角蛋白质（共7篇）
角蛋白质 篇1
摘要：伴随多系统器官组织发生恶变的增加,癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、鳞状上皮细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen,SCC)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)等各种肿瘤标志物在临床中得到广泛应用。近几年,新型的肿瘤标志物层出不穷,细胞角蛋白19片段(cytokerantin-19-fragment,CYFRA21-1)即是一种新型的肿瘤标志物,越来越多地受到大家的关注,但其在各个系统中的临床应用并不是十分明确,需进一步研究。在本文中作者归纳总结CYFRA21-1在乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、上皮性卵巢癌、肺癌、胃癌、胆道肿瘤、宫颈癌等肿瘤中的应用。
关键词：细胞角蛋白19片段,肿瘤标志物,临床应用,文献综述
近年来,肿瘤越来越受到大家的重视。肿瘤是指机体在多种导致肿瘤发生的因素的协作下,部分组织的某些细胞在基因水平上的生长和分化发生调控失常,致使其克隆性异常增生而形成的新生物。随着肿瘤的产生,各种肿瘤标志物也随之应用于临床。肿瘤标志物是肿瘤组织分解代谢和分泌产生的分子产物,代表细胞或体液的生理及化学特性[1]。肿瘤标志物同时还具有非侵入、简单经济、快速有效的特点。细胞角蛋白19片段(cytokerantin-19-fragment,CYFRA21-1)即是一种新型的肿瘤标志物,在多个系统的肿瘤中可进行检测及临床评估。现将近几年来对CYFRA21-1的临床应用作一简要的综述。
1 CYFRA21-1的结构
CYFRA21-1是细胞角蛋白家族中的一个类型,相对分子质量为40 000,等电点5.2,是存在于上皮细胞中的细胞结构蛋白,其可溶性片段上的2个抗原决定簇可特异性地与2个单克隆抗体BM19-21、KS19-1相结合。
2 CYFRA21-1的表达
一般来讲,CYFRA21-1含量非常低,常以寡聚物形式存在。伴随着上皮细胞发生癌变,激活的蛋白酶促进细胞角蛋白的降解,很多CYFRA21-1释放出来,导致其在尿液、血液等体液中的水平上升[2]。CYFRA21-1分布于鳞状上皮、复层上皮以及单层上皮细胞如结肠、乳腺导管、汗腺、气管、腺泡、子宫内膜和肝细胞等,其分布的部位非常广泛[3]。
3 CYFRA21-1在各种肿瘤诊治中的临床应用
由于CYFRA21-1分布广泛,可用于乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、上皮性卵巢癌、肺癌、胃癌、胆道肿瘤、宫颈癌等的预后、病情监测及疗效评价等。
3.1 乳腺癌
20世纪以来乳腺癌的发病率在世界各地均有上升的趋势。乳腺癌的诊断也越来越受到重视。白树祥[4]通过采用电化学发光免疫法检测62例乳腺癌患者、57例乳腺良性疾病患者及50例健康对照组的血CYFRA21-1、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)和糖类抗原153(carbohydrate antigen-153,CA153)水平,得出结果:CYFRA21-1在乳腺癌患者中明显高于乳腺良性肿瘤和健康对照组(P<0.01);血清CYFRA21-1在3个肿瘤标志物中特异性最高,为89.7%,其敏感性为45.2%,但是CYFRA21-1作为单一的肿瘤标志物具有一定的局限性,与CEA、CA153联合检测可提高敏感性和准确性,弥补单一检测的不足,同时可用于术后随访和监测疾病复发。
3.2 胰腺癌
胰腺癌是一种恶性程度和病死率都很高的肿瘤,早期症状不明显,一经发现多为晚期。饮食结构不合理、生活缺少规律,可诱发胰腺癌[5]。CYFRA21-1已经作为生物标志物在一些上皮的恶性肿瘤中应用。然而,其在胰腺癌的作用还需进一步研究。
Boeck等[6]将72例胰腺癌患者纳入研究,其中45例接受治疗。在前瞻性临床试验中分别测定治疗前和每周CYFRA21-1、糖类抗原199(carbohydrateantigen-199,CA199)、CEA的水平,这些每周测定值由姑息一线化疗中得到。该试验通过生物标志物的数据,利用单向和多变量分析疾病进展时间(time to progression,TTP)和总生存期(overall survival,OS)。试验结果:TTP中位数为3.9个月,OS中位值7.7个月;治疗前CYFRA21-1水平与体能状态(P=0.039 9)和疾病的阶段(P=0.000 1)均显著相关联。化疗之前标志物水平和2个月的3种标志物分段标记值被认为是对治疗效果的重要预测。在多变量分析中,只有CYFRA21-1和体能状态为胰腺癌的独立预测因子。结论:CYFRA21-1可以用作晚期胰腺癌监测治疗反应和评估预后的宝贵工具。
3.3 鼻咽癌
鼻咽癌是一种头颈部恶性肿瘤,因临床表现不一且复杂、前期症状不明显、起病隐匿,不容易确诊。鼻咽癌患者主要依靠影像学检查监测复发、远处转移及治疗效果,但不能动态反映疗效及监测复发[7]。CYFRA21-1的研究有利于改变鼻咽癌的现状。
国内一项研究[8]通过测定332例鼻咽癌患者治疗之前血清CYFRA21-1水平,研究其与OS、无瘤生存期(tumor-free survival,TFS)、局部复发时间(time to local recurrence,TLR)和远处复发时间(time to distant recurrence,TDR)的关联。结果:多因素分析表明,治疗前血清CYFRA21-1水平和肿瘤分级高是OS缩短和TDR的独立预测因子。高水平的治疗前CYFRA21-1是更短的TFS和TLR的独立预测因子。结论:治疗前血清CYFRA21-1的水平将是一个可靠的生物标志物,用以评估患者的未分化鼻咽癌的长期预后。
3.4 上皮性卵巢癌
卵巢癌是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤,具有发现晚、治疗效果差、转移早等临床特点,病死率居妇科恶性肿瘤首位[9]。
Wu等[10]回顾性分析42例未经治疗的上皮性卵巢癌患者的血清的CYFRA21-1浓度,采用单变量和多变量分析该疾病的不同预后,同时测定血清标志物糖类抗原125(carbohydrate antigen-125,CA125)浓度,并分析比较。此试验得出结果:CYFRA21-1和CA125的血清水平与腹膜后阳性淋巴结和铂电阻有关;与比较低的水平CYFRA21-1相比,较高水平的CYFRA21-1(3.0 ng·ml-1为截点)与更短的无病存活率(16个月vs 28个月P=0.001)和总生存期(29个月vs 41个月,P=0.007)相关。进一步的单变量分析显示,CYFRA21-1和腹膜后淋巴结转移均与铂电阻和死亡率有关。多变量分析显示腹膜后淋巴结转移和血清CYFRA21-1水平可作为TFS和OS的独立危险因素。结论:未经治疗的上皮性卵巢癌血清CYFRA21-1水平有显著的预后意义,当它超过3.0 ng·ml-1时预后差。
测定血清CYFRA21-l的水平对卵巢癌的预后进行评估,随时监测病情变化,具有重要意义。
3.5 肺癌
肺癌是造成肿瘤患者死亡的重要因素,其发病率高,而且不易早期诊断,不仅病死率高,治疗后效果也不佳。
国内一项研究[11]通过电化学发光法测定血清CEA和CYFRA21-1的水平,这些血样采自102例肺癌患者,45例良性肺疾病患者和36例健康对照者。结果:在肺癌患者中,血清CYFRA21-1水平和阳性率[(14.08±8.34)ng·ml-1,62.7%]显著高于良性肺部疾病患者[(3.27±2.87)ng·ml-1,7.7%;P<0.05]和健康对照组患者[(2.69±2.02)ng·ml-1,3.8%;P<0.05]。肺癌患者处于不同TNM阶段,其CYFRA21-1水平都不同程度地增加:Ⅱ期(10.05±6.76)ng·ml-1,Ⅲ期(15.93±6.66)ng·ml-1,Ⅳ期(22.78±4.12)ng·ml-1。结论:CYFRA21-1单独采用对肺癌的诊断有帮助。
在肺癌的诊断中以组织病理检查和细胞学为诊断依据,特异性高,但敏感性不强,所以肿瘤标志物成为了理想的指标[12]。CYFRA21-1的出现,对肺癌诊断提供了便利条件。同时,CYFRA21-1便于确定病理类型,若联合检测可以提高肺癌诊断的敏感性,大大提高肺癌的检出率[13]。
3.6 膀胱癌
膀胱癌为泌尿系统中常见的恶性肿瘤。膀胱癌复发率很高,约一半的患者可能复发,一小部分复发患者可进展为浸润性肿瘤[14]。
Washino等[15]通过研究血清CEA、CA19-9和CYFRA21-1水平来分析它们对膀胱癌的诊断和监测的有效性,血样来自85例膀胱癌患者。在不同的肿瘤临床分期和病理分级中,比较每个肿瘤标志物的绝对水平和阳性率。标志物的变化用来评估患者有无疾病进展,同时评估生存与这些肿瘤标志物之间的关系。结果表明:较高的CYFRA21-1血清水平与较高的肿瘤分期关系密切(P<0.01),同时与较高的病理分级(P<0.05)相关。CYFRA21-1的水平随着疾病的进展显著升高[从(7.33±13.3)增至(55.9±127)ng·ml-1,P<0.01]。CYFRA21-1阳性的患者疾病特异生存率更差,(P<0.000 1,时序检验)。结论:血清CYFRA21-1在膀胱移行细胞癌的诊断上似乎是一个先进的标志物,CYFRA21-1可以有效地监测膀胱癌的进展及评估其预后。
3.7 胃癌
近些年,各种肿瘤标志物已被应用在胃癌的管理中,只有少数报道描述CYFRA21-1。
Gwak等[16]通过试验评估CEA、CA19-9、糖类抗原72-4(carbohydrate antigen 72-4,CA72-4)、CYFRA21-1和神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)在胃癌患者中的潜在诊断性能。结果表明:在胃癌的初期阶段,根据两个不同的临界值(推荐的和调整的),CYFRA21-1(≥2.0和1.2 ng·ml-1)有各自的敏感性,分别为50%和78.1%;CEA(≥7.0和3.9 ng·ml-1)的敏感性分别为8.3%和18.8%;CA19-9(≥37和26.7 ng·ml-1)的敏感性分别为15.6%和18.8%;CA72-4(≥4.0和13 ng·ml-1)的敏感性分别为28.1%和9.6%;NSE(≥14.7和15.0 ng·ml-1)的敏感性分别为7.3%和7.3%。CYFRA21-1在ROC曲线下的面积(AUC)0.978(95%置信区间,0.964~0.991)是相对最高。结论:CYFRA21-1是最敏感的肿瘤标志物,并显示出在5个胃癌管理肿瘤标志物中最强大的诊断性能。
3.8 胆道肿瘤
胆道肿瘤包括肝内、肝门部、远端胆管和胆囊癌。血清CYFRA21-1水平升高在胆道肿瘤中有少量报道。
Huang等[17]通过研究探讨血清CYFRA21-1在胆道癌亚型中的临床意义。该实验随访134例恶性和52例良性病变患者,测定其血清CYFRA21-1、CA199和CEA术前、术后的值,分析了生物标志物的受试者特征曲线。CYFRA21-1水平与患者临床病理特征及随访数据相关。结果:CYFRA21-1在胆道恶性肿瘤中显著上调,而且在不同的亚型中有表达差异。在确诊胆囊癌和肝内胆管癌方面,CYFRA21-1比其他肿瘤标志物具有更好的诊断性能;在手术切除肿瘤后下降,在肿瘤复发时升高,它与肿瘤的侵袭性和TNM分期相关。这是一个多因素分析中1年无复发生存率和总生存率的独立预测因子。结论:血清CYFRA21-1在应用于诊断胆囊癌和胆管癌上,是一种可靠的生物标志物。
3.9 宫颈癌
宫颈癌是一种恶性的妇科肿瘤,其预后评估受到极大的重视,具有重要的临床意义。Piao等[18]通过回顾性分析506例宫颈癌患者根治性子宫切除术或次同步放化疗治疗的数据。治疗前测定患者血清鳞状上皮细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen,SCCAg)和血清CYFRA21-1水平,采用Cox比例风险模型进行多因素分析,探讨治疗前变量的预后意义。结果:治疗前CYFRA21-1(P=0.010)血清水平独立影响总生存率。同样,在非鳞状细胞癌患者中,治疗前CYFRA21-1的血清水平是影响无病生存期和总体生存率的独立预后因素(P<0.001,P=0.006)。结论:参考血清SCCAg,治疗前CYFRA21-1水平可作为宫颈癌的一个有效预后指标。
3.1 0 其他肿瘤
CYFRA21-1不仅在乳腺癌、胰腺癌、鼻咽癌、上皮性卵巢癌、肺癌等疾病中检测出,同时在其他肿瘤中也被检测出,如食管鳞状细胞癌。丁文秀等[19]采用电化学发光法分别检测健康对照组(45例)和初次诊断食管鳞状细胞癌患者(90例)血清中CYFRA21-1和CEA浓度,并对出现淋巴结转移和(或)远处转移者再次检测血清中CYFRA21-1和CEA的浓度。该实验结果表明:CYFRA21-1对食管鳞状细胞癌的诊断及预后有重要价值,而且优于CEA。
4 CYFRA21-1在慢性炎症性疾病中的临床应用
华红等[20]通过研究表明:CYFRA21-1不仅在肿瘤疾病中有所表达,同时在结核性胸膜炎等慢性炎症疾病中有所表达,但CYFRA21-1在结核性胸膜炎中的水平不及肿瘤高。
5 结语
随着CYFRA21-1在各个系统肿瘤中的研究越来越多,其应用也越来越广泛,不仅应用于肿瘤诊断、监测病情变化方面,而且在肿瘤的预后评估方面也有重要价值。然而,CYFRA21-1本身也具有一定的局限性,在各系统肿瘤中特异性及敏感性都有一定的差异,该肿瘤标志物敏感性、特异性相对较低,所以即使有时肿瘤标志物阴性,也不能完全排除肿瘤的存在。但是通过CYFRA21-1与其他肿瘤标志物如CEA、CA125、CA199等的联合检测,会大大提高其诊断的阳性率。如果同时结合病理诊断,就更能体现CYFRA21-1的实用价值,进一步造福于患者。我们相信在不久的将来,CYFRA21-1的临床应用会走向成熟。
角蛋白质 篇2
关键词：生物技术,角蛋白微生物降解,营养改善,家禽羽毛
1 引言
家禽羽毛占家禽体重的5%~7%, 是一种废弃物, 但作为动物饲料又具有应用的潜力和限制。尽管羽毛对鸟类来说具有重要作用, 但在离开了鸟的身体后, 它们的生物学利用似乎不太理想。家禽羽毛可能组成了自然界中最丰富的角蛋白资源。家禽在被人们食用后, 其羽毛就被当作废弃物堆积起来。因此废弃物就产生了很大的污染影响, 尤其随着全球家禽类产品的增长。
可以理解, 家禽羽毛中大量有潜在使用价值的蛋白与氨基酸 (如表1) , 可以用作动物饲料, 这使得羽毛资源循环利用成为了动物营养学家感兴趣的课题。因为羽毛作为蛋白饲料, 在价格和替代性上都具有潜力。然而, 羽毛利用的限制主要是其不容易消化, 生物学价值低, 以及缺乏一些有营养价值的必须氨基酸, 如蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸 (Baker et al, 1981;Papadopoulos et al, 1985;Dalev et al, 1997) 。同时, 羽毛组成的氨基酸是多变的 (Wang and Parsons, 1997) 。另外, 随着家禽年龄增长, 其毛中总必需氨基酸含量下降, 尤其是蛋氨酸、赖氨酸、精氨酸, 而总非必需人氨基酸相对增加 (Stilborn et al, 1997) 。天然羽毛蛋白的营养缺陷主要来源于维持羽毛蛋白结构刚性的氨基酸组成与分子结构。同样的原因也可以解释天然角蛋白不能被大多数蛋白水解酶降解。蛋白链中大量存在的α螺旋 (α角蛋白) 或β折叠 (β角蛋白) 形成超螺旋多肽链, 从而使羽毛具有很强的机械稳定性与抗蛋白酶水解性。大量双硫键的形成也使多肽链的交联度提高。
大量的半胱氨酸促进了双硫键的形成。多肽链中的氢键, 疏水作用以及超螺旋的稳定性进一步促进了角蛋白的强度和耐水解性。
然而, 生产易消化蛋白粉的传统方法是热降解法。根据Papadopoulus (1989) , Latshaw et al. (1994) 和Wang and Parsons (1997) 可知, 热处理对营养的改善有限, 必需氨基酸像赖氨酸、蛋氨酸和色氨酸会遭受损失, 并且会形成非营养氨基酸如溶素丙氨酸、羊毛硫氨酸等 (表1) 。
在有限的营养改善背景下, 考虑到羽毛传统加工的热能耗成本, 从营养改善, 环境友好和谐, 生物资源最优化以及成本有效化入手探索一种替代性技术是合理的。
涉及到微生物及其酶的生物技术方法是一种概念上合理的处理技术。然而, 还没有文献记录角蛋白水解微生物的工业应用前景, 尤其是强调角蛋白酶产品、性能和其水解的机理和缺陷的文献。因此, 为了促进生物技术处理羽毛将其用作动物饲料, 本文综述了生物法水解角蛋白的最新信息。羽毛营养价值升级可以生产出高蛋白饲料, 从而可以大大节约家禽饲料中大豆和鱼粉的使用。此外, 可以预测, 羽毛的生物转化会有益于养禽业、人类以及环境。
2 微生物角蛋白水解和角蛋白酶产品
2.1 自然界中角蛋白水解的证据
尽管角蛋白非常稳定, 但在自然界中羽毛也不会积累, 因此可证明确实存在天然的角蛋白分解者或食用者。从人类或家禽的蹄、指甲、角质层、角、头发等角蛋白部分的致病性皮肤真菌和生长 (感染) 可以获得进一步证据, 或许会是自然界中角蛋白降解的一个更好的研究方面。皮肤真菌一种微生物, 可以寄生于活体动物的角质基层中。当此类微生物在含有角蛋白的介质中培养时, 它们可以将角蛋白基质作为碳源和氮源而食用。皮肤真菌在角蛋白基质中的生长说明它们有能力合成降解复杂角蛋白的蛋白水解酶。
2.2 微生物角蛋白降解以及它们生物技术应用的理由
很多科研工作者 (Yu et al, 1969;ElmayergiandSmith, 1971;Takiuchi et al, 1984;Asahi et al, 1985;Wawrzkiewicz et al, 1987;Abdel-Hafezand El-Sharoumy, 1990;Malviyaet al, 1992;Santos et al, 1996;Simpanya and Baxter, 1996;Singh, 1997) 已经证明和报道过很多微生物都能分解角蛋白, 这些微生物中大多数是真菌和细菌。一些腐生菌和寄生菌可以降解角蛋白 (Safranek and Goos, 1982) 。还有很多新孤立的微生物表现出降解角蛋白的性能。最近, Lin et al. (1995) 测序并表达了ker A基因, 它能翻译出地衣芽孢杆菌PWD-1 97%序列一致的角蛋白水解酶。
观察角蛋白底物的天然降解与寄生虫感染降解, 在实验室条件下进行重复性实验, 结果表明, 作为动物饲料通生物技术提高羽毛利用是可靠的。这与Lin, Dozie和Santos等人的断言一致。
生物技术在羽毛加工上的应用具有以下重要意义。第一, 微生物的培养和角蛋白酶的活力可能会改变羽毛角蛋白的结构。这就有可能改变对食用动物消化酶的抵抗性 (Elmayergi and Smith, 1971;Barabas, G.等, 未公开结果, 1986;Benedek等, 1985;Willianms and shih, 1989) 。此外, 可以有从微生物蛋白质的生物量的羽毛粉, 可能是互补或添加剂的营养富集。Barabas, G等 (未公开发表结果, 1986) 发现, 与未发酵羽毛相比, 发酵羽毛中赖氨酸、蛋氨酸和精氨酸含量更高, 得出结论, 不仅羽毛角蛋白可以作为蛋白来源, 微生物也可以。Earlier, Elmayergi和Smith (1997) 已经报道过, 通过S.fradiae的一种蛋氨酸分泌突变体发酵的羽毛蛋氨酸和赖氨酸含量有少量增加。第三, 氨基酸的生产也是可行的, 尤其是饲料级的赖氨酸和其它来自于羽毛微生物发酵产生的氨基酸 (MohammedEl-Akied, 1987;Williams和Shih, 1989) 。表2和表3提供了发酵羽毛营养改善 (氨基酸含量增加) 的证据。
2.3 角蛋白降解微生物的生态学
角蛋白降解微生物在自然界普遍存在, 尽管倾向于靠角蛋白基物生长。或许研究最透彻的就是皮肤癣菌因为大多数研究者对病理学很感兴趣 (Grappel和Blank, 1972;Higuchi等, 1981;Wawrzkiewicz等, 1987, 1991;Apodaca和Mckerrow, 1989;Hanel等, 1991;Porro等, 1997) 。Geophilllic皮肤寄生真菌得到了很大关注 (Abdul-Fatah等, 1982;Al-Musallam, 1988;) 。角蛋白降解微生物已经从污泥中分离 (Ulfig和Korcz, 1983, 1994) 。一种嗜动物性皮肤真菌发癣菌对鸡毛有高度专一性 (Wawrzkiewi cz等, 1987) 。
具有角蛋白降解能力的非寄生真菌也被分离来对它们的酶进行提纯和角蛋白水解性评估 (Malciya等, 1992, 1993a, b;Dozie等, 1994) 。Williams和Shih从混合了粪便与鸡毛的消化池中分离了B型地衣杆菌。从土坑壤中分离了链霉菌sp.A11, 可产生解朊和角蛋白水解活性 (Mukhopadhyay和Chandra, 1990) 。Santos等人1996年报道了烟曲霉菌, 这是一种在人体, 鸟类和其它动物中普遍存在并伺机靠空气传播的病原体, 将鸡毛作为其唯一的碳和氮源。
角蛋白降解微生物在不同生态和环境条件下生长, 并且溶解角蛋白基物和其它复合蛋白基物的能加很宽泛。微生物主要是通过合成和分泌蛋白酶将底物降解和分解为可吸收的小分子营养素。然而, 有相关文献已经报道了具有角蛋白水解活性的蛋白内切酶或细胞结合酶 (Yu等, 1971;Lamkin等, 1996) 。同时对于它们在复合蛋白底物中的分子机理的理解仍远不够。
2.4 角蛋白降解酶的特性
通过能够降解角蛋白的微生物在细胞内或外加工释放出的特性蛋白酶命名为角蛋白酶或角蛋白水解酶。这种酶与其它类似的蛋白水解酶相比, 水解复合底物的活性更好, 从而就区分了角蛋白酶与其它蛋白酶或肽酶。
多数角蛋白酶在很大程度上是诱导性的, 需要角蛋白作为外源诱导物。某些微生物的角蛋白酶有消抑制作用, 如念珠菌、白色念珠菌 (Kapica和Blank, 1957, 1958和金孢子菌 (DOZIE等, 1994) 分化带来他们从组成前分泌表达的细胞结合的角蛋白酶。
许多角蛋白酶在细胞外是有活性的, 从合成物的细胞内位点释放出。然而, 与细胞相关活力的证据蛋白酶已有报道癣菌 (Yu等, 1971) , 和一种被充分研究过的角蛋白降解微生物毛癣菌 (Lamkin等, 1996) 。但T.rubrum的内切酶对蛋白质底物具有宽的选择范围, 不像T.gallinae。
本文献描述了不同微生物对角蛋白的水解活力和酶底物的专一性。这可能是方法论和物种不同的原因。例如, Lin等1992年发现从B.地衣杆菌中提取的蛋白酶可以水解所有被测的蛋白底物, 包括牛血清蛋白、胶原、弹性蛋白和羽毛角蛋白。与上述一致, Bockle等1995年观察了从鸡毛不同可溶底物 (酪蛋白与明胶) 与不可溶底物 (天然与热压处理) 所含肽的释放情况。相反, Dozie等1994年报道了一种亲热性角蛋白水解酶。这种酶从C.keratinophllum中获得, 只水解角蛋白, 但对酪素、牛血清蛋白或角蛋白粉无水解活力。这表明分离的酶对角蛋白底物具有专一性。从另一个角度, Bockle等1995年发现, 在40~70℃范围内用角蛋白降解S.pactum的培养滤液可以将完整鸡毛分解, 远超过了生理需求, 然而, 纯化酶的溶解率还不到底物的10%。
高度专一性细胞内角蛋白酶通过T.gallinae加工释放 (Wawrzkiewicz等, 1987) 。从一些角蛋白降解微生物中提取的特征角蛋白酶的物理化学性能总结在表4中。
2.5 微生物角蛋白水解的机理
角蛋白微生物水解的基本是一种蛋白降解的过程, 因为底物 (角蛋白) 本质上就是蛋白质, 也就说蛋白重量占95%。尽管角蛋白酶的物理化学性能不同, 但它们对角蛋白具有相同作用这一点毋庸置疑。大多数角蛋白水解酶特性可以作为蛋白酶, 对角蛋白有活性。然而, 对于角蛋白水解的重要机理和角蛋白降解微生物的新陈代谢还不太清楚。尽管对角蛋白酶的动力行为缺乏完整理解, 但很多证据证明以下流程存在的可能性。
2.6 机械的角蛋白水解
这只用于真菌和菌丝体的生产, 角蛋白降解微生物。机械角蛋白水解可以理解为是由角蛋白底物或菌丝压力引起的角蛋白降解。Malviya等1992注意到, 在细胞外发现角蛋白酶活性之前角蛋白就开始水解了, 而且降解与菌丝体生长有关。这或多或少预示了机械降解。真菌菌丝体生长与伸长对复合底物产生压力或作为完整的角蛋白水解机理, 机械降解的证据已被预先讨论过 (Wawrzkiewicz等1987) 。
真菌对宿主的入侵结合了机械压力与酶的水解。通过Figueras等最近的研究, 在不考虑成分结构角质化的前提下, 使用超微结构显微照片可以观察出真菌垂直侵蚀毛发的能力。菌丝的机械渗透是有必要的, 有利于暴露出更多酶解肽键的反应位点。
从可获得的证据来看, 或许可假设机械角蛋白降解促进了酶的水解, 实际上当菌丝产生外切蛋白酶时更是这样。机械水解和酶水解和协同作用或许发生在起始过程之后。然而, 纯化角蛋白酶的初始化能力, 持续羽毛降解的能力也许会对以上假设产生质疑。
2.7 硫解
因为羽毛粉中半胱氨酸含量较高, 才出现了硫解的标志。可以理解, 羽毛中含有半胱氨酸的优势就是通过形成双硫健使生物分子结构更加稳定。大从数研究工作者已经认为角蛋白降解的一种可能机理就是双硫键的断裂。然而, 验证性研究在这方面很缺乏。
2.7.1硫解证据
在角蛋白的降解过程中, Kunert的调查对硫解提供了深刻的理解。从Ruffin等和Malviya等的研究中也获得了贡献性证据。双硫键是角蛋白具有突出稳定性与抗降解性的主要原因。只有通过双硫键断裂使蛋白变性, 角蛋白才可以完全水解, 大家对此达成共识。
根据Kunert (1992) , 癣菌和非癣菌将代谢出的自由的或结合的半胱氨酸作为硫源和氮源 (Ziegler等1969) 。通过真菌代谢的胱氨酸产物是无机硫和其它中间产物。Kunert (1992) 认为过量的硫以氧化态的硫酸盐和亚硫酸盐形式排泄回介质中。根据下面反应式, 在中性至碱性p H范围内, 亚硫酸盐与胱氨酸反应, 生成半胱氨酸和硫磺基半胱氨酸。
根据Kunert (1992) , 结合在蛋白质上的胱氨酸也会发生这种反应, 包括角蛋白。因此由于亚硫酸盐的释放, 角蛋白在被蛋白酶降解之前就已经变性了, 这就导致了双硫键的分解。Kunert, Malviya等人提供了双硫键断裂与角蛋白分解同时进行的充实证据。实事上, Malviya等人发现只有超过一半的角蛋白被降解后才能在培养介质中检测到角蛋白。这也就意味着角蛋白有非酶或非水解方式的降解。在角蛋白培养液中出现像磺化半胱氨酸, 硫代硫酸盐, 硫酸盐以及半胱氨酸这样的硫解产物进一步证明双硫键断裂。然而, 很多研究者几乎未检测到中间产物。对于这种现象的解释是真菌优先将半胱氨酸作为硫源。Malviya与Mohammed El-Akied的研究表明培养液中残留半胱氨酸量持续下降, 很明显是因为被真菌代谢消耗。
此外, 当加入DDT, DMSO, 巯基乙醇盐, 苏糖醇等还原剂时可以加强角蛋白水解, 这就可以提供物理化学的证据。为了确认亚硫酸盐分泌降解角蛋白先于真菌蛋白酶降解角蛋白, Kunert比较了五种还原剂磺酸钠、半胱氨酸、谷氨酰胺、巯基乙醇和苏糖醇对微孢菌蛋白酶活性的影响效果。结果表明, 亚硫酸钠在浓度为3.78 mg/m L时, 蛋白酶活性提高最多, 达到2.9倍。半胱氨酸, 巯基乙醇, 谷氨酰胺的效果逐步下降, 并且浓度在0.3~1.0 mmol时效果最好。效果最差的是苏糖醇。Kunert发现, 24 h内, 胱氨酸桥键断裂32%、66%和97%并且转化为硫磺基半胱氨酸后, 水解效果分别增加3.7、29和43倍。Kunert讨论了获得的结果, 从而揭示出随着硫解程度增加, 蛋白水解的敏感性迅速增加并且底物的溶解也可以从微观证明和重量测定。Bockle等人也证明了添加DDT对细菌蛋白酶混合物和纯角蛋白酶的角蛋白水解活性有催化效果。作者还发现如果没有1%的DDT加入, 角蛋白降解率只有大约10%, 然而加入后能够达到70%。此前, Takami等人发现巯基乙酸盐催化时, p H12, 温度70℃, 1 h内就可将毛完全溶解。并且, 在无还原剂的情况下, 蛋白酶几乎无角蛋白水解活性。Sinha等人还报道了S.fradiae的两种丝氨酸蛋白酶, 在加入DDT后蛋白酶活性增强。加入巯基乙酸盐时, S.pactum的蛋白酶无活性, 但加入DDT后有活性。这就表明, 微生物酶对能还原双硫键的化学试剂具有不同反应。
其它验证性间接数据也有, 两种非专一性蛋白酶胰蛋白酶和链霉蛋白酶硫解天然羊毛相同的降解效果, 这可以作为验证性的间接数据。Everett之前也报道了一种类似的发现。组织化学反应也揭示出在硬角蛋白降解的位点上有大量硫磺基团。然而, 不同微生物的硫解能力不同, 这或许与它们寄生潜能的差别相关。
2.8 蛋白水解
然而, 角蛋白的水解阶段或许被过度简化了, 并且与肽键水解类似, 角蛋白酶的敏感性不同。不同的相对分子质量、活化剂以及最适环境条件 (p H, 温度) 表明仍缺乏酶解蛋白机理的相关知识。的确, 非专一蛋白酶降解硫化角蛋白的能力使角蛋白酶的专一性进一步复杂化。这种矛盾在纤维素、甲壳素、多糖这类复杂有机化合物的微生物代谢中普遍存在。
但是, 与其它蛋白酶相比时, 微生物角蛋白酶的高水解性是一个突出的因素。此外, 纯角蛋白对长链和复杂分子的特殊偏爱也对支持角蛋白专一性提供了补充证据。角蛋白酶对底物的专一性也暗示了不同作用方式的可能, 但仍然有待了解。
2.9 角蛋白水解的反应顺序
对角蛋白降解提出精确的反应顺序是有困难的。然而, 对于真菌和放线菌, 大概从菌丝的生长开始, 接着分泌破坏双硫键亚硫酸盐, 最后蛋白水解。过了初始阶段, 几个过程同时进行, 微生物也仍在生长。当有细菌体、纯酶或粗酶加入时, 或许是一种不同的降解机理。这基本上需要角蛋白底物的分解。Kunert经过大量研究证实了真菌存在时角蛋白降解的假设路径, 当使用纯酶时, 角蛋白酶分离纯化后的结果可以从表面上说明可能的机理。也很可能是一种单独的作用模式, 或许不会适用于所有类型的角蛋白降解微生物。
2.1 0 羽毛粉的微生物处理:生物技术应用的可能性
大多数研究者同意作为饲料蛋白羽毛 (角蛋白) 的微生物转换代表了一种改善羽毛使用价值微生物技术。通过在羽毛中培养角蛋白降解微生物, 接着在细胞外分泌角蛋白酶, 可以达到羽毛的生物降解。不用微生物单独使用含有角蛋白酶或粗酶的培养滤液, 或着单独使用纯酶也可达到羽毛的生物降解。
2.1 1 羽毛粉营养改善的证据
Elmayergi和Smith的研究为我们作了先驱工作, 他们评价了S.fradiae发酵后羽毛粉的氨基酸的营养补充情况。尽管发酵产品的蛋氨酸、赖氨酸和色氨酸含量仍很低, 但与未发酵产品相比, 蛋氨酸含量增加 (表3) 。Elmayergi和Smith表示羽毛发酵后所有氨基酸的浓度均大大提高。然而, 通过喂养试验得出的结果表明发酵与未发酵羽毛粉的营养价值无太大区别 (表5) 。这也就解释了产品不能用于鸡类的原因。通过补充蛋氨酸以达到生物需求继续实验, 即给肉鸡喂食分离的大豆, 最终肉鸡的生长率发生了明显的变化。在一个类似的研究中, Barabas, G等人发现与完整羽毛相比微生物发酵的羽毛粉中赖氨酸、蛋氨酸和精氨酸含量更高 (表2) 。作者分析了两组老鼠喂养试验, 发现喂食羽毛水解物的老鼠体重未减少, 而喂食少蛋白食物的老鼠体重减少。尽管喂食羽毛粉的老鼠可能因为蛋氨酸缺乏而有体重下降的可能, 但这些研究也可确认羽毛水解物的可消化性和使用性。从他们的研究中可以得出结论, 不仅羽毛粉 (角蛋白) 可以当作蛋白质喂食动物, 同时产酶菌的生物量也可以。
2.1 2 粗角蛋白酶的使用
Lee等人报道了粗角蛋白酶作为饲料添加剂首次使用。角蛋白酶从地衣芽孢杆菌中获得。他们发现, 添加了角蛋白酶后原毛总氨基酸的可消化性从30%增加到66%, 而商品毛从77%增加到了99%。在第二个以8天为基准的实验中, 对年龄三周大肉鸡分别喂食大豆粉、商业羽毛粉、角蛋白酶补充处理的羽毛粉, 肉鸡的日增长量分别为66g, 50 g, 56 g。从两个实验可以得出结论, 添加角蛋白酶可以提高羽毛产品的可消化性, 这样就扩大了角蛋白酶在增强羽毛粉营养方面的应用。
2.1 3 纯角蛋白酶的使用
莱纳大学J.C.H Shih和他的同事获得了纯角蛋白酶作为饲料补充的大量应用证据。为了降低酶的自分解, 研究者最近所作的努力是将从地衣杆菌分离的纯角蛋白酶固化。固化角蛋白酶对不可溶的羽毛角蛋白和可溶性的酪素都表现出水解活性。而且与未固化角蛋白酶相比表现出更高的热稳定性和耐酸性, 因此增加了其在更多应用上使用的潜能。
2.1 4 生物技术方法对羽毛营养改善的建议途径
考虑到生物技术应用于羽毛营养改善具有很大潜能, 在羽毛加工上, 微生物技术的应用范围如下:
(1) 获得完全的羽毛结构降解。通过化学处理或微生物处理或几种方法结合处理达到硫解是可行的。需要全面实施对外部内部以及培养过程中辅因子的研究, 因为这些辅因子或许会优化酶的催化作用。
(2) 加强羽毛粉的营养价值, 尤其是蛋氨酸和赖氨酸的含量。可能以下任何生物技术工具的结合都是相关的。
1) 像赖氨酸这种主要有限氨基酸的转肽作用或氨基酸结合或共价结合作用。
2) 通过角蛋白降解微生物的突变或蛋白质工程进行基因操控。
3) 角蛋白酶基因在无害微生物的翻译, 因为很多活性角蛋白水解微生物具有致病性。
(3) 使用一种联合方法设计出一种微生物复合酶很有意义, 这种方法能将角蛋白水解酶与肽解酶进行共同加工。也需要考虑结合能分有限氨基酸 (蛋氨酸和赖氨酸) 的细菌作为联合成员的可能性。从混合培养物中发现了很多这种微生物协同作用的例子, 如在动物饲料中添加益生茵, 又如微生物纤维素酶复合物用作饲料添加剂。能产生多组分酶复合物的真菌将会是理想的考虑对象。
(4) 使微生物在高温下获得稳定性是生物技术应用的先决条件, 并且在中性条件下具有活性也是有益的。或许在较高的培养温度下并且通过使用具有还原性的添加剂 (化学试剂) 可以获得较高的角蛋白水解率。有关文献报道说, 酶中一些二价金属的稳定效应导致了它们的高活性。
(5) 进一步为角蛋白酶产品筛选具有极高活性的非致病微生物, 以及酶在无需分离和纯化条件下的使用。它们的生物量可能对最终产品的蛋白质和氨基酸含量有贡献。
(6) 通过对皮肤杆菌致病机理知识的整理综合深刻了解了角蛋白结构降解的机理。这种合作性研究将会对家禽羽毛的营养优化产生有效的生物技术策略。
3 结论
角蛋白质 篇3
羊毛主要组成物质是角朊蛋白质, 由近20种α-氨基酸以—CO—NH—肽键构成多肽长链。大分子间除依靠范德华力、氢键结合外, 还通过盐式键、二硫键、酯键相结合而使其大分子具有网状结构。尤其二硫键的存在, 致使羊毛不溶于水并具有较强的耐酸能力, 打开二硫键并保持羊毛大分子主链的完整是溶解羊毛的关键[1,2]。目前将废弃毛溶解制取角蛋白溶液, 在缓释肥料[3]、再生蛋白纤维[4,5]、薄膜[6,7]以及组织工程支架[8,9]等材料领域, 已取得较大进展。大分子角蛋白作为一类天然高分子材料, 具有良好的生物亲和性及可降解性等优良特性[10,11], 具有类似羊毛纤维的结构, 但纯羊毛角蛋白膜在干燥条件下脆、硬、易折裂的特点, 极大地限制其使用。同时我国羊毛资源丰富, 每年废弃的毛数量巨大, 造成环境污染及资源浪费[12]。为实现废旧羊毛的再生利用, 扩展角蛋白资源的应用领域, 对其改性制备优良使用性能的膜材料及其功能材料势在必行。
聚合物共混是改善角蛋白性能的主要手段之一, 通过共混可使不同聚合物之间产生强烈的相互作用, 利用能够与蛋白质分子形成氢键和静电作用力的聚合物与其共混, 即可提高纯角蛋白膜的使用性能[13,14]。张华林[15]等利用高浓度、高黏度、高制成率的羊毛角蛋白与羧甲基壳聚糖 (NOCC) 及增塑剂甘油, 通过机械共混法制膜, 结果表明, NOCC的加入明显改善了纯角蛋白膜材料的物理机械性能, 添加甘油使共混膜具有良好的弹性和韧性。王辉[16]等研究了羧甲基纤维素钠共混改性丝素蛋白膜的结构与性能, 结果表明:加入羧甲基纤维素钠的共混膜, 丝素蛋白含量大于70%时, 拉伸强度适中, 伸长率最大, 适合作医用创面材料。但共混改性存在高分子材料相容性较差的缺点, 并且增塑剂多与高分子材料形成氢键次级键作用, 在膜的耐水性能方面有待改善, 所以交联改性方法值得借鉴。马春辉等[17]研究了交联改性制备胶原蛋白膜, 配制胶原蛋白溶液, 依次加入淀粉、戊二醛、增塑剂增稠, 真空脱气后涂布于光滑玻璃板上, 干燥后揭膜, 戊二醛起到交联改性作用。冯治平等[18]利用交联作用改善大豆分离蛋白膜的保藏特性, 提高其阻湿性和抗拉强度。结果表明:经0.04%二醛或0.2%环氧氯丙烷交联后, 大豆分离蛋白膜的阻湿性分别下降5.7%和5.1%。抗拉强度提高35%和33%。经二醛交联过的大豆分离蛋白膜用于葡萄的保藏试验, 能明显防止葡萄的褐变, 延缓营养成分损失, 有效延长保藏时间。由于丝素蛋白、胶原蛋白、大豆蛋白与羊毛角蛋白在结构上类似, 以上方法可以借鉴。
本研究的前期工作是利用实验室自行提取的羊毛角蛋白溶液, 与羟甲基纤维素钠溶液共混, 并添加山梨醇做增塑剂, 制取共混膜, 但膜材的耐水性能较差。故本研究改用添加交联剂戊二醛, 对原料高分子进行交联改性。戊二醛分子式为C5H8O2, 是典型的双功能团试剂, 2个醛基 (—CHO) 可与羊毛角蛋白氨基 (—NH2) 发生醛化缩合反应, 共价结合, 与伯氨基作用形成环状吡啶结构, 基本原理如图1 (a) 所示, 在一定条件下交联剂能将单体、线型高分子转变成复杂三维网状结构, 交联度亦能达到很高程度, 醛化反应使肽链链段排列更加紧密。此外戊二醛与蛋白质的交联反应比较复杂, 也可能发生类似以下的结合, 3个戊二醛分子与一个氨基酸侧链反应可以生成图1 (b) , 醛基与氨基缩合生成希夫碱结构后, 再进一步反应, 多个 (b) 缩合连接构成图1 (c) , 形成共轭结构与环状结构的稳定结合[19]。添加戊二醛可以优化复合膜的机械性能、耐水性能、弹性与柔韧性, 本研究将深入探讨交联剂对复合膜各方面性能的影响。
1 试验部分
1.1 原料与仪器
废旧羊毛, 山东棉纺厂;
羟甲基纤维素钠 (CMCNa) , 食品级, 其重均分子质量5.0×105g/mol (黏度为300~800m Pa·s, 替代度中级D.S 0.75~0.9) , 天津市标准科技有限公司;
亚硫酸氢钠、溴化锂、十二烷基磺酸钠 (SDS) 、氢氧化钠、戊二醛, 均为分析纯, 上海嘉辰化工有限公司。
所有仪器由天津工业大学分析测试中心提供。
1.2 羊毛角蛋白的制备
称取一定质量羊毛, 加入还原剂Na HSO3/金属盐Li Br/表面活性剂SDS溶解体系, 调节适宜p H值和温度, 通入纯氮气隔绝空气反应若干时间后, 得到浅黄色、透明的羊毛角蛋白溶液, 经截留分子质量 (8 000~14 000) 透析袋流动水透析48h, 再用去离子水透析24h, 去除残余试剂和小分子多肽蛋白, 便得到了大分子羊毛角蛋白原液[20]。
1.3 复合膜的制备
配制一定质量浓度的羊毛角蛋白溶液, 同时将羟甲基纤维素钠粉末在50℃水浴下搅拌溶解于去离子水中, 配制成一定浓度的CMCNa溶液, 通过溶液共混方法将二者以一定配比混合, 并加入适量的交联剂戊二醛, 在一定温度、时间下搅拌均匀后得到制膜液, 静止稳定后倾倒于制膜容器中, 37℃下烘干1h, 室温下自然干燥成膜。根据之前制备羊毛角蛋白/羟甲基纤维素钠共混膜正交试验的研究[21], 羟甲基纤维素钠对膜的性能影响最大, 反应温度和时间影响较小, 故本研究在反应温度37℃, 反应时间1h, 羊毛角蛋白/CMCNa质量比5∶5条件下, 进行复合膜的制备。
1.4 力学性能测试
参照国标GB1039-79和GB1040-79, 采用织物拉力仪测试复合膜的拉伸强度和断裂伸长率。将膜材在真空干燥箱里烘24h, 用千分尺在样品上选取3点测厚度, 计算得平均厚度。取制备好的厚度相近的膜 (0.175±0.005mm) , 用裁样刀裁成长条型试样, 样品宽度为15mm, 夹持长度为30mm, 测试温度为室温, 湿度为 (65+5) %, 样品最终取值均由5次独立的测试结果求平均值得到, 织物拉力仪定速拉伸速度为100mm/min。拉伸强度和断裂伸长率的计算如下式所示:
1.5 含水率测试
膜在20℃、RH=65%条件下达吸湿平衡24h后, 取膜Wa (g) 放于烘箱中干燥48h, 烘至恒重, 称重Wb (g) 。计算其中所含水分质量占膜原质量的百分比, 每种样品均做5个平行试验, 取平均值。利用下面公式计算复合膜含水率:
1.6 溶失率测试
将膜精确称重Wa (g) 后, 置于盛有蒸馏水的锥形瓶中, 于37℃下放置30min后, 取出烘干至恒重, 再称重Wb (g) 。利用下面公式计算膜的溶失率:
1.7 透气率测试
按照国家标准GB/T12704-1991织物透湿性测定方法—透湿杯法进行:杯内装入10m L蒸馏水, 膜封装在杯口, 测试试样组装体于38℃环境中, 每隔1h测定1次, 重复5次。利用下面公式计算膜的透气率Qv:
式中:Gi为每次称量的透湿杯重量, g;
n为称量的次数;
t为称量的相隔时间, h;
A为膜的有效面积, m2。
1.8 扫描电镜测试
取力学性能良好的复合膜样品, 经干燥、喷金处理, 利用H-7650型扫描电镜测试并获得电子照片。
1.9 红外光谱测试
将膜样品剪成粒径小于40mm的粉末, KBr压片制样, 采用德国BRUK-ER公司TENSOR37型红外光谱仪测定膜样品的红外光谱。
1.10 X-射线测试
利用X-射线在晶体上产生的衍射现象, 可以从分子水平上分析物质的内部结晶状态以及晶体晶面在材料内部的取向。本试验利用X-多晶粉末射线衍射仪观测复合膜的晶体结构。
2 结果与讨论
2.1 实物膜对比
由图2 (a) 可以看出:纯羊毛角蛋白膜呈现小碎块状态, 无法形成整片膜, 羊毛角蛋白溶液干燥成膜后硬且脆, 轻触即碎裂, 力学性能较差, 需改性以提高应用性能。由图2 (b) 可知:纯羟甲基纤维素钠具有成膜性, 能够形成整膜, 但膜偏硬, 柔韧性和弹性欠缺, 无拉伸性, 以上二者均不能满足力学性能测试要求。图2 (c) 为力学性能较好的复合膜实物图, 表面光滑、半透明、均匀有一定柔韧性和弹性, 并且膜材具有一定厚度。
2.2 复合膜的表观形态
由图3 (a) SEM照片可以看出复合膜成膜效果比较理想, 表面无明显孔隙和较大裂缝, 复合膜内各组分相容性良好。图3 (b) SEM照片显示复合膜断面比较致密均匀, 各组分已达到分子结合水平。膜的表面出现的细小纹路可能是由于测试过程中温度偏高以及膜具有一定的含水率未进行脱气处理所致。
2.3 交联剂用量对膜力学性能的影响
由图4可以看出:复合膜的拉伸强度和断裂伸长率均随戊二醛浓度的增加而增加, 当戊二醛浓度为0.15%时, 复合膜具有最大断裂伸长率26.3%, 同时拉伸强度为40.1MPa。因为戊二醛与角蛋白分子的侧链集团形成密集的交联网状结构, 在戊二醛浓度较小的区域范围即可对羊毛角蛋白分子进行较大程度的改性, 促使原料分子内部结晶区域改变, 相应力学性能发生变化, 改善膜的柔韧性及弹性。当戊二醛浓度在0.15%~0.25%区间, 膜的断裂伸长率急剧下降至5%左右, 几乎难以拉伸伸长, 同时浓度在0.2%~0.25%区间, 膜的拉伸强度也大幅下降。当戊二醛浓度过大, 交联程度增加, 复合膜材料趋向硬化, 柔韧性急剧下降, 脆裂程度增大。在试验中观察, 随戊二醛浓度增加, 制膜液颜色由透明逐渐变至白色, 气泡也渐增多, 当戊二醛在浓度范围0.1%~0.2%之间, 复合膜的强度和拉伸性能较好, 戊二醛浓度超过0.2%, 膜材表现出硬且易裂的状态, 成膜性差。综合以上分析, 戊二醛最佳用量在0.15%, 兼具较好的拉伸强度和断裂伸长率, 并且膜材透明均匀, 弹性好易揭取。
2.4 交联剂用量对膜含水率的影响
膜材的含水率主要与各组分的亲水基团数目相关, 羊毛角蛋白和CMC-Na分子自身都含有一定数目的亲水基团, 故复合膜具有一定的含水率。由图5可知膜的含水率随戊二醛浓度的增加而逐渐减小, 从起始的9.25%至3.48%, 下降趋势明显。首先角蛋白与CMCNa分子间形成氢键缔合, 使膜内部的亲水基团减少, 另外主要因为戊二醛结构中含2个醛基, 与角蛋白分子氨基发生醛化缩合反应, 形成不可逆的共价结合, 使角蛋白分子间氢键作用明显减弱, 交联改性作用突出, 分子间形成紧密而复杂的交联网络结构, 促使原料分子中的亲水基团不断减少, 导致含水率明显下降。在戊二醛浓度为0.15%时, 复合膜具有最佳力学性能, 其含水率为7.05%。
2.5 交联剂用量对膜溶失率的影响
溶失率是膜材料的重要指标, 反应膜的耐水性能, 对膜材料的应用领域起到至关重要的作用。由图6可以看出随戊二醛浓度的增加, 膜的溶失率呈显著下降趋势。因为戊二醛与原料分子形成交联网状紧密结构, 浓度越高, 形成的交联程度越大, 膜越致密, 硬度强度越大, 溶失率下降幅度也较大, 与膜的力学性能相对应。当添加戊二醛浓度范围在0.1%~0.2%区间, 复合膜的力学性能良好, 其溶失率也较小在10%~20%之间, 耐水性较好。尤其在戊二醛浓度为0.25%时, 溶失率最小可达6.80%, 但此时的复合膜偏硬化趋势, 拉伸性与弹性均不理想。由此可说明添加戊二醛的复合膜的耐水性能较好, 形成的膜材在厚度、强度、韧性和耐水性方面, 均强于添加山梨醇做增塑剂的共混膜材料。
2.6 交联剂用量对膜透气率的影响
由图7可以看出:在戊二醛浓度范围0.05%~0.1%时, 膜的透气率逐渐增加, 因为角蛋白与CMCNa分子间形成氢键次级键作用, 另外戊二醛起交联作用, 与原料分子间构成不可逆的键合作用及大量交联网状结构, 打破原有分子间的结晶结构, 各分子间空隙增加, 膜的透气性能增强。当戊二醛浓度0.1%时, 透气率达到最高点74.5g/m2·h, 同时0.1%浓度亦形成分界, 即透气率下降的拐点, 随着戊二醛浓度的增大, 在0.1%~0.25%范围区间, 交联程度显著增大, 分子间密集的交联结构增加, 复合膜内部结晶区域增大, 膜材料更加致密, 厚度硬度极大增加, 透气性明显下降, 当戊二醛浓度为0.25%时, 透气性下降至30g/m2·h以下。
2.7 红外光谱分析
由图8a可知:纯羊毛角蛋白膜经红外光谱测试, 在1 650.0、1 537.5cm-1分别为α-螺旋型构象的酰胺Ⅰ和Ⅱ带的强特征吸收处出现强吸收峰, 表明是以α-螺旋型构象为主的羊毛角蛋白。另外在3 434.1、1 457.5cm-1处均有特征吸收峰, 属于酰胺键 (—CONH) 伸缩振动范围, 证明羊毛角蛋白膜中含有大量酰胺键的多肽分子结构, 并以α-螺旋型构象为主。羟甲基纤维素钠膜的红外光谱如图8b所示, 1 582.1cm-1处为羟甲基基团的特征吸收峰, 3 597.3cm-1处的吸收峰, 表明是羟甲基纤维素钠中—OH的振动峰, 此处振动峰的吸收强度比较大, 是由于羟甲基纤维素钠中的—OH基团比较多。由复合膜的红外光谱图8c对比图8a和图8b可以看出:羊毛角蛋白膜的1 650.0、1 537.5cm-1酰胺Ⅰ和Ⅱ带的强吸收峰明显向低波数偏移至1 643.8、1 414.2cm-1, 且吸收峰趋向平缓, 同时3 434.1cm-1酰胺键 (—CONH) 伸缩振动特征吸收峰也向低波数偏移至3 291.1cm-1。图8b中1 582.1cm-1和3 597.3cm-1处的特征吸收峰消失, 这是由于羊毛角蛋白分子与羟甲基纤维素钠分子之间形成氢键缔合, 纯角蛋白和羟甲基纤维素钠分子结构均发生改变, 同时证明了复合膜组分分子间存在分子水平的强烈相互作用, 在交联剂戊二醛作用下, 复合膜内部实现良好的分子间结合, 纯角蛋白膜得到充分改性, 复合膜材的各性能得以改善。
2.8 X-射线分析
由文献[22]可知羊毛角蛋白在2θ为6°和18°有2个较平缓的特征衍射峰, 内部存在结晶结构, 羟甲基纤维素钠膜在2θ=21°有强衍射峰, 在2θ=15.5°有弱衍射峰, 说明其有2种结晶结构的存在。若复合膜中各组分没有相互作用, 则在膜中会有各自的结晶区, 衍射图谱会相应表现为各组分按混合比例简单的叠加。由图9a可以看出:角蛋白/CMCNa/戊二醛复合膜衍射图谱中在2θ为4.6°和7°出现2个明显尖锐的特征衍射峰, 结晶度较为集中突出。相比纯角蛋白和CMCNa发生了较大变化, 原有组分衍射峰消失。如果角蛋白、CMC-Na与戊二醛没有相互作用或作用较弱, 复合膜中将会出现各自组分的结晶区域, XRD图谱将会出现各自的衍射峰。添加戊二醛的复合膜体系, 因戊二醛的交联改性作用, 改变原有组分的结晶状态, 分子间形成强烈的相互作用, 导致膜的内部结构存在新的结晶区域, 且结晶度较大, 以此说明戊二醛交联改性的成功。由图9b可以看出:角蛋白/CMCNa/山梨醇共混膜的XRD图谱, 由于山梨醇的增塑效果, 与角蛋白和CMCNa形成强烈的氢键作用, 破坏了原有组分的晶体结构, 角蛋白与CMCNa原有的衍射峰消失, XRD曲线比较平缓, 没有特别突出的衍射峰, 结晶度不大。以上分析证明复合膜各组分之间具有很好的相容性, 存在强烈的分子水平相互作用。由剪纸称重法得出结晶度:角蛋白/CMCNa/戊二醛复合膜>角蛋白/CM-CNa/山梨醇共混膜。
a.羊毛角蛋白膜的FTIR曲线;b.CMCNa的FTIR曲线;c.角蛋白/CMCNa/戊二醛复合膜的FTIR曲线
3 结论
角蛋白质 篇4
关键词：鸡毛角蛋白,脱色剂,水解,印染废水,脱色
印染废水具有水量大、有机污染物含量高、色度深、碱性大、水质变化大等特点,属难处理的工业废水。色度的去除是其处理的一大难题[1—3]。化学(絮凝)法脱色具有成本低、操作简便、占地少、处理速度快和易管理等特点,已有广泛的应用[1—5]。目前印染废水常用的絮凝药剂以无机铝盐、铁盐为主,但这些无机絮凝剂对活性染料和水溶性染料的脱色效果较差,甚至没有脱色作用[3—5]。为此,国内外同行都在致力于开发新的脱色絮凝剂[6—9]。
鸡毛是一种废弃的角蛋白,其来源十分广泛,如果被弃于环境中,会导致苍蝇、病毒滋生,造成水污染和大气污染,给人类健康带来威胁。这类蛋白质水解后成为水解蛋白质,含有大量的—NH2、—COOH、—OH等极性基团,主链上还含有大量的肽键(—CONH—),形态上为无定形的松散胶团。在适当的条件下,它们与染料离子和分子间可产生静电引力、氢键、范德华力和疏水作用力,从而吸附染料或将染料包埋在胶团中,经絮凝、聚沉达到除去废水中染料的目的[6]。本文在前人[6—10]研究的基础上,对鸡毛水解工艺进行了改进,使其简单、易行,并将其应用于染料废水的脱色上,获得很好的效果。
1 实验
1.1 材料及仪器
1.1.1 材料及染化药剂
鸡毛:靖边屠宰厂收集的废弃鸡毛;染料(酸性湖蓝A,活性藏青B—GD,分散蓝2BLN,士林金黄TGK):上海染料化工厂生产;化学试剂(盐酸、亚硫酸氢钠、氢氧化钠、冰乙酸等,均为分析纯):西安化学试剂厂生产。
1.1.2 仪器
GKC—11—CR2电子恒温水浴锅(上海金桥科析仪器厂);722型分光光度计(上海第三分析仪器有限公司);Ph S—3C型精密酸度计(上海雷磁仪器厂)等。
1.2 方法
1.2.1 鸡毛的溶解方法
(1)鸡毛溶解工艺过程
(2)操作步骤
鸡毛除掉杂物,用30℃的洗衣粉稀溶液洗净后,晾干,剪碎。将洁净鸡毛用盐酸预处理,在75℃处理1 h后倒掉残液,水洗鸡毛;水洗后的鸡毛加入亚硫酸氢钠溶液,75℃处理1.5 h倒掉残液,不水洗;预处理后的鸡毛加入氢氧化钠溶液,75℃水解40 min后用涤纶筛网滤掉杂质,调节p H至中性,即为脱色剂。
1.2.2 染料废水脱色方法
采用单品种染料配制模拟废水,实验水样中染料浓度均为0.06 g/L。脱色方法为在模拟染液中加入脱色剂,于一定温度下搅拌一定时间后静置,然后取上清液,用分光光度计测其脱色率。
1.3 脱色率测定
使用分光光度法测定染料废水的脱色率,脱色率按(1)式计算[11]:
式(1)中,R为脱色率;Ai为脱色后染料溶液稀释n倍后的吸光度;Ao为脱色前染液稀释m倍后的吸光度。
2 结果与讨论
2.1 预处理工艺条件优选
2.1.1 盐酸的用量
用盐酸预处理鸡毛,具有一定的松散纤维的作用,适当条件的酸预处理可增加蛋白质的收率,但酸用量过大会使蛋白质损失严重,从而使收率降低。蛋白质的损失主要在以下三个方面(1)盐酸及亚硫酸氢钠预处理时,有部分蛋白质损失掉;(2)鸡毛不能完全溶解,必然会有损失;(3)碱溶解后,过滤的过程中也有损失[8]。图1为盐酸用量不同(处理1 h),亚硫酸氢钠用量为30%(处理1.5 h),氢氧化钠用量40%(处理40 min)条件下制备出的鸡毛角蛋白液对酸性湖蓝A废水的脱色率曲线,当盐酸用量为20%时,脱色率为77%,当用量达到30%时,脱色率提高了近10%,用量为40%时脱色率达到最佳88%。此时,鸡毛的溶解率已达到一个很高的值,再增加盐酸的用量,溶解率提高甚微,而盐酸用量过大,如用量为50%时蛋白质损失加大,导致收率降低,脱色率降低。
2.1.2 Na HSO3的用量
Na HSO3预处理可以部分打开双硫键,这有利于鸡毛的溶解。图2为盐酸用量为40%,亚硫酸氢钠用量变化,其它条件同前,由此制备出的鸡毛角蛋白液对酸湖蓝A废水的脱色率曲线。由图2看出,随着Na HSO3用量的增加,脱色率呈现先升后降的趋势,当亚硫酸氢钠用量30%时,脱色率达到最大89%。这是由于(1)Na HSO3预处理后鸡毛不能水洗,否则打开的双硫键会恢复,因此当Na HSO3用量增大时,鸡毛上的残留Na HSO3也会增加,碱溶解时,碱首先会和残留的Na HSO3反应,从而碱量降低,溶解不足,蛋白质收率下降,脱色率自然也就降低了;(2)Na HSO3预处理时,会有一定的蛋白质损失,其用量越多,损失也就越严重[8,12]。
预处理可以部分打开鸡毛双硫键,同时预处理也降低了氢氧化钠的用量。实验中发现,当加入的氢氧化钠量达到100%,同时再加入80%的尿素,在95℃处理1h时鸡毛仍然不能完全溶解,而预处理后氢氧化钠的用量仅为20%,且温度、时间均降低了,这大大提高了鸡毛的溶解效率。综上,鸡毛预处理最佳条件为:盐酸用量40%,亚硫酸氢钠用量30%。
2.2 碱溶解条件的优选
按2.1确定的预处理条件处理鸡毛,然后分别改变氢氧化钠用量、温度,探讨碱溶解条件对脱色效果的影响。
2.2.1 Na OH的用量
图3为鸡毛预处理后,改变氢氧化钠用量,由此制备的鸡毛角蛋白液对酸性湖蓝A的脱色率曲线。由图3看出,随着Na OH用量的加大,脱色率呈先缓慢上升然后又逐渐下降的趋势。碱用量不足时,实验中发现,鸡毛大部分没有完全溶解,因而蛋白质收率低,脱色效果就不好,随着碱量的增加,鸡毛角蛋白溶解率提高,蛋白质收率较高,此时蛋白质分子量较大,蛋白质对染料的絮凝、吸附作用较大,脱色率提高;当氢氧化钠用量达到20%时,脱色率达到最大(90%以上),但随着碱量增大即在浓碱的作用下,肽键遭到强烈降解,蛋白质分子量迅速降低,其在脱色中絮凝、架桥作用显著下降,脱色率也急剧下降。如碱用量为60%时,鸡毛溶解很快,溶解液中几乎没有鸡毛残渣剩余,但其脱色率仅为80%。由于氢氧化钠用量在12%~20%范围内的脱色率相差不大,所以实际应用中氢氧化钠用量可选择为12%~20%之间。
2.2.2 碱溶解温度
氢氧化钠溶解鸡毛的温度对鸡毛角蛋白脱色液的脱色效果有较大影响,温度太低,鸡毛溶解不了,温度太高,溶解液中小分子增多,不利于蛋白质分子对染料分子的吸附、絮凝。图4为鸡毛预处理后,改变氢氧化钠溶解的温度(氢氧化钠20%),由此制备的鸡毛角蛋白液对酸性湖蓝A废水的脱色率曲线。图4显示,65℃时脱色率为86%,明显低于80℃时的脱色率92%,这可能是由于65℃时鸡毛的溶解不完全,使得水解液中蛋白质损失严重,而温度高于80℃时,由于鸡毛已完全溶解,温度再高,使得大分子进一步水解为小分子肽链,其在水中溶解度增大,不利于与染液形成具有优异絮凝特性的线性高分子[8],从而抑制了鸡毛角蛋白液对染料分子的吸附絮凝。
因此,碱溶解鸡毛的最佳用量为20%,最佳溶解温度为80℃。由此制备出的脱色剂具有良好的脱色效果,具有一定的应用前景。
2.3 鸡毛角蛋白脱色剂的结构表征
为研究鸡毛角蛋白脱色剂的结构特征,对其进行红外光谱分析,分析结果见图5。图5中,(3 500—3 400)cm-1左右的宽峰是O—H的伸缩振动吸收峰,2 930 cm-1处为CH2和CH3的振动峰,2 500 cm-1处为S—H的弱振动峰。1 640 cm-1峰为CO的伸缩振动,即酰胺Ⅰ带。1 500 cm-1附近出现的肩峰为肽链上C—H的伸缩振动和N—H的弯曲振动和吸收,即为酰胺Ⅱ带。1 450 cm-1左右处为亚甲基和甲基C—H的变形振动,1 400 cm-1附近为C—N—C的很弱的伸缩振动吸收。(1 200—1 100)cm-1处峰为C—N—C或C—O的伸缩振动吸收,即酰胺Ⅲ带。这些吸收特征表明,鸡毛角蛋白脱色剂具有典型的多肽结构。
因此,鸡毛角蛋白脱色剂在适当的条件下,可以与染料离子和分子间产生静电引力、氢键、范德华力和疏水作用力等,将染料吸附或包埋在角蛋白胶团中,通过絮凝、吸附架桥、聚沉等作用去除,从而达到废水脱色的目的。
2.4 脱色效果评定
由表1,脱色剂对实验所选的酸性染料、活性染料、分散染料、还原染料废水都有很好的脱色效果。在室温酸性条件下,加入2 g/L的角蛋白脱色剂,1 h后酸性湖蓝A、活性藏青B—GD、分散兰2BLN、士林金黄TGK废水的脱色率均达到了95%以上,有的甚至达到100%,可见脱色剂对含磺酸基的阴离子染料具有良好的脱色效果。磺酸基团是亲水性阴离子基团,含有此类基团的染料为水溶性较好的阴离子染料,通常此类染料的脱色具有一定的困难,而脱色剂对此类染料具有优良的脱色效果,因此该类生物环保型脱色剂具有很好的发展前景。
3 结论
(1)鸡毛角蛋白脱色剂制备工艺为鸡毛经预处理后再水解,预处理的较佳条件为:75℃时,用40%的盐酸处理鸡毛1 h后再用30%的Na HSO3处理1.5 h。碱水解的较佳工艺条件为:80℃时,预处理后的鸡毛用20%的Na OH水解40 min,由此制得鸡毛角蛋白脱色剂。
(2)红外光谱表征,鸡毛角蛋白助剂具有典型的多肽结构,有利于吸附、絮凝染料分子。
(3)在室温酸性条件下,加入2 g/L的脱色剂,1 h后时酸性湖蓝A废水的脱色率达到了最高95.2%,此条件下活性染料废水的脱色率达到了95%以上,分散、士林染料废水的脱色率达到了100%。
(4)鸡毛角蛋白脱色剂是一种良好的脱色剂,它不仅原料来源广泛,制备工艺简单易行,成本低廉,而且脱色效率高,对多种染料的脱色效果良好,尤其对水溶性染料的脱色具有很大的优势,因此这种脱色剂的发展和应用具有广阔的前景。
角蛋白质 篇5
关键词：废弃羊毛,角蛋白,资源化利用
1 前言
羊毛角蛋白质纤维作为人类利用的第一种纤维材料,在人类文明史的发展长河中扮演了重要的角色,它是纺织工业的重要原料[1]。在制革工业生产中,脱毛是一道必不可少的工序。我国是制革大国,因此也是废弃羊毛纤维资源的大国。羊毛作为皮革工业的副产品在毛纺工业中极具利用价值,但羊毛经提绒后会残留大量的废弃粗羊毛,回收利用率低,据有关部门统计表明,我国每年平均生产9万吨左右的粗长毛,它们质量低下、加工难度大又不易降解,很难得到充分利用,还会带来严重的COD、BOD废水污染[2]。传统回收利用方法主要是物理机械手段的加工,但羊毛中含有大量角蛋白,如果将其溶解后再利用,产品的附加值就可大大提高。近年来随着化学及生物技术的发展,羊毛角蛋白在提取及资源化利用方面研究发展迅速。
2 羊毛角蛋白主要提取方法
人类对天然角蛋白的加工利用已经有很长的历史了,其中最早的塑料制品就是以角蛋白为原料制成的[3]。可生物降解塑料及生物医学材料越来越受到重视,其中研究的热点之一就是从毛发、禽羽毛等中提取角蛋白。羊毛角蛋白的加工和提取方法主要有两大类:机械法和化学法。
2.1 机械法提取角蛋白
机械法[4]制备角蛋白一般都是用加热(100～200℃)和加压(0.3～1.0 MPa)的方法破坏角蛋白内部的二硫键和肽链,使它变为可溶的、易消化的多肽混合物,多应用于饲料行业。
2.1.1 挤出法
挤出法是在高温、高压下于挤出装置中,将已粉碎的原料分散于介质(水)和还原性附加剂(主要为Na2S)所形成的液相中加热熔化后挤出成型。此法主要用于制备热塑性材料,优点是可将原料加工成为任意需要形状的饲料食品。
2.1.2 挤压法
挤压法是在高温、高压、强剪切的环境下使角蛋白中的二硫键发生断裂,它的粗产物呈膨松状,只要轻压就可以得到角蛋白粉。挤压的作用使角蛋白在化学结构上和物理形态上均发生变化。角蛋白二硫键经挤压作用后发生降解,降解幅度达50%～60%。挤压法具备简便易行、易于连续化操作和投资少等优点,在食品工业、饲料行业等得到了广泛应用。
2.1.3 水解法
水解法是采用高温高压法对毛持续进行蒸煮,使胱氨酸中的二硫键被破坏。此工艺破坏了毛角蛋白的稳定空间结构,水解产物蛋白质含量不低于75%,为可被畜禽消化吸收的可溶性蛋白。
2.2 化学法制备角蛋白
较为成熟的毛发水解方法[5]主要包括酸碱法、还原法、氧化法、铜氨溶液法、金属盐法、微生物法和酶解法等。不同的水解方法,毛发角蛋白水解片断大小分布有所不同。
2.2.1 酸碱法
酸碱法是比较传统的提取角蛋白的方法。一般是先用酸预处理溶胀纤维,后在特定的温度下用碱溶解,过滤后收集滤液,再用等电点法提纯角蛋白。但是酸碱法会产生大量的碱性废水和废酸的蒸汽,污染环境。
2.2.2 还原法
用还原剂的碱性溶液将角蛋白中的二硫键(-S-S-)还原成巯基(-SH),制得可溶性角蛋白溶液。一般常用还原剂是巯基乙醇,它可以打开二硫键而不会使肽链断裂。
2.2.3 氧化法
Timmons等[6]选用氧化剂(如过氧乙酸、卤素、双氧水等)将角蛋白中的二硫键部分氧化成磺酸基团,使产物的亲水性增加。被部分氧化后的毛发经过干燥、研磨成粉,然后直接用浓硫酸或甲酸酸化至pH小于1,制得角蛋白溶液,进而制成膜。根据报道,这种角蛋白膜可用作包装材料、药物缓释膜等。
2.2.4 电化学还原法
此法溶解蛋白质较为新颖,通过使用电解槽氧化还原而有效地拆开角蛋白分子中的二硫键。阴极槽一般采用还原反应体系,含有巯基化合物,阳极槽是电解质溶液和稀硫酸,隔栅选用离子交换树脂膜材料。再经反渗透、甲酸溶液透析,就可获得角蛋白溶液。但是,这种方法过程繁琐,电解产物成分也复杂。
2.2.5 铜氨溶液法
铜氨溶液、铜乙二胺溶液等对分子间的氢键有很好的分解能力,但若要提高羊毛角蛋白的溶解,需添加一定浓度的还原剂,这样获得的角蛋白溶液浓度才不至于太低,角蛋白相对分子质量才会相对来说较高[7,8],且获得的角蛋白相对分子质量较高。另外,铜氨溶液也可作为纤维素很好的溶剂,将棉短绒等天然纤维素原料溶解在氢氧化铜或碱性铜盐的浓氨溶液中,配成纺丝溶液,经过一定的处理可使铜氨纤维素分子化合物发生分解而再生出纤维素,可用于毛发与纤维混纺材料的资源化再生利用。但是这种方法对蛋白质肽链的破坏程度很大,角蛋白相对分子质量不高。
2.2.6 金属盐法
选用氯化锌、溴化锌、氯化锂等具有拆开氢键能力的金属盐,这种方法一般用于再溶解毛发角蛋白质粉末或接枝共聚物。
3 羊毛角蛋白的应用
天然角蛋白的来源广,应用价值高。从毛发、动物的蹄壳中提取角蛋白不但可以回收角蛋白,而且可以减少角蛋白对环境的污染,在取得经济效益的同时也保护了环境。目前羊毛角蛋白溶液的应用主要有以下几种方式:碱法制得的角蛋白质溶液[9]蛋白多肽相对分子质量相对较低,制取纤维时还需要接枝其他的高聚物,这种方式可以制得蛋白含量低于40%的羊毛再生纤维;铜氨溶液法[10]主要用于毛/粘、毛/麻、毛/棉等混纺(合)品资源的再生利用,也可以获得蛋白含量不超过40%的蛋白/纤维素共混纤维;若采用金属盐法,则制得的蛋白相对分子质量非常高而且溶液黏度高,可以与其他的高聚物共混纺丝得到蛋白含量超过50%的共混纤维;若采用还原法则可以生产出蛋白含量不超过50%的蛋白共混纤维。当蛋白含量达到45%时,共混纤维的强度将是羊毛强度的2倍[11]。
提纯后的硬角蛋白质可以用作动物饲料的添加剂、毛定形整理剂、皮革功能性添加剂、纺织品亲水性和舒适性整理剂、羊皮革饰面剂[12]、重金属离子捕捉剂等。一般由于应用领域的不同会选择不同的方法来制备溶液。
3.1 在纺织领域的应用
如同丝素整理剂一样,提纯后的羊毛角蛋白也能作为亲水性整理剂用于合成纤维加工;使用还原方法制得的具有还原性的羊毛角蛋白质溶液,可以用于高卷曲羊毛、形状记忆羊毛纱、形状记忆羊毛织物等羊毛制品定形整理的加工;另外,角蛋白溶液还可以用于羊毛再生纤维的生产。羊毛角蛋白溶液的成纤维性极差,通常采用混合溶液的方式纺丝。Kazunori Katoh[13]等将制得的角蛋白与PVA通过湿法纺丝来制得角蛋白-PVA复合纤维。这种复合纤维不仅可以吸附有毒的甲醛气体和Ag+,而且还具备了合成纤维的力学性能[14]。湖北省纺织工业科学研究所用碱法来溶解羊毛,采用甲醛等做交联剂。但此方法制得的角蛋白质溶液存在一些缺点,浓度较低、蛋白质易变性、产业化成本高[11]。鄂尔多斯公司采用了与Kazunori Katoh的方法类似的再生角蛋白功能纤维的加工技术,并且将功能性分散液添加到纺丝溶液中使纺出的丝具有抗菌防静电等功能[15]。据有关报道称:2005年中国科学院工程研究所、四川宜宾五粮液集团有限公司关于“纳米抗菌生物蛋白纤维”的制备,将银系纳米抗菌粉均匀分散于角蛋白溶液和纤维素纺丝液的共混液中,采用粘接纺丝工艺制造出了抗菌功能性蛋白纤维[16]。
3.2 作为医用生物材料的研究
羊毛角蛋白由于其来源于动物体,因此具有较好的组织相容性,在医学领域中具有潜在的应用价值。有研究指出利用羊毛角蛋白作为伤口缝合线[17],与壳聚糖的复合材料相比具有更好的生物相容性。早在20世纪90年代,国外就有人在降解后的羊毛角蛋白溶液中加入葡萄糖氧化酶等生物活性物质,应用到纤维集合体的表面来制备生物传感器等生物材料,并获得了相关专利[18]。另外,将羊毛采用巯基乙醇还原法制得角蛋白高分子溶液,然后经过滤或透析,采用平板成膜法成膜,用于组织工程结构材料的研究[19]。还有研究将提纯后的角蛋白复合聚乳酸棒来作为承重骨内的固定材料,结果表明此材料具较高初始力学强度和早期降解速度缓慢等的优点[20]。超声波处理角蛋白溶液与甲苯的混合液,形成水包油型乳化体系,采用凝聚法制得以角蛋白为囊壁材料的微胶囊。此胶囊颗粒强度好,在沸水、二甲基甲酰胺和二甲基亚砜中性质稳定,可以把油脂和染料等不溶于水的液体包裹其中[21],有作为药物缓释控系统中药用胶囊的可能性。
3.3 用作膜和包装材料的研究
制备角蛋白膜[22],一般是将毛发采用一定的化学方法水解成角蛋白溶液,然后平铺在塑料或玻璃板上,在一定条件下溶剂析出或水分蒸发后即可。但是用此种方法制得的膜弹性差,易断裂,不透气,不适合直接应用。通常会加入交联剂(如甲醛)或增塑剂(如甘油),来改善应用性能。
2004年,Tanabe[23]等在羊毛角蛋白溶液中加入壳聚糖制得复合膜,不仅提高了角蛋白膜的强度和柔韧性,还保留了良好的生物相容性,但不足的是壳聚糖在酸性和中性溶液中易膨胀。后来改换戊二醛作为交联剂,大大降低了复合膜在酸性和中性溶液中的膨胀性,而且在碱性溶液中其膨胀率也小很多。该角蛋白复合膜仍可进行细胞培养,但细胞吸附率低于角蛋白膜和壳聚糖角蛋白复合膜[24]。还可采用压铸方法成膜,即将角蛋白溶液或粉末直接放在热的压板上,高温高压下压制成角蛋白膜,与平板蒸发制成的膜相比,这种膜的强度、弹性和模量要好很多[25]。1997年Ingen[26]发明了一种利用角蛋白来制备热塑性材料的方法,主要方法是:先将角蛋白溶解,然后利用高温、高压的条件使角蛋白塑化,这种材料可被压制加工成各种形状,具有良好的抗水性和力学性能。
4 结语
角蛋白质 篇6
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取本院2008—2013年有完整临床和病理学诊断资料, 并行手术切除的大肠癌患者42例, 术前均无放疗或化疗史。其中男24例, 女18例;年龄≤45岁14例 (33.3%) , 46~65岁13例 (31.0%) , >65岁15例 (35.7%) ;管状腺癌23例 (54.8%) , 乳头腺癌10例 (23.8%) , 黏液腺癌9例 (21.4%) 。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂和仪器
试剂包括小鼠抗人CK1 9单克隆抗体 (美国Chemicon公司) 、羊抗小鼠二抗试剂盒 (武汉博士德生物工程有限公司) , 以及多聚赖氨酸、多聚甲醛、明胶、甘油、香草酚等。仪器包括OLYMPUS BX-70荧光显微镜成像系统、德国徕卡切片机、三气培养箱、数码照相机、电子天平和微量加样枪。
1.2.2 操作
将大肠癌及癌旁组织取材后固定, 制作石蜡标本, 待收集试验所需材料充足, 将其常规切片及裱片, 应用CK19单克隆抗体行免疫组织化学检测, 磷酸缓冲盐溶液代替一抗。
1.2.3 图像分析
免疫组化切片在2 00倍显微镜下观察结直肠癌标本, 每张切片随机选取5个视野。采用OLYMPUS BX-70荧光显微镜成像系统拍照, 经Image-Pro Plus5.1图像分析系统对阳性细胞进行图像分析。
2 结果
大肠癌42例中CK19表达率为100%, 而癌旁正常组织CK19表达均为阴性。
3 讨论
大肠癌的发生与环境、饮食、遗传、社会经济状况等多种因素有关, 在这些因素共同作用下细胞周期发生紊乱、细胞失控性生长。大肠癌发生还与高脂肪、高蛋白质饮食、过量饮酒、进食纤维较少密切相关。目前, 对于大肠癌与其肿瘤标记物的研究很多, 都在试图找出一个有效的标记物, 便于更好地指导治疗。细胞角蛋白作为细胞骨架蛋白无疑成为研究重点之一[4]。角蛋白是上皮细胞中间丝蛋白, 具有突出的分子多样性, 其杂聚中间丝是由配对的Ⅰ型和Ⅱ型分子组成。人体中有54个功能性角蛋白基因存在, 代表了上皮类型和细胞分化阶段的高度特异性模式。作为上皮细胞骨架的一部分, 角蛋白对于上皮细胞和组织保持机械稳定性、完整性起着非常重要的作用。此外, 还有一些角蛋白起调控功能并参与细胞内信号途径, 如压力保护、伤口愈合和细胞凋亡[5]等。恶性肿瘤中90%都是上皮源性肿瘤, 在其发生发展的过程中, 中间丝蛋白始终保持特有的保守性, 所以细胞角蛋白成为诊断肿瘤的重要工具。CK19是人细胞角蛋白一个亚型, 相对分子质量为54000, 主要表达于上皮细胞, 如乳腺、肺、胰腺、膀胱等腺上皮, 而正常胃肠腺上皮一般不表达。
Hernandez等[6]应用大肠癌组织芯片检测了CK20和CK19在癌、黏膜中的表达, 结果表明CK1 9与阳性肿瘤的进展有关。近年来, 一种新的大肠癌变途径被大家逐渐认识, 即增生性息肉-锯齿状腺瘤-癌顺序[7]。依据增生性息肉-锯齿状腺瘤-癌变途径理论, CK19的表达很可能是循此路径发生大肠癌的标志物之一[8], 同时CK19在正常大肠组织中无阳性表达。本文结果显示, 大肠癌中CK19表达率为100%, 而癌旁正常组织CK19表达均为阴性, 与上述结论一致, 表明CK19可作为大肠癌的特异性表面标志物用于明确诊断。
摘要：目的 探讨细胞角蛋白19 (CK19) 在大肠癌细胞的表达意义。方法 选取该院2008-2013年收治的大肠癌患者42例, 癌组织及癌旁组织标本均经组织固定、石蜡包埋后切片, 应用CK19单克隆抗体进行免疫组织化学染色, 采用荧光显微镜成像系统拍照, 经图像分析系统对阳性细胞进行图像分析。结果 大肠癌中CK19表达率为100%, 而癌旁正常结肠组织CK19表达均为阴性。结论 CK19可作为大肠癌的特异性表面标志物用于明确诊断。
关键词：大肠癌,细胞角蛋白19,免疫组织化学染色
参考文献
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角蛋白质 篇7
组织切片技术可直观地观察皮革的组织结构变化,藉以认识和了解脱毛的机理[1,2,3]。S. Sivasubramanian等更是通过不同的染色方法的组织学观察和组织免疫学观察对一种碱性蛋白酶的脱毛机理进行了阐述[4]。
角蛋白酶(Keratinase)是一种可以特异性降解角蛋白的酶类,由细菌、放线菌和真菌等多种微生物产生。角蛋白酶来源不同,其结构、理化性质、活性和底物也不同[5]。尽管一些具有代表性角蛋白酶的基因Ker已被完全解析出来,但还存在如表达形式为包涵体,对宿主细胞有毒性等很多问题,且角蛋白酶作用于制革工业脱毛的机理尚未完全阐明,已成为其发展的障碍之一。Ekta Tiwary等[6]对Bacillus licheniformis ER-15的脱毛条件进行了优化,并表明了角蛋白酶在脱毛过程中对于毛具有特异性降解的作用。J. Friedrich等[7]观察到脱毛工序中表皮层和真皮层区域的分离,从而推测只有角质层的上层暴露给角蛋白酶,而进入表皮层中其他非角质化的区域则非常困难。
本文就已筛选Bacillus cereus SZ-4的发酵粗酶液,以羊皮为对象,通过对其脱毛条件的优化及其酶脱毛过程中组织结构变化特点的研究,以揭示其脱毛的机理。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
1.1.1 主要试剂
苦味酸饱和水溶液(质量分数约1.22%),自制。苏木素,成都天泰生命科技公司。其他试剂均为分析纯。
1.1.2 主要仪器
高速冷冻离心机:TGL16M(湘南离心机,长沙);超净工作台:SW-CJ-2FD型(苏州净化设备有限公司,苏州);电热恒温培养箱:DHP-9162(上海一恒实验仪器有限公司,上海);恒温振动培养器:QYC-2112型(上海福玛实验设备有限公司,上海);光学显微镜:CX31RTSF(Olympas 日本)。冷冻切片机(Leica,德国);转鼓:GI热泵自动式转鼓(德润轻工机械厂,无锡);发酵罐:BIOSTATB plus(Sartorius,德国);板框压滤机:BASO.1/20-FB型板框式0.1平米暗流不锈钢式压滤机(荣成压滤机设备厂,成都)。
1.2 培养基
种子培养基:葡萄糖、天冬氨酸培养基[8];发酵培养基:添加0.2%脱脂羊毛粉的改良高氏培养基[9],即以脱脂羊毛粉取代培养基中作为有机氮源;保藏培养基: 营养培养基[8];LB培养基[9]。
1.3 实验方法
1.3.1 粗酶液的制备
本实验室分离蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus SZ-4的发酵液经压滤的滤清液为粗酶液。
1.3.2 角蛋白酶活力测定
据参考文献[10]所述的方法测定发酵离心上清液的角蛋白酶活力。其活力定义为1 mL酶液在所述的条件下,30 min释放蛋白质相当于1μg BSA的量为一个酶活力单位(U)。
1.3.3 角蛋白粗酶液脱毛条件的优化
浸水脱脂后的山羊皮依背脊线被切割为相同大小(10 cm×20cm),放入装有适当不同稀释倍数粗酶液(适当不同初始pH及适当不同温度条件下)的有机转鼓中,转动30 min后停鼓,其后每隔50 min转动10 min,观察其脱毛状况、脱毛速度及作用特点[11],确定其脱毛的最佳酶活力、pH和温度。脱毛效果采用6分评估法。
脱毛液角蛋白酶活力分别为64、96、128、160、192、224、256、288 U/mL,其初始pH分别是7、8、8.5、9、10、11,温度分别是25、30、32、35 ℃。
确定脱毛酶液的初始pH、温度和活力后,羊皮处理24 h后取样,观察其时间对组织结构的影响。
脱毛后,进行浸灰和复灰[11,12],观察其白皮的粒面和柔软状况。
1.3.9 组织学观察
酶处理前后,分别在相应的位置取样(5 cm×10 cm),10%中性甲醛固定24 h,冰冻切片法纵向(顺毛生长方向垂直于粒面)切片,切片厚度15 μm:,采用Van Gieson氏染色法[13]染胶原纤维、表皮和毛囊,通过光学显微镜观察该角蛋白酶粗酶液处理样品脱毛程度3及脱毛程度6的胶原纤维、表皮和毛囊之间的区别。
2 结果与讨论
2.1 脱毛条件的影响
如表1所示,30 ℃,初始pH 10的脱毛液中,不同活力的脱毛液处理山羊皮大约6 h,其毛基本脱光,但活力为160 U/mL的脱毛液,在其初始阶段脱毛效率较其它活力的脱毛液。研究结果表明,在其脱毛接近50%的阶段,主要是降解表皮角蛋白的过程,且该活力降解表皮角蛋白效率最高,而在其后期则主要常规蛋白酶起主导作用,所以脱毛时间无显著差异,该酶的主要特点则是在无硫脱毛。
观察不同活力脱毛液的脱毛结果表明,活力增高,对其毛孔大小影响不显著,但对其花纹和洁白度有影响,活力增高,花纹变得模糊且泛黄,坯革松面而且弹性差。
在30 ℃下,脱毛液酶活力160 U/mL,不同初始pH脱毛效率的研究结果表明:初始pH的对山羊皮脱毛率50%和100% 所需要时间影响较大,当pH为9和10时,其脱毛时间最短。初始pH增加或减少,其时间均匀延长,但脱毛效果无显著差异。
活力160 U/mL,初始pH为9脱毛液研究温度影响的结果表明,温度对脱毛时间及脱毛效果的影响显著,脱毛液的温度为25 ℃时,其作用相当缓慢,温度升高,脱毛时间缩短,作用温度达到30 ℃后,在30～35 ℃的范围,提高作用温度,脱毛率达到50%所需时间保持稳定,其脱毛皮坯洁白度、粒面清晰度等变差。
2.2 角蛋白酶粗酶液脱毛组织学观察结果
A-脱毛开始时羊皮组织学观察图。B-脱毛完成时羊皮组织学观察图。C、D-脱毛程度为3时的羊皮组织学观察图。E-脱毛酶活力单位为288 U/mL,pH9,30 ℃下脱毛完成时的羊皮组织学观察图。F-脱毛酶活力单位为160 U/mL,pH9,30 ℃下作用24 h的羊皮组织学观察图。
图1B是活力160 U/mL,初始pH为9,作用温度30 ℃脱毛率100%时组织切片观察结果。与脱毛初始态比较(图1A ),其毛囊部位呈现空洞,表皮角质被除去,边缘规则,纤维分散适度且均匀,脱毛率50%的组织切片结果比较(图1C和图1D),后者已其表皮角质层的已被除去且毛囊角质层的也被降解,羊毛及毛根等硬角质仍部分残留于毛囊中。活力过高或作用时间过长亦会导致胶原纤维断裂(图1E和图1F)。在一定范围内,温度稍高或初始pH接近该酶的最适pH(以脱脂羊毛为底物测)则纤维分散均匀,坯革质量也有所提高。该角蛋白酶的作用特点是不仅水解角蛋白,同时也作用基底膜,破坏粘性蛋,使基底膜使毛根与毛囊脱离[4]。Bacillus cereus SZ-4的粗酶液系时间和pH依赖型,与J. Friedrich等研究Doratomyces microsporus角蛋白酶在制革脱毛中应用结果是一致的[6]。
3 结论
基于粗酶活力、作用温度和初始pH脱毛效率和感官指标结果的研究表明,Bacillus cereus SZ-4角蛋白酶粗酶液应用山羊皮脱毛的最适酶活力、初始pH和温度分别为160 U/mL、pH9和30 ℃,系时间和pH依赖型。