病毒蛋白

病毒蛋白（精选10篇）

病毒蛋白 篇1

猪瘟病毒 (classical swine fever virus, CSFV) 自1833年首次发现于美国的俄亥俄州以来已有百余年的历史, 世界上所有养猪国家都曾有过不同程度的流行, 给养猪业造成了极大的经济损失。在我国, 猪瘟是引起养猪业损失的最重要的传染病之一, 在各省市均有流行, 其中以地区性散发为主。

1 猪瘟病毒基因组结构

CSFV的基因组大小约12.3kb, 由5'端非编码区, 开放阅读框和以及3'端非编码区三部分组成。开放阅读框编码一个多聚蛋白, 此多聚蛋白又进一步被加工为4个成熟的结构蛋白和7个非结构蛋白, 由5'~3'分别为Npro、C、E0、E1、E2、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。

CSFV的毒力是多种蛋白共同作用的结果, 并非由某一种蛋白决定。研究发现, 能诱导产生猪瘟病毒抗体的主要是由基因E0、E2以及NS3所编码的蛋白质, 其中E0蛋白和E2蛋白是主要的抗原蛋白, 能引起高水平中和抗体的产生。因此, 研究者常将其作为研究CSFV毒力的靶标。

2 猪瘟病毒毒力基因及功能

2.1 E0蛋白

E0蛋白也称Erns, 由病毒ORF上Glu268~Ala494组成, 共227个氨基酸。它能诱导机体产生中和抗体, 是主要的保护性抗原之一。李艳蕊等表达CSFV的E0蛋白能特异识别CSFV抗体, 且具有很好的反应原性。

E0是一种尿嘧啶特异的核酸酶, 可以表达不同的生物学活性, 已证明的有神经毒性、抗蠕虫和免疫抑制活性, 其活性在pH4.5~6.5时最高, 最适温度为55℃, 酶活性不受Ca2+、Mg2+或EDTA的影响, 但能够被Zn2+离子抑制。E0对DNA没有活性, 只作用于RNA, 对富含U序列活性最高。E0的RNase活性能够影响宿主细胞中病毒RNA的复制, 并且对感染动物早期的免疫防御有一定的抑制作用。Luo等研究认为E0能够结合到外源性的dsRNA上并抑制IFN-β产生, 却不能阻断TRIF介导的IFN-β产生。

E0蛋白在介导病毒入侵易感细胞中发挥关键作用。猪瘟病毒通过与E0和E2的相互作用进入易感细胞。Van Gennip HGP等利用在昆虫细胞表达的E0和E2蛋白进行的抑制试验表明, 猪瘟病毒最初结合到细胞上是通过E0蛋白介导的, 试验还证实, E0 C端的肽段 (480-KKLENKSK-487) 是相互作用所必须的。

2.2 E2蛋白

E2蛋白是CSFV最主要的结构蛋白之一, 也是猪瘟病毒各基因中研究最多的。不同毒株E2核苷酸序列差异常被用于瘟病毒属中不同成员之间区别的依据之一。

近年来, 研究证实了E2分子由四个抗原结构域A、B、C、D组成, 位于E2 N末端的690~866位氨基酸处。A结构域又分为A1、A2和A3三个功能区, 是E2蛋白的中心部位, 为一段保守区, A1亚区能诱导产生中和抗体;A3亚区靠近B、C区, 不能诱导产生中和抗体, 也不具保守性;B和C均为非保守区, 是诱导产生中和抗体的主要部位;D区既不能诱导产生中和抗体也不保守。刘珂等在大肠杆菌中诱导表达E2蛋白, 证明猪瘟病毒E2糖蛋白A/D区是其线性B细胞表位区。

E2是目前研究最热的CSFV候选疫苗靶标。大多数CSFV的疫苗都是根据毒株的主要抗原决定簇E2设计和开发的。目前, 许多研究者针对E2设计出了标记疫苗, 从而有助于从疫苗接种猪群中筛查出野毒感染猪。Van等利用杆状病毒表达了CSFV E2 (不包括跨膜区) , E2的A区及E2的B/C区制成亚单位标记疫苗, 结果均能使免疫猪产生抵抗强毒攻击的保护。

2.3 NS3

NS3蛋白为多功能酶蛋白, 具有RNA激活的解旋酶活性、核苷三磷酸酶活性及丝氨酸蛋白酶活性。NS3蛋白的丝氨酸蛋白酶和核苷三磷酸酶/RNA解旋酶活性分别位于其N端的1/3区和C端的2/3区, 在NS3蛋白上可能处于两个相对独立的功能结构区。前者主要负责病毒多聚蛋白的翻译后加工, 产生成熟的病毒蛋白, 而NTPase/helicase则主要参与病毒RNA的复制过程。同时, NS3蛋白通过阻断干扰素调节因子-3, 可能阻断了干扰素的产生, 从而避开了机体的先天性免疫而产生了免疫逃避。有研究者报道NS3与瘟病毒体外致细胞病变有关。徐浩利用PK-15细胞系表达非结构蛋白NS3来研究CSFV致细胞病变作用, 结果显示, 转染p EGFP-NS3的阳性细胞出现凋亡, 且凋亡现象与细胞内的NS3蛋白表达量有关。

除此之外, 猪瘟病毒基因组编码的其他蛋白质也在CS-FV入侵及致病方面发挥了重要作用。如Npro在病毒逃避天然免疫的过程中起着一定的作用;NS2由其多聚蛋白前体NS2-3经两个蛋白酶水解切割而释放出来的一种参与病毒基因调控的非结构蛋白;NS4B的疏水区是病毒复制的必需原件;NS5A蛋白参与病毒增殖等。

摘要：猪瘟病毒是黄病毒科瘟病毒属成员, 能引起各种年龄段猪的急性、热性和高度致死性的传染病。本文就猪瘟病毒的分类、形态及及病毒的基因组结构进行了综述, 并对其编码的几种主要抗原蛋白E0、E2、NS3的功能等进行了简要介绍。

关键词：CSFV,E0,E2,NS3

参考文献

[1]Martin Beer, et al.Novel marker vaccines against classi cal swine feve[J].Vaccine2007 (25) :5665-5670.

[2]李艳蕊, 等.猪瘟病毒Erns蛋白在毕赤酵母中的表达和鉴定[J].湖南农业科学, 2010 (5) :130-134.

[3]M.von Freyburg, et al.Comparison the effects of RNase-negative and wildtype classical swine fever on peripheral blood cells of infected pigs[J].J virol2004 (85) :1899-1908.

[4]Xuelian Luoa, et al.Glycosylation of classical swine fever virus Erns is essential for binding double-stranded RNA and preventing interferon-beta induction[J].Virus Re search, 2009 (146) :135-139.

[5]刘珂, 等.猪瘟病毒E2蛋白抗原表位的表达与免疫活性研究[J].动物医学进展, 2008, 29 (5) :40-42.

[6]P.A.van Rijn, et al.An experimental marker vaccine and accompanying serological diagnostic test both based on envelope glycoprotein E2of classical swine fever virus (CSFV) [J].Vaccine, 1999 (17) :433-440.

[7]徐浩.猪瘟病毒NS3蛋白致PK-15细胞病变作用及转录靶向猪瘟病毒3’-UTR shRNA细胞株的建立[D].硕士论文, 西北农林科技大学, 2007 (5) :5.

病毒蛋白 篇2

目的:构建新型的.马传染性贫血病毒(EIAV)的候选疫苗.方法:利用BAC-To-BAC杆状病毒表达系统,将中国马传贫驴白细胞弱毒疫苗(EIAV DLV)及其亲本株(EIAV LN)env基因导入到杆状病毒基因组中.转染昆虫细胞后,得到的重组病毒用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物.以本实验室构建的含有EIAV Env基因的重组痘苗病毒,单独或与重组杆状病毒表达的EIAV Env蛋白联合免疫小鼠.结果:构建的重组杆状病毒能正确表达全长Env蛋白.与单独免疫组相比,联合免疫组免疲应答显著增强,其中中和抗体的滴度提高5～9倍.结论:含有EIAV Env基因的重组痘苗病毒与Env蛋白抗原联合免疫,能够诱导高滴度的中和抗体.

作 者：代春铭 张晓燕 张然然 邵一鸣 沈荣显 DAI Chun-ming ZHANG Xiao-yan ZHANG Ran-ran SHAO Yi-ming SHEN Rong-xian 作者单位：代春铭,DAI Chun-ming(中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防与控制中心病毒免疫室,北京,100050;首都医科大学免疫学系,北京,100054)

张晓燕,张然然,ZHANG Xiao-yan,ZHANG Ran-ran(中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防与控制中心病毒免疫室,北京,100050)

邵一鸣,SHAO Yi-ming(中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防与控制中心病毒免疫室,北京,100050;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所疫病室,黑龙江哈尔滨,150001)

沈荣显,SHEN Rong-xian(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所疫病室,黑龙江哈尔滨,150001)

病毒蛋白 篇3

【关键词】纳洛酮；丙种球蛋白；小儿病毒性脑炎

【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2015）02-0009-02

小儿病毒性脑炎，是儿科当中常见的一种疾病，其致残率非常高，严重者甚至危及患儿生命[1]。本文研究当中，针对小儿病毒性脑炎疾病的患儿，通过纳洛酮联合丙种球蛋白进行治疗，取得的临床成效是非常可观的，现将详情报告如下文所示。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选自2013年11月到2014年10月，位于我院儿科，实施病毒性脑炎疾病治疗的患儿作为研究对象，共收集104例。所有患兒入院后，经过临床诊治，均符合病毒性脑炎疾病的标准。将这104例病毒性脑炎患儿随机分组分为观察组和对照组这两组，每组各52例。观察组当中，男性患儿占32例、女性患儿占20例，年龄1岁到14岁之间、平均年龄（7.21±2.61）岁；对照组当中，男性患儿占30例、女性患儿占22例，年龄10个月到13岁之间、平均年龄（7.03±2.24）岁。对两组病毒性脑炎疾病患儿的性别、患儿的年龄等一般资料进行比较，没有明显的对比差异，不具有统计学意义（P>0.05），因此可以进行研究对比。

1.2 方法

给两组病毒性脑炎患儿，都采取常规综合方式[2]治疗。具体内容为，给予患儿抗病毒处理、降颅内压处理、降温解痉治疗、脑细胞营养补充和纠正紊乱代谢，必要时根据患儿病情，给予糖皮质激素进行短期的辅助治疗。观察组在常规综合治疗基础上，采取纳洛酮联合丙种球蛋白的方式[3]进行治疗。纳洛酮每日使用1mg/（kg.d）剂量，分为三次静脉滴注；丙种球蛋白每日使用500mg/（kg.d）剂量，静脉滴注的方式治疗，共计治疗两周。

1.3 观察指标及疗效判定标准

1.3.1观察指标

根据两组病毒性脑炎患儿的治疗方式对患儿实施治疗，观察两组患儿的临床病情症状和生命体征，主要包括头晕症状、呕吐症状、发热症状、惊厥症状、意识存在一定的障碍等，监测患儿的脑电图情况、脑脊液情况，记录两组患儿的住院时间，测评两组患儿的治疗效果，以此作为观察指标。

1.3.2疗效判定标准

观察两组病毒性脑炎患儿在经过治疗后的效果，将其分为三个等级标准：

显效：在治疗后的四天内，患儿的临床病情症状和生命体征基本恢复正常。

有效：在治疗后的五天到七天内，患儿的临床病情症状和生命体征基本恢复正常。

无效：在治疗后超过八天，患儿的临床病情症状和生命体征才基本恢复正常。

总有效率=（显效例数+有效例数）/总例数×100%

1.4 统计学处理

两组治疗病毒性脑炎疾病的患儿中，其各项观察指标情况的研究数据，在本次研究结束后，均准确无误地录入到SPSS19.0软件中，进行统计数据处理，以95%作为可信区间。使用均数±标准差x±s表示为计量资料，对比方法为t检验；使用例数（%）表示为计数资料，对比方法使用χ?检验。当P<0.05时，表示两组病毒性脑炎疾病患儿之间，对比不同方式的治疗效果存在差异，统计学具有意义。

2 结果

两组病毒性脑炎疾病的患儿分别接受治疗后，其临床病情症状、生命体征等恢复的时间均有不同。根据结果显示，观察组患儿的总有效率是92.31%，对照组患儿的总有效率是71.15%。由此可以得出，观察组病毒性脑炎疾病患儿的总有效率高于对照组，故此，两组病毒性脑炎疾病的患儿之间，对比不同方式的治疗效果有明显差异，统计学具有意义（P<0.05）。

3 讨论

在儿科疾病当中，小儿病毒性脑炎疾病的感染途径，主要包括消化道、呼吸道等，在病毒侵入患儿机体后，进入患儿中枢神经系统的方式，主要是通过血循环系统和血脑屏障，从而造成患儿脑实质受损，导致患儿出现头晕情况、呕吐情况、发热情况、惊厥情况以及意识出现障碍等临床病情症状和生命体征。

纳洛酮[4]主要是用来治疗阿片类药物中毒，使用纳洛酮药物治疗后，只会导致极少数的患儿出现呕吐、口干、厌食、恶心、血压升高、心率加快等轻微的不良反应情况，且大部分患儿产生此类不良反应后，都不需要进行处理就能自行恢复，不会给患儿术后造成任何困扰。纳洛酮应用于小儿病毒性脑炎疾病的治疗，能够有效抑制中枢神经系统阿片受体和内啡肽结合，改善患儿的呼吸中枢，阻止形成自由基，从而改善患儿的脑水肿、脑代谢情况，恢复患儿的正常意识，保障患儿的呼吸作用，并且可以直接对患儿的神经细胞起到保护作用。丙种球蛋白[5]能够提高患儿机体抵抗能力，增加患儿的抗体含量，平衡病毒感染，起到切断免疫损伤的效果。在本次研究当中，观察组病毒性脑炎患儿，在采取常规综合治疗基础上，采取纳洛酮联合丙种球蛋白的方式进行治疗后，其治疗的总有效率高达92.31%，而对照组病毒性脑炎患儿，只进行常规综合治疗后，其治疗的总有效率仅有71.15%。由此可见，两组病毒性脑炎患儿的治疗效果对比有差异，统计学具有意义（P<0.05）。

综上所述，针对小儿病毒性脑炎疾病的患儿，通过纳洛酮联合丙种球蛋白进行治疗，能够有效缓解患儿的临床病情症状和生命体征，缩短治疗时间，在保障显著的治疗效果同时，还能获得临床上较高的系统评价。

参考文献：

[1]宋献丽，许立民，孔磊等.高压氧治疗小儿病毒性脑炎的疗效观察及护理[J].护士进修杂志，2011，26（20）：1912-1913.

[2]黄纯，梁文旺.更昔洛韦、大剂量丙种球蛋白联合治疗小儿病毒性脑炎35例[J].广西医科大学学报，2010，27（5）：796-797.

[3]张玉彩，邹东方，胡婷等.小儿病毒性脑炎血清、脑脊液中S100B蛋白与sVCAM-1含量的变化[J].中国妇幼保健，2012，27（19）：3010-3013.

[4]徐海平，洪丽娟，刘清宁等.系统护理干预对小儿病毒性脑炎治疗效果的影响[J].齐鲁护理杂志，2011，17（16）：7-9.

病毒蛋白 篇4

关键词：乙型肝炎病毒,外膜大蛋白

乙型肝炎病毒(HBV)感染在我国具有较高的发病率,也是引起肝硬化、原发性肝癌的重要病因之一。长期以来,在乙型肝炎的诊断中,人们习惯用HBV DNA或乙型肝炎e抗原(HBeAg)是否阳性来判断乙型肝炎患者体内HBV复制及传染性的强弱。但随着HBeAg 变异株的出现以及近年来随着对乙肝表面抗原大蛋白中前S区抗原在乙肝发病机制、感染与复制等方面研究的深入,研究者们逐渐认识到乙肝表面抗原前S区具有越来越重要的临床意义。HBV S基因编码合成的HBV外膜蛋白由3种蛋白组成,包括小蛋白、中蛋白和大蛋白。小蛋白即HBsAg,中蛋白即HBsAg和PreS2Ag,乙肝病毒大蛋白(HBV-LP)即HBsAg,PreS2Ag和PreS1Ag。作为一个新的HBV血清学检测指标,HBV外膜大蛋白(HBV-LP)检测已被应用于实验室诊断HBV感染、复制和治疗效果、预后评估的一个重要指标。本研究通过同时检测乙肝患者血清HBV-LP及HBV DNA,验证HBV-LP能否替代HBV DNA检测,作为一种新的判断病毒复制的诊断指标。

1 资料与方法

1.1 研究对象

104份血清标本均来自2011年2月-2012年11月本院门诊或住院的乙肝患者,男79例,女25例;年龄21～76岁,平均年龄37.2岁。所有病例选择均符合2000年中华医学会传染病与寄生虫病学分会制定的《病毒性肝炎防治方案》中的诊断标准[1],其中HBV DNA阳性血清标本72份。

1.2 检测试剂与方法

HBV“二对半”检测采用时间分辨荧光免疫分析法,试剂由苏州新波生物技术有限公司提供; HBV-LP检测采用ELISA法,试剂由北京热景生物技术有限公司提供。HBV DNA 由广州达安基因股份有限公司提供检测;测定采用FQ PCR,其含量小于1.00×103copies/ml时判为阴性,反之判为阳性。

1.3 统计学分析

应用SPSS12.0统计软件,计数资料采用四格表χ2检验,血清HBV-LP水平与HBV DNA对数值之间相关性采用相关分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 104例乙型肝炎感染者的HBV-M、HBV DNA、HBV-LP检测情况

不同HBV-M模式的HBV DNA、HBV-LP阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。HBeAg阳性者34例,HBV-LP与HBV DNA阳性检出率分别为94.12%和97.06%,两者差异无统计学意义(P>0.05)。HBeAg阴性者70例,HBV-LP与HBV DNA阳性检出率分别为51.43%和55.71%,两者差异无统计学意义(P>0.05)。而HBeAg阳性模式中HBV-LP与HBV DNA阳性率明显高于HBeAg阴性模式,两者差异有统计学意义(P<0.05)。检测结果见表1。

2.2 HBV-LP浓度均值与HBV DNA相关比较

HBV DNA含量(拷贝数对数)与 HBV-LP浓度均值呈正相关关系(r=0.917),HBV-LP阳性率与HBV DNA载量之间存在关联性(χ2=9.035,P<0.01),且随着HBV DNA载量的增加而增加,表明HBV DNA拷贝数与HBV-LP阳性率之间有很好的一致性,见表2。

2.3 HBV DNA与HBV-LP、HBeAg阳性率比较

72例血清HBV DNA阳性患者中,HBV-LP阳性65例,阳性率90.3%。表明在HBV DNA阳性患者中,HBV-LP在判断HBV病毒复制方面与HBV DNA的临床意义是高度一致的,且明显高于HBeAg阳性率(52.8%)。两者差异有统计学意义(P<0.01)。提示HBV-LP在反映HBV复制程度方面,明显优于HBeAg的检测,见表3。

3 讨论

近年来研究发现,由HBV S基因编码合成的HBV-LP存在于感染性颗粒(Dane颗粒)和亚病毒管状颗粒上,是病毒形成完整外膜的重要标志,与病毒复制密切相关。其具有反式激活病毒复制的作用,并与病毒颗粒从细胞内释放调节有关,过量HBV-LP在肝细胞内质网积聚是导致内质网应激反应的关键因素[2]。有研究表明HBV-LP具有独特的跨膜拓扑结构,其内侧可以和HBV核壳体膜结合,外侧可与病毒受体结合,是HBV颗粒成熟包装的关键。由于单独的前S区抗原作为乙肝表面抗原大蛋白的一部分,无法模拟其复杂的拓扑结构,通过此方法制作的单克隆抗体只具有线性表位,这种针对低级结构抗原制作出的单克隆抗体在实际运用中便有可能造成漏检。而乙肝病毒大蛋白试剂利用构象型前S区的高亲和力、高特异性的单抗,敏感性和特异性均优于HBV PreS1Ag、HBV PreS2Ag的检测。

本研究显示,在HBV感染的HBeAg阳性血清中,HBV DNA与HBV-LP阳性率很高,两者差异无统计学意义(P>0.05)。表明在此种情况下,HBV-LP在判断HBV复制方面,与HBV DNA、HBeAg的临床意义是一致的。但在HBeAg阴性血清中,HBV-LP与HBV DNA仍具有较高的阳性率(本实验中分别为51.43%和55.71%)。说明HBeAg阴性患者病毒复制并未终止或病毒血症并未消失[3]。分析可能是部分患者体内HBV前C区或CP区基因发生变异,导致HBeAg合成障碍[4],临床检测HBeAg敏感性降低,甚至出现假阴性结果。但这部分患者乙肝病毒仍然活跃复制,病情凶险,预后往往比HBeAg阳性患者更差。因此,HBV-LP在一定程度上可以弥补HBV-M检测的不足,可以更加真实地反映HBV在体内复制和感染情况。

HBV DNA是目前临床判断HBV复制和传染性大小的可靠指标,但不能反映缺乏核酸的亚病毒的存在和载量,可出现假阴性结果。HBV基因变异和抗病毒药物的广泛应用又常导致HBeAg阴性或HBV-M特殊阳性模式,常常给乙型肝炎患者的诊断和治疗带来困难[5]。本实验结果显示,在32例HBV DNA检测阴性(HBV DNA<103拷贝/ml)的乙型肝炎患者中,有3例HBV-LP阳性,表明在这部分病例中,HBV-LP仍有较高的阳性检出率,分析原因可能是(1)含有HBV-LP的亚病毒管状颗粒的数量远远高于完整病毒颗粒的数量,故血液中消退的时间也晚于HBV DNA。(2)近年来抗病毒药物广泛应用,但是抗病毒只能抑制HBV DNA的复制,并不能抑制已经形成的病毒表达蛋白质,即并不减少前基因组RNA和mRNA,提示以病毒DNA为模板的转录和病毒蛋白的转译表达不受影响,因此血DNA下降速度可能远快于HBV-LP[6]。(3)

由于HBV具有适应性和变异性倾向,导致HBV变异频繁,已经设计好的商品化PCR引物有一定的漏检率,而HBV-LP检测是采用单克隆抗体特异识别,受基因变异影响较少。因此,HBV-LP亦可作为HBV DNA的补充项目。

综上所述,HBV-LP在不同HBV-M感染模式中,与HBV DNA的阳性率比较吻合,而且HBV-LP浓度能较好的反映体内HBV DNA的存在状态。再加上PCR技术要求精密,条件高,易发生污染和假阳性,不适合基层医院的开展。而HBV-LP采用ELISA法检测,操作简便、经济、快速,更适合作为HBV-M与HBV DNA的补充项目,在临床判断乙型肝炎病毒的复制和疾病的预后具有重要的参考价值。

参考文献

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[3]Lim SG,Cuindon S,et al.Viral quasi-species evolution duringhepatitis Be antigen seroconversion(J).Gastroenterology,2007,133(3):951-958.

[4]孙颖,孙颖,辛绍杰,等.乙型肝炎病毒外膜大蛋白检测对于判定HBV DNA复制的意义(J).世界华人消化杂志,2006,14(3):354-357.

[5]刘灿,陈静,李雯.化学发光法与ELISA法对乙肝两对半少见模式测定的比较分析(J).中国实验诊断学,2007,11(12):1680-1681.

病毒蛋白 篇5

对对虾白斑综合症病毒(WSSV)基因组序列分析发现,基因组3%的区域均匀分布有与昆虫杆状病毒类似的9个同源重复区,很可能具有昆虫杆状病毒同源重复区参与病毒复制起始或转录调控的功能.以WSSV基因组同源重复区中一个包含高度保守结构域的小重复片断DNA(210bp)作为配体,利用WSSV基因组噬菌体展示库,经过5轮淘选出一个可与DNA特异结合的重组噬菌体克隆,包含的外源DNA片断长度为306bp.通过与WSSV基因组序列对比,发现该序列为WSSV的ORFs中wsv 021的.5′端部分.推测wsv 021是一个可能与病毒复制或调控相关的重要功能基因.

作 者：朱艳冰 杨丰 ZHU Yan-bing YANG Feng 作者单位：朱艳冰,ZHU Yan-bing(集美大学生物工程学院,福建,厦门,361021;国家海洋局第三海洋研究所,福建,厦门,361005)

杨丰,YANG Feng(国家海洋局第三海洋研究所,福建,厦门,361005)

病毒蛋白 篇6

1 材料与方法

1.1 试验材料

菜豆黄花叶病毒分离物分离自青海的蚕豆及豌豆病株, 经鉴定后, 于无病毒、健康的蚕豆和豌豆上繁殖[1], 用于总RNA提取。蚕豆、豌豆的生长环境为温室环境, 繁殖菜豆黄花叶病毒分离物的蚕豆、豌豆品种分别为青海11号、草原20号。

1.2 试验方法

1.2.1 设计引物[1]。

设计外壳蛋白基因序列引物 (正向、反向引物) , 其中正向引物序列为D89545-CPU:5′-GGCAACCAC CATACAGTCAAC-3′ (对应D89545 1706~1726) , 反向引物序列为D89545-CPD:5′-GTG AAA CCT CGC TAA CACATA GT-3′ (对应D89545 2754~2776) [1]。引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。

1.2.2 反转录-聚合酶链式反应[1]。

第一链cDNA合成采用M-MLV逆转录酶, 逆转录反应体系为20μL, 取植物总RNA提取液3μL, 72℃变性后立即置于冰上, 加入反应混合液1 (表1) , 充分混合, 保存1 h (42℃) , 处理5 min (95℃) 。PCR反应体系为50μL[1]。取上述cDNA液3.0μL, 加入47.0μL反应混合液2 (表2) , 变性2 min后 (94℃) , 30 s (94℃) , 1 min (55℃) , 2 min (72℃) , 35个循环, 最后72℃反应5min, 4℃保存[1]。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳, 检测其与理论扩增片段的大小差异, 然后对扩增产物进行克隆、鉴定、测序、序列分析与同源性比较。

(μL)

(μL)

1.3 数据分析

利用DNAMAN软件进行外壳蛋白基因序列和氨基酸序列进行分析。

2 结果与分析

2.1 外壳蛋白基因的扩增与克隆

分标样将表现花叶症状的叶片进行总RNA提取, 通过特异扩增和琼脂糖电泳, 获得与目标条带大小相近的片段 (图1) 。克隆测序表明片段大小为1 071 bp, 比对结果表明该片段为菜豆黄花叶病毒 (BYMV) 序列的一部分。

注:M表示100 bp DNA ladder;泳道1~10表示BYMV蚕豆分离物;泳道11表示阴性对照。

该试验共获得6个蚕豆和1个豌豆分离物的特异性扩增, 其扩增大小都为1 071 bp, 其中包括NIb部分核苷酸序列 (1~178 bp) , 外壳蛋白基因核苷酸序列 (179~997 bp) 和3′-UTR核苷酸序列 (998~1 071 bp) [1]。NIb/CP裂解位点序列为Q/S, 外壳蛋白基因全长819个核苷酸, 编码一个由273个氨基酸组成的蛋白。但是与蚜传相关基序DAG被替换成为NAG[1]。许多马铃薯Y病毒属在外壳蛋白的N-末端都为DAG (Asp-Ala-Gly) 保守序列, 这3个氨基酸残基中任何一个发生缺失或替换, 都可能导致蚜虫传播能力显著下降或完全丧失[12,13]。该分离物的蚜传能力未作验证。

2.2 外壳蛋白基因的序列比对和序列分析

7个菜豆黄花叶病毒的外壳蛋白基因序列以及推导的氨基酸序列比较分析的结果表明, 在不同分离物之间, 两者的同源性分别为98.7%~99.9%和98.9%~100.0%, 变异很小;在菜豆黄花叶病毒的蚕豆分离物和豌豆分离物之间的差异性也很小。通过比对发现, 分离物中核苷酸位点 (17个) 和氨基酸位点 (9个) 发生了变异[1]。

进一步将获得的蚕豆和豌豆上的BYMV的CP基因序列及推导的氨基酸序列与文献报道的、在NCBI数据库中已登录的BYMV的60个分离物和5个国内的蚕豆分离物 (引用亓鹏文章) 相应序列比较发现 (图2) :该研究克隆的7个BYMV分离物CP基因序列与云南5个BYMV的蚕豆分离物同源性最高[1], 其CP基因序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.3%~99.1%和98.2%~99.6%, 其中青海豌豆BYMV分离物与BYMV-XY、BYMV-WS的核苷酸同源性最高, 为99.1%, 而青海蚕豆的9-16、9-3分离物的BYMV-DL、BYMV-LJ、BYMV-WS的氨基酸同源性为99.6%。与其他BYMV分离物的比较结果表明, 青海蚕豆的9-16、9-3分离物与澳大利亚蚕豆分离物的CP基因核苷酸和氨基酸同源性分别为98.3%~98.7%和98.5%~99.6%。青海分离物13-2、6-6、9-3与EU082114、EU082115和EU082128的核苷酸同源性均为98.7%, 9-3、9-16与EU082114、EU082115氨基酸同源性也达到99.6%。而与与日本蚕豆分离物的核苷酸和氨基酸同源性最高分别为98.2%和98.9%[1]。ABO41970与6-6、9-3和2-4核苷酸同源性都是98.2%, ABO29440与9-16、9-3氨基酸同源性都是98.9%[1]。而我国青海地区的BYMV蚕豆、豌豆分离物与美国的豌豆分离物 (AY520092) 同源性较低, 核苷酸同源性最高83.8%, 氨基酸同源性最高为89.7%。

3 讨论

该研究中主要运用特异性引物设计对BYMV在青海蚕豆分离物CP进行了序列克隆分析, 将所得序列与GenBank收录的60个BYMV相应的CP序列和5个已报道的BYMV云南蚕豆分离物进行同源性比较。结果显示, 本研究克隆的7个BYMV分离物CP基因序列与中国云南5个BYMV的蚕豆分离物同源性最高, 只有5个核苷酸发生了变异, 说明青海的这几个分离物和云南的分离物存在的地域地域性差异不大, 而与GenBank中报道美国的豌豆分离物 (AY520092) 同源性最低, 地域性差异显著。

病毒蛋白 篇7

鹅细小病毒病又称小鹅瘟[2]。以雏鹅小肠纤维素性、栓塞性病变为主要特征[3,4], 具有病程短促、传播快、死亡率高等特性。番鸭细小病毒病俗称三周病[5], 以腹泻、气喘及胰脏坏死和出血为主要特征, 发病率与死亡率达40%~50%。

1995年, Z.Zádori等[6]首次发表了鹅细小病毒与番鸭细小病毒的全基因组序列。基因组含2个开放阅读框 (ORF) 。左侧ORF编码2个非结构蛋白NS1和NS2, 主要参与病毒DNA的复制及调节基因的表达;右侧ORF编码3个结构蛋白VP1、VP2和VP3, 其中VP3是主要的衣壳蛋白, 含有免疫保护性抗原[6,7], 能诱导产生具有中和作用的抗体。

1 材料与方法

1.1 毒株与主要试剂

大肠杆菌DH5α感受态细胞、番鸭细小病毒DK、DYL毒株和鹅细小病毒ZJ、G3、LJY毒株, 均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所水禽细菌病研究组保存;DNA提取试剂盒和质粒小提纯化试剂盒, 购自杭州爱思进生物技术有限公司;r Taq DNA聚合酶、胶回收试剂盒, 购自上海华舜生物技术有限公司;p MD18-T载体, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司。

1.2 引物

根据Gen Bank中全基因组序列, 对番鸭细小病毒和鹅细小病毒分别设计2对引物, 见表1, 引物均由博仕生物技术有限公司合成。

1.3 病毒核酸片段的PCR扩增

参照DNA提取试剂盒说明书提取病毒DNA, -20℃保存, 备用。PCR体系 (总体积为50μL) :病毒DNA 3μL, 相应上、下游引物 (20 pmol/L) 各1μL, r Taq DNA聚合酶25μL, 用dd H2O补充至50μL。扩增程序:94℃5 min;94℃30 s, 54℃30 s, 72℃1 min, 共30个循环;72℃10 min, 最后于4℃保存, 备用。

1.4 病毒基因的克隆、序列测定与分析

参照胶回收试剂盒说明书进行纯化回收, 用p MD18-T载体连接, 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞, 涂布于含氨苄西林的LB琼脂平板上, 37℃倒置培养12~16 h, 采用PCR方法鉴定重组质粒, 阳性质粒送博仕生物技术有限公司测序。用Lasergene v7.1 DNAStar软件进行序列拼接, 并与GenBank中的其他基因序列比对分析。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

用2对引物扩增得到的PCR产物大小均为1 000 bp, 扩增结果与预期片段大小相符, 见图1。

2.2 序列分析

利用Lasergene v7.1 DNAStar软件进行序列拼接后, 得到的鹅细小病毒和番鸭细小病毒结构蛋白基因序列大小为2.1 kb, 利用Meg Align中的Clustal W方法, 对DK、DYL、ZJ、G3、LJY这5株毒株序列与其他16株基因组序列 (其中鹅细小病毒序列13个, 番鸭细小病毒序列3个) 结构蛋白的氨基酸序列进行比对, 观察其同源性。

1.DL-2 000 Marker;2~3.PCR扩增结果。

结构蛋白包括VP1、VP2和VP3, 终止于同一个密码子, 长度分别为2 199, 1 764, 1 605 bp, 分别编码732, 587, 534个氨基酸。

鹅细小病毒VP1蛋白氨基酸序列的同源性为95.1%~100%, G3、ZJ和LJY毒株之间VP1蛋白的同源性分别为96.9%、96.2%、96.3%;番鸭细小病毒之间的同源性为96.9%~99.3%, DYL和DK毒株之间的同源性高达98.9%;鹅细小病毒和番鸭细小病毒之间的同源性为85.1%~88.3%, 鹅细小病毒ZJ毒株与番鸭细小病毒FM毒株之间同源性最低 (85.1%) 。

鹅细小病毒VP2蛋白氨基酸序列的同源性为95.2%~100%, G3、ZJ和LJY毒株之间的同源性分别为96.1%、96.3%和97.4%;番鸭细小病毒之间的同源性为96.6%~99.3%, DK和DYL毒株之间的同源性为98.6%;鹅细小病毒和番鸭细小病毒之间的同源性为85.5%~88.1%, 鹅细小病毒ZJ毒株与番鸭细小病毒FM、DK毒株之间的同源性最低 (85.5%) 。

鹅细小病毒VP3蛋白氨基酸序列的同源性为95.0%~100%, G3、ZJ和LJY毒株之间的同源性为96.3%、96.3%和97.9%;番鸭细小病毒之间的同源性为96.8%~99.4%, DK与DYL毒株之间的同源性为98.5%;鹅细小病毒与番鸭细小病毒之间的同源性为88.4%~91.0%, 番鸭细小病毒DK毒株与鹅细小病毒GDa GPV毒株之间的同源性最低。

结构蛋白在氨基酸水平上, 同为鹅细小病毒的3个毒株与标准毒株B相比分别有41, 79, 74个碱基差异, 引起的氨基酸改变分别有23, 30, 17个;而番鸭细小病毒DK毒株与DYL和FM毒株相比有43, 35个碱基改变, 引起的氨基酸改变分别有23, 17个。无论是鹅细小病毒毒株还是番鸭细小病毒毒株, 氨基酸改变主要集中在VP3区域, 并且鹅细小病毒较番鸭细小病毒变化较多。通过Net NGlyc 1.0 Server预测潜在糖基化位点, 发现番鸭细小病毒2个毒株均含有8个糖基化位点, 而鹅细小病毒一般只有4~6个糖基化位点, 除了均存在与番鸭细小病毒相同的前2个位点 (即219~221 NAS和331~333 NLT) 外, 不同鹅细小病毒毒株在VP区缺少1~2个位点。ZJ毒株含有全部6个糖基化位点, 而G3和LJY毒株只含有5个糖基化位点, 分别缺少582~584 NTT和703~705NRT。

2.3 进化分析

利用Mega5.2软件中Neighbor Joining (NJ) 法绘制结构蛋白的遗传进化树。在结构蛋白基因水平上, 鹅细小病毒可分为2个基因亚群, 即a亚群和b亚群, 见图2~4。a亚群为中国亚群, 主要包括中国大陆各地区及台湾省的毒株, LJY毒株就位于这个亚群, 与安徽E株接近;b亚群为混合亚群, 其中包含中国台湾省、匈牙利及德国的毒株, G3和ZJ毒株位于这个亚群, 与德国VG32/1毒株接近。同为番鸭细小病毒的DK和DYL毒株与上海市的P毒株比较接近。

3 讨论

1995年, Z.Zádori等[6]首次发表了鹅细小病毒与番鸭细小病毒的全基因组序列, 了解到2种细小病毒的基因组都包含2个ORF, 右侧的ORF编码结构蛋白VP1、VP2和VP3, 其中编码结构蛋白的3个基因是2种细小病毒的主要免疫原基因, 且在病毒装配过程中, VP3蛋白主要在病毒衣壳的表面, 是病毒最主要的保护性抗原。VP3蛋白为病毒提供了保护性抗原, 那么它的多变就可以更好地避免外界对病毒自身的破坏。鹅细小病毒相对于番鸭细小病毒在结构蛋白VP3区域变化较多, 这就使得鹅细小病毒可以更好地逃避宿主的免疫系统, 从而导致鹅细小病毒感染鹅与番鸭;而番鸭细小病毒只能感染番鸭。相对于番鸭细小病毒, 鹅细小病毒糖基化位点的缺失从另一个角度说明了免疫逃逸的问题, 糖基化位点是病毒感染宿主必不可少的区域, 那么它的缺失就会产生不同的宿主范围。有研究猜测, 糖基化位点的缺失还可能与毒力的改变有关, 但是否有直接关系, 还需要进一步研究。当糖基化位点数目相同时, 缺失不同位置的糖基化位点对毒株的影响也同样需要进一步研究。从遗传进化树的分析结果可以看出, 鹅细小病毒结构蛋白有明显的遗传特性, 但不同地区的毒株有较高的亲缘性, 这可能是由于水禽业的发展, 各地区的品种改良及外来品种的引进加速了不同地区病毒基因的交流, 使其更加多样化, 然而番鸭细小病毒的遗传特性不甚明显, 没有明显的分支, 基因组同源性相对较高, 糖基化位点也一直保持不变, 到底是什么原因导致番鸭细小病毒相对低变, 还需要进一步分析。

参考文献

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[5]刘惠丽, 李震, 王英, 等.雏番鸭细小病毒病病毒分离鉴定[J].上海农业学报, 2001, 17 (1) :54-58.

[6]ZDORI Z, STEFANCSIK R, RAUCH T, et al.Analysis of the complete nucleotide sequences of Goose and Muscovy duck parvoviruses indicates common ancestral origin with adeno-associated virus[J].Virology, 1995, 212 (2) :562-573.

病毒蛋白 篇8

1资料与方法

1. 1一般资料选取2014—2015年湘雅萍矿合作医院收治的288例乙肝患者为乙肝组, 其中男198例, 女90例; 年龄20 ~ 81岁, 平均 ( 43. 2 ± 9. 3 ) 岁。均符合 “慢性乙型肝炎防治指南” ( 2005年修订) 诊断标准。排除病毒性肝炎者。 取同期健康体检者50例为对照组。选取病例对本研究均知情同意。

1. 2方法采集两组受检者清晨空腹静脉血5ml, 将血清离心分离, 于- 70℃ 保存待测。应用酶联免疫吸附试验 ( ELISA) 检测HBV - LP, 实时荧光定量聚合酶链式反应 ( PCR) 法检测HBV DNA。诊断标准: HBV DNA载量> 5. 0 × 102copies / ml为阳性, HBV - LP采用双抗体夹心法检测, 以S/CO≥1. 0为阳性, 各操作均依据说明书实施。

1. 3统计学方法采用SPSS 13. 0软件进行数据处理, 计数资料采用 χ2检验; 相关性分析采用直线相关分析。以P < 0. 05为差异有统计学意义。

2结果

2. 1 HBV DNA与HBV - LP阳性率乙肝组HBV DNA阳性188例 ( 65. 3% ) ; HBV - LP阳性194例 ( 67. 4% ) 。对照组50例HBV - LP与HBV DNA均为阴性。HBV - LP与HBV DNA呈正相关 ( r = 0. 175, P < 0. 05) 。

2. 2 HBe Ag阳性患者HBV DNA与HBV - LP阳性率乙肝患者HBe Ag阳性127例, 其中HBV DNA阳性112例, 阳性率88. 2% ; HBV - LP阳性106例, 阳性率为83. 5% 。HBV DNA与HBV - LP阳性率比较, 差异无统计学意义 ( P > 0. 05) 。

3讨论

对HBV包膜蛋白特性展开分析, 其由小、中、大蛋白组成, 进一步研究示, 小蛋白由S基因编码参与构成, 中蛋白由Pre - S2基因区及S区编码参与构成, 大蛋白由Pre - S1及S2基因区编码构成。大蛋白于管状亚病毒颗粒和Dane颗粒分布, 具有双重拓扑结构, 是HBV包膜蛋白一种核心组成分布, 还具有升高DNA拷贝数、反式激活增强病毒复制等作用[3,4]。对HBV感染者血清感染性展开研究发现, 其与大蛋白分布的亚病毒颗粒数量和Dane颗粒数量密切相关。开展血清HBV - LP检测, 可对HBV是否有完整外膜加以评估, 与亚病毒颗粒数或病毒基因相关[5]。HBV - LP检测在判定乙肝患者体内HBV复制方面具有较高价值。

以往认为, 乙型肝炎患者检测出HBe Ag时, 表明HBV复制呈十分活跃状态, 此阶段传染性较强, HBe Ag转阴表明传染性降低, 且复制程度也减弱, 提示预后相对良好。但本研究中, HBe Ag阳性患者, HBV DNA、HBV - LP阳性率比较无统计学差异。可能是HBV基因前C区变异或免疫清除不全导致。表明HBe Ag转阴无法说明病毒复制能力降低, 相较HBe Ag, 检测HBV - LP更占优势, 可对HBV - M检测的不足予以弥补。

目前, 定量检测HBV DNA是公认的评估抗病毒治疗效果和HBV DNA复制的指标。本研究结果显示, 应用实时荧光定量RCR法和ELISA对HBV DNA与HBV - LP检测, 在阳性率上差异并不明显, 故检测HBV - LP可起到补充及替代作用[6,7]。同时可在一定程度上反映HBV复制活跃程度, 作为机体HBV复制、感染及乙型肝炎诊治的一种重要标志物, 临床应用价值显著。

临床通常采用ELISA检测HBV - LP, 而ELISA一直是乙肝病毒感染临床常用的一项检测手段。以往研究中显示, 乙肝患者HBe Ag呈阳性表现, 提示HBV具较强烈的传染性, 且复制也呈活跃状态, Hbe Ag阴转是病毒传染性降低、复制程度减弱、可获取良好预后的象征。有报道指出, 在HBe Ag阴性患者133例中, HBV - LP阳性率为44. 16% , HBV DNA阳性率为41. 16% , 可能由HBV基因前C区变异或机体在用药后免疫清除不全导致, 在临床以慢性乙肝患者为主[8]。而此类患者有较高的罹患肝癌、肝硬化等恶性疾病风险。ALP是一项有效、可靠的评估肝内炎症活动度的指标, 临床通常将血清转氨酶水平作为对乙肝病情转归评估的重要指标, 此报道还指出, HBV - LP阳性患者ALT水平更高, 表明HBV - LP呈阳性患者的肝组织损伤更为严重, 与HBV - LP阳性表明HBV存在复制情况一致[9]。国内外有报道表明, HBV - LP是重要的诱导肝细胞发生病变及出现凋亡的原因, HBV - LP可用于治疗预后评估。国内有学者研究示, 在HBV感染血清中检测HBV - LP, 较HBe Ag、HBVpre S1等更为敏感, 其原因可能是: 应用具立体构象型表位特性的单克隆抗体对HBV - LP进行检测, HBVpre S1、S2作为HBV - LP重要组成部分, 不可对呈复杂状态的双重拓扑结构理想模拟, 在对单克隆抗体进行后续制作时, 因序列表现为卷曲、折叠状, 而失去了表位表露的机会, 进而增加漏检事件风险。此外, HBV突变株在检验时不断增加, HBV DNA检测灵敏度缺陷无法反映肝组织内HBV感染状况, 特别是HBV DNA检测值居较低水平时, HBV DNA在患者肝内仍可维持在一定水平。目前临床应用的抗病毒方案仅对ccc DNA再复制进行抑制, 对病毒表达蛋白不具抑制作用, 在一段时间内, 富含大蛋白的亚病毒颗粒仍存在。因长期治疗、C启动子变异等诸多原因影响, HBe Ag阴性的慢性乙肝流行率近年呈明显上升趋势, HBe Ag阴转不可反映HBV复制。HBV - LP是评估疗效的一项良好指标。另也有报道指出, 在DNA检测结果为阴性的乙肝患者血清标本中, 部分有HBV - LP检出, 而这些患者正为抗病毒治疗阶段, 表明在HBV DNA阴性患者中, HBV - LP阳性是抗病毒治疗不彻底和肝内病毒继续复制的标志, 但此结论仍需深入研究证实。

HBV - LP科研研究较少, 一直属检验学领域的研究内容, HBV - LP何时被广泛运用, 还需时间。随着乙肝抗病毒治疗研究的进步, 原监测指标已不能满足对慢性乙肝治疗结果的评估, e抗原血清转换、HBV DNA转阴已不能作为临床治疗的终点, 治疗终点应为HBs Ag阴性。故目前对HBV - LP是否可作为抗病毒治疗的监测指标, 不管是临床应用或是检测方法, HBV - LP优势性均较明显, 有临床广泛应用的可能[10]。本研究中, ELISA检测HBV DNA含量与HBV - LP浓度, 结果呈正相关, 提示乙肝病例体内HBV - LP与病毒复制关系紧密, 表明对HBV - LP检测, 可反映患者体内病毒复制情况, 也可作为对HBV感染、复制及乙肝患者诊治、预后评估的重要参考指标, 临床价值较为显著。

综上所述, HBV - LP可作为一种病毒复制的血清学指标, 应用价值较为显著。

摘要：目的 探讨乙型肝炎 (乙肝) 患者乙肝病毒外膜大蛋白 (BHV-LP) 及与乙肝病毒DNA (HBV DNA) 关联性。方法 选取2014—2015年湘雅萍矿合作医院收治的288例乙肝患者为乙肝组, 并选取同期的健康体检者50例为对照组, 应用实时荧光定量聚合酶链式反应 (PCR) 技术和酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测HBV DNA及HBV-LP。结果 乙肝组HBV DNA阳性188例 (65.3%) ;HBV-LP阳性194例 (67.4%) 。对照组50例HBVLP与HBV DNA均为阴性。HBV-LP与HBV DNA呈正相关 (r=0.175, P<0.05) 。乙肝患者HBe Ag阳性127例, 其中HBV DNA阳性112例, 阳性率88.2%;HBV-LP阳性106例, 阳性率为83.5%。HBV DNA与HBV-LP阳性率比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。结论 HBV-LP可作为一种病毒复制的血清学指标。

关键词：乙型肝炎,乙型肝炎病毒

参考文献

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[8]陈凯杰, 钟琼, 袁汉尧, 等.乙型肝炎病毒外膜大蛋白的检测及其临床意义[J].国际检验医学杂志, 2010, 31 (7) :658-659.

病毒蛋白 篇9

关键词：乙型肝炎病毒携带者,孕妇,乙型肝炎病毒外膜大蛋白

母婴垂直传播是乙型肝炎病毒 (HBV) 感染的主要途径之一, 我国的慢性HBV感染者有30%～50%是通过母婴垂直传播引起的[1]。母婴垂直传播包括产前通过宫内感染、产时胎儿经产道感染和产后水平传播3种途径, 且妊娠可加重孕妇自身肝炎的发展。正确评估HBV携带者孕妇HBV复制情况, 对控制和阻断HBV的母婴传播有重要作用。我们使用包被针对构象型前S区的高亲和力、高特异性单克隆抗体的酶免试剂盒, 检测HBV携带者孕妇血清中HBV外膜大蛋白 (LHBs) , 同时检测HB e Ag及HB V-DN A, 并进行比较分析, 进一步研究LHBs与病毒复制的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2010年6月至2011年12月本院妇保科门诊3243例孕妇为研究对象。孕8～32周, 年龄18～39岁。

1.2方法

空腹采集静脉血5 m l, 取血清, 所有样本均无溶血。酶联免疫吸附法 (E LISA) 检测HBsAg、HBsAb、H B e Ag、H B e A b、H B c A b 5项指标, 所用试剂为北京金豪制药股份有限公司提供。ELISA法检测乙肝LHBs, 检测试剂由北京热景生物技术有限公司提供, Cutoff值为0.105。各项检测严格按试剂说明书操作。对HBsAg阳性的血清HBV-DNA检测由有资质的部门检测, 判断标准≥1 0 3 co pies/m l为阳性。仪器:美国B I O-R A D 5 5 0型酶标仪, 北京普朗洗板机。

1.3 统计学方法

应用统计软件为SPSS 1 1.5。计数资料的两指标间关联与率的显著性检验采用卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H B V感染分布及不同模式下L H B s、H B V-D N A阳性结果比较

3243例中, 孕妇乙肝五项指标全阴有2150例 (66.3%) , 仅HBsAb阳性的有733例 (22.6%) , HBsAg阳性的有241例 (7.4%) 。241例HBsAg阳性者LHBs、H B V-D N A检测结果见表1。

由表1可见, 2 4 1份H B s Ag阳性标本中LH B s和H B V-D N A阳性率分别为6 2.2%和5 6.0%。把上表分为HB e Ag阳性和HB e Ag阴性两组, 结果表明:H Be Ag阳性孕妇71例 (29.5%) , HBeAg阴性孕妇170例 (70.5%) 。在7 1例H Be Ag阳性标本中, LH B s和H B V-D N A阳性率分别为9 1.5%、9 3.0%。170例HBeAg阴性标本中, LHBs和HBV-DNA阳性率分别为50.0%、40.6%。

2.2 H B e Ag、H B V-D N A与L H B s的检测结果 (表2)

由表2可见, LHB s与HBV-DNA检测结果一致有1 80例 (7 4.7%, 1 8 0/2 41) , LH B s与H B eAg检测结果一致有144例 (59.8%, 144/241) 。

2.3 H B V-D N A水平与血清L H B s (O D值) 水平的关系

135例HBV-DNA阳性标本中, LHBs (OD值) 随着H B V-D N A拷贝数的增加而呈上升趋势, 详见表3。

3 讨论

临床上常用HBe Ag、HBV-DNA作为判定HBV复制程度、传染性的强弱及预后的标志。以往认为, H B e Ag阳性转化为HBeAb阳性已是乙肝恢复期, 并且具有了免疫力, 预示HB V复制中止。但是研究发现HB V基本核心启动子 (BCP) 突变、前C区基因提前出现终止子、启始密码子变异和移码突变等原因分别在转录和翻译水平上影响了HBeAg的合成[2]。这种变异可导致HBeAg表达水平低下或不表达[3]。所以, H Be Ag阴性并不意味着病毒清除或复制水平减低。如果体内有HBV在复制, HBeAg阴转, 反而有助于HBV免疫逃逸。HBV-DNA是HBV复制最可靠最直接的证据, 但是H BV基因变异频繁, 已经设计好的商品PCR引物导致漏诊;抗病毒药物应用广泛, 抑制H B V-D N A复制, 病毒D N A为模板的转录和病毒蛋白的转译表达不受影响, 导致检测出现假阴性结果;实际血清低水平H BV-D NA时肝内D N A仍可维持一定水平, 因此血清HBV-DNA检测阴性并不意味着病毒已经完全清除。H B V-L H B s是H B V的包膜蛋白。研究表明, L H B s的前S蛋白具有复杂跨膜构象拓扑结构, 是LHBs活性表位所依赖的, 并可反式激活细胞内的HBV复制, 在HBV感染、装配、复制及刺激机体产生免疫反应等方面起重要作用, 检测含有此拓扑结构的LHBs对于判定HBV复制具有重要意义[4]。Chan等[5]认为LHBs与HBV复制关系密切, L H B s阳性可作为H B V在体内复制活跃的重要指标。

本组HBsAg阳性的241例孕妇血清中LHBs阳性率高于H B e Ag, L H B s在H B e Ag阳性孕妇血清中阳性率为91.5%, 在HBeAg阴性孕妇血清中阳性率也达50.0%。说明HBeAg阴性的HBV携带者孕妇中仍有部分存在病毒复制的情况。LHBs是可反映HBV复制和传染性的指标, 在某种程度上要比HBeAg更能反映HBV的复制情况, 提示临床上对HBeAg阴性HBV携带孕妇仅做乙肝两对半检测是不够的, 应补充LHBs检测, 以避免处于病毒复制期的孕妇被漏诊, 导致H B V母婴传播。

统计发现, 135例HBV-DNA阳性孕妇血清中, LHBs (O D值) 随H B V-D N A拷贝数增加而呈上升趋势, LH B s与HBV-DNA阳性率差异也无统计学意义;71例HBeAg阳性标本中, LHBs和HBV-DNA阳性率分别为91.5%、93.0%, 差异无统计学意义;170例HBeAg阴性标本中, L H B s和H B V-D N A阳性率分别为5 0.0%、4 0.6%, 差异有统计学意义。241例HBV携带者孕妇中LHBs与HBV-D N A诊断结果符合率为7 4.7%, LH B s、H B V-D N A间阴阳性不符除了反映HBV基因变异频繁外, 还与PCR检测本身技术水平有关, 在H B V-D N A检测水平下限, 认为H B V-D N A阴性 (1 0 3co pies/m l) , 仍可能有一定的残留病毒量。LH B s和H B V-D N A在检出率上有一定关联, 但两者变化并不一致。这也进一步说明目前尚无一个指标可以准确地反映HBV感染和复制情况以及机体的免疫状态, 同时检测LH B s和H B V-D N A互为补充。

综上所述, LH Bs在乙型肝炎病毒携带者孕妇中有较高的阳性检出率, 在HBeAg阴性的乙型肝炎病毒携带者中, LHBs较HBV-DNA更能敏感反映HBV的感染复制状态, 操作简便, 适合无开展PCR检测条件的基层医院检验室推广。

参考文献

[1]范祎, 肖小敏, 郦爱贞, 等.分娩方式对乙肝病毒母婴垂直传播的影响[J].广东医学, 2007, 28 (2) :252-253.

[2]林裕龙, 彭永正, 冯桂湘, 等.乙型肝炎病毒前C信号肽酶裂解位点变异对HbeAg表达的影响[J].中华检验医学杂志, 2004, 27 (1) :17-19.

[3]中华医学会肝病学分会, 中华医学会感染病分会.慢性乙肝防治指南 (2010年版) [J].中国医学前沿杂志, 2011, 3 (1) :66-76.

[4]Bruss V.Envelopment of the hepatitis B virus nucleocapsid[J].Virus Res, 2004, 106 (2) :199-209.

病毒蛋白 篇10

1 材料与方法

1.1 毒株

马动脉炎病毒Bucyrus标准株, 青岛出入境检验检疫局马病实验室提供。

1.2 主要试剂及仪器

琼脂糖, 购于上海生工生物工程技术服务有限公司; DL-2 000 Marker、BamHⅠ、HindⅢ、T4 DNA连接酶, 购于TaKaRa公司;pET-32a载体、M-MLV反转录酶、微量移液器、高速冷冻离心机, 购于法国Eppendorf公司;PCR仪, 购于Ampgene公司;胶回收试剂盒, 购于新芝科技生物股份有限公司。

1.3 引物和探针的设计与合成

根据GenBank上公布的EAV ATCC 标准株GL蛋白基因序列, 用Primer Premier 5.0设计1对特异引物[由宝生物工程 (大连) 有限公司合成], 上游引物5′-GGGGGATCCATGTTATCTATGATTG-3′ (下划线部分为BamHⅠ酶切位点) , 下游引物5′-AGTTGTGTTGGATGTGAAAGCTTGTC-3′ (下划线部分为HindⅢ酶切位点) 。

1.4 总RNA的提取

取500 μL病毒悬液, 向其中加入800 μL Tripure细胞裂解液振荡混匀, 置于室温下10 min;加入200 μL氯仿, 混匀后于室温下静置5 min, 4 ℃、12 000 r/min离心15 min;吸取上清液, 向其中加入0.5倍体积的异丙醇, 充分混匀后于室温下静置15 min;随后4 ℃、12 000 r/min离心10 min;排尽管内液体, 加入70%乙醇1 mL, 混匀, 4 ℃、7 500 r/min离心5 min;弃去液体, 待管壁稍干燥后加入20 μL DEPC处理过的超纯水溶解, 即得到EAV总RNA。

1.5 cDNA的合成

总体系 (20 μL) :EAV总RNA 9.2 μL, 5×Buffer 4 μL, 10 mmol/L dNTP 2 μL, 2.5 mmol/L MgCl2 0.8 μL, Rnasin 1.0 μL, 引物各1.0 μL, 65 ℃、15 min后, 再加入M-MLV反转录酶1.0 μL, 42 ℃ 1 h, 94 ℃ 5 min。

1.6 GL基因的扩增

以5 μL cDNA为模板, 加入2.5 mmol/L MgCl2 0.7 μL, 10×Buffer 2.0 μL, Taq酶 0.3 μL, DEPC处理水17 μL, 反应总体系为25 μL。在PCR扩增仪内进行扩增, 扩增条件为94 ℃ 5 min;94 ℃1 min, 53 ℃ 1 min, 72 ℃ 1.5 min, 共35个循环;72 ℃ 10 min。按胶回收试剂盒使用说明进行回收, 并对回收产物进行电泳鉴定。

1.7 GL基因的克隆与鉴定

用胶回收试剂盒回收PCR产物, 与pET-32a载体分别双酶切:每管中加入高压过的超纯水50 μL, 10×K Buffer 10 μL, BamHⅠ 2.5 μL, HindⅢ 2.5 μL, 分别加入PCR产物35 μL和pET-32a载体35 μL, 总体积100 μL, 37 ℃ 作用3 h。

酶切产物电泳鉴定:分别用胶回收试剂盒纯化目的条带。

连接:10×T4 DNA Ligase Buffer 1.0 μL, Ligase 1.0 μL, GL基因1.0 μL, pET-32a 3.5 μL, 超纯水3.5 μL, 总体积10 μL 。16 ℃过夜。转化DH5α感受态细胞, 涂布于含氨苄西林的平板上, 37 ℃培养18 h, 挑取单个菌落, 扩大培养所提质粒, BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定, 阳性质粒命名为pET-GL。

1.8 序列的测定和结果分析

将pET-GL质粒送宝生物工程 (大连) 有限公司进行序列测定。应用DNASTAR软件分析测序结果与Bucyrus标准株的同源性。

2 结果

2.1 马动脉炎病毒GL蛋白基因RT-PCR扩增电泳图谱 (见图1)

1.RT-PCR产物;M.DL-2 000 Marker。

2.2 pET-GL双酶切电泳鉴定图谱 (见图2)

1, 2.pET-GL重组质粒BamH Ⅰ+Hind Ⅲ双酶切结果;M. DL-2 000 Marker。

2.3 GL基因测序结果 (见图3)

注:下划线部分中斜体分别为BamHⅠ和HindⅢ酶切位点。

GL基因序列与GenBank上公布的EAV标准序列的同源性达97.6%。

3 讨论