三维细胞培养

三维细胞培养（共7篇）

三维细胞培养 篇1

三维细胞培养技术 (3D cell culture) 在组织形成、血管发育和器官再造等发育生物学的分支领域得到了广泛的应用;同时在筛选新药的疗效分析和毒理试验方面, 利用三维培养获得了与二维单层培养完全不同的结果, 引起了生命学家的极大兴趣[1,2,3,4,5,6,7,8,9]。不同于传统的二维单层细胞培养, 三维细胞培养技术是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养, 使细胞能够在载体的三维立体空间中迁移、生长、构成三维的细胞-载体复合物。在真正的活体, 细胞通常在三维环境中生长并建立三维活的组织或器官。细胞培养的微环境对于细胞的形状、代谢、功能、迁移、增殖和分化等具有至关重要的作用。传统单层细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增生逐渐散失了原有的性状, 往往与体内情况不相符;动物试验虽在体内进行, 但体内多种因素制约以及体内和外界环境相互影响而不能观察到研究者最为关心的中间过程。三维细胞培养技术模拟体内的微环境, 填补了单层细胞培养和动物试验的鸿沟。正如Nature中的一篇文章指出:“意识到三维组织培养潜在的优势的科学家还是太少了。但是, 这项技术带来的好处是不言而喻的 (图1) [4]。”三维细胞培养技术作为体外无细胞系统及单层细胞系统的研究与组织器官及整体研究的桥梁, 显示了其既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础, 又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。目前这一技术主要应用在哺乳动物细胞培养研究中, 涉及到植物细胞培养中的研究报道甚少。但是植物细胞和动物细胞有许多相通之处, 例如:原生质体 (去壁后的植物细胞) 和哺乳动物细胞有很多的相似之处, 可以摄入细胞器、微粒体、病毒以及DNA等大分子物质, 这就为将三维细胞培养技术引入到原生质体培养中提供了可能性。笔者根据已有文献检索, 利用木本植物材料开展初步研究, 对于这方面研究中的应用前景作一评述。

1 三维细胞培养支架制备

三维细胞培养的关键在于三维细胞培养支架制备 (3D cell culture scaffold, 3DCCS) (图2) , 其研究内容将涉及微加工制造、生物偶联、表面化学修饰、软光刻制作、高分子合成、细胞生物学等多个领域。目前可用于制备3D-CCS的材料主要有聚苯乙烯 (PS) 、聚己内酯 (PCL) 、聚酰胺 (PA) 、聚二甲基硅氧烷 (PDMS) 、硅片、玻璃、胶原蛋白或水凝胶等[16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27]。而相应的制备方法有:运用相分离法合成的多孔高分子支架;利用电放纤维技术人工合成的纳米纤维支架;尤其是运用精密微加工技术制备具有均一微结构的支架, 其确保多孔结构的可重复性以及可调控性, 并且可以和微流控技术相集成, 开发新型的微流控三维细胞培养芯片。目前商业化的3DCCS主要有英国Reinnervate公司的alvetex三维支架 (http://www.reinnervate.com) , 其被Scientist网站评为2010年的全球生物技术的十大革新之一, 名列第6位 (http://www the-scientist.com/2010/12/1/47/1/) 。另外, 还有美国3D Biotek公司的3D InsertTM三维支架 (http://www.3dbiotekstore.com/) 和国内的瑞康健生物医学有限公司等。

注:上列:左图来自文献[10], 中间图来自文献[11], 右图来自文献[12];下列:左图来自文献[13], 中间图来自文献[14], 右图来自文献[15]。

笔者利用微乳模板法人工合成了PS三维细胞培养支架。SEM图片 (图3) 显示40μm孔径分布在整个支架的内部, 且相互中通。这些材料正在应用于杂交鹅掌楸细胞的胚胎发育中。

2 基于微流控芯片的细胞培养系统

植物细胞培养是通过一个能模拟生物体内环境的体外空间, 配置以无菌、适当温度、酸碱度和一定营养条件的细胞离体培养体系, 使之生长、发育, 实现植株再生、繁殖或进行特定目标的科学研究的细胞水平的现代试验技术体系。现阶段, 人们多采用瓶、皿或微孔板培养方式, 但这种传统的器皿培养技术, 不仅操作繁琐, 而且试剂耗量大、占用空间多、微环境较难调控。更为重要的是, 相对于细胞的微小尺寸, 这种培养环境与体内环境相差较远, 客观上难以真实反映细胞生命过程的生理、遗传等分子和细胞生物学特征。

微流控芯片技术的出现恰恰为解决这一难题提供了契机。微流控芯片技术是据于微电子的微细加工技术和微机电加工系统 (MEMS) 原理而发展起来的, 现代生物技术、微细精确仪器分析和高分子材料等领域的学科交叉点。它不同于人们熟悉的一次性的生物芯片 (Biochip) 及其技术, 微流控芯片技术通过对微通道中的流体的控制, 把一个分子生物学分析实验室的采样制备、溶液配制、试剂和试验样品进样、反应、分离和检测等功能, 集成到邮票或信用卡大小的芯片上的“芯片实验室”。该申请项目涉及到的植物细胞培养微流控芯片与其他微流控芯片一样, 具有不同操作单元之间在技术上组合灵活、整体可控和规模集成等特点。在用于细胞研究的过程中主要体现在以下几点:一是芯片通道尺寸 (通常10~100μm) 与种子植物细胞直径大小 (10~200μm) 相适应, 有利于单细胞操纵、分析;二是芯片的多维网格结构形成相对封闭的环境, 与植物生命体的正常生理状态下的细胞空间特征接近;三是芯片通道微尺度下传热、传质较快, 可以提供有利于细胞研究环境和进行培养微环境的调控;四是芯片可以满足高通量细胞分析的需要, 可同时获取大量的生物学信息;五是芯片上多种单元技术的灵活组合使集成化的细胞研究成为可能, 诸如细胞进样、培养、分选、遗传操作和分离检测等过程均可在一块芯片上完成。微型化、集成化和自动化的细胞培养系统, 将极大地简化操作步骤, 减少细胞或试剂耗量, 降低成本, 并可方便地与其他单元操作耦联, 有可能使常规细胞培养技术产生根本性变革。

目前基于微流控芯片的细胞培养系统, 多采用灌流式培养方法:将细胞悬液注入微通道或微培养室, 待细胞贴壁后, 将培养液连续灌入培养区域, 实现营养物质的连续更新。芯片材料多采用聚二甲基硅氧烷 (PDMS) , 该类材料具有良好的生物相容性, 对气体有一定的通透性, 有利于细胞培养过程中O2和CO2气体的交换。另外, 由于其透明, 也利于激光共聚焦显微镜等进行动态观察。并且通过软光刻技术, 可以制造复杂的微纳三维结构, 其已被广泛应用于微流控细胞培养芯片的制作。虽然以细胞为对象的微流控芯片研究起步较晚, 但近几年引起了各国科学家的广泛重视。日本东京大学的Teruo Fujii课题组研制的微流控芯片细胞培养系统, 可实现肝癌HepG2细胞株连续10 d培养;在此基础上构筑的多层PDMS芯片组成的堆栈式细胞培养装置, 可实现细胞大规模的培养[28,29]。美国伯克利大学的Luke P Lee课题组通过模拟体内环境设计了一种高通量微流控细胞培养芯片, 这种芯片可以减轻剪切力对细胞的培养[30]。国内大连化物所的林炳承课题组利用通透性水凝胶材料的微加工技术, 研制了一系列具有不同功能的二维或三维结构, 并用于细胞培养。以上这些报道的芯片设计仍然停留在对多个细胞的培养, 无法实现高通量的单细胞培养。在已有的报道主要是拘于动物和人类医学方面应用的研究, 有关植物的研究报道甚少, 在木本植物上的应用尚未见报道。与动物细胞不同, 对于植物细胞而言, 在细胞膜外还具有1层厚厚的细胞壁结构, 植物细胞在人工培养条件下, 会大量合成次生代谢物, 对培养物的微环境干扰大。由于植物细胞生物学结构特点以及在人工培养条件下容易结团、对于剪切力极敏感等固有特点, 使得研制适合于植物, 尤其是木本植物的单细胞培养芯片就显得很为重要。美国麻省理工学院的Joel Voldman曾连续报道了坝式结构和网孔状的微流控芯片可以迅速、高通量的捕获单个植物细胞 (图4) [15,31]。美国伯克利大学的Luke P Lee课题组和美国华盛顿大学的Albert Folch课题组也进行了类似的研究[32,33]。但结果表明, 他们的坝式结构的芯片无法消除培养过程中的流体剪切力对植物细胞的影响, 而网孔状结构的芯片无法实现后续的细胞原位培养。瑞士苏黎世联邦高工的Textor M课题组利用微孔状的PDMS芯片系统研究了细胞的三维培养情况[10]。韩国大学的Lee S H课题组研究了Nicotiana tabacum原生质体在PDMS微流控芯片中的培养情况, 国内的西北农林大学王进义课题组研究了tobacco mesophyⅡ原生质体在PDMS微流控芯片中的培养和细胞融合情况[11,34]。其研究结果显示:相对于传统的培养方式, 原生质体的生长、分化速度都得以提高, 这说明PDMS微环境对于原生质体培养有着有利影响。

注:左图来自文献[15], 中间图来自文献[32], 右图来自文献[33]。

笔者加工了多种不同形状微单元的PDMS芯片。并在真空下, 利用酶液 (纤维素酶、果胶酶) 溶解拟南芥叶片2 h后, 再过筛, 得到直径30μm的原生质体样品。滴加PDMS芯片表面上, 通过原生质体自然沉降, 实现对其捕获。经过大量的沉降参数优化, 发现在真空条件, 亲水处理后的圆形微孔状 (直径40μm) 、间隔40μm阵列分布的PDMS芯片可以有效地捕获原生质体 (图5) 。

3 三维细胞培养技术在植物细胞研究中应用的前景展望

目前该技术主要应用在哺乳动物细胞培养研究中, 涉及到植物细胞培养中的研究报道甚少。但是植物细胞和动物细胞有许多相通之处, 例如:原生质体 (去壁后的植物细胞) 与哺乳动物细胞有很多的相似之处, 例如可以摄入细胞器、微粒体、病毒以及DNA等大分子物质, 这就为将三维细胞培养技术引入到原生质体培养中提供了可能性。尽管也有一些类似的研究已开展, 但现在大多还处于理论探索阶段, 与农、林等生产实践相结台的应用研究也尚处于起步阶段。综合分析认为, 这种多学科的交叉融合和互相渗透无疑将成为今后研究植物细胞培养技术发展趋势。以后研究将主要集中在以下几方面。

(1) 适合植物细胞的单细胞芯片的研发。这种细胞芯片具备以下3个特点:一是可以简单、迅速、大范围的捕获单个细胞;二是可消除流体剪切力对植物细胞生长的影响, 以获得真实的生物学信息;三是便于原位培养, 同时也便于进行原位、长时间动态的跟踪观察和进行精确的高通量分析。

(2) 通过在支架表面固定RGD, 人工建立支架表面-质膜-细胞骨架跨膜的连续体, 研究基底表面纳米几何结构, 对原生质体细胞壁再生、细胞分裂等活动的影响。在微纳米尺度下, ECM的表面几何、化学、力学性质等, 可以调控哺乳动物细胞在材料表面的粘附、生长、运动等。这主要是由于动物细胞膜表面上的存在整合素这样的受体, 其胞外域可以结合ECM, 胞内域与细胞骨架连接, 确保了细胞与环境, 或细胞与细胞间信号传递的通道。类似的植物细胞中同样存在RGD依赖的识别系统, 该系统参与协调控制植物细胞壁的分裂和适当细胞壁的合成[10]。因此, 通过在支架表面固定RGD, 人工建立支架表面-质膜-细胞骨架跨膜的连续体, 进而改变支架表面纳米结构, 必然会影响原生质体细胞壁再生、细胞分裂等活动。

骨髓间充质干细胞的三维培养 篇2

关节部位的损伤或关节疾病如骨关节炎、关节退行性病变严重影响人类健康,而究其原因主要是关节部位软骨不同程度的缺损或病变。组织工程技术是目前修复关节软骨损伤研究领域的热点,其中种子细胞、组织工程支架、生长因子的选择是当前研究的核心,其主旨是利用支架为种子细胞提供三维培养环境,从而促进细胞的渗入、黏附和组织的形成。

2 材料和仪器

2.1 实验动物

日本大耳白兔(武警医学院动物实验中心)。

2.2 实验材料

壳聚糖粉末(医用,山东奥康生物科技有限公司)。

2.3 主要试剂

聚乙二醇(Sigma公司);CD44、CD45试剂盒(Sigma公司);冰醋酸、速眠新、肝素钠等(华北制药厂)。

2.4 主要实验仪器

冻干机(北京博医康);超纯水系统(英国Millipore公司);台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂);FEI Quanta 200扫描电镜(荷兰FEI公司)。

3 实验方法

3.1 壳聚糖支架制作

将3%壳聚糖醋酸混合溶液100 mL,加入相对分子质量为1 000的聚乙二醇1 g,放入37℃水浴箱内以溶解腊状聚乙二醇,以1 500 r/mim转速离心10 min去除气泡。将壳聚糖醋酸溶液缓慢倒入72孔板内,放入冰箱-20℃预冷冻10 h,再放入冷冻抽干机中冻干24 h,制备壳聚糖支架。将支架从72孔板内取出,放入0.1mol/L NaOH中,中和支架内的残余醋酸,以PBS液反复冲洗至pH值中性备用。

3.2 扫描电镜观察支架超微结构

将制备好的壳聚糖支架用锐刀切开放入3%戊二醛固定4 h,磷酸盐缓冲液漂洗10 min×3次,1%四氧化锇固定2 h,磷酸盐缓冲液漂洗10 min×3次,梯度乙醇(30%~100%)脱水,乙酸异戊酯置换,冻干法干燥,金离子溅射法镀膜(SCD-005),FEI Quanta 200扫描电镜观察该支架的孔径大小及支架的超微结构。

3.3 骨髓间充质干细胞的提取及鉴定

无菌胸骨穿刺针从日本大耳白兔胫骨近端采取骨髓约5 mL,全骨髓培养法分离骨髓间充质干细胞,10%胎牛血清的LG-DMEM作为细胞培养基,在37℃、体积分数为5%的CO2及饱和湿度条件下培养,取第3代BMSCs,免疫细胞化学测定其细胞表面抗原CD44、CD45,对BMSCs进行鉴定。

3.4 骨髓间充质干细胞-壳聚糖支架的三维培养

将壳聚糖支架浸泡在装有75%酒精的6孔板内,放入超净台内紫外线照射30 min,无菌条件下以PBS缓冲液反复清洗3次,再用LG-DMEM反复清洗2次,吸去培养液后,重新加入LG-DMEM液浸泡24 h备用。将支架从培养液中取出,置入24孔培养板内,取第3代BMSCs以1×106/mL密度接种于支架内(各孔加入3 mL培养基将支架完全浸没),放入37℃、5%CO2及饱和湿度培养箱内培养。分别在培养24、48 h后取出细胞/支架复合体进行电镜检测,观察细胞在支架上的黏附生长情况。

4 结果

4.1 细胞培养及鉴定结果

细胞培养2周后长满培养板底壁,细胞形态多呈梭形(如图1所示)。CD44免疫细胞化学检测可见阳性细胞主要集中在细胞密度高的区域,胞浆内可见棕黄色颗粒,细胞周围也出现黄染区(如图2所示);CD45检测结果为阴性(如图3所示),符合骨髓间充质干细胞的生物学特性。

4.2 扫描电镜观察壳聚糖支架的超微结构

电镜下壳聚糖支架在横断面上可见内部密布大小均一的孔洞,孔径为150~360μm,平均为255μm左右(如图4所示)。

4.3 骨髓间充质干细胞与支架的三维培养

BMSCs与支架共培养24 h后,多孔支架表面密布细胞,部分细胞已渗入支架孔内生长(如图5~6所示),分泌少量细胞外基质,并与支架建立连接;48 h后,部分孔内可见细胞呈簇生长,底层细胞已呈现梭形黏附在支架上,部分细胞分泌大量细胞外基质,与支架黏附较好,细胞在三维培养环境下生长较好(如图7~8所示)。

5 讨论

5.1 骨髓间充质干细胞作为种子细胞的可行性

骨髓腔内含有造血和基质两大系统。前者由造血干细胞及其分化的细胞组成,后者是富含骨髓基质的异质细胞群体,BMSCs是存在于骨髓基质中的非造血干细胞。20世纪70年代,Friedenstein等[1]在骨髓标本中首次发现骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)。它具有自我复制能力及多向分化潜能。在体内和体外通过外界干预及环境的变化,可以分化成具有多种功能的细胞,干细胞可分为成体干细胞和胚胎干细胞,BMSCs是成体干细胞的一种。现阶段,BMSCs已广泛应用于组织工程、基因治疗等方面。其中在神经系统、心肌组织、骨组织、软骨组织的组织工程应用尤为广泛[2,3,4]。BMSCs不仅存在于骨髓,在软骨膜、骨膜及肌肉中也有间充质干细胞的分布,但骨髓中的含量相对较多,BMSCs可以来源于机体各部位的骨髓,不同来源的BMSCs的功能状态不一。Minguell等发现同等条件下,椎骨来源的BMSCs其碱性磷酸酶活性低于胫骨来源的细胞[5],故我们选取胫骨取材,另外,有研究发现BMSCs的数量随年龄增加而逐渐减少[6]。D’Avis等观察到随供体年龄增长BMSCs数目下降并对生长因子的反应性降低[7]。而成年后长骨骨髓腔内以黄骨髓为主,若以此作为BMSCs的来源,则分离出的脂肪细胞较多,BMSCs少,而幼年动物骨髓腔内以具有多向分化潜能的各种未分化幼稚细胞为主。因此,我们选取2.5月龄的日本大耳白兔作为实验动物,用以分离到数目相对较多且功能良好的BMSCs。

5.2 利用壳聚糖制备组织工程支架的可行性

组织工程支架从取材方面看分为天然材料、人工合成材料和天然与人工合成复合材料。天然材料主要有几丁质类(壳聚糖,Chitosan,CS)、胶原(Collagen,COL)、纤维蛋白(Fibrin,FIB)、藻酸盐(Alginate,ALG)、蚕丝蛋白等;人工合成材料主要有聚乳酸(Polylactide,PLA)、聚羟基乙酸(Polyglycolide,PGA)、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物(Polylactic-co-glycolic acid,PLGA)、羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)、磷酸三钙(Tricalcium phosphate,TCP)等;天然与人工合成复合材料支架,如CS/HA支架、COL/TCP支架、COL/PLGA支架等。

其中壳聚糖支架的优点有:(1)良好的生物相容性和组织相容性[8,9]。壳聚糖是自然界广泛存在的一种天然多糖类有机聚合物,它的分子结构和软骨基质糖氨多糖(GAG)结构相似,具有良好的生物相容性和组织相容性,对软骨细胞有较好的吸附作用,能促进细胞在材料上的增殖与分化[10]。(2)多孔结构特性[11]。通过冻干法将混合溶液中的聚乙二醇去除,从而形成多孔结构,诸多多孔结构利于细胞的渗透,增大细胞在支架上的黏附生长面积,为组织的重建奠定基础。(3)良好的加工性能。由于实验中以72孔板为磨具,制备的材料以圆柱形为主。实际上我们可以根据临床需要,设计并制备大小、形状、厚度相匹配的支架,从而构建出适合需要的细胞/支架修复体。(4)支架易于消毒、保存,消毒后支架材料不降解[12]。壳聚糖支架的消毒可应用酒精浸泡方式消毒,并通过缓冲液及培养液的反复洗涤去除酒精,实验证实该种消毒方式下细胞在支架上能够较好生长,并未见明显其他细菌滋生。不足之处:力学特性和耐磨损性能相对差,关节部位由于其解剖特点特殊,其受力因素较为复杂,在机体运动过程中,关节部位的受力不但有纵向和横向受力,而且存在切面方向的滚压式受力,因此支架材料的选择应适合力学环境下的需要,保持一定的力学性能和耐磨性适应临床治疗的需要。

5.3 骨髓间充质干细胞三维培养的必要性和可行性

实验表明[13],细胞在单层培养时,细胞在增殖、生长一段时间后常会发生细胞之间的接触性抑制,从而抑制了细胞生长和增殖。利用三维培养,为细胞提供三维立体的生长环境,从而更加利于细胞的生长、黏附,减少细胞间的接触性抑制。同时,我们知道,软骨组织的缺损其结构亦为立体结构,单层细胞无法对软骨缺损进行修复。三维培养就是为种子细胞提供三维立体结构,按照支架结构的形状、大小形成组织,以适应临床需要,并且三维多孔结构,孔与孔之间相通,在培养液中添加药物或生长因子,可通过孔道相互传递,达到浓度均一,从而利于外界因素对组织工程化软骨形成的干扰,对组织的构建提供更好的平台。

6 结语

三维细胞培养 篇3

利用组织工程技术实现牙齿的再生是人类解决牙齿缺失问题的终极目标。传统的组织工程技术的基本原理是将体外培养扩增的种子细胞复合到支架材料上,构成细胞-支架复合体,再进行体外培养或植入体内相应的病损部位[1]。支架材料内部细胞分布难以控制。生物打印是一种新型的组织工程手段,是快速成型技术在生物医学中的应用,即:在计算机辅助下,按照预先设计的特定的三维结构,对活细胞、生物活性组织及相关生物材料等基本构件的逐层堆积的生物制造技术[2,3,4,5]。与传统的组织工程技术相比,生物打印技术可以个性化控制细胞分布以及精确控制支架成型。人牙髓细胞(human dental pulp cells, hDPCs)的生物打印研究可为牙齿组织工程提供新的思路和方法,相关工作未见报道。

1材料和方法

1.1主要试剂和仪器

1.1.1 主要试剂

Ⅰ型胶原酶(Worthington Biochem,美国);碘化丙啶(propidium iodide,PI)、dispase酶、胰酶、海藻酸钠、明胶(Sigma-Aldrich,美国);胎牛血清(HyClone,美国);α-最低必需培养基(α-minimum essential medium,α-MEM)(Gibco,美国);钙黄绿素-AM(calcein-AM,CAM)(Invitrogen,美国)。

1.1.2 仪器

生物打印机Cell Assembler Ⅱ(清华大学,中国);激光共聚焦显微镜LSM 5 Excitor(Carl Zeiss,德国)。

1.2实验方法与步骤

1.2.1 hDPCs的培养

临床收集(18～25)岁因阻生拔除的人第三磨牙,无菌条件下取出牙髓,剪碎,用3 mg/mL的Ⅰ型胶原酶和4 mg/mL的dispase酶在37 ℃消化1 h。加入含20%胎牛血清的α-MEM培养基终止消化,台式离心机以1 000 r/min离心5 min后收集细胞。加入20%胎牛血清的α-MEM培养基,转入培养瓶后置于37 ℃,5%CO2孵箱内培养。隔天更换培养基。传代后改用含10%胎牛血清的培养基培养,取状态良好的第4代细胞用于实验。

1.2.2 细胞-基质共混物的制备

将明胶干粉溶于α-MEM培养液中,获得14%(w/v)的明胶溶液,高压灭菌消毒。海藻酸钠干粉,高压灭菌消毒后,在无菌的超净台内用α-MEM培养液溶解,获得6%(w/v)的海藻酸钠溶液。将明胶溶液与海藻酸钠溶液按体积比1∶1混合,于70 ℃磁力搅拌达到均匀共混,调节pH值在7.2～7.4,得到10%的海藻酸钠-明胶透明胶状液体,记为SG。胰酶消化第4代hDPCs制成细胞悬液。用台盼蓝染色检验细胞的存活率大于90%后,将SG与hDPCs轻柔混匀,细胞终密度为2×106/mL。

1.2 3 细胞-基质共混物的三维生物打印

生物打印过程采用生物打印机Cell Assembler Ⅱ(图1)进行。首先,将细胞-基质共混物置入1 mL一次性无菌注射器,注射器的前端与金属喷嘴连接,固定在密闭的温控成形室内。然后,采用步进电机驱动柱塞挤出的成形方法,将共混物喷出到低温成形腔,在载有无菌培养皿的三维微动平台处拉成线状。挤出的共混物因明胶的温度敏感性发生交联,由溶胶转变为凝胶。在具有层片信息的预设计算机辅助设计模型(图2)数控驱动下,逐层挤出/沉积形成不同的层面。不同的打印层面之间依次交错叠加,最终形成三维结构体。主要成形参数见表1。

为维持三维结构体的稳定性,使未完全交联的结构体进一步交联,将成形的结构体在4°C的1%的无菌氯化钙溶液中浸泡5 min,然后用生理盐水反复冲洗,获得含有hDPCs的三维结构体。将结构体转移到α-MEM培养液中,在37°C,5 % CO2培养箱中培养。

1.2.4 三维结构体的观察

肉眼观察结构体外形,然后用倒置相差显微镜观察结构体。

1.2.5 打印后细胞活性分析

取培养24 h的结构体,用生理盐水漂洗,用含5 μmol/L的CAM和3 μmol/L的PI的α-MEM无血清培养液孵育45 min,生理盐水反复漂洗,用激光共聚焦显微镜分别在488 nm(CAM激发波长)和543 nm(PI激发波长)的激发光下在Z轴每隔20 μm扫描观察结构体内细胞的活性,保存所获图像。

2结果

2.1三维结构体的观察

通过生物打印技术,获得大小约为5 mm×5 mm×1.5 mm的半透明的网格状三维结构体(图3)。该结构体符合预先计算机辅助设计的结构。倒置显微镜下可见三维结构体中微丝直径约350 μm,孔隙的尺寸在350 μm左右,结构体中hDPCs的密度高,细胞在结构体中呈圆球形均匀分布(图4)。

2.2细胞活性分析

图5(a)和图5(b)分别为不同层面细胞在结构体中的情况。图5(a)为Z轴高度255 μm平面,图5(b)为Z轴高度340 μm平面。激光共聚焦显微镜在不同层面上可见细胞均匀分布,大部分细胞呈绿色荧光,少量被染成红色荧光的死细胞零散分布。

3讨论

生物打印是在快速成型技术发展的基础上,结合细胞生物学、计算机辅助设计和生物材料学等多个领域发展而来的一种新型的组织工程技术,其最终目标是实现器官打印[2]。与传统的组织工程技术相比,生物打印技术有诸多优势: (1)通过对生物打印喷头的三维协同控制、精确定位,在构建形态、结构复杂的组织工程结构体的同时可实现多种细胞在三维空间的同时精确定位[2]。(2)所构建出的组织内部细胞密度较高[6]。(3)可以在打印组织结构的同时在组织内部打印血管网,因而可解决较厚的组织结构的血管化问题[7]。(4)该技术自动化程度高,可升级而且重复性好,有利于进行大规模的工业化组织工程生产[2]。(5)细胞打印是完全由计算机控制的高通量细胞排列技术,可发展成为直接在生物体内进行的原位操作技术[8]。将生物打印技术运用于牙齿的再生,有望解决传统组织工程手段所难以解决的一些问题。

本研究所采用的生物打印技术的基本原理是结合离散-堆积快速成形原理和溶胶-凝胶相变机理,在计算机控制下,根据预先设计的三维数字模型,构建含活细胞的三维结构体,从而实现细胞打印[9]。本研究以明胶-海藻酸钠水溶胶为载体,在打印前将2×106/mL的hDPCs与水溶胶均匀混合,实现了细胞在三维结构体里的均匀分布(图4)。在4 °C的低温成形室内,以容积驱动挤出成形的方式,通过精确的三维定位系统,按照计算机软件预先设计的结构体外形、大小和内部孔径,将水溶胶以微丝形式精确挤出,不同层面的微丝逐层交错堆积,相邻层面的微丝相互粘接,构建出了含有hDPCs的网格状三维结构体(图3)。该结构体符合预先设计的尺寸和外形,结构体内部具有互相连通的孔隙,有利于组织形成及材料内部的hDPCs新陈代谢。打印过程中,微丝中的明胶水溶胶在低温环境下转变为凝胶,使结构体得以成形。经氯化钙溶液浸泡,结构体中的海藻酸钠与氯化钙溶液中的钙离子发生化学交联,转变为海藻酸钙凝胶,使结构体的稳定性得以维持。

细胞活性是评价细胞打印效果的重要指标。细胞打印过程容易对细胞造成损伤,如果不能使细胞所受损伤降至最低或零损伤,形成的三维结构体随着细胞的大量死亡也失去了意义。CAM和PI是用于细胞活性检测的典型荧光指示性染料[10]。CAM扩散进入活细胞,被胞内非特异性酯酶所水解,产物在波长为488 nm的激发光激发下发射明亮的绿色荧光;PI扩散进入丧失膜完整性的细胞(死细胞),与胞内DNA结合形成复合物,该复合物在波长为543 nm的激发光激发下发射红色荧光。激光共聚焦显微镜观察双荧光染色三维结构体的结果(图5)提示,本研究所采用的打印方法对hDPCs的损伤很小,hDPCs经三维生物打印存活率高。

综上,本实验将hDPCs和海藻酸盐-明胶水凝胶形成的共混物在生物打印设备上按照一定参数打印,构建出了具有自定义形状、尺寸,可控细胞密度,高细胞存活率的具有活细胞的三维结构体。这为生物打印技术进一步应用于牙齿组织工程奠定了基础,有望为牙齿再生提供了一种新的手段。尽管本研究利用生物打印技术构建的结构体尺寸较小、结构较简单,但现有研究工作已经验证了生物打印技术在牙齿组织工程中应用的可行性。

摘要：通过生物打印方法构建含人牙髓细胞(human dental pulp cells,hDPCs)的组织工程三维结构体。探讨对hDPCs进行三维生物打印的可行性。用常规体外培养hDPCs至第4代。将细胞悬液与海藻酸钠-明胶水溶胶混合,制备hDPCs-海藻酸钠-明胶水溶胶共混物。细胞终密度为2×106/mL。用生物打印机根据预先设计的参数进行生物打印,构建组织工程三维结构体。对结构体进行肉眼观察和倒置相差显微镜观察。用钙黄绿素-AM和碘化丙啶双荧光染料对结构体进行染色,激光共聚焦显微镜观察分析结构体中hDPCs的活性。通过生物打印技术的结果可按照预先设计的参数打印出含有hDPCs的网格状的水凝胶结构体,该结构体的大小约为5 mm×5 mm×1.5 mm。倒置相差显微镜下可见结构体内微丝的直径约300μm,微丝间的孔隙相互通连,孔隙大小约350μm×350μm,hDPCs在结构体中呈球形均匀分布。激光共聚焦显微镜观察证实结构体中大部分细胞存活。初步证明hDPCs可耐受生物打印过程。通过研究说明三维生物打印技术构建出了含人牙髓细胞的组织工程三维结构体,实现了hDPCs的生物打印,为生物打印技术应用于牙组织工程奠定了基础。

关键词：生物打印,组织工程,牙髓细胞

参考文献

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三维细胞培养 篇4

关键词：三维适行放疗,细胞因子诱导杀伤细胞,局部晚期非小细胞肺癌

非小细胞肺癌 (NSCLC) 约占原发性肺癌患者总数的80%。由于早期诊断较为困难, 确诊时约40%患者已进入晚期, 仅20%左右的患者可以采取手术根治[1]。局部晚期非小细胞肺癌是指尚未远处转移, 局部肿瘤进展而不能手术的Ⅲ期病变, 约占全部非小细胞肺癌的1/3以上, 是临床最常见的疾病阶段。放疗在局部晚期NSCLC的治疗中具有非常重要的作用, 但是治疗5年生存率只有5%左右, 中位生存期约6～11个月[2]。为进一步提高治疗效果, 石家庄市第一医院对住院及门诊40例局部晚期NSCLC采用三维适行放疗 (3D-CRT) 后联合细胞因子诱导杀伤细胞 (CIK) 治疗方案, 并设40例住院及门诊病例单独采用3D-CRT治疗作为对照, 现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2006年6月至2009年6月石家庄市第一医院80例患者, 经病理学或组织细胞学证实为Ⅲa期或Ⅲb期非小细胞肺癌 (UICC2002分期标准) 。卡式评分 (KPS) ≥70;有可测量或可评价的病灶;无严重内科疾病;血常规、肝肾功能正常。将患者随机分为联合治疗组和对照组各40例, 联合治疗组患者男28例, 女12例, Ⅲa 18例, Ⅲb 22例, 年龄38～75岁;对照组患者男26例, 女14例, Ⅲa 19例, Ⅲb 21例, 年龄40～77岁。两组资料具有可比性。

1.2 治疗方法

联合治疗组行3D-CRT联合CIK治疗, 对照组行单独3D-CRT。3D-CRT治疗方法:患者取仰卧位, 双手交叉置于头顶, MED-TEC体膜固定。以治疗体位行定位CT扫描, 并将CT重建图像输入系统, 采用上海拓能公司维纳斯适行调强放疗计划系统设计治疗计划。靶区定义遵循国际辐射单位和测定委员会 (ICRU) 62号文件定义, 临床靶区体积 (CTV) 包括原发灶、同侧肺门和纵膈淋巴引流区, CT片肺窗显示大体肿瘤体积 (GTV) 外1cm作为边界。CTV外放1.5cm为PTV。采用4～6个野进行适行放疗。治疗计划优先采用剂量体积直方图 (DVH) 。计划照射剂量60～70Gy。每次2～2.5Gy, 每天1次, 每周5d。CIK治疗:三维适形放射治疗后, 如无严重放射性肺炎或其他合并症, 则1周内抽取自体静脉血行CIK细胞培养, 具体过程如下: (1) 包被:用250mL纤维连续片段+100mLCD3+20mLPBS包被过夜。 (2) 抽取外周血用Ficol分离并收集单个核细胞, 用PDS洗涤3次, 将细胞 (不少于3×107) 悬浮于GT551培养基中。当天加入IFN-r、IL-2 1000U mL、2%～3%自体血浆。24h后加入rhIL-1、IL-2 100U/mL培养。以后隔天加入IL-2和1%～3%自体血浆。 (3) 第6～8天作细菌、真菌、病原体培养。 (4) 第10～14天细胞数达到6～8×109时经生理盐水洗3次, 加入1%人血白蛋白生理盐水中回输。一般分4～6次回输, 之前半小时予苯海拉明20mg肌内注射。

1.3 观察指标

近期疗效参照WHO实体瘤疗效评定标准。完全缓解 (CR) :肿瘤全部消失维持至少4周, 无新病灶出现;部分缓解 (PR) :肿瘤消退50%以上, 维持至少4周, 无新病灶出现;无变化 (NC) :肿瘤消退不足50%, 或增大25%以下;病变进展 (PD) :肿瘤增大25%以上, 或有新病灶出现。总有效率为CR+PR病例占可评价病例的百分数, 局部控制率为CR+PR+NC病例占占可评价病例的百分数。生存时间为开始治疗之日计算到患者死亡或最后一次随访止。在末次随访时仍存活者生存时间计算截尾值[3]994-997。

1.4 统计学处理

采用采用SPSS12.0统计软件进行数据分析, 组间比较采用χ2检验, 以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 近期疗效

联合治疗组患者临床症状均有不同程度缓解, 总有效率 (CR+PR) 明显好于对照组 (χ2=4.53, P<0.05) , 见表1。

2.2 中位生存期比较

联合治疗组为21个月, 对照组为13个月 (P<0.05) ;生存率比较:1年生存率分别为72.5%和47.5% (P<0.05) , 2年生存率分别为37.5%和22.5% (P>0.05) 。

2.3 不良反应情况

主要不良反应为放射性肺炎及放射性食管炎, 两组间不良反应无明显区别 (P>0.05) 。

3 讨论

注:与对照组比较, χ2=4.53, P<0.05

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一, 居各类肿瘤病死率之首。非小细胞肺癌 (NSCLC) 约占肺癌的75%～80%, 其中1/3的患者属于局部晚期Ⅲ期 (LA-NSCLC) , 其中约80%已失去手术时机。放射治疗对于局部晚期NSCLC是比较重要的手段之一, 但由于肿瘤内存在乏氧细胞, 使放射敏感性降低, 再加上肿瘤周围正常组织和器官 (食管、脊髓和肺) 照射剂量的限制, 无法继续增加放射剂量, 导致肺癌局控率降低, 影响生存率。

放疗的基本目标是提高治疗增益比, 即将放射剂量最大限度集中到病变区域内, 杀灭肿瘤细胞, 减少或避免周围正常组织器官不必要的照射[4]。3D-CRT技术较好的改善了肿瘤组织与周围正常器官的剂量关系, 使放射线剂量在三维方向上分布, 并与肿瘤靶区高度一致, 在对肿瘤组织放疗的同时, 最大限度保护周围正常器官, 减少局部复发率及并发症的发生。王颖杰等[5]通过对91例NSCLC患者进行适行放疗, 结果表明适行放疗效果明显优于常规放疗。

细胞因子诱导的杀伤细胞 (cytoking induced killer, CIK) 是将人外周血单个核细胞在体外通过多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞, 其效应细胞主要为CD3+CD+56细胞。该种细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子, 兼有T淋巴细胞的抗肿瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤的优点, 又被称为NK细胞样T淋巴细胞。CIK细胞可以识别肿瘤细胞, 并与肿瘤细胞直接接触释放颗粒酶B、穿孔素等直接杀伤肿瘤;同时CIK细胞表达Fas分子, 并通过Fas/FasL途径诱导细胞凋亡;CIK细胞可分泌TNF-α、IFN-γ等炎性细胞因子抑制肿瘤生长并激活免疫系统, 提高患者自身抗肿瘤能力[6]。

谢强等[7]研究表明放疗联合CIK明显提高鼻咽癌患者体内穿孔素和颗粒酶的水平, 为CIK联合放射治疗提供了实验室依据。本组研究结果显示3D-CRT联合CIK治疗局部晚期非小细胞肺癌近期疗效较好, 有效率为77.5%, 明显优于单独三维适行放疗组。在中位生存期、1年生存率, 联合治疗组均明显优于对照组, 且没有增加不良反应。因此, 3D-CRT联合CIK是一种治疗局部晚期非小细胞肺癌的较好方法。

参考文献

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三维细胞培养 篇5

1 材料与方法

1.1 材料

海藻酸钠、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶(Sigma,USA),明胶(河北衡水市绿岛明胶有限公司),H-DMEM培养液(Gibco,USA),胎牛血清(杭州四季青公司)。

1.2 方法

1.2.1 兔耳软骨细胞的分离、培养

4周龄新西兰兔(解放军总医院实验动物中心),耳缘静脉注射空气处死。无菌条件下取兔双耳廓软骨,剥去皮肤及软骨膜,将软骨剪碎,PBS液(含青霉素200U/ml,链霉素200mg/ml)漂洗3遍后,用2.5g/LⅡ型胶原酶在37℃摇床中消化11～13h,滤网过滤后,1 000r/min离心5min,弃上清,用无血清DMEM培养基漂洗3遍后,移入培养瓶中,加入含10%FBS的DMEM培养液置细胞培养箱中常规培养。收集3代前软骨细胞备用。

1.2.2 细胞-基质混合材料的制备

将4%海藻酸钠与20%明胶溶液高温间歇灭菌后,按体积比1∶1与软骨细胞充分混合均匀[2],细胞终密度为3.0×107/ml[3]。

1.2.3 软骨组织前体的组装

组装过程采用清华大学机械系激光快速成形中心研制的细胞三维受控组装机Ⅰ代(图1)完成。将细胞-基质混合物放入4℃冰箱预交联15～20min后,取0.5ml注入容积为1ml的喷腔内。采用步进电机驱动柱塞挤出的成形方法,成形室温度在6～15℃之间时,将材料喷出在载有灭菌玻璃底板的三维微动平台后拉成线状,在具有层片信息的CAD模型直接驱动下,形成不同的层面。不同的层面之间再层层交错叠加粘接[4],形成10mm×10mm×5mm大小,孔径为500μm,孔隙率达90%以上的三维结构体(图2),即软骨组织前体。最后用无菌的2%CaCl2溶液交联5min,再用PBS溶液冲洗3遍,DMEM培养液冲洗1遍后,置六孔板中,用高糖DMEM培养液常规体外培养,隔天换液并定期观察。1.2.4取材与观察分别在体外培养1、2、3、4周时取材做冷冻切片(5μm),进行HE及甲苯胺蓝染色,观察组装的软骨组织前体内的细胞生长及成熟情况。

2 结果

2.1 大体观察

刚组装成形的软骨组织前体为半透明状(图3),台盼蓝染色表明细胞存活率达90%以上,细胞在结构体内呈透亮圆球形均匀分布。体外培养1d后观察:细胞在结构体内增殖、迁移并聚集成团,可见处于分裂相的细胞。结构体孔隙四周的软骨细胞分裂、聚集尤其明显,可能是因为孔隙四周的细胞与培养液充分接触的原因。从水凝胶支架材料中游离出的细胞在培养板底部贴壁伸展呈多角形或椭圆形。随着细胞的增殖,结构体的透明度降低,体外培养4周时,结构体呈淡黄色。倒置显微镜下观察,结构体内的细胞多以细胞聚集团的形式充斥于结构体内。结构体的弹性增强,而强度明显减弱,结构体的孔隙有变圆变小的趋势,可能是由于水凝胶支架在培养液中的溶胀引起的。

2.2 组织学观察

软骨组织前体体外培养1周,HE染色显示有软骨组织形成,甲苯胺蓝染色显示有少量软骨基质形成(图4)。体外培养4周,HE染色显示软骨细胞位于陷窝中并有软骨基质形成(图5),甲苯胺蓝染色显示有大量软骨基质形成(图6)。

3 讨论

20世纪末,出现了细胞间接受控组装技术,即在已成形支架上种植细胞的组织工程[5]。近年来,基于细胞直接三维受控组装技术构建器官的研究成为热点[2,6]。本实验就是采用这种三维受控组装技术寻求构建组织工程软骨的新方法。与传统的组织工程技术相比,此种技术有3个显著优点:(1)细胞在支架材料中均匀分布。传统的组织工程,细胞只能在支架表面黏附生长,很难进入支架材料的内部;近年来出现的可注射软骨组织工程,虽能做到细胞的均匀分布,却无法兼顾到支架的三维多孔及高孔隙率。(2)制造复杂形状方面柔性高。通过模型软件设计和修改参数,可构建出更大更厚的软骨组织前体及复杂精细的形状。(3)结构体的孔隙尺寸和相互贯通性可以得到很好的控制,有利于细胞营养和新陈代谢物质的交换。通过设计和调整喷头,可以实现多种细胞的定点排布[5]。

海藻酸钠和明胶均属水凝胶类基质材料。水凝胶材料的温敏性,海藻酸钠与二价Ca离子交换形成三维多孔支架结构的特性,令其是应用三维受控组装的理想支架材料。

本实验结果表明,由细胞直接三维受控组装技术构建的软骨组织前体在体外培养可达4周甚至更长时间,且保持细胞活力与软骨细胞表型,细胞增殖显著,在本实验植入结构体中的细胞量并不大(3.0×107/ml)的情况下,在体外培养4周时,即有大量软骨基质形成并可见软骨陷窝。说明细胞直接三维受控组装技术是一种很具潜力的构建组织工程化软骨的技术,为将来的软骨组织缺损修复提供了新途径。但也有不足之处,即所构建的软骨结构体强度较弱,这个问题的解决可从增强支架材料和寻找更有效的交联剂、交联方法入手。

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三维细胞培养 篇6

目前主要的体外细胞培养体系有平面培养和三维培养两种培养体系。三维培养体系因生长方式更接近体内细胞, 所以比平面培养体系更能够模拟复杂的体内细胞微环境[1]。壳聚糖是一种天然多聚糖, 与粘多糖 (glycosaminoglycans, GAG) 结构相似, 可以为细胞提供支架以供细胞附着和生长, 更为重要的是, 以壳聚糖为原料制作的多孔支架价格低廉并可以应用于不同规格的培养皿或孔板[2]。

本次实验的目的是构建上皮细胞三维培养网络。出于该目的, 我们构建了人肾小管上皮细胞培养系统, 为了对该系统中细胞形态和生长状况进行评估, 我们用电子显微镜观察该系统培养细胞的形态变化, 用Annexin V/PI双染法分析三维和二维培养细胞的凋亡情况。

1 材料和方法

1.1 材料

人肾小管上皮细胞系HRPTEpi C及其配套上皮细胞培养基Epi CM购自美国Sciencell公司。该培养基为每500ml基础培养基含10ml胎牛血清、5ml上皮细胞生长补充物质以及5ml青霉素链霉素溶液。胰酶购自吉诺生物医药技术有限公司。壳聚糖、明胶和乙基二甲基胺丙基碳化二亚胺 (N-ethyl-N- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride, EDAC) 购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 人肾小管上皮细胞二维和三维培养

二维培养时, 将细胞置于5%CO2、37℃培养箱中培养, 每2d用0.25%胰酶 (吉诺生物医药技术有限公司) 消化传代。三维培养时, 用0.25%的胰酶消化细胞, 收集后用上皮细胞培养基重悬, 以1×105/孔的密度种植在24孔板内或预先放置三维培养支架的24孔板内, 每2d更换培养液, 并对不同培养天数的细胞形态进行后续的观察和检测。

1.2.23D支架合成的步骤简要叙述如下[3]

根据Natália M.Breyner等的研究, 按以下步骤合成3D支架。室温下将壳聚糖和明胶 (1.4%) 溶于0.1mol/L乙酸, 1.4%壳聚糖溶液与1%EDAC发生交联, 形成以壳聚糖为基础的3D支架。将明胶按照1:1的比例加入, 从而得到壳聚糖/明胶为基础的3D支架。将该支架置于室温4h后放入-20℃过夜, 之后置于冻干机 (德国CHRIST, ALPHA1-2LD plus) 内冻干20h。冻干的支架在4℃与0.1%EDAC再交联2h后, 冻干24h。最后, 在24孔培养板 (购于美国Costar公司) 中形成10mm×16mm的3D细胞培养支架。

1.2.3 扫描电镜观察

用扫描电镜 (Scanning electron microscopy, SEM) 观察支架形态和结构。样品处理及照片拍摄均于复旦大学上海医学院电镜室完成, 使用扫描电子显微镜S-520。样品处理简要概括如下:用2.5%戊二醛前固定24h (放入0~4℃冰箱中) 后, 乙醇系列30%→50%→70%→85%→95%→100% (2次) 逐级脱水, 再经中间液代换、临界点干燥、粘贴样品及离子贱射镀膜后入镜观察。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡情况

将肾小管上皮细胞在壳聚糖/明胶3D支架或二维培养系统培养9d, 分别用胰酶消化成单个细胞, 收集后, 进行Annexin V和PI染色, 用配备激发光波长488nm的BD FACS AriaⅡ流式细胞分选仪检测, 用流式分析软件Flowjo7.6分析检测结果。

1.2.5 统计学分析

所有实验各组均设3个平行壳聚糖/明胶3D培养, 每个实验至少重复3次, 应用SPSS 13.0软件处理, 数据用x珋±s表示, 两组间比较采用t检验, 组间比较采用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖/明胶3D支架的超微结构

电镜观察壳聚糖/明胶3D支架的超微结构并拍摄图片如图1所示。该支架具有高度的多孔性, 孔洞的形状和位置不规则, 大小随机。这种高度多孔性的结构可以促进细胞生长和增殖。

A, B:电镜下壳聚糖/明胶3D支架的结构 (A, ×200;B, ×500) 。A and B:SEM images of a 3D chitosan/gelatin scaffold showing a porous structure (A, ×200;B, ×500) .

2.2 壳聚糖/明胶3D支架培养的肾小管上皮细胞形态

电镜观察接种于壳聚糖/明胶3D支架后, 细胞的黏附情况, 图2显示了电镜观察的培养1d和2d的肾小管上皮细胞的贴壁情况以及细胞形态。细胞接种于壳聚糖/明胶3D支架1d, 可见细胞黏附在支架表面, 折光性好, 细胞伸出短小的突起, 通过突起黏附于支架表面, 胞体大, 成球形。培养2d后, 可见细胞黏附在支架表面, 折光性好, 细胞伸出多个细长或短小的突起, 突起较第1d增多, 胞体大, 成球形。

2.3 壳聚糖/明胶3D支架对肾小管上皮细胞增殖的影响

3d、6d和9d的肾小管上皮细胞的形态并拍摄图片如图2所示。图3分别显示了电镜观察培养3d、6d和9d的肾小管上皮细胞的贴壁情况以及细胞形态。肾小管管上皮细胞种植在壳聚糖/明胶3D支架内部第3d, 可见大多数细胞存活, 呈圆形, 细胞伸出突起, 折光性较好。第6d, 支架内细胞密度增加明显, 折光性相对较好, 偶见扁平形细胞, 细胞体积相对较大。第9d, 支架内细胞密度更高, 折光性较好, 可见扁平形细胞, 大多数细胞伸出细长或短的突起, 通过这些突起附着于支架表面。随培养时间延长, 该3D支架培养下的细胞形态无明显改变。

2.4 三维和二维培养系统培养的肾小管上皮细胞凋亡情况的比较

Annexin V和PI双染, 流式细胞仪检测壳聚糖/明胶3D支架培养的肾小管上皮细胞的细胞凋亡情况。结果显示, 三维培养早期凋亡率为2.53%, 与二维培养 (3.26%) 相比, 早期自发凋亡细胞比例显著减少 (P<0.05) ;三维培养晚期凋亡率为1.81%, 与二维培养 (2.61%) 相比, 晚期凋亡细胞比例也减少, 但差异无统计学意义 (P>0.05) 。

A:普通显微镜下二维培养的人肾小管上皮细胞的形态 (×100) ;B、C:电镜下人肾小管上皮细胞分别在壳聚糖/明胶3D支架培养1d (×1 000) 、2d (×1 200) 的生长情况。A:HRPTCs in monolayer culture;B and C:SEM images of HRPTCs cultured in 3D chitosan/gelatin scaffolds for 1 day and 2 days, respectively.

A、B、C:人肾小管上皮细胞分别在壳聚糖/明胶3D支架培养3d、6d和9d的生长情况 (×500) 。A, B and C:SEM images of HRPTCs cultured in 3D chitosan/gelatin scaffolds for 3 days, 6 days and 9 days, respectively.

3 讨论

组织工程是是一个跨学科的领域。它应用工程学和生命科学的方法研究用以保持或者增强组织或者器官功能的生物替代物。该领域的方法之一是基于构建支架用于细胞支持, 将细胞种植在该支架内进行体外培养, 并最终培养成为可用于移植的组织[4,5]。

天然或人工合成的多分子聚合物已作为生长支架应用于组织工程学[2]。许多研究提出将双层骨支架应用于促进软骨缺陷的再生[6]。这些研究均基于以三维多孔结构作为支架支持, 并已用于研究骨细胞重构和软骨细胞修复[7]。

壳聚糖已被用于研究骨、软骨和干细胞等组织工程三维支架[2,8]。虽然明胶自身的机械稳定性较差, 降解迅速, 当其与壳聚糖交联后, 其稳定性增加, 从而可以用于软骨组织工程的支架[9]。3D壳聚糖支架培养MSC的实验说明MSC粘着于壳聚糖基质能够促进细胞分化[10]。与平面培养相比, 3D培养系统的优势之一是巨大的面积/体积比例, 能够显著增加细胞与培养系统的接触[11,12]。除了促进MSC分化, 有研究表明, 壳聚糖可以促进软骨细胞分化, 如形态变圆, 表达软骨基质分子包括Ⅱ型胶原等[13]。

A、B:流式图显示人肾小管上皮细胞分别在二维培养系统和壳聚糖/明胶3D支架培养9d的细胞凋亡情况;C、D:对人肾小管上皮细胞分别在壳聚糖/明胶3D支架和二维培养系统培养9d的细胞凋亡情况进行统计分析, n=3, *P<0.05。HRPTCs were cultured in a 3D chitosan-based scaffold for 9 days.Cell viability were measured by Annexin V/PI staining.A and B:representative pictures of apoptosis during HRPTCs cultured in 2D culture system and 3D chitosan-based scaffold.C and D:The analysis of early or late stage of apoptosis of HRPTCs cultured in 2D culture system and 3D chitosan-based scaffold.Results are presented as the mean±SD of triplicates from three experiments.*P<0.05 compared to controls.

应用壳聚糖/明胶共同合成支架的主要目的是促进两种物质的机械稳定性, 模拟细胞生长的自然状态[14]。有研究表明, 壳聚糖-明胶支架显著促进总胶原的产生, 并促进分化的MSC产生Ⅱ型胶原, 从而促进分化, 基质重构, 并促进细胞存活[3]。与之类似, 有研究表明, 培养环境和地塞米松是促进小鼠胚胎干细胞软骨形成和Ⅱ型胶原分泌的因素[14]。

三维细胞培养 篇7

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择本院2007年7月~2014年7月期间收治的肺癌患者224例, 不适于或拒绝手术治疗的Ⅰ~Ⅳ期NSCLC患者, 男168例, 女56例, 年龄41~79岁, 中位年龄58岁, 卡氏评分≥70分, 所有病例均由明确的病理学或细胞学证实。其中鳞癌126例, 腺癌63例, 其他类型35例, 中心型肺癌140例, 周围型肺癌84例, TNM肿瘤分期Ⅰ期7例, Ⅱ期56例, Ⅲ期126例, Ⅳ期35例。

1.2 治疗方法

1.2.1 体位固定

患者取仰卧位, 双手上举交叉置于额顶, 真空负压垫固定体位。

1.2.2 CT扫描

患者在体模固定下行增强CT扫描, 扫描层间距为5 mm, 扫描范围上至环状软骨, 下至肾上腺。

1.2.3 图像重建及靶区勾画

将定位CT所得图象信息传输至TPS系统, 三维重建患者体廓及各重要组织器官信息。GTV (大体靶体积:模拟定位CT上显示的病变) 由医生在CT图像上逐层确认并勾画。在肺窗上勾画肺部肿瘤靶体积;在纵隔窗上勾画纵隔肿瘤靶体积, 当纵隔淋巴结阳性时, GTV勾画包括同侧肺门淋巴结。GTV外放5 mm为CTV (临床靶体积) , CTV外放5 mm为PTV (计划靶体积) 。

1.2.4 放疗计划设计

根据临床剂量学原则采用共面野和或非共面野, 所有病例采用3~6个野;用剂量体积直方图 (DVH) 综合评估肿瘤及危及器官的剂量分布, V20≤25%, 脊髓最大受照剂量<40 Gy, 食管最大受照剂量<50 Gy, 心脏平均受照剂量≤35 Gy。90%剂量线包绕PTV周边, 治疗区与PTV三维适形, 内剂量分布均匀, 以6MV-X线实施放疗, 单次分割剂量4~9 Gy, 5~10次不等, 隔日1次, DT中位剂量为45~64 Gy。

1.2.5 治疗计划的实施

采用多叶光栅或整体挡铅技术, 6MV-X线实施放疗。

1.3 随访及评价指标[3]

治疗结束后2年内3个月复查1次, 2年后半年复查1次。随访内容包括病情发展转归及化验检查 (肿瘤标记物、肺及其他部位的CT扫描等) 。

近期疗效按世界卫生组织 (WHO) 实体瘤近期疗效评价标准评定:CR为肿瘤完全消失;PR为肿瘤消退≥50%且无新病灶出现;SD为肿瘤无变化, 消退<50%或增大≤25%;PD为肿瘤增大>25%或新病灶出现。评价指标包括局部控制率及生存率。放疗的毒副反应参照美国肿瘤放射治疗协作组织 (RTOG) 放射损伤评价标准评价正常组织急性放疗反应 (自放疗开始90 d内出现的放疗反应) 。

1.4 统计学方法

采用SPSS19.0统计学软件包进行统计处理, 应用Kaplan-Meier法进行生存分析。计数资料用率 (%) 表示, 采用χ2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 随访

全部患者随访至年月, 随访时间24~48个月, 失访8例, 随访率96%。大分割三维适行放疗见图1。

2.2 近期疗效

完全缓解19.6% (44/224) , 部分缓解47.8% (107/224) , 稳定29.5% (66/224) , 进展3.1% (7/224) 。有效率67.4% (151/224) 。

2.3 局部控制率和生存率 (OS)

1、2年局部控制率分别为79%和58%, 1、2年生存率分别为81%和49%, 中位生存期24个月。

2.4 不良反应

急性食管反应1级30例, 2级9例;急性放射性肺炎1级11例;晚期反应中1级食管狭窄1例, 经对症治疗后均缓解并未影响疗效。无放射性脊髓炎和肺纤维化, 无放射性心脏损伤。

2.5 死亡

死亡28例, 死亡原因主要是局部复发和远处转移。其中18例复发, 7例远处转移, 3例复发并转移。

3 讨论

近年来NSCLC发病率和病死率日益上升, 虽然肺癌的治疗技术发展迅速, 但疗效并不理想, 5年生存率仅为5%~42%[4]。部分早期NSCLC患者可通过手术治疗, 对于不能手术或拒绝手术的早期患者、中晚期患者, 放疗是首选的治疗手段, 如何改进放疗技术也成为研究热点。既往常规放疗具有一定的局限性, 常规治疗NSCLC的生物效应剂量 (BED) 为60~70 Gy, 放疗时间超过9周。大量临床研究证明[5], 60~70 Gy的常规放疗剂量获得肿瘤的局控率 (30个月无肿瘤复发) 15%~25%, 5年生存率不到10%, 如要达到50%~80%局控率, 原发灶<3 cm需65 Gy以上剂量, 原发灶>5 cm时需80~100 Gy, 由于肺组织及其他重要器官耐受剂量的限制, 在传统放疗中, 肿瘤区难以达到如此高的照射剂量。且有研究统计[2]:放疗疗程若超过6周之后, 每延长1 d生存率可能将下降1.6%。如此不但增加了患者身体、心理及经济负担, 而且为肿瘤细胞的恶性克隆创造了条件。

为改善放疗计划最大程度的提高放疗的治疗率及精确率, 采用大分割放疗 (单次放疗剂量超过2.5 Gy) , 缩短治疗时间, 使大剂量放射线短时间内聚焦于靶区, 加强对肿瘤的杀伤力, 有效快速灭活肿瘤组织, 减少肿瘤细胞再增殖从而改善放疗效果[6]。近年发展起来的三维适形放射治疗 (3DCRT) 是一种高精度的放疗措施, 它利用CT图像重建虚拟三维肿瘤结构, 放疗实施过程中针对靶区在不同方向设置不同照射野, 采用与病灶形状一致的适形挡铅, 使得病灶周围正常组织的受量降低的同时, 高剂量区的分布形状在三维方向上与靶区形状一致, 从而改善放疗的精确性。随着精确放射治疗3DCRT及立体定向放疗 (IMRT) 技术的成熟, 该技术已逐步成为放射治疗的主流技术应用于多种肿瘤[7,8]。

本研究针对本院224例运用3DCRT大剂量分割放疗治疗NSCLC患者的临床资料进行回顾性分析并随访, 统计后提示全部患者完成治疗, 并取得了较好的近期疗效。放疗计划设计中采用LQ模型公式计算处方剂量, 在三维重建结构上对照射效果进行全面评估并进行适当改进, 对于较小的周围型肿块, 设计单次剂量4~9 Gy/次;对于较大的中央型肿块, 为保护的功能较大的支气管防止支气管黏膜功能丧失等严重并发症, 每次剂量<6 Gy。放疗过程中尽量保证定位、摆位的精确性, 减少人为误差。本研究结果提示大分割放疗患者1、2年局部控制率分别为79%和58%, 1、2年生存率分别为81%和49%, 中位生存期23个月;既往有研究得出, 常规分割放疗1、2年生存率分别为60%和45%, 中位生存期19个月。相比之下, 三维适形大分割放疗提高了患者短期疗效及长期生存率。

在放疗技术中, 放射性副反应的发生, 直接制约着疗效和患者生存率、生活质量, 限制了放射治疗剂量的提高。肺、食管组织对放射线敏感, 其放射性的副作用并不与受照射体积成正比例。食管尤甚, 即使食管受到的高剂量照射体积仅有1 m3, 亦可能出现严重的放射性损伤, 是限制胸部肿瘤放疗剂量提高的主要器官[9], 所以必须注意食道的保护。本临床试验暗示了大分割放疗的高度安全性, 在整个研究过程中没有发生治疗相关的死亡, 主要毒性观察包括放射性食管炎及放射性肺炎, 放射性食管炎发生率达84.6%, 在本研究中, 因为利用累及野照射技术与不施用选择性淋巴结照射, 放射性食管炎主要是1级或2级, 观察到的放射性肺炎均为1级, 对放疗耐受不良事件行对症治疗后并没有影响放射治疗方案的实施。

三维适形大分割放疗治疗非小细胞肺癌, 提高了短期疗效及生存率, 在不增加放射不良反应的前提下, 明显提高肿瘤的杀伤效应, 提高肺癌的治疗效益比, 是一种安全有效的治疗手段。

摘要：目的 分析大分割三维适形放疗治疗非小细胞肺癌 (NSCLC) 的疗效。方法 224例非小细胞肺癌患者, 给予大分割三维适形放疗, 剂量49 Gy, 510次不等, 隔日1次, DT中位剂量为4564 Gy。结果 224例患者总有效率 (CR+PR) 为67.3%, 1、2年局部控制率分别为79%和58%, 1、2年生存率分别为81%和49%, 中位生存期24个月。毒副反应为急性放射性食管炎39例, 急性放射性肺炎11例。结论 对于拒绝手术的非小细胞肺癌给予大分割三维适形放疗是有效的, 毒副反应可以接受。

关键词：大分割,三维适形放疗,非小细胞肺癌

参考文献

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