羊水细胞培养

羊水细胞培养（精选5篇）

羊水细胞培养 篇1

产前诊断又称为宫内诊断, 根据取材和检查手段可以分为创伤性方法和非创伤性方法两种[1], 创伤性方法包括羊膜腔穿刺、脐血取样等, 非创伤性方法包括B超检查、胎儿细胞检测等。羊水细胞培养是目前临床上常用的创伤性方法之一, 其被广泛用于染色体病和胎儿畸形的诊断。羊水细胞培养的穿刺时间为妊娠12~30周;在进行羊水细胞培养的孕妇中, 高龄孕妇约占50%~60%[2,3]。如不进行产前诊断, 一旦患儿出生, 对家庭来说无论在精神上还是经济上都是一个巨大的负担。因此, 对高危孕妇进行羊水细胞培养势在必行。为了探讨羊水细胞培养在产前诊断中的价值, 对2010年5月—2015年10月在医院进行羊水细胞培养的216例孕妇的资料进行分析, 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

整群选取在医院住院部进行产前诊断的216例高危孕妇, 年龄23~43岁, 平均年龄 (31.2±2.3) 岁;孕周12~25周, 平均孕周 (18.5±2.2) 周;所有孕妇均为单胎。所有患者术前均给予血常规、凝血等检查, 在B超引导下行羊膜腔穿刺手术。所有患者均有不良生育史、近亲结婚、高龄产妇等指征, 所有各种资料均经患者的同意, 并通过伦理委员会的批准。

1.2 方法

所有孕妇常规无菌消毒, 在B超引导下羊膜腔穿刺, 抽取2 m L羊水并离心5 min, 后分装到3个培养皿中, 在37℃的5%二氧化碳培养箱中静置培养5~7 d, 然后经过收获、低渗、制片10~15 d后, 观察细胞生长情况, 直到出现“鱼眼样”透明细胞, 对其进行预固定和固定后, 滴片, 常规分带。

2 结果

2.1 穿刺成功率

216例孕妇中有214例一次穿刺成功, 有2例为2次穿刺成功, 穿刺成功率为99.1%。见表1。

2.2 染色体异常检出率

216例孕妇经过羊水细胞培养后, 211例为正常核型, 占97.7%, 5例为异常核型, 占2.3%, 其中4例为21三体征, 细胞核型为 (47, XX或XY, +21) , 1例双重嵌合体, 细胞核型为 (45, X, +21/46, XY) 。

3 讨论

羊水是维持胎儿生命所不可缺少的重要成分, 羊水的颜色随孕周增加而变化, 其多少和质量对孕妇和胎儿的健康和安全有着至关重要的作用。羊水细胞培养是产前诊断的一项重要技术方法, 最佳培养孕周为16周左右[4], 这时羊水增长速度较快, 细胞较多, 细胞易于培养, 对胎儿的损伤最小。羊水细胞是从胎儿的皮肤、呼吸道和消化道脱落下来的细胞, 死细胞约占95%, 需要在无菌环境、适当温度和酸碱度等条件下经过细胞培养, 并维持其结构和功能, 使活细胞数目增多进而进行染色体核型分析。研究显示[5], 孕妇穿刺的妊娠结局、分娩方式、胎儿的出生体重等与未穿刺无明显差异。因此, 对高危妊娠孕妇进行羊水细胞培养对胎儿染色体疾病的发现有重要意义。

染色体病是由于染色体的结构和数目异常导致的, 研究显示[6], 我国约有5 100万残疾人, 2 200多万遗传病患者, 约3 000万患者属于先天缺陷。进行羊膜穿刺时要避开胎儿, 抽取羊水时速度要缓慢, 避免宫压骤降引起子宫收缩, 穿刺结束后轻按穿刺点3 min左右, 216例孕妇中, 无一例出现并发症, 穿刺成功率为99.1%。从进行羊水细胞培养的216例孕妇中发现, 211例为正常核型, 5例为异常核型, 异常核型中以21三体征为主, 占80%, 与石冲等[7]报道的唐山地区1 108例孕妇羊水穿刺产前诊断结果分析的结果染色体异常检出率96.57%相似, 可见21三体征是临床上最常见的染色体畸形疾病[8]。21三体征是由法国细胞遗传学家Lcjeune研究发现的, 以智力低下, 肱骨或股骨短小, 鼻骨短小等为临床特征。可见, 羊水细胞培养可以发现染色体有无增多、缺乏、易位、倒置等数量和结构的异常, 可以了解胎儿的染色体核型, 减少先天畸形儿的出生, 对提高人口素质起到了积极作用。

综上所述, 对孕妇进行羊水细胞培养在产前诊断中意义重大, 可以预防先天性缺陷患儿的发生, 提高了新生儿质量, 具有科学、安全、结果准确等特点, 值得在临床上推广应用。

摘要：目的探讨羊水细胞培养在产前诊断中的应用价值。方法 整群选取2010年5月—2015年10月在医院进行产前诊断的216例高危孕妇, 给予羊膜穿刺和羊水细胞培养后分析染色体核型。结果 所有孕妇穿刺成功率为99.1%, 经过羊水细胞培养后, 211例为正常核型, 占97.7%, 5例为异常核型, 占2.3%。结论对孕妇进行羊水细胞培养在产前诊断中意义重大, 可以预防先天性缺陷患儿的发生, 提高新生儿质量, 值得应用。

关键词：羊水细胞培养,产前诊断,染色体

参考文献

[1]South ST.ACMG Standards and Guidelines for constitutional cytogenomic microarray a-nalysis, including postnatal and prenatal applications:revi-sion 2013[J].Genet Med, 2013, 15 (11) :901-909.

[2]许静, 何冬梅, 黄栋莉, 等.95例中期唐氏筛查高风险的分析与临床策略[J].医学信息, 2014 (27) :65-66.

[3]Breman A.Prenatal chromo-somal microarray analysis in a diagnostic laboratory;ex-perience with>1 000 cases and review of the literature[J].Prenat Diagn, 2012, 32 (4) :351-361.

[4]王淑惠, 蓝信强.产前诊断染色体异常二例[J].中华医学遗传学杂志, 2014, 31 (2) :159-160.

[5]李博杰, 聂茹, 佟桂芬.孕中期唐氏筛查与产前诊断的临床应用价值[J].中国妇幼保健, 2015 (9) :3-4.

[6]吴坚柱, 周祎, 谢英俊, 等.产前诊断中绒毛嵌合体的研究[J].中华医学遗传学杂志, 2015, 32 (5) :8.

[7]石冲, 张国彬, 韩宝生.唐山地区1108例孕妇羊水穿刺产前诊断结果分析[J].重庆医学, 2014, 43 (30) :125-126.

[8]张欣.羊水细胞培养在产前诊断中的应用价值[J].医学理论与实践, 2013, 26 (22) :164-165.

羊水细胞培养 篇2

一、血清灭活问题。

1、问：加到培养基中的血清必须灭活吗？ 答：不是必须的，看做什么实验了。

2、问：四季青胎牛血清灭活是56℃30分钟吗？

答：如果用于培养大多数的肿瘤细胞，血清一般是不需要灭活的，这样可以有效保存血清中的生长因子。但是如果用于培养一些表面具有补体受体的细胞，如内皮细胞，血清是需要灭活，一般是56℃，30min。

3、问：我要做滋养细胞培养，胎牛血清要灭活吗？

答：进口的一般都已灭活，国产的不一定，最好还是灭活一下再用较安全。

4、问：我用病毒上清转染细胞，培养用的血清需要灭活吗？因为血清中可能有些补体和抗体，是不是会影响转染？我想未灭活的血清中含些抗体补体可能会和病毒相结合，影响转染，正确吗？细胞是单核细胞白血病细胞，病毒是病毒包装细胞PT67收集的病毒上清。为什么要用无血清培养基加病毒孵育几小时，目的是什么？

答：血清一定要灭活，可以先用无血清培养基加病毒孵育几小时以后再加血清。避免杂蛋白对病毒和宿主结合过程的干扰，一般是2-6小时，根据细胞的状态决定。血清不一定需要灭活，灭活的目的是将血清中的补体灭活！这要根据实际情况而定，如果没有把握那就灭活吧，也不麻烦56度半个小时。

5、问：(1)我买的是杭州四季青的新生牛血清，要灭活吗？有些说法是需要，有些说直接解冻后就可以加入到培养基中；我配制胰蛋白酶液，用的是D-PBS，有关系吗？

答：关于血清的热灭活，是很多人感兴趣也存在一定争议的话题。大多数实验室将血清的热灭活还是作为常规来执行，因为有两个作用，第一是灭活补体，第二是灭活血清中可能存在的支原体。但是实验者并没有考虑热处理对血清中的生长因子、氨基酸等成分带来的负面影响。

我在实验室处理血清的时候，有一次水浴箱在灭活过程中出现故障，温度升高到80℃，血清变成了凝胶状，我重新处理了另外一份血清，将两份血清对比，发现高温直接影响到血清所含的抗体蛋白。在56℃下灭活半小时以上，肯定也会对里面的蛋白起到破坏作用。下次有机会我做个延长灭活时间的实验试试，看看到底有多大的影响。热灭活之后，血清放在四度冰箱久了，就会有沉淀产生，这常常会被认为是微生物污染或者是黑胶虫污染。为了验证到底有没有污染，常常又会把血清放置37℃温育，但是血清中的蛋白会进一步析出，最后还是要做镜检，无菌培养试验，和革兰氏染色试验，非常麻烦。

我看过一份资料，里面提到70%的实验者认为灭活是理所当然的。常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间，而时间则从15分钟到60分钟不等。其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。随着血清采集、处理、加工工艺的提高，许多早先认为是热灭活的原因已经不再成立，只有少数对血清进行热灭活的研究者在实验中证实了这一步骤的有效性和必要性。有人比较过11个不同细胞株，发现其中热灭活对6 个细胞株(HBAE，MDBK，Vero，成纤维细胞，MRC-5)的生长带来负面影响，三个细胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受热灭活的影响，而只有两个细胞株(Balb/3T3，Sp2/0Ag14 hybrid)，在热灭活之后，细胞生长有轻微的改善。所以，在正常的操作下，热灭活通常对细胞的生长没有明显的促进作用。

你可以摸索一下，血清从-20℃冰箱拿出来之后在常温解冻，然后混匀分装成两份，一份灭活，一份不灭活，比较这两种血清对细胞是否有影响。然后再确定是灭活还是不灭活。这个过程最多也就一个星期。同时你还要考虑血清灭活与否对你后续的实验有没有影响。

问：(2)分装后的血清从-20℃取出放4℃让其液化，却见血清比较混浊，有沉淀产生，这属正常吗？ 答：正常。

二、血清灭活时温度问题。

1、问：因为实验室水浴锅失控，血清灭活时，温度到了61.7℃，这血清还能用吗？

答：多长时间啊？短时间应该可以吧，我有一次加热了一个多小时，还照样用。

2、问：我灭活胎牛血清时，用的电磁炉，定在了70℃，本来说调温度到56℃再放血清的，后来忘了，就把血清放进去了，所以灭活的温度肯定超过56℃了，不知道这样对血清有没有影响？

答：常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间，而时间则从15分钟到60分钟不等，其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。看看你养的细胞是什么，一般的话估计问题不大，要是很珍贵的细胞还是慎重一点啊。热灭活目的是为了去除血清中补体等对热敏感的物质，在对补体灭活以外，热处理同时也对血清中可能存在的支原体具有灭活作用。现在好像不主张热灭活，热灭活经常给血清产品带来负面影响，对血清的加热经常导致血清中沉淀的产生，此外，有研究结果证实热灭活步骤减弱了胎牛血清和小牛血清对细胞的促粘附作用。

三、血清的制备方法问题。

1、问：我的实验需要自己制备一些血清用于培养细胞，有没有人知道用于培养细胞的血清需要怎样的制备过程？

答：自己制备血清当心污染啊。如果无菌条件好的话，用静置析出方法就行。

2、问：一般我们用得胎牛血清用前还要灭活，我想用大鼠的血，不知道要不要灭活？

答：你直接把采来的血液在离心管里4℃过夜，离心，取上清，在无菌过滤，也可灭活，然后分装冻存，用时再配。

3、问：如果灭活会不会对血清中的一些因子有损伤？

答：加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。灭活一般不会对血清中的一些因子损伤的。

四、血清的保存问题。

1、问：2006年6月到期的GIBCO胎牛血清到2007年5月还能用吗？ 答：只有试试了，如果一直在-20℃冻着来者，应该还可以，先少用点看看。养细胞系应该没问题，原代不行。

2、问：请问我自然溶化好的胎牛血清和1640培养基今天用不上，明天用，我不想放到冰箱里，放在室温下一晚行吗？100毫升培养瓶加多少培养基呢？

答：可以放4℃。4-5ml。

3、问：4℃冰箱内保存3个月的胎牛血清，能否继续使用？相关细胞和其它试剂的代价比较高，不敢轻易尝试。

答：需要长期保存的胎牛血清必须要保存在-20至-70℃的低温冰箱中，4℃冰箱中保存时间不要超过1个月。

五、FBS可否代替人AB型血清？

问：我现在在做人的外周血b淋巴细胞的培养，文献上要求用人的AB型血清，但是我觉得很多代理商都没有。我想FBS代替，但不知道可否，我先是担心免疫排斥之类，但是我查了些资料后，应该不会(我觉得)。但是我又不能够TRY。因为细胞因子确实太贵了，所以咨询一下。谢谢！答：你最好照文献的做。除非你系列实验证明你用代用品的结果与文献的相同(你还是要用到文献的试剂)。细胞培养的影响因素很多，特别是培养基的成分。

六、血清和培养基的种类及品牌问题。

1、问：细胞培养的胎牛血清用哪个公司的产品比较好呢？周围有人用PAA或Hyclone的，这两种跟Gibco或sigma出品的差别大吗？ 答：如果是长得非常快得细胞如pa317，293，c6等恶性肿瘤细胞，一般得国产血清就可以，如果是原代培养的细胞，最好应用胎牛血清或类标准胎牛血清，Hyclone公司血清的质量不如GIBCO(同类血清)。国产的杭州四季青和甘肃民海(中美和资)不错。有些细胞(如：sf9，293还有其他一些元代细胞)，用Gibco的比其他两种好很多，会大大加速试验进度。对于其他一些细胞(如：vero，MDCK，pk)四季青，Hyclone的小牛血清足矣！另外，Gibco的还要看产地。

2、问：最近要订一瓶胎牛血清，实验室之前都在用小牛血清，没有买过胎牛血清。请问哪个公司的好一些？问过试剂公司，有两种：一种是PAA的(分普通级和优级)，一种是Hyclone的(只有普通级，而且是新西兰产的)。试剂公司推荐使用PAA优级的，但看好多文献都用Hyclone的，公司说是因为现在Hyclone的都不是美国进口的了。请问用的哪种胎牛血清比较好？

答：民海的效果还不错，要是不放心国产的，那就买进口的。进口的好多公司都有，新西兰产的效果一般。Hyclone和Gibco的都还可以。民海的似乎比四季青的要好些。复蒙的感觉也不错。

3、问：四季青“无噬菌体、低内毒素胎牛血清”与“无支原体胎牛血清”的区别？培养肿瘤传代细胞用哪一个比较好些？ 答：用无支原体胎牛血清就可以啦。

4、问：SKBR-3细胞培养用哪种型号的1640培养基及胎牛血清？ 答：我一直用GIBCO的1640，你可以买含HEPES的1*10L的包装，胎牛血清也是用的GIBCO，10%就行。请查阅：

七、培养基血清浓度问题。

问：在1640里加血清时加多了，90ml里加了20ml血清，约为18%，以前都是加10ml的，查了网上多建议用10%-15%，有关系吗？

答：我认为一般来说血清浓度的较大波动对细胞的状态影响较大，建议再加90ml1640调成10%。血清浓度大当然细胞状态感觉要好，但是高浓度的血清可能改变细胞的基因表达谱，影响后续实验的结果。10%的浓度培养鼻烟癌细胞很好。

八、心肌细胞原代培养时血清的使用问题。

1、问：在进行心肌细胞原代培养时，需要用含血清的培养基中止胰酶的消化作用，我现在使用的是含血清10%的培养液，但近日看北医一个细胞培养的课件发现，有用1%血清培养液进行中止消化的，想问一下，1%的是否可以，效果是否有保证？这样确实能节省不少血清的。答：关于心肌细胞元代培养的FBS问题：

(1)1%的血清完全培养基可不可以，得看你胰酶的用量。但是在心肌细胞元代培养就不行。10%的FBS完全培养基效果都不太好，开始心肌细胞元代培养需要高浓度的FBS，20%左右，但这就有出现另一个问题，在FBS完全培养基中，成纤维细胞呈优势细胞，须得在培养基加入适量的BrdU以抑制其生长，纯化心肌细胞。

(2)FBS的作用不仅仅是拿来中和胰酶，只是FBS中的一些蛋白质如α-巨球蛋白等有抑制胰酶活性作用。

(3)元代心肌细胞培养的FBS使用，有讲究：刚开始使用20%左右的高浓度的FBS，后逐渐递减为无血清的DMEM/F-12培养基培养。

2、问：我胰酶的用量是0.08%，并混和了0.08%的胶原酶。FBS要高浓度递减是否是说的在细胞培养中啊，难道在消化时终止也需要如此高的浓度吗，还有，我的BRDU只用到48小时就不用了，因为担心其损伤太大，可以持续用多久呢？

答：我用10%FBS终止的，然后差速1h，然后还是用10%FBS的HG-dmem养的，没有用brdu，心肌细胞还是比较多和稳定的，我第3天就可以用，第2天晚上看就会有搏动。

九、牛血清污染噬菌体的问题。

1、问：有谁知道小牛血清制造过程中怎样能够避免噬菌体的污染，以及对已污染噬菌体的牛血清怎样能够除去噬菌体？

2、问：我也想知道，我用的血清中大部分都有噬菌体，它对细胞培养到底有什么影响？ 暂无回答。

十、问：MTT加药的时候加不加血清？加药时要用无血清的培养基吗？ 答：我的药就是用含血清的培养基稀释的，不含血清的培养基对细胞有毒性或抑制作用，无形中对细胞造了一个serum-free的模型，细胞在提内本来就是有血清供应，如果该药物都不能对抗，那该药物就没有什么临床价值了，这是我的理解。

十一、AB血清的制备问题。

问：本人想从人的外周血中分离AB血清的，用于B淋巴细胞的培养。谢谢大家给点建议。人的血，来之不易啊。答：是AB血型人的血清吗？这种血清即没有抗A型抗原抗体，也没有抗B型抗原抗体。分离血清时将采集的血液注入试管中，待血液凝固后离心分离血清。可将采集的血液放在37℃水浴箱中促进血液凝固，减少凝固时间。离心可在2500～3000rpm，10min，足可以分离血清。分离后将血清吸出保存即可。分离血清的量可按采集血液的50%左右计算，因为红细胞占总血液的50%左右。当然整个过程要注意无菌操作。

十二、PC12细胞培养所用血清问题。

问：我正准备购买上海细胞所的未分化的PC12细胞，需要灭活的马血清，可现在买血清很困难，好像是海关有封锁，代理商这么说的，我原定购买的Gibco的horse surum，现在无法买到了，好容易找到一个目前可以进血清的公司Hyclone，有一种Donor Equine serum是马血清吗？

答：Hyclone的Donor Equine serum可以用，我以前用的就是这个。我当时是在鼎国(重庆办事处)买的，100ml大概140元，具体不记得了。当时是看它比别的进口的马血清便宜。另外：我买了以后灭活的。

十三、血清或培养基产生了颜色或沉淀的问题：

1、问：我用的是四季青的胎牛血清，56℃30分钟灭活后出现了白色少量絮状沉淀，是不是污染？还能不能再用？血清的生产日期是2006年7月(现在是2007年6月11日)。

答：应该问题不大。你可以取少量血清放入培养皿中，37℃过夜培养看看就知道是否污染了。血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血渭解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。

2、问：我用MTT法测细胞的增殖，用DMSO裂解细胞，发现把DMSO加入到孔中就会形成乳白色(用的含胎牛血清的1640培养基，由于没有离板子的离心机，所以没有去除培养基直接加的DMSO)。以前用含小牛血清的培养基没有看到有这种情况。该怎么解决？

答：为什么要用离心机离心呢？难倒你养的是悬浮细胞吗？如果是贴壁细胞的话直接将MTT倒掉，再加DMSO即可，我们就是这么做的，效果很好！并且测细胞的增殖的话如果不去掉MTT就加DMSO的话误差应该很大！有时不一定就是血清的原因，可能跟你的MTT放置的时间或以及其他成分有关！

3、问：(1)GIBCO胎牛血清500ml，今天解冻后没有混匀直接分装，结果使得前面的几管是清亮的，后面就带有棕色的，不知有没有影响？估计有什么影响？前面的成分好还是棕色的成分好啊？

答：肯定有。最好还是重新混合重新分装，我觉得有效成分会集中在棕颜色部分。

问：(2)为什么会出现棕色呢？

答：血清中的棕色多一些可能是因为红蛋白的含量高些的缘故吧。问：(3)血清灭活之后可以存放吗？我的是前天灭活的，但是没有加到培养基里，而是放在冰箱里，那下次可以直接用吗？还是再次灭活啊？ 答：当然可以，如果多的话，分装后最好放在－20℃，下次用时再解冻，也不用再灭活。最好用一管拿一管，少许血清可以放在4℃。分装时还要注意不要装得太满，以免溢出污染。

十四、问：悬浮细胞培养时能否加血清？如果加了会有什么结果？为什么悬浮细胞培养时就不能加血清？

答：血清是细胞培养基中重要的培养成份之一，对细胞生长有广泛影响。在细胞培养时，我们通常会加入10%的血清。血清的质量对细胞培养的成功至关重要。一般说来，牛血清包括以下成分：生长因子(如激素，白细胞介素等)，他们可以促进细胞生长；贴附因子，他们可以促进细胞的贴壁，往往只有细胞贴壁才能增值(悬浮培养的细胞除外)；蛋白质(如血清白蛋白，球蛋白等)，既可以作为营养物质，又可以中止胰酶的作用；还有很多成分不明的物质。血清还可以起到解毒作用，如脂肪酸、重金属和某些蛋白酶的毒性。血清还可以是细胞免受机械损伤。因此，无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，血清是必不可少的。除非因实验要求无血清培养时，例如：为使细胞同步化时，我们会采用无血清培养的。单纯的说悬浮细胞培养不能加血清就没有太多的道理了。

十五、Gibico的胎牛血清内是否含糖？

问：我想做糖诱导细胞凋亡的试验。细胞培养液里加入了20%的胎牛血清。因此胎牛血清里是否含有糖对我实验的培养液糖终浓度影响比较大。今天打电话问GIBCO公司的技术顾问，回答我糖浓度少于5μg/ml，因此基本可认为是不含糖。但我今天把胎牛血清送到我们医院检液科，结果却是：6.2mmmol/l(葡萄糖氧化酶法)。难道是检测人血清的血糖浓度的方法不能用于检查牛血清吗？(另起茶水验尿事件？)检验科没有给我回答。答：应该是不含糖的。请参照gibco的网站：http:///content/sfs/brochures/B_08A00_0619_FBS_bro.pdf。第五页我做了个记号。直接点击链接就可以看到它的说明书页面。我想我们肯定要以公司的说明书为准。至于为什么检验科测起来有误差，我想可能是样本不一样，需要用标志品矫正有关。具体需要检验科的战友解释了。

十六、关于中和消化液需要的血清量。

问：用胰蛋白酶消化细胞后，需要用血清中和。具体这种中和作用所要求的胰蛋白酶和血清之间的比例是多少？

答：做了很久的试验，真的没有想过胰酶和血清的对应关系。不过细想下来，这个应该也没有固定的比值。血清的品种都是不同的，成分必然有差异，如何能确定其与胰酶的比值关系？我们消化细胞的时候，如果是传代，细胞变形后，吸出胰酶直接加入适量的hanks液或者全培，这个量看自己的喜好和吹打细胞方便而定。一般都可以中止消化的。不会存在继续消化的事情。如果是从组织上消化细胞做原代培养，我一般都使用全培进行中止，而且加的很多，0.25%的胰酶，用10%血清，按1:2的比例应该是足够的。当然全培是2，一般我养细胞的时候，会用国产的比较便宜的血清配制全培，专门用于中止消化，这样有几个好处：一是中止消化的效果应该好于hanks液吧，再是也有利于维持细胞活性。而且这部分液体会被离心去掉，血清便宜，离心掉了不会心疼。而养细胞的时候用好血清。个人观点，仅供参考。

十七、血清中的悬浮物问题。

1、问：发现培养的细胞瓶中背景有许多的小黑点，培养液中也有一些漂浮的物。看了之前的帖以为是胶原虫。本打算换液，换液前特意看了下前些天配的培养液，肉眼发现培养液中有悬浮的颗粒状物质(不多)，于是放在镜下观察，新鲜培养液中有一些悬浮的小颗粒，不多。(培养液是R1640+20%牛血清+1%双抗)于是又将分装在4℃保存的小牛血清拿出观察，肉眼可见5、6个白色小小球状的物质，在血清瓶稍靠下的部位悬浮。镜下观察，也有少量的不知什么物质的东西漂浮。小牛血清是Hyclone新西兰的，标签上写已经经过2μm滤膜过滤处理。根据上述培养液的情况，是否说明培养液已被污染？如果是正常的血清是不是在镜下不应该看到杂物，哪怕是极少量的？根据上述血清的描述，是不是说明血清也存在问题，还能用吗？补充：细胞培养以来生长状态就不好。买血清的时候厂家说明不用灭活，所以未灭活。

答：(1)血清应该-20℃保存，解冻血清时，请按照的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大实验显示非常容易产生沉淀物。(2)血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白在血清解冻后，也会存在于血清中，亦可造成沉淀物。(3)若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清，再放回冷冻，若存放于4℃时，请勿超过一个月，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白，可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。

(4)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

(5)排出了血清的原因，在考虑实验用品和无菌操作的问题。

(6)细菌病毒、衣原体、黑胶虫污染也很常见，如果细胞死的太多，影响较大建议更换培养液。

2、问：今天在配培养液时，发现血清里面有小碎片样的漂浮物，血清仍然清亮，不浑浊。不知道是什么，问了实验室的学长，说仍然可以用，但还是不放心，没有用血清。求助园子的各位达人，这可能是血清出了什么问题？我的血清用了一个月不到，四季青的。

答：可能的原因：(1)培养液配置时Votex不够，当时是清亮的，但过一段时间会析出来；(2)真菌污染。

十八、污染和过滤的问题。

1、问：怀疑血清染菌，想用滤膜过滤一下，可否自己用0.22μm滤膜过滤？对血清性质有多大影响？有做过的么？

答：可以过滤的，血清当出厂时都是0.22μm或0.1μm过滤除菌。想证明有没有染菌不用过滤这么麻烦，只要放置于37℃过夜就可以了，如果有微生物污染会变浑浊的，如果还是澄清的就说明没有问题的。实验室中血清很难直接过滤，一般要加到培养基中再过滤。我们实验室制备培养基时，都使用滤膜过滤，一般而言如果制备1-2瓶培养基，一个滤膜及一支30ml注射器可以过滤50ml小牛血清。如果大量制备培养基也可以将血清加到培养基中，使用0.22微米的大滤膜一起过滤。

2、问：我怀疑我用的完全1640培养液被污染了，准备重新过滤消毒，过滤后是否需要补充胎牛血清？如需又如何补充？

答：完全1640培养液被污染了，如果是支原体的话，过滤没有作用，支原体可以通过滤膜。我们用1640液，都是配液后保留500ml，然后其他的分装100-200ml，现用现配因为血清比1640要贵，如果你想过滤的话，建议你加原比例血清，因为血清不会很容易通过滤膜。最主要的还是找到可能污染的原因。

3、问：加好了血清双抗的培养基由于污染了再过滤后还能用吗？ 答：建议不要用了。在加了双抗的情况下已经污染，那么细菌污染的可能性会较小了。一般的过滤除不能去除病毒或者部分真菌的污染的。

4、问：我准备把使用的完全1640培养液重新过滤一遍，不知道培养液中的血清成分是否能通过滤膜，过滤后是否还需要补充胎牛血清？如需又如何补充？

答：可以透过，但是随着液体量的增多会很慢，如果不加压会比较麻烦，还有最好用低蛋白吸附的，不然损失是比较大的。

十九、更换无血清培养基后细胞大量死亡的问题。

问：我使用Lipofectamine2000转染成骨细胞，在转染前要换上无血清的培养基。本来条件模的好好的，转染效率也可以接受。但是寒假一回来就发生了怪事：细胞在有血清的培养基中长的好好的，一换无血清的培养基就死亡。大概4个小时就能看到较多的细胞飘起来。但是原来我换无血清培养基，就算放那里10个小时都是没问题的啊。已经换了不同批次的培养基，甚至吸管什么的都换过了，但是就是不行，是怎么回事？

答：(1)两周后的培养液应补加谷氨酰胺，或者重新配液，转染时应不含抗生素。

(2)确认操作方法和环境，建议检查一下。

(3)Lipofectamine2000，脂质体的毒性很大，如果有质粒参与对细胞损伤更大，如果Lipofectamine2000在常温放置过，对细胞更大，假期冰箱是否断过电。

(4)培养箱的温度、c02浓度，湿度。

二十、完全培养液的相关定义。

问：“完全培养液一词”，是指加了血清的培养液吗？我在做含药血清的实验，涉及到血清添加量的问题。所以想弄明白文中所指的“完全培养液”是否是含药血清。

答：原液是指配置后过滤除菌。不完全培养液是指不含有血清的原液，其他成分已补充。完全培养液是指不完全培养液加入血清后称完全培养液。二

十一、血清相关知识总结。使用胎牛血清的注意事项：

血清是细胞培养中最重要的元素之一。下面是实验室里常会遇到的问题，仅供大家参考：

1、保存血清最好的方法： 建议血清应保存在-5℃ 至-2O ℃。然而，若存放于 4 ℃ 时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

2、如何解冻血清才不会使产品质量受损：

建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃ 冰箱使之溶解，然后在室温下使之全溶。但必须注意的是，溶解过程中必须规则地摇晃均匀。

3、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理：

血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血渭解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。

若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。

4、何谓热灭活：

一般是以 56℃，30 分钟来处理已解冻的血清，因为此加热步骤，可以使补体去活化，而补体所参与的反应有 : 溶细胞活性，平滑肌的收缩，肥大细胞和血小板组胺的释放，增强吞噬作用，淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活。

5、关于胎牛血清的灭活： 有必要做热灭活吗？ 实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒立显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在 37℃ 环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

因此我们建议您，若非必须，您可以不需要做热处理这一步。如此一来，不但节省您宝贵的时间，更确保您血清的质量！

6、血清相关知识： 如何避免沉淀物的产生？

我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作 :(1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-2O℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。(2)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

(3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。(4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。

羊水细胞培养 篇3

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2010年1月-2013年6月间收治的35例行产前诊断的孕妇, 所有孕妇均有产前诊断指征, 经遗传咨询, 签署知情同意书。孕妇年龄22~35岁, 平均年龄 (27.4±1.3) 岁, 孕周16~26周, 平均 (20.8±0.9) 周。

1.2 方法

B超引导下确定胎盘位置及羊水最佳穿刺点, 常规无菌消毒, 使用9号穿刺针经腹壁行羊膜腔穿刺术, 先抽取5ml羊水, 观察羊水颜色、浑浊度, 再抽取20~30ml, 密封注射器, 无菌条件下立即送检。将羊水注入无菌50ml离心管, 常温下以1 500r/min离心10min。将细胞沉渣接种入培养基, 羊水细胞全培养基由杭州贝因美公司提供, 置5%CO2、37℃恒温箱中进行密闭式培养6~7d。培养6~7d后于显微镜下观察细胞生长情况, 有若干梭长型细胞克隆生长, 吸入离心管, 更换新鲜培养液, 再用75%生理盐水冲洗, 使其完全脱落后, 以1 000rpm/min离心8min, 吸取上清液, 留0.5ml悬液备用。加入0.5ml新配的固定液, 用细长玻璃管吸出一滴, 滴在冰冻玻璃片上, 轻轻吹开, 玻片置空气中干燥后, 在显微镜下观看染色体分散情况。

2 结果

本组35例行羊水细胞培养检测的孕妇中, 羊水培养成功33例, 羊水培养成功率为94.3%, 失败2例, 均为细胞生长不良。培养成功的染色体正常核型31例, 异常核型2例, 异常检出率为6.1%, 异常2例均为平衡易位携带者46, XX。

3 讨论

产前诊断是当前遗传病诊断学研究的重点领域, 其中羊水细胞学检测在临床产前诊断中的应用作为广泛, 能够在产前及时、安全、准确地诊断胎儿遗传病, 有利于临床医生和产妇共同协商、选择恰当的处理方案[2], 对提高我国人口素质具有重要的意义。

羊水中的细胞主要来自羊膜层的羊膜细胞与胎儿的脱落上皮细胞[3], 羊膜腔穿刺是羊水细胞学检测过程中的一个重要步骤, 关系到培养的成败, 目前临床主要采取B超引导下行羊膜腔穿刺, 该方法具有一定的安全性和准确性, 且适用范围日益扩大, 但作为一种有创性操作也存在着一定的风险, 国外文献报道[4]:孕中期羊膜腔穿刺的流产率在0.5%~1%, 因此操作应严格掌握指征, 遵循操作规范, 以有效预防并发症及不良结局。本文羊水细胞培养检测结果表明:羊水培养成功率为94.3%, 培养成功的染色体异常核型检出率为6.1%。染色体异常核型均为平衡易位携带者, 据文献报道[5]:平衡易位携带者没有遗传物质的丢失, 表型正常, 但可以遗传, 生育染色体异常患儿的几率高达50%~100%。因此夫妇双方中一方为平衡易位携带者的, 应建议接受产前诊断。影响羊水细胞培养成功率的因素很多[6], 因此应在不断改善实验室条件的基础上进一步规范、改良操作方法, 严格对穿刺、培养、收获、制片等环节进行质量控制, 以提高羊水细胞培养的成功率。

综上所述, 羊水细胞培养在诊断胎儿遗传病方面发挥着重要的作用, 在产前诊断中有较高的临床应用价值, 值得临床进一步推广使用。

摘要：目的:探讨羊水细胞培养在产前诊断中的应用价值。方法:选取35例孕妇作为研究对象, B超引导下抽取羊水, 对细胞培养结果进行分析。结果:本组35例行羊水细胞培养检测的孕妇中, 羊水培养成功33例, 羊水培养成功率为94.3%, 失败2例。培养成功的染色体正常核型31例, 异常核型2例, 异常检出率为6.1%。结论:羊水细胞培养在诊断胎儿遗传病方面发挥着重要的作用, 在产前诊断中具有较高的临床应用价值, 值得临床进一步推广使用。

关键词：产前诊断,羊水细胞培养,染色体

参考文献

[1]胡美红, 刘雨生, 何国平, 等.羊水细胞培养及染色体核型分析在产前诊断中的应用[J].临床输血与检验, 2011, 13 (1) :23-25.

[2]卢守莲, 肖云山, 王珏, 等.羊水细胞培养用于产前细胞遗传学诊断177例分析[J].东南大学学报:医学版, 2007, 26 (4) :298-301.

[3]黎明红, 吴嵩龄, 殷照初, 等.羊水细胞培养及FISH技术用于产前诊断[J].海南医学院学报, 2002, 8 (3) :136-138.

[4]Evans MI, Wapner RJ.Invasive prenatal diagnostic procedures2005[J].Semin Perinatoll, 2005, 29 (4) :215-218.

[5]贺爱军, 王永青, 霍莹, 等.羊水细胞培养染色体检查用于产前诊断的探讨[J].中国妇幼保健, 2001, (16) :376-377.

《动物细胞培养》教学反思 篇4

动物细胞培养教学反思

杨建波

赛课已经结束，但我的表现并不好。首先，引入新课不够精彩，没有激发学生的求知欲。我觉得应该以演员SELINA演习时皮肤大面积烧伤,治疗通常是取健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，如何来治疗该病人作为问题引起同学们讨论，引出这节课的主要内容——动物细胞培养。在此之前学生已经学过了植物组织培养，因此我先回顾植物组织培养的原理并提出了一个问题：动物细胞培养能否像植物组织培养那样最终培养成新个体？引导同学们思考两者之间的异同。在讲述培养过程时，学生阅读课本自主总结和借助课件展示过程，帮助学生理解培养的过程及把握注意事项。本堂课上完后，我发现了自己有不少缺点和不足，需要在以后的教学中加以改正：1．没有充分发挥学生的主体地位。新课程的理念是要转变教师和学生的角色，让学生成为课堂的主导者，而本节课仍然以传统的教学模式为主，仍然是教师为主体。在实际教学过程中，主观的想引导学生探究问题，思考问题，得出结论，而事实上学生回答问题答不到点子上，我就匆匆的把答案公布了，没有真正做好引导工作。2．没有充分调动学生的积极性。课堂教学的气氛对整堂课的教学质量是至关重要的，纵观整节课，学生对问题的思考、回答等积极性不高。3．时间安排不够紧凑。导致最后讲动物细胞培养技术的应用时时间紧，讲得比较匆忙。当然本节课的成功之处是采用了多媒体教学，使课堂的知识容量比较大，对前面学过的内容可以比较快的复习，真正做到温故而知新。

羊水细胞培养 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料

该文随机选取该院就诊于该院的714例高龄孕妇为研究对象,所有孕妇均行羊膜腔穿刺抽羊水,进行羊水细胞培养。孕妇的年龄为35~46岁,孕妇的孕周为19~25周。纳入病例标准:①年龄在35岁及以上的孕妇;②无羊膜腔穿刺禁忌症者;③无严重慢性疾病者;④签署了知情同意书,并接受随诊。

1.2 检测方法

①羊水采样:术前完善血常规、血型、凝血四项、肝肾功能、乙肝两对半、抗HCV、抗HIV、RPR、TPPA检查及产科超声估计孕龄、胎儿数量、羊水量、胎盘位置等情况检查,排除羊膜腔穿刺禁忌症的高龄孕妇,如:先兆流产、有感染征象,术前2次测量体温(腋温)高于37.2°C;出血倾向(血小板≤70×109/L,凝血功能检查有异常),中央性前置胎盘或前置、低置胎盘有出血现象;妊娠合并症及产科并发症等。在具备抢救条件的手术间完成羊膜腔穿刺术,穿刺前嘱孕妇排空膀胱,取仰卧位,具体步骤:常规消毒腹部皮肤,铺无菌巾,采用B超引导下确定最佳穿刺部位,穿刺腹壁后进到羊膜腔,并拔出针芯开始抽取2 m L羊水丢弃,更换注射器再抽取约20 m L羊水,分装于2支15 m L的无菌离心管中,插入针芯并拔出穿刺针,对穿刺点进行局部的消毒后覆盖无菌纱布,用胶布进行固定。②羊水培养:2支分装有羊水的无菌离心管按照2 000 r/min的离心速度离心10 min后弃去上清液,保留约0.5 m L羊水细胞层,每管加入4 m L一生骏羊水细胞培养液(粤穗食药监械(准)字2013第140005),吸管轻混匀,移至25 cm2方形一次性培养瓶中。在温度为37℃、5%的二氧化碳培养箱中进行静止恒温培养1周。可见成纤维样或上皮细胞生长,当细胞生长旺盛,在贴壁细胞层的背景上出现圆形细胞时,可视情况换液,换液24~48 h后,若细胞生长状况良好,即可终止细胞培养并收获,然后进行制片,完成羊水染色体制备,常规320条带G显带进行分析。

1.3 统计方法

采用常规的Excel软件工作表对数据进行收集与分析,并利用百分比描述性分析。

2 结果

2.1 染色体的核型异常情况分布

该文选取的714例高龄孕妇中染色体异常的分类有21三体综合征、18三体综合征、性染色体异常和其它的染色体异常。有23例高龄孕妇的染色体出现异常,检出率为3.22%;其中12例为21-三体综合征,检出率为1.68%;1例为18-三体综合征,检出率为0.14%;3例为性染色体异常,检出率为0.42%;7例为其它的染色体异常,检出率为0.98%。数据如表1所示。

2.2 不同年龄高龄孕妇的胎儿染色体异常检出率比较

714例高龄孕妇中35~39岁占450例,发现胎儿染色体异常例数9例,检出率为2..00%;40~41岁高龄孕妇占135例,发现胎儿染色体异常例数为5例,检出率为3.70%;42~43岁高龄孕妇占98例,发现胎儿染色体异常例数为6例,检出率为6.12%;44~46岁高龄孕妇占31例,发现胎儿染色体异常例数为3例,检出率为9.68%。数据如表2所示。

3 讨论

高龄孕妇的年龄不断增加致使孕妇的卵巢不断的衰老,且卵母细胞的质量也逐渐的衰老,细胞收缩、细胞膜起泡、核小体的DNA断裂及染色体固缩等都会对受精卵质量产生影响,进而增加了下一代染色体溢出发病的风险[3]。目前,随着产前的诊断技术不断提高,孕妇的优生、优育意识不断增强,在临床利用羊膜腔穿刺羊水细胞培养对胎儿染色体的核型进行分析的应用逐渐增多[4]。介入性穿刺具有一定风险性,0.5%左右的羊膜腔穿刺都会可能导致孕妇出现流产及胎儿丢失的现象。夫妇双方的机体内、外环境等因素发生改变都会引起胎儿先天性染色体出现异常等染色体病,其中有染色体数目及结构异常。介入性产前诊断可以对缺陷胎儿的出生起到预防的作用,是提高优生、优育的重要方法之一。

据相关文献报道,新生儿染色体异常发生率为0.1%~0.2%,最常见的染色体异常为21-三体综合征,其次是18-三体综合征和性染色体异常[5]。根据孕中期羊膜腔穿刺羊水细胞培养的孕妇染色体核型分析,21-三体综合征是染色体异常中最常见的一种胎儿染色体疾病,18-三体综合征、性染色体异常的也有一定发生率,其他染色体异常导致染色体疾病的发生率均较高,与文献报道的基本一致[6]。该文研究结果显示,所选取的714例高龄孕妇中染色体异常的分类有21-三体综合征、18-三体综合征、性染色体异常和其它的染色体异常,有23例高龄孕妇的胎儿染色体出现了异常,检出率为3.22%;其中12例为21-三体综合征,检出率为1.68%;1例为18-三体综合征,检出率为0.14%;3例为性染色体异常,检出率为0.42%;7例为其它的染色体异常,检出率为0.98%。研究发现高龄孕妇异常核型检出率(3.23%)现在高于普通的人群[7]。714例高龄孕妇中35~39岁占450例,发现胎儿染色体异常例数9例,检出率为2..00%;40~41岁高龄孕妇占135例,发现胎儿染色体异常例数为5例,检出率为3.70%;42~43岁高龄孕妇占98例,发现胎儿染色体异常例数为6例,检出率为6.12%;44~46岁高龄孕妇占31例,发现胎儿染色体异常例数为3例,检出率为9.68%;结果表明:年龄越高的孕妇,其胎儿的染色体异常检出率越高,高龄孕妇的年龄与其胎儿的染色体异常发生率呈正相关,羊膜腔穿刺羊水细胞培养在高龄孕妇的产前诊断中对减少胎儿染色体病的诊断中具有重大的意义[8]。

综上所述,高龄孕妇在产前进行羊膜腔穿刺羊水细胞培养可以对胎儿染色体异常的情况进行有效的检测,有效的对高龄孕妇分娩畸形胎儿进行预见性的诊断,进而降低了新生儿的缺陷率,达到了优生的目的,提高了出生人口素质。

参考文献

[1]王绍文.超声筛查及超声引导下羊水穿刺诊断胎儿染色体异常的价值[J].辽宁医学院学报,2015,36(2):37-38.

[2]梁玥宏,任晨春,王文靖,等.1544例妊娠中期孕妇羊水细胞染色体核型分析[J].中国妇幼保健,2015,30(8):1208-1210.

[3]徐聚春,曹利,胡华,等.8864例孕妇唐氏综合征筛查与羊水穿刺结果分析[J].中国优生与遗传杂志,2012,20(1):30,32.

[4]石冲,张国彬,韩宝生.唐山地区1108例孕妇羊水穿刺产前诊断结果分析[J].重庆医学,2014,43(30):4096-4098.

[5]张传英,赵咏梅,孟君,等.某市孕中期产前筛查诊断结果分析[J].检验医学与临床,2014(16):2229-2230.

[6]蔡婵慧,郭莉,胡晶晶,等.4636例高龄孕妇羊水细胞染色体分析[J].中国优生与遗传杂志,2014,22(8):35-37.

[7]梁朝霞,杜蒙悟,陈丹青.高龄妇女再生育的产科合并症风险[J].中国计划生育和妇产科,2014,7(6):10-13.