细胞培养基质

细胞培养基质（精选4篇）

细胞培养基质 篇1

牙周疾病造成的牙周附着丧失和牙槽骨缺损是临床急需解决的一个重要问题,而组织工程学理论和应用的迅速发展为促进牙周组织再生提供了新的思路。骨髓基质细胞(bone marrow stromal stem cells, BMSCs)具有多向分化潜能,在体外诱导因子的作用下可向成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、神经细胞等方向分化[1,2],目前已成为牙周组织工程理想的种子细胞来源。近年来研究表明,釉基质蛋白(enamel matrix proteins, EMPs)能够促进牙周组织再生[3]。但目前还未见到有关EMPs对人BMSCs作用的报道。因此,本实验初步研究了EMPs对人BMSCs细胞周期和碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。

1 材料和方法

1.1 主要试剂、仪器

EMPs 从猪的牙胚中提取[4],并制成冻干粉备用;DMEM细胞培养基(Gibco,美国),胎牛血清(Hyclone, 加拿大),MTT(Amersco, 美国), CO2培养箱(Thermo Life sciences, 美国),倒置相差显微镜(Leica,德国),DMSO(宜兴市达华化工有限公司,江苏),流式细胞仪(FACSalibur, Becton Dickinsan),碱性磷酸酶试剂盒(上海仁宝医用试剂研究有限公司)。

1.2 人BMSCs的培养

采用全骨髓法培养人BMSCs。无菌条件下,用肝素化骨髓穿刺针于健康成年志愿者髂后上棘抽取骨髓,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液(含10%胎牛血清, L-谷氨酰胺 0.3 g/L, 100 U /ml青霉素及100 U /ml 链霉素),接种于培养皿中培养。3 d后半量换液,1 周后全量换液,去除悬浮红细胞及未贴壁细胞。此后每周换液2 次,倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。至细胞达到80%～90%左右的汇合后,进行传代培养。取第3代细胞用于实验研究。

1.3 细胞周期分析

选择增殖实验[5]中的EMPs作用人骨髓基质细胞最佳浓度200 μg/ml进行分析,以不加EMPs为空白对照。用流式细胞仪检测EMPs 对人BMSCs细胞周期的影响。

1.4 碱性磷酸酶染色

以矿化诱导液培养细胞(DMEM培养液加地塞米松10-8 mol/L,维生素C 50 mg/L,β-甘油磷酸钠10 mmol/L)。以200 μg/ml EMPs作用于细胞为实验组,以不加EMPs为对照组。培养2、5 d后,取细胞爬片按照试剂盒说明进行碱性磷酸酶染色。用图像分析系统测量平均灰度值。

1.5 统计学分析

采用SAS6.12软件对所得数据行统计学分析,检验水准为α=0.05。

2 结 果

2.1 人骨髓基质细胞的体外培养

接种后最初3 d内,培养皿中含有大量造血干细胞及悬浮细胞(包括血细胞及未贴壁单核细胞),无法观察到细胞贴壁情况。7 d时全量换液后,造血细胞成分基本消失,可见贴壁细胞呈细胞集落,其形态、大小和密度各不相同,大部分细胞呈梭形或三角形,少数呈多角形,细胞体积较大,细胞核较大,呈扁圆形。随着不断培养、换液,集落中的细胞逐渐扩增,呈放射状,细胞呈片状汇合。12～14 d后,细胞基本汇合成单层,长满整个培养皿底可进行传代(图 1)。传代后的细胞生长明显加快,4～6 h大部分细胞贴壁,细胞逐渐伸展为梭形、三角形或多角形,表面颗粒少;48 h后,可见细胞开始分裂增殖、聚集。5～6 d后即可见细胞汇合,长满培养皿底。

2.2 细胞周期分析

流式细胞仪测得细胞周期的分布情况见图 2及表 1。细胞周期的分布情况表现为EMPs组S期细胞数目较多,为19.48%,而对照组S期细胞数目为9.89%;对照组G1期细胞数目比例为89.46%,高于EMPs组的77.59%;说明 EMPs作用下的骨髓基质细胞具有较强的增殖能力。

2.3 碱性磷酸酶(ALP)染色

矿化诱导液培养2 d时,对照组和实验组均有少量阳性细胞,无明显区别(图 3);培养5 d时,可见实验组阳性细胞数明显增多,呈条索状、片状,而对照组阳性细胞数较少,稀疏(图 4)。经图像分析系统测定平均灰度值,2 d时,实验组0.18±0.02与对照组0.16±0.01无显著性差异(P>0.05);5 d时,实验组0.25±0.02与对照组0.21±0.03有显著性差异(P<0.05)。

3 讨 论

随着组织工程技术的发展,牙周组织再生的理论不断丰富,利用组织工程技术重建牙周组织成为可能。骨髓基质细胞是牙周组织工程中极有潜力的种子细胞。EMPs可以促进牙周组织再生已得到证实,而关于釉基质蛋白对骨髓基质细胞生物学作用的国内外报道甚少,并多为鼠、兔、猪等动物细胞的研究,因此该组织工程技术距临床应用尚有很大距离。本研究观察釉基质蛋白对人BMSCs生物学特性的影响,试图进一步了解EMPs促进牙周组织再生的机制。

目前常用的骨髓基质细胞的分离培养方法有2 种[6]:全骨髓培养法和密度梯度离心法。全骨髓培养法是一种保留造血干细胞和其他各种细胞混合培养的方法,将骨髓稀释后反复抽吸制成单细胞基液,利用BMSCs贴壁生长的特性将其分离纯化,由于维持了BMSCs原始的生活环境,有利于BMSCs的分化。本实验选择无血液疾病的健康成年人,利用全骨髓培养法成功培养了人骨髓基质细胞,体外培养的成人BMSCs 适应能力较强,接种成活率高,增殖速度较快,这可能是保留的血细胞成分中含有部分生长因子或促进贴壁的物质有关,而且全骨髓培养法维持了BMSCs原始的生活环境,更接近将来体内移植研究的要求。因此,利用BMSCs进行骨组织工程学的研究具有良好的应用前景。

目前评估细胞生长和增殖状况的方法主要有3 种: 3H-TDR 掺入法、MTT 比色法和流式细胞仪细胞周期检测法[7]。MTT 法检测细胞增殖结果显示,EMPs作用于人BMSCs 3 d时,200 μg/ml EMPs组与对照组相比差异即有显著性,说明该浓度有促增殖作用[5]。这与EMPs对兔BMSCs和鼠BMSCs增殖的结果不尽相同,虽然EMPs均能促进鼠[8]、兔BMSCs的增殖,但作用的浓度不同。结果不同的原因可能是由于细胞培养过程中,不同种属细胞分裂增殖活动恢复的快慢不同;其次可能与提取获得的EMPs的纯度和效价不同有关,当然也可能与不同实验室所用培养液的成分不完全相同有关。我们在用MTT法检测细胞增殖的基础上,进一步采用流式细胞仪检测EMPs对人BMSCs细胞周期的影响。结果显示,加入EMPs培养5 d的人BMSCs,G1期DNA含量减少,而S期DNA含量增高,表明EMPs可以增加人骨髓基质细胞DNA含量,具有促进BMSCs早期DNA合成,使细胞从G0/G1期进入S期的作用,从而促进细胞增殖。

碱性磷酸酶(ALP)的表达是成骨细胞分化的主要特征之一。我们观察了EMPs对人BMSCs的ALP活性的影响,发现5 d时,在EMPs条件下,ALP阳性细胞数明显增多,呈条索状、片状。表明BMSCs可在矿化诱导液培养下,向成骨细胞方向分化,并可被EMPs所增强。诱导的细胞能够产生ALP, 也表明BMSCs具有矿化能力,已具备成骨细胞的生物学特性,而且应用矿化诱导液联合EMPs诱导5 d后即明显表达成骨细胞表型,说明联合应用矿化液和EMPs能在较短时间内有效诱导BMSCs分化为成骨细胞。

本实验以成人骨髓为培养材料建立的成人BMSCs的培养方法和成骨诱导途径,为该组织工程技术的临床应用打下了基础,但组织工程技术应用于牙周病学临床还需更多的深入研究。

摘要：目的:观察釉基质蛋白(enamelmatrix proteins,EMPs)对人骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)细胞周期和碱性磷酸酶(ALP)活性的影响。方法:体外培养人骨髓基质细胞,以200μg/ml EMPs作用于细胞为实验组,以不加EMPs为对照组。流式细胞仪检测EMPs对BMSCs细胞周期的影响,碱性磷酸酶试剂盒检测ALP的活性。结果:体外培养的人BMSCs生长良好,200μg/ml浓度的EMPs能提高细胞的ALP活性;影响细胞周期变化,EMPs组S期细胞数目较多,为19.48%,而对照组S期细胞数目为9.89%。结论:釉基质蛋白可促进人骨髓基质细胞的分化,影响细胞周期变化。

关键词：釉基质蛋白,骨髓基质细胞,增殖,矿化,细胞周期

参考文献

[1]Jiang Y,Jahagirdar BN,Reinhardt RL,et al.Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow[J].Nature,2002,418(6893):41-49.

[2]Shi S,Wang CY.Bone marrowstromal stem cells for repai-ring the skeleton[J].Biotechnol Genet Eng Rev,2004,21:133-143.

[3]Sakallioglu U,Acikgoz G,Ayas B,et al.Healing of period-ontol defects treated with enamel matrix proteins and root surface conditioning———An experimental study in dogs[J].Biomaterials,2004,25(10):1831-1840.

[4]宋爱梅,束蓉,谢玉峰,等.釉基质蛋白对猪骨髓基质细胞增殖和根面附着生长的影响[J].实用口腔医学杂志,2006,22(5):679-683.

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细胞培养基质 篇2

目的.研究恒河猴骨髓基质细胞(BMSCs)在体外向神经细胞诱导分化过程中神经递质分泌和神经细胞抗原表型表达情况.方法无菌条件下密度梯度法分离猴BMSCs,在体外应用神经干细胞培养液进行体外培养和诱导分化,分阶段用高效液相色谱法检测培养基中单胺类生物活性物质的含量,免疫细胞化学方法检测神经细胞抗原表型.结果高效液相检测神经干细胞培养基未测到单胺类生物活性物质,而经体外培养增殖10 d、14 d、30 d的细胞培养基可检测到去甲肾上腺素(NE)和多巴胺(DA).Asp方差分析显示:随着BMSCs培养天数的增加,培养基中所含的NE和DA无显著性差异(P>0.05).同期细胞免疫组化检测出酪氨酸羟化酶(TH)、巢蛋白抗体(nestin)、β-微管蛋白(β-tublin)、胶质原性纤维酸性蛋白抗体(GFAP)和神经元特异烯醇化酶(NSE)抗原表达.结论恒河猴BMSCs能在体外增殖,在适宜条件下能分化成神经元样细胞,并合成、分泌NE和DA;部分细胞表达神经干细胞、成熟神经元、胶质细胞和DA能神经元的抗原表型,提示在一定条件下,诱导分化的BMSCs经过神经干细胞阶段可向成熟神经组织细胞分化.

作 者：徐强 徐如祥 姜晓丹 潘力 陈剑荣 蔡颖谦 张世忠 XU Qiang XU Ru-xiang JIANG Xiao-dan PAN Li CHEN Jian-rong CAI Ying-qian ZHANG Shi-zhong 作者单位：徐强,潘力,XU Qiang,PAN Li(200040,上海,复旦大学华山医院神经外科)

徐如祥,姜晓丹,陈剑荣,蔡颖谦,张世忠,XU Ru-xiang,JIANG Xiao-dan,CHEN Jian-rong,CAI Ying-qian,ZHANG Shi-zhong(510282,广州,南方医科大学珠江医院神经外科)

细胞培养基质 篇3

1 材料与方法

1.1 细胞、菌株及载体

细胞株与质粒 MEPE cDNA质粒由美国EMORY大学王亚教授馈赠。293T细胞株购自上海中国科学院细胞研究所。质粒 pLEGFP-N1为BD Biosciences Clontech公司产品,大肠杆菌E.coli DH5α由本室保存。

1.2 主要试剂

PCR产物纯化采用BIO101公司提供的Geneclean II 试剂盒(Cat# 1001-400);质粒提取采用Qiagen公司QIAprep质粒提取试剂盒;限制性内切酶及T4 DNA连接酶购自Takara生物公司。

1.3 PCR扩增、表达质粒的构建及序列测定

由质粒上扩增出MEPE cDNA全长,所用扩增引物为:上游引物:5′-CATATGAAGC TGAATGAAGAT-3′,下游引物:3′-GGATCCTTA CATTTGGGGGAGATG-3′,PCR扩增的目的基因经Nde I与BamH I双酶切后,克隆到经过同样酶切处理的pLEGFP-N1载体上,得到融合表达质粒,转化感受态大肠杆菌DH5α挑取单克隆进行PCR筛选,选1～2个阳性克隆进行测序,鉴定序列及读码框架是否正确。

1.4 稳定转染细胞株构建

在细胞生长状态良好,融合率达90%～95%时进行转染。按照Lipofectamin2000操作手册转染六孔板内细胞。转染48h后消化、重悬细胞,10倍稀释后铺96孔板,每孔分别加入800μg/mL G418完全培养基进行克隆筛选,4周后选择阳性细胞克隆进行鉴定、扩增培养冻存。

1.5 MTT检测增殖能力

将生长密度达80%的293T细胞,常规胰酶消化、计数,以5×103密度的细胞200μL接种于96孔板。目的基因组、空载体组,每组3个复孔。置于37℃、5% CO2培养箱中培养。细胞培养1、3、5及7d后,每孔吸出100μL培养基后每孔再加入10μL MTT(5mg/mL),培养箱中继续孵育。4h后,吸去孔内液体,每孔加入200μL二甲基亚砜溶解沉淀。选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值并记录结果。

1.6 RT-PCR检测

按照北京华大蛋白质研发中心有限公司总RNA提取试剂的说明书,用Trizol提取细胞总RNA。所用的实验器具使用前均需用DEPC水浸泡过夜,去除RNA酶。RT-PCR检测转染细胞中p53基因的表达。p53引物上游:TCAACAAGATGTTTTGCCAACTG,下游:ATGTGCTGTGACTGC-TTGTAGATG。

2 结果

2.1 稳定转染细胞株检测结果

提取稳定转染细胞株总RNA,进行RT-PCR,电泳结果显示两组细胞87bp左右均可见GAPDH扩增条带出现;转染目的基因细胞在110bp处见扩增条带;空载体组在110bp处无扩增条带出现,证明转染成功,细胞可用于后续试验。见图1。

1:DL500DNAmarker;2-3:转染目的基因及空载体细胞中GAPDH表达;4:转染MEPE质粒细胞中MEPE表达;5:转染EGFP细胞中MEPE表达。

2.2 MTT检测细胞增殖结果

MEPE转染细胞和EGFP空载体转染组细胞铺96孔板,并分别于1d、3d、5d、7d用MTT法测细胞增殖。从统计结果可知转染MEPE的293T细胞其增殖指数是转染EGFP空载体组细胞增殖指数的1.30倍。见表1,图2。

2.3 RT-PCR检测增殖与迁移相关因子表达情况

p53基因高表达细胞可表现出黏附、增殖、迁移侵袭等方面的生物学行为,实验通过实时荧光定量PCR,检测转染MEPE蛋白与转染空载体细胞中三种基因的表达,从PCR产物电泳图及实时荧光扩增曲线两方面比较三种基因在两种细胞中的不同表达。

1.DL500DNAmarker;2.转染MEPE细胞中p53表达;3.转染空载体细胞中p53表达;4.DL500DNAmarker;5.转染MEPE细胞中GAPDH表达;6.转染空载体细胞中GAPDH表达。

3 讨论

MEPE是小型N端连接整合素家族蛋白成员,近几年来,越来越多的报道显示SIBLING家族成员与肿瘤发展的各个阶段包括增殖、侵袭、转移、血管生成相关。Lee JL等[4]人发现骨桥蛋白(OPN)与细胞表面受体蛋白CD44相结合,可以使结肠癌HT29细胞加速增殖并提高转移潜能。Sharp JA等[5]人发现骨唾液蛋白(BSP)可以在体外促进乳腺癌MDA-MB231细胞增殖,转染IBSP基因的乳腺癌细胞注射裸鼠后肿瘤形成速度加快。Khodavirdi AC等[6]人在两株前列腺癌细胞中提高OPN蛋白的表达水平,发现OPN有增加细胞侵袭的能力,在小鼠成瘤模型中观察到高表达OPN的前列腺癌细胞侵入血管的能力增强。对大量的实验结果分析,我们可以发现SIBLING蛋白家族成员在许多肿瘤细胞中高表达,作为可溶性分泌性蛋白因子主要分布在细胞基质中,通过与细胞表面受体蛋白CD44、整合素受体、金属蛋白酶相互作用参与调节细胞信号传导,在肿瘤细胞的黏附性、趋化性、抗凋亡、侵袭、迁移、不依赖支持物生长等恶性生物学特性中具有重要作用,并与肿瘤转移以及预后不良相关。

在SBLING家族中对于MEPE在肿瘤发生发展中所起到的作用研究较少,与其他家族成员在结构上高度同源的MEPE是否也对肿瘤细胞的增殖侵袭有影响,需要进一步实验验证。近年来研究表明,许多肿瘤在发展过程中伴有MEPE蛋白的高表达,而且发现这些高表达MEPE蛋白的肿瘤同时也表现出高的转移倾向,且其抗电离辐射等抵抗DNA损伤诱导能力与MEPE蛋白的表达量呈正相关。本实验结果证明提高MEPE蛋白表达水平可影响细胞增殖等生物学特性,并进一步证实其作用机制是通过P53蛋白信号通路实现的。因此临床检测MEPE表达可对恶性肿瘤的发生、转移做出预测,为恶性肿瘤基因治疗奠定基础。而且检测MEPE的表达水平还可监测肿瘤治疗的预后,为肿瘤基因基因治疗提供新的靶点。虽然目前基因治疗尚未临床普及,但其具有良好的潜在应用前景,在人类攻克癌症,提高肿瘤患者生存率及生活质量上有望发挥重要作用。

参考文献

[1]Rowe PS,De Zoysa PA, Dong R,et al.MEPE, a new gene expressed in bone marrow and tumors causing osteomalacia[J].Genomics,2000,67(1):54-68

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[3]Fisher LW, Fedarko NS. Six genes expressed in bones and teeth encode the current members of the SIBLING family of proteins[J].Connect Tissue Res, 2009, 44(Suppl 1):33-40

[4]Lee JL. Osteopontin promotes integrin activation through outside-in and inside-out mechanisms:OPN-CD44V interaction enhances survival in gastrointestinal cancer cells[J].Cancer Res,2007,67:2089-2097

[5]Zhiyong Mi, Hongtao Guo and Paul C Kuo. Identification of osteopontin-dependent signaling pathways in a mouse model of human breast cancer[J].BMC Research Notes,2009,2:119-127

细胞培养基质 篇4

IGF-1基因转染对骨髓基质细胞分泌IGF-1、ON和Ⅰ型胶原的影响

目的:观察胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因转染的骨髓基质细胞(MSCs)合成IGF-1、骨粘连素(osteone-ctin,ON)和Ⅰ型胶原(Collagen-Ⅰ)的变化,进一步了解基因转染骨髓基质细胞的生物学特性.方法:将含有IGF-1基因的真核质粒转染入大鼠骨髓基质细胞(MSCs)中,以正常培养的.MSCs为对照组,分别于1、3、5、7 d对MSCs进行IGF-1、ON和Collagen-Ⅰ免疫组化观察.通过图像分析检测IGF-1基因转染对MSCs合成IGF-1、ON和Collagen-Ⅰ的影响.结果:IGF-1基因转染后可促进MSCs合成IGF-1、ON和Collagen-Ⅰ(p＜0.05),第3 d合成IGF-1、ON和Collage-Ⅰ作用最明显.结论:IGF-1基因转染的MSCs较未转染细胞合成IGF-1、ON和Collagen-Ⅰ显著增加.

作 者：朱国强 吴织芬 王勤涛 李袁飞 ZHU Guo-qiang WU Zhi-fen WANG Qin-tao LI Yuan-fei  作者单位：朱国强,李袁飞,ZHU Guo-qiang,LI Yuan-fei(解放军264医院,山西,太原,030001)

吴织芬,王勤涛,WU Zhi-fen,WANG Qin-tao(第四军医大学口腔医院)

刊 名：临床口腔医学杂志  ISTIC英文刊名：JOURNAL OF CLINICAL STOMATOLOGY 年，卷(期)：2007 23(10) 分类号：Q813 关键词：基因转染   骨髓基质细胞   胰岛素样生长因子-1   骨粘连素   Ⅰ型胶原