低分子蛋白质

低分子蛋白质（精选9篇）

低分子蛋白质 篇1

鲨鱼是一种特殊的海洋生物, 1992年在美国首先将鲨鱼软骨 (shark cartilag, SC) 粉直接用于临床治疗癌症, 取得了一定的效果。但未经提取的SC粉其有效成分含量不足, 直接用于临床抗肿瘤难于达到治疗目的, 因而许多学者则纷纷采用提取鲨鱼软骨血管生成抑制因子 (shark cartilag angiogenesis inhibiting factor, SCAIF) 来抗肿瘤生长, 但是SCAIF含量较低, 易降解, 纯化困难, 进行其新药开发仍有许多技术问题需要解决。为此, 有许多研究就集中到了鲨鱼软骨粗提物的抗肿瘤作用上, 而传统的提取方法繁琐, 使用了盐酸胍、丙酮[1~3]等不仅对人体有害, 且造价昂贵不利于大规模生产, 本实验提取的低分子蛋白明显抑制血管生长, 且提取方法简单便于大规模生产。

1 材料与试剂

鲨鱼 (广西北海产) 取其软骨冷冻保存备用;受精鸡蛋 (南宁养鸡场) 20个;人脐静脉内皮细胞株HUEVC (上海午立公司) ;胎牛血清 (Gibco公司) ;DMEM (Gibco公司No12800-017) ;胰蛋白酶 (DIFCO公司) :噻唑盐 (MTT) 及其余试剂为国产分析纯。96孔、24孔培养板 (Germany) ;Militan XX8000230型超滤系统;PLBC超滤膜 (分子量为100 000, Millipore公司) 。

2 方法

2.1 鲨鱼软骨低分子蛋白的提取

将200 g SC碎后加入1 000 ml的蒸馏水, 反复冻融5周期, 采用低温梯度密度离心法, 于4℃下以6 000转/min离心30 min, 弃残渣;继续在4℃下以12 000转/min离心30 min;上清液经超滤获取分子量在100 000以下[5~10]的SC粗提液, 真空冷冻干燥后, 4℃贮存备用。

2.2 鲨鱼软骨低分子蛋白体外对人脐静脉内皮细胞株HUEVC生长的影响

取对数生长期的HUEVC细胞, 用含10%胎牛血清DMEM培养液调整细胞浓度为5×103个细胞/ml, 体积为200μl, 铺96孔培养板, 复孔8孔, 体外培养12 h后更换为含低分子蛋白100μg/ml[4]的培养液, 体外培养48 h后以MTT法检测肿瘤细胞抑制率。抑制率 (%) = (对照组平均OD值-试验组平均OD值) /对照组平均OD值×100%。

2.3 鲨鱼软骨低分子蛋白体外对血管内皮细胞黏附的抑制实验

取对数生长期的HUEVC细胞, 用无血清培养液洗3次, 收集并重新悬浮在含有0.1%BSA的无血清培养液中, 浓度为5×105细胞/ml。将细胞种入96孔培养板 (40μl/孔) , 加入含低分子蛋白100μg/ml的无血清培养液, 于37℃孵育2 h。用Dulbecco’PBS液 (DPBS) 清洗细胞4次, 除去未黏附细胞;黏附细胞用20%甲醇稀释的0.5%结晶紫染色、固定、漂洗和空气晾干。用比例为1∶1的乙醇和0.1 mol/L枸橼酸钠溶液洗涤染色的细胞, 用酶标仪在540 nm波长测定吸收度 (OD) 。黏附抑制率 (%) = (对照组平均OD值-试验组平均OD值) /对照组平均OD值×100%。

2.4 鲨鱼软骨低分子蛋白体外对血管内皮细胞迁移抑制实验

配制2.0%琼脂糖溶液 (溶于PBS中) , 高压灭菌融化后, 铺24孔板, 每孔500μl, 使其凝固成胶。用灭菌刀片沿直径垂直切下, 去除二分之一的凝胶, 在此处加200μl含5×105细胞/ml的培养基, 培养24 h待细胞贴壁后, 小心移去剩余的一半凝胶, 倾去原培养基并用PBS冲洗。换含有低分子蛋白100μg/ml的DMEM培养基继续培养, 48 h后去除培养液, 用甲醇固定, 瑞氏染色, 显微摄影记录结果, 并计数相同迁移距离的不同迁移细胞数, 按下列公式计算迁移抑制率:抑制率 (%) = (对照组细胞数-试验组细胞数) /对照组细胞数×100%。

2.5 鲨鱼软骨低分子蛋白体外对鸡胚绒毛尿囊膜血管抑制实验

将受精鸡蛋放入在38℃、湿度40%~70%条件下孵化, 期间每日早、中、晚各翻动1次, 第5天时在鸡蛋气室端钻约1.0 mm2~2.0 mm2的小孔, 并穿透气室壳膜;在胚头右下方0.5 cm~1.0 cm处用小砂轮磨切开窗 (0.5 cm×1.5 cm) , 切破壳膜, 暴露出绒毛尿囊膜后, 用灭菌透明胶纸封窗制造一假气室, 继续孵化;第6天时选择2根主干血管间较少分支的部位, 加含100μg/ml低分子蛋白的PBS溶液20μl, 用灭菌透明胶纸封窗, 将鸡胚平置于恒温箱托架上, 孵化48 h后, 观察低分子蛋白对尿囊膜形成新生血管的影响, 并剪取鸡胚绒毛尿囊膜, 在显微镜下随机取一个视野数直径在0.2 mm~1 mm血管数, 并显微摄影记录结果。

2.6 统计学方法

计量资料用平均值±标准差表示, 自身比较及组间比较均用t检验或χ2检验, 采用SPSS10.0统计学软件进行统计分析。

3 结果

3.1 鲨鱼软骨低分子蛋白对HUEVC细胞株生长、黏附和迁移的影响

反复冻融法得到的低分子蛋白能有效地抑制HUEVC细胞株的生长[MTT法抑制率为 (42.026±3.530) %];低分子蛋白能有效地抑制HUEVC细胞株的黏附[抑制率为 (66.783±5.220) %]。低分子蛋白能有效地抑制HUEVC细胞株的迁移[抑制率为 (86.760±12.487) %]。结果见图1、图2。

3.2 鲨鱼软骨低分子蛋白对鸡胚绒毛尿囊膜血管的抑制

低分子蛋白能有效地抑制鸡胚绒毛尿囊膜的新生血管形成, 观察加药48 h后尿囊膜上直径在0.2 mm~1 mm之间的血管数目, 阴性对照组为 (18.00±2.87) 根, 低分子蛋白试验组为 (7.10±2.31) 根, 差别有统计学意义 (P<0.05) 。结果见图3、图4。

4 讨论

血管生成是实体瘤生长、浸润和转移的一个重要因素, 肿瘤血管生成已成为抗肿瘤治疗的新靶点。与传统的肿瘤治疗相比, 抗肿瘤血管生成药物主要针对已经启动的新生血管, 故具有特异性。而且血管内皮细胞暴露于血流中, 药物能直接发挥作用, 故有剂量小、疗效高、一般不易造成骨髓抑制、胃肠道反应或脱发等不良反应的优势。因此, 肿瘤的抗血管增生疗法仍是国内外的研究热点。

有研究表明[5], 鲨鱼软骨血管生成抑制因子 (SCAIF) , 其抑制作用主要发生在细胞周期的S期, 可抑制内皮细胞DNA的合成, 有抑制新生血管形成的作用。同时SCAIF对内皮细胞产生IL-6有抑制作用, 此抑制作用与剂量呈依赖趋势, 这一作用的产生可能与内皮细胞被抑制有关, 因为IL-6可由血管内皮细胞产生, 但形成这种现象的真正原因和其代表的功能机制尚有待于进一步的研究, 其抑制效应关系也将有待研究证实。

近20年来, 不同实验室从不同的SC中获得了相对分子量不同的活性蛋白。Oikawa等[1]从日本鲨鱼软骨中获得了对肿瘤和鸡胚胎血管生成具有明显抑制作用的提取物, 其相对分子量在1 000~10 000之间。Dupont[6]利用快速蛋白质液相层析等方法进一步分离鉴定, 发现活性蛋白相对分子量为2.5万, <1万, 1万~3万, 3~10万和>10万的组分对肿瘤细胞都有直接抑制作用, 而且随着分子量的递增抑制活性减弱。王路[7]等从姥鲨软骨中获得的SCAIF, 其相对分子量为16 100。我国台湾学者Sheu[8]等从青鲨软骨中分离纯化出两条多肽, 相对分子量为1万和1.4万。王树森[9]等从SC中获得了相对分子量为32 680的SCAIF。美国加州大学的Liang和Wong[10]从SC中分离纯化获得SCAIF其分子量大约为1万。沈先荣[11]等从我国沿海鲸鲨软骨中提取分离了两种高度纯化了的SCAIF1和SCAIF80, 它们的相对分子量分别为1.8万和8万。大量研究提取的SCAIF相对分子量多在100 000以下, 因此, 本实验选取分子量在100 000以下的SC低分子蛋白进行研究。

国内外几家实验室的研究均证实SC除了含有血管生成抑制因子, 同时含有肿瘤细胞抑制因子和丰富的酸性黏多糖[12]。只要在制备过程中去除SC中的血管生长因子等杂质, 尽可能提高低分子蛋白的含量, 就可能得到具有较好抗肿瘤作用的鲨鱼软骨制剂。鲨鱼软骨制剂在美国已应用于Ⅱ期临床, 在我国也已开始用SC胶囊用于荷瘤小鼠[13]及治疗晚期癌症患者[14], 取得良好效果。但至今国际上尚无人报道SC活性物质简易、高效的分离方法, 使SC制品在临床应用受到很大局限。我们通过改进工艺制备得到了SC低分子蛋白, 不仅可以抑制内皮细胞生长、黏附和迁移运动, 抑制肿瘤新生血管的形成, 而且未曾使用盐酸胍、丙酮等有害物质, 提取方法简单、造价便宜利于大规模生产, 有望进一步研发成一种经济有效的抗肿瘤新药。

低分子蛋白质 篇2

浅谈利用模型进行蛋白质分子结构教学的几点思考

蛋白质分子结构和功能的教学是新课标必修模块一中的重中之重,是帮助学生初步了解结构和功能相统一思想的最佳切入点.在教学中,教师可利用各种模型,让学生充分地理解蛋白质组成单位--氨基酸的.分子结构,从而扩展到整个蛋白质的分子结构乃至蛋白质的功能.

作 者：邵蕾 Shao Lei 作者单位：江苏省南通市南通中学,226001刊 名：中学生物学英文刊名：MIDDLE SCHOOL BIOLOGY年，卷(期)：25(8)分类号：关键词：

低分子蛋白质 篇3

1 材料

1.1 试剂

鲨鱼软骨低分子蛋白, 本研究组从鲨鱼软骨中获得, 分子量为10～100 kDa;胎牛血清 (Gibco公司) ;DMEM (Gibco公司) ;胰蛋白酶 (DIFCO公司) ;环磷酰胺 (CTX) (上海华联制药有限公司) ;其余试剂为国产分析纯。

1.2 小鼠及其分组情况

C57BL/6健康、雄性小鼠40只, 6周龄, 体重 (20±2) g中国科学院上海医药工业研究院提供, 合格证号:沪动合证字第107号。

查随机数字表, 将C57BL/6小鼠40只, 随机分为4组: (1) 生理盐水对照组; (2) 环磷酰胺对照组; (3) 鲨鱼软骨低分子蛋白组; (4) 鲨鱼软骨低分子蛋白+环磷酰胺组。

2 方法

2.1 移植性小鼠Lewis肺癌模型的建立

取对数生长的小鼠Lewis肺癌细胞, 调整细胞密度为2×107个细胞/ml, 接种于小鼠右腋皮下0.1 ml/只, 保留生长旺盛的荷Lewis肺癌肿瘤小鼠。取生长旺盛的荷Lewis肺癌肿瘤小鼠瘤组织, 无菌匀浆离心后, 用培养液调整肿瘤细胞密度为2×107个细胞/ml, 将其接种于小鼠右腋皮下每只0.1 ml。

2.2 药物干预

接种后第2天腹腔注射给药, 按小鼠体重0.1 ml/10g计算每只用药量, 每天给药1次, 连续10 d。 (1) 生理盐水对照组, 用生理盐水干预; (2) 环磷酰胺对照组, 用含环磷酰胺10 mg/ml生理盐水干预; (3) 鲨鱼软骨低分子蛋白组, 用含10 mg/ml鲨鱼软骨低分子蛋白生理盐水干预; (4) 鲨鱼软骨低分子蛋白+环磷酰胺组, 用含10 mg/ml鲨鱼软骨低分子蛋白和10 mg/ml环磷酰胺的生理盐水干预。

2.3 对移植性小鼠Lewis肺癌的疗效观察

解剖并完整地分离出皮下瘤块, 称瘤体质量, 按下列公式计算肿瘤抑制率。肿瘤抑制率 (%) = (对照组平均瘤重-给药组平均瘤重) /对照组平均瘤重×100%。

2.4 统计学方法

本文采用SPSS10.0统计学软件进行统计分析数据, 计量资料用均数±标准差表示, 自身比较及组间比较均用t检验。

3 结果

鲨鱼软骨低分子蛋白与生理盐水组相比差异有统计学意义 (P<0.01) , 肿瘤抑制率为 (44.625±5.630) %;鲨鱼软骨低分子蛋白+环磷酰胺组的肿瘤抑制率明显高于环磷酰胺组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结果提示, 鲨鱼软骨低分子蛋白有抑制荷Lewis肺癌肿瘤小鼠瘤体生长的作用, 虽然其肿瘤抑制率不及化疗药物环磷酰胺, 但对化疗药物有增强疗效的协同作用。见表1。

2组与3组比较 (t=17.9779, P=0.0000) , 3组与1组比较 (t=16.3253, P=0.0000) , 4组与2组比较 (t=9.5979, P=0.0142) 。

4 讨论

从海洋生物中寻找高效、低毒的抗肿瘤药物是近年天然药物研究的热点, 近年来, 许多学者和研究人员把目光转移至鲨鱼软骨血管抑制因子, 包括anti-MMPs[3]、anti-VEGF[4]、细胞凋亡因子[5]、t PA激活因子[6]等等, 通过拮抗内皮细胞生长因子、下调内皮细胞生长因子受体、下调内皮细胞表面黏附分子和促进内皮细胞凋亡等综合作用可抑制新生血管的形成。Boivin等[7]研究发现, 85μg/ml的鲨鱼软骨粗提物可引起内皮细胞DNA断裂和细胞凋亡, 进而达到抑制血管形成的功效。本研究组提取的SC低分子蛋白已证实[1,2]可以抑制血管内皮细胞生长、黏附和迁移运动, 抑制新生血管的形成。本实验又进一步证实鲨鱼软骨低分子蛋白能抑制实体瘤生长, 与化疗药物环磷酰胺联合使用有协同作用, 有望成为恶性肿瘤化学治疗的靶向新药, 并在其他血管增生性疾病中也会有广阔的应用前景。

摘要：目的观察SC低分子蛋白对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。方法选C57BL/6小鼠40只, 随机分为4组, 建立荷Lewis肺癌肿瘤小鼠模型, 连续给药10d后, 计算各组肿瘤抑制率。结果鲨鱼软骨低分子蛋白能抑制荷Lewis肺癌肿瘤小鼠肿瘤生长, 鲨鱼软骨低分子蛋白组与生理盐水组相比差异有统计学意义 (P<0.01) , 抑制率为 (44.625±5.630) %;鲨鱼软骨低分子蛋白+环磷酰胺组抑制率明显高于环磷酰胺组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论鲨鱼软骨低分子蛋白可抑制实体瘤的生长, 有望成为治疗恶性肿瘤及其他血管增生性疾病的新药。

关键词：鲨鱼软骨,低分子蛋白,抑制,肿瘤

参考文献

[1]尚俊英, 谢裕安, 杨帆, 等.鲨鱼软骨低分子蛋白的提取及其抑制新生血管形成的初步研究[J].广西医学, 2008, 30 (2) :156～158

[2]尚俊英, 谢裕安.鲨鱼软骨低分子蛋白对新生血管形成的影响[J].基层医学论坛, 2008, 12 (2) :157～159

[3]Falardeau P, Champagne P, Poyet P, et al.Neovastat, a naturally occur-ring multifunctional antiangiogenic drug, in phaseⅢclinical trials[J].Semin Oncol, 2001, 28 (6) :620～625

[4]Béliveau R, Gingras D, Kruger EA, et al.The antiangiogenic agent Neo-vastat (AE-941) inhibits vascular endothelial growth factor-mediated biological effects[J].Clin Cancer Res, 2002, 8 (4) :1242～1250

[5]Boivin D, Gendron S, Beaulieu E, et al.The antiangiogenic agent Neovasat (AE-941) induces endothelial cell apoptosis[J].Mol Cancer Ther, 2002, 1 (10) :795～802

低分子蛋白质 篇4

目的 在原核表达系统中表达脂多糖应激新分子编码的蛋白质.方法 PCR扩增Hlrg Cdna编码区,克隆入表达载体pcTAT中,构建成融合6His的`表达载体pcTAT-lrg,转化E.coli BL21(DE3),以IPTG诱导.表达产物用SDS-PAGE及凝胶光密度扫描分析,用Ni-NTA亲和层析柱纯化.结果 经过IPTG诱导4 h,表达出相对分子质量(Mr)约25 000的蛋白,占菌体总蛋白的51%.表达产物为可溶性的,用Ni-NTA亲和层析柱纯化的表达蛋白达到电泳纯.加入培养液中的纯化蛋白,可在30 min内进入HEK293细胞.结论 在E.coli中成功地高表达人Lrg融合蛋白,并对其进行初步纯化,为人Lrg功能的研究打下基础.

作 者：杜可军 常文辉 侯立朝 骆文静 刘承利 陈苏民 陈景元 柴玉波 DU Ke-jun CHANG Wen-hui HOU Li-chao LUO Wen-jing LIU Cheng-li CHEN Su-min CHEN Jing-yuan CHAI Yu-bo  作者单位：杜可军,骆文静,陈景元,DU Ke-jun,LUO Wen-jing,CHEN Jing-yuan(第四军医大学劳动与环境卫生学教研室,陕西,西安,710032)

常文辉,CHANG Wen-hui(陕西省疾控中心)

侯立朝,HOU Li-chao(第四军医大学西京医院,麻醉科)

低分子蛋白质 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年6月-2012年6月笔者所在医院妇产科收治的复发性流产患者60例, 年龄23~39岁, 平均 (29.3±4.2) 岁, 所有患者均具备复发性流产的条件: (1) 无家族遗传病史且夫妻双方染色体正常; (2) 无死胎、死产史且连续3次或3次以上复发性流产; (3) 男方精液分析正常且无其他内科合并症; (4) ACA阳性;同时排除先天性子宫畸形、子宫发育异常、甲状腺功能低下、黄体功能不全及合并严重内科疾病等患者。将其随机分为观察组和对照组两组, 每组30例, 其中观察组年龄23~38岁, 平均 (28.8±4.6) 岁;对照组30例, 年龄24~39岁, 平均 (29.2±3.8) 岁。两组患者一般资料方面比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 治疗方法

1.2.1 对照组采取传统保胎方法治疗

对照组30例患者给予肌内注射黄体酮20 mg/d, 用至10~12周, 同时服用维生素E100 mg/d, 治疗期间密切观察孕妇是否出现阴道流血及腹痛情况, 并定期进行产检及B超检查胎儿的发育情况。

1.2.2 观察组采用低分子肝素联合静滴丙种球蛋白治疗

静脉滴注免疫球蛋白500 mg/ (kg·d) , 每周连用3 d, 用至12~14周;皮下注射低分子肝素注射液0.4 ml, 2次/d, 注射期间应定期检测, 若B超检查示胎儿生长发育良好、孕酮正常、血h CG每3天即升高一倍及凝血纤溶正常时停药。若治疗期间患者出现牙龈出血情况, 应停药1~2 d后继续给药治疗。

1.3 观察指标

观察两组患者的保胎成功率及不良反应发生率。

1.4 疗效判定标准

(1) 治疗成功:妊娠至足月生产或未足月但获得活产儿; (2) 治疗失败:自然流产或者B超显示胎儿发育停止。

1.5 统计学处理

采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析, 计量资料用均数±标准差 ( ±s) 表示, 比较采用t检验;计数资料以率 (%) 表示, 比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者保胎成功率比较

观察组保胎成功率为86.67%, 显著高于对照组的33.33%, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。详见表1。

注:保胎成功率= (早产胎儿存活+足月产) /例数

2.2 两组患者不良反应发生情况比较

两组患者均未发生严重不良反应, 观察组出现1例过敏性皮疹, 1例牙龈出血, 上述症状在停药3 d后未进行任何处理, 患者自行缓解, 并继续用药治疗。两组患者不良反应发生率比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。

3 讨论

流产是临床妇科常见疾病, 对患者及其家庭造成的影响极大, 临床一般将连续出现两次以上的自然流产称之为复发性流产, 据统计其在妊娠中所占比例达5%。有关复发性流产的发病因素多样, 其中仅1/2为可识别病因, 主要涉及遗传因素、解剖因素、内分泌因素、感染因素和免疫学因素等。对于复发性流产, 相关研究指出免疫因素在复发性流产中占有重要地位, 和该病的关联密切, 约50%为免疫因素致病, 此结论为复发性流产的治疗提供了一定的依据。

临床传统保胎主要是针对内分泌因素, 如黄体功能不全、多囊卵巢综合征、糖尿病等, 对照组使用黄体酮治疗, 这种传统的治疗方法仅对黄体功能不全而导致的先兆流产疗效显著, 对其他病因或病因不明的复发性流产的保胎治疗效果较差[2]。具有强大抗凝作用的低分子肝素, 可以防止微血栓的形成, 虽然目前对其发挥作用的机制尚完全明确, 部分学者推断可能与其免疫抑制和免疫调节作用有关[3,4]。低分子肝素对孕妇血液高凝状态的改善效果明显, 使血液粘滞度及血管阻力降低了, 同时胎盘的血液供应得到增加, 孕妇的宫内微环境从根本上得到了改善, 对胚胎的生长发育起到了良好的促进作用[5,6]。低分子肝素不通过胎盘, 对胎儿无致畸作用, 用药安全性较佳。大量研究提示免疫因素是影响流产的主要因子, 因此免疫疗法逐渐被用于复发性流产的治疗中。丙种球蛋白是免疫球蛋白的主要成分, 丙种球蛋白注射是目前临床上应用较为广泛的一种被动免疫疗法, 主要用于免疫缺陷病和丙种球蛋白缺乏症的治疗。通过免疫疗法可以将免疫球蛋白所包含的大量抗体输给受者, 使之很快达到暂时免疫保护状态[7,8], 对细菌、病毒感染所致的流产也具有良好的预防控制作用。丙种球蛋白的治疗优点包括:不需要患者进行免疫学检查、对肝素联合阿司匹林或泼尼松治疗失败的患者也有效、对淋巴细胞主动免疫治疗无效者仍可使用、相对其他治疗方法可降低母婴并发症[9]。笔者通过对30例复发性流产患者采用低分子肝素联合静滴丙种球蛋白治疗发现保胎成功率86.67%, 显著高于对照组的33.33%, 两组比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。两种药物协同, 治疗效果显著提高, 由此可以推测免疫因素是造成复发性流产的主要因素。两组不良反应发生情况比较, 结果提示两组均未出现严重不良反应, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。说明低分子肝素联合静脉滴注丙种球蛋白对孕妇的健康危害轻微, 具有较高的安全性。邱海平等[10]通过对257例复发性流产患者分别采用5种方法治疗, 并进行了对比分析, 其结果与本次研究结果基本相符。

综上所述, 复发性流产的诱发因素多样, 该病以免疫因素为主, 临床治疗时要根据病因选择性治疗, 低分子肝素联合静滴丙种球蛋白对复发性流产中的疗效明显, 提高了保胎效果, 安全性高, 值得临床推广。

摘要：目的:观察分析低分子肝素联合静滴丙种球蛋白治疗复发性流产的临床疗效。方法:选取2011年6月-2012年6月笔者所在医院收治的复发性流产患者60例, 随机分为观察组和对照组, 每组30例, 观察组采用低分子肝素联合静滴丙种球蛋白治疗, 对照组采用传统保胎法, 观察两组的保胎成功率和不良反应发生情况。结果:观察组保胎成功率为86.67%, 显著高于对照组的33.33%, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;两组患者均未发生严重不良反应, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。结论:低分子肝素联合静滴丙种球蛋白治疗复发性流产, 保胎效果好, 安全性高, 值得临床推广。

关键词：低分子肝素,丙种球蛋白,复发性流产

参考文献

[1]张永红, 刘巧英.低分子肝素联合小剂量阿司匹林治疗自身免疫型复发性流产的疗效观察[J].中国实用医药, 2011, 6 (2) :62-63.

[2]黄佩贤, 刘倩, 张睿, 等.896例低分子肝素治疗复发性流产的观察与护理[J].现代医院, 2011, 11 (7) :92-93.

[3]秋娴, 龙启才.肝素在妊娠期疾病中的应用[J].医学综述, 2008, 14 (8) :1244-1246.

[4]王晓东, 刘兴会.抗凝剂的种类及其在妊娠中的应用[J].中国实用妇科与产科杂志, 2006, 22 (3) :165.

[5]陈巧儿, 秦卫兵, 叶嘉玲, 等.丙种球蛋白被动免疫治疗原因不明性反复性流产的研究[J].中国妇幼保健, 2007, 22 (23) :3260-3262.

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[7]桑艳萍, 徐静, 李艳红.静脉滴注丙种球蛋白联合低分子肝素联合治疗42例复发性流产临床疗效观察[J].中国性科学, 2013, 22 (6) :29-31.

[8]胡昭怡, 梁宝珠.小剂量阿斯匹林结合低分子肝素治疗复发性流产95例[J].长江大学学报自然科学版:医学卷, 2012, 9 (3) :15-16.

[9]林茹.低分子肝素联合静滴丙种球蛋白治疗复发性流产的疗效分析[J].中国医药指南, 2012, 10 (26) :578-579.

低分子蛋白质 篇6

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年5月至2012年6月来我院诊治的连续自然流产2次或2次以上的流产患者236例, 年龄23~37岁, 平均年龄 (28.2±2.5) 岁, 按照复发性流产所具备的条件: (1) 夫妻双方染色体正常, 无家族遗传病史; (2) 连续两次或两次以上复发性流产者过去没有死胎、死产史; (3) 排除女方生殖道畸形或感染; (4) ACA阳性; (5) 内分泌激素和优生筛查阴性; (6) 无其他内科合并症且男方精液分析正常; (7) ASAb (-) , Acp Ab (-) 。将符合以上各条的患者随机分为两组, 治疗组130例采取肝素联合丙种球蛋白治疗, 对照组106例采取传统方法保胎, 两组在年龄、流产次数等方面比较, 差异无统计学意义 (P<0.05) , 具有可比性。

1.2 方法

对照组肌内注射黄体酮20mg每天, 用至10~13周;同时口服VE (莱益, 浙江医药股份有限公司, 100 m g/粒) , 100mg Dd, 治疗期间严密观察孕妇是否有腹痛及阴道流血情况, 对其定期进行检查, 触诊及B超检查胎儿发育情况;治疗组130例患者对其近行肝素联合丙种球蛋白治疗, 方法为从孕周为5周起对孕妇静脉滴注丙种球蛋白450mg/ (kg·d) Qd每周连用2天, 用至12~13周;皮下注射低分子肝素 (速碧林, 葛兰素史克有限公司, 0.4m L/支, 含4100 IU) , 使用方法为0.4m L, 2次/d, 同样治疗过程中需定期检查胎儿生长发育良好的情况下, 每3天血HGG值翻倍上升, 孕酮值正常, B超检查显示胎儿发育与孕周相符合, 凝血纤溶指标检测项目恢复正常, 立刻停药。停药后定期检查, 每月对凝血纤溶指标进行检测, 有异常时重新用药, 同时用药七天以上有牙龈出血者, 停药1~2d后继续使用。

1.3 疗效标准

成功标准:妊娠维持至足月生产, 或者未足月但获得活产儿, 此为治疗成功;失败标准:发生自然流产, 或者B超显示胎儿发育停止, 即为治疗失败。

1.4 统计学处理

观察两组数据进行结果比较, 卡方检验, 应用SPSS11.0软件完成数据的统计处理。以P<0.05, 说明有显著差异, 有统计学意义。

2 结果

2.1 两组妊娠成功率比较

(1) 治疗组:妊娠成功率为89.2% (115/130) , 失败15例; (2) 对照组:妊娠成功率为30.1% (31/106) , 失败75例;见表1。

两组间有显著差异 (P<0.05) , 可见治疗组疗效明显高于对照组。

2.2 不良反应

治疗组及对照组均未发生严重不良反应, 治疗组中发现个别患者出现一些药物过敏及牙龈出血的现象, 其中包括5例过敏性皮疹, 3例牙龈出血, 上述症状可在停药后3天缓解无需进行任何处理。

3 结论

临床上, 常常会遇到原因不明的反复性流产者, 医院通常会对此类患者给以常规胞胎治疗为主, 即采用黄体酮、绒毛膜促性腺激素治疗, 但这种方法只对黄体功能不全导致的先兆流产起作用。其对免疫功能导致的复发性流产疗效甚微。临床发现大部分反复性流产与免疫学异常有关, 一种情况是由于夫妇的白细胞抗原相容性过高, 受孕以后母体不能产生对胚胎有保护性的“封闭抗体”, 因此, 母体免疫细胞对胎儿产生强烈的排斥现象, 导致胚胎受到攻击而停止孕育。另一种现象是, 由于患者自身的免疫系统紊乱, 产生各种对抗自身组织器官的抗体, 这些抗体也可以破坏胚胎组织和营养胚胎组织的胎盘细胞, 导致胚胎死亡。

本研究采用低分子肝素联合丙种球蛋白旨在治疗因免疫系统紊乱 (ACA) 导致的复发性流产, 有文献报道ACA导致流产的原因很多其中主要包括[3]: (1) 导致蜕膜血管病变; (2) 引起了炎性反应; (3) 导致血栓形成; (4) 干扰胎盘形成合体滋养层。低分子肝素在治疗复发性流产中发挥的机制尚不明确, 文献报道可能与它的免疫抑制和免疫调节有关。低分子肝素通过改善孕妇高凝状态的血液, 从而使血管阻力及血液粘稠度降低, 这就增加了胎盘有血液的供应, 也改变了子宫内的相应微环境, 进而促进胎儿的发育生长。另一方面低分子肝素还具有安全, 不导致畸型的优点, 因为他不通过胎盘吸收。

丙种球蛋白是一种被动免疫疗法, 它把免疫球蛋白内含有的大量抗体输给受者, 使之从低或无免疫状态很快达到暂时免疫保护状态[4]。选择丙种球蛋白治疗该类复发性流产的优点可总结为以下几点: (1) 淋巴细胞主动免疫治疗无效的患者可继续选择此方法; (2) 产妇无需做复杂的免疫学检查; (3) 对阿司匹林联合肝素治疗失败的患者仍可使用; (4) 和其他方法相比较可降低母婴的并发症。

本研究旨在研究低分子肝素联合丙种球蛋白对复发性流产的疗效分析, 经过两组患者实验对比, 明显发现采用此方法较之前的传统保胎方法对复发性流产的预防有明显的治疗效果, 但是针对低分子肝素的作用机制尚不明确, 还需要继续深入探讨和研究;丙种球蛋白对该类流产的预防是有治疗意义的, 它对于治疗抗磷脂抗体阳性的复发性流产患者的机制经文献报道, 可能是因为该药物增加了自身抗体的清除率;通过与B细胞的抗原受体结合一级调节受体, 通过FC受体的阻断减少抗磷脂抗体对血小板的结合和激活。

综合来看两种药物的结合综合了各自的优点, 发挥各自的治疗功能, 从而产生了本研究的理想结果。治疗组成功率明显高于对照组, 具有统计学意义, 实验结果提示我们:低分子肝素联合丙种球蛋白治疗复发性流产疗效高, 安全性强, 值得我们进一步研究。

参考文献

[1]张健平, 黄涛威.保胎药物的临床应用[J].中国实用妇科与产科杂志, 2008, 24 (6) :422-425.

[2]刘玉昆, 张建平.IV/IG在复发性自然流产中的应用[J].中国处方药, 2006, 9 (54) :41-43.

[3]王晓东, 刘兴会.抗凝剂的种类及其在妊娠中的应用[J].中国实用妇科与产科杂志, 2006, 22 (3) :165.

低分子蛋白质 篇7

1 资料与方法

2013年5月~2014年1月本院治疗流产者45例, 年龄24~45岁, 平均年龄33.57岁, 均具备以下条件: (1) 连续2次以上复发性流产者, 过去没有死胎、死产及活产史; (2) 抗心磷脂抗体 (ACA) 间隔6周以上2次阳性; (3) 排除女性子宫颈机能不全、生殖道畸形或感染; (4) 内分泌激素和病毒四项筛查阴性; (5) 夫妻双方染色体正常; (6) 无其他内科合并症; (7) 男方精液检查正常及抗精子抗体、支原体、衣原体均为阴性, 无传染性疾病。

1.2 方法

1.2.1 用药方法

拜阿司匹林:孕前3个月至孕后12周口服100 mg, 1次/d。地屈孕酮片:排卵后口服10 mg/次, 3次/d;12~33周2次/d。强的松片:口服5 mg/d, 12周后停用。低分子肝素钙:排卵后0.4 ml皮下注射, 1~2次/d, 直至妊娠12周。病情需要可延至妊娠33周。注射方法:患者取卧位, 注射部位为前外侧或后外侧腹壁的皮下组织内, 左右交替。该药出厂时在注射器内留有与注射器乳头及针梗容积相同的气体, 在注射前不要按常规将气体排出, 注射针垂直, 完全插入注射者用拇指和食指捏起的皮肤皱褶内, 不要水平注入。丙种免疫球蛋白:从确定宫内妊娠后开始静脉滴注丙种球蛋白一个疗程 (5.0 g/d, 连续使用3 d) , 4周1个疗程, 连续3个疗程。

1.2.2 护理

1.2.2. 1 心理护理

习惯性流产的患者, 容易产生不同程度的恐惧、焦虑、失落、抑郁的心理[1], 严重影响患者的生活质量[2]。此时患者的心理问题甚至重于身体疾病。护士要和患者进行沟通交流, 了解患者对于药物治疗、治疗后效果和方法选择的认知程度, 通过交流, 分散她们注意力[3]。护士用友善同情的态度对待孕妇, 让孕妇产生信任感, 积极配合治疗。

1.2.2. 2 产科护理

观察有无腹痛, 阴道流血的量及颜色, 嘱保留会阴垫, 以便准确记录出血量。保持外阴清洁, 防止逆行感染的发生。指导孕妇学会自我监测, 能正确识别腹痛等异常症状, 及时向医生反映病情变化。

1.2.2. 3 健康指导

患者要保持愉悦的心情, 多听音乐缓解紧张情绪。饮食做到营养均衡, 多食用富含膳食纤维的食物预防便秘。对于需要卧床休息的患者可在适当做抬举上肢、屈伸膝关节等运动。定期做产前检查, 如出现腹痛及阴道流血及时就诊。妊娠3个月内和7个月以后避免性生活。

2 结果

2.1 疗效 以妊娠维持至28周获得有生机儿为治疗成功。45例中41例取得成功, 成功率为91.1%, 其余4例流产。

2.2 患者不良反应 45例中, 5例出现过敏性皮疹, 停药1d自行缓解。

2.3 患者能正确评估自身病情变化, 积极配合治疗, 心理状态稳定。

3 讨论

现在常规保胎治疗、或中药安胎治疗仍是我国治疗复发性流产的的常用方法, 但疗效不一[4]。丙种球蛋白联合低分子肝素钙等药物治疗复发性流产是近几年来应用的新方法, 我院应用其治疗患免疫性复发性流产的患者取得明显的效果。医生对患者治疗侧重于病情的治疗用药, 缺乏更多的时间来关心患者的心理感受。护士配合医生对患者开展有效的护理干预, 通过教育使其学会照顾自己的方法, 能正确观察病情变化。

作者认为丙种球蛋白联合低分子肝素钙等治疗复发性流产成功率高、安全、有效。同时做好患者的护理是保证妊娠成功的关键。

参考文献

[1]康威.浅谈先兆流产患者心理分析与心里护理对策.中医药导报, 2007, 4 (4) :74.

[2]邵丽丽.不孕不育患者的心理护理及健康教育.中国实用医药, 2008, 3 (4) :120-121.

[3]胡秀芬.心理干预对习惯性流产的心理研究.临床和实验医学杂志, 2010, 5 (9) :763.

低分子蛋白质 篇8

1 分子伴侣与蛋白复性

1.1 分子伴侣的定义和类型

1978年, Laskey 发现组蛋白和DNA在体外生理离子强度条件下重组时必须要有一种细胞核内的酸性蛋白-核质酸 (nucleoplasmin) 存在时, 两者才能组装成核质体, 否则就发生沉淀, 据此Laskey称这种物质为“分子伴侣”。随后分子伴侣的概念几经修正, 现在分子伴侣是指能够结合和稳定另外一种蛋白质的不稳定构象并能通过有控制的结合和释放促进新生多肽的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输等的一类蛋白。经研究表明分子伴侣是一组在胞内活动中起重要作用的多种蛋白质和酶的总称。分子伴侣可分为3类。第1类是普通意义上的分子伴侣, 目前已鉴定的主要是在进化上非常保守的热休克蛋白 (heat shock protein, HSP) 的3个家族:Hsp60 (GroEL) 家族;Hsp70 (Dnak) 家族, 包括Hsp70, HSC70, p75, BIP以及GRP78;Hsp90 (HrpC) 家族, 包括Hsp90和Grp94/Grp96。第2类是具有酶活力的分子伴侣, 又称折叠酶。至今已经发现的有2个折叠酶: (1) 蛋白质二硫键异构酶 (phosphodiesterase, PDE) , 可以防止二硫键的错配和分子间聚合; (2) 肽基脯氨酰顺式异构酶 (protein disulfide isomerase, PDI) , 它可以催化以脯氨酸异构反应为限速步骤的蛋白质的复性, 提高复性速率。现已证明这2种酶既是酶又是分子伴侣[2]。第3类是分子内伴侣 (intramolecular chaperone, IMC) , 研究表明许多合前导肽 (Pro) 肽的前体形成合成的蛋白质折叠与成熟必须要有Pro肽的存在才能完成, 这类前导肽就称为体内分子伴侣[3]。由于体内分子伴侣不易与复性蛋白分离, 所以实际应用时体外分子伴侣较为方便。常用的分子伴侣有GroES/GroEL, DnaK/DnaL, TrxA/TrxC。

1.2 分子伴侣在蛋白质复性中的作用

除了共价的肽键和二硫键外, 还需要大量复杂的次级键共同作用来维持蛋白质分子三维结构, 因而蛋白质在复性过程中既肽链折叠过程中可能暂时形成最终活性蛋白中不存在或不该有的结构, 它常是一些疏水表面, 它们之间很可能发生本不该有的错误的相互作用而形成无功能的蛋白, 甚至造成变性蛋白的聚集和沉淀。蛋白质的复性过程是一个正确途径和错误途径相互竞争的过程, 为了提高蛋白质复性的效率, 应该有帮助正确途径的竞争机制, 而分子伴侣就能使蛋白质获得正确的构型, 这种过程是通过与变性蛋白质在复性中暴露的反应表面结合, 从而阻止这些反应表面与其他区域作用产生不正确的构型来完成的。分子伴侣是一类与蛋白质的不稳定构象相结合并使之稳定。它在蛋白质复性过程中主要起2个作用: (1) 帮助变性蛋白质完成正确的折叠; (2) 在ATP的存在下负责对正在复性或复性好的蛋白质进行监控, 防止蛋白质错误折叠。

1.3 分子伴侣GroE在蛋白复性中的应用

GroE是最常用的分子伴侣, 也是近年来研究的热点, 来源于大肠杆菌的Chaperonin家族。GroE有2种分子量不同但氨基酸顺序相关的蛋白, 大的称GroEL, 由14个分子量约57kD相同亚基形成双层饼状, 具有三磷酸腺苷 (ATP) 酶的活性, 在辅助肽链的折叠过程中需要ATP的存在, 水解ATP释放底物蛋白和能量;小的称GroES, 由7个分子量约10kD相同亚基形成单层饼状, GroES具有促进GroEL折叠肽连的作用。现在GroE在辅助蛋白质体外复性的作用已被许多研究所证实:Buchner等在极易凝胶沉淀的柠檬酸合成酶的复性过程中添加GroE辅助复性, 使复性率达到28%, 而无GroE存在时复性率低于3%;郑平华等[4]在重组人γ-干扰素复性过程中加入GroEL、GroES, 使得重组人γ-干扰素复性率由6.4%提高到50%以上, 比活从6.6×104U/mg增加到1.0×107U/mg, 这些结果充分显示了分子伴侣在蛋白质复性中的应用前景, 但由于分子伴侣不能重复利用, 这样用分子伴侣辅助蛋白复性的费用十分昂贵。现在这个问题已得到解决, 董晓燕等[5]利用甲酰基纤维素凝胶固定化GroE, 研究了其对变性溶菌酶的复性作用, 结果显示在37℃、pH6～8条件下, 溶菌酶的复性率在85%以上, 而且固定化GroE可反复利用5次, 每次的复性率无明显变化, 保持在82%～88%, 解决了分子伴侣的重复利用问题, 表明固定化GroE有可能在实际生物下游工程中得到利用。

2 小分子伴侣与蛋白复性

近几年来利用固定化小分子伴侣来辅助蛋白复性的研究越来越多。“小分子伴侣”是指GroEL顶端区域氨基酸残基191-345的片段, 其N端融合了由17个氨基酸组成的组氨酸标签, 由Zahn等于1996年首次构建, 该片段可以在大肠杆菌中表达, 其发酵产量可达到556.3mg/L[6]。其作用原理是它们保留了GroEL顶部区域的多肽结合部位, 能够和底物蛋白质以1∶1形成瞬间的结合物, 使变性蛋白质相应的成单分形式, 从而防止多肽链的错误折叠, 抑制聚集体的形成保证在隔离的条件下进行复性。小分子蛋白辅助蛋白复性的优点在于分子量较小易于表达, 且不需要ATP的辅助作用, 更多适用于固定化。Altamirano等[7]将它和PDE (蛋白质二硫键异构酶) 、PPI (肽基脯氨酰顺式异构酶) 2种酶联用使利用其他方法很难复性的蝎毒Cn5的复性率达到98%。亲环蛋白A (Cyclophilin A) 和吲哚3-甘油磷酸合成酶 (IGPS) 在GroEL (191-345) 的辅助下复性率分别达到87%和92%[8], 而且小分子伴侣能有效的促进硫氰酸酶以及芽孢杆菌RNA酶的复性。Myrianm等人成功将小分子伴侣固定在琼脂糖上, 对几种难以复性的蛋白实现了高效复性, 并利用固定化小分子伴侣在色谱拄上对包涵体中的不溶蛋白以及贮存中失活的蛋白实现了高效复性。关怡新等[9]在重组人γ-干扰素 (rhIFN-γ) 体外复性中, 初始蛋白质浓度为100mg/L, 加入GroEL 191-345, 复性后蛋白回收率提高了2.2倍, 活性提高了近3倍。将GroEL 191-345固定在NHS-activated Sepharose Fast Flow 凝胶后, 不但能重复利用, 而且进一步提高了rhIFN-γ复性效率, 在初始蛋白质浓度为400mg/L时, 蛋白回收率达到46.29%, 比活为1.95×107U/mg。

3 人工分子伴侣与蛋白复性

人工分子伴侣主要模拟天然分子伴侣GroES/GroEL的功能, 小分子去污剂能与变性蛋白结合形成复合物, 掩蔽其暴露的疏水基, 从而阻止蛋白质的凝聚, 去污剂的作用类似于GroEL, 当加入β-环糊精后使去污剂从蛋白质上剥离, 蛋白质就逐渐复性, β-环糊精的作用类似于ATP和GroES。

近年来用小分子去污剂和β-环糊精 (β-CD) 合成人工分子伴侣来辅助蛋白质复性也得到了广泛的研究应用, 而且相比分子伴侣高昂的费用, 人工分子伴侣具有成本低廉、性质稳定等优点。王颖等[10]利用人工分子伴侣十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 和β-CD与凝胶过滤色谱耦合来进行溶菌酶复性, 结果表明在连续复性操作条件下可使进料浓度为1mg/ml的变性酶获得89%的复性率, 相比于单纯凝胶过滤色谱的复性率48%提高了80%。张晓栓等[11]在重组内抑素复性中加入 SDS和β-CD, 比例为1∶4, 在pH 8.0, Tris-Hcl 100mm条件下, 复性回收率达到89%。王新华等[12]利用人工分子伴侣十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 和β-CD系统辅助复性鸡IL-18重组蛋白 (rCHIL-18) , 复性率为42.54%, 而盐酸胍-去离子水透析法复性率为10.67%, 盐酸胍-谷胱甘肽复性率为14.83%, 所以人工分子伴侣能够很好的提高rCHIL-18的复性率。

4 讨 论

与传统的稀释、透析复性等方法相比, 尽管添加分子伴侣、小分子伴侣以及合成人工分子伴侣能够显著提高蛋白复性率, 为其在蛋白复性的应用方面奠定了一定的基础, 但它们仍然是处于发展阶段, 要开发出生产规模的复性系统还需进一步研究。而且在蛋白质药物实际的生产过程中, 究竟采用何种复性工艺, 不仅要考虑技术的可行性, 还要从蛋白质药物的申报工艺验证要求、下游工艺、制剂处方、生产工艺的稳定性、技术经济性等方面进行综合考虑。

低分子蛋白质 篇9

紫外-可见分光光度法是分子吸收光谱法, 涉及分子的价电子在不同分子轨道间能级的跃迁, 对应的光谱范围为200~800nm。紫外-可见吸收光谱包括紫外吸收光谱 (200~400nm) 和可见吸收光谱 (400~800nm) 。紫外-可见分光光度法主要用于分子的定量分析, 但紫外光度法为四大波谱之一, 是鉴定许多化合物, 尤其是有机化合物的重要定性工具之一。随着科学技术的发展, 结合现代的光、电和计算机技术, 紫外-可见分光光度法具有灵敏度高、准确度好、仪器价格低廉、操作简便快速等优点, 使紫外-可见分光光度法在有机化学、生物化学、药品分析、食品检验、医疗卫生、环境保护、生命科学等各个领域和科研生产工作中成为一种重要的检测手段[3]。当用荧光偏振光激发荧光分子时, 荧光分子发射偏振光。这种偏振发射是由荧光分子对激发光子的取向引起的。实验测得的荧光通常是消偏振的。其中最具有研究意义的是由于荧光分子在激发态寿命期间发生旋转运动而引起发射消偏振。Perrin早在1926年就报道过荧光偏振的原理, 而Weber进一步拓展了荧光偏振的理论。荧光偏振测定已广泛地应用于生命科学、临床医学、药物分析和环境科学等领域。近年来, 有不少关于荧光偏振的研究与应用的综述发表。荧光偏振理论将荧光分子看成是一个振荡偶极子 (oscillating dipole) , 有内在的 吸收偶极 矩 (absorption dipole moment) 和发射偶极矩 (emission dipole moment) , 也称吸收跃迁矩 (moment for absorption transi tion) 和发射跃迁矩 (moment for emission transition) 。由于荧光分子的电子基态和电子激发态的电子分布不同, 荧光分子的吸收偶极矩和发射偶极矩通常是不共线的。吸收偶极矩和发射偶极矩之间的夹角对每个荧光分子而言是由分子结构决定的。当用非偏振光激发荧光分子时, 荧光分子优先吸收那些光子电矢量 (E) 与荧光分子的吸收偶极矩 (M) 平行的光子[4]。

蛋白质是生命的最基本物质之一, 它与营养、发育、遗传、新陈代谢等生命活动等密切相关, 牛血清蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 在血浆中是含量较为丰富, 是最重要的载体蛋白, 具有存储和转运内源性和外源性代谢产物的重要生理功能。因为蛋白质中含有络氨酸和色氨酸, 所以它在紫外线照射下会发出紫外线荧光, 因此可以进行荧光测定。蛋白质与某些荧光染料作用, 有时会使染料的荧光强度增强, 但有时也会使染料的荧光强度减弱, 这些都视染料的自身性质而定, 但均可用于蛋白质的检测。并且由于其干扰少、快速、灵敏度高、准确、实用性高而发展很快, 引起研究者的密切关注。

丽春红S (Ponceau S) (又名猩红S, 酸性红112) 是一种带负电荷, 可以与带正电荷的氨基酸残基结合, 在水中的溶解度为10 g/L的偶氮染料。

本文以牛血清白蛋白为血液中生物大分子的代表, 在模拟生理条件下 (p H=7) , 应用荧光偏振技术, 采用荧光光谱法、紫外-可见分光光度法, 研究丽春红S与牛血清白蛋白相互作用的光谱, 对进一步探讨丽春红S对蛋白质染色机理具有一定的意义。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

LS-55荧光分光光度计 (美国, PE公司) ;UV-2550紫外分光光度计 (日本岛津, 日本) ;F-7000荧光分光光度计 (日本, 日立公司) ;电子天平: (AB135-S, Switzerland) , 100ul微量进样器, 移液管, 10ml具塞刻度试管20支;BSA固体 (Sigma) , 丽春红S (上海抚生实业有限公司) , 磷酸二氢钠, 磷酸氢钾, 实验用水均为三次水, 所用试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 配置 PBS 缓冲溶液 (p H=7.4 0.01M)

(1) 用电子天平准确秤取0.0241g磷酸二氢钠, 0.2316g磷酸氢钾, 将其溶于水中, 转移到100ml容量瓶中, 定容, 摇匀。

(2) 用PH试纸将其调至p H=7。

1.2.2 配置 BSA 母液 (C=1mg/ml)

(1) 用电子天平准确称取25 mg BSA固体, 将其溶于水中, 转移到25 ml棕色容量瓶中, 定容, 摇匀。

(2) 取BSA母液0.25ml将其置于25ml棕色容量瓶中, 定容, 摇匀。得到BSA溶液的浓度为10g/ml。 (实验所用BSA浓度均为10g/ml) 。

1.2.3 配置工作液 (丽春红 S) 母液 (C=1 m M)

(1) 用电子天平准确称取0.3800g丽春红S固体, 将其溶于水中, 转移到50ml棕色容量瓶中, 定容, 摇匀。

(2) 取上述母液5ml将其置于50ml棕色容量瓶中, 定容, 摇匀。得到丽春红S溶液的浓度为100M。

(3) 取100M的溶液0.5ml将其置于50ml棕色容量瓶中, 定容, 摇匀。得到丽春红S溶液的浓度为1M。

1.2.4 配置一系列浓度梯度的样品溶液

溶液浓度 依次为1n M、2n M、5n M、10n M、20n M、50n M、100n M、200n M、500n M、1M、2M、5M、10M、20M、50M、100M。

1.3 荧光光谱的测定

1.3.1 确定最大 Ex、Em 的波长

(1) 测BSA的Ex、Em光谱确定最大Ex、Em的波长。 (Ex=280nm, Em=349nm)

(2) 以测BSA的参数测PBS的Ex、Em光谱。

(3) 按浓度由低到高依次换上1.2.4中配置的BSA-染料溶液并测其Em光谱。

1.3.2 测定 FP

(1) 测定BSA的FP。

(2) 按浓度由低到高测定1.2.4中配置的BSA-染料样品的FP。

1.3.3 在紫外区测定丽春红 S 的荧光强度。

1.4 紫外光谱的测定

配置一系列样品溶液 (0—3M) 并稀释至10ml;设置仪器参数, 进行光谱扫描。

2 实验结果与讨论

2.1 最大 Ex、Em 波长的确定

实验结果显示, BSA的最大Ex=280nm、Em=349nm。

2.2丽春红S对牛血清白蛋白内源性荧光的猝灭

牛血清白蛋白分子中含有的氨基酸, 如色氨酸 (Tyr) 、酪氨酸 (Trp) 和苯丙氨酸 (Phe) 残基, 能够发射荧光, 因而牛血清白蛋白是内源性荧光物质。由于牛血清白蛋白的内源荧光可能发生Tyr至Trp的转移, 当激发光波长为280nm时, 牛血清白蛋白荧光发射峰位置在349nm附近。随着丽春红S浓度增加, 荧光峰强度有规律地降低, 但在图1中荧光峰的位置没有发生特别明显的移动, 说明丽春红S与牛血清白蛋白的相互作用没有引起蛋白质空间结构的明显改变, 因此产生的是内源性荧光猝灭。

CBSA=10ug/ml、从上到下丽春红S浓度依次为:1:0、2:1n M、3:5n M、4:20n M、5:50n M、6:100n M、7:200n M、8:500nM、9:1μM、10:2μM

2.3 丽春红 S 的浓度与吸光度的关系

用紫外可见吸收光谱研究丽春红S的浓度与吸光度的关系, 分析发现, 随着丽春红S浓度的增加, 吸光度值逐渐增加。在280n M左右的吸收峰是BSA的吸收峰。在350n M、530n M左右的吸收峰是丽春红S + BSA的吸收峰。实验中所用溶液浓度:丽春红S+BSA的浓度 (3:0.2M, 4:0.5M, 5:3M) ;丽春红S+PBS的浓度 (系6:3M) 1:PBS

2.4丽春红 S 的浓度对荧光偏振强研究丽春红 S F0/F-C 关系

实验发现, 随着丽春红S的浓度的增加, F0/F呈增强的趋势。 (F0是BSA的荧光强度, F是丽春红S+BSA的荧光强度) 。 丽春红S浓度依次 为 :20n M、50n M、100n M、200n M、500n M、1000n M、2000n M

得出关系式F0/F=0.0011C+1.1435

3 结论

(1) 通过荧光光谱发现, 一系列不同浓度的丽春红S溶液, 随着丽春红S浓度的增加, 荧光峰强度减弱, 出现了荧光猝灭现象。说明丽春红S能对牛血清白蛋白内源性荧光产生猝灭作用。实验中若不加入BSA, 只加入丽春红S和PBS, 不论是在可见光区还是在紫外区荧光强度均很小, 说明丽春红S自身的荧光强度很小。

(2) 在紫外可见吸收光谱中随着丽春红S浓度的增大, 吸光度逐渐增强;当丽春红S浓度相同时, 只有丽春红S的吸光度值比丽春红S+BSA的吸光度值大。

(3) 当丽春红S的浓度在0-2000n M范围内, 随着丽春红S的浓度的增加, 其荧光偏振强度 (F0/F) 呈增强的趋势。

摘要：采用荧光偏振技术, 运用荧光光谱法、紫外光谱法和三维荧光光谱法研究了在p H=7的PBS缓冲介质中, 不同浓度的丽春红S (Ponceau S) 和一定量牛血清白蛋白 (bovine serum albumin, BSA, 以下简称BSA) 的光谱作用。荧光光谱表明随着染料浓度的增加, 荧光偏振强度 (FP) 呈下降的趋势, 其关系式为:F0/F=0.0011C+1.1435, R=0.9938, 说明丽春红S与BSA相互作用产生了荧光猝灭;紫外光谱表明, 随着染料浓度的增加, 吸光度呈增大的趋势。

关键词：荧光光谱法,紫外光谱法,丽春红S,牛血清白蛋白,荧光偏振,荧光猝灭作用

参考文献

[1]许金钩, 王尊本.荧光分析法[M].北京:科学出版社, 2006:7-8.

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