蛋白组学

蛋白组学（精选10篇）

蛋白组学 篇1

随着人类基因组图谱绘制的完成, 生命科学进入了后基因组时代, 因此, 诞生了一门在蛋白质水平上的新学科“蛋白质组学”。随着蛋白质组学技术的飞速发展, 以及用于蛋白质鉴定和功能推测的生物信息学的不断发展与完善, 蛋白质组学已成为鉴定疾病相关标记和治疗靶点的有效工具, 并对生命科学产生了深远的影响[1]。

为迎接更全面的生命科学的发展, 提高生物科学专业学生适应学科发展的需要的能力, 我们学院专门开设了针对生物科学专业的限选课程———蛋白质化学与蛋白质组学。本课程在介绍蛋白质化学基本内容的同时, 兼顾学科发展动态, 使学生掌握蛋白质组学的基本理论、基础知识、主要研究方法和生物信息学在蛋白质组学及蛋白质工程方面的应用及典型的研究实例, 力求增长生物科学专业学生的专业知识与技能, 为完成毕业论文设计及今后从事生命科学相关工作打下坚实基础。课程开课几年来, 笔者及同教研室课题组对蛋白质化学与蛋白质组学课程的教学理念、教学内容、教学方法, 教学效果评价方式进行了积极的实践与探索。

一教师本身要努力提高教学质量

蛋白质化学与蛋白质组学的授课对象是生物科学专业本科三年级的学生。该阶段的学生面临毕业论文设计及准备考研两大难题, 对此, 本课程的教学目标应该是养成学生的科研思维, 提高实验设计水平, 培养其动手能力。这就要求教师必须更新教育理念, 改变以往理论课单向授课的方式, 要认识到此时的教学课程必须以学生为中心。因此, 教师在精心准备教案讲义, 认真制作多媒体课件的同时, 应当思索如何灵活地运用各种教学方法, 引导学生的兴趣, 并使学生参与到教学过程中来。提高教师自身的理论水平和科研能力, 改革教师课堂教学方法和教学结构, 认真研究学生的认识规律和学习方式, 培养学生的学习兴趣, 充分调动学生的主观能动性是提高教学质量所必需的。在教学过程中, 教师扎实的理论基础、丰富的科研经验、熟练的实验操作水平是引导教学成功的先决条件。

二教学理念要转变, 教学方式要灵活

“以学生为中心, 以能力培养为导向”这一理念近年来备受教师关注和学生欢迎[2]。这一理念强调由教师引导, 确定教学目标, 学生为中心和主导, 根据教学目标, 主动收集整理资料, 自主探究相关知识, 发现问题, 分析问题, 解决问题, 最后由教师总结, 将学习的主动权真正交还给学生。这样, 教师与学生在发现分析解决问题的过程中, 各自完成教学任务, 效率和认知度远超过以往单向的教授方式。

由于该门课程为限选课, 选课学生维持在25~40人左右, 因此, 教师从备课开始就应以灵活的方式与学生去沟通。在课堂上, 我们在进行多媒体教学的同时, 增加与学生的互动, 及时掌握学生的兴趣点与理解程度, 可以充分调动学生的积极性。实践证明, 教师更新教学理念, 提高教学质量, 对于端正学风, 提高学生的积极性有着积极的作用。

生命科学是一门实践性很强的科学, 因此理论与实践相结合是完成教学任务的必经之路。因此, 笔者根据课程的教学内容和学生的理论水平及兴趣点, 经常开展各种课间讨论, 促进学生深刻并灵活地掌握知识。笔者常采用以下方式:首先, 生命科学是一门发展迅速的科学, 与医学、社会学等学科有交叉, 且与我们的生活生产密切相关。因此, 灵活地举例对于培养学生的学习兴趣显得十分重要。例如, 北京蛋白质组学研究中心是我国蛋白质组学国家重点实验室, 作为国际人类肝脏蛋白质组计划实行总部, 目前该中心已成功鉴定人类肝脏蛋白质13000余种, 并绘制了高可信度的肝脏蛋白质互作图谱, 发现了58种潜在的肝脏疾病候选基因等。像常见的脂肪肝、肝炎病毒感染、肝癌癌变及转移等标志蛋白质陆续被发现, 为今后肝脏相关疾病的预防及治疗打下了坚实的基础。通过这一举例, 既能够增强学生对蛋白质组学的认可度, 且因为该项目为我国自主研究项目, 能够为学生提供今后科研的方向, 也能增强学生的科研信心。其次, 安排学生参加教学实验或科研实验, 引导学生有意识地学会科研思维, 激发学生学习兴趣, 培养其分析问题和解决问题的能力。例如, 通过让学生参与笔者主持或参与的科研课题, 了解科研实验的实施过程, 在此过程中理解并掌握所学知识。再次, 指导学生进行实验设计和科研设计, 培养其科研能力。例如, 让学生根据需解决的科研问题和掌握的实验方法等, 指导其通过参考文献等方法进行初步的实验设计及课题研究报告的撰写。近年来, 笔者已指导学生撰写科研课题研究报告多项, 并获学校及学院立项, 极大地提高了学生的信心和兴趣。此外, 为了提高课程的实用性, 提高学生的动手能力和解决问题的能力, 笔者所在学院开设了开放实验课程, 我们鼓励学生主动地进行实验设计, 习得相应的实验技能。

三考核方式和教学效果评价方法要改进

高校的选修课程普遍采用平时成绩和期末成绩综合评价的方式进行考核。以往的课程其平时成绩部分通常以出勤率或者答题的方式为参考, 对于评价学生的学习效果并不适用, 而期末成绩仅凭一张理论考试试卷也难以评价学生的科研思维和能力。生命科学是一门实践性很强的学科, 而蛋白质组学的教学目的, 是通过本课程培养学生的科研思维, 培养学生的科研能力。因此, 在考核方式上, 也应当实施多种考核方式, 综合评价学生能力。考试方式主要由平时成绩、综述写作及期末理论考试成绩组成。以探究式教学方法教学, 重点在于灵活地考查学生运用理论知识探究科学问题的能力。因此, 在平时, 我们让学生以小组或个人形式, 自由地进行发挥。如, 进行课题设计, 讨论实验思路, 撰写研究论文, 演讲PPT及答辩等方式进行评分, 借此改变单独理论考试的单一形式, 建立更科学的多元化评价方式, 引导学生进行探究式学习, 注重对学生能力的培养。此外, 综述的写作有助于学生形成对某一科研领域的综合认识, 期末理论考试主要考核蛋白质组学相关概念和理论的掌握程度, 同时结合实验分析题也可以一定程度上了解学生对某些重要蛋白质组学技术的掌握程度。

蛋白质化学与蛋白质组学这门课程作为生物科学专业学生的限选课程, 在国内院校开得并不多, 该课程在我校已开设多年, 以探究式的教学方式为主要教学方法受到了学生的欢迎和肯定。对于需要进行毕业论文设计和今后即将进入医院或科研机构的生命科学专业学生来讲, 这门课程在一定程度上让他们初步形成了科研思维, 并且得到了一定的训练, 对于今后进入实验室有着较好的铺垫作用。此外, 毕业论文设计的指导老师也普遍认为学生具有一定的科研思维能力, 知识较全面, 因此也充分显示了该课程教改的优势和效果。

四教师应当以身作则, 培养学生求真的科学态度

伟大的教育家陶行知曾说:“千教万教教人求真, 千学万学学做真人”。科研探索是用于发现问题、分析问题和解决问题的, 在此过程中, 需要对每次的实验结果进行多次论证, 力求结果的真实及科学性。孔子云:“其身正, 不令而行。其身不正, 虽令不从。”因此, 教师自身良好的教学态度和科研精神起到了楷模示范的作用。由于学生理论及实验水平有限, 在课外指导学生进行实验设计或论文撰写时, 教师必须直接参与并监督实验的实施与完成, 在此过程中, 教师需要一丝不苟, 严谨求真, 坚韧不拔, 同时, 也应严格要求学生在实验前做好各项准备工作, 实验过程中规范操作, 对实验结果进行独立思考和分析, 杜绝造假及人为疏忽。

在处理与学生的关系时, 一定要真诚平等, 这一点十分重要。教师传授知识, 学生学习知识, 师生关系融洽是完成教学任务的一项重要保证。教师如能自律, 一丝不苟, 真诚平等地对待每一位学生, 那么学生也会以真诚的态度对待课程, 如此才会有良性循环。

综上所述, 蛋白质化学与蛋白质组学的教学过程中应时刻把握“以人为本, 以学生为中心”的教学理念。将探究式教学方式贯穿课程的教学过程, 能够提高学生的科研思维和创新能力, 在此过程中, 学生自主或相互合作, 与教师共同参与教学过程, 激发了学生的学习兴趣, 充分地调动了其主观能动性, 因而直接提升了教学质量, 对于面对即将进行毕业论文设计, 即将考研或即将实习的生物科学专业学生而言, 受益匪浅。

当然, 该门课程属于新开课程, 碰到许多难题。首先, 在教材的选择上, 我们选择很久, 教育部没有正式出版的专门针对蛋白质化学与蛋白质组学的规划教材, 因此, 我们选择何华勤主编的《简明蛋白质组学》作为授课教材, 该书内容全面且简明扼要, 并以利布莱尔主编的《蛋白质组学导论———生物学的新工具》、Wilkins主编的《蛋白质组学研究:概念、技术及应用》为参考书要求学生阅读。第二, 学生前两年以修学分为主, 理论课程较多, 实践时间较少, 因此对本课程很多稍微复杂点的实验内容, 如亲和柱层析、DIGE等缺乏深刻理解;此外, 课程中讲解到的各种实验仪器, 如双向电泳系统、质谱仪等由于价值不菲, 对本科生的开放程度有限, 因此, 学生即使掌握理论, 但无法形成深刻认识;最后, 生物信息学内容专业复杂, 学生的认知度与课程要求有落差, 限制了教学的效果。但是笔者与同课题组成员课余开放本研究所现有的双向电泳平台, 力求为学生创造条件。

生命科学学科发展日新月异, 高校人才培养观念和体系也要不断与时俱进, 教师需要不断修正教学方案, 及时总结教学规律, 才能提高教学质量, 这样才能真正做到以学生为中心, 以能力培养为导向, 努力而有效地培养出适应社会和经济发展需求的生命科学学科专业人才。

参考文献

[1]尹稳, 伏旭, 李平.蛋白质组学的应用研究进展[J].生物技术通报, 2014 (1) :32-38.

[2]谷岩, 宋文, 刘敏华.以能力培养为导向的大学计算机基础课程教学改革与实践[J].中国大学教学, 2012 (8) :52-54.

蛋白组学 篇2

文章综述了差异蛋白质组学中主要分离技术如双向电泳、差异凝胶电泳、多维色谱技术及以质谱为基础的`分离鉴定技术.

作 者：喻小燕 陈锋菊 作者单位：喻小燕(湖南信息职业技术学院;湖南师范大学)

陈锋菊(湖南师范大学;湖南科技大学)

蛋白组学 篇3

关键词：蛋白组学 食品科学 运用

中图分类号：Q51 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）06-0000-00

随着人们生活水平的提升，食品安全问题成为了许多人开始关注的问题，针对食品科学进行的研究成为了近些年来一个比较热议的话题，研究学者发现，通过对食品蛋白组学的有效研究，能够对食品科学领域中存在问题进行分析，并已经取得了一定的成果，本文就针对这项技术在食品科学研究过程中的具体应用进行如下的论述和分析。

1概述

对于蛋白质组来讲，其不同于一般的基因组，属于某一细胞或是生物在一定的病理或者生理状态下所要表达的一种针对所有蛋白质功能、数量和特征进行的系统性研究，可以为具体研究提供较为全面的动力学信息，具有特异性、空间性、动态性和时间性等特点，其本质就是一种在基因组表达基础上所产生的对应蛋白质，可以在生命或者细胞的整体水平之上对生命现象活动规律和本质进行有效的阐述。

2具体技术

2.1应用质谱分析技术

采用这项技术可以对蛋白质的序列进行有效的测定和鉴定，其中，离子化的方法普遍采用的是电喷雾和MALDI这两种软电力方式，这种方法可以保证样品分子在进行电力操作时保证其分子完整性，确保分子不会变成碎片形式的例子，这种图谱分析技术又被称作为肽指纹图谱技术，采用这项技术主要是针对点喷雾电离提出的一种核心技术。采用这一类技术首先需要将胰蛋白酶进行消化，这种蛋白酶本身具有一定的特异性，经过消化作用能够产生大量的多肽，这些多肽经过反向分离和阳离子交换柱的有效分离后能够进行准确地分析。经过分离作用后产生的蛋白质能够借助于芯片上的一些底物和抗体本身具有的亲和力获得多个或单个形式的目标蛋白[1]。这项应用现如今已经普遍应用于一些商业化或者开放性资源的数据库平台上，内容涉及许多蛋白质信息的鉴定，同时还可以应用于一些代谢数据库的研究之中。

2.2双向电泳技术

这项技术主要是应用电泳这种方法将蛋白质从复杂样本中进行有效的分离，具体是根据蛋白质本身分子量和等电点之间的不同以及电荷转移的具体位置绘制成一个特定的蛋白质图谱，在图谱上存在许多个蛋白质点，每一个点都代表着一种特定的蛋白质，采用这种方法可以同时鉴定1万多个不同的蛋白质点，同时采用这种方法还能够有效地对蛋白质的质点染色强度进行定量分析，进而得到经过翻译后的蛋白质修饰信息，同时还能够针对不同程度磷酸化或者单糖化蛋白质亚型进行分离。经过长期的研究，现如今国际上以及成功测定了多组织和多无中的胶图谱，包括：玉米、水稻、水产品、牛、猪和鸡等，其中一部分的图谱已经被应用于一些食品品质的性状标记当中。

3食品科学中的具体研究应用

3.1食品品质改良和加工过程中的研究应用

这方面主要是指一些农作物的产量和品质，对这些方面的影响因素有许多种，通过近些年来相关研究人员对蛋白质组学的研究发现，一些研究成果对于农作物产品产量的提升以及相关性状的合理改良等多个方面都具有十分积极的促进作用。通过国外学者对于栽培型和野生型两种大豆种子蛋白图谱进行的研究发现，这两种作物之间具有非常相似的部分，通过提升大豆作物中的蛋白质硫氨基酸浓度可以显著提升大豆作物的蛋白质[2]。除此之外，在提升农作物产品的产量方面，相关学者采用双向电泳这项技术对小麦的面筋、胚乳进行蛋白组的分析之后发现，小麦生面团可以形成一种可溶性的蛋白，这种蛋白质本身对于面团中产生的气泡具有非常显著的稳定作用，这一研究为提升面食的质量提供了非常重要的理论基础。我国的何中虎教授在针对中国小麦这种品种的品质评价体系进行研究后取得了非常大的进展，尤其是在对蛋白组学的相关方法进行研究之后发现了一种水溶性的蛋白，这种蛋白质本身与面筋的强度有着直接的关系，这一发现对于面条和面包亚基组成的具体要求进行了很好的明确。

3.2方便了食品的鉴伪

近些年来我国爆发了许多食品安全问题，这些问题的出现引起了社会上的极大关注，在这些食品问题中，过敏问题一直是人们着重关注的主要问题，随着现如今人们饮食环境的多样化发展，一些过敏性疾病呈现出越来越严重的发展趋势，海洋过敏作为食品过敏中一个重要的组成部分其引发原因就是因为海鲜中的特殊蛋白质。通过对蛋白组学进行研究，能够对这些海鲜类食品的过敏原进行有效的鉴定，进而有效避免一些过敏问题的出现。除了海鲜过敏之外，研究学者采用电泳和质谱这两项技术连用的形式已经检测出了2500多种的不同蛋白质，并且在水稻的种子中检测出了多种致敏性的蛋白，这为食品过敏情况的监督起到了非常重要的作用。

3.3针对食品贮藏的研究应用

对于畜禽肉和鱼贝类水产品来讲，其细胞组织都是由大量蛋白质共同组成的，对蛋白组学进行分析和研究对于这一类蛋白指之间相互关系的研究具有非常重要的研究价值。研究学者对蛋白质图谱进行研究之后发现，不同的冷冻条件对其并不会产生非常显著的影响，但是冷冻的时间会严重影响蛋白质浓度的变化，这就是导致食品出现变质的主要原因，因此，对蛋白组学进行研究，对于食品的合理贮藏同样具有非常重要的影响意义。

4结语

综上所述，针对蛋白组学进行有效的研究对于食品科学的多项研究都具有十分积极的影响意义，涉及到了食品贮藏、食品鉴伪、食品加工和改良等多个方面，随着人们生活水平的提升，人们越来越重视食品的安全问题，因此，针对蛋白组学进行的研究在今后仍然具有非常广阔的发展前景。

参考文献

[1]李学鹏，朱军莉，于平 等.蛋白组学及其在食品科学研究中的应用[J].中国粮油学报，2010（02）.

[2]王龑，许文涛，赵维薇 等.组学技术及其在食品科学中应用的研究进展[J].生物技术通报，2011（11）.

收稿日期：2015-02-04

作者简介：蒋奕（1993—），女，汉族，四川璧山人，在读本科，研究方向：食品科学与工程。

植物磷酸化蛋白组学研究进展 篇4

在植物中,发现蛋白磷酸化过程与组织感应光、病原入侵、激素、温度胁迫和营养缺乏等不同的内外部信号有关[10,11,12]。通过磷酸化蛋白质组系统分析植物在特异生物应答中的激酶及其激活与产生磷酸化蛋白,将为植物生物学过程的大范围调节提供新的思路。

1 植物磷酸化蛋白质组学研究

1.1 发育的种子中存在大量磷酸化蛋白

Agrawal等对发育的油菜籽的磷酸化蛋白质进行了系统的定量[13],首次就植物磷酸化蛋白质进行大规模定量分析。其中用高分辨率的2-DE通过磷酸化蛋白特异的Pro-Q DPS和LC-MS/MS,鉴定出在种子填充阶段表达的磷酸化蛋白质的存在。Agrawal等首次鉴定出的磷酸化代谢酶有微管蛋白β-8支链、细胞腔结合蛋白、热激蛋白、蛋白酶体蛋白、14-3-3蛋白、膜联蛋白和储藏蛋白cruciferin的亚基,并揭示了在已鉴定的磷酸化蛋白中有44%以上的酶参与了各种代谢途径,暗示了目前的植物代谢调节方面的研究可能仅仅是个开端[14]。

1.2 盐胁迫、核染色质相关蛋白和细胞分化的磷酸化蛋白质组分析

Chitteti和Peng利用2-DE磷酸化蛋白质组的研究方法来鉴定水稻根系盐胁迫下的差异调控磷酸化蛋白[15]。鉴定出38个磷酸化蛋白表现出差异表达,其中20个为上调,18个为下调点,利用MS分析了其中17个上调和11个下调斑点。其中上调磷酸化蛋白包括核糖体蛋白S29、HSP70(dnak-type molecular chaperone)、GST、丙酮酸脱羧化酶同工酶2和小GTP结合蛋白Os Rac2。在核染色质相关蛋白的分析中,采用了一种从水稻悬浮培养的细胞中分离核染色质的改进的磷酸化蛋白质组学研究方法,利用2-DE和shotgun蛋白质组研究方法联用,最终应用MS鉴定了共509个蛋白质斑点,269个非冗余蛋白[16]。Chitteti等为研究拟南芥细胞去分化过程中的磷酸化蛋白质组的变化,以拟南芥子叶为材料,分析鉴定了53个假定磷酸化蛋白质[17]。在这53个斑点中有9个在细胞去分化过程中差异表达。这些磷酸化蛋白在翻译水平被类锚定蛋白、叶绿素a/b结合蛋白2、14-3-3蛋白、ATP合成γ支链1、细胞分化fts H同源蛋白等蛋白所调控。

1.3 植物中的酪氨酸磷酸化

Sugiyama等对拟南芥磷酸化的研究中强调拟南芥的酪氨酸磷酸化程度与人磷酸化蛋白质组十分相近[6]。在1 346个蛋白上共有2 172个非冗余磷酸化位点,其中磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸的相对丰度分别为85.0%、10.6%和4.3%。在人磷酸化蛋白质组中,不同样品的磷酸酪氨酸的相对比例被报道为1.8%~6.0%[7,8,9]。值得注意的是,大多数磷酸化肽段包含的酪氨酸发现被多次磷酸化,且此酪氨酸磷酸化残基似乎发生在其他磷酸化残基附近。人类和拟南芥的磷酸化蛋白质组中酪氨酸磷酸化程度惊人的相似性暗示通常在植物中,至少在拟南芥中,酪氨酸磷酸化是十分重要的。

1.4 胞质核糖体磷酸化蛋白质组学鉴定RPS6和酸性蛋白

1-DE/Pro-Q DPS/Ti O2磷酸化肽段富集蛋白质组学研究方法被应用于拟南芥胞质核糖体蛋白磷酸化程度的系统研究中[18]。利用1-DE/Pro-Q DPS/MS分析鉴定了RPS6和RPL13等6个核糖体蛋白。Ti O2/nano-LC-MS/MS进一步鉴定了共7个磷酸化蛋白。这些被鉴定的蛋白大部分是酸性核糖体蛋白家族中的成员,如P0、P1、P2、P3、RPS6和RPL13。在此研究中,这些蛋白的丝氨酸残基也被认为是潜在的磷酸化位点。

1.5 胁迫下质膜水通道蛋白磷酸化状态变化的定量

水通道蛋白作为通道蛋白参与调解水、中性溶剂的跨膜运输,有时也参与响应非生物胁迫的离子跨膜运输,在生物体内无处不在[19]。据报道,磷酸化丝氨酸残基出现在多种植物的水通道蛋白的N和C端尾部[20]。

Prak等将定量磷酸化蛋白质组学和细胞生物学方法结合,进一步研究了拟南芥根部水通道蛋白的磷酸化与响应Na Cl和H2O2处理的根透水性有怎样的关系。共鉴定出6个在几种拟南芥质膜内在蛋白(At PIPs)C端尾部的新磷酸化位点。通过相对定量的方法鉴定出At PIP2;1位于C端2个的磷酸化位点,Ser280和Ser283。为了验证水通道蛋白亚细胞运输中Ser280和Ser283磷酸化的作用,在At PIP2;1的2个位点的其中一个形成突变,然后与GFP融合并在转基因植株中超表达。这些植株的共聚焦显微分析揭示了Ser283的磷酸化对At PIP2;1锚定质膜十分重要。

1.6 响应普通诱导子的早期信号和防御的质膜的蛋白和囊泡运输

包括跨越质膜的离子流、分裂素激活的PKs(MAPKs)和ROS的形成等早期信号事件,一般仅发生在几分钟之内。通过拟南芥悬浮培养细胞的14N/15N新陈代谢标记进行的定量的磷酸化蛋白质组学方法被建立起来,以进行参与调控早期信号事件的磷酸化过程的观察[21]。在这种定量方法中,共鉴定出1 172个磷酸化肽段,其中包括1 011个新发现的磷酸化肽段。在木聚糖酶处理细胞中鉴定的所有磷酸化肽段中,近60%同时存在于经flg22处理的细胞中,说明在发现的磷酸化肽段中有大量的重叠,并且木聚糖酶和fla22诱导子由此可能共用一个信号途径。同时,在木聚糖酶和fla22处理对比下,共发现有76个膜相关蛋白和防御相关蛋白表现为差异磷酸化。另外,分别应答木聚糖酶和fla22的53和19个蛋白可能由不同的磷酸化途径调控。这些蛋白显示出一个或更多个在磷酸化位点上的质量变化,体现了在翻译后修饰水平的高度复杂性,例如RBOHD(respiratory burst oxidase protein D)的复杂调节模式。因此,早期信号和抵御诱导子的防御应答过程中蛋白和囊泡的运输起到非常重要的作用。

2 结语

在最近几年,几种利用MS进行的高通量蛋白质磷酸化分析的新技术推动了植物蛋白质磷酸化的系统研究,为植物特异磷酸化蛋白质组学数据库提供了网络资源,促进了生物信息学预测方法的发展。

蛋白组学 篇5

绿色植物在生长过程中遭遇的环境胁迫包括非生物胁迫(如干旱、高温、低温、高盐、营养)和生物胁迫(如病虫,害)两大类.本文对植物响应上述逆境胁迫的比较蛋白质组学研究进展进行概述,并展望植物抗逆蛋白质组学的研究前景.

作 者：林秀琴 袁坤 王真辉 邓军 杨礼富 LIN Xiuqin YUAN Kun WANG Zhenhui DENG Jun YANG Lifu 作者单位：林秀琴,LIN Xiuqin(中国热带农业科学院橡脱胶研究所;农业部热带作培生理学重点开放实验室,海南,儋州,571737;海南大学农学院,海南,儋州,571737)

袁坤,王真辉,邓军,杨礼富,YUAN Kun,WANG Zhenhui,DENG Jun,YANG Lifu(中国热带农业科学院橡脱胶研究所;农业部热带作培生理学重点开放实验室,海南,儋州,571737)

猪精子差异蛋白质组学研究进展 篇6

用于分析哺乳动物的蛋白质组的方法表明了蛋白质组学不仅建立在蛋白质的鉴定和定量, 同时还需要了解蛋白质的结构、定位、修饰、交互作用、活性和功能[2]。到目前为止, 还没有研究建立一种比2-D聚丙烯酰胺凝胶电泳更精确实用的分析方法, 它是一种基础的蛋白分析技术。

采用2-D凝胶电泳技术可以鉴定并分析在细胞状态改变下差异表达的蛋白, 由于没有使用一些如亲和层析和凝胶层析 (多维色谱) 的特殊方法, 常规的2-D电泳只能用于检测蛋白的表达, 不能用于蛋白-蛋白之间的交互作用以及蛋白的主要功能的分析。所以, 在进行蛋白质组学分析时, 就需要一些其他的方法在蛋白质水平上的辅助, 有利于更加广泛地理解细胞学机制。

1精子粘附因子家族 (spermadhesins)

大量的研究表明配偶子的识别和精卵融合是由糖类蛋白交互作用的模式介导的。早在之前已有研究表明哺乳动物卵母细胞的透明带是由两到四个糖蛋白家族组成的[4,5], 这些结合到透明带的精子膜蛋白, 其生物化学结构和分子量 (14KDa～90KDa) 各不相同, 随着物种改变而相应改变。

精子粘附因子, 在猪、牧马和公牛的生殖道表达, 属于一个新的分泌蛋白家族, 经研究发现与精子表面有关联[6]。精子粘附因子的功能性质上的分化是通过转录后的修饰促进的, 尤其是糖基化[7]。糖基化不仅仅是对蛋白家族结构多样性起作用, 同时, 调节精子粘附因子的配体结合能力, 即在不损伤肝素结合能力下失去了透明带结合活性[7,8]。精子粘附因子属多功能蛋白质, 有广泛的配体结合能力, 如, 糖、硫酸化糖胺聚糖、磷脂和蛋白酶抑制剂等, 说明它们作用于受精的各个阶段[5,9]。经研究证明, 猪精子粘附因子家族的所属蛋白的绝大部分是由水泡腺合成, 在某些特定情况下, 也可由附睾和睾丸网进行合成。猪精子粘附因子的结构、生物化学性质以及生理功能方面已有大量的文献进行报导。

截止目前为止, 7个精子粘附因子, PSPI, PSP-II, AQN-1, AQN-2, AQN-3, AWN和DQH已在猪精液中被鉴定, 除PSP-I外, 皆具有肝素结合能力[9,10]。在猪精液中, 精子表面蛋白 (PSP, AQN, AWN和DQH) 的聚集形式比单体形式更占优势。它们之间的交互作用可能有利于精液蛋白聚集形式的形成或者精子表面蛋白的排列和重塑。另外, 精液中聚集形式的蛋白与单个独立的蛋白的肝素结合活性只有一个区别:精子粘附因子异 (源) 二聚体PSP-I/PSP-II, 表现出连锁PSPII亚基糖结合活性[10,11]。最近研究结果表明了PSP-I/PSP-II精子粘附因子促进巨噬细胞释放嗜中性粒细胞趋化物质, 暗示着精子粘附因子异源二聚体是作为子宫免疫活性的调节子作用的[12]。

2热休克蛋白家族 (HSPs)

近来来, 已有研究表明, 冻精, 即在液氮中保存的精液, 在冷冻过程中的损伤, 主要是蛋白质等大分子的含量和功能的改变。与其他家畜相比, 猪精子对于抗冻和低温打击十分敏感。主要是因为猪精子膜上胆固醇/磷脂的比例较低, 磷脂酰乙醇胺和鞘磷脂的含量较高, 胆固醇的分布不对称, 外膜的大于内膜, 使内膜对冷休克特别敏感。

Medeiro等[13]通过精子冷冻实验证明冻融过程会导致精子提前发生获能样变化, 具体表现为细胞膜通透性增强、精子质膜表面胆固醇流失、精子活率和活力降低等现象。精子的质膜也因此被认为是在低温环境中最容易受损伤的关键结构。

研究证明精子的质膜、胞器以及顶体等部位的损伤实质是改变了相应部位重要功能蛋白的质和量, 如热休克蛋白70 (HSP70) 、热休克蛋白90 (HSP90) 等与受精过程相关的功能蛋白, 谷草转氨酶 (AST) 、乳酸脱氢酶 (LDH) 、丙氨酸氨基转移酶 (ALT) 等与精子代谢有关的酶类, 特异性透明质酸酶 (PH-20) 、受精抗原1 (FA-1) 、甘露糖结合蛋白 (MBP) 、顶体素 (acrosin) 等与精卵相互识别的信号蛋白, 以及一些基因表达的调节蛋白[14]。

S Vlope等在猪精子表面发现并定位了Hsp-60, Hsp-70, Hsp-90。Huang等研究表明, 温度降低至5℃时, Hsp-90开始减少, 超低温冷冻保存后Hsp-90的含量极显著降低[15]。HSP90通过调节蛋白激酶活性, 参与调节精子运动, 其水平的降低导致了三磷酸腺苷 (adenosine triphophate, ATP) 合成减少, 且冷休克后ATP的减少在后期不能得到补偿。由此推测, 降温过程中HSP90的减少是导致ATP耗竭的关键因素, 并导致了精子活力的显著降低。金一等[16]通过研究降温过程中HSP90对猪精子活力的影响, 再次证明HSP90参与ATP代谢, 冷休克造成精子ATP合成减少的不可逆转, 使精子运动能力减弱。

Garcia-Gardena等[17]报告说, HSP90可以激活一氧化氮合酶 (nitric oxide synthase, NOS) , 由L-精氨酸在一氧化氮合酶的作用下生成少量一氧化氮 (NO) , 提高精子活力、活率, 降低精子脂质过氧化, 提高精子的受精能力。

3其他猪精子蛋白

目前在人类精子表面的蛋白质研究表明, 共显示了1 397个蛋白点, 分子量为5-160 kDa, pI 4-11。Wolkowicz等还首次发现鞭毛蛋白tektin B1也位于精子表面。Wenlei Cao在鼠精子上发现鞭毛蛋白TEKT 5, 其参与精子形成过程中鞭毛的形成并介导精子活力[18]。Alfredo R.Ramírez[19]等在猪精子上发现并鉴定了多巴胺2型受体 (DRD2) , 其影响精子的活力、精子获能以及精子能动性的调节。Ollero[20]等研究指出, 冷冻后牛精子膜蛋白组成和鲜精不同, 精子膜蛋白的变化导致精子活率和活力的降低。

蛋白组学技术的应用可以帮助揭露蛋白结构, 理解其功能以及蛋白-蛋白的交互作用的不同变化, 这些有助于理解和分析调节精子的功能, 例如过度活跃, 获能以及顶体反应。

摘要：蛋白质组学对于鉴定调节雄性生殖细胞性能机制的蛋白的性质和功能的研究是至关重要的。蛋白质组学提供了一个工具区分析和理解精子与卵子之间的相互作用, 这有可能为研究精细胞表面配体与卵细胞的相互作用提供一个有用的模型。本篇综述包括了目前对于猪精子蛋白组学的研究进展以及一些基本蛋白质组学的研究技术。

蛋白组学 篇7

蛋白质组是一种基因组所表达的全套蛋白质, 包括一种细胞或一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组的外文名 (Proteome) 源于蛋白质 (protein) 与基因组 (genome) 两个实词的重新组合, 其本质是在大规模水平上研究蛋白质的特征, 包括蛋白质的表达水平、翻译后的修饰、蛋白与蛋白之间的相互作用等。借助这种研究, 就可以探析生命活动的生理基础及其内在规律, 了解疾病发生、发展与细胞代谢过程, 在蛋白质水平上获得整体而全面的认识[1]。蛋白质组学的核心技术是双向电泳 (two-dimensional electrophoresis, 2-DE) 、质谱 (mass spectrometry) 及生物信息学 (bioinformatics) 等, 已被应用于生命科学研究的诸多领域, 受到越来越多的关注。

1 基本原理

研究正常生理个体间的蛋白质组, 同时也研究异常病理个体间的蛋白质组, 将二者进行对比、分析, 找出相同点与差异点, 就有可能发现某些疾病的特异性蛋白质分子, 以提供疾病早期诊断的分子标志。将此作为分子靶点, 设计新药物, 深入研究, 以求攻克[2]。由此可见, 蛋白质组学的研究, 能为生命活动规律提供物质基础, 也能为阐明疾病发生、发展的机理提供根据, 作为寻找解决问题的有效途径, 以利于消除这些疾病。

蛋白质组学探索, 是生命科学进入后基因时代的研究新途径, 是未来科学揭示生命奥秘的先进方向, 能与其它科学研究一样, 更好地为人类的健康事业服务, 并有可能发挥更大的社会效益, 甚或由之产生巨大的经济利益。

蛋白质组不等同于基因组, 二者之间有较大差别。蛋白质会伴随组织、环境等状态的差别而改变。在转录过程中, 一个基因可以多种信使核糖核酸 (m RNA) 形式剪接, 同一蛋白也可能以多种形式进行翻译后的修饰。在蛋白质组中, 蛋白质的数目, 有时可以超过基因组的数目。蛋白质组学不是单纯的方法学, 不是一个封闭的知识体系, 而是一个更大范围、更大规模的研究领域。蛋白质组学集中于基因调节的动态描述, 定量测定基因表达的蛋白质水平, 观察疾病对生命过程的影响, 鉴定药物对病理的作用靶点, 解释基因表达的调控机制[2]。蛋白质组学研究, 是蛋白质 (多肽) 谱研究以及基因产物图谱研究的进一步延伸。

人类基因组计划, 经过多个国家的科学工作者的团结协作和共同努力, 人类基因的全序列测定, 最终得以完成。其研究的标志性业绩是:人类基因组工作草图与初步分析结果。这些内容已经被人类基因组计划组织和美国Celera公司公布, 先后刊载于世界顶级自然科学刊物《Nature》与《Science》上。研究成果是巨大的, 其重要贡献是为人类在基因活性与疾病的相关性方面, 提供了客观证明和微观依据。现在的问题是, 不少疾病的发生, 并非全由基因的改变所引起, 还有导致多种疾病发生与发展的其它病原和影响因素。基因表达的方式多种多样, 相当复杂。如果条件不同, 或者时间不同, 即使是完全相同的基因, 也有可能起到异样作用, 会随时发生变化, 有的甚至可以发生突变、畸变, 甚至癌变, 差别非常大。关于这些方面的难题, 仅仅依靠基因组学的研究, 是不可能攻克的。因此, 后基因组学的研究, 就显示出必要性。鉴于蛋白质在人体生理病理中产生的重要作用, 科学工作者已经将探索目标转移到蛋白质功能的研究上来。尤其是蛋白质组学的研究, 更有希望解决以上难题, 也正顺应了这个发展趋向, 并突显出蛋白质组学研究在攻克人类众多疾病中的重大意义。

蛋白质组学研究是一项更为复杂、更具有挑战性的科学探索, 需要国际间的协作与配合。专门研究人类蛋白质的组织 (HUPO) 已经在美国建立, 并由此拉开了国际合作研究的序幕。世界各地的生命科学研究工作者, 广泛开展了各种生物体的蛋白质组学研究。为了避免重复, 减少浪费, 各个国家开展的蛋白质组学研究, 既有协作, 又有侧重, 以集中人力、物力、财力等方面的优势资源, 寻求重点突破。例如:人类肝脏蛋白质组学的研究计划就由中国牵头, 其它国家辅助, 互相配合, 协作攻关。余如人类血液蛋白质组学的研究计划, 则由美国科学界牵头;人类脑蛋白质组学的研究计划, 即由德国科学界牵头。在中国, 政府非常重视这一工作, 在蛋白质组学的研究工作方面, 投入了大量的优质资源, 给予人力、物力、财力等方面的鼎力支持, 已经将其列为目前到2020年的研究重点, 并收入《国家中长期科学与技术发展纲要》。在国家现阶段设立的四个重大科学研究计划中, 蛋白质组学计划就是其中之一, 成为当前国家科学研究的重点突破方向。

基因组包含的遗传信息, 经转录产生信使核糖核酸 (m RNA) , m RNA经过翻译之后, 产生相应的蛋白质。翻译后修饰是蛋白质调节功能的重要方式。在特定生理条件或病理状态下, 某一细胞表达的各种蛋白质, 构成其蛋白质组。在不同生理条件或病理过程中, 各种细胞所表达的蛋白质的种类, 有一定差别。研究蛋白质的结构、定位以及它们之间的相互作用, 将为观察和阐释生命现象, 揭示疾病发生、发展、变化的本质, 提供直接的微观的客观的证据。

二维电泳与质谱技术的巧妙结合, 形成蛋白质组学研究中的理念结合与技术佳配, 具有相辅相成的促进作用和协同效果, 为科学工作者研究蛋白质的表达规律提供了理想的可行的技术支持[3]。探索蛋白质与蛋白质之间的相互作用, 将是这一研究领域的重要方面。

蛋白质组学系基因能表达全部蛋白质, 其研究是针对不同时间和/或空间上发挥功能性的特定蛋白质群组, 探索其作用机理、功能模式及其群组内的相互作用、调节与调控, 为生理研究、病理分析、临床诊断、新药开发、药品筛选、代谢途径等, 提供客观依据, 建立理论基础[4]。蛋白质组学研究的重点目标和发展方向, 主要是为了促进分子医学的发展, 如寻找药物靶分子, 消除致病基因, 修复正常生理基因, 以利于攻克疾病, 促进机体恢复健康。

2 核心技术

2-DE是双向凝胶电泳技术。蛋白质有2个重要的理化特性, 一是等电点, 二是分子量。根据样品中的这2个蛋白质理化特性, 可以将其分离。原理:一是向基于蛋白质PI不同用等电聚焦分离, 二是按MW的不同用聚丙烯酰胺十二烷基硫酸钠凝胶电泳分离。这样, 复杂蛋白混合物中的蛋白质, 就会依据其理化特性, 在二维平面上自行分离。差异凝胶电泳, 是提取2个不同样品中的蛋白质, 分别标记以不同的荧光染料, 再将标记后的2个样品混合, 进行双向凝胶电泳。因发光波长不同, 同一块胶上2个样品的蛋白质, 可以自行分离, 并能测出其含量。因其通量高, 分辨率好, 具有可重复性, 可与质谱分析技术联用, 故成为当今最流行的蛋白质组学的研究手段, 属于最可靠的实验方法。2-DE技术, 可以广泛应用于各种蛋白质组学的研究, 成为研究结构蛋白质组与功能蛋白质组的重要方法[5], 最具有实际应用价值。在蛋白质组学研究的实验技术中, 属于不可或缺的项目, 占据着十分重要的地位。

质谱分析, 是唯一可以确定分子质量的方法。在高分辨率质谱仪中, 能够准确测定质量, 而且可以确定化合物的化学结构式, 并进行结构分析。质谱法的灵敏度极高, 鉴定的最小量可达10-10g, 检出限可达10-14g。质谱仪的种类多样, 如:有机质谱仪、无机质谱仪、同位素质谱仪等。其中有机质谱仪有气-质、液-质、富变质谱仪, 激光解吸飞行时间变质谱仪等。质谱分析是用高速电子, 撞击气态分子或原子, 将电离后的正离子加速, 导入质量分析器。试样在离子源内被气化、电离。用电子轰击法在10-5Pa高真空下, 以50-100e V能量的电子流轰击试样, 有机物常常被击出一个电子。若加速电压和磁场强度都一定时, 不同m/z的离子, 由于运动的曲线半径不同, 在质量分析器中彼此分开。在磁场中, 按质荷比 (m/z) 大小, 进行收集和记录, 得到质谱图。根据质谱峰的位置, 进行物质的定性, 作结构分析。还可根据峰的强度, 进行定量分析。其原理是受试样品, 从进样器进入离子源, 在离子源中产生正离子。正离子加速进入质量分析器, 质量分析器将离子按质荷比大小不同进行分离。分离后的离子先后进入检测器, 检测器得到离子信号, 放大器将信号放大, 并记录在读出装置上。通过正确测定蛋白质分子的质量, 进行蛋白质分子鉴定、修饰和相互作用的研究[6,7]。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱, 可检测离子, 并确定分子量, 能反映被检测样本中蛋白质的全部情况, 找到多个蛋白质标志物。

生物信息学技术, 是分子生物学与信息技术的结合体, 是利用数学、统计学、应用信息学、计算机科学等方法, 研究生物学中的问题。生物信息学的研究材料和结果就是各种各样的生物学数据, 其研究工具是计算机。研究方法, 包括对生物学数据的搜索、收集、筛选、处理, 包括编辑、整理、管理和显示, 利用、计算和模拟等。目前主要的研究有:基因识别、基因重组、基因表达、序列比对、蛋白质结构预测、蛋白质反应预测, 以及建立进化模型等。生物学技术生成大量的复杂数据, 生物信息学利用数学工具, 从大量数据中提取有用的生物学信息。生物信息学处理的问题:重新组装在霰弹枪定序法测序过程中被打散的DNA序列, 从蛋白质的氨基酸序列预测蛋白质结构, 利用m RNA微阵列或质谱仪的数据检验基因调控的假说。生物信息学技术通过蛋白质微阵列技术或高通量质谱分析, 对生物标本进行测量, 获得数据, 其中包含有大量生物标本内蛋白质的信息。生物信息学被广泛应用于这些数据的分析[8]。Michael Waterman是这方面的行家里手, 他率先将数学和计算方法引入生物学研究, 将数学、统计、计算机科学应用于各种分子生物学问题的研究中, 开辟了多个重要的研究方向, 在生物信息领域有不少创新性的贡献。他受聘于清华大学, 为清华大学的生物信息学学科发展作出了突出贡献。2013年, 他荣获了外国专家在中国从事研究工作的国际友谊奖。

相对和绝对定量同位素标记, 是一种体外同种同位素标记的相对与绝对定量技术, 利用多种同位素试剂, 标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团, 经用高精度质谱仪串联分析, 可同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量, 是定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。将蛋白质裂解为肽段, 然后用试剂进行差异标记。由于试剂是等量的, 用不同同位素, 标记同一多肽后, 在第一级质谱检测, 分子量完全相同。用串联质谱方法, 对在第一级质谱检测到前体离子, 进行碰撞诱导解离, 产物离子, 通过第二级质谱进行分析。通过数据库查询和比较, 可以鉴定出相应的蛋白质前体[9]。技术特点是:定量精确、高效率样品分离、高鉴定率、适用范围广、仪器性能优良, 可获得更加准确的结果。

蛋白质芯片, 是一种高通量的蛋白功能分析技术, 用于蛋白质表达谱的分析, 研究蛋白质与蛋白质的相互作用, 筛选药物作用的蛋白靶点。蛋白质芯片技术研究的原理, 是对固相载体进行特殊的化学处理, 再将已知的蛋白分子产物, 如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等, 固定在其上面。根据这些生物分子的特性, 捕获能与其特异性结合的待测蛋白, 经洗涤、纯化, 再进行确认和生化分析。为获得重要生命信息, 如未知蛋白组分、序列, 体内表达水平, 生物学功能, 分子相互调控关系, 药物筛选, 药物靶位选择等, 提供有力的技术支持。蛋白芯片主要有三类:蛋白质微阵列、微孔板蛋白质芯片、三维凝胶块芯片。应用于基因表达的筛选、抗原抗体检测、筛选及研究、生化反应检测、药物筛选、疾病诊断等。优点是直接分析粗生物样品, 如血清、尿、体液等, 同时快速发现多个生物标记物, 小量样品, 高通量的验证能力, 发现低丰度蛋白质, 测定疏水蛋白质, 在同一系统中集发现和检测为一体, 特异性高, 减少测定蛋白质序列的工作量, 可以定量, 功能广, 可测定细胞内的抗原, 而且灵敏度高[10,11]。蛋白芯片技术与质谱技术相结合, 展现出独特的优势。

多维色谱, 是利用不同物质, 在不同相态下的选择性分布, 以流动相洗脱固定相中的混合物。在色谱分析中, 一旦遇到难分离的物质对, 首先考虑改变固定相的选择性。高度复杂混合物, 可能包含不同沸点、不同极性的化合物。更换色谱柱, 其中的部分物质分离效果就会得到改善, 其它物质的分离效果可能变差。要改善总体分离效果, 就需要采用多维气相色谱。原理是两根独立控制、极性不同的色谱柱, 通过切换手段, 将第一根色谱柱的馏分, 选择性地转移到第二根色谱柱, 进行二次分离, 以获得比单柱更强大的分离能力。多维色谱技术在峰容量方面提供了更广阔的空间, 其中多维气相色谱和多维液相色谱较为常用。根据样品组分的性质差别, 选择几种色谱分离模式组合, 对样品进行分离, 与质谱技术联合, 获得分子量信息, 用以分析蛋白质[12,13]。多维液相色谱具有高分辨率、高灵敏度和高速度等优点, 可用于分离复杂样品, 并可广泛应用于生物大分子等复杂样品的分析及分离鉴定, 是蛋白质组学研究技术中的重要方法之一。

3 临床应用

癌症的发生, 是环境与遗传等多重因素, 相互作用, 激活体内原癌基因, 导致抑癌基因失活, 或表达被抑制, 细胞失去原有的生理调节, 产生异常增生。应用蛋白质组学技术, 能系统、全面、动态地分析癌症样本蛋白质种类与含量, 结合肿瘤发生、发展过程中的分子作用网络, 阐明癌症发生机制, 寻找不同肿瘤的诊断、治疗、预后的特异性标志物, 为临床医疗提供线索与依据。为了研究肝癌的发生、发展机制, 应用蛋白质组学方法, 对患者人源性肝癌组织与正常人体肝组织之间的蛋白质进行比对分析, 发现RAS-RAF-MEK-ERK信号通路与肝癌发生、发展机制有相关性。通过对肝癌患者肝组织标本的细胞株进行蛋白质研究, 发现转移性肝癌患者, 肝组织样本的细胞株中, AGR2表达异常增高, 推测AGR2的过度表达, 可促进肝癌转移。使用液相色谱串联质谱和二维荧光差异凝胶电泳法, 检测不同分化程度的胃腺癌患者, 分析出肿瘤组织中差异表达的蛋白质。用定量聚合酶链式反应、蛋白质印迹法技术, 对结果进行验证, 确认这些因子的表达水平, 与蛋白质组学鉴定结果一致, 不同分化程度胃腺癌中的蛋白表达, 存在显著差异性, 差异蛋白质所对基因, 与胃腺癌的发生以及分化程度相关。使用定量蛋白质组学技术, 对金雀异黄素诱导蛋白在胃癌细胞中的改变与具有抗癌作用的染料木素的分子机制进行分析, 显示KIF20A在染料木黄酮的防癌作用中发挥了重要作用, 可能是胃癌药物治疗干预的分子靶点。比较MKN45胃癌细胞株和敲除了CXCR1基因的MKN45细胞, 分析二者之间的蛋白质表达谱变化, 发现CXCR1在胃癌的侵袭、增殖、转移、耐药、预后等方面, 发挥重要作用。利用液体芯片-飞行时间质谱技术, 检测健康志愿者、食管癌患者的血清, 作蛋白质组学分析, 发现患者体内细丝1、微管蛋白β链、细胞色素b-c1复合亚基、α-异构体等, 表达明显增高, 这些表达失调的蛋白质/多肽, 可能参与了食管癌的发病机制, 可作为食管鳞状细胞癌血清学诊断的生物标志物。利用蛋白质组学技术, 对外周血蛋白谱进行分析比较, 对差异表达的蛋白质, 应用MALDI-TOF-MS技术进行鉴定, 发现慢性胰腺炎患者、胰腺癌患者、胰腺癌病情得到控制的患者, 表达存在显著性差异, 用Weste Rn Blot法再次验证, 发现识别体蛋白C3可作为胰腺癌特异性血清标志物。乳腺囊性疾病是诱发乳腺癌的乳腺良性病变, 应用MALDI-TOF质谱分析法, 研究后来发展成乳腺癌的GCDB患者, 进行冻存血清分析, 发现实验组与对照组相比, C3f片段有显著增加, 认为C3f可作为预测指标, 用于健康人群和有癌前病变妇女患乳腺癌风险的评估[14,15]。

4 结语

人类红细胞蛋白质组学研究进展 篇8

1红细胞的蛋白组成

红细胞发源于骨髓造血干细胞,由于没有细胞核和内膜系统,红细胞内的蛋白主要分为膜蛋白、膜骨架及胞浆蛋白。膜蛋白分为内在蛋白和外周蛋白以及脂锚定蛋白;膜骨架蛋白是细胞膜下与膜蛋白相连的由纤维蛋白组成的网状结构,参与维持质膜性状并协助完成其多种生理功能;胞浆蛋白主要为血红蛋白(hemoglobin,Hb),其次还含有碳酸酐酶、硫氧还蛋白过氧化物酶和其它抗氧化酶。

2红细胞蛋白质组学的研究进展

研究红细胞蛋白质组学,需要了解红细胞中每种蛋白质的氨基酸序列、转录后修饰以及每个细胞内蛋白质含量及蛋白间的相互作用。现代质谱技术和生物信息学的应用,使人们对红细胞蛋白质组学有了深层次的认识。2002年之前人们对红细胞蛋白质组学的研究并未全面展开,尔后随着这一领域相关研究技术的进展,红细胞蛋白质组学的研究紧密跟进。2002年,Low等首次使用双向电泳分离红细胞膜蛋白,银染后用MALDI-TOF质谱鉴定出84种膜蛋白。之后,Kakhniashvili等利用经典的RBC分离技术,联合Shotgun蛋白质组学分析方法和ThermoF innigen LCQ DECA XP离子阱串联质谱鉴定了RBC中181种膜蛋白和胞浆蛋白,其中包括血型糖蛋白A和C及只有几百拷贝数的其他蛋白(如基细胞黏连分子B-CAM)。Neelam等[2]利用免疫共荧光和蛋白质免疫印迹证明,RBC中存在蛋白酶体亚型和完整的蛋白酶体,打破之前RBC中没有蛋白酶体降解蛋白的研究报道。2006年底,Pasina等[3]利用四极杆-飞行时间串联质谱和Thermo热电混合线性离子阱傅里叶变换质谱鉴定出RBC内566种蛋白质,包括314种膜蛋白和252种可溶性蛋白质。同时,Pasini等用乙醇和碳酸钠优化膜蛋白提取方法,对蛋白质鉴定产生实质性技术上的贡献。至此,忽略转录后修饰和蛋白水解,共鉴定出751种RBC蛋白质。随着肽配体库和质谱技术的发展,2008年,Roux-Dalvai等[4]通过快速和高通量Electron LTQ Orbitrap质谱成功鉴定出1578种RBC胞质蛋白。2010年,Proteominer技术的应用使红细胞蛋白质数量增加1 331种,达到2 082种[5]。2010年至今,红细胞蛋白质组学的进展主要集中在膜蛋白领域。van Gestel等[6]用双向蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术从524种膜蛋白中鉴定出其中67种是胞浆蛋白。最近,这项技术被拓展为四维正交凝胶系统。该系统由非变性电泳部分及变性电泳部分组成。通过非变性电泳对RBC及Raji细胞胞质蛋白的分离并结合SDS-PAGE和质谱分析,确定了六种蛋白质复合体,即蛋白酶体20S核心复合体、Hb A、Hb A2、过氧化物氧化酶-2(peroxiredoxin-2,Prx2)、碳酸酐酶-1(carbonic anhydrase-1,CA1)以及热休克蛋白60(heat shock protein 60,HSP60)复合体。从中选择四种具有不同分子量和等电点的复合体:CP、Hb A、Prx2及HSP60进行变性电泳蛋白质组学分析,结果表明,4-DES不仅适用于复杂生物样品中的蛋白质复合体及蛋白质相互作用的研究,而且可用于复杂稀释样品中完整蛋白质复合体的分离富集[7]。De Palma等[8]将完整RBC用胰蛋白酶消化后分离膜蛋白,将其用Triton X-100溶解后分离可溶部分和膜骨架,将二者再用胰蛋白酶消化,用Mud PIT技术和线性离子阱LTQ质谱对这三部分进行蛋白鉴定。结果显示,确定的299种蛋白中211种是膜蛋白。Speicher等[9]用SDS-PAGE分离红细胞膜蛋白后将凝胶分成30等份,之后用LTQ-Orbitrap XL质谱分析鉴定了842种蛋白。创新性的方法的应用,使红细胞蛋白质总数从2010年的2082上升到2 289,仅增加了207种。因此,要鉴定所有的RBC蛋白质还有很长的路要走,这有待于更高灵敏度和准确性的质谱技术进一步发展。

3红细胞蛋白相互作用的研究

蛋白质通过与其它物质(蛋白质,核酸,小分子等)相互作用而行使其功能,一旦这种有序的相互作用遭到破坏,就会导致疾病甚至死亡。因此,蛋白质与其它物质的相互作用成为人类疾病预防和治疗的重要对象,而蛋白质与蛋白质之间的相互作用又成为其中最关键的一部分。在高通量RBC及RBC膜蛋白质组数据获得后,关于RBC内蛋白质之间的相互作用主要是通过生物信息学进行预测。初步的红细胞相互作用分析是基于Uni HI数据库[9,10]。Goodman等最初基于已发现的RBC内751种蛋白建立了RBC蛋白相互作用网络,并发现751种蛋白中有279种与其它蛋白之间存在相互作用。在对红细胞蛋白质相互作用的研究中重要的发现是“损伤和修复”盒,此盒主要由蛋白酶体亚基、伴侣分子、热休克蛋白组成,对红细胞的损伤修复至关重要。Ammann和Goodman[11]用称为广泛拓扑重叠分析的方法对节点的相似性进行统计学的聚类分析。运用这样的方法发现在镰刀形红细胞贫血中“损伤和修复”盒中的蛋白酶体亚基发生改变。这之后有学者提出了VDG的概念对红细胞蛋白质之间的相互作用进行分析,认为这是一种比聚类分析更快速的分析方法[12]。

4疾病的红细胞蛋白质组学

早期对RBC蛋白质组学与疾病关系的研究是利用双向电泳来比较疾病组织与正常组织中的蛋白质含量。Jiang等[13]用这样的方法比较正常人群和2型糖尿患者之间膜蛋白的差异,在2型糖尿患者的膜蛋白中发现了27个上调点和15个下调点。经MALDI TOF质谱分析发现脂筏蛋白、Flotlin 1、精氨酸酶增加,突触融合蛋白1C减少。推测融合蛋白减少会导致2型糖尿病红细胞膜Glut 4糖尿病载体减少,推测由于精氨酸酶增加而与一氧化氮合酶竞争,从而减少一氧化氮产生。Tonge等[14]利用2D-DIGE研究纯合子镰状细胞疾病(sickle cell disease,SCD)时发现,SCD红细胞膜蛋白中有38个点增加,而纯合子SCD中有11个点增加。用Nano LC MS/MS串联质谱对44个点进行鉴定发现其中有22个有转录后修饰,而纯合子中的蛋白多数与氧化应激有关。Prabakaran等[15]用2D-DIGE对精神分裂患者的红细胞蛋白进行了研究。研究发现,Spectrinα和β-actin的改变可能会影响转录后修饰的改变,而硒绑定蛋白1可作为一种精神分裂症的生物标志物。最近对疾病与红细胞蛋白质组学的研究主要是利用蛋白质组学对疾病的分子基础、疾病进程等进行研究,疟疾、溶血性贫血、阿尔茨海默病、慢性肾病等红细胞膜蛋白组学的相关研究取得了一定的进展。

蛋白质组学在肿瘤研究中的应用 篇9

关键词：蛋白质组学,肿瘤研究,应用

随着人类基因组计划的完成, 生命科学研究已进入了后基因组时代。在这个时代, 生命科学的主要研究对象是功能基因组学, 包括结构基因组研究和蛋白质组研究等。[1]1994年澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams提出了蛋白质组 (Proteome) 的概念。[2]2001年2月, 《Nature》和《Science》杂志对蛋白质组学研究进行了述评与展望。[3,4]蛋白质组学有别于传统的单个基因或单个蛋白的研究模式, 从机体或细胞的整体水平上来阐明生物体全部蛋白质的表达、修饰、结构功能和相互作用, 以及蛋白质和核酸之间的相互作用, 对生命的复杂活动有全面和本质的认识, 在整体、动态和网络水平上对蛋白质进行研究。肿瘤是由环境和遗传因素相互作用的多基因、多蛋白质参与的疾病。蛋白质组学 (Proteomics) 可全面、动态、定量地分析比较正常与癌变标本中蛋白质种类和数量的改变, 不仅有助于肿瘤发病机制的阐明, 还能筛选和鉴定蛋白质特异性标记和特异性抗原, 在肿瘤的早期诊断、治疗和新药研制方面, 具有广阔的应用前景。[5]

一、蛋白质组学在肿瘤研究中的方法

随着后基因组时代的到来, 蛋白质组研究为尽早发现肿瘤标志物提供了可能, 各种技术方法的发展为其运用于肿瘤临床诊断创造了条件, 目前蛋白质组学技术在实验诊断与临床医学中已经得到越来越多的应用, 在蛋白质组学研究中, 蛋白质分离技术、生物质谱技术、生物信息学这三项技术对实验诊断与临床医学发展有决定性的影响, 尤其对肿瘤的早期诊断至关重要。[6]蛋白质组学在肿瘤研究中的主要方法和技术如下。

(一) 双向凝胶电泳技术 (two-dimensional gel electrophoresis , 2DE) 。

该技术主要用于分离细胞或组织蛋白质抽提物, 构建特定组织或细胞蛋白质的“二维电泳图谱”, 分析特定条件下蛋白质的表达状况, 进行蛋白质组差异比较。2DE技术凭借其高通量、高灵敏度、高分辨率和重复性好, 便于计算机进行图像分析处理, 可以很好地与质谱分析等鉴定方法匹配的优点, 已成为目前蛋白质组学研究中最常用的蛋白质分离技术。其他的蛋白质分离技术有液相色谱和毛细管电泳技术。尤其是新近发展的液相色谱技术可与质谱联用, 具有高分辨率, 可直接用于高复杂性蛋白质混合物的分析, 对低丰度蛋白的检测能力超过了2D-PAGE。[7]

(二) 质谱技术。

蛋白质组学研究中常用的质谱技术有: (1) 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS) 技术; (2) 电喷雾串联质谱 (ESI2MS/MS) 技术; (3) 表面增强激光解析离子化-飞行时间质谱 (SELDI-TOF-MS) 技术等。其中SELDI-TOF-MS应用基因芯片的设计理念, 把层析、质谱等技术合理应用于蛋白芯片的检测, 不需进行蛋白质的双向电泳, 能快速、简便地从各种体液和组织中找出疾病相关蛋白质。其最大特点是快速、简便、易行、样品用量少和高通量分析, [8]有潜在的临床应用前景。近来质谱技术与液相色谱联用 (liquid chromatography/ tandem mass spectrometry.LC2MS/ MS) , 具有在高复杂性样本中鉴定低丰度蛋白质的强大功能。有高敏感性和分辨率, 具有较大的动态检测范围, 且所需时间较短, 每次操作时间不超过11h, 可用于大规模临床蛋白质组分析。[9]

(三) 蛋白质组的生物信息学。

生物信息学其在蛋白质组中的研究有两个重要应用: (1) 构建和分析双向凝胶电泳图谱; (2) 数据库的搜索与构建。在后基因组时代, 生物信息学的研究内容已经从对基因组和蛋白质组数据的高效分析, 转移到比较基因组学、代谢网络分析、基因表达谱网络分析、蛋白质结构与功能分析以及药物靶点筛选等, 分别与功能基因组、蛋白质组、结构基因组等研究领域互相配合、紧密相关, 成为目前极其热门的系统生物学研究的重要基石。[10]蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础。生物信息学的发展已给蛋白质组研究提供了更方便有效的计算机分析软件, 特别值得注意的是蛋白质质谱鉴定软件和算法发展迅速。最近发展的质谱数据直接搜寻基因数据库使得质谱数据可直接进行基因注释, 判断复杂的拼接方式。

二、蛋白质组学在肿瘤诊断中的应用

蛋白质组学技术通过比较正常细胞与疾病细胞等各类细胞间的多种差异蛋白的表达, 寻找与疾病发生发展相关的关键蛋白可深入探讨疾病的产生机制, 通过质谱分析等技术确认差异蛋白, 为疾病提供早期诊断依据。贾继辉[11]等运用固相PH梯度双向凝胶电泳等技术, 筛选出猴病毒40转化的人胃黏膜上皮GES-1, 与人胃癌细胞MGC-803间若干与肿瘤发生密切相关的差异表达蛋白质。这种差异蛋白分析有助于深入研究胃癌的发生发展机制, 进而为胃癌的早期诊断和防治提供依据。龙云铸[12]应用双向凝胶电泳和质谱技术, 分析乙型肝炎病毒相关性肝细胞癌HCC癌组织与癌周肝硬化组织之间的蛋白质组差异, 鉴定其中的差异蛋白质点, 发现有表达水平存在显著差异的蛋白质点35个, 14个差异蛋白质点得到了初步鉴定, 其中癌组织凝胶中表达明显的蛋白质有8个:在癌组织中表达明显降低而在肝硬化组织中增强的蛋白质有6个。这为进一步阐明肝癌的发病机制和早期诊断, 奠定了良好的实验基础, 可能有助于癌变机制、肿瘤标记和治疗靶标的进一步研究。

三、蛋白质组学在肿瘤药物研发上的应用

(一) 发现药物作用新靶点定向合成有效药物。

疾病相关蛋白质组学可以提供一种发现和鉴定在疾病作用下表达异常蛋白质的方法。这种蛋白质可以作为药物筛选的靶点。疾病特异性蛋白的不断发现为药物设计提供了丰富的靶点:如Chen等应用蛋白质组学对MCF27乳腺癌细胞在加0.1μmol/L抗肿瘤药阿霉素2d后的蛋白质表达变化进行了研究, 结果发现热休克蛋白27 (HSP27) 变化最为显著;以HSP27作为药物靶点有可能开发出新的抗乳腺癌药物。Oda等采用蛋白质组学技术对有生物活性但未知靶点的化合物进行探测靶点研究, 成功发现了E7070类抗肿瘤药物特异结合蛋白靶点, 以此靶点为研究对象可进一步合成有效药物, 并应用于临床治疗。

(二) 药物作用机制的研究。

通过运用蛋白质组学高通量地对比分析药物作用前后蛋白质表达谱或蛋白质表达丰度的改变有助于药物的作用机制的研究。如Steiner等通过分析抑制素类降胆固醇化合物对小鼠肝脏蛋白质组的影响从药物治疗前后表达变化的蛋白质中鉴定出合成酶, 从而阐明了该类降胆固醇药物的作用机制。此外, 药物蛋白质组学的应用可使药物的子药理机制研究更快速和准确。Bruneau等应用蛋白质组学对白色念珠菌在给予吡啶类药氟康唑和伊曲康唑以及mulundcadin类药物后的基因表达的变化, 发现mulundcadin类药物作用机制为抑制3D葡聚糖合成酶的表达, 而吡啶类药的作用机制为抑制麦角固醇合成酶的表达。上述研究提示通过蛋白组学研究明确分子药理机制, 可使药物作用的关键靶点更加清晰, 为药物研制带来新的思路和途径。

(三) 药物毒理机制的研究。

蛋白质组学在药物研究上的应用使人们对药物毒理机制的认识达到了一个新高度。通过这方面的研究, 可以使许多药物的毒副作用得到准确而快速的揭示。尽管一些药物的毒性在临床上早已为人所知, 但对其机制并不完全清楚。如庆大霉素明显的毒副作用是肾毒性, Kennedy等运用蛋白质组学研究了庆大霉素治疗后的大鼠血清标本, 发现了评价庆大霉素毒性的非侵入性标志物。此外, 蛋白质组学与传统方法的有机结合在鉴定药物毒理机制上具有重要意义。如Heijne等将蛋白质组学和基因组学结合起来研究溴苯的毒性发现了溴苯诱导多个基因的表达的特性, 表明了二者相结合的重要性。

四、蛋白质组学在肿瘤治疗中的应用

蛋白质组学研究现已在多种人类肿瘤组织或细胞系如卵巢癌、子宫癌、肾癌、胃癌中开展, 并取得了一些成果。

(一) 胃癌。

胃癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤, 在高病死率的恶性肿瘤中胃癌居首位。提高胃癌患者生存率、降低病死率关键在于早发现、早诊断及早治疗, 而积极寻找敏感性和特异性较高的胃癌标记物为胃癌早诊断提供了强有力的手段。Ebert等[14]利用SELDI-TOF-MS技术对胃癌和健康人血清进行研究建立了一个包含50个决策树的分类模型, 在诊断胃癌的特异性和敏感性都达到100%。而Landuyt等[15]对胃肠道间质瘤 (GIST) 的研究发现, C-kit基因中外显子9和外显子11突变的2组肿瘤, 应用SELDI-TOF-MS检测蛋白质质谱发现有154个不同的蛋白质表达, 提示C-kit基因不同外显子突变的GIST可能具有完全不同的表现。

(二) 肺癌。

肺癌已成为本世纪发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一, 严重危害人类健康和生命。Ying等[20]利用蛋白质技术探讨肺组织癌变过程。对原代细胞R15H和经238Pu高能量α粒子照射HPV218永生化人支气管上皮细胞BEP20得到早期传代细胞R15H20, 用蛋白质技术分析, 发现两系细胞中有43个蛋白质点强度改变, R15H20与R15H相比, 21种蛋白表达增加, 22种蛋白表达减少;3种蛋白质仅在R15H细胞表达, 其中2种被确定为高移动蛋白组1;在R15H20细胞中减少的2种蛋白被确定为maspin前体。

(三) 乳腺癌。

乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤, Luftner等[16]应用蛋白质组学发现了分子量为2813KD的血清蛋白NMP66, 其对乳腺癌早期诊断 (无腋窝淋巴结转移) 的特异性达到100%, 且对导管内癌的诊断敏感性高达80%, 可作为预测导管内癌术后复发及治疗效果的重要指标。Wright等[17]也发现NMP66在健康人和乳腺纤维瘤患者以及乳腺良性疾病中均不存在。Alaiya等[18]研究发现, 在不同临床病理类型中蛋白质表达形式也有所不同, 侵袭性癌中核增殖抗原和某些膜蛋白质如HSP90、PHSP60等存在高度表达, 而在乳腺纤维腺瘤和侵袭性癌之间共有24个已知蛋白的差异表达。

(四) 宫颈癌。

宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤, 近年来发病率有明显增高及年轻化的趋势, 严重威胁了广大妇女健康。Matsui等使用22DE和MALDI2TOF～MS技术在ME2180宫颈癌细胞中鉴定出IFNγ、TNF调节蛋白和三种细胞因子调节蛋白 (丙糖酸磷酸化异构酶、蛋白酶体亚单位C3及GTP连接蛋白RAN) 。Sahota等[19]使用WSQ4蛋白芯 (0220000Da) , 在50例患者 (包含宫颈癌和非癌患者) 中检测到32个蛋白峰, 它们全部出现在阳性组或对照而在另一组缺如, 说明宫颈癌组细胞的蛋白与非癌组有明显差异。

(五) 卵巢癌。

由于卵巢位于盆腔深部, 不易扪及或查出, 80%的患者就医时卵巢的恶性肿瘤都不是早期, 医学上对其至今都缺乏有效的早期诊断方法, 故卵巢癌已成为严重威胁妇女生命的肿瘤。Moshkovskii等[20]采用SELDI2TOF2MS、22DE及HPLC方法对27份卵巢癌标本中的蛋白质组进行了分析, 结果发现15份 (55.6%) 标本中出现1117kDa及11.5kDa双峰, 而对照组34份中仅有2份 (5.8%) 出现双峰现象, 同时发现11.7kDa的本质为血清淀粉A1, 11.5kDa为其N2末端缺少精氨酸的变构体, 二者皆可作为早期卵巢癌的肿瘤标志物。Yu等[21]采用SELDI2TOF2MS方法研究了32例卵巢癌肿瘤标本, 29例作为健康对照, 结果发现了5种潜在的肿瘤标志物:2085Da、5881Da、7564Da、9422Da、6044Da, 其敏感度、特异性和阳性预测值皆可达到96.7%。

五、展望

植物细胞核蛋白质组学研究进展 篇10

1 植物细胞核与核蛋白质的制备

目前的植物细胞核蛋白质组学研究,主要是从植物幼苗或悬浮培养细胞中提取细胞核。从幼苗中提取细胞核,首先在低温条件下将幼苗研磨成粉末,进而通过以Percoll为介质的密度梯度离心富集细胞核[1]。从悬浮培养细胞中提取细胞核,利用匀浆机破碎或细胞壁水解酶除去细胞壁,然后通过改变细胞内外渗透压破碎原生质体,并利用密度梯度离心富集细胞核[1]。获得细胞核以后,通常利用DAPI染色后的显微观察,或通过测定细胞核制备液中叶绿素含量等方法来评价细胞核的纯度。然后利用酚抽法或TCA丙酮沉淀法提取细胞核蛋白质。进而,以组蛋白或核仁纤维蛋白为细胞核标记蛋白质,通过免疫印迹实验来检测细胞核蛋白质的纯度,也可通过检测过氧化氢酶活性来评价细胞核蛋白质的纯度。

2 水稻细胞核蛋白质组学

水稻(O.sativa)是重要粮食作物,也是进行分子生物学研究的良好模式植物。Aki et al[2]利用蛋白质组学技术鉴定了563种水稻细胞核蛋白质,其中307种为DNA结合蛋白质。这些蛋白质中除了包括mRNA转录和剪切相关的因子外,还包括参与糖信号传递的己糖激酶,以及参与蛋白质相互作用的WD40类蛋白等。此外,Choudhary et al[3]鉴定了水稻响应干旱胁迫过程中的109种细胞核蛋白质,这些蛋白质主要参与胁迫防御、信号转导、染色质重塑、基因调控、转录调节、蛋白质合成与降解等过程。其中受干旱胁迫影响的蛋白质主要包括:参与胁迫早期应答的受体类蛋白激酶、33-kDa分泌蛋白、酪氨酸磷酸酶类蛋白质、无机焦磷酸酶,参与细胞代谢活动的氨基转移酶、亚甲基四氢叶酸还原酶、甲基转移酶、硫甲基转运酶,以及参与细胞防御的超氧化物歧化酶等[3]。

3 维柯萨细胞核蛋白质组学

维柯萨(X.viscosa)是典型的复苏植物,其叶片组织相对含水量可以降低到5%,在持续干旱80 h后复水,叶片仍可以完全恢复。Abdalla et al[4]鉴定了维科萨叶片细胞核中18种干旱应答蛋白质。其中参与基因表达(如反转录酶、锌指解旋酶和内含子成熟酶)、蛋白质合成(如核糖体蛋白L28和蛋白翻译延伸因子)、蛋白质折叠(如分子伴侣)、蛋白质降解(如蛋白水解酶),以及能量代谢(如ATP合成酶α链)等蛋白质表达受到干旱诱导。这表明维柯萨通过调节特定基因表达与蛋白质折叠等应对干旱胁迫[4]。

4 洋葱细胞核蛋白质组学

洋葱(A.cepa)根分生组织具有持续或周期性分裂能力,是研究细胞周期与细胞增殖的良好材料。GonzálezCamacho et al[5]比较分析了洋葱根分生组织和非分生组织细胞核蛋白质组的差异。他们利用双向电泳技术在根分生组织中检测到384个蛋白质点,在非分生组织中检测到209个蛋白质点。其中,一些人们熟知的细胞核蛋白质,如RNA聚合酶Ⅰ、B23和类核仁蛋白NopA100在细胞增殖过程中表达量明显上升。进而,他们通过双向电泳结合Western杂交实验在分生组织样品中检测到26个NopA100的蛋白质斑点,而在非分生组织中只检测到7个蛋白质斑点。这表明,NopA100被磷酸化的程度与细胞核的活性相关,在细胞周期过程中NopA100可能被高度磷酸化。

5 拟南芥细胞核蛋白质组学

拟南芥(A.thaliana)是基因组背景清楚的模式植物,适用于细胞核蛋白质组学研究。Jones et al[6]鉴定了拟南芥悬浮培养细胞细胞核表达的345种蛋白质中的416条磷酸化多肽,极大地丰富了细胞核磷酸化蛋白质数据库。其中一些蛋白质(如转录因子、染色质重塑蛋白质、RNA沉默组分和剪切体等)磷酸化位点是新鉴定到的。这些信息为进一步研究蛋白质翻译后修饰在植物细胞中mRNA的转录、可变剪切与沉默过程中的作用提供了重要线索。Calikowski et al[7]成功分离了拟南芥悬浮培养细胞的细胞核基质,并利用双向电泳技术分离得到300个核基质蛋白质斑点。他们鉴定到了36种核基质蛋白质,主要包括核仁蛋白质IMP4、Nop56、Nop58、纤维蛋白和核仁素等,也包括核糖体蛋白质、组蛋白去乙酰化酶、翻译起始因子、热激蛋白和DnaJ等。这些为深入研究核仁甲基化作用和核仁定位等生物学功能提供了重要信息。此外,Pendle et al[8]鉴定了拟南芥悬浮培养细胞核仁中的217种蛋白质。他们对其中72种蛋白质进行了GFP融合蛋白表达,结果表明87%的蛋白质表现为核仁或核仁相关定位。他们还意外地发现6种外显子联接复合体(exonjunction complex)的组分,为深入研究植物细胞mRNA向细胞核外运输和无义介导的mRNA降解(Nonsense-mediated mRNA decay)提供了线索。

6 鹰嘴豆细胞核蛋白质组学

鹰嘴豆(C.arietinum)是豆科草本植物,也是重要的粮食作物。Pandey et al[9]利用双向电泳技术分离得到了鹰嘴豆幼苗细胞核中表达的600多个蛋白质斑点,并利用液相色谱结合质谱技术鉴定了150种蛋白质。其中,多数蛋白质参与信号转导和基因表达(占36%),以及DNA修复与转录(占17%)。这也是对基因组未知植物物种细胞核蛋白质组的首次报道。他们进一步分析了鹰嘴豆幼苗147种干旱胁迫应答细胞核蛋白质组的变化。这些蛋白质包括重要的调控蛋白质和功能蛋白质,如:各种分子伴侣,以及参与基因转录与复制、细胞信号转导、染色质重塑的蛋白质[10]。

7 大豆细胞核蛋白质组学

大豆(G.max)是重要的粮食作物和油料作物,由真菌(Phakopsora pachyrhizi)引起的大豆锈病对大豆产量有很大影响。Cooper et al[11]利用高通量液相色谱结合质谱技术比较了易染病大豆品种Williams 82与含有Rpp1抗性基因的Williams 82近等基因系叶片细胞核蛋白质组的差异。他们鉴定到了4 975种细胞核蛋白质,并发现其中847种蛋白质被磷酸化修饰,其中大量蛋白质是核调控蛋白质与转录因子。这些结果表明,真菌侵染会诱导细胞核蛋白质的表达与翻译后修饰。

8 展望

近年来的植物细胞核蛋白质组学研究为深入分析植物基因表达与调控机制提供了重要信息。但是由于受到蛋白质分离技术和质谱检测灵敏度的限制,对一些低丰度表达核蛋白质的鉴定仍然是植物细胞核蛋白质组学研究的瓶颈。今后,随着更多植物种类全基因组序列测定的完成,以及蛋白质分级与鉴定技术的完善,对更多物种细胞核蛋白质组进行研究将成为可能。同时,深入分析细胞核蛋白质的翻译后修饰与相互作用将为解析植物发育与环境应答的调控机制提供更重要的信息。

参考文献

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[2]AKI T,YANAGISAWA S.Application of rice nuclear proteome analysisto the identification of evolutionarily conserved and glucose-responsivenuclear proteins[J].J Proteome Res,2009,8(8):3912-3924.

[3]CHOUDHARY M K,BASU D,DATTA A,et al.Dehydration-responsivenuclear proteome of rice(Oryza sativa L.)illustrates protein network,novel regulators of cellular adaptation,and evolutionary perspective[J].Mol Cell Proteomics,2009,8(7):1579-1598.

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[9]PANDEY A,CHOUDHARY M K,BHUSHAN D,et al.The nuclearproteome of chickpea(Cicer arietinum L.)reveals predicted and unexp-ected proteins[J].J Proteome Res,2006,5(12):3301-3311.

[10]PANDEY A,CHAKRABORTY S,DATTA A,et al.Proteomics approachto identify dehydration responsive nuclear proteins from chickpea(Cicer arietinum L.)[J].Mol Cell Proteomics,2008,7(1):88-107.