基质金属蛋白-7（通用7篇）
基质金属蛋白-7 篇1
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一个蛋白水解酶家族,可以降解细胞外基质(extracellular matrix,EMC)中的绝大多数成分,也是肿瘤侵袭和转移过程中起关键作用的酶,另一方面,MMPs可能通过调节细胞的增殖与凋亡、改变细胞的微环境、调节血管形成等参与肿瘤的发生过程[1,2,3]。MMP-7属于MMPs家族的成员,它们的异常表达可能与癌细胞的浸润和转移特性有关,已有实验证明MMP-7在卵巢癌组织中的表达明显增高[4,5],提示MMP-7可能与卵巢癌的发生存在某种关联。在MMP-7启动子区-181A/G单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)可以影响基因的转录活性,从而影响基因的表达[6]。本实验通过病例-对照研究,对MMP-7基因启动子区多态位点与上皮性卵巢癌发生和发展的关系进行探讨。
1 材料和方法
1.1 研究对象
130例卵巢癌患者为2001年12月~2003年12月在河北医科大学第四医院妇产科住院治疗的北方籍汉族妇女,平均年龄为57.13岁(范围20~75岁)。患者的年龄、月经史、生育史及家族史等资料均有病历详细登记,并且所有病例均经病理证实为卵巢上皮性癌,其中浆液性癌54例(41.54%)、黏液性癌18例(13.84%)、宫内膜样癌43例(33.08%)、低分化癌15例(11.54%)。手术病理分期采用国际妇产科联盟(FIGO)标准(1989年),早期:Ⅰ~Ⅱ期,晚期:Ⅲ~Ⅳ期,其中早期病例59例(45.38%)、晚期病例71例(54.62%)。159例健康对照为同地区无肿瘤及遗传病史的无关个体,且均为汉族女性,平均年龄为56.89岁(范围22~69)。以上标本采集均由本人知情同意。
1.2 方法
1.2.1 标本采集及外周血白细胞DN A的提取
所有研究个体均采集静脉血5 m L,经枸橼酸钠抗凝,4℃冰箱保存。采血后1周内,以蛋白酶K-饱和氯化钠盐析法[7]提取外周血白细胞DNA。
1.2.2 MMP-7、基因启动子区SN P基因分型
MMP-7基因型检测采用PCR-RFLP(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism)方法。PCR反应体积为25μL,其中含100ng模板DNA,2.0 m M氯化镁,0.2 m M d NTPs,0.2μM上、下游引物,2.5U Taq-DNA聚合酶和2.5μL10×PCR缓冲液。
MMP-7-181A/G位点的上、下游引物序列分别为5'-TGGTACCATAATGTCCTGAATG-3'和5'-TCG TTATTGGCAGGAAGCACACAATGAATT-3'[8],扩增产物为150 bp。PCR反应条件为:94℃预变性5min,然后94℃30 s,58℃,72℃30 s,35个循环后,72℃再延伸5 min。扩增产物经限制性内切酶Eco RⅠ37℃消化过夜后[9],于4%琼脂糖凝胶电泳分析基因型。MMP-7-181A/G的A/A基因型为150 bp,G/G基因型为120和30 bp,A/G基因型为150,120和30 bp(附图)。
1:DNA marker;2、3:A/A基因型;4、5:A/G型基因型;6、7:G/G型基因型
为进行基因型检测的质量控制,每一批PCR反应均以蒸馏水替代DNA作为阴性对照。10%的DNA标本进行了2次分型以确定实验结果的可靠性。
1.3 统计学分析
统计分析采用SPSS 11.5软件包进行。采用χ2检验比较基因型频率的观察值与预期值,并进行Hardy-Weinberg平衡分析。病例组和对照组的MMP-7-181A/G的等位基因频率及基因型分布比较采用行×列表的χ2检验。应用非条件logistic回归模型计算表示相对风险度的比值比(odds ratio,OR)及其95%可信区间(confidence interval,CI),OR值经年龄进行校正。以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 一般特性
统计学分析显示对照组人群MMP-7-181A/G SNP位点基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。130例卵巢癌患者平均年龄为57.13(范围20~75);159例对照者平均年龄为56.89(范围22~69),两组的年龄差异无显著性,t=1.65,P=0.10。
2.2 MMP-7基因启动子区-181A/G与卵巢癌的关系
MMP-7基因启动子区-181A/G多态的等位基因和基因型频率分布在病例组与对照组之间差异有显著性(P<0.05),与A/A基因型相比,携带G等位基因的个体能明显增加上皮性卵巢癌的发病风险,经年龄校正的OR值为3.21(95%CI=1.63~6.32)(见表1)。
注:覮年龄校正,相对A/A基因型,A/G+G/G基因型的风险值
以临床分期和病理类型分层分析,MMP-7-181A/G的基因型和等位基因频率在各组间分布均未发现显著性差异(P均大于0.05)(见表2,3)。
3 讨论
本研究结果显示,MMP-7基因启动子区-181A/G多态的基因型频率分布在中国北方汉族妇女上皮性卵巢癌患者组与对照组之间差异有显著性,提示该单核苷酸多态可能与上皮性卵巢癌的发病风险相关。
MMP-7基因又称为基质溶素(matrilysin),是MMP家族中最小的一个,位于11q21-q22[10],可降解Ⅳ型胶原、明胶、弹力素、层黏连蛋白、纤黏连蛋白等构成细胞外基质(extracellular matric,ECM)与基底膜(basement membrane,BM)的重要成分。主要表达在上皮细胞中,在基质细胞中不表达,以往研究显示MMP-7既能提高肿瘤细胞的增殖活性,增强其侵袭能力,又能提高内皮细胞的增殖活性,促进肿瘤的血管和淋巴管生成,还可能与E-钙黏蛋白、Fas配体(Fas L)相互作用而促使细胞发生恶变[11,12]。
MMP-7启动子区转录起始点-181bp处存在一个功能性的A/G多态位点,由于A→G突变产生了一个NGAAN序列,该序列是热惊厥转录因子(HSTF)的结合序列,可影响核酸与蛋白质的结合,从而增加了启动子的转录活性[6]。且体外转染试验的结果也显示:携带-181G等位基因的MMP-7基因启动子区的转录活性是A等位基因的2~3倍,从而提高了m RNA的转录水平,增加了该蛋白的表达。已有研究结果表明:MMP-7-181A/G多态可能与肿瘤的发病相关,结果基本一致。GHILARDI[13]的研究显示MMP-7启动子区的-181A/G多态与结肠直肠癌易感性有关,病例组G等位基因频率明显增高,提示携带G等位基因明显增加了结直肠癌的发病风险。ZHANG[14]等基于中国北方人群的研究报道G等位基因的频率分布在食管癌,贲门癌和非小细胞肺癌患者组与对照组之间差异具有统计学意义,即与A/A基因型相比,携带G(A/G+G/G)等位基因明显增加了这3种肿瘤的发病风险;SUGIMOTO[15]等对日本人群的研究也同样发现-181A/G多态与胃癌的发病风险相关。本研究结果与之相同,MMP-7-181A/G SNP G等位基因的存在可以提高卵巢癌的发病风险,与A/A基因型相比,携带A/G+G/G基因型明显增加了卵巢癌患者的发病风险。
此外,根据临床分期和病理类型分层分析,本研究未发现MMP-7-181A/G多态与卵巢癌的临床分期及病理类型之间存在明显关联。该多态的等位基因和基因型频率分布在早期与晚期患者组以及卵巢癌的各种病理类型之间的差异无显著性,由于样本量较小,需要扩大样本量来验证本研究的结论。
卵巢癌的发生发展所涉及的不只是单基因的作用,而是多基因的联合作用。因此进一步研究不同肿瘤候选基因独立或联合在肿瘤遗传易感性中的作用,对阐明肿瘤的发生机制和研究肿瘤的防治具有重要的意义。
基质金属蛋白-7 篇2
关键词：食管癌,临床特征,金属基质蛋白酶-7基因,系统评价
食管癌是恶性程度较高的消化道肿瘤, 世界每年约有40万人死于食管癌[1]。与其他胃肠道肿瘤相比, 食管癌预后较差, 这与其较强的局部浸润能力及较高的淋巴结转移几率相关。肿瘤的局部浸润与转移是不同的蛋白水解酶对不同细胞外基质成分降解作用的结果[2]。金属基质蛋白酶 (matrix metalloproteinases, MMPs) 是一类锌结合金属蛋白酶, 目前已分离出28种家族成员。根据其结构及底物专一性的不同, 可以将MMPs分为:胶原酶MMPs、明胶酶MMPs、基质降解素MMPs及膜型MMPs等[3]。较多的文献就不同种类的金属基质蛋白酶基因与食管癌临床特征间的关系进行了研究, 其中有部分研究提示MMP-7的阳性表达改变与食管癌的组织浸润及远处转移等临床特征有一定的关系。也有研究提示MMP-7的表达与食管癌的临床特征关联度不高。本研究收集2014年4月之前的文献, 对以往发表的文献结果进行综合评价, 观察MMP-7基因的阳性表达改变在中国人群食管癌临床特征中的作用。
1 资料与方法
1.1 检索策略
应用检索词在国内外相关数据库中检索MMP-7基因与食管癌临床特征相关的文献, 将“metalloproteinases”、“MMP-7”、“esophageal cancer”、“esophageal carcinoma”、“esophagealneoplasm”、“金属基质蛋白酶”及“食管癌”等作为主题词, 检索使用的外文数据库包括:Pubmed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed) , 检索使用的中文数据库包括:万方 (http://www.wanfangdata.com.cn/) 及CNKI (http://www.cnki.net/) , 检索2014年4月之前的相关文献。
1.2 文献检索结果及纳入研究的方法学评价
由两名独立的评价员 (肖婧, 闫涵) 分别就所有相关文献进行评价及筛选, 综合两名评价员的评价结果, 如遇不一致则通过讨论解决达成一致。文献质量的评价按照NOS量表[4]进行评分, 评分内容包括:病例与对照的选择、可比性及暴露三方面。0~4颗星为低质量研究, 5~9颗星为高质量研究。每篇文章均按照作者、发表年份、基因检测的方法、病例总数进行整理。
1.3 文献的纳入标准
纳入标准: (1) 文献包含2014年4之前公开发表的关于MMP-7基因与食管癌临床特征的观察性研究; (2) 结果能反映MMP-7基因在食管癌组织中的表达及与食管癌临床特征间的关系, 各文献中需直接或间接地提供O^R值及95%可信区间; (3) 各文献的研究方法需要大致相同, 观察对象均为中国人群, 且采用的MMP-7表达的检测方法为免疫组化法或RT-PCR法中的一种。
1.4 文献的剔除标准
剔除标准: (1) 研究对象为食管癌细胞系及实验动物的文献; (2) 相似或相同的重复报道文献、年代久远的文献及资料不全的文献; (3) 文献报道质量差, 基本数据不全者; (4) 文献中采用的检测方法特殊, 有别于其他文献者。
1.5 干预与评价方法
最后将纳入的文献对MMP-7基因表达改变与食管癌的临床特征的关系进行了评价, 其中肿瘤组织分化程度、肿瘤的浸润深度、有无淋巴结转移及食管癌临床分期被作为食管癌临床特征的主要评价指标。其中, 肿瘤组织的分化程度按高、中、低分化进行分级, 肿瘤的浸润深度按是否侵及外膜进行划分, 肿瘤的临床分期分为Ⅰ~Ⅳ期。纳入文献的组织分化程度标准参照WHO (2000) 年消化系统肿瘤病理及遗传学分类标准中的分级标准, 肿瘤的侵犯深度、淋巴结转移及肿瘤临床分期的判断标准参照国际抗癌联合会议 (UICC) 制定的TNM分期 (1999年) 的标准。在纳入的相关文献中, MMP-7基因表达的检测方法均采用免疫组织化学法或RT-PCR法。
1.6 统计学方法
应用Revman 5.0进行统计学分析, 应用χ2检验分别对筛选出的关于MMP-7基因的表达与食管癌临床特征关系的研究进行异质性检验, 若各项研究无明显异质性存在 (I2<50%) , 则采用固定效应模型进行效应量的合并;若各项研究存在明显的异质性 (I2>50%) , 则采用随机效应模型进行效应量的合并。将O^R值及95%CI作为MMP-7基因表达与食管癌的分化程度、食管癌浸润深度、淋巴结转移及食管癌临床分期关系的测定指标, 分别绘制出MMP-7基因与食管癌分化程度、食管癌浸润深度、淋巴结转移及食管癌临床分期关系的系统评价森林图。最后对纳入的文献进行发表偏倚分析, 检测偏倚应用漏斗图[5]进行评价。
2 结果
2.1 纳入研究的基本情况
经过最初的检索, 共检索出41篇文献, 浏览全文后筛选出28篇文献。对纳入的28篇文献进行质量评估后, 最后获得符合研究标准的文献共11篇。纳入研究的对象均为经病理证实的食管癌患者, 共750例。其中, 研究MMP-7表达与食管癌组织分化关系的研究对象例数为718例;研究与淋巴结转移关系的例数为641例;研究与食管癌组织浸润深度关系的例数为518例;研究与食管癌分期关系的例数为539例。在纳入的11篇文献中有4篇文献MMP-7表达的检测方法采用的是免疫组化S-P法, 3篇采用的是免疫组化SABC法, 2篇采用的是免疫组化Envision法, 2篇采用RT-PCR法, 数据资料的提取信息见表1。
2.2 异质性检验
分别对研究MMP-7基因表达与食管癌分化程度、淋巴结转移、组织浸润深度和食管癌临床分期关系所纳入的文章进行异质性分析。各异质性检验的结果所得到的I2值分别为46%, 19%, 0%及38%, 均<50%, 认为各组研究中存在的异质性较小, 遂均采用固定效应模型进行效应量的合并。
2.3 系统评价结果
应用Revman 5.0软件进行数据分析, 结果显示MMP-7基因阳性表达组中食管癌低分化患者比例为34.03%, 而MMP-7阴性表达组中食管癌低分化患者比例为21.13% (O^R=2.13, 95%CI:1.50~3.04) , 组间比较差异具有统计学意义 (P<0.000 1) , 表明MMP-7基因表达阳性可能与食管癌患者的组织分化程度差有关。MMP-7基因与食管癌分化程度的相关性评价的数据分析森林图见图1。
在观察MMP-7基因表达改变与淋巴结转移的关系时, 结果显示MMP-7基因阳性表达组中有淋巴结转移的患者比例为57.14%, 而在MMP-7阴性组中该比例为31.69% (O^R=3.25, 95%CI:2.29~4.62) , 组间比较差异具有统计学意义 (P<0.00001) , 表明MMP-7基因表达阳性的食管癌患者较MMP-7基因阴性的患者更容易发生淋巴结的转移。MMP-7基因与食管癌患者淋巴结转移的相关性评价数据分析的森林图见图1。
MMP-7基因表达改变与食管癌组织浸润深度的结果显示:MMP-7基因阳性表达组中食管癌侵及外膜的患者比例为57.75%, 而在MMP-7阴性组中该比例为32.16% (O^R=3.45, 95%CI:2.36~5.03) , 组间比较存在统计学意义 (P<0.000 01) , 表明MMP-7基因表达阳性的食管癌患者比MMP-7基因阴性的患者组织侵润深, 更易侵及外膜。MMP-7基因与食管癌组织浸润深度相关性评价的数据分析森林图见图1。
MMP-7基因表达改变与食管癌分期的研究结果显示:MMP-7基因阳性表达组中肿瘤分期为Ⅲ+Ⅳ期的患者比例66.42%, 而MMP-7阴性组中该比例为34.84% (O^R=3.71, 95%CI:2.57~5.36) , 组间比较差异具有统计学意义 (P<0.000 01) , 表明MMP-7基因为阳性的食管癌患者临床分期晚于MMP-7基因阴性的患者。MMP-7基因与食管癌分期相关性评价的数据分析森林图见图1。
应用Revman 5.0对上述四组研究分别作出漏斗图后均未发现存在明显的发表偏倚, 各组研究的发表偏倚的漏斗图见图2。
2.4 亚组分析
本研究纳入文献所采用的MMP-7基因的检测方法存在一定的差异, 因此本研究依据检测方法的不同进行了亚组分析。亚组分析的结果显示:应用IHC S-P检测方法组中, MMP-7的阳性表达对食管癌的分化程度、淋巴结转移、浸润深度而言均为危险因素 (P<0.05) , 而在IHC SABC方法的亚组中, MMP-7阳性表达对食管癌的组织分化程度无显著影响 (P=0.22) , 而对淋巴结转移、组织浸润深度及肿瘤的临床分期等均为危险因素。在RT-PCR检测方法亚组中, 结果提示MMP-7阳性表达仅与食管癌的淋巴结转移有关 (P=0.007) , 而与组织分化程度及肿瘤的临床分期无关 (P≥0.05) 。在IHC Envision检测方法亚组中, 结果提示MMP-7阳性表达与组织分化程度及淋巴结转移无关 (P≥0.05) 。亚组分析的结果详见表2。
A:分化程度;B:淋巴结转移;C:浸润深度;D:临床分期
A:分化程度;B:淋巴结转移;C.浸润深度;D:临床分期
2.5 敏感性分析
在本研究所纳入的文献中, 其中1篇文献[6]的研究人群是中国哈萨克族的患者, 另外1篇[9]的研究人群是中国维吾尔族的患者, 当去除上述2篇文章对研究进行了敏感性分析, 发现统计结果与剔除文献前结果一致。
3 讨论
肿瘤的侵袭与转移是一个多因素参与的肿瘤细胞与人体相互作用的过程[17,18]。MMPs可以调节肿瘤细胞的微环境, 并且促进肿瘤细胞的转移。相比于正常组织, 它们几乎在所有的肿瘤中都有着更高的表达及活化。在正常情况下, 细胞外基质和基底膜在保持细胞正常结构及控制细胞生长过程时起到了重要的作用;在恶性肿瘤的形成过程中, 肿瘤的生长、侵袭及转移与MMPs表达的金属基质蛋白酶对于细胞外基质及细胞基底膜的降解作用密切相关。学者LIU等[19]在研究不同MMPs的启动子区多样性与癌症转移的过程中, 报道恶性肿瘤发生转移的风险与MMP-1、MMP-3、MMP-7及MMP-9存在着关系。MMP-7是MMPs家族中结构最小的成员, 它不仅表达于人体很多正常组织中, 同时也被发现表达于肿瘤组织中。MMP-7的酶解作用较为广泛, 它对于胶原、蛋白聚糖、层粘连蛋白、纤连蛋白及酪氨酸等均有一定的降解作用[20]。有较多研究提示MMP-7的阳性表达与食管癌的浸润深度、淋巴结转移、晚期扩散等生物学行为存在着密切的关系。
有研究[21]结果显示, MMP-7基因表达阳性对于食管癌组织浸润深度有着显著的影响。YAMAMOTO等[22]学者在对100例食管癌组织进行免疫组化染色检测MMP-7表达后发现, MMP-7基因表达阳性与食管癌组织浸润深度 (P<0.000 1) 及食管癌分期 (P=0.0159) 均有着密切联系。在本研究中笔者亦得到相似的结论, MMP-7基因阳性表达组中食管癌侵及外膜的患者比例为57.75%, 而在MMP-7阴性组中该比例为32.16% (O^R=3.45, 95%CI:2.36~5.03) , 组间比较差异存在统计学意义 (P<0.00001) , 表明MMP-7基因表达阳性的食管癌患者比MMP-7基因阴性的患者组织侵润深, 更易侵及外膜。MMP-7基因阳性表达组中肿瘤分期为Ⅲ+Ⅳ期的患者比例66.42%, 而MMP-7阴性组中该比例为34.84% (O^R=3.71, 95%CI:2.57~5.36) , 组间比较差异具有统计学意义 (P<0.0001) , 表明MMP-7基因为阳性的食管癌患者临床分期晚于MMP-7基因阴性的患者。但也有研究认为[23]MMP-7的表达与食管癌的病理分化程度、淋巴结转移、TNM分期均无关系 (P>0.05) , 仅与组织浸润深度有关 (P<0.05) 。本研究结果显示, MMP-7基因阳性表达组中食管癌低分化患者比例为34.03%, 而MMP-7阴性表达组中食管癌低分化患者比例为21.13% (O^R=2.13, 95%CI:1.50~3.04) , 组间比较差异具有统计学意义 (P<0.000 1) , 表明MMP-7基因表达阳性可能与食管癌患者的组织分化程度差有关。MMP-7基因阳性表达组中有淋巴结转移的患者例数比例为57.14%, 而在MMP-7阴性组中该比例31.69% (O^R=3.25, 95%CI:2.29~4.62) , 组间比较差异具有统计学意义 (P<0.000 01) , 表明MMP-7基因表达阳性的食管癌患者较MMP-7基因阴性的患者更容易发生淋巴结转移。
在依据不同检测方法而进行的亚组分析中, 笔者发现应用IHC S-P检测方法组中, MMP-7的阳性表达对食管癌的分化程度、淋巴结转移及浸润深度而言均为危险因素 (P<0.05) , 而在IHC SABC方法的亚组中, 笔者发现MMP-7阳性表达对食管癌的组织分化程度无显著影响, 而对淋巴结转移、组织浸润深度及肿瘤的临床分期等均为危险因素。在RT-PCR及IHC Envision检测方法亚组中, 笔者得到的结论与总体差异较大, 考虑这种差异可能与该亚组纳入的研究较少有关 (均为2篇) 。尽管亚组间的结果存在一定的差异, 综合O^R比仍提示MMP-7阳性表达是食管癌的危险因素。
总之, 笔者的系统评价结果提示中国人群的MMP-7基因阳性表达改变与食管癌的临床特征间存在着一定的关系。MMP-7表达阳性的食管癌患者其组织分化程度更低、更易发生淋巴结转移、肿瘤更易侵及外膜, 并且肿瘤临床分期更晚。当然, 本研究仍存在着一些局限性:由于纳入的食管癌患者可能存在性别、年龄、民族等混杂因素的差异, 对于本研究的分析造成一定的变异, 因此, 笔者在分析过程中进行了异质性分析, 所得到的异质性评价指标I2均在50%以下 (46%, 19%, 0%及38%) , 异质性较小, 故认为混杂因素对于研究的影响较小。同时笔者还就纳入文献中存在的不同民族差异进行了敏感性分析, 所得到的结论与原统计结论一致。因此, 认为本研究中民族差异对本研究结论影响较小。另外, 本文所纳入的研究中MMP-7基因表达阳性的检测方法存在差异, 进行亚组分析后, 发现IHC S-P检测方法与IHC Envision及RT-PCR等方法相比, 得出的统计结论与总体研究统计结论更为一致。考虑与纳入研究的数目相关, 今后仍需要大规模的临床研究以进一步验证及统一规范精确灵敏的检测方法, 从而消减因检测方法不同所造成的结果变异。
基质金属蛋白-7 篇3
1 材料和方法
1.1 材料
本研究收集南华大学附属第一医院2007年6月~2009年6月46例临床资料完整的手术切除的卵巢癌和10例癌旁正常卵巢组织的石蜡固定标本。所有病例均经病理检查证实,确诊前未接受化疗和放疗。患者年龄32~71岁,平均46.5岁。按WHO(1999年)分类标准进行肿瘤分型,按FIGO(2000)修订的手术病理分期标准进行分期,其中浆液性囊腺癌25例,非浆液性囊腺癌21例,高-中分化19例,低分化27例。TNM分期按UICC标准,Ⅰ~Ⅱ期20例,Ⅲ~Ⅳ期26例,术后病理检查有淋巴结转移24例,无转移22例。免疫组织化学染色试剂盒SP-9000、浓缩性DAB试剂盒、MMP-7鼠抗人的单克隆抗体(ZM-0334)均购于北京中杉金桥生物技术有限公司,MIF兔抗人的多克隆抗体(FL-115)购自美国Santa Cruz公司。
1.2 方法
免疫组织化学染色按试剂盒说明进行,所有新鲜标本均经10%甲醛固定,石蜡包埋,将标本制成4~5μm厚的连续切片,脱蜡、水化、微波抗原修复5min,30 m L/L H2O2孵育10 min,PBS洗3次,每次3min,非特异性血清封闭10 min,PBS洗3次,每次3min,滴加一抗4℃孵育过夜,PBS洗3次,每次3min,二抗孵育10 min,PBS洗3次,每次3 min,DAB显色,苏木素复染细胞核,脱水,透明,封片,镜检,摄像。取已知阳性组织作阳性对照,PBS替代一抗作阴性对照。
1.3 结果判定
MIF免疫组织化学染色以细胞质或细胞核中出现淡黄色至棕褐色颗粒状为其阳性判定标准,根据着色的程度判定,不着色为阴性(-),淡黄色为弱阳性(+),棕黄色为中度阳性(++),棕褐色为强阳性(+++)。MMP-7免疫组织化学染色以细胞质内出现棕黄颗粒着色为阳性标记,每张切片高倍镜下选10个高倍视野,每个高倍视野计数100个肿瘤细胞,计算出每张切片的阳性细胞百分数。分为4个等级:阳性细胞数<25%记为阴性(-),26%-50%记为(+),51%-75%记为(++),>75%记为(+++)。
1.4 统计学处理
采用SPSS 13.0软件作统计学分析。数据用均数±标准差表示,计数资料用R×C表的χ2检验,相关性分析采用Spearman等级相关分析,P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 MIF和MMP-7在乳腺癌组织中的表达
MIF阳性染色主要位于胞浆,亦可见胞膜和核膜,呈淡黄色至棕褐色颗粒状。MIF在正常卵巢组织中阴性表达,在卵巢癌组织中的阳性表达率为67.4%(表1),染色强度多为棕黄色至棕褐色(图1、2);随着组织学分级越低及临床分期越高,MIF染色强度越强,阳性细胞亦越多;伴有淋巴转移的卵巢癌组织,染色强度亦越强。MMP-7的阳性表达以细胞质为主,部分为胞膜着色,为棕黄色颗粒(图3、4),阳性细胞在癌巢中的分布是不均匀的,常位于癌巢周边。间质细胞无阳性染色,靠近肿瘤的正常组织亦无染色,这表明MMP-7的表达仅限于肿瘤细胞。正常卵巢组织中MMP-7无表达,而卵巢癌组织的阳性表达率为65.2%(表1)。
2.2 MIF和MMP-7表达和卵巢癌临床病理参数的关系
MIF和MMP-7蛋白在卵巢癌不同患者年龄、病理学类型中的差异无显著性(P>0.05),在不同组织学分级、TNM分期、淋巴结转移中的差异有显著性(P<0.05),即MIF和MMP-7蛋白与卵巢癌患者年龄、病理类型无关(P>0.05),而与组织学分级、临床分期和淋巴结转移密切相关(P<0.05)。见表2。
2.3 卵巢癌中MIF和MMP-7表达的相关性
采用Spearman等级相关分析:MIF和MMP-7在卵巢癌组织中的表达存在显著正相关(r=0.9250,P<0.01)。见表3。
注:rs=0.9250,P<0.01
3 讨论
MIF是一种由活化的T细胞产生的细胞因子,因能抑制单核/巨噬细胞移动而命名,可以促进巨噬细胞的聚集与肿瘤细胞相互作用。巨噬细胞通常聚集在肿瘤浸润区域邻近的间质组织中,肿瘤细胞与巨噬细胞的相互作用导致了细胞外基质降解酶的产生,促进了血管生成反应。这种反应促进了肿瘤的浸润和转移。肿瘤细胞又可以分泌MIF,通过促进巨噬细胞的聚集而加快肿瘤的生长。MIF一方面可以诱导肿瘤细胞MMP-9和IL-8表达上调,这可能是肿瘤早期组织侵袭和淋巴结转移的重要因素;又可以促进细胞的转化、抑制肿瘤细胞的特异性免疫溶解反应,增强肿瘤血管的生成[5]。因此,MIF可能是调节肿瘤生长的靶蛋白。MIF在多种肿瘤细胞中呈现高表达,如转移性前列腺癌、乳腺导管癌和结肠癌细胞等。本研究结果中,MIF在正常卵巢组无表达,在卵巢癌组织中高表达,在不同组织学分级、TNM分期、淋巴结转移的标本中的差异有显著性(P<0.05),说明MIF不但参与了卵巢癌的侵袭和转移,而且还影响到卵巢癌的早期发生。这亦与DELDING等[6]的研究结果相一致:即MIF可以上调血管内皮生长因子(VGEF)、转移生长因子β(TGF-β)等的表达,和肿瘤的侵袭、转移密切相关。
基质金属蛋白酶(MMPs)家族是一组锌依赖肽链内切酶,几乎能降解细胞外基质的所有成分。MMPs一方面通过降解基底膜和包绕肿瘤的基质,突破基质屏障,促进肿瘤侵袭转移[7];另一方面则通过毛细血管增生、新生血管生成等促进肿瘤生长和扩散。MMP-7是MMPs家族中的重要成员之一,具有强大的基质降解功能和广泛的底物活性,参与多种恶性肿瘤的浸润转移过程[8],有研究证实MMP-7的过度表达与肿瘤的发生、发展关系密切[9]。本研究资料显示,MMP-7在正常卵巢组织中无表达,在卵巢癌组织中高表达,与前述观点相符。MMP-7是降解基膜和细胞外基质主要结构的关键酶,对恶性肿瘤的发展及间质血管新生起着决定性作用。它可以通过降解细胞外基质、调节细胞凋亡、增加细胞黏附能力、促进新血管生成等方面促进肿瘤细胞的生长、浸润和转移[10]。本研究结果显示,MMP-7的阳性表达与卵巢癌患者的年龄及病理类型无关,而与组织学分级、TNM分期和淋巴结转移有关,这也表明了MMP-7在卵巢癌的侵袭和转移中起到了促进作用。有研究证实MIF能诱导基质金属蛋白酶家族的表达,本实验同样显示MIF和MMP-7在卵巢癌组织中的表达存在显著正相关(r=0.9250,P<0.01),提示MIF可能通过促进MMP-7的表达使细胞外基质降解,促进肿瘤的生成、侵袭和转移。两者在卵巢癌的发生、发展过程中起着重要的正协同作用。
目前,对卵巢癌的研究中尚无MIF和MMP-7相关性的报道,本实验统计结果提示二者均在卵巢癌组织中高表达并存在正相关。促MMP-7表达可能是MIF在卵巢癌的作用机制,但MIF如何促进MMP-7在卵巢癌的表达还有待进一步研究。故联合检测MIF和MMP-7在卵巢癌组织中的表达情况,可以帮助卵巢癌的早期诊断和预后,为卵巢癌的临床治疗提供指导,提高卵巢癌患者的生存率。
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基质金属蛋白-7 篇4
1 资料与方法
1.1 临床资料
选取本院2007年2月~2010年9月诊治的60例EOC患者初次切除后的卵巢石蜡包埋组织标本,年龄33~67岁,平均年龄(47.5±13.3)岁;根据国际妇产科联盟(Intemational Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)标准进行临床分期及病理组织学的分级,其中临床分期Ⅰ~Ⅱ期24例,Ⅲ~Ⅳ期36例;高分化~中分化程度35例,低分化程度25例;术后对60例EOC患者进行随访2~6年。并取同期因子宫良性疾病手术而切除卵巢的患者的石蜡包埋组织标本其中正常卵巢组织10例,患者年龄35~64岁,平均年龄(47.2±12.4)岁,术前未做任何的化疗及放疗;良性卵巢肿瘤组织16例,年龄34~68岁,平均年龄(48.9±15.1)岁。对数据进行分析比较。
1.2 方法
1.2.1 实验试剂
即用型鼠抗人MMP-2、MMP-9、CD34单克隆抗体及SP免疫组织化学超敏染色试剂盒和二氨基联苯氨(diaminobenzidin,DAB),均由美国Maxim公司生产,购于迈新生物技术有限公司。
1.2.2 方法
标本取材后采用5.0%的甲醛缓冲液固定,进行常规脱水和石蜡包埋,切取5.0μm石蜡切片,放置于54℃烘箱中。MMP-2、MMP-9和CD34表达情况的检测采用免疫组织化学SP法,按照MMP-2、MMP-9、CD34鼠抗人的单克隆抗体、SP免疫组化试剂盒和DBA显色液试剂盒中各自的说明进行操作,每组染色均以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。
1.2.3 观察标准
显微镜下观察细胞的染色情况,细胞浆或细胞核中出现黄色或棕黄色颗粒作为阳性判定的标准。按照5.0%以上细胞浆或细胞核呈棕黄色染色为表达阳性,<5.0%的细胞着色或细胞与背景一致不着色定位阴性(-),5.0%~30.0%的细胞阳性染色定为(+),30%~50.0%的细胞阳性染色定为(++),阳性细胞>50.0%定为强阳性(+++)。微血管密度(microvessel density,MVD)的计数:先在40倍镜下全面观察用免疫组织化学SP法进行CD34染色的切片,确定MVD的最高点;然后在200倍镜下记录5个视野内的微血管数,取其平均值作为该病例的MVD值。
1.3 统计学处理
采用SPSS11.5统计学软件对数据进行处理分析,各组MMP-2、MMP-9与临床病理特征的关系采用χ2检验,MVD与临床病理特征的关系采用t检验,MMP-2和MMP-9与MVD的相关性应用Spearman分析,检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 MVD在3种组织中的表达
CD34呈棕黄色细颗粒状,在卵巢肿瘤组织间质血管内皮细胞胞浆呈阳性表达,EOC、良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织的MVD分别为(41.25±32.12)、(14.27±9.58)和(7.43±5.47),EOC组中的MVD与卵巢良性肿瘤组比较显著升高(P<0.05)。
2.2 MMP-2和MMP-9在3种组织中的表达
MMP-2和MMP-9免疫组织化学的阳性产物均呈棕黄色细颗粒状,主要定位于肿瘤细胞的胞浆和胞核。60例EOC中MMP-2和MMP-9的阳性率分别为67.45%和72.41%,显著高于卵巢良性肿瘤组及正常组(P<0.05)。
2.3 EOC中MMP-2和MMP-9的表达与临床病理特征的关系
EOC中MMP-2和MMP-9的表达与肿瘤大小无关(P>0.05),与细胞的分化程度、转移和肿瘤分期具有相关性(P<0.05),结果见附表。
2.4 卵巢上皮性癌中MMP-2、MMP-9与MVD表达的相关性分析
MMP-2和MMP-9的表达均与MVD表达呈正相关,相关系数为(r=0.254,r=0.246,P<0.05)
3 讨论
MMPs是蛋白水解酶中较为重要的一类。资料显示[4,5],肿瘤细胞除了能分泌MMPs外,还能分泌血管生成因子,如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),诱导内皮细胞产生MMPs。降解细胞外基质和基底膜[6,7],进一步促进肿瘤新生血管的生成。
据资料,MMP-9在EOC的表达与局部肿瘤血管生成的关系的报道较少,本文通过研究,将正常卵巢组织与卵巢上皮性癌组织进行对比分析,结果显示卵巢上皮性癌中MMP-9的阳性表达率显著升高(P<0.05),这与王喜梅[8]的报道相一致,从而证实了MMP-9在卵巢上皮性癌中过度表达,促进肿瘤血管的生成。MMP-2是分子量为72 kD的Ⅳ型胶原酶,主要的作用底物为4、5型胶原,主要由肿瘤细胞、成纤维细胞以及炎性细胞分泌,研究[9]表明,其在肿瘤介导的细胞外基质降解中发挥着重要的作用,基质膜和基质的降解对血管生成所必需的内皮细胞极为重要,MMP-2被认为是肿瘤血管生成关键因素之一。通过本次研究结果显示,MMP-2及MMP-9的表达率高的EOC患者,其肿瘤血管生成的能力越强[10],因此,卵巢上皮性癌中MMP-2和MMP-9表达的增强,可能与卵巢上皮性癌的发生发展具有相关性(r=0.254,r=0.246,P<0.05)。检测EOC中MMP-2及MMP-9的表达有助于进一步了解肿瘤血管的生成情况。
综上所述,MMP-2及MMP-9与EOC的血管生成显著相关,是EOC相关的一种癌蛋白,在EOC的发生和发展中发挥着重要的作用,对蛋白的表达有正向的调节作用,进而可以影响EOC血管的生成。
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基质金属蛋白-7 篇5
关键词：肺纤维化,基质金属蛋白酶-2,基质金属蛋白酶-9
肺纤维化是多种慢性肺疾病的共同结局, 表现为肺间质细胞大量增殖、细胞外基质 (ECM) 异常增生及肺组织结构的重构, 疾病早期表现为弥漫性肺泡炎, 肺泡结构破坏, 肺泡上皮细胞和基底膜的损伤是肺间质纤维化病理过程的特征性改变, MMP-2和MMP-9可以降解肺泡壁基底膜的重要成分Ⅳ型胶原, 因此, MMP-2和MMP-9在肺纤维化的发生过程中起着重要的作用。清肺化痰通络方是全国名老中医邱幸凡教授的临床经验方, 在临床应用中取得了较好疗效。本实验借鉴博莱霉素A5 (BLMA5) 诱发的大鼠肺纤维化模型, 利用免疫组化法检测肺内MMP-2和MMP-9的表达, 以探讨清肺化痰通络方防治肺纤维化的作用及可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物
雌性Wistar大鼠72只, SPF级, 体重 (200±20) g, 购于武汉大学试验动物中心。
1.2 试验药物
清肺化痰通络方由黄芩、瓜蒌、桃仁、地龙、黄芪、当归、鱼腥草 (购于湖北省中医院) 组成;常规水煎后, 水浴浓缩药液至每1 m L含生药2 g, 4℃保存。将BLMA5 (8 mg/支, 天津太和制药有限公司, 批号:030705) 制成5 mg/m L的生理盐水溶液。MMP-2单克隆抗体 (产品编号:ZM-0330) 、MMP-9单克隆抗体 (产品编号:ZM-0335) 及Sp试剂盒 (产品编号:SP-9000) 由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。
1.3 肺纤维化模型制作
参照文献[1], 将大鼠麻醉, 趁动物吸气瞬间, 在额镜的直视下迅速将焊锡制成圆头的12号腰穿针头, 通过声带插入气管约3~4 cm, 缓慢注入BLMA5生理盐水溶液1 m L/kg。立即将大鼠直立旋转。
1.4 动物分组及处理方法
将72只大鼠随机分为三组: (1) 模型组 (24只) :造模2 h后, 生理盐水灌胃, 15 m L/ (kg·d) ; (2) 干预组 (24只) :造模2 h后, 清肺化痰通络方水煎剂灌胃, 15 m L/ (kg·d) ; (3) 对照组 (24只) :不造模, 生理盐水灌胃, 15m L/ (kg·d) , 灌胃前禁食4 h, 不禁水。以上各组动物分别在实验第3、7、14、28天各处死6只。
1.5 标本采集及处理
经0.5%戊巴比妥钠溶液腹腔内注射麻醉后, 称重;颈动脉放血处死, 10%甲醛溶液固定右肺上叶, 制作石蜡切片, 用于HE染色和Masson染色及肺组织MMP-2和MMP-9表达检测。
1.6 指标检测
1.6.1病理染色分析依据Szapiel等[2]方法, 确定肺泡炎及肺纤维化程度。 (1) 肺泡炎分级, 0分:无明显病变;1分:轻度肺泡炎, 病变占全肺20%以下;2分:中度肺泡炎, 病变局限在全肺20%~50%;3分:弥漫性肺泡炎, 病变范围超过50%。 (2) 肺间质纤维化分级, 0分:无肺间质纤维化;1分:轻度肺间质纤维化, 病变范围局限在全肺20%以下;2分:中度肺间质纤维化, 病变范围占全肺20%~50%;3分:重度肺间质纤维化, 病变范围超过50%, 肺泡结构消失, 肺组织结构紊乱。
1.6.2免疫组织化学分析Sp法测定肺组织的MMP-2和MMP-9表达, 采用HUMIAS-2000医学图文分析系统, 对免疫组织化学结果定量分析。每张切片在高倍视野 (×400) 下随机选择不相重叠的5个视野, 细胞核为蓝色, MMP-2和MMP-9阳性细胞为棕黄色, 阴性对照片以PBS替代MMP-2和MMP-9。测定阳性细胞的积分光密度, 观察MMP-2和MMP-9免疫阳性细胞的分布, 以反映各组肺组织中MMP-2和MMP-9表达的变化。
1.7 统计学方法
采用SPSS 12.0统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差 (x±s) 表示, 三组间比较采用单因素方差分析, 用q检验进行不同组间的两两比较, 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 清肺化痰通络方对肺纤维化大鼠肺组织的影响
2.1.1肉眼观察对照组可见大鼠肺呈粉红色, 表面光滑, 弹性良好。模型组第3、7天可见大鼠双肺呈鲜红色, 有数个的散在出血点, 体积增大, 第14天双肺可见暗红色陈旧出血, 第28天时双肺苍白、表面凸凹不平、体积缩小、弹性较差, 硬度增加。干预组与模型组病变基本一致, 但程度稍轻, 肺体积略增大, 弹性稍差。
2.1.2镜下观察对照组大鼠肺组织结构清晰, 肺泡壁完整, 肺泡上皮细胞形态正常, 均未见明显病变。模型组第3天时肺内出现肺泡间隔增宽、炎性细胞浸润等急性肺泡炎改变;第7天时炎症表现更明显, 镜下见大片炎性细胞浸润, 成纤维细胞开始增殖;第14天时肺泡炎持续加重, 纤维组织开始增生;第28天肺泡炎较前有所减轻, 部分肺泡腔消失, 被大量成纤维细胞、增生的胶原纤维所取代, 已基本呈现肺纤维化改变。干预组大鼠肺部病理表现的变化规律与模型组基本一致。三组间同时段的肺泡炎程度, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;干预组和模型组同时段肺泡炎程度差异有统计学意义 (P<0.05) , 特别是第7天和第14天干预组肺泡炎程度较模型组轻, 两组间差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。干预组和模型组在第3天肺纤维化程度差异无统计学意义 (P>0.05) , 三组在第7、14、28天的肺纤维化程度, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;第28天干预组肺纤维化程度较模型组轻, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。见表1。
2.2 三组MMP-2和MMP-9蛋白表达比较
对照组肺组织中可见MMP-2少量阳性表达, 主要分布在肺泡巨噬细胞、肺泡上皮细胞、成纤维细胞和气道上皮细胞胞浆内。模型组、干预组第3天时, 肺内MMP-2阳性表达细胞均多于对照组, 肺泡间隔内可见少量成纤维细胞呈阳性反应, 血管、支气管周围及肺泡腔镜下内可见大量单核巨噬细胞呈强阳性反应, 三组间比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;第7天模型组和干预组MMP-2表达明显增强, 可见大量肺泡巨噬细胞和间质内的成纤维细胞呈阳性表达;第14天模型组和干预组肺内阳性细胞表达最强, 与第3、7、28天比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;第28天时, 模型组和干预组阳性细胞较同组第14天时明显减少, 但仍高于对照组。见表2。
对照组肺内可见MMP-9少量弱阳性表达, 表达主要分布于肺胞巨噬细胞和支气管上皮细胞。第3天时模型组、干预组大鼠肺内血管、支气管周围及肺泡腔内的单核巨噬细胞呈强阳性反应, 与对照组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;第7天模型组和干预组肺内MMP-9表达增强, 除支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞外, 还见大量间质内的成纤维细胞和肺泡巨噬细胞呈阳性表达, 与同组第3、14、28天比较, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) ;第14天模型组和干预组肺内阳性细胞略有减少;第28天模型组和干预组MMP-9表达较第7天时明显减弱, 但仍高于对照组 (P<0.05) 。干预组阳性细胞明显少于同时段模型组, 两组间差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。
3 讨论
现代医家根据肺纤维化临床表现及病机变化将其归为咳嗽、肺胀、喘证、气短、肺痿、肺痹、痰饮等范畴, 正气亏虚为本, 血瘀内阻为标, 正虚邪实为其基本病机, 其中, 痰阻肺络、肺阴不足、瘀血阻滞、内闭喘脱为临床多见的病变类型。消肿化痰通络方中黄芩、瓜蒌为君药, 黄芩味苦寒主入肺经, 可泻火解毒, 治肺热所致咳吐黄痰;瓜蒌药味甘、微苦, 性寒, 归肺、胃、大肠经, 清热化痰, 宽胸散结、痛疮肿毒, 两者相伍则肺之热清痰化而气机调畅;鱼腥草味辛, 性微寒, 归肺经具有清热解毒、消痈排脓功效, 肺萎之人久咳入络, 必兼气虚血瘀, 故以地龙、桃仁活血化瘀、通络, 且地龙性寒味咸, 善下行可平抑上逆之肺气而止咳平喘;佐以黄芪、当归养血补气, 与君药相配, 苦寒、甘温并用, 使肺热得清而不伤肺津, 共奏清热化痰、止咳平喘、活血益气之功。
实验结果显示, 造模大鼠均有不同程度的耸毛、活动减少、嗜睡, 少吃等症状。造模初期可见大鼠体重明显下降, 约3 d后逐渐缓解, 其中, 干预组体重恢复较快, 第28天时体重已与空白对照组相近, 而模型组体重恢复较慢, 第28天时仍明显低于对照组。通过HE光镜观察模型组早期即出现肺泡炎, 14 d后以肺纤维化病变为主, 28 d出现典型的肺纤维化改变, 符合肺纤维化的病理改变过程[3], 提示造模成功。干预组肺泡炎程度明显的轻于模型组, 提示清肺化痰通络方可以减轻早期肺泡炎的改变, 第14、28天干预组肺纤维化程度轻于同时段的模型组。提示清肺化痰通络方可以减轻模型动物的症状, 并在肺组织结构上减轻和延缓纤维化的发生。
组织纤维化的发生是由于ECM代谢失衡, 打破了脏器原有的组织结构, 纤维结缔组织大量增生的结果[4]。ECM包括纤维性成分、连接蛋白和间质成分, 主要为糖胺聚糖等, 其对细胞增殖和分化发挥重要调控作用, 合成和降解这些蛋白质的ECM代谢酶可分为基质金属蛋白酶类 (MMPs) 和基质金属蛋白酶组织抑制物 (TIMP) 。MMPs的明胶酶 (MMP-2、MMP-9) 主要降解Ⅳ胶原纤维、纤维连接蛋白、肺基膜等成分, 由于肺基膜及结构支架的损伤与肺纤维化密切相关, 因此, MMPs在肺纤维化发生中的作用日益受到重视[5]。有报道MMP抑制剂巴马司他等能降低MMP-9活性, 抑制TNF-α和TGF-β1释放, 减轻动物模型的肺纤维化[6,7]。Lemjabbar等[8]测定了肺间质纤维化患者支气管肺泡灌洗液中蛋白和MMP-2 m RNA的表达, 显示激素及免疫抑制剂治疗可以降低肺内MMP-2表达。上述研究均表明损伤肺组织可能通过持续性高表达MMPs, 使基膜不可逆性损伤断裂, 阻碍新生上皮组织重构正常肺泡腔, 最终导致肺纤维化。
本实验研究显示, 第3天开始模型组和干预组肺内MMP-2、MMP-9的表达均开始增加, 模型组和干预组MMP-9在第7天时已经达到高峰, 然后干预组快速下降, 到第28天时MMP-9水平基本接近正常, 模型组在第7天出现MMP-9表达高峰, 第14、28天也出现明显的下降, 但是28天时MMP-9的水平仍高于对照组。肺纤维化大鼠在造模的第3~14天以肺泡炎的病理改变为主, 提示MMP-9可能与早期上皮基底膜损伤有关, 参与了细胞外基质和基底膜的降解。干预组的MMP-9明显下降, 且在第14天时MMP-9的表达明显低于模型组, 推测清肺化痰通络方可能是通过抑制MMP-9表达, 从而延缓、减轻早期肺泡炎的发生。模型组和干预组MMP-2在第14天时达到高峰, 然后缓慢下降, 第28天时, 模型组和干预组仍高于对照组。第14、28天时以肺纤维化为主要病变, 提示MMP-2则可能在肺泡上皮细胞的再生与肺组织的异常修复中起重要作用。第14、28天MMP-2在干预组的表达低于模型组, 且干预组肺纤维化程度比模型组轻, 提示清肺化痰通络方通过延缓或者抑制MMP-2表达, 达到延缓以及抑制肺纤维化的目的。
综上所述, 本实验结果提示, BLMA5诱导的肺纤维化模型在不同时期MMPs的表达不同, 早期病变肺组织以MMP-9的增加为主, 晚期则以MMP-2增加为主, 与有关报道一致[9]。清肺化痰通络方可能通过抑制MMP-9在肺纤维化大鼠肺内的表达, 减轻早期的肺泡炎, 抑制MMP-2的表达, 延缓和抑制后期肺纤维化的发生。
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基质金属蛋白-7 篇6
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源
本组研究中宫颈组织石蜡标本均取自2002年6月~2008年12月在我院妇科门诊进行宫颈活检、住院患者手术切除的组织,慢性宫颈炎20例、CINⅠ级15例,CINⅡ级15例,CINⅢ级15例,宫颈癌42例。宫颈癌临床分期采用FIGO标准,其中宫颈癌Ⅰ期14例,Ⅱ期21例,Ⅲ期7例,全部病例在术前均未接受放疗、化疗。所选病例无高血压、糖尿病等合并症。
1.1.2 试剂
MMP-2和MMP-9均为兔抗人单克隆抗体,购自北京中杉金桥生物技术公司。
1.2 方法
1.2.1 免疫组织化学染色
按免疫组织化学二步法进行,石蜡切片经二甲苯脱蜡、酒精水化后,微波炉中修复抗原,用1︰50 MMP-2一抗及MMP-9一抗作用过夜,生物素二抗孵育,链亲和素-生物素过氧化合物酶复合物作用后经DAB显色封片观察。每批实验以扁桃体为阳性对照,以PBS代替第一抗体作为阴性对照。
1.2.2 结果判定标准
用低倍和高倍镜观察全片,MMP-2及MMP-9阳性染色为在细胞浆内出现棕黄色颗粒,根据阳性细胞数所占比例及染色强度分为以下几级:无染色细胞(-);阳性染色细胞数<20%(+),染色淡黄,个别可黄至棕黄色;阳性染色细胞数20%~50%(++),染色黄色:阳性染色数>50%(+++),强度黄至棕黄色,少数为淡黄色。对CIN及宫颈癌病例,进行病变部位MMP-2和MMP-9测定。
1.3 统计学方法
采用等级资料中多个样本比较的秩和检验,及列联表资料的χ2检验,检验水准α=0.05。
2 结果
2.1.1 MMP-2在慢性宫颈炎、各级CIN、宫颈癌组织中的表达
MMP-2主要表达于宫颈上皮细胞胞浆内,从下表显示:在慢性宫颈炎,MMP-2的阳性细胞率表达很低,仅为5%,在各级CIN、宫颈浸润癌阳性表达高,其阳性表达强度随CIN级别增高而增强,至宫颈癌表达强度最高,差异有显著性,见表1。
注:H=64.34,P<0.005
2.1.2 MMP-2在各级宫颈癌组织中的表达
MMP-2在宫颈癌上皮细胞中表达阳性率达100%,但宫颈癌的临床分期与MMP-2的表达强度差异无显著性,见表2。
例
注:χ2=7.02,0.1
2.2.1 MMP-9在慢性宫颈炎、各级CIN、宫颈癌组织中的表达
MMP-9主要表达于宫颈上皮细胞胞浆内,从下表显示:在慢性宫颈炎,MMP-9的阳性细胞率表达很低,在各级CIN、宫颈浸润癌阳性表达高,其阳性表达强度随CIN级别增高而增强,至宫颈癌表达强度最高,并差异有显著性,见表3。
例
注:H=57.19,P<0.005
2.2.2 MMP-9在各级宫颈癌组织中的表达
MMP-9在宫颈癌上皮细胞中表达阳性率达100%,宫颈癌的临床分期与MMP-9的表达强度差异有显著性,见表4。
例
注:χ2=11.83,0.01
3 讨论
细胞外基质(extracellular matrix,ECM)有间质性基质和基底膜两种形式,恶性肿瘤侵袭正常组织及转移必须突破ECM,尤其是基底膜,基底膜的主要成分为Ⅳ型、Ⅴ型胶原、弹力蛋白等。ECM的降解主要依靠蛋白水解酶,基质金属蛋白是其中最为重要的一类,几乎能降解ECM的所有成分。明胶酶MMP-2、MMP-9的降解底物为Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原、纤维蛋白、弹力蛋白等,由此推论:组织中明胶酶的改变与肿瘤的侵袭、转移有关。
肿瘤转移是一个多步骤过程[1],MMP-2和MMP-9降解ECM的能力从各个方面影响肿瘤进展,主要分为以下两个方面:(1)肿瘤血管形成及肿瘤生长。血管形成是肿瘤生长的前提条件,MMP-9被认为是形成新生血管的关键因素,在人神经母细胞瘤异种移植模型中,MMP-9缺乏可导致血管形成减少,以及肿瘤微血管覆盖的外周细胞不连贯[2]。将B16-BL6黑色素瘤细胞种植入MMP-2缺乏的鼠体内,可观察到血管形成减少。(2)转移。肿瘤的转移仍依赖于其血管的形成。在鼠肉瘤模型,MMP-9的抑制可阻断肿瘤的转移[3]。大量的研究显示MMP-2、MMP-9与恶性肿瘤的的进展有关[4]。
宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤,宫颈上皮瘤样变是其癌前病变。从该研究来看,MMP-2和MMP-9在慢性宫颈炎组织中的表达极低,而CIN各级组织中的表达率高,随着CIN级别增高,其表达强度逐渐增强,至宫颈癌表达强度最高,并差异有显著性。与GAIOTTO等[5]的研究结论相似。表明MMP-2和MMP-9与从宫颈癌前病变发展至宫颈癌这一过程相关。
ZHAI等[6]使用原位杂交技术测定正常宫颈、低度CIN、高度CIN及浸润癌组织中膜型基质金属蛋白酶(membertype-matrixmetalloproteinase,MT-MMP)的表达,结果显示随着宫颈病变的进展,MT-MMP的表达逐渐增强,而MT-MMP能激活MMP-2酶原,推断MT-MMP的表达增强导致MMP-2的水平增高。
ARGUELB-RAMIREZ等[7]的研究表明MMP-2和MMP-9的表达与宫颈癌的临床分期密切相关。但笔者在测定不同临床分期宫颈癌组织中的MMP-2和MMP-9水平时发现:虽然这两种明胶酶在宫颈癌组织中的表达很高,但MMP-2的表达强度与宫颈癌的临床分期无关,MMP-9与其临床分期差异有显著性,说明MMP-2在宫颈癌的形成中是一个早期事件,在宫颈癌的进展中,MMP-9起着更重要的作用。有研究显示,MMP-9主要在浸润性癌组织中表达,在原位癌中表达弱,在许多恶性肿瘤,血清可溶性MMP-9的水平能反映肿瘤的转移与否,通常被认为是恶性肿瘤的一项预后指标[8]。MEYER等[9]报道,对于远处转移的肿瘤细胞,MMP-9还有保护性抗凋亡的作用。
综上所述,表明MMP-2和MMP-9在从宫颈癌前病变进展至宫颈癌这一过程中起着重要作用,其表达增强与CIN的分级有关,MMP-9还与宫颈癌的临床分期相关。由此推论,对于宫颈炎、CIN、怀疑宫颈癌的宫颈活检组织进行MMP测定,有助明确诊断,并有助于判定预后。
参考文献
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[6]ZHAI Y,HOTARY KB,NAN B,et al.Expression of membrane type1matrix metalloproteinase is associated with cervical carci-noma progression and invasion[J].Cancer Res,2005,65(15):6543-6550.
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基质金属蛋白-7 篇7
目前已发现20多个MMPs家族成员, 这些成员可以具有如下的基本结构: (1) 信号肽区和前肽区:信号肽的功能是引导翻译后的产物至胞浆内质网。前肽区内含有一个半胱氨酸和两个保守区域, 它的裂解与MMPs的激活有关, 此区域在酶的活化过程中将被水解掉。 (2) 铰链区与类红素蛋白结合区:此区的作用与大多数MMPs的底物特异性有关。 (3) 跨膜区:只存在于膜型MMPs中, 可将其固定于胞膜上。 (4) 催化区:包括Zn2+和Ca2+结合区;此外, MMPs还具有Zn2+结合的活性位点, 通过特定的催化区识别和裂解相应的细胞外基质, 在细胞外间隙激活, 以酶原形式分泌, 需激活产生活性, 活化后可被相应的抑制剂抑制。
二MMPs的激活和调节
除了少数几种MMPs是在细胞内外活化外, 其他MMPs均以无活性的酶原形式分泌到细胞外, 依靠外源性酶水解切掉酶原结构所激活。体内一些蛋白水解酶如:胰蛋白酶、血浆纤溶酶、激肽释放酶等选择性的裂解前肽片段, 使酶原处于一种活化的中间状态。随后, 一些已被激活的MMPs便可以裂解这些处于活化中间状态的酶原。其中, 纤溶酶系统是MMPs最重要的激活剂, 特别是尿激酶型纤溶酶原激活剂可以启动瀑布式酶联激活过程而导致间质的降解。另外, 通过MMPs之间的相互作用也可以激活, 如MMP-3是pro-MMP-9最有效的体内天然活化剂。
MMPs的调节机制分为基因水平调节、酶原活化调节和活化后调节。 (1) 基因水平调节:多细胞因子、细胞外基质成分、原癌基因产物、激素等均可诱导多种细胞表达MMPs。前列腺素、促性腺激素、秋水仙碱可诱导或促进MMPs的合成或分泌。目前对MMPs的激活机制进行了广泛研究, 其中AP-1结合位点是研究的一个热点。该位点位于转录起始位点上游约70碱基处, 在MMPs启动子激活中起着重要作用。 (2) 酶原活化后调节:绝大多数MMPs都是以无活性的酶原形式由细胞合成分泌的, 酶原在细胞外被激活成为具有活性的酶, 参与组织重建、修复、细胞迁移、炎症反应、肿瘤侵袭和转移。MMPs可被体内存在的天然激活剂激活, 也可在体外被特定的化学物质所激活, 如糜蛋白酶和胰蛋白酶可激活MMP-3和MMP-8。一些MMPs也可以激活其它的MMPs。 (3) 活化后调节。此阶段主要是基质金属蛋白酶抑制因子 (tissue inhibitor of matrix metalloproteinases, TIMPs) 对MMPs的抑制。TIMPs是MMPs重要的抑制因子, 表达于肿瘤组织和间质细胞[1~2].TIMPs主要在酶原活化阶段和MMPs活化阶段抑制MMPs的激活。
三MMPs与恶性肿瘤的关系
恶性肿瘤是人类健康最严重的疾病。恶性肿瘤无限生长及其转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因, 其转移和侵袭依赖与细胞外基质降解和肿瘤间质新生血管。这个过程需要一系列蛋白水解酶参与。其中基质蛋白酶是最重要的一类酶。在乳腺癌、食管癌、胃癌、直肠癌、肺癌等多种癌组织中可检测到MMPs含量增加。Shiozawa认为, MMP-1存在于结直肠癌的癌细胞和癌周的间质细胞, 与结直肠癌浸润深度、淋巴结转移以及Ducks分期呈正相关性。
大量研究表明, MMPs在肿瘤转移中的核心作用是通过降解ECM, 促进肿瘤的侵袭和转移。其中最重要的是M M P-2、M M P-9、MMP-7, MMPs活性增加, 会加速细胞外基质的降解作用, 从而促进肿瘤细胞的浸润和转移。将MMP-7和MT-MMP完整c DNA导入无转移潜能或转移潜能较弱的细胞, 受转染细胞的侵袭和转移能力大大提高。ECM的过度降解是由于MMPs及其抑制剂表达不平衡而导致的, 这种失衡可以是MMPs过度表达, 也可以是其抑制剂TIMPs表达降低引起。研究证明, TIMPs均有明显的抑制肿瘤细胞侵袭和转移的作用。
MMPs在肿瘤新生血管形成过程中发挥重要的作用。实验中抑制MMP-2活性可使肿瘤体积减少70%, 将肿瘤细胞移植入MMP-2或MMP-9基因缺失的鼠, 与正常对照鼠比较, 肿瘤血管生成明显减少。另外, MMP-2与MMP-9的表达与血管内皮生长因子呈正相关性, 这也预示其在肿瘤血管形成中有着协同作用。
摘要：基质金属蛋白酶 (matrixmetal loproteinases, MMPs) 是一组结构相近、功能复杂的蛋白水解酶, 因其需要Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名。MMPs通过参与细胞表面和细胞外基质蛋白的降解或激活过程来调控细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质 (extracel lular matrix, ECM) 之间的相互作用, 是正常细胞与肿瘤细胞微环境的重要调节因子。
关键词：基质金属蛋白酶,MMP,恶性肿瘤
参考文献
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