蛋白质功能

蛋白质功能（精选11篇）

蛋白质功能 篇1

一、说教材

《蛋白质的结构与功能》是中图版必修一第二单元第一章第一节。课标要求是理解水平。蛋白质是细胞中含量最多的有机物, 又是生命活动的承担者, 在有机体的各项生命活动中有着多种重要的功能, 因此, 本节内容是今后继续学习“生物的新陈代谢”, 激素调节机制等核心知识的基础。学生要了解生命活动的规律、探索生命本质, 必须掌握蛋白质的结构和功能。

二、说学生

高一学生认识了蛋白质的重要地位, 建立了生物体的结构与功能相适应的基本观点。可以理解蛋白质结构多样性与功能多样性的关系。但有机化学知识很欠缺, 抽象思维能力有待加强, 所以对于碳的化学性质以及有机化学基团的联系在理解上有障碍。因此对于氨基酸结构通式和氨基酸缩合反应的理解有一定的难度。在这里, 我们可以请教化学教师, 想办法用简洁的语言和方式让学生理解。

三、说教学目标

结合高一年级学生的认知结构, 我制定了以下教学目标:

1. 知识目标:

简述氨基酸的基本结构, 结构通式, 氨基酸的脱水缩合反应;解释蛋白质分子结构的多样性, 理解结构与功能的关系;概述蛋白质的功能。

2. 能力目标:

通过探究归纳出氨基酸的基本结构, 培养学生的观察、分析、抽象思维能力;学生归纳蛋白质的知识体系, 进一步培养学生的归纳综合能力。

3. 情感与价值观目标:

通过体验蛋白质的化学结构和空间结构及其成因, 培养学生的动手、动脑能力和团结协作的团队精神, 使学生建立结构与功能相适应的观点, 深刻地认识生命的物质性。

四、说教学的重难点

本着生物新课程标准, 我在吃透教材的基础上, 结合学生的学情, 确定了以下教学重点和难点。

教学重点:氨基酸的基本结构、蛋白质结构多样性。

教学难点:氨基酸分子结构, 氨基酸形成蛋白质的过程, 蛋白质结构多样性的原因。

为了突出重点, 突破难点, 教师在教学过程中, 要让学生从“学会”向“会学”转变, 成为学习的真正主人。可以采用以下几种教学方法:

1. 学案导学法:

问题驱动, 学在前, 导在后。

2. 直观演示法:

利用图片、动画、板书、模型、学生自身等手段进行直观演示, 激发学生的学习兴趣, 活跃课堂气氛, 促进学生对知识的掌握。

3. 活动探究法:

引导学生通过手拉手模拟缩合过程, 用铁丝穿塑料珠子等活动形式获取知识, 以学生为主体, 使学生的独立探索性得到了充分的发挥, 培养学生的自学能力、思维能力、活动组织能力。

4. 集体讨论法:

组织学生进行分组讨论, 促使学生在学习中解决问题, 培养学生团结协作的精神。

五、说教学过程

下面我具体来谈谈这一堂课的教学过程。在学习时按照一条主线进行, 即组成元素 (C、H、O、N) →基本单位 (氨基酸) →肽链→蛋白质分子, 再由结构到功能循序渐进, 从而使学生逐步理解掌握。根据我校的高效课堂模式, 可分为以下四个环节。

1. 情景导入 (2～3分钟)

展示图片, 让学生了解到蛋白质无处不在, 虽然形态万千, 但基本单位相同, 蛋白质有着怎样的结构, 为什么这么重要呢?调动起学生的求知欲望。这是教学非常重要的一个环节, 从而引出课题。

设计意图:由于本节课容量大, 这样导入可开门见山地进入主题, 还可为后面蛋白质功能的学习打下基础, 做到首尾呼应, 节省时间。

2. 学导结合 (35分钟)

(1) 蛋白质的基本单位

设置问题情境:我们吃了鸡蛋能在身上长出个鸡蛋来吗, 吃了牛肉能在身体上长出牛肉吗?从而引出氨基酸的学习。

设计意图:通过简单的常识使学生有了学习这节课的渴望和热情。

教师总结:蛋白质的基本组成单位是氨基酸, 大约有20多种, 组成不同蛋白质的氨基酸种类和数量不一样。

列举4种氨基酸的结构简式归纳, 师生共同圈出相同部分和不同部分。可以用氨气和二氧化碳的结构式, 介绍氨基和羧基。提示如用R表示不同的部分, 让学生自己总结出氨基酸的结构通式, 并找同学到黑板上写出来, 其他同学写在学案相应的位置上。教师总结评价, 并且提出这只是平面结构, 实际上它是三维立体的。

然后请一位学生上讲台, 伸开双手, 两脚并拢, 面向同学, 代表氨基酸, 什么的不同会导致氨基酸种类和性质的不同?学生很容易就明白了。再让他转过去, 表示基团空间位置的变化, 并且板书注意通式的写法, 也可以这样, 归纳氨基酸结构特点, 展示立体模型。

设计意图:通过启发式教学和直观教学法突破本节的难点, 学生印象深刻。通过这种模拟形式, 学生很容易就可理解和掌握氨基酸结构通式这一重点内容, 为后面公式的推导也做了准备。

接着练习让学生标出各种氨基酸的R基来。可以在其中加一个不是氨基酸的化合物, 及时反映学生对知识的掌握程度, 以便教师及时采取措施弥补, 加深我们对教材的理解, 培养学生吃透知识的能力。

(2) 蛋白质的结构

设问:20种氨基酸是怎么样组成千差万别的蛋白质呢?引导学生观察P29页的“氨基酸形成蛋白质示意图”, 并给出循环播放的二肽形成的动画, 小组合作讨论以下问题……

设计意图:氨基酸的脱水缩合反应及有关计算, 是本节课的难点。但学生知道物质的合成需要断开某个化学键和重新生成新的化学键, 同时利用动画来帮助学生进行学习。以问题驱动, 合作探究的形式来完成本部分的教学, 设置的问题层层深入, 学生的参与度很高。新课程提倡学生自主学习、合作学习和实验探究, 要求教师为学生提供自主学习的氛围和机会。我非常注重这一教学理念, 并且应用到实践中, 根据学生的知识结构、认知特点和学习兴趣, 精心设置了这些问题。

根据小组讨论, 中心发言人展示的结果, 教师及时点拨, 师生互动、生生互动, 相关问题一一解决。如果对于最后两个问题不理解, 可请一排4个学生起立, 手拉手, 问:4个氨基酸结合脱去多少分子水?形成的肽键有多少个?叫几肽?强调这是多个氨基酸形成一条肽链的情况, 如果是几条肽链又会是怎样的情况呢?

再指出另两排学生, 共3排12人, 可形成3条肽链, 问可形成几个肽键。以此类推, 用m代表肽链的数目, 让学生仔细观察列表并总结出计算水分子数与肽键数的公式: (n-m) 个。

设计意图:通过形象直观的模拟, 由结论式教学转变为过程式教学, 符合人类的认知过程, 实现了学习方式的根本转变, 学生们非常容易地掌握了计算的方法和规律, 也体会到了生物界的奇妙, 激发了学习的兴趣。

教师及时让学生做练习, 巩固脱水缩合这一难点, 加深学生对教材的理解。

3. 探究深化

那么氨基酸缩合成的多肽链是如何形成蛋白质的呢?探究活动:利用彩珠与铜丝构建蛋白质的结构模型, 让学生体会蛋白质结构的多样性。

让学生总结出蛋白质结构不同的原因。教师只需把学生的答案总结, 再展示几种蛋白质的空间结构, 用一根铁丝演示蛋白质的一级结构、二级结构, 把课前准备好的弯曲的铁丝拿出来, 演示三级结构、四级结构。

设计意图:蛋白质的空间结构是一个抽象的概念, 对于高一还没有深入学习立体几何的学生来说, 空想一个空间结构是困难的, 而且也很难理解蛋白质分子结构为什么会有多样性, 学生通过动手操作, 直观的体会蛋白质分子的空间结构以及蛋白质分子结构多样性的原因。

接着, 通过结构与功能相统一的思想, 自然过渡到结合实例列举出蛋白质的多项重要功能, 具体的各项功能在后面各章节中再去进一步讲解。

4. 总结反思 (2～3分钟)

引导学生归纳蛋白质的知识体系, 目的是强化认识, 进一步培养学生的归纳综合能力。

六、说反思

在这节课的教学过程中, 我注重突出重点, 条理清晰, 紧凑合理, 各项活动的安排也注重互动、交流, 最大限度地调动了学生参与课堂的积极性、主动性, 力求使学生在积极、愉快的课堂气氛中提高自己的认识水平, 从而达到预期的教学效果。

蛋白质功能 篇2

基于网络的蛋白质序列检索与核酸类似，从NCBI或利用SRS系统从EMBL检索。

1、疏水性

分

析

ExPASy的ProtScale

程

序（http:// PHDhtm: http:

EpitopeInfo: http://epitope-informatics.com/Links.htm

5、蛋白质功能预测 蛋白质序列分析的一般流程如下图。图1 蛋白质序列分析的一般流程（1）基于序列同源性分析的蛋白质功能预测 至少80个氨基酸长度范围内具有25%以上的序列一致性才提示可能的显著性意义。未知功能序列对库检索的一般分析策略如下： ①和运行Blastp程序的服务器（http://，将目的序列粘贴到输入框中，点击“search”即可。数据库PROSITE是由专家根据生物学知识审编的SWISS-PROT蛋白质序列中有生物学意义的位点（sites）、模式（patterns）和轮廓（profiles）的数据库，包括酶活性位点、辅因子结合位点、二硫键位点等。此库可以帮助确定新的蛋白质序列是否属已知的家族。其网址为： http://

PFAM: http://可用于对查询蛋白质序列相似性分析以确定其结构。

c、ISSD数据库

http://www.protein.bio.msu.su/issd/。d、HSSP数据库

http://www.sander.embl-heidelberg.de/hssp/。e、蛋白质结构分类数据库（SCOP）蛋白质结构分类数据库（structural classification of proteins，SCOP）http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/。f、Dali/FSSP数据库

http://www.embl-ebi.ac.uk/dali/。（2）蛋白质二级结构预测

蛋白质多重序列对齐结果进行蛋白质二级结构预测的PHD程序：

http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html（3）蛋白质三级结构预测 a、与已知结构的序列比较

采用BlastP程序直接搜索NRL-3D、SCOP等数据库，如果在连续100个氨基酸范围内含有大于40%的一致性，那么在蛋白质结构上则具有较为显著的相似性。此种情况下，即预测中结果按照同源模建（homology modeling）方法能够提供详细而准确的结果。在25~40%之间则难以提供精确的结果。

如果无法在NRL-3D数据库找到匹配序列，下一步则是搜索HSSP数据库。最简单的方法是用BLAST或FASTA程序搜索蛋白质序列数据库（SWISS-PROT，Trembl，PIR）。序列检索系统（sequence retrieve system，SRS）能够提供大于25%的序列一致性。如果检出结果含有HSSP数据库的信息，那么在字段DR中会有注释。如果与HSSP数据库中的蛋白质含有超过25%的序列一致性，那么一般认为该蛋白质至少和HSSP数据库中的蛋白质具有相似的折叠模式。

b、同源模建

Swiss-Model服务器（http://www.expasy.ch/swissmod/SM_TOPPAGE.html）提供自动化财同源模建分析任务。c、穿针引线（threading）算法和折叠识别 有如下程序资源： TOPITS: http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html frsvr

(fold

recognition

server): http://www.mbi.ucla.edu/people/frsvr/frsvr.html 123D: http://www-lmmb.ncifcrf.gov/~nicka/123D.html THEADER

and

THEADER2: http://globin.bio.warwick.ac.uk/~jones/threader.html http://globin.warwick.ac.uk/~jones/threader.html

7、蛋白质分子进化分析

同源蛋白质（homolog）进一步可分为直系同源（ortholog）和旁系同源（paralog）。前者指在不同物种中具有相同功能和共同起源和基因，后者则指在同一物种内具有不同功能、但也有共同起源的基因，例如同是起源于珠蛋白的α珠蛋白、β珠蛋白和肌红蛋白。

早期基于序列同源性来区分蛋白质家族的不同层次。由于在分子进化过程中，组成一个蛋白质序列的所有氨基酸并不具备同样的进化速率，具有重要功能位点的氨基酸显然进化较慢，因此单纯基于序列相似性并不合理。蛋白质进化过程中反映出重要氨基酸组群进化速率较慢而形成的保守性。这一结果体现在很多蛋白质家族成员之间蛋白质序列相似性可能只局限于某个序列区域或结构域中。因此，蛋白质超家族的概念已发展成为具有某种共同结构域的所有分子组成的分子集合。这一概念将蛋白质超家族进行了扩大。这一点也反映在PDB数据库的处理中，即PIR数据库不只依据序列的相似性，而且结合结构域的分析进行蛋白质家族和超家族分类。

蛋白质分类数据库（ProtoMap）：http://www.protomap.cs.huji.ac.il/。如果发现一个未知蛋白质序列和较多不同种属或同一种属的蛋白质序列具有较高的同源性（大于30%），那么提示待分析蛋白质序列可能是相应家族的成员，从而可从分子进化的角度对蛋白质序列进行综合分析。基本步骤包括：

①用待分析蛋白质序列检索蛋白质序列数据库，获取同源性较高的蛋白质序列。此过程可通过NCBI/Blastp程序分析。

②将所有相关序列组织成FASTA格式，作为后续进行Clustal W/X软件分析的输入数据。

蛋白质功能 篇3

低蛋白饮食对肾功能不全治疗所起的辅助作用，早已获医学界认可。在积极治疗同时，严格遵循低蛋白饮食，有助于改善蛋白、糖及脂肪代谢，延缓肾功能不全的发展，减少并发症。

1. 肾功能不全患者尿蛋白排泄量与蛋白质摄入量密切相关，在治疗同时坚持低蛋白饮食，有助于减轻蛋白尿，延缓肾损害进展。

2. 肾功能不全患者控制高蛋白摄入，可减少尿蛋白排泄。在热量充足情况下， 减轻尿蛋白流失能适应性增加蛋白质合成，并能通过减轻胰岛素抵抗，促进细胞摄取氨基酸合成蛋白质，改善蛋白质代谢，维持机体正氮平衡。

3. 肾功能不全患者体内大量酸性蛋白质代谢废物堆积，从而产生代谢性酸中毒。代谢性酸中毒危害极大，可引起或加重肾功能不全患者的症状及并发症（如高血钾症、营养不良、肾性骨病及心肌病变等）。从源头控制低蛋白质摄入，可减少代谢废物的生成及代谢性酸中毒的发生。

4. 肾功能不全患者常出现胰岛素抵抗，与其体内蛋白质代谢废物蓄积及代谢性酸中毒相关，而胰岛素抵抗会导致空腹血清胰岛素水平增高。减少蛋白摄入量，能减轻代谢性酸中毒和胰岛素抵抗程度，改善糖代谢。

5. 肾功能不全患者肾小球滤过磷减少，血磷增高即可刺激甲状旁腺素分泌；同时，肾脏生成钙三醇减少，血钙减低，进一步使甲状旁腺素分泌增加，最终造成继发性甲状旁腺亢进。

低蛋白饮食：优质蛋白+足够热量

综上所述，对肾功能不全患者而言，严格控制饮食中蛋白质的摄入量极其重要。坚持低蛋白饮食，除保证低蛋白摄入量和高比例优质蛋白外，还要保证足够的热量，否则会产生营养不良，加重体内蛋白分解，使代谢毒素增加，严重危害健康。

作为三餐中的主食，大米也应遵循低蛋白饮食的要求。为降低米饭中的低蛋白摄入，低蛋白米饭由此研发而生。营养学家计算得出结论：食用低蛋白米饭，不仅可以满足每日蛋白和热量的需求，还有多种肉类和蔬菜可供肾功能不全患者选择食用，既保证了每日热量所需，又保证了优质低蛋白的健康饮食。

此外，降低血磷是治疗肾功能不全的重要方面。低蛋白米饭含磷量低，每100克普通大米含磷100～130毫克，而每100克低蛋白米饭含磷量仅为13～25毫克。因此，长期食用低蛋白米饭可减少每日磷元素摄入，在一定程度上增加肾功能不全患者营养治疗的价值。

蛋白质功能 篇4

花椒籽的主要成分

在花椒籽当中, 包含有很多不同的成分, 例如脂肪酸、蛋白质、氨基酸、矿质元素和生育酚等物质。经过采用气相色谱法对花椒籽进行分析实验, 能得出其中主要含有棕榈油酸、油酸、亚麻酸、亚油酸、硬脂酸、棕榈酸和十七碳烯酸等。其中, 亚麻酸、亚油酸和油酸为主要成分, 能够达到58% ~ 88% 的总含量。在原料花椒籽当中, 含有14% ~ 16% 的蛋白质, 在经过脱脂处理后, 其饼粕当中的蛋白质含量能够达到48% 以上。而在脱脂处理的花椒仁当中, 能够达到更高的蛋白质含量, 约为64%。经过相关部门的检验分析, 证明了在脱脂处理后的花椒仁和花椒饼蛋白质当中, 含有较为齐全的氨基酸组成, 而各种必需氨基酸的含量也相对较高。相比于大豆, 除了赖氨酸以外的其他必需氨基酸含量, 花椒籽都要更高, 由此可以看出花椒籽是一种较为完全的蛋白质资源。利用原子吸收分光光度计检测和分析精制之后能够发现, 花椒籽主要包含锰、锶、铁、镁、钾、钙、钠等矿质元素, 其中, 镁、钾、钙、钠等物质的含量较高, 锰、锶、锌、铁等物质也较为丰富, 而一些重金属元素的含量要远远低于使用卫生标准。利用高效液相色谱对花椒籽进行检测, 发现在每一百克花椒籽当中, 含有27.1 毫克的 α- 生育酚、0.3 毫克的 γ- 生育酚、27.4 毫克的维生素E总量, 但是其中并没有发现 β- 生育酚的成分。

花椒籽蛋白的提取

在提取花椒籽蛋白的过程中, 可采用传统的碱溶酸析法进行制备。提取条件是p H值为12 的溶液酸碱性, 按照1:15 的比例将原料与溶剂进行混合。首先在p H为6 的环境下进行沉淀和离心, 然后在p H为3.6 的环境中进行二次沉淀。在得到花椒籽蛋白后, 加水将溶液p H调至中性环境, 最后进行喷雾干燥。通过这种方法, 能够达到56.4% 的花椒籽蛋白回收率。

除此之外, 还可以利用较为高效的膜分离法进行提取。通过相应的预处理, 得到花椒籽蛋白溶液, 通过超滤浓缩将一部分离子成分、低聚糖、可溶性有毒成分、溶剂等除去, 从而得到花椒籽蛋白。通过超滤的方式, 能够对全部的可溶性花椒籽蛋白进行浓缩和纯化, 不会有所损失。在超滤之后, 利用20% 的三氯乙酸溶液对全部透过物进行检测, 证明其中没有蛋白质, 只有一些肽类物质和一些小分子含氮物质。采用超滤处理的防范, 能够提升可溶性清蛋白自由水剂萃取物当中的含量, 并且迅速除去大部分有毒化合物。在脱毒实验当中, 花椒籽饼粕蛋白质氯化钠萃取液当中, 可以利用渗透和超滤的方式, 完全除去其中的植酸盐。采用超滤处理方法处理水相酶解法得到的花椒籽蛋白溶液, 在202 ~ 203MPa操作压力下, 将温度控制在50℃, 选取p H为9 ~ 10 的溶液环境, 能够得到纯度较高, 且不含毒素的花椒籽蛋白, 回收率远远高于传统方法, 能够达到90% 以上。

花椒籽蛋白质的功能性质

随着p H值的变化, 花椒籽蛋白质的溶解度也会随着发生变化, 并且其变化的趋势与其他很多蛋白质基本相同。在等电点左侧, 随着p H的上升, 花椒籽蛋白质的溶解度会下降。在等电点附近, 溶解度会下降到最低值。而在等电点右侧, 随着p H的上升, 花椒籽蛋白质的溶解度也会上升。但是, 如果p H高于一定限度, 蛋白质的溶解度还会发生下降。随着温度的上升, 花椒籽蛋白当中的持水力会有所降低, 这主要是由于在温度上升的过程中, 蛋白质分子会发生构象变化, 相互之间产生凝聚, 从而降低了持水力。对于花椒籽蛋白质的起泡性来说, 其浓度会产生一定的影响。如果浓度上升, 蛋白质的起泡性也会上升。当处于1% ~ 2% 的浓度之间时, 起泡性将会大幅度上升。同时, 当花椒籽蛋白质浓度处于0.1% ~ 0.5% 之间的时候, 随着浓度的上升, 蛋白质的乳化性和乳化稳定性都会有所提高。如果其浓度在0.1% ~ 0.2% 之间的时候, 乳化稳定性将会迅速提升, 而后其浓度继续提高, 乳化稳定性的增幅就会逐渐减小。

结论

蛋白质功能 篇5

低蛋白饮食对肾功能不全的治疗作用，早已获医学界认可。在药物积极治疗同时，严格遵循低蛋白质饮食，有助于延缓肾功能不全的发展，减少并发症。其作用贯穿肾功能不全发病机制各方面。

延缓肾损害进展 尿蛋白排泄量与蛋白质摄入量密切相关， 通过减轻肾小球高滤过和蛋白质对肾小管刺激活化，可以减轻肾小球硬化和肾小管纤维化。

改善蛋白质代谢 肾功能不全患者在热量充足情况下减少蛋白质摄入，可减少尿蛋白排泄，适应性增加蛋白质合成，并通过减轻胰岛素抵抗[A1]，促进细胞摄取氨基酸合成蛋白质，维持机体正氮平衡。

减轻代谢性酸中毒 肾功能不全患者体内大量酸性蛋白质代谢废物堆积，从而产生代谢性酸中毒。酸中毒可引起或加重肾功能不全患者的症状及并发症（ 如高血钾症、营养不良、肾性骨病及心肌病变等）。从源头控制蛋白质摄入，可减少代谢废物的生成及代谢性酸中毒的发生。

改善糖代谢 肾功能不全患者常出现的胰岛素抵抗，与其体内蛋白质代谢废物蓄积及代谢性酸中毒相关，而胰岛素抵抗会导致空腹血清胰岛素水平增高。减少蛋白质摄入量，能减轻代谢性酸中毒和胰岛素抵抗程度。

改善钙磷代谢及减轻继发性甲状旁腺功能亢进 肾功能不全患者往往会出现高磷和低钙血症，血磷增高可刺激甲状旁腺素分泌，引起肾性骨病。采用低蛋白饮食后，磷的摄入量减少，可减轻上述症状。

低蛋白米饭：保证优质蛋白比例+足够热量+低磷

对肾功能不全患者除保证低蛋白质摄入量（0.6克/千克/天）外，还要保证足够的热量（30～35卡/千克体重/天），否则会产生营养不良，加重体内蛋白质分解，使代谢毒素增加。同时要保证优质蛋白质的比例达到60%～75%。

作为三餐中的主食，大米也应遵循低蛋白质饮食的要求，低蛋白质米饭由此研发而生，其中的蛋白质含量从8%降到0.3%。营养学家经计算得出结论：食用低蛋白质米饭，不仅可以满足每日蛋白质和热量的需求，还可增加多种肉、蛋和奶的摄入，既保证了每日热量所需，又保证了优质低蛋白质的比例。

此外，低蛋白质米饭含磷量低，每100 克普通大米含磷100 ～ 130 毫克，而每100 克低蛋白质米饭含磷量仅为13 ～25 毫克。因此，长期食用低蛋白质米饭可减少每日磷元素摄入。

低蛋白营养管理：医护团队+医患合作

营养管理是慢病肾病管理的重要方面，需要有医护团队和医患合作，具体指导每个肾功能不全患者如何进行低蛋白质饮食治疗。患者也应了解低蛋白质饮食的重要性，通过实践，逐步达到饮食要求。

锌指蛋白结构及其功能研究 篇6

关键词：锌指蛋白,转录因子,结构,功能

锌指蛋白主要分布在动植物和微生物中, 对基因的调控都起着重要的作用, 而且在基因表达调控、细胞分化、胚胎发育、增强植物抗逆性等方面也具有重要的作用。

一、锌指蛋白

1988年, Pabo等把锌指结构定义为:在调节蛋白一小段氨基酸序列中, 含有几个Cys残基, 这些区域是依赖锌的DNA结合域, 通过结合Zn2+自我折叠形成短的稳定的“手指”状结构。锌与多个半胱氨酸和 (或) 组氨酸排列成不同的组合, 通过疏水作用组成稳定的四面体结构。在锌指蛋白中, 锌的地位不可替代而且作用巨大, 脱锌或用Fe、Cu、Mn、Co、Ni等其它金属离子置换锌离子后, 锌指蛋白与DNA等结合特异性就会显著地被抑制, 同时蛋白本身的结构稳定性也会被破坏, 影响基因表达, 使其丧失功能。由此可见, 锌离子是锌指蛋白发挥作用的关键, 锌指结构的稳定性确保了锌指功能的有效性。

二、锌指蛋白的分类

在锌指蛋白中, 几个保守的氨基酸与一个Zn2+结合, 形成了一个在蛋白质中相对独立的区域, 即形成一个氨基酸的环, 由锌结合位点突出手指状结构, 锌被结合在保守的氨基酸形成的四面体结构中, 所以叫作锌指。根据锌指的保守基序特点, 可以将锌指蛋白分成9类:

l、C2H2型 (Cys2His2) 即TFⅢA型锌指;主要与核酸结合。

2、C8型 (Cys8) ;主要与DNA结合。

3、C6型 (Cys6) ;主要与DNA结合。

4、指环型 (Cys3His Cys4) ;主要与蛋白作用。

5、Cys2His Cys;主要与单链核酸结合。

6、LIM型 (Cys2His Cys5) ;主要蛋白与蛋白作用, 也可能与核酸结合。

7、C4型 (Cys4) ;主要与DNA结合。

8、Cys3His;功能未知。

9、Cys4His Cys3;功能未知。

三、锌指蛋白调控基因转录的功能

锌指蛋白通过与生物大分子如DNA、RNA或者蛋白分子的结合来进行转录调控, 或通过锌指蛋白与锌指蛋白之间的连接直接调控基因的转录。

1、锌指蛋白与DNA的识别作用

锌指蛋白由于其特殊的三维结构决定其能够识别DNA。锌指的DNA结合区域有一个特殊结构, 这个特殊结构可以与DNA双螺旋结构互补。其中包含一个a螺旋, 它能够伸入到DNA双螺旋的主要沟槽中并与之结合。结合时a螺旋位于大沟且锌指间的接头结构相对固定C2H2型锌指蛋白的锌指就是通过a螺旋与DNA双螺旋结构的大沟结合, 从而识别特定的DNA序列。两者相互作用具有序列特异性, 就是说每个锌指保守结构域特异性地接触位于DNA的大沟中的碱基, 每个锌指结构识别单元跨越3个碱基对。一般情况下, 锌指蛋白识别DNA需要2-4个串联的锌指。然而, 当仅有一个或两个锌指存在时, 只能通过方法来增强识别DNA, 例如激活其它的一些关键结构。锌指排列顺序的不同使其能识别大量的不同的DNA序列。由于复合物不同的结合位点及空间关系的复杂性, 因此, 锌指蛋白对于目的DNA的特异识别的规律性是很复杂的。

2、锌指蛋白与RNA的识别作用

由于结构的不同, 有些锌指蛋白仅能与DNA结合, 有些锌指蛋白仅能与RNA结合, 有些锌指蛋白既可以与DNA相互识别作用, 也可以与RNA相互识别作用。近些年来, 对于锌指蛋白的研究主要集中在锌指对DNA的识别上, 而对于锌指与RNA结合的研究较少。这主要是由于RNA的二级和三级结构比较复杂, 特别是内部的环和与发夹圈相似的螺旋部分。TFⅢA是第一个被发现的不仅能与DNA结合, 而且还能与爪蟾属的成熟卵母细胞的5Sr RNA结合的锌指蛋白。

3、锌指蛋白之间的相互作用

C2H2型锌指蛋白不仅可以识别DNA、RNA分子, 也可以同蛋白质相互作用, 间接地调节转录, 影响锌指结合DNA的性质。研究表明锌指蛋白之间可以互相作用, 与其它蛋白之间也可以相互影响。如Kim等科学家从大豆c DNA文库中分离到了一个冷诱导的锌指蛋白基因, 获得了大豆冷诱导锌指蛋白SCOF-1, 该基因的编码产物含有两个典型的C2H2锌指结构, 转基因研究证实了SCOF-1的过量表达可以增强拟南芥和烟草的耐冷性。SCOF-1的表达受低温和ABA特异性诱导, 而不受盐胁迫诱导。SCOF-1不能直接与冷调节基因COR启动子区的CTR/DRE顺式作用元件和ABA应答元件ABRE结合, 但是SCOF-1可以和另外一个大豆b ZIP转录因子SGBF-1互作, 以增强SGBF-1与ARRE元件的结合能力, 从而促进COR基因的表达, 提高植株的耐冷性。

四、锌指蛋白在基因治疗方面的应用

植物病原效应蛋白功能研究方法 篇7

关键词：病原菌,效应蛋白,研究方法,作用机制

植物与病原菌相互对抗的过程中, 病原菌会分泌一些蛋白到寄主细胞中。这些蛋白被称为“效应蛋白 (Avr) ”, 能够通过多种方式抑制植物免疫反应, 促使病原成功侵染植物。植物主要通过2种防御反应来对抗病原菌的侵染[1,2]。一种是通过表面受体 (pattern recognition receptor, PRR) , 如CEBiP和OsCERK1[3]等, 识别病原微生物分子相关模式 (Pathogenor microbe associated molecular patterns, PAMPs) , 激活植物内在免疫系统进行防御, 被称为依赖于病原菌识别的免疫激活途径 (PAMP-triggered immunity, PTI) ;另一种是通过抗性蛋白 (R蛋白) 识别病原菌分泌的效应蛋白, 激活植物免疫系统, 被称为效应蛋白介导的激活免疫途径 (Effectortriggered immunity, ETI) [4]。随着植物病原效应蛋白基因组测序的完成, 采取一定的策略分离、克隆相关Avr基因, 对于Avr基因的功能及与寄主植物间的互作机制研究具有重要意义。现结合几种细菌、真菌效应蛋白研究的最新进展, 综述了病原功能效应蛋白研究策略, 提出研究单一效应蛋白需要多种分析方法。

1 图位克隆策略分离效应蛋白

植物病原效应蛋白基因间的同源性较低, 其表达蛋白的结构功能及生化性质尚不清楚, 因此, 目前克隆效应蛋白基因的主要策略是图位克隆法[5]。图位克隆 (Map-based cloning) 又称定位克隆 (positional cloning) , 是一种建立在分子标记图谱基础上的基因分离和克隆技术。迄今为止, 稻瘟菌中已有40多个效应蛋白基因被鉴定, 其中Pwl1、Pwl2、AvrPiz-t、Avr-Pita和Avr1-CO39都是通过图位克隆得到的[6,7,8,9]。AvrPiz-t是Li等在毒性菌株81278ZB15中分离, 并通过基因精细定位及互补实验证实AvrPiz-t的存在。Orbach等 (2000) 结合RFLP标记定位与染色体步行方法从菌株O-137克隆分离了Avr-Pita。该基因编码一个全长为223个氨基酸的中性锌金属蛋白酶, 其成熟蛋白仅176个氨基酸, 能与Pi-ta特异结合。但是, 由于寻找与效应蛋白无毒基因紧密连锁的分子标记、构建基因组文库是图位克隆法中最为关键的2个环节, 这使得传统的图位克隆法存在周期长、效率低等缺点。随着稻瘟病菌全基因组测序的完成和信息生物学的发展, Yoshida等[10]于2009年利用关联遗传学结合基因组序列信息的方法, 揭示了3个新型稻瘟病菌无毒基因, 为更快捷、更高效完成效应蛋白基因的克隆提供新的方向。

2.2 异源表达分析鉴定功能效应蛋白

2.2.1 农杆介导的瞬时表达方法。

农杆菌介导Avr蛋白的瞬时表达是植物转化中最常用的方法。其中, 利用农杆菌注射瞬时表达能够快速、简便地用于效应蛋白功能的初步鉴定。通过Avr基因与CaMV 35S启动子共表达, 能在植物单一叶片同时高水平表达几个重组载体, 其瞬时性避免了构建稳定表达载体的耗时过程, 能在1~2 d完成。对于病原体, 寄主细胞中的效应蛋白的活性是触发ETI及其随后HR反应的先决条件。因此, 农杆菌注射植物叶片的瞬时转化可以用于抗性植物的无毒活性的研究[11,12,13]。Kim等 (2002) 利用带有或不含有Pto基因的番茄植株瞬时转化发现AvrPtoB的表达只有Pto存在时才引起细胞死亡。Chen等 (2013) 结合水稻原生质体瞬时表达和农杆菌注射本生烟叶片的方法, 对5个可诱导植物细胞坏死的新型Avr蛋白MoCDIP1-5进行了鉴定。另一种则是通过叶肉原生质体瞬时表达植物表达效应蛋白。尽管原生质体缺乏成熟细胞壁, 但它们对完整叶片中找到的大多数模拟激发子都产生反应。而且, 原生质体表达能在没有细菌及其相关PAMP存在下转化植物细胞, 检测单一PAMP信号。在原生质体中, PAMP感知导致的基因表达的变化可用一个荧光素酶报告系统进行研究[14,15]。Ribot等 (2013) 结合GUS等报告基因, 原生质体瞬时表达表明, Avr1-CO39在带有Pi-CO39的水稻中能触发HR过敏反应类细胞死亡。但是, 用这一系统只能进行分子或生化性质研究, 不能完整地反应病原菌及其宿主之间的生理互作。

2.2.2 寄主植株中稳定表达方法。

植物中效应蛋白表达的另一方法是通过构建稳定转化植株来实现。通过CaMV35S、地塞米松、雌二醇等诱导系统驱使效应蛋白在寄主植物中表达。制备稳定转化植株所需时间大大超过了任何瞬时转化方法, 但一旦成功, 这些植株将有利于大量获得性功能分析, 并为不同病原体的研究提供一个唯一合适的方法。在植物中, 由于效应蛋白的表达增强了一个缺失T3SS病原体的生长表明效应蛋白也可以抑制细胞内免疫反应, 从而使得质外体中细菌的生长。这一结果已经在几个DC3000效应蛋白表达中被发现, 包括拟南芥中得到AvrPtoB[16]。在大多数情况下, 效应蛋白的单独诱导表达可以使植物的生理发生改变, 包括萎蔫、萎黄甚至坏死。因此, 效应蛋白的高水平表达能够干扰植物的生理作用, 在转基因植株中表达效应蛋白更有利于一些独特分析。

2.2.3 酵母系统异源表达方法。

利用异源系统如酿酒酵母中, 同样可以获得效应蛋白表达信息。一些效应蛋白诱导细胞死亡和抑制细胞死亡的活性在种属间是保守的, 并且在酵母中有相同的功能[17]。在酵母中, AvrPtoB能够抑制由几种诱导子触发的程序性细胞死亡, 表明AvrPtoB可以识别许多保守的真核序列用于其产生细胞死亡抑制活性[18]。另外, Cesari等[19] (2013) 利用酵母双杂交技术研究水稻中2个NB-LRR蛋白编码基因:RGA4和RGA5, 发现二者都是被稻瘟菌Avr蛋白AVR1-CO39识别所必需。酵母系统为鉴定假定效应蛋白及其互作子提供了一个简单的方法, 但是, 目前在这些酵母筛选的植物病原效应蛋白途径和蛋白鉴定的研究非常少。

3 效应蛋白分子机制的探究策略

3.1 同源性分析

在效应蛋白研究早期, 尽管有些效应蛋白表现主要氨基酸序列与已知功能的蛋白相似, 但大部分是不同的[20]。利用重复BLAST搜索能够把Avr蛋白分组。丁香假单胞菌效应蛋白AvrPtoB和DC3000效应蛋白HopN1被归类于YopT效应蛋白家族, 命名为YopT。和YopT一样, HopN1和AvrPtoB都具有半胱氨酸蛋白酶活性, 突变影响酶的活性已经被证实是Avr蛋白无毒活性和毒力活性所必需的[21]。Mentlak等[22] (2012) 研究发现, 除了Slp1以外, 稻瘟菌基因组中还包含了其他几个LysM基序的效应蛋白, 如Slp2, 与Ecp6有高度的同源性。该基因在植物侵染过程中不会诱导表达, 基因敲除突变体不会影响毒力活性。

3.2 结构生物分析

研究表明, 包括AvrPtoB、AvrPto、AVR1-CO39在内的效应蛋白, 与其他已知诱导植物细胞坏死的效应蛋白没有同源性, 很难进行同源性功能研究。对于这些Avr蛋白, 最有效的方法就是结构生物分析。通过分析AvrPtoB的晶体结构发现在抑制植物产生细胞坏死的过程中, AvrPtoB的C端部分不依赖于N端部分, 其结构显示和真核中含有RING指和U盒结构的效应蛋白一样具有E3泛素连接酶活性[23]。相反, AvrPto进行核磁共振结构分析则不会受蛋白酶活性限制。然而, 其结果显示蛋白部分区域可能和Pto相互作用。对AvrPto-Pto复合体进行结构分析表明AvrPto通过与Pto互作而对免疫反应产生信号[24]。这些研究说明, Pto与AvrPto的互作共同接触面和Pto与AvrPtoB的单独互作接触面是相同的。很明显, 结构分析并不能应用于所有效应蛋白功能研究, 但对于某些效应蛋白而言, 它却能很好地应用于其作用机制的研究工作。

4 展望

蛋白质功能 篇8

1 材料

1.1 菌株和质粒

马链球菌 (Streptococcus equi) CF32、基因文库及康复血清, 由John Timoney教授提供;大肠杆菌 (E.coli) BL21 (DE3) 、p ET载体、大肠杆菌XL-1 MRF’、SOLR和辅助噬菌体 (Helper phage) , 购自Novagen生物工程公司;LB培养基、CNA培养基及THB+2%酵母浸出液培养基, 购自Invitrogen公司。

1.2 工具酶和化学试剂

PvuⅡ、XholⅠ、Bam HⅠ、T4 DNA连接酶、Taq酶, 均购自上海生工生物工程技术服务有限公司;邻苯二胺 (OPD) 和4-氯-1-奈酚, 购自Promega公司;BCA、生物素 (Biotin) 及Percoll试剂盒, 购自Pierce公司;过氧化物酶标记亲和素 (Avidin) 和荧光标记链霉亲和素 (Streptavidin) , 购自Promega公司;硝酸纤维膜、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G和过氧化物酶标记Protein G, 均购自普博欣生物公司。

2 方法

2.1 阳性克隆的筛选及纯化

参照参考文献[4]进行, 将滴定好的基因组文库接种在一个大的平皿上过夜, 把浸泡有0.025 mol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 的醋酸纤维素膜贴在平皿表面, 37℃作用2~4 h (使噬菌体表达的融合蛋白吸附到膜上) ;取下硝酸纤维素膜, 用TBST洗3次后, 加入4%的脱脂奶粉封闭30 min;依次加入马链球菌康复血清 (1∶500) 和辣根过氧化物酶标记Protein G (1∶4 000) 分别作用2 h;每步之间用TBST洗3次, 加入新配制的过氧化氢处理的4-氯-1-奈酚显色;根据膜上显色斑点, 选择平皿上的阳性噬菌体克隆, 将每个噬菌体克隆用大肠杆菌XL-1MRF’按上述方法进一步纯化, 直至硝酸纤维素膜上的斑点都出现一致颜色, 选择其中之一用于拯救质粒。

2.2 阳性克隆质粒的拯救

拯救方法按Helper phage试剂盒提供的方法并参照参考文献[4]进行。

2.3 质粒的酶切鉴定及测序

将获得的质粒用PvuⅡ酶切鉴定, 确定插入片段的大小, 测序并比较序列确定开放阅读框架 (ORF) 。

2.4 PCR扩增

以F1 5'-GCCCTCGAGAGAAAGGGTTATATG-3'、F2 5'-CGATCCTTAGCTCAGTTTCTGCC-3'为引物 (下画线部分为XhoⅠ和Bam HⅠ酶切位点) , 以拯救的质粒为模板进行PCR扩增。反应条件:94℃预变性3 min;92℃变性1 min, 57℃退火30 s, 72℃延伸66 s, 共30个循环;72℃延伸10 min。

2.5 Ide E基因PCR产物的连接转化

由于PCR产物的两端含有酶切位点, 将PCR产物及p ET15b用XhoⅠ和Bam HⅠ酶切后回收, 按载体与片段为1∶3的比例进行连接, 转化感受态细胞。

2.6 重组质粒的筛选与鉴定

挑取转化子若干个, 在3 m L LB液体培养基中培养12~16 h;质粒小抽提后经1%凝胶电泳, 根据DNA分子质量的大小, 初步筛选阳性质粒;然后取初步筛选的阳性质粒进行XhoⅠ和Bam HⅠ酶切后用1%琼脂糖凝胶电泳分析, 进一步筛选阳性质粒;将重组质粒进行PCR反应, 比较PCR产物与酶切产物的大小。

2.7 Ide E蛋白的表达

将鉴定为阳性的重组质粒载体转化至BL21 (DE3) , 在1 mmol/L IPTG诱导下表达, 收集菌体。

2.8 表达蛋白的纯化及Western-blot分析

采用Talon试剂盒提纯重组蛋白, 纯化的蛋白加等量上样缓冲液, 100℃作用5 min;SDS-PAGE电泳后染色观察;Western-blot方法参照2.1方法进行, 蛋白浓度采用BCA试剂盒测定。

2.9 Ide E阳性血清的制备

取2只健康白兔 (购自天津市奥臣实验动物有限公司) , 用100μg重组蛋白辅以氢氧化铝佐剂皮下免疫接种, 接种后14天和28天各加强免疫1次, 于第1次接种后35天采血分离血清。

2.1 0 Ide E降解免疫球蛋白的分析

分别取重组Ide E 1μg与0.5μg、1μg、2μg、4μg Ig G在PBS中37℃作用过夜, SDS-PAGE观察。

2.1 1 重组Ide E的Biotin标记

按Biotin试剂盒说明书进行。

2.1 2 Biotin标记的重组Ide E与嗜中性粒细胞结合试验

嗜中性粒细胞的分离按Percoll试剂盒说明书进行, 新分离的嗜中性粒细胞经计数后, 取2×106个与3μg Biotin标记的Ide E在200μL PBS中于37℃作用1 h;之后将嗜中性粒细胞用PBS洗3次, 在4℃条件下与荧光标记的Streptavidin作用30 min, 用流式细胞仪检测。

2.1 3 Ide E抗吞噬作用的检测

按参考文献[3]进行, 首先对分离的嗜中性粒细胞进行计数 (2×106个) , 将培养至对数生长期的CF32计数后 (1×107cfu) 用Se M特异性兔阳性抗体调理处理, 加入不同浓度重组Ide E, 然后于37℃与分离的嗜中性粒细胞作用1 h (总体积1 m L) ;放在冰上终止反应, 取100μL涂在CNA血液平板上培养过夜, 计数。

3 结果

3.1 Ide E基因的序列特征

通过筛选CF32基因组文库, 有3个与康复血清出现较强反应, 其中有1个克隆表达大约40 ku的蛋白。对拯救的质粒进行测序发现, 这2个克隆含有相同的开放阅读框架 (ORF) , 其含有1 101个核苷酸, 共编码367个氨基酸, 成熟的蛋白分子质量为39.6 ku, 序列分析比较发现Ide E与马链球菌兽疫链球菌Ig G分解酶和Ig G内切酶关系最为密切, 与白细胞C3b受体Mac (CD11b) 和人产脓链球菌免疫球蛋白分解酶具有同源性, 见图1。

3.2 抗吞噬蛋白基因的扩增结果

根据已知的抗吞噬蛋白基因序列设计了PCR扩增引物F1和F2, 并进行PCR扩增, 结果表明, 扩增的片段大小与预期相符。

3.3 重组表达质粒p ET15b-Ide E的构建及鉴定结果

将获得的PCR产物及p ET15b在37℃用限制性内切酶XhoⅠ和Bam HⅠ酶切4 h;经胶回收试剂盒回收后采用T4 DNA连接酶连接, 转化感受态细胞;挑取生长的部分菌落加入20μL去离子水煮10 min;4 000 r/min离心5 min;取上清液用F1和F2作PCR扩增重组质粒中的插入片段;挑取PCR阳性菌落, 摇菌过夜提取质粒, 用XhoⅠ和Bam HⅠ进行酶切鉴定, 得到预期的约为1 kb的片段, 由此得到含有目的片段的重组质粒, 命名为p ET15b-Ide E。

3.4 表达产物的SDS-PAGE及Western-blot分析结果

将p ET15b-Ide E质粒转化表达载体, 经1 mmol/L IPTG诱导后, 表达产物经Talon纯化试剂盒纯化后进行SDS-PAGE分析, 得到特定的目的蛋白条带, 约39.6 ku, 与预计的分子质量相符。证实该蛋白与阳性血清反应, 见图2。

M1, M2.蛋白Marker;1.纯化Ide E的Western-blot结果;2.纯化抗吞噬蛋白的SDS-PAGE检测结果。

3.5 Biotin标记的Ide E与嗜中性粒细胞结合检测结果

与对照组相比, 标记的Ide E与嗜中性粒细胞结合后荧光强度明显增强, 见图3。

3.6 Ide E降解Ig G及抗吞噬作用结果

试验中以相同的Ide E与不同剂量的Ig G相互作用, 经SDS-PAGE分析发现, 该蛋白没有呈现出降解Ig G的作用;将不同浓度的重组Ide E添加在嗜中性粒细胞与链球菌的混合液中, 结果见图4。

由图4可见, 重组Ide E对嗜中性粒细胞具有剂量依赖性杀菌抑制活性。

4 讨论

链球菌具有很强大的抵抗吞噬活性, 因此研究抗吞噬机制始终是各种链球菌研究的热点之一。本研究首次通过筛选基因文库鉴定出马链球菌一个新毒力因子Ide E, 并且成功地克隆表达该蛋白。通过分析基因库发现, 该蛋白与马链球菌兽疫链球菌Ig G分解酶和Ig G内切酶关系最为密切, 与白细胞C3b受体Mac和人产脓链球菌免疫球蛋白分解酶具有同源性, 但是Ide E没有呈现降解Ig G作用, 可能是由于进化过程中某些氨基酸的改变引起的。Mac-1作为i C3b的受体, 是内皮细胞整合素家族黏附素分子, 在嗜中性粒细胞活性氧杀伤中起重要的调节作用。有学者发现, 人嗜中性粒细胞Mac-1与Fc受体 (CD16) 在结构与功能上关系密切, 人产脓链球菌Mac能阻碍抗体和补体与其受体的结合, 进而抑制细菌的吞噬作用。本研究结果表明:Ide E也具有杀菌抑制活性, 并且呈现剂量依赖性;Biotin标记的Ide E可结合到嗜中性粒细胞上, 阻止抗体/补体与嗜中性粒细胞的结合, 从而呈现抗吞噬活性。

摘要：为了研究链球菌的分子发病机制, 试验筛选了马链球菌随机基因组文库, 得到1个阳性克隆, 对拯救质粒进行测序, 确定插入片段编码成熟蛋白阅读框架的分子质量为39.6 ku, 经序列分析确定为IgG内切酶蛋白 (IdeE) , 与白细胞C3b受体Mac (CD11b) 具有同源性, 设计特异性引物PCR扩增该基因, 并对该蛋白进行克隆表达和功能分析。结果表明:该蛋白不能分解IgG, 但可以结合嗜中性粒细胞, 呈现剂量依赖性抗吞噬活性。

关键词：马链球菌,IgG内切酶蛋白,功能分析

参考文献

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蛋白质功能 篇9

1 AQPs在水液转运和代谢中的作用

迄今为止, 从哺乳动物组织中克隆鉴定的AQPs已经有13种, 广泛分布于机体各种组织细胞中, 尤其是与液体分泌和吸收有关的上皮细胞及内皮细胞;并且研究发现其参与了机体水的分泌、吸收及细胞内外水的平衡等重要生理活动。它的发现为从分子水平揭示机体内水的转运和代谢机制提供了条件。近期研究发现AQPs的分布具有组织和细胞特异性, 参与了人体内多种重要的生理功能, 对维持人体正常生理状态具有重要作用, 例如:AQP0在晶状体纤维细胞中表达丰富, 与晶状体的透明度有关, 它的突变可能导致晶状体水肿和白内障, 小鼠缺乏AQP0将患先天性白内障[1];AQP1在胆管上皮质膜中有表达, 可能与其分泌功能有关[2];AQP2在肾中大量分布, 在调节肾脏水平衡中起重要作用;AQP5主要分布于各种腺体细胞, 与唾液分泌密切相关, 研究表明AQP5基因敲除小鼠唾液分泌明显减少[3], 并且AQP5还可能参与了肺内炎症时液体的异常转运[4]。

2 AQPs和脏腑功能的关系

中医学把体内一切正常水液称为津液, 包括各脏腑组织的内在体液和其正常分泌物, 如:唾液, 消化液, 泪液及尿液等。津液的生成、输布和排泄与各脏腑功能密切相关, 包括:肺、脾胃、肾、大肠和小肠等, 特别是肺脾肾三脏。《素问》曰:“饮入于胃, 游溢精气, 上输于脾, 脾气散精, 上归于肺, 通调水道, 下输膀胱, 水精四布, 五精并行”。中医学还认为津液是把各脏腑功能联系在一起的物质基础, 如果脏腑功能失调将影响津液的代谢, 破坏体内津液代谢的平衡, 正如《医学法律》所说“然则水病以肺脾肾为三纲矣”。津液代谢紊乱也必将进一步影响脏腑的功能, 《医学入门》所说“肺失宣降与通调, 则水不能布, 而致痰饮, 咳喘, 水喘”。津液的主要成分是水, 可以说无水则无津液, 现代医学认为水在体内的转运和代谢要通过AQPs, 可见津液代谢与AQPs密切相关, 而且AQPs在肺、消化系统和肾都有广泛表达, 说明AQPs可能和肺脾肾等脏腑功能密切相关, 研究生理状态下AQPs的分布和功能以及病理状态下AQPs的表达改变和机制, 将为中医学研究肺脾肾等脏腑功能提供新的思路和方向。

2.1 AQPs和肺主通调水道

肺位于上焦, 为水之上源, 主通调水道。通过肺的宣发和肃降对体内津液的输布, 运行和排泄起到调节作用。肺接受从脾转输而来的津液, 通过宣发作用输布至人体上部和体表, 通过肃降作用输布至肾和膀胱以及人体下部。因此肺的宣发和肃降不但能使水液运行的道路通畅, 还在维持机体水液代谢平衡中发挥重要的调节作用。如果肺的宣发和肃降功能异常, 则必然会影响机体水液代谢和平衡, 从而导致一些疾病的产生。如肺失清肃, 通调水道功能失司, 水液不行, 则聚而成痰, 停留于肺, 影响肺的呼吸功能;如果水液不能下输膀胱, 还能出现小便不利, 水肿等症状。由此可以看出肺在水液代谢的调节中起重要作用, 这可能和肺参与了体内AQPs的调节有密切关系, 王哲等[5]的关于实验性肺气虚证对大鼠肾组织AQP2的表达影响研究则为肺参与体内的AQP的调节提供了依据, 该研究表明肺气虚时, 肾脏AQP2表达增强。

2.2 AQPs和脾主运化

脾位于中焦, 为后天之本, 主运化水谷精微, 为体内津液代谢的枢纽, 能将津液上输于肺或直接布散全身, 以灌四旁。《太平圣惠方》“脾失健运, 则水湿内停, 而至水饮, 痰饮, 水泻”, 说明脾的运化功能与体内津液生成和输布也有密切相关。脾胃功能异常, 将导致体内津液代谢紊乱, 如《素问·至真要大论》所说“诸湿肿满, 皆属于脾”, 脾失健运, 水液停聚, 会形成水湿, 发为水肿, 并且脾虚时津液代谢紊乱形成的病理产物还会影响到其其它脏腑功能, 如肺的呼吸功能等。周正等[6]就从AQP4的表达变化探讨了脾胃湿热证的发生机理, 并证明AQP4的异常表达可能是脾胃湿热证的发生机制之一。王德山[7]等从脾虚大鼠结肠上皮细胞水通道蛋白8 (AQP8) 表达的变化探讨了脾虚泄泻的发生机制, 并认为AQP8表达下调可能是脾虚大鼠产生泄泻病理生理机制之一。这些研究都说明脾的运化功能与AQPs功能有内在相关性, 为今后脾的实质研究提供了新途径。

2.3 AQPs和肾主水

肾位于下焦, 《素问·逆调论》云:“肾者水脏, 主津液”, 在津液代谢中起主宰作用。肾主水液, 主要是指肾中精气的气化功能, 对于体内津液的输布和排泄, 维持体内津液代谢的平衡, 起着极为重要的调节作用。肾中精气的蒸腾气化作用是脾胃、肺等脏腑功能的动力, 推动了全身津液的输布。由肺下输至肾的津液, 通过肾的气化, 清者蒸腾, 经三焦上输于肺而布散全身, 浊者生成尿液注入膀胱, 排出体外。AQPs的正常表达可能是肾主水液的分子生物学基础[8], 肾阳对水液代谢的调节出现异常, 水通道蛋白表达异常可能是癃闭、淋证、水肿等水液代谢异常的发生机制。

3 AQPs和肺脾肾三脏功能相关性的关系

肺脾肾三脏在体内津液代谢中都有重要作用, 而且通过参与津液生成、输布与排泄, 把它们的功能密切联系在一起。某一脏腑的功能异常将会影响到全身的津液代谢, 也必将会影响到其它脏腑的功能, 如果能够从AQPs表达变化入手, 研究肺脾肾三脏在水液代谢中的作用及其相关性, 可能为肺脾肾三脏功能的相关性的研究提供新思路。如王哲等[5]的研究表明实验性肺气虚大鼠肾组织AQP2表达增强, 说明在机体水液代谢中, 肺和肾两脏相互配合, 共同维持水液代谢的平衡。如果肺失宣降, 通调水道失职, 将累及于肾, 而导致尿少, 甚至水肿。赵娴等[9]的研究也表明哮喘时肺失肃降状态下, 豚鼠尿液中AQP2的含量升高和肺的功能异常相关。

由此可见, AQPs在肺、消化系统和肾的正常表达可能是“肺主通调水道”、“脾主运化”和“肾主水液”的分子水平基础之一。通过研究AQPs的表达和调节机制, 将为揭示肺脾肾三脏的功能及其功能的相关性提供新途径, 为中医肺气虚证、脾气虚证、脾胃湿热证及肾虚证等证的本质研究提供新方向。

摘要：通过论述水通道蛋白和肺脾肾三脏在体内水液代谢中的作用, 探讨水通道蛋白和中医学肺脾肾三脏功能的内在相关性, 提出AQPs在肺、消化系统和肾的正常表达可能是“肺主通调水道”、“脾主运化”和“肾主水液”的分子水平基础之一。因此通过研究AQPs的表达和调节机制, 将为揭示肺脾肾三脏的功能及其功能的相关性提供新途径, 为中医肺气虚证、脾气虚证、脾胃湿热证及肾虚证等证的本质研究提供新方向。

关键词：水通道蛋白,肺,脾,肾

参考文献

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蛋白质功能 篇10

化妆品早已成为人们生活必需品，随着科学技术的发展，它的研发也不再是传统的工艺技术。2013年，迪奥美妍科学中心实验显示丝聚蛋白生成的减少是导致肌肤黑色素生成的一项重要因素。而其他有关丝聚蛋白的研究和应用基本局限于医学，在化妆品中的应用少之又少。本文描述FLG的产生和在皮肤中的相关生化作用，结合目前FLG在医学上的研究，总结出FLG在化妆品中的皮肤屏障功能中的作用，为化妆品领域开拓视野。

在角质层中，丝聚蛋白（filaggrin，FLG）又称丝聚合蛋白，相对分子质量约35000，是参与皮肤屏障的重要因子，主要功能是参与表皮细胞的分化及皮肤屏障的形成。FLG是表皮中末分化的重要组成蛋白，主要存在于表皮颗粒层和透明层。在肽基精氨酸去亚氨基酶的催化下，其碱性精氨酸位点去亚胺基形成中性瓜氨酸，产生中性及酸性异构体；酸性异构体只有很弱的亲和能力与角质蛋白作用，使丝聚蛋白从角质丝中释放出来，继而被逐步降解为高度保湿的氨基酸及其衍生物。目前认为这些氨基酸及其衍生物是皮肤的天然保湿因子，可能对维持皮肤的正常pH值、调节蛋白酶活性、表皮屏障的通透性及其皮肤对微生物的防御功能起关键作用，对维持角质层的水和作用非常重要。

FLG的基因表达与调控

1.1 FLG基因表达

FLG基因定位于人类染色体1q21 的表皮分化复合物区域（ EDC）内，EDC 是一个包含了几个保持正常表皮屏障功能重要基因的区域。在颗粒层、角蛋白中间丝与新合成的FLG相互作用，进一步聚集成束。兜甲蛋白、内披蛋白及富含脯氨酸的小蛋白（SPRRs）等沉积在细胞膜内侧，通过转谷胺酰胺酶的交叉连接作用，共同形成一种稳定的蛋白壳膜即角质化包膜（CE），成为表皮防御屏障的基础。它是一层坚韧的不溶于水的组成和保持皮肤屏障的大分子层。角质化包膜表皮终末分化的过程不仅包括表皮终末分化特异性角蛋白的表达，而且涉及其他几种重要的角蛋白中间丝相关蛋白，包括：丝聚合蛋白、兜甲蛋白、内披蛋白及SPRRs等，这些结构蛋白由转谷氨酰胺酶广泛交联作为角质化包膜的支架。在角质化包膜的形成过程中，丝聚蛋白原经脱磷酸化和蛋白水解作用由丝氨酸蛋白水解酶裂解，释放丝聚蛋白功能片段。

FLG在颗粒层强烈的表达，导致巨大的前体蛋白—丝聚蛋白原产生。丝聚蛋白原是一个大的、高度磷酸化的多肽，是颗粒层透明角质颗粒的重要成分。丝聚蛋白原经过脱磷酸和蛋白水解作用后，在颗粒细胞的终末分化期被裂解为功能丝聚蛋白肽。这种肽可以捆绑和崩解角蛋白细胞骨架，随后每个肽段逐渐被酶降解为亲水的氨基酸，包括吡咯酮、羧酸、丙氨酸和反式尿刊酸（咪唑丙烯酸）这些氨基酸和各种离子被叫做天然保湿因子（NMF）。NMF在角质层的水合作用中起至关重要的作用。所以说丝聚蛋白在保持有效的皮肤屏障和保水方面起着关键作用。

1.2 FLG的基因调控

由于游离的FLG单体可以引发角蛋白丝的聚合和塌陷，所以表皮分化期间丝聚蛋白原的表达必须被严格的控制，从而防止骨架之间这些成分任何过早地相互作用。在控制FLG表达方面，有几个重要的因素。早期研究表明，AP1家族转录因子近端FLG启动子应答元件的结合对于维持高水平的丝聚蛋白原的表达是必不可少。

此外，POU结构域蛋白（含二分DNA结合转录因子域被称为POU结构域）在表皮中表达，POU结构域蛋白结合体内两个特定识别元件的启动子，并且通过该启动子的刺激或拮抗活性发挥其功效。研究表明，转录因子p63对于表皮发育至关重要，转录因子p63存在多种亚型，并且是启动子的替代。这些亚型的表达在角质形成细胞分化期间存在差异。p63蛋白（TAp63α和TAp63γ基因）封闭的TA-结构域阻挡了FLG基因的转录，但对分化标志物角蛋白1和角蛋白10没有影响，这表明这些异构体对丝聚蛋白原的表达有影响。同样，N端短亚型Np63α的α-尾也妨碍了丝聚蛋白原基因的表达，而P63亚型Np63p40（缺乏ΔNp63α完整的α-尾）可以让表皮分化标志一个完整的面板，包括丝聚蛋白原，鼠FLG已被证明含有一个末端同源异型域蛋白DLX3的结合位，该结合位点是p63蛋白下游的靶向目标。DLX3通常在颗粒层中表达，但是，当它在表皮的基底细胞层被异位表达时，丝聚蛋白原就会被过早地诱导表达，这导致了表皮分化被严重破坏。人类的FLG启动子还包含视黄酸和糖皮质激素反应元件，其功能是抑制在它们的配体存在下启动子的活动。丝聚蛋白原表达的其他调节者包括过氧化物酶体增生物激活受体（PPAR）家族。PPARs是有配体活性的转录因子，但是与转录因子有不同的功用。在小鼠中，丝聚蛋白原的表达可以随着局部治疗的进行与PPARγ兴奋剂量的增加而增加；然而，通过对PPARγ缺陷的小鼠兴奋剂治疗，没有观察到丝聚蛋白原表达水平的变化，这表明PPARγ的活性直接影响丝聚蛋白原的表达。综上所述，表皮分化期间FLG启动子活性的调控非常复杂，这涉及众多的转录因子之间微妙平衡的相互作用。

FLG在皮肤屏障功能中的作用

2.1 表皮物理屏障作用

丝聚合蛋白在参与组成皮肤表皮外层的角质包膜过程中，促进表皮分化，形成表皮角质层独特的屏障结构，在维持皮肤的屏障功能中具有重要作用。且FLG是连接角蛋白纤维的重要分子，在FLG单体的协助连接下，角蛋白成纤维束有规则地聚集，进而引起细胞紧密的状态，促使角蛋白细胞骨架塌陷，使椭圆形的颗粒层细胞塌陷成扁平的角质细胞，形成皮肤最外层。

在FLG与表皮分化过程涉及的一系列物质的共同作用下，人表皮角质形成细胞（KC）中形成不溶性的角质包膜，大量的扁平的含角质包膜的KC在表皮的最外层形成了坚实的物理屏障。KC衍生的脂质一方面与细胞外表面共价连接，一方面粘附于结构蛋白形成的骨架结构之上，从而在细胞外层形成外脂质膜，当皮肤受到外界环境刺激时或者破坏时，组成角化包膜的蛋白会代偿性表达上调，从而防止表皮水分的丢失和外界过敏物质的入侵。endprint

2.2 表皮保水作用

FLG在表皮角质层降解形成的氨基酸小分子具有保湿功能，因此被称为“ 天然保湿因子”。在角质层中上层，FLG从角蛋白纤维束中解离出来，转化降解形成吸水性氨基酸混合物，组成具有渗透活性的物质，形成NMF。NMF占到角质层细胞基质的10%，通过渗透压来吸引水分子，再通过水合作用锁住皮肤水分。据研究显示，与NMF结合的水是角质层中较固定的一部分。NMF的吸水功能能够维持表皮的水合作用，减少经表皮水分的丢失，保持表皮的含水量。

2.3 表皮酸性环境的维持

FLG 是一种富含组氨酸的蛋白质，其降解产物组氨酸经代谢能转变为反式利尿酸以及吡咯烷酮-5-羧基酸。表皮的这种弱酸性环境能够防止外界微生物的入侵同时为一些表皮蛋白酶发挥作用提供一个较适宜的环境。Jungersted[15]等发现FLG 失功能突变基因携带者表皮的pH 值会升高，导致一系列疾病发生。因此，认为FLG降解代谢产生的酸性产物在维持表皮的酸性环境中具有重要作用。

2.4 表皮防晒作用

已有一些研究证实，FLG 降解产物顺式利尿酸具有一定的紫外线防护作用。丝聚蛋白原经过蛋白水解处理后得到聚角蛋白微丝，聚角蛋白微丝可以降解成丰富的组氨酸，其降解产物是表皮利尿酸的主要来源。反式利尿酸再通过紫外线辐射转化为顺式利尿酸。顺式利尿酸不仅能产生一种光谱为280～310 nm的分子，还对KC和白细胞具有免疫调节功能。FLG 的减少会导致利尿酸浓度的下降，从而使细胞对紫外线诱导的表皮细胞凋亡的敏感性增加，这进一步说明FLG可能具有一定的防止皮肤晒伤作用。

FLG在皮肤屏障功能受损疾病中的差异性

有学者表示，在银屑病皮损中，可能与丝聚蛋白减少致角质形成细胞及颗粒层细胞之间的链接和聚集功能受限有关。另外已经证实，缺少丝聚蛋白的基因可以导致寻常型鱼鳞病的发生，这也是特应性皮炎的高危因素。

3.1丝聚蛋白在斑秃患者中的表达

在西兰组对“斑秃患者皮损丝聚蛋白的表达”的研究中，采用丝聚蛋白的免疫组化标记的方法对37例斑秃患者（8例伴特应性疾病、29例伴特应性疾病）皮损及10例斑秃患者皮损及外科头皮手术如皮肤色素痣，面部行美容拉皮手术切除术边缘头皮组织进行病理活检，并进行丝聚蛋白免疫组化染色。荧光半定量（RT-PCR）的方法分别对22例斑秃患者和13例正常对照头皮皮损的丝聚蛋白mRNA表达水平进行半定量荧光PCR检测。

用这两种实验方法测得FLG的免疫组化标记的方法和荧光半定量（RT-PCR）的方法的结果一致。在正常对照组及斑秃患者皮损的头皮，丝聚蛋白的分布主要位于表皮的颗粒细胞层上层、角质层、毛囊漏斗部和峡部近管壁部位的细胞胞质中。斑秃皮损丝聚蛋白和其mRNA的表达水平较正常对照明显降低，而且这种降低在脱发面积较大、病程较长和有指甲改变的斑秃患者中更明显。提示丝聚蛋白可能参与斑秃的发病，并和疾病的严重程度有关。3.2银屑病患者皮损丝聚蛋白表达

银屑病是一种常见的慢性复发性、炎症性皮肤病。银屑病皮损病理上表现为表皮基底层角质形成细胞增殖加速，有丝分裂周期及表皮更替时间缩短，组织病理上表现为角化不全，颗粒层消失，且病情多于冬天加重，这种组织学及临床表现提示银屑病患者的皮肤屏障功能可能受损。丝聚蛋白在正常皮肤组织中为阳性至强阳性的表达，而在银屑病患者皮损中为弱阳性的表达。与正常组织相比较，在银屑病组织中，丝聚蛋白表达稍微下降。银屑病患者在治疗和康复过程中，银屑逐渐减少，丝聚蛋白的表达增多。

3.3丝聚蛋白在鱼鳞病皮肤中的表达

鱼鳞病是一种常染色体半显性遗传性皮肤病。长期以来，研究者认为其发病机制主要是由于表皮透明角质颗粒的形状、大小的改变或数量的减少，甚至完全缺失引起的，而透明角质颗粒中的主要物质就是丝聚蛋白原分子。鱼鳞病患者的皮肤组织病理检查显示，其表皮中的透明角质颗粒减少或缺失，而透明角质颗粒的主要成分就是丝聚蛋白原。近年来Smith发现FLG基因第3个外显子内的两个功能突变R501X和 2282del4 与鱼鳞病发生有关。R501X和 2282del4功能突变导致FLG分子表达水平下降，使得表皮终末角化过程出现障碍，表皮的保湿和屏障功能受损，皮肤表现为干燥、脱屑，抵挡外界过敏原和化学物质等入侵的能力下降，易于发生鱼鳞病。

3.4丝聚蛋白在特应性皮炎中的表达

特应性皮炎是一种常见的慢性反复性炎症性皮肤疾病，FLG基因突变是该病的发病基础，FLG基因突变使角质层细胞结构异常、细胞间连接过度裂解、细胞间脂质减少、丝聚合蛋白及NMF含量降低，表皮的保水能力、皮肤弹性及机械性能降低，外界变应原及刺激物更易侵入皮肤，而NMF含量的减少又使皮肤表面pH值升高，进一步影响表皮脂质代谢酶的活性，构成恶性循环，可以引起皮肤屏障的改变。

FLG在化妆品中的应用

丝聚蛋白是表皮细胞的分化蛋白，是表皮屏障的重要组成成分，其缺乏可导致外来变应原通过破损的表皮屏障进入机体，并和抗原提呈细胞结合导致特应性疾病的发生发展。FLG的功能缺失突变，从而出现皮肤干燥、起皮疹，伴瘙痒等特应性皮炎的症状及体征，严重时瘙痒难以忍受，甚至影响睡眠，大大降低了生活质量。

2013年科学家通过激光对组织切片进行显微解剖，精确分析色斑区域的皮肤细胞群及其周围组织，发现黑色素生成区域缺少一种名为丝聚蛋白的蛋白质，但它却存在于肌肤无斑之处。这一发现显示丝聚蛋白生成的减少是导致肌肤黑色素生成的一项重要因素。

蛋白质功能 篇11

1 固有无序蛋白序列、结构特点

1.1 序列特点

在生理条件下蛋白质氨基酸序列决定其是有序化还是固有无序化状态。IDPs编码基因的核苷酸与有序蛋白不同,其富含鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸[7],这使得IDPs在氨基酸组成上与有序蛋白存在明显差异[8]。组成IDPs的氨基酸序列具有比较明显的偏性特征[9],疏水性氨基酸含量较低,而亲水性氨基酸含量较高,IDPs富含E、K、S、Q、P、D、T等氨基酸[10]。另外,IDPs在序列上常出现重复的区域,所以其序列复杂性低于有序蛋白质[11]。IDPs无序区和有序区氨基酸分布具有不对称性,主要是由于IDPs有序区与无序区氨基酸序列在疏水性、平均电荷等多种理化性质方面存在差异造成的。

1.2 结构特点

通常在溶液里,IDPs存在多种构象不断动态变化,主要是由于IDPs较高的未被中和的电荷产生了强烈的静电排斥,无法形成稳定的疏水核心[12],所以IDPs很难形成稳定的结构。在生理条件下,由无序区造成IDPs的构象变化使其整体或部分没有确定的三维结构[13],原子位置和主链的二面角的平衡值随时发生变化,主要存在熔球态[14]、前熔球态、无规卷曲这三种构象。IDPs结构具有灵活性,当与其他物质结合时,为形成相对稳定的结构,它们会诱导其构象由无序向有序转变,即诱导折叠,这个过程通常被称为折叠与结合的耦合[15]。尽管IDPs与受体结合后局部区域发生折叠变得更加有序,但肽链上的局部区域仍可能是无序的[16]。

研究发现,IDPs分子间的相互作用力弱于其与受体间的相互作用力,也就是说,IDPs结合状态下的有序结构主要靠其与受体间的非共价键作用力来稳定[17]。在细胞内部空间拥挤的条件下,因组成蛋白质的氨基酸序列不同,IDPs的构象也会发生改变。理论上讲,由于溶液中大分子的存在使得自由空间相对减小,所以蛋白质更倾向于形成体积较小的构象[18]。这种构象可能是非折叠态或是有序折叠态。

2 固有无序蛋白的预测、鉴定

2.1 预测方法

IDPs的功能位点大多分布在无序区,所以无序区是其发挥功能的主要区域,因此判断蛋白是否无序可着手于预测蛋白质无序区。有关IDPs的预测越来越受到人们的重视,著名的蛋白质结构预测大赛(Protein Structure Prediction Center,CASP)[19]从第五届开始就已经把IDPs的预测列为其中一项重要的比赛内容。

已开发出的无序区预测方法大致可分为三种[20]:第一,利用支持向量机(SVMs)、人工神经网络等机器学习法结合贝叶斯等多种分类方法开发的算法。如发展比较完善的基于氨基酸序列特征对无序区进行预测的PONDR[21]系列分类器可以根据序列对IDPs的长短区域进行分类预测[22]。而随后发展的对训练数据库不敏感的SPINE-D[23]可以高度精确的预测长短无序区。仅凭单核处理器在几小时内鉴定全基因组的ESpritz[24]可同时快速并准确地对多条蛋白序列进行预测。这为IDPs蛋白组学研究提供了条件。DISOPRED3[25]采用一种新型SVM分类器可对无序区和蛋白质结合位点进行预测,利用SVM和长区域神经网络预测无序区,更易于整合、更新数据和维护。这类软件虽然在IDPs预测方面表现很好,但由于它们的black-box性质通常缺乏对潜在机制的解释。第二,结合多种预测算法的元方法,这种方法不直接根据输入的信息预测IDPs,而是运行几个预测程序,通过一系列程序并考虑所有结果做出最后的综合预测。如PONDR-FIT结合了包括PONDR VLXT、VSL2、VL3、Fold Index、IU-Pred、Top IDP在内的6种独立的预测方法,通过八折交叉验证训练的单层人工神经网络整合6种预测方法的结果,精度分析表明PONDR-FIT与这6种方法相比准确度平均提高11%。已经通过实验数据证实,由8种主要基于序列信息的预测软件形成的Dis Meta[26],在许多蛋白质样品生产方面非常成功。这种方法还提供二级结构、信号肽、跨膜螺旋区和由PROFsec、Signal P、TMHMM和SEG形成的低复杂性区域的分析。此类算法由多种初级预测软件组成所以其预测速度相对较慢。第三,理论上运用相关特征参数,发展出的基于IDPs氨基酸理化性质的预测软件。如人们熟知的Fold Index[27]、IUPred[28]、和Fold Unfold[29]等。随后发展的Is Unstruct[30]采用伊辛模型并基于统计物理学识别无序区。这种方法在长短无序区预测方面表现很好,其准确率高于PON-DR-FIT。此类方法快速简单,但是不能优化利用数据,通常精确性不如前两类方法。

目前开发的预测算法逐步趋于专门化,但对于IDPs与DNA、RNA、蛋白等生物大分子的相互作用结合位点的预测算法的研究较少,而且对短无序区和蛋白C端、N端无序性预测的准确率还有待提高。所以应加深对无序区结构、理化特征的研究。通过实验手段深入探究IDPs与其他配体互作的结合位点获得的最适特征参数来设计预测算法,分析互作时结合位点的氨基酸残基[31,32],并考虑固有无序蛋白和结构化蛋白训练集中的错误率,扩大分类器搜索空间,减少过拟合现象,以此来提高预测的准确度。随着人们对IDPs生化性质的深入了解,对无序区域的预测质量将得到进一步提高。

2.2 鉴定

实验鉴定IDPs的方法主要分为两种,第一,根据IDPs的理化性质来鉴定IDPs。利用IDPs普遍的热稳定性、对蛋白酶的敏感性及其在SDS凝胶电泳中表现出的低流动性特征来判断无序蛋白。第二,基于物理化学的实验方法对IDPs进行表征,主要包括核磁共振(NMR)[33]、X射线晶体衍射技术(X-Ray)[34]、圆二色谱法(CD)[35]、荧光光谱(Fluorescence Spectroscopy)、振动性圆二色谱法(Vibrational circular dichroism)、拉曼光谱(Raman Spectroscopy)[36]、沉降法、傅里叶变换红外法、小角度X射线散射(SAXS)等。其中NMR是研究无序蛋白结构最为常用的手段,无序蛋白H化学位移通常限制在8.0~8.5 ppm[37]。由于IDPs的结构是动态变化的,为获取氨基酸水平的动态信息,可用NMR方法对瞬间出现的二级、三级结构进行检测,判断蛋白无序的程度。

为了有效区分IDPs和有序蛋白质可以综合利用多种实验方法,可以对具体IDPs的构象和功能特征深入研究,为系统认识IDPs的功能机制奠定实验基础。然而,这些实验手段并非对所有蛋白都适用,如NMR目前无法测定结构庞大的蛋白质结构。且实验周期长、成本高,还存在技术问题。至今为止,大规模测定IDPs的结构还很困难,所以IDPs的实测数据较少,只有在结构测定方面取得突破性进展才能在蛋白质组范围内进行大规模研究。可以综合运用计算方法和预测软件,对已测数据进行统计分析并对未知的实验无法测定结构的蛋白进行预测。

3 固有无序蛋白的功能

3.1 分子功能

IDPs的原子内部的分子间相互作用比较小,肽链相对伸展,自由度较高,容易发生各种构象变化,而这种变构效应也是实现功能复杂性的机制之一[38]。Disprot[39]数据库(http://www.disprot.org/index.php)根据其收录的IDPs归纳了IDPs所具有的几种不同功能:首先,作为分子伴侣,帮助其他蛋白质或RNA实现正确的折叠状态,防止蛋白聚集,并促使折叠错误的蛋白质重新折叠,如拟南芥中ERD10和ERD14能阻止高温诱导的聚合和各种基底失活,减少细胞失水,从而维持细胞的渗透平衡[40]。其次,作为修饰位点,通过化学添加剂或蛋白酶切割实现蛋白质修饰。泛素化位点、糖基化位点、甲基化位点和磷酸化位点等是IDPs上主要的修饰位点。由于无序区富含磷酸化位点,且被大量的翻译后修饰,说明IDPs很可能是大量激酶和其他修饰酶的底物。第三,作为分子识别效应器,允许多个伙伴高特异性、低亲和力的结合,且通常用于信号转导。IDPs与蛋白质、核酸、配体相互作用来启动和调节大部分的分子过程。如两种折叠后结合的效应器p21和p27,可以结合多种受体分子,从而形成不同的复合体,它们分别调节不同的负责控制哺乳动物细胞周期连续的周期依赖性激酶(Cdk)。第四,分子组装,IDPs可组装、调节和稳定蛋白复合物,如核糖体的装配,其依赖蛋白质和RNA一系列的协同结合步骤。虽然,rRNA折叠初期可能是由RNA本身驱动的,但是,通过结合rRNAs,核糖体蛋白随后折叠,导致RNA和蛋白质的结构变化,并使得复合物向其自然状态转变。第五,作为分子识别净化剂,IDPs与疏水基团结合使其更加可溶,可存储和中和它们的配体,如酪蛋白和其他钙结合磷蛋白(SCPPs)[41]可溶解牛奶和其他生物流体中的磷酸钙集群,唾液富脯氨酸糖蛋白可结合消化道内的鞣酸分子等。第六,存储和帮助消除或中和重金属以解毒,如Mp Dhn12蛋白作为一个功能互补蛋白,可使转Mp Dhn12基因的Cu2+敏感体酵母在高浓度Cu2+下生长,使突变体酵母细胞重新获得Cu2+的耐受性[42]。最后,IDPs可以提供高熵链,由于IDPs构象的无序才使得熵链执行功能。熵链通常连接两个有序的域,并调节它们之间的距离,如微管相关蛋白2(MAP2)投射域,因其排斥接近微管的分子,从而提供细胞骨架的空隙。

3.2 固有无序蛋白与人类疾病

随着越来越多的IDPs被发现,人们对其功能有了一定的认识。IDPs在细胞生物学和分子生物学上具有重要的生物学功能[43]。IDPs的无序区在需要许多生物元件相互作用的信号转导和信号通路等生物过程及蛋白互作网络[44]、蛋白活性调节、大蛋白复合体组装过程中[45]起到了非常重要的作用,对大部分低吸引力、高特定性蛋白质相互作用来说是必需的[46]。

IDPs重要的生物学功能以及在蛋白质相互作用网络中的核心地位使得IDPs与各种人类疾病相关。许多疾病相关位点处于固有无序区域,而且IDPs丰度改变也可引起某些疾病的发生,尤其是某些复杂疾病,例如癌症、糖尿病、神经性疾病以及心血管疾病,都被证实与IDPs相关[47]。通过生物学实验得知一些IDPs的病理学功能,所以IDPs的深入研究对疾病治疗也具有重要意义。IDPs的研究不仅为疾病治疗和蛋白的全新设计提供新选择,而且为药物靶点的设计提供新思路。以IDPs为基础设计药物应用前景非常广阔,可能对药物开发产生重大影响[48]。

3.3 固有无序蛋白与植物抗逆性

生命形式越高级则IDPs的含量就越多,即蛋白质中无序区域含量的增加是生物进化的一个重要特点。越来越多在环境应答方面发挥重要功能的IDPs在植物中被发现,如ASR1蛋白的表达可以提高植物抗盐、耐旱的能力[49]。在拟南芥中将近23%的蛋白质被预测为完全无序[50],IDPs缺乏稳定结构使得它们能够促进植物遇到胁迫条件时的相关功能[51],可使植物在遭遇胁迫时迅速反应,减少细胞损伤。

生物系统中由各种生理过程构成复杂的互作网络,中心节点蛋白质必须可以和大量不同的配体结合。基于IDPs的结构特点,中心节点上的蛋白均具有大量的无序序列。通过对蛋白质互作数据库研究发现[52],非生物胁迫信号通路中的关节点蛋白亦包含大量的无序区,基于它们在中心节点蛋白执行功能时的作用,对IDPs特殊功能域的研究将成为关注焦点。根据已有的实验数据可以清楚地了解到IDPs与植物抗逆性强烈相关,因此IDPs被视为作物品种改良中具有潜在应用价值的一类蛋白。

4 展望

随着蛋白质组学研究的发展,基于IDPs的非折叠蛋白质组学开始受到重视,并逐渐成为研究热点。有关IDPs的研究已经成为蛋白科学领域非常重要的组成部分。揭示、阐明IDPs的生物学功能是IDPs研究的核心问题之一。目前国内外对IDPs的研究主要包括以下三方面:第一,通过实验手段对IDPs的特征、功能特性进行深入研究。第二,开发预测软件分析IDPs氨基酸相关特性并推断其可能的功能以及高通量实验数据分析。第三,对与疾病相关的IDPs的动力学性质及其在药物开发方面的应用进行研究。

对IDPs的研究不仅有利于对蛋白质折叠机制的研究,帮助人们更好地测定蛋白质的结构,还有助于蛋白质设计,可能成为新的药物靶标[53],对提高植物抗逆性也具有重要意义。迄今为止,关于IDPs的研究成果大多基于功能及结构的预测,对蛋白无序性的精准预测仍有很多障碍;而且缺乏基于IDPs变构效应的多样性生物学功能的实验研究,尤其是IDPs特殊功能域的鉴定方面;对IDPs怎样与多种靶分子特异性结合及它们之间的互作应答机制等诸多问题有待研究。因此,精确高效地分析IDPs的结构及功能特性将是解决问题的关键,可通过综合利用预测及实验方法,开发有针对性的专门化预测软件,通过NMR、X-Ray等实验方法获得IDPs结构相关的实测数据后,利用基于蛋白互作的蛋白质体外结合实验等生化方法,筛选目的蛋白及证实蛋白间的互作。总之,深入研究IDPs,对与IDPs相关疾病的药物开发和植物抗逆机制的研究具有指导意义及实际的应用前景。

摘要：固有无序蛋白是一类在天然条件下没有稳定单一的三维结构,存在多种动态互变结构,与传统蛋白不同类型的蛋白质。这类蛋白普遍参与多种生理过程,具有特定的生物学功能。该文对固有无序蛋白的序列、结构特点进行了介绍,总结了无序蛋白预测和鉴定方法,对固有无序蛋白的分子功能和抗逆机理进行了阐述,最后对其在国内外的发展趋势及应用前景进行了展望。