙磷复合体对变形链球菌生长、产酸的影响[J].现代预防医学, 2006, 32 (10) :1815-1817.
[3]李艳萍, 刘兴容, 徐皑, 等.酪蛋白磷酸肽钙磷液对发酵乳杆菌产酸影响的实验研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志, 2006, 16 (11) :627-629.
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蛋白质复合体 篇9
羊毛主要组成物质是角朊蛋白质, 由近20种α-氨基酸以—CO—NH—肽键构成多肽长链。大分子间除依靠范德华力、氢键结合外, 还通过盐式键、二硫键、酯键相结合而使其大分子具有网状结构。尤其二硫键的存在, 致使羊毛不溶于水并具有较强的耐酸能力, 打开二硫键并保持羊毛大分子主链的完整是溶解羊毛的关键[1,2]。目前将废弃毛溶解制取角蛋白溶液, 在缓释肥料[3]、再生蛋白纤维[4,5]、薄膜[6,7]以及组织工程支架[8,9]等材料领域, 已取得较大进展。大分子角蛋白作为一类天然高分子材料, 具有良好的生物亲和性及可降解性等优良特性[10,11], 具有类似羊毛纤维的结构, 但纯羊毛角蛋白膜在干燥条件下脆、硬、易折裂的特点, 极大地限制其使用。同时我国羊毛资源丰富, 每年废弃的毛数量巨大, 造成环境污染及资源浪费[12]。为实现废旧羊毛的再生利用, 扩展角蛋白资源的应用领域, 对其改性制备优良使用性能的膜材料及其功能材料势在必行。
聚合物共混是改善角蛋白性能的主要手段之一, 通过共混可使不同聚合物之间产生强烈的相互作用, 利用能够与蛋白质分子形成氢键和静电作用力的聚合物与其共混, 即可提高纯角蛋白膜的使用性能[13,14]。张华林[15]等利用高浓度、高黏度、高制成率的羊毛角蛋白与羧甲基壳聚糖 (NOCC) 及增塑剂甘油, 通过机械共混法制膜, 结果表明, NOCC的加入明显改善了纯角蛋白膜材料的物理机械性能, 添加甘油使共混膜具有良好的弹性和韧性。王辉[16]等研究了羧甲基纤维素钠共混改性丝素蛋白膜的结构与性能, 结果表明:加入羧甲基纤维素钠的共混膜, 丝素蛋白含量大于70%时, 拉伸强度适中, 伸长率最大, 适合作医用创面材料。但共混改性存在高分子材料相容性较差的缺点, 并且增塑剂多与高分子材料形成氢键次级键作用, 在膜的耐水性能方面有待改善, 所以交联改性方法值得借鉴。马春辉等[17]研究了交联改性制备胶原蛋白膜, 配制胶原蛋白溶液, 依次加入淀粉、戊二醛、增塑剂增稠, 真空脱气后涂布于光滑玻璃板上, 干燥后揭膜, 戊二醛起到交联改性作用。冯治平等[18]利用交联作用改善大豆分离蛋白膜的保藏特性, 提高其阻湿性和抗拉强度。结果表明:经0.04%二醛或0.2%环氧氯丙烷交联后, 大豆分离蛋白膜的阻湿性分别下降5.7%和5.1%。抗拉强度提高35%和33%。经二醛交联过的大豆分离蛋白膜用于葡萄的保藏试验, 能明显防止葡萄的褐变, 延缓营养成分损失, 有效延长保藏时间。由于丝素蛋白、胶原蛋白、大豆蛋白与羊毛角蛋白在结构上类似, 以上方法可以借鉴。
本研究的前期工作是利用实验室自行提取的羊毛角蛋白溶液, 与羟甲基纤维素钠溶液共混, 并添加山梨醇做增塑剂, 制取共混膜, 但膜材的耐水性能较差。故本研究改用添加交联剂戊二醛, 对原料高分子进行交联改性。戊二醛分子式为C5H8O2, 是典型的双功能团试剂, 2个醛基 (—CHO) 可与羊毛角蛋白氨基 (—NH2) 发生醛化缩合反应, 共价结合, 与伯氨基作用形成环状吡啶结构, 基本原理如图1 (a) 所示, 在一定条件下交联剂能将单体、线型高分子转变成复杂三维网状结构, 交联度亦能达到很高程度, 醛化反应使肽链链段排列更加紧密。此外戊二醛与蛋白质的交联反应比较复杂, 也可能发生类似以下的结合, 3个戊二醛分子与一个氨基酸侧链反应可以生成图1 (b) , 醛基与氨基缩合生成希夫碱结构后, 再进一步反应, 多个 (b) 缩合连接构成图1 (c) , 形成共轭结构与环状结构的稳定结合[19]。添加戊二醛可以优化复合膜的机械性能、耐水性能、弹性与柔韧性, 本研究将深入探讨交联剂对复合膜各方面性能的影响。
1 试验部分
1.1 原料与仪器
废旧羊毛, 山东棉纺厂;
羟甲基纤维素钠 (CMCNa) , 食品级, 其重均分子质量5.0×105g/mol (黏度为300~800m Pa·s, 替代度中级D.S 0.75~0.9) , 天津市标准科技有限公司;
亚硫酸氢钠、溴化锂、十二烷基磺酸钠 (SDS) 、氢氧化钠、戊二醛, 均为分析纯, 上海嘉辰化工有限公司。
所有仪器由天津工业大学分析测试中心提供。
1.2 羊毛角蛋白的制备
称取一定质量羊毛, 加入还原剂Na HSO3/金属盐Li Br/表面活性剂SDS溶解体系, 调节适宜p H值和温度, 通入纯氮气隔绝空气反应若干时间后, 得到浅黄色、透明的羊毛角蛋白溶液, 经截留分子质量 (8 000~14 000) 透析袋流动水透析48h, 再用去离子水透析24h, 去除残余试剂和小分子多肽蛋白, 便得到了大分子羊毛角蛋白原液[20]。
1.3 复合膜的制备
配制一定质量浓度的羊毛角蛋白溶液, 同时将羟甲基纤维素钠粉末在50℃水浴下搅拌溶解于去离子水中, 配制成一定浓度的CMCNa溶液, 通过溶液共混方法将二者以一定配比混合, 并加入适量的交联剂戊二醛, 在一定温度、时间下搅拌均匀后得到制膜液, 静止稳定后倾倒于制膜容器中, 37℃下烘干1h, 室温下自然干燥成膜。根据之前制备羊毛角蛋白/羟甲基纤维素钠共混膜正交试验的研究[21], 羟甲基纤维素钠对膜的性能影响最大, 反应温度和时间影响较小, 故本研究在反应温度37℃, 反应时间1h, 羊毛角蛋白/CMCNa质量比5∶5条件下, 进行复合膜的制备。
1.4 力学性能测试
参照国标GB1039-79和GB1040-79, 采用织物拉力仪测试复合膜的拉伸强度和断裂伸长率。将膜材在真空干燥箱里烘24h, 用千分尺在样品上选取3点测厚度, 计算得平均厚度。取制备好的厚度相近的膜 (0.175±0.005mm) , 用裁样刀裁成长条型试样, 样品宽度为15mm, 夹持长度为30mm, 测试温度为室温, 湿度为 (65+5) %, 样品最终取值均由5次独立的测试结果求平均值得到, 织物拉力仪定速拉伸速度为100mm/min。拉伸强度和断裂伸长率的计算如下式所示:
1.5 含水率测试
膜在20℃、RH=65%条件下达吸湿平衡24h后, 取膜Wa (g) 放于烘箱中干燥48h, 烘至恒重, 称重Wb (g) 。计算其中所含水分质量占膜原质量的百分比, 每种样品均做5个平行试验, 取平均值。利用下面公式计算复合膜含水率:
1.6 溶失率测试
将膜精确称重Wa (g) 后, 置于盛有蒸馏水的锥形瓶中, 于37℃下放置30min后, 取出烘干至恒重, 再称重Wb (g) 。利用下面公式计算膜的溶失率:
1.7 透气率测试
按照国家标准GB/T12704-1991织物透湿性测定方法—透湿杯法进行:杯内装入10m L蒸馏水, 膜封装在杯口, 测试试样组装体于38℃环境中, 每隔1h测定1次, 重复5次。利用下面公式计算膜的透气率Qv:
式中:Gi为每次称量的透湿杯重量, g;
n为称量的次数;
t为称量的相隔时间, h;
A为膜的有效面积, m2。
1.8 扫描电镜测试
取力学性能良好的复合膜样品, 经干燥、喷金处理, 利用H-7650型扫描电镜测试并获得电子照片。
1.9 红外光谱测试
将膜样品剪成粒径小于40mm的粉末, KBr压片制样, 采用德国BRUK-ER公司TENSOR37型红外光谱仪测定膜样品的红外光谱。
1.10 X-射线测试
利用X-射线在晶体上产生的衍射现象, 可以从分子水平上分析物质的内部结晶状态以及晶体晶面在材料内部的取向。本试验利用X-多晶粉末射线衍射仪观测复合膜的晶体结构。
2 结果与讨论
2.1 实物膜对比
由图2 (a) 可以看出:纯羊毛角蛋白膜呈现小碎块状态, 无法形成整片膜, 羊毛角蛋白溶液干燥成膜后硬且脆, 轻触即碎裂, 力学性能较差, 需改性以提高应用性能。由图2 (b) 可知:纯羟甲基纤维素钠具有成膜性, 能够形成整膜, 但膜偏硬, 柔韧性和弹性欠缺, 无拉伸性, 以上二者均不能满足力学性能测试要求。图2 (c) 为力学性能较好的复合膜实物图, 表面光滑、半透明、均匀有一定柔韧性和弹性, 并且膜材具有一定厚度。
2.2 复合膜的表观形态
由图3 (a) SEM照片可以看出复合膜成膜效果比较理想, 表面无明显孔隙和较大裂缝, 复合膜内各组分相容性良好。图3 (b) SEM照片显示复合膜断面比较致密均匀, 各组分已达到分子结合水平。膜的表面出现的细小纹路可能是由于测试过程中温度偏高以及膜具有一定的含水率未进行脱气处理所致。
2.3 交联剂用量对膜力学性能的影响
由图4可以看出:复合膜的拉伸强度和断裂伸长率均随戊二醛浓度的增加而增加, 当戊二醛浓度为0.15%时, 复合膜具有最大断裂伸长率26.3%, 同时拉伸强度为40.1MPa。因为戊二醛与角蛋白分子的侧链集团形成密集的交联网状结构, 在戊二醛浓度较小的区域范围即可对羊毛角蛋白分子进行较大程度的改性, 促使原料分子内部结晶区域改变, 相应力学性能发生变化, 改善膜的柔韧性及弹性。当戊二醛浓度在0.15%~0.25%区间, 膜的断裂伸长率急剧下降至5%左右, 几乎难以拉伸伸长, 同时浓度在0.2%~0.25%区间, 膜的拉伸强度也大幅下降。当戊二醛浓度过大, 交联程度增加, 复合膜材料趋向硬化, 柔韧性急剧下降, 脆裂程度增大。在试验中观察, 随戊二醛浓度增加, 制膜液颜色由透明逐渐变至白色, 气泡也渐增多, 当戊二醛在浓度范围0.1%~0.2%之间, 复合膜的强度和拉伸性能较好, 戊二醛浓度超过0.2%, 膜材表现出硬且易裂的状态, 成膜性差。综合以上分析, 戊二醛最佳用量在0.15%, 兼具较好的拉伸强度和断裂伸长率, 并且膜材透明均匀, 弹性好易揭取。
2.4 交联剂用量对膜含水率的影响
膜材的含水率主要与各组分的亲水基团数目相关, 羊毛角蛋白和CMC-Na分子自身都含有一定数目的亲水基团, 故复合膜具有一定的含水率。由图5可知膜的含水率随戊二醛浓度的增加而逐渐减小, 从起始的9.25%至3.48%, 下降趋势明显。首先角蛋白与CMCNa分子间形成氢键缔合, 使膜内部的亲水基团减少, 另外主要因为戊二醛结构中含2个醛基, 与角蛋白分子氨基发生醛化缩合反应, 形成不可逆的共价结合, 使角蛋白分子间氢键作用明显减弱, 交联改性作用突出, 分子间形成紧密而复杂的交联网络结构, 促使原料分子中的亲水基团不断减少, 导致含水率明显下降。在戊二醛浓度为0.15%时, 复合膜具有最佳力学性能, 其含水率为7.05%。
2.5 交联剂用量对膜溶失率的影响
溶失率是膜材料的重要指标, 反应膜的耐水性能, 对膜材料的应用领域起到至关重要的作用。由图6可以看出随戊二醛浓度的增加, 膜的溶失率呈显著下降趋势。因为戊二醛与原料分子形成交联网状紧密结构, 浓度越高, 形成的交联程度越大, 膜越致密, 硬度强度越大, 溶失率下降幅度也较大, 与膜的力学性能相对应。当添加戊二醛浓度范围在0.1%~0.2%区间, 复合膜的力学性能良好, 其溶失率也较小在10%~20%之间, 耐水性较好。尤其在戊二醛浓度为0.25%时, 溶失率最小可达6.80%, 但此时的复合膜偏硬化趋势, 拉伸性与弹性均不理想。由此可说明添加戊二醛的复合膜的耐水性能较好, 形成的膜材在厚度、强度、韧性和耐水性方面, 均强于添加山梨醇做增塑剂的共混膜材料。
2.6 交联剂用量对膜透气率的影响
由图7可以看出:在戊二醛浓度范围0.05%~0.1%时, 膜的透气率逐渐增加, 因为角蛋白与CMCNa分子间形成氢键次级键作用, 另外戊二醛起交联作用, 与原料分子间构成不可逆的键合作用及大量交联网状结构, 打破原有分子间的结晶结构, 各分子间空隙增加, 膜的透气性能增强。当戊二醛浓度0.1%时, 透气率达到最高点74.5g/m2·h, 同时0.1%浓度亦形成分界, 即透气率下降的拐点, 随着戊二醛浓度的增大, 在0.1%~0.25%范围区间, 交联程度显著增大, 分子间密集的交联结构增加, 复合膜内部结晶区域增大, 膜材料更加致密, 厚度硬度极大增加, 透气性明显下降, 当戊二醛浓度为0.25%时, 透气性下降至30g/m2·h以下。
2.7 红外光谱分析
由图8a可知:纯羊毛角蛋白膜经红外光谱测试, 在1 650.0、1 537.5cm-1分别为α-螺旋型构象的酰胺Ⅰ和Ⅱ带的强特征吸收处出现强吸收峰, 表明是以α-螺旋型构象为主的羊毛角蛋白。另外在3 434.1、1 457.5cm-1处均有特征吸收峰, 属于酰胺键 (—CONH) 伸缩振动范围, 证明羊毛角蛋白膜中含有大量酰胺键的多肽分子结构, 并以α-螺旋型构象为主。羟甲基纤维素钠膜的红外光谱如图8b所示, 1 582.1cm-1处为羟甲基基团的特征吸收峰, 3 597.3cm-1处的吸收峰, 表明是羟甲基纤维素钠中—OH的振动峰, 此处振动峰的吸收强度比较大, 是由于羟甲基纤维素钠中的—OH基团比较多。由复合膜的红外光谱图8c对比图8a和图8b可以看出:羊毛角蛋白膜的1 650.0、1 537.5cm-1酰胺Ⅰ和Ⅱ带的强吸收峰明显向低波数偏移至1 643.8、1 414.2cm-1, 且吸收峰趋向平缓, 同时3 434.1cm-1酰胺键 (—CONH) 伸缩振动特征吸收峰也向低波数偏移至3 291.1cm-1。图8b中1 582.1cm-1和3 597.3cm-1处的特征吸收峰消失, 这是由于羊毛角蛋白分子与羟甲基纤维素钠分子之间形成氢键缔合, 纯角蛋白和羟甲基纤维素钠分子结构均发生改变, 同时证明了复合膜组分分子间存在分子水平的强烈相互作用, 在交联剂戊二醛作用下, 复合膜内部实现良好的分子间结合, 纯角蛋白膜得到充分改性, 复合膜材的各性能得以改善。
2.8 X-射线分析
由文献[22]可知羊毛角蛋白在2θ为6°和18°有2个较平缓的特征衍射峰, 内部存在结晶结构, 羟甲基纤维素钠膜在2θ=21°有强衍射峰, 在2θ=15.5°有弱衍射峰, 说明其有2种结晶结构的存在。若复合膜中各组分没有相互作用, 则在膜中会有各自的结晶区, 衍射图谱会相应表现为各组分按混合比例简单的叠加。由图9a可以看出:角蛋白/CMCNa/戊二醛复合膜衍射图谱中在2θ为4.6°和7°出现2个明显尖锐的特征衍射峰, 结晶度较为集中突出。相比纯角蛋白和CMCNa发生了较大变化, 原有组分衍射峰消失。如果角蛋白、CMC-Na与戊二醛没有相互作用或作用较弱, 复合膜中将会出现各自组分的结晶区域, XRD图谱将会出现各自的衍射峰。添加戊二醛的复合膜体系, 因戊二醛的交联改性作用, 改变原有组分的结晶状态, 分子间形成强烈的相互作用, 导致膜的内部结构存在新的结晶区域, 且结晶度较大, 以此说明戊二醛交联改性的成功。由图9b可以看出:角蛋白/CMCNa/山梨醇共混膜的XRD图谱, 由于山梨醇的增塑效果, 与角蛋白和CMCNa形成强烈的氢键作用, 破坏了原有组分的晶体结构, 角蛋白与CMCNa原有的衍射峰消失, XRD曲线比较平缓, 没有特别突出的衍射峰, 结晶度不大。以上分析证明复合膜各组分之间具有很好的相容性, 存在强烈的分子水平相互作用。由剪纸称重法得出结晶度:角蛋白/CMCNa/戊二醛复合膜>角蛋白/CM-CNa/山梨醇共混膜。
a.羊毛角蛋白膜的FTIR曲线;b.CMCNa的FTIR曲线;c.角蛋白/CMCNa/戊二醛复合膜的FTIR曲线
3 结论
蛋白质复合体 篇10
1 资料与方法
1.1 材料准备
HA多孔生物材料 (美国印第安那大学医学院提供) , 孔隙率为60%～80%, 孔径为100～500 μm。将材料修整为1.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小, 蒸馏水加压反复冲洗, 去离子水超声清洗2次, 每次30 min, 高压蒸汽灭菌后备用。蚕茧丝 (苏州丝绸研究所提供) 10 g在0.5wt%的NaHCO3溶液中煮沸脱胶45 min, 脱胶后的蚕茧丝在60℃条件下干燥24 h。按1∶2∶8摩尔比分别称取无水CaCl2 13.88 g、无水C2H5OH 11.50 g和H2O 18.00 g, 将长度约为2 cm的脱胶蚕茧丝浸入无水C2H5OH和H2O混合液中, 湿润后加入无水CaCl2搅拌, CaCl2溶解释放的热量可使蚕茧丝溶解。为保证充分溶解, 于60℃条件下继续搅拌20～30 min制得丝素溶液。将材料分别置于带胶皮塞的离心管中, 加入丝素溶液, 负压抽吸使丝素溶液进入材料孔隙内, 4℃放置24 h, 吸除溶液, 晾干。用pH值为7.4的0.01mol/L PBS漂洗至中性, 晾干。
1.2 组织工程骨制备和实验分组
取健康新西兰白兔2只, 双侧胫骨结节处备皮消毒, 无菌条件下用骨穿针穿刺抽取红骨髓8 mL, 加入含肝素的DMEM培养液 (Gibco公司) , 混匀后加入3 mL淋巴细胞分离液 (Gibco公司) , 1 800 r/min离心10 min, 吸除中间层细胞后再离心, 所得细胞沉淀以1×106/mL密度接种于含15%胎牛血清的DMEM培养液中, 于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。待细胞相互融合达90%生长面积时用0.25%胰蛋白酶 (Sigma公司) 消化传代培养。细胞传至3代时, 移入含1×10-8mol/L地塞米松、50 mg/L维生素C和1×10-2mol/L β-磷酸甘油钠的DMEM培养液诱导培养3 d, 诱导后的细胞表型经鉴定为成骨样细胞。将支架材料用DMEM培养液浸泡1 d后弃残液, 每个支架材料以1×106/mL密度接种经诱导培养的MSCs, 于37℃、5%CO2饱和湿度培养7 d。实验分为A组:MSCs复合SF表面修饰的HA培养;B组:MSCs复合HA单纯材料培养;C组:单纯MSCs培养。
1.3 细胞的黏附和生长
各组取组织工程骨1块, 倒置相差显微镜直接观察细胞在材料孔隙内的生长。各组取组织工程骨1块, PBS漂洗3遍, 戊二醛固定, 酒精梯度脱水, 标本经干燥和喷金处理后, 用扫描电镜观察细胞在材料表面的黏附和分布。
1.4 MTT法检测细胞活力
各组取组织工程骨6块, 于培养板中加入5 mg/mL的MTT, 反应4 h后弃液, 加入DMSO, 振荡10 min, 用酶标仪 (美国Perkin Elmer公司) 选择波长490nm读取光密度值 (OD值) , 分析细胞活力。
1.5 碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 活性检测
各组取组织工程骨6块, 消化并收集细胞。采用对硝基苯磷酸法[1], 用紫外/荧光/可见光高效分析仪 (美国Perkin Elmer公司) 测定ALP活性, 了解细胞产生的ALP活性。
1.6 流式细胞仪检测
各组取组织工程骨6块, 消化收集细胞并计数, PI染液染色, 用流式细胞仪 (美国Coulter公司) 检测细胞周期和DNA含量, 计算DNA指数 (DI值) 。
1.7 统计学方法
实验结果以undefined表示, 采用SPSS 10.0软件包对组间计量资料行方差分析和q检验, P<0.05为有统计学意义。
2 结 果
2.1 细胞的黏附和生长
各组细胞在材料表面和孔隙内均可黏附和生长, 细胞与材料紧密黏附, 聚集成团, 相互连接成网状。其中, A组材料孔隙内分布大量细胞, B组材料孔隙内分布少量细胞。各组细胞在材料表面均可黏附, 呈梭形或多角形, 相邻细胞间有突起相互连接, 细胞周围有网状胶原附着。其中, A组材料表面黏附大量细胞, 并有较多胶原连接;B组材料表面黏附细胞较少, 胶原连接较少 (见图1～2) 。
2.2 MSCs活力检测
黏附于材料的细胞活力分别为:A组 (0.721 6±0.012 8) , B组 (0.523 3±0.019 5) , C组 (0.901 2±0.021 1) , 细胞活力A组大于B组, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。
2.3 细胞ALP活性检测
黏附于材料细胞的ALP活性分别为:A组 (0.938±0.052) U/L, B组 (0.675±0.089) U/L, C组 (2.125±0.072) U/L, 细胞的ALP活性A组>B组, 差异有统计学意义 (P<0.01) 。
2.4 流式细胞仪检测细胞周期
每块材料黏附细胞数分别为:A组 (4.25±0.29) ×105, B组 (3.71±0.51) ×105, C组 (6.12±0.36) ×106, 每块材料黏附细胞数A组大于B组 (P<0.05) 。各组细胞周期未见明显变化, 无异倍体细胞, 见表1。
3 讨 论
HA化学成分、晶体结构、物理化学性能与人体骨的无机质相似, 具有良好的骨传导和生物活性, 可与骨组织牢固结合而促进骨骼生长, 是目前国际公认的良好骨修复替代材料[2]。但HA降解速率慢, 韧性低且脆性大, 在生理环境中抗疲劳强度差, 是一种典型的脆性生物材料[3]。SF是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白, 广泛应用于手术缝合线、药物缓释载体、人工血管、人工肌腱和韧带、创面覆盖物等[4]。研究表明, SF有很多优良的生物学特质, 如良好的生物相容性、降解性和力学性能;良好的细胞相容性, 能促进种子细胞的黏附、增殖和分化;良好的血液相容性, 对机体的凝血机制无显著影响[5,6]。本实验采用SF/HA生物材料保留了HA良好的骨传导和力学刚性, 结合SF优良的韧性和可降解性, 通过优化组合制备的SF/HA新型生物材料, 解决了HA降解慢和脆性大, 以及SF机械强度差和降解快的缺点。HA材料表面的亲水性差、表面自由能低、缺乏细胞识别和吸附位点等缺点, 易使接种细胞流失, 不利于接种细胞的黏附和生长, 直接影响组织或器官的组织工程化研究[7]。通过在材料表面固定氨基酸、多肽、蛋白质、黏附因子来改善材料表面的亲和性, 可进一步优化组织工程支架材料的黏附性能[8]。Zhao等[9]研究表明, 细胞的黏附和伸展同吸附在各种材料表面的黏附蛋白有关, 细胞在材料表面的黏附和迁移取决于预涂黏附蛋白和黏附蛋白抑制剂的浓度。材料表面加入化学基团, 如羟基, 可改变材料表面的湿润度, 提高黏附蛋白对材料表面的吸附能力, 进而促进细胞的黏附。将胶原类蛋白质固定在材料表面, 设计出接近组织中的条件反应界面, 同样可增加材料表面的黏附性。此外, 可将蛋白质加入聚合物单体中, 或将蛋白质与聚合物溶剂混合, 以促进材料对细胞的黏附性。Unger等[10]将纤维连接蛋白 (fibronectin, FN) 预衬于生物活性玻璃表面, 可显著增强其对成骨细胞的黏附, 且与FN的表面密度呈正相关。成骨细胞的黏附是由FN的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 (Arg-Gly-Asp, RGD) 多肽位点介导, 用FN抗体或与FN竞争的短肽RGD可抑制成骨细胞的黏附。
我们的研究表明, MSCs复合SF表面修饰的HA培养, 材料表面黏附且孔隙内分布大量细胞, 形成较多胶原连接;MSCs复合HA单纯材料培养, 材料表面黏附且孔隙内分布少量细胞, 胶原连接较少, 说明SF表面修饰的HA材料的表面活性和细胞相容性优于单纯材料。随着培养时间的延长, 细胞活力和ALP活性均高于未经SF修饰组。流式细胞仪结果分析表明, 培养7 d后, SF修饰材料黏附细胞数明显高于未经RGD多肽修饰组, 而细胞周期未见明显变化, 未见异倍体细胞。结果进一步提示, SF表面修饰对HA材料的细胞相容性有一定的优化作用。骨缺损修复研究, 从骨替代材料到骨组织工程, 经历着密切关联、相互促进的发展历程。目前对骨组织工程支架材料的研究很多, 进展很快, 但尚未找到一种理想的骨替代材料, 还有很多有待解决的问题[11,12]。a) 支架材料的降解速率与成骨速度不协调。b) 材料的机械强度很难与降解速率相匹配。c) 材料在体内仍会引起一些炎症和免疫反应。4) 材料的表面活性差, 影响种子细胞的黏附、分布和功能发挥。虽然SF/HA复合生物材料在孔隙结构、生物降解和组成成分方面具有明显优势。但迄今为止, 仍不能满意解决其免疫原性和生物力学性能等问题, 有待于进一步的研究和改进。单一类型的支架材料存在各自的优缺点, 仅靠单一材料很难满足骨组织工程细胞外基质材料的要求, 需要将不同材料的特性结合起来考虑, 取长补短。笔者认为未来理想的骨组织工程基质材料的制备应考虑到无机陶瓷类材料、合成聚合物材料和天然生物衍生材料的优缺点, 将有机材料和无机材料通过合适的方法组合成复合材料, 模拟天然骨基质组成成分, 并含有最佳组合的生长因子缓释系统, 促进成骨细胞的黏附、增殖和分化, 从而发挥最佳的成骨能力。
摘要：目的 了解丝素蛋白 (silk fibroin, SF) 表面修饰对羟基磷灰石 (hydroxyapatite, HA) 细胞相容性的影响。方法 以骨髓基质干细胞 (marrow stromal stem cells, MSCs) 复合SF表面修饰的HA或单纯材料培养制备组织工程骨, 观察MSCs的黏附和生长情况、检测细胞活力和碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP) 活性、流式细胞仪分析细胞周期。结果 MSCs在材料表面和孔隙内均可黏附和生长, 黏附于SF修饰HA的细胞活力和ALP活性明显高于未经SF修饰组。各组细胞周期未见明显变化, 未见异倍体细胞。结论 SF表面修饰对HA材料的细胞相容性有明显的优化作用。
关键词：组织工程,丝素蛋白,羟基磷灰石,细胞相容性
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蛋白质复合体 篇11
对于海藻酸钠微球的制备方法有挤出-外源凝胶法、静电液滴法、乳化-外源凝胶法、乳化-内源凝胶法等[9,10,11]。乳化-内源凝胶法是将一定浓度的海藻酸钠与不溶性钙盐 (如碳酸钙等) 分散在蒸馏水中混合形成水相, 再分散到油相中形成稳定的乳化液, 往体系加入油溶性酸 (如冰醋酸) , H+透过油-水界面的分散剂层进入海藻酸钠溶液, 造成液滴内部pH降低, Ca2+被释放, 从而引发海藻酸钠乳液固化成凝胶, 形成海藻酸钙凝胶微球, 利用该方法能制备出形态好、粒径均匀的海藻酸钙微珠, 且易于工业化[12]。
本研究利用内源乳化凝胶法制备海藻酸钠/羽毛蛋白复合微球, 主要研究制备工艺参数对微球的影响, 为下一步海藻酸钠/羽毛蛋白复合微球在载农药领域的开发应用提供技术支持。
1 实验部分
1.1 药品与试剂
海藻酸钠 (分析纯) , 阿拉丁试剂 (上海) 有限公司;羽毛蛋白, 参照文献[13]氧化法自制;纳米级碳酸钙, 通亚精细化工厂;液体石蜡 (化学纯) , 上海市奉贤奉城试剂厂;乳化剂 (Span80, 化学纯) , 天津市北联精细化工品开发有限公司;冰醋酸 (化学纯) , 广州化学试剂厂。
1.2 海藻酸钠-羽毛蛋白复合微球的制备
按与海藻酸钠一定的质量比, 称取羽毛蛋白和碳酸钙, 然后将二者分散于蒸馏水中, 然后加入一定浓度完全溶解的海藻酸钠溶液, 搅拌均匀, 采用超声消除气泡, 作为水相待用。称取与海藻酸钠一定质量比的表面活性剂Span80充分分散于液体石蜡中作为油相, 按一定油水比, 慢慢往油相中加入水相, 高速持续搅拌30min形成稳定的乳化液;向乳化液中加入冰醋酸酸解碳酸钙解离出Ca2+, 引发凝胶化反应, 形成海藻酸钠/羽毛蛋白微球, 固定化时间为20min, 最后用Tween80水溶液和去离子水依次冲洗, 分离水溶液和微球, 收集微球。
单因素实验方法:先固定海藻酸钠浓度为37.5g/L, 海藻酸钠浓与羽毛蛋白的质量比为2∶1, 油水比为3∶1, 表面活性剂Span80的量为为海藻酸钠质量的4%, 纳米碳酸钙为海藻酸钠质量的26.7%, 乳化时间30min, 然后采用单因素控制变量法, 保持其它反应条件不变, 分别改变乳化条件及内部凝胶化反应中的一个实验条件, 如羽毛蛋白与海藻酸钠的比例、油水比、表面活性剂用量, CaCO3用量等, 研究其对海藻酸钠/羽毛蛋白复合微球形态和粒径的影响。
1.3 复合微球的表征
1.3.1 红外光谱测试
采用溴化钾压片方式制样, 利用美国珀金埃尔默公司Spectrum100型傅立叶变换红外光谱仪对海藻酸钠、羽毛蛋白、海藻酸钠/羽毛蛋白复合微球进行测试。
1.3.2 复合微球形貌
采用中山仪康光学有限公司GSM-C289B型光学显微镜下观察凝胶微球的球形度和表面光洁度, 除非特别说明, 显微镜放大倍数均为100倍。
1.3.3 凝胶微球的粒径分布
使用英国Mastersizer 2000型马尔文激光粒度仪分析所得微球的粒径分布。
2 结果与讨论
2.1 红外分析
图1是海藻酸钠 (SA) 、羽毛蛋白 (FP) 与海藻酸钠/羽毛蛋白复合微球 (SA/FP) 的红外光谱图。海藻酸钠的-OH伸缩振动峰为3427cm-1, 羽毛蛋白在3312cm-1处的吸收峰为-CO-NH-的N-H对称伸缩振动, 海藻酸钠羽毛蛋白复合微球在3000~3500cm-1的峰相对SA与FP的峰变宽、有偏移且强度增大, 说明海藻酸钠与羽毛蛋白之间存在氢键作用[14]。再观察羽毛蛋白的红外图, 在1656cm-1处为-CO-NH-中CO的伸缩振动带 (酰胺吸收带Ⅰ) , 1535cm-1处是C-N的伸缩振动带 (酰胺吸收带Ⅱ) 。而复合微球酰胺吸收带Ⅱ明显减弱且有偏移, 同样表明羽毛蛋白与海藻酸钠发生了相互作用, 这是因为羽毛蛋白中质子化的氨基和海藻酸钠中离子化的羧基之间发生了静电吸附。
2.2 海藻酸钠与羽毛蛋白质量比对复合微球的影响
图2是不同质量比的海藻酸钠与羽毛蛋白所制得微球的形貌。当海藻酸钠与羽毛蛋白的质量比为3∶1时, 如图2 (a) , 可以看到复合微球之间相互粘合, 球的表面出现了凹陷且粒径分布不均一, 这是由于羽毛蛋白的量不足以将聚阴离子的海藻酸钠完全结合, 致使还存在较多的海藻酸钠聚阴离子, 从而使所制得微球囊壁较柔软, 易与其它微球相互粘合;同时也由于囊壁较柔软, 搅拌过程中破坏了球的形态结构致使球出现了凹陷、粒径不均匀。当海藻酸钠与羽毛蛋白的质量比为2∶1时, 如图2 (b) , 所得微球呈球形结构, 表面光滑, 不呈现凹陷、皱褶等, 粒径分布较均匀。而当二者质量比至1∶1时, 如图2 (c) , 复合微球不再是单一的规则球形结构, 变成了形态结构不规则的球体, 这是因为过量的羽毛蛋白导致复合微球的内部结构变得紧密, 内部相互作用力更强, 致使球的形状发生扭曲, 改变了原有的球形形态。
图3是海藻酸钠与羽毛蛋白的质量比为2∶1时复合微球的粒径分布图, 其平均粒径为185μm。
2.3油水比对复合微球的影响
图4是不同油水比条件下复合微球形貌图, 当油水比为1∶1时, 如图4 (a) , 所得微球相互粘结形成了团块状物质, 而非以单一的个体存在, 这是由于油相不够, 不足以将水相包裹而成球, 使得加入的油相随着滴加的量的增加而形成了水相团块, 从而不能形成一个个的微球。当油水比为2∶1时, 如图4 (b) , 所制复合微球表面结构光滑, 粒径较均一, 不存在结成团块和复乳的现象。而当油水比例为3∶1时, 如图4 (c) , 所制得的复合微球中存在乳液液滴, 复乳的存在是由于油相过量, 致使在搅拌过程中随着乳液体系的形成而带入到微球中。
图5是油水比为2∶1时复合微球的粒径分布图, 其平均粒径为172μm。
2.4 乳化剂用量对复合微球的影响
图6是不同乳化剂用量时微球的形貌图, 当乳化剂的用量为海藻酸钠质量的1.3%时, 如图6 (a) , 微球粒径较大, 且粒径分布不均一, 这是由于乳化剂的用量较少, 所制得的乳液体系间相互融合, 不断地长大, 从而使粒径变大, 最终制得的微球的粒径也不均一。当乳化剂的用量为海藻酸钠质量的4%时, 如图6 (b) , 所得微球结构形态良好, 粒径均一, 易于搜集, 不易流失。进一步提高乳化剂用量, 当乳化剂用量为海藻酸钠质量的6.7%时, 如图6 (c) , 所得微球粒径较小 (小粒径微球占据了绝大部分, 只有较少的大粒径微球) , 因此在洗涤搜集的过程中, 由于球的质量较轻, 随着洗涤水而容易漂浮在水面而流失, 最终使搜集到微球的量少, 影响微球的产率。
图7是乳化剂用量分别为海藻酸钠质量的4%和6.7%时的复合微球粒径分布图, 其平均粒径分别为171μm和115μm。
2.5 纳米碳酸钙用量对复合微球的影响
图8是不同纳米碳酸钙用量时的微球形貌图, 当碳酸钙含量过低 (为海藻酸钠质量的6.7%时) , 如图8 (a) , 被酸引发解离钙离子数量少, 无法形成稳定的海藻酸钠凝胶/羽毛蛋白复合微球, 尤其粒径大的乳液无法维持凝胶形态而被清洗去除, 所以碳酸钙用量降到一定程度使得凝胶微球的平均粒径和产率都有所下降。当碳酸钙的用量为海藻酸钠质量的13.3%时, 如图8 (b) , 所得微球结构形态良好, 没出现破损, 粒径均一。进一步增加碳酸钙含量, 如为海藻酸钠质量的26.7%时 (图8 (c) ) , 所得微球出现穿孔、破烂的现象, 产量也减少, 这是因为碳酸钙添加量过高, 由酸激发钙离子释放的同时产生了大量二氧化碳气体涨破形成的微球的结果。
图9是碳酸钙的用量为海藻酸钠质量的13.3%时复合微球粒径分布图, 其平均粒径为176μm。
根据上述单因素实验的结果, 确定海藻酸钠/羽毛蛋白复合微球较优的制备条件:海藻酸钠羽毛蛋白质量之比2∶1、油水比2∶1、乳化剂添加量为海藻酸钠质量的4%、碳酸钙添加量为海藻酸钠质量的13.3%。在此工艺下得到的复合微球的形貌如图10所示, 可以看出, 微球结构形态良好, 粒径均一。粒径分布如图11所示, 平均粒径184μm。
3 结论