纤维细胞细胞（共12篇）
纤维细胞细胞 篇1
成纤维细胞是结缔组织中最主要的细胞类型, 具有较强的分裂增生能力, 适应性强, 性状稳定, 是容易培养的动物细胞类型之一, 在生物学、医学、药理学及生物工程等研究中应用广泛, 起着重要的作用。成纤维细胞是常用的体细胞核移植技术的供体细胞[1,2], 体细胞克隆技术在动物育种、制备转基因动物、基因治疗和器官移植等方面具有重大的作用和广阔的应用前景。体细胞已经逐渐成为重要的畜禽品种资源, 通过构建濒危畜禽品种细胞库的途径保存其种质资源, 是目前最为理想的方法之一[3]。成纤维细胞的体外培养可作为体外细胞模型, 用于研究细胞因子对其功能的调控作用。近年来, 由体细胞直接重构为诱导性多能干细胞 (i PS细胞) 技术[4]的研究正在兴起。成纤维细胞成为i PS细胞研究的主要体细胞来源, 不仅为i PS细胞技术的研究提供种子细胞, 而且也可作为干细胞培养的饲养层, 从而建立完全无动物源性的干细胞培养系统[5]。
建立稳定、高效、易操作的成纤维细胞培养方法是开展各项研究的基础。猪器官的组织结构和生理生化特性与人类相近, 利用克隆转基因技术生产经遗传修饰的克隆猪, 可作为异种器官移植的供体, 因此猪成纤维细胞的培养具有更深远的意义。关于猪成纤维细胞培养方法的报道较多[6,7,8];但因试验条件、品种、取样部位的不同, 采用的方法不尽相同, 且对不同组织成纤维细胞培养方法比较的报道较少。本研究采用不同的培养方法, 培养了猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞, 对比培养效果, 旨在筛选出最佳的培养方法, 现报道如下。
1 材料
卡那霉素、青霉素、链霉素、DMEM/F12培养基、血清, 购自Gibco公司;胰酶、配制PBS所用的试剂, 购自Sigma公司;台盼蓝、EDTA、DMSO, Amresco公司产品;细胞培养所用的耗材, JET BIOFIL (广州) 公司产品。
2 方法
2.1 样品的采集及处理
猪胎儿采自昆明某屠宰场。把妊娠约30 d的猪胎儿 (约3 cm长) 连带一段子宫浸泡在PBS (含有50μg/m L卡那霉素、100 IU/m L青霉素和100μg/m L链霉素) 中, 立即带回实验室。剪开子宫壁和胎膜, 取出胎儿, 移入超净工作台 (型号为BCM-1300A, AIRTECH公司生产) , 用镊子去除胎儿头、尾、四肢、心脏及其他脏器, 用PBS清洗后用眼科剪将胚胎充分剪碎, 用PBS冲洗几次, 备用。
猪耳皮肤采自版纳微型猪。尽量挑选猪耳组织上血管较细少的部位, 用乙醇擦拭消毒, 剪下一小块猪耳组织, 将组织块放入PBS (含有50μg/m L卡那霉素、100 IU/m L青霉素、100μg/m L链霉素) 中, 立即带回实验室。在超净工作台上, 将猪耳组织块浸入75%乙醇10 s, 然后置于无菌培养皿中, 用眼科剪剪去毛, 再用PBS清洗5~10次, 然后剪成1~2 mm3的小块, 备用。
2.2 培养
2.2.1 胰酶热消化法
向剪碎的组织块中加入约2倍组织块体积的37℃预温的0.25%胰酶-0.04%EDTA, 在37℃培养箱 (Thermo) 中消化1 h (期间有规律地摇晃几次, 以充分消化) ;加入DMEM/F12培养液 (含10%FBS) 终止消化;取上清液, 以800 r/min离心5 min;弃上清液, 然后加入培养液, 轻轻吹打重新悬浮细胞, 以5×104/m L的密度接种于培养瓶中, 利用台盼蓝染色法计算细胞存活率。
2.2.2 胰酶冷热结合消化法
向剪碎的组织块中加入少量0.25%胰酶-0.04%EDTA, 置于4℃冰箱中冷消化3~4 h;在37℃培养箱中消化30~60 min;终止消化, 收集细胞, 离心, 重悬细胞, 培养并计数。
2.2.3 胰酶室温消化法
在组织块中加入室温的0.25%胰酶-0.04%EDTA, 在室温条件下, 置于摇床上消化1~2 h;终止消化, 收集细胞, 离心, 重悬细胞, 培养并计数。
2.2.4 组织块培养法
将组织块剪碎后, 加入37℃预温的DMEM/F12培养液, 转移至50 m L培养瓶内, 并均匀铺开, 吸去多余的培养液, 放入培养箱, 使组织块充分吸附于瓶底, 5 h后再加入37℃预温的DMEM/F12培养液, 24~48 h后观察组织块旁细胞生长情况。
2.3 成纤维细胞的传代、培养与纯化
细胞形成细胞单层 (80%~90%汇合) 时进行传代培养。在传代过程中成纤维细胞被纯化, 用PBS冲洗3次, 去除血清和脱落的组织块及死细胞, 加入1~2 m L 0.25%胰酶-0.04%EDTA, 显微镜下观察, 细胞收缩变圆时倒掉消化液, 加入含10%血清的DMEM/F12终止消化。轻敲瓶底, 用吸管反复吹打培养瓶瓶壁, 使成纤维细胞脱落, 并把细胞团分散为单细胞, 分瓶继续培养。
2.4 成纤维细胞生长曲线的绘制
选择生长状态良好的成纤维细胞, 用常规消化法消化, 制成细胞悬液, 计数;再以1×104/m L密度接种于24孔培养板, 于37℃、5%CO2的培养箱中培养。从接种时间算起, 每天对3个孔中的细胞进行计数, 算出平均值。以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标绘制生长曲线。
2.5 成纤维细胞的冻存、复苏
冻存:常规消化, 计算冻存细胞数量, 收集细胞, 弃去上清液, 用冻存液 (70%DMEM+20%FBS+10%DMSO) 调节细胞密度为1×106/m L, 分装于冻存管中。将冷冻管放入细胞程序冷冻盒 (型号为5100-0001, NALGENE公司生产) , 置于超低温冰箱冷冻2~3 h, 然后转入液氮罐中长期保存。
复苏:从液氮中取出冻存管, 立即放入38℃温水中并不停搅动, 令其快速解冻。将细胞悬液移入离心管中, 加入DMEM/F12培养液5 m L, 800 r/min离心5 min;弃上清液, 加入培养液, 充分吹打, 利用台盼蓝染色法计算复苏率。以5×104/m L的密度接种于培养瓶, 放入37℃、5%CO2的培养箱中培养, 观察。
3 结果与分析
3.1 不同培养方法的培养效果
猪胎儿成纤维细胞原代培养分别采用了胰酶热消化法、胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法和组织块培养法, 其中胰酶热消化法解离细胞量多, 但细胞存活率显著地低于胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法 (P<0.05) , 且细胞贴壁效果较差;与胰酶冷热结合消化法相比, 胰酶室温消化法所获得的细胞量略少, 但细胞存活率显著提高 (P<0.05) , 且贴壁效果也较好, 所得到的细胞透明度好, 细胞内颗粒少, 立体感强, 界限明显, 而且胰酶室温消化法操作简单, 操作时间短, 不用反复离开操作台, 减少污染的可能性;组织块培养法培养所需要的时间长, 1~2 d游离出少量细胞, 7 d可生长出大量细胞。综上所述, 胰酶室温消化法操作简单, 细胞培养效果好, 是猪胎儿成纤维细胞较好的培养方法。
注:同列数据肩标小写字母不同表示差异显著 (P<0.05) 。
在猪耳皮肤成纤维细胞原代培养中, 胰酶热消化法和胰酶室温消化法分离的细胞数量少, 组织块几乎不能被分离;胰酶冷热结合消化法在冷处理时, 胰酶可充分与组织接触, 对细胞的伤害也小一些, 所得的细胞较胰酶热消化法和胰酶室温消化法多, 可培养成功;组织块培养法所需的组织量少, 6~12 h部分组织块可贴壁, 2~3 d大部分组织块贴壁, 并游离出个别成纤维细胞, 细胞生长很快, 逐渐向周围铺开, 长成单层。10 d左右连生, 并铺满瓶底 (见180页彩图1) 。鉴于新生猪耳皮肤组织可供的试验取材量少, 且耳皮肤组织比猪胎儿难消化, 在4种方法中组织块培养法是猪耳皮肤成纤维细胞原代培养的理想培养方法。
3.2 成纤维细胞传代、培养与纯化
试验中培养的细胞经原代培养长成单层并铺满瓶底时进行传代。传代几次后生长状态基本相似, 生长繁殖旺盛, 4~5 d即可长满, 继续传代。所培养的细胞呈梭形、多角形等, 为典型的成纤维细胞形态, 胞质近中央处有椭圆形胞核, 核仁清晰可见。但仍然可见到上皮样细胞 (呈星型或三角状) 、神经细胞、游走型细胞。这些杂细胞会在反复传代过程中被逐渐淘汰。随着培养时间的延长, 整个细胞群体呈现火焰状和旋涡状, 成群细胞呈现放射状、漩涡状等走行形式。
3.3 成纤维细胞生长曲线
试验绘制出细胞生长曲线, 为掌握细胞传代周期提供参考。接种后第1天细胞计数略微下降, 2~4 d为缓慢生长期, 5~6 d细胞开始加速生长, 7~8 d细胞成倍增长 (为细胞对数期) , 8 d以后细胞转为缓慢增长, 为细胞增长平台期 (见图2) 。
3.4 成纤维细胞的冻存、复苏
试验采用的冻存方法得到的细胞复苏率在85%以上, 可满足试验要求。细胞复苏后贴壁很快, 24 h后观察已有半数细胞呈现梭形或三角形, 细胞生长状态与冻存前相同, 为典型的成纤维细胞状态。4~5 d已基本汇合成单层并铺满培养瓶底部。
4 讨论
提高细胞在体外培养的成功率和效率是细胞培养试验工作的首要问题。动物细胞的培养方法主要有2种, 即组织块培养法和酶消化法。组织块培养法简单方便, 虽获得传代细胞需较长的时间, 收获的细胞量不大, 但长出的细胞比较整齐且便于选择, 培养动物皮肤成纤维细胞常用此法。体外培养中最常用的消化酶是胰酶。胰酶是一种能够破坏基质和黏附蛋白的蛋白水解酶, 容易破坏以单层方式生长的细胞所分泌的细胞外基质和黏附蛋白;因此必须严格控制酶浓度、作用时间长短以及酶处理温度, 并且要根据不同的组织选择合适的细胞分离方法。本试验分别采用胰酶热消化法、胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法和组织块培养法培养猪胎儿成纤维细胞和猪耳皮肤成纤维细胞, 以筛选合适的原代细胞分离方法。试验中发现, 采用常规的胰酶消化法对猪胎儿组织进行分离与培养时, 分离效果良好, 传代细胞与原代细胞在形态上无明显差异。但是采用胰酶热处理法处理猪耳皮肤成纤维细胞时, 发现细胞分离效果差, 得到的细胞量少, 难以继续培养, 其原因是耳皮肤表皮上有角质, 结缔组织多, 比胎儿组织难消化。
不同消化方法对细胞贴壁和生长增殖有明显影响。试验对常规的胰酶热消化法进行改进, 对比了胰酶热消化法、胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法获得细胞的存活率和细胞贴壁情况。在猪胎儿成纤维细胞培养中, 胰酶热消化法解离细胞多, 但细胞存活率显著低于胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法 (P<0.05) , 且细胞贴壁效果也差一些。于珠玲等[8]的研究也表明, 胰酶冷热结合消化法的细胞存活率明显高于胰酶热处理法, 胰酶冷热结合消化法对细胞的损伤较少。孙兴参等[9]的研究也认为, 室温消化法与常规的热消化法相比, 是一种能够获得高成活率、高收获量、细胞形态和生长状况良好的胎儿成纤维细胞培养方法, 与本研究结果一致。本试验中室温消化法所获得的细胞量略少于胰酶冷热结合消化法, 但细胞存活率显著提高 (P<0.05) , 且贴壁效果也较好, 得到的细胞透明度好, 细胞内颗粒少, 立体感强, 界限明显。由此可见, 在4种培养方法中, 胰酶室温消化法最适合于猪胎儿成纤维细胞的原代培养。
猪耳皮肤成纤维细胞最好采用组织块培养法。胰酶消化法得到的细胞数量少, 组织块几乎不能被分离;胰酶冷热结合消化法所得到的细胞比其他两种消化法多, 冷处理时胰酶可充分与组织接触, 对细胞的伤害也小一些, 可培养成功。组织块培养法需要的组织量少, 操作简便, 易于掌握, 10天左右爬片细胞就可以铺满瓶底。鉴于新生猪耳皮肤组织可供的试验取材量少, 且耳皮肤组织比猪胎儿难消化, 在4种方法中组织块培养法是猪耳皮肤成纤维细胞原代培养的理想培养方法。丁生财等[7]的研究也表明, 组织块培养法培养猪皮肤成纤维细胞的效果优于胰酶消化法。一些研究均采用了组织培养块法培养不同物种的耳皮肤成纤维细胞[10,11]。
胰酶和胶原酶是消化、分离动物组织的常用酶。胰酶常用于消化细胞间质较少的软组织, 是源于胰腺的蛋白水解酶, 不仅消化力强, 残留酶活性很容易用血清中和, 且对组织的消化较彻底, 但对细胞的损伤较大。胶原酶是从细菌中提取的酶, 在pH值为6.5~7.8的范围内都有活性, 且其活性不依赖于Ca2+、Mg2+, 也不受血清影响, 虽然对组织的消化不完全, 但对细胞损伤小。本试验未采用胶原酶处理组织, 有待于进一步研究。
无论是用消化分散的单细胞培养还是组织块培养, 混合生长的原代细胞都有多种细胞类型, 大多是上皮细胞与成纤维样细胞的混合物。组织培养初期, 由于细胞仍基于原组织生长, 还保持着较强的增生能力, 因此组织块周围首先移出的是上皮样细胞。成纤维细胞在体外生存能力强, 生长速度快, 3~4 d后呈优势生长。上皮细胞与成纤维细胞分区生长, 这一特征与牛、人、山羊皮肤组织细胞的体外生长特征相似[12]。成纤维细胞较上皮细胞贴壁快, 对胰酶的敏感性高, 容易消化脱落, 依据这一特征收集不同消化时间的细胞, 经多次选择传代, 可纯化成纤维细胞。本研究也采用该方法得到了纯化的猪胎儿成纤维细胞和猪耳皮肤成纤维细胞。
由生长曲线可以看出, 成纤维细胞在离体培养条件下的生长曲线呈“S”型, 与杨素芳等[6]得到的广西巴马香猪、丁生财等[7]得到的贵州小香猪的皮肤成纤维细胞生长曲线相似。
本研究以含10%DMSO、20%FBS的DMEM/F12为冻存液保存成纤维细胞效果较好。丁生财等[7]的研究也采用了相同的方法。任芳丽等[13]证明10%DMSO保护液对牛皮肤成纤维细胞的冷冻效果较其他浓度的DMSO及乙醇 (EG) 、甘油 (GL) 作为冷冻液的效果更好, 表现出较稳定的保护效果, 平均贴壁率达87.9%。还有报道称, 用含一定浓度的BSA、EG和蔗糖的PBS液为冻存液冻存小鼠胎儿和牛睾丸成纤维细胞的效果优于10%DMSO和血清的DMEM冻存液, 用此冷冻液保存猪成纤维细胞的效果是否更好, 有待于进一步研究。
摘要：为了研究猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞的分离培养体系, 根据取样组织的不同, 筛选出最佳的培养方法, 试验以猪胎儿和耳皮肤为试验材料, 用4种不同的培养分离方法, 即胰酶热消化法、胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法和组织块培养法, 分离培养猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞, 对比培养效果, 筛选出最佳的培养方法。结果表明:胰酶室温消化法分离的猪胎儿成纤维细胞存活率显著高于胰酶热消化法和胰酶冷热结合消化法 (P<0.05) , 细胞贴壁效果好, 且操作简单;猪耳皮肤成纤维细胞原代培养中, 胰酶热消化法和胰酶室温消化法分离的细胞数量少, 组织块培养法所需的组织量少, 且较胰酶冷热结合消化法操作简单。试验中培养的细胞呈典型的成纤维细胞形态, 生长曲线呈“S”型, 经冻存复苏后生长状态良好, 说明胰酶室温消化法是猪胎儿成纤维细胞较好的培养方法, 胰酶热消化法和胰酶室温消化法是猪耳皮肤成纤维细胞原代培养的理想培养方法。
关键词：猪,胎儿成纤维细胞,耳皮肤成纤维细胞,培养方法
纤维细胞细胞 篇2
强脉冲光对成纤维细胞增殖与周期的影响
目的`:研究强脉冲光对正常离体人皮肤成纤维细胞(fibroblast,FB)的生长活力、细胞增殖能力以及细胞周期变化的影响并探讨其可能的发生机制,为强脉冲光除皱提供可能的理论依据.方法:培养人皮肤成纤维细胞,应用MTT比色法、免疫组织化学的方法和流式细胞仪(FCN)分析技术,观察皮肤成纤维细胞经不同能量的强脉冲光照射后细胞的生长活力、细胞增殖能力以及细胞周期变化.结果:强脉冲光能促进体外培养人皮肤成纤维细胞增殖,FCN结果显示强脉冲光照射后,成纤维细胞G1期百分比降低,而S期百分比升高,增殖指数PrI值(S+G2M)百分比增高.结论:强脉冲光可促进正常成纤维细胞增殖和DNA合成,从而为强脉冲光面部美容除皱供理论依据,
作 者：李晓格 李世荣 曹川 邓向东 LI Xiao-ge LI Shi-rong CAO Chuan DENG Xiang-dong 作者单位：第三军医大学西南医院整形科,重庆,400038刊 名：中国美容医学 ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF AESTHETIC MEDICINE年，卷(期)：16(10)分类号：Q813.1关键词：强脉冲光 成纤维细胞 细胞增殖 细胞周期 面部除皱
纤维细胞细胞 篇3
【关键词】 恶性纤维组织细胞瘤;胸壁肿瘤;诊断;治疗
【中图分类号】R734.4 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2014）15-0150-01
恶性纤维组织细胞瘤（malignant fibrous histiotoma，MFH）是一种来源于成纤维细胞或原始间叶细胞的恶性肿瘤，常见于中老年人。本病好发于肢体近端的肌肉组织，原发于胸壁的罕见。我院自2011～2013年经手术及病理诊断原发性胸壁恶性纤维组织细胞瘤2例，本文分析其症状、体征和相关检查、术后病理及其预后，提高对胸壁恶性纤维组织细胞瘤认识。
1 材料与方法
例1，男，74岁，近20天来有胸痛，伴有咳嗽、咳黄痰。既往无疾病病史。查体：右侧语颤略减弱，右下肺叩诊浊音，右肺呼吸音略弱，未闻及明显干湿罗音。胸CT示：右侧胸腔可见液体密度影，左下肺可见片状磨玻璃密度影，气管居中，纵膈未见明确肿大淋巴结。起初患者有右侧胸腔积液，行胸腔穿刺抽液治疗。胸腔积液中末见癌细胞和结核分枝杆菌。待抽不出液体后复查胸CT见右侧胸壁肿物，临近肋骨受累，骨质破坏，右肺上下叶受累。行右胸壁病损切除，右肺上下叶部分切除，胸壁缺损修补术。术中见肿物位于右肩胛下角下约3cm处，约6×5×4cm大小，切面呈鱼肉状，侵及7、8肋及部分右肺上下叶。病理诊断：右侧胸壁恶性纤维组织细胞瘤，侵犯肺组织，肋骨未见瘤组织侵犯。患者术后未行放化疗，于术后七个月肿瘤复发肺内转移救治无效死亡。
例2，男，64岁。近2个月来有胸背部隐痛。既往无疾病病史。查体：右侧胸壁（约第7肋）可扪及一质硬、边界清楚的肿块，约2 cm×3 cm，有压痛，皮肤无红、肿、热。胸部CT见：右侧胸壁有一软组织密度影，边界尚清。肿块向外压迫胸壁，致局部隆起凸起，无纵隔淋巴结肿大。行右胸壁肿瘤扩大切除，胸壁缺损修补术。术中见肿物位于右侧胸壁，与第6肋骨界限不清，约6×7×4cm大。病理诊断：右侧胸壁恶性纤维组织细胞瘤，肋骨未见瘤组织侵犯。患者术后未行放化疗，1年后肿瘤复发肺内转移救治无效死亡。
2 结果
本组2例胸壁恶性纤维组织细胞瘤患者均以胸痛为主诉入院。一例行胸CT检查示有胸腔积液。胸腔穿刺抽液后复查胸CT可见胸壁肿物。另一例胸壁可触及肿物。两例均行手术治疗。术后七个月及一年肿瘤复发导致患者死亡。
3 讨论
胸壁恶性纤维组织细胞瘤非常少见，胸壁恶性纤维组织细胞瘤症状、体征及诊治报道也相对较少[1，2]。本文分析了胸壁恶性纤维组织细胞瘤的症状、体征、相关检查及术后病理，以加强对胸壁恶性纤维组织细胞瘤诊治的认识。
3.1 临床、影像学表现及病理特点 本病症状可表现为无痛性增大的皮下结节及胸痛，如肿瘤侵及壁层胸膜产生胸腔积液可出现胸闷、气短的症状;累及肺组织则出现咳嗽、咳痰的症状。影像学特点：胸部CT显示肿块可向胸腔内外同时生长，侵犯胸膜、肋骨、肺脏，胸CT显示有肋骨破坏，胸腔积液及肺内占位影;如例1肿瘤既向内侵犯了肺组织又向外侵犯了肋骨。因此，患者有胸背部疼痛。
恶性纤维组织细胞瘤病理组织学特点：它是一种多形性肉瘤，来源于间叶细胞，其主要成份是纤维细胞和组织细胞，可伴有数量不等的单核细胞、多核巨细胞、泡沫细胞、未分化的原始间充质细胞和各种炎细胞，其间还存在着各种不同形态的过渡性细胞，数量及分化程度不等，大量成纤维细胞样细胞呈席纹状或轮辐状排列为其特征性病理表现[3]。肿块一般直径较大，可为1.5～20 cm，大多在3～8cm间。较大的肿瘤常伴有出血、坏死。MFH生长迅速，以局部浸润性强为其生物学特征，多复发，易转移。免疫组化对病理诊断有一定价值。综合文献报道，免疫组化检测阳性项目有Vimentin、CDm、Lysozyme、AAT、AACT。阴性检测有HHF35、CK、NSE、S-100、EMA、CEA、Actin、Desmin等。Vimentin普遍呈阳性表达，对于CD68，据资料[4]显示其表达不同作者的结果差异很大，阳性率从0%-79%，而本例呈阳性表达。恶性纤维组织细胞瘤没有组织细胞特异性的抗体。结合免疫组化可以除外其他的肿瘤。
3.2 治疗 手术切除是本病的首选的治疗手段[5]。术前要正确判断肿瘤生长部位、侵犯范围及是否累及周围重要组织器官，是否为复发肿瘤等。本文报道两例胸壁恶性纤维组织细胞瘤预后较差可能与肿瘤侵犯范围较广泛及术后未行放化疗有关。由于MFH术后容易复发，因此早期诊断并且做到手术时适当的扩大切除，切缘无肿瘤细胞残留是十分重要的。对于中晚期的恶性纤维组织细胞瘤的患者可采用新辅助放化疗等综合治疗[6]。
4 体会
本文报道了2例胸壁恶性纤维组织细胞瘤的诊断、治疗及其预后，并结合相关文献分析体会如下：胸壁恶性纤维组织细胞瘤临床症状无特异性，可有胸痛或触及胸壁肿物。行胸部CT等影像学检查有助于诊断及判断肿瘤侵及范围，若肿瘤侵犯胸膜可出现胸腔积液等征象。治疗以扩大手术切除为主，切缘切至无肿瘤细胞残留是必要的。早期诊断、治疗及术后应用放化疗会降低术后肿瘤的复发转移。
参考文献
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[6]刘士龙，谷文光. 恶性纤维组织细胞瘤起源和分类及其治疗的研究进展[J].中华肿瘤防治杂志，2011，18（10）：812～815
纤维细胞细胞 篇4
1 材料与方法
1.1 乳腺组织的获取
用无菌外科手术的方法取处于妊娠后期或泌乳期的健康初产荷斯坦奶牛乳腺组织5～10 g,置于DMEM/F12完全培养液[含青霉素300 IU/mL、链霉素300 μg/mL、两性霉素2.5 μg/mL、庆大霉素50 μg/mL、20%胎牛血清(FBS)]中,迅速带回实验室。
1.2 主要试剂与仪器
DMEM/F12(12400-016),Invitrogen公司生产;胎牛血清(南美洲,SV30087.02),Hyclone公司生产;胰蛋白酶(1∶250,0458),Amresco公司生产;细胞角蛋白-18(MS-142-P0)、波形蛋白(MS-129-P0),Neomarker公司生产;兔/鼠通用S-P免疫组化试剂盒(KIT9710)、DAB(0031),福州迈新生物技术开发有限公司生产;抗体稀释液(C-0007),北京博奥森生物技术有限公司生产;DMSO(D-5879),Sigma公司生产;青霉素钠、硫酸链霉素,华北制药股份有限公司生产;丙酮等其他试剂均为国产分析纯。
CO2培养箱(型号为HEPA class 100),Thermo公司制造;倒置相差显微镜(型号为IX71),Olympus公司制造;普通光学显微镜(型号为YS100),Nikon公司制造;离心机(型号为3-30K),Sigma公司制造;生物安全柜(型号为AC2-4S1),ESCO公司制造。
1.3 奶牛乳腺组织细胞的原代培养
用组织块贴壁法培养原代细胞,具体方法如下:将带回实验室的乳腺组织用37 ℃预热的灭菌生理盐水洗涤数次,清除血迹、乳汁及其他杂质;用无菌小剪镊分离腺泡于盛有灭菌生理盐水的小烧杯中,反复冲洗至冲洗液清亮后,将腺泡转移至生物安全柜中盛有灭菌PBS(含有青霉素200 IU/mL、链霉素200 μg /mL,pH值为7.4)的小烧杯中;将腺泡组织置于75%乙醇中浸泡约1 min后,用双抗PBS洗涤3次,每次3 min;然后将其转入青霉素小瓶中剪至约1 mm3大小的小块,备用。用牙科探针挑取组织块,将其轻轻铺于细胞培养瓶底壁上,植块间距0.5 cm,尽量使组织块黏附于瓶壁后沿对侧瓶壁加入DMEM/F12培养液(含青霉素200 IU/mL、链霉素200 μg/mL、15%FBS),旋上瓶盖,翻转培养瓶,使有组织块的一面向上,置于37 ℃、含5% CO2的饱和湿度培养箱中翻转培养2 h,使组织块微干涸;然后轻轻将培养瓶翻转过来,使培养液浸没组织块,根据培养液的颜色变化及细胞的生长情况每3～4 d更换一次培养液;待大多数组织块周围游出较多细胞时,用牙科探针轻轻掀掉组织块,并将组织块转瓶,使其继续贴壁培养,原瓶换液使细胞长满至汇合。
1.4 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的纯化培养
每日观察细胞的生长情况并记录,待细胞生长至汇合后,根据成纤维细胞和上皮细胞对胰蛋白酶的耐受时间与贴壁速度的差异,结合使用差时胰酶消化与差时贴壁2种方法分别纯化出奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞,具体方法如下:弃去培养液,用D-hank’s液冲洗3次后,加入0.05%胰蛋白酶-0.02%EDTA于37 ℃消化3～5 min;至成纤维细胞变圆、细胞间距增大、有少量细胞团块漂起后,加入培养液(含青霉素100 IU/mL、链霉素100 μg/mL、10%FBS)终止消化,反复轻轻吹打成纤维细胞区域,吸取消化液转入新的细胞培养瓶中,置于培养箱培养1 h;待大多数成纤维细胞贴壁后,轻轻去除上清液,加入新的培养液继续培养至细胞长满并汇合,得到以成纤维细胞为主的细胞;去除成纤维细胞后,用D-hank’s液再冲洗3次,然后加0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA于37 ℃消化4～5 min;至上皮细胞回缩变圆、细胞间距增大乃至细胞成片(团)脱落时加入含10%FBS的DMEM/F12培养液终止消化,反复轻轻吹打,按细胞密度加入培养液,置于培养箱中约1 h;取培养上清液转到新的细胞瓶中继续培养至细胞长满、汇合,得到以上皮细胞为主的细胞。如此反复进行纯化以得到较纯净的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞。
1.5 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的形态学观察与鉴定
1.5.1 倒置相差显微镜观察
每天定时观察细胞的形态和生长情况,拍照并作记录。根据每天对细胞生长情况的观察,掌握奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的生长特性和细胞形态的差异。
1.5.2 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的鉴定
将处理过的小盖玻片置于12孔细胞培养板的底壁,加少量培养液使其粘在培养孔底壁,分别将纯化的乳腺上皮细胞和成纤维细胞接种于含盖玻片的孔中,培养5 d后,用无血清培养基处理24 h并进行鉴定。
姬姆萨染色:将细胞爬片取出,PBS洗3次,每次3 min;冷冰酮固定20 min;用PBS洗3次,每次3 min;姬姆萨染液染色50 min;用灭菌水反复冲洗,置37 ℃温箱干燥6 h以上;二甲苯透明,中性树胶封片,镜检,观察细胞的形态并拍照。
免疫组化鉴定:每组细胞爬片分成3份,分别作为细胞角蛋白、波形蛋白和阴性对照,具体步骤为将细胞爬片取出,PBS浸洗3次,每次3 min;冷丙酮固定20 min,PBS浸洗3次,每次3 min,并将爬片放入湿盒中;加0.5%TritonX-100(用PBS配制)室温作用20 min;用PBS冲洗3次,每次3 min;滴加内源性过氧化酶阻断液(S-P试剂盒A液),避光作用10 min;用PBS液冲洗3次,每次3 min;滴加动物非免疫血清(羊) (S-P试剂盒B液),37 ℃孵育20 min;轻轻甩掉血清,勿冲洗;分别滴加鼠抗人细胞角蛋白-18单克隆抗体和鼠抗人波形蛋白单克隆抗体,均用抗体稀释液按1∶100倍稀释,阴性对照加PBS,37 ℃孵育2 h;PBS液冲洗3次,每次3 min;滴加生物素标记羊抗鼠/兔IgG(S-P试剂盒C液),37 ℃孵育20 min;PBS液冲洗3次, 每次3 min;滴加链霉素抗生物蛋白-过氧化酶(S-P试剂盒D液),37 ℃孵育20 min;用PBS液冲洗3次,每次3 min;滴加DAB作用5～10 min (现配现用),显微镜下观察并控制显色,用纯化水漂洗终止显色;苏木精复染5 min,在 0.25%盐酸乙醇溶液中浸提一下,自来水返蓝15 min;用纯化水浸洗,37 ℃温箱干燥6 h以上,二甲苯透明,中性树胶封片,镜检并拍照。
1.5.3 细胞生长曲线的绘制
分别将乳腺上皮细胞和成纤维细胞按每孔2×105个接种于24孔板中,每组3孔,共分为14组。分别于接种后每天同一时间计数细胞平均数,每孔计2次,直至细胞的生长达到平台期。以培养时间为横坐标、细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。
1.6 细胞的冻存与复苏
1.6.1 细胞的冻存
用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA将细胞消化下来,1 000 r/min离心5 min;收集细胞,加入1 mL新鲜培养液重悬细胞,用台盼蓝染色,用血细胞计数板计数后,加含20%FBS的DMEM/F12培养液调整细胞数至5×106～10×106个/mL,并按10%的比例缓慢加入DMSO,混匀后分装于2 mL冻存管中,每管1 mL,4 ℃放置15 min;-20 ℃放置20 min;-80 ℃过夜,然后沉入液氮罐中长期保存。
1.6.2 细胞的复苏
从液氮罐中取出冻存管,立即投入37 ℃水浴中晃动,使其在1 min内完全融化。加入5 mL培养液悬浮细胞,1 000 r/min离心5 min;收集细胞,根据细胞密度加入生长培养液重悬细胞,将其接种于细胞培养瓶中,置37 ℃、含5% CO2的饱和湿度培养箱中培养。
2 结果
2.1 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的培养纯化及形态观察结果
2.1.1 组织块的培养结果(见169页彩图1)
培养1～2 d后细胞贴壁,3～5 d后开始游出,以成纤维样细胞和上皮细胞为主,并且这2种细胞并不混杂生长,存在着明显的界限(见169页彩图1a,b)。其中成纤维样细胞先从组织块周围向外游出,其形态多为长梭形,排列疏松,呈旋涡状或放射状生长(见169页彩图1a,b);而后上皮样细胞从组织块周围游出,多为单层多角形,排列紧密,细胞核呈圆形或椭圆形,核仁清晰可见,多呈鹅卵石样或铺路石样聚集生长(见169页彩图1a,b)。
2.1.2 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的纯化及形态学观察结果
经差时胰酶消化和差时贴壁2种方法对奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞分别进行纯化,上皮细胞多成团生长,未纯化完全时成纤维细胞常包裹于上皮细胞的外围生长(见169页彩图1c)。细胞经3～5次纯化后即可分别得到较为纯净的奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞。纯化的上皮细胞大多为多角形,细胞排列紧密,细胞核呈圆形或椭圆形,有时可出现双核或多核现象,核仁清晰可见,以3～5个居多,多呈单层铺路石样或鹅卵石样成团聚集生长(见169页彩图1d)。传代的上皮细胞贴壁后,多成团聚集生长形成岛屿状,并且成团的多角形上皮细胞聚集生长时增殖快,而单个散在圆形贴壁细胞很难继续增殖。随着培养时间的延长,一些上皮细胞的胞浆出现大小不一的空泡和泡状结构(见169页彩图1e),这是上皮细胞分泌产生的大小不等的乳滴。上皮细胞传到第5～6代时生长仍很旺盛,随着细胞密度的增加,多形成类似腔的结构,在腔的周围细胞密集包绕生长,更换培养液后继续培养,一些生长迅速的新生细胞可向腔内生长,并出现拉丝样支架将两侧细胞连接起来(见169页彩图1f),细胞沿着支架继续增殖可达到融合,形成类似圆顶样结构,随传代次数的增多和培养时间的加长这种结构会逐渐增多。此外,在一些区域,上皮细胞还可形成腺泡样结构(见169页彩图1g)。上皮细胞传至第7～8代,其形态基本一致,只不过有些细胞体积较大,呈圆饼样,增殖速度慢;有的细胞体积较小,呈鹅卵石样,增殖迅速,随着培养时间的加长,细胞间的界限愈加明显;随着细胞密度的增加,细胞受到挤压,一些细胞呈短梭形。而当细胞传到第8～9代以后形态变得非常不均一(见169页彩图1h),出现长形、梭形和三角形等多种形态共存,而典型的上皮细胞越来越少。纯化的奶牛乳腺成纤维细胞单层生长,呈典型的放射状或旋涡状排列(见169页彩图1i),且随着传代次数的增多,成纤维细胞的形态和生长特性基本不发生改变。
2.2 细胞的鉴定结果
2.2.1 姬姆萨染色法鉴定细胞的形态(见169页彩图2)
乳腺上皮细胞为深蓝染,胞核呈圆形或椭圆形,核仁清晰可见,多为3～5个,并且胞浆内常可见大小不一的白色空泡(见169页彩图2a),这是上皮细胞分泌的乳滴。成纤维细胞多呈长梭形,胞核蓝染,为椭圆形,位于细胞中央,一般可见核仁呈旋涡状或放射状排列生长(见169页彩图2b)。
2.2.2 免疫组织化学法鉴定细胞的纯度
镜检可见细胞胞浆内有特异性棕黄色或棕褐色颗粒沉着者判为阳性。结果(见170页彩图3)显示,乳腺上皮细胞角蛋白-18反应呈阳性,波形蛋白反应呈阴性(见170页彩图3a,b);乳腺成纤维细胞角蛋白-18反应呈阴性,波形蛋白反应呈阳性(见170页彩图3c,d);阴性对照均为阴性(见170页彩图3e,f)。经纯化后,2种细胞的纯度均可达到95%以上。乳腺上皮细胞传至第8～9代以后,细胞的形态开始发生变化,出现长形、梭形、三角形等多种细胞共存,而直至细胞传至第14代时,细胞角蛋白-18反应仍呈阳性(见170页彩图3g),阴性对照为阴性(见170页彩图3h)。
2.3 细胞的生长曲线(见图4)
奶牛乳腺上皮的生长曲线(见图4a)和成纤维细胞的生长曲线(见图4b)均呈较典型的“S”型,其中成纤维细胞较上皮细胞潜伏期短,增殖快。
2.4 细胞的冻存与复苏
代次较低的奶牛乳腺上皮(3～6代)细胞经冻存复苏后生长状态良好,传1～2代后细胞的形态和生长特性均未发生改变,而代次较高(7～8代)的细胞冻存复苏后形态正常,但传代后细胞形态就发生了改变。复苏后的成纤维细胞生长状态良好,形态和生长特性均未发生明显改变。
3 讨论
3.1 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的培养与纯化
目前,有关奶牛乳腺上皮细胞培养的研究已有很多,培养方法主要有组织块培养法、机械破碎法和酶消化方法。也有人从乳汁中分离出奶牛乳腺上皮细胞[6,7],有待于进一步验证。机械破碎法和酶消化法极易丢失和损伤细胞,最终造成细胞不能正常生长和增殖[8,9],其中以组织块培养法最能保持乳腺上皮细胞二倍体特性,不破坏细胞的活性。本试验根据奶牛乳腺上皮细胞较成纤维细胞贴壁和生长慢、贴壁牢、不易被消化下来的特性,应用组织块贴壁转瓶培养,采用差时胰酶消化法和差速贴壁法结合的方法,用较少的组织即分别培养及纯化出奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞。
目前,关于奶牛乳腺细胞体外培养的研究主要集中在上皮细胞上,而关于成纤维细胞的报道并不多见,不过后者培养和纯化都相对较容易。研究发现,奶牛乳腺上皮细胞纯化的难易程度跟乳腺组织的取材也有很大的关系,在腺泡发育好的妊娠期和泌乳期取材所获取的细胞活性好,生长快,细胞中上皮细胞占的比例较大[10,11],此时纯化出上皮细胞就相对较容易,所以把握取材时机非常关键。另外,去除脂肪和结缔组织,分离乳腺腺泡进行培养也很关键[10,12]。
3.2 奶牛乳腺上皮细胞和成纤维细胞的形态学观察
试验培养得到的奶牛乳腺上皮细胞的形态特征与王亨等[10]、彭新荣等[11]及E.Matitashvili等[13]的报道基本一致,奶牛乳腺成纤维细胞的形态特征与吴娟等[14]报道的结果一致。乳腺上皮细胞是构成乳腺腺泡的主要成分,具有分泌乳汁的功能。本研究中,在体外培养奶牛乳腺上皮细胞时,胞浆内出现大小不一的空泡和泡状结构即为上皮细胞分泌的乳滴,与崔立莉[7]报道的结果一致;与彭新荣等[11]报道的结果不一致,其认为胞浆内出现的小颗粒和泡状结构可能为变形的线粒体及溶酶体。上皮细胞还可形成乳腺腺泡管样结构,与王治国等[15]和E.Matitashvili等[13]的试验结果一致。不过,王治国等[15]的试验中添加了一些激素和生长因子,E.Matitashvili等[13]的试验中添加了ECM,而本试验中未添加。而上述现象在成纤维细胞中均没有,可见在体外培养条件下,奶牛乳腺上皮细胞仍保留着其原有的一些功能和特性。
体外培养的乳腺上皮细胞传代后的大小和形态并不完全一致,经纯化传代后,细胞多成团、聚集成岛屿状,其中体积较小的呈鹅卵石样,聚集成长的细胞增殖较快,而体积较大的呈圆饼形,细胞的增殖则较慢,这2种细胞可能为乳腺上皮细胞不同发育时期的细胞。前者可能为较幼稚的细胞,分裂增殖较快;而后者为接近终末分化的细胞,故增殖较慢。与王亨等[10]的试验结果相一致。另外,乳腺上皮细胞成团时增殖较快,而单个细胞很难贴壁并增殖[10,11];因此细胞的接种密度对于细胞的生长非常重要。随着上皮细胞生长密度的增加,可形成许多类似腔的结构,细胞继续增殖达融合后,可形成类似圆顶样结构,与丁月云等[16]的试验结果相一致,而8～9代以后部分细胞渐渐分化,细胞形态变得不均一,出现长形、梭形和三角形的细胞,与彭新荣等[11]的试验结果相一致。
3.3 细胞鉴定
奶牛乳腺腺泡上皮细胞中的骨架蛋白以角蛋白-7,8,18为主,而肌上皮细胞以角蛋白-5和14为主[16],故角蛋白-18可用于奶牛乳腺腺泡上皮细胞的鉴定。波形蛋白是间质细胞特异性表达的一种中间纤维蛋白,是间质细胞和成纤维细胞的标志蛋白之一[17],可用于成纤维细胞的鉴定。综合应用这2种蛋白不仅可以鉴定细胞的类型,而且可以鉴定细胞的纯度。本试验结果表明:奶牛乳腺上皮细胞对角蛋白-18反应阳性,与E.Matitashvili等[13]的研究结果一致;对波形蛋白反应阴性,与J.L.Anaya-Lopez等[18]的研究结果一致。而成纤维细胞与上皮细胞的结果相反,对角蛋白-18反应阴性,对波形蛋白反应阳性,表明结果成立。经鉴定,上皮细胞传至14代后,对细胞角蛋白-18的反应仍为阳性,表明虽然细胞的形态发生了变化,但所得的细胞仍为上皮细胞。
3.4 细胞的冻存与复苏
由于原代奶牛乳腺上皮细胞具有二倍体的特性,属于有限细胞系,随着传代次数的增多,细胞的形态和生长特性会逐渐发生改变,导致其失去二倍体细胞的特性甚至发生细胞转化;因此,在纯化后对其及早进行冻存非常重要[5]。与上皮细胞不同,奶牛乳腺成纤维细胞的形态和生长特性受传代和冻存的影响相对较小,但仍应在其生长旺盛、传代次数较少时将其冻存,以防影响细胞的特性。
试验采取妊娠后期或泌乳期荷斯坦奶牛乳腺组织分离腺泡,培养后应用组织块贴壁转瓶培养,采用差时胰酶消化和差速贴壁结合的方法,用较少的组织即分别培养并纯化出了乳腺上皮细胞和成纤维细胞,所得细胞形态良好,生长曲线呈较典型的“S”型,符合细胞生长的一般生物学规律,经鉴定细胞的纯度可达95%以上。目前,国内外的许多研究者认为乳腺上皮细胞的贴壁依赖于基质,生长依赖于激素和生长因子的添加,而本试验中未使用基质和激素也成功培养出了生长良好并具有泌乳功能的乳腺上皮细胞,避免了胶原和激素所造成的影响,为相关的后续研究奠定了良好的基础。
a.细胞从组织块中游出并在组织块周围生长(100×);b.上皮细胞与成纤维细胞不混杂生长,之间存在明显的界限,上皮细胞排列紧密形成细胞单层,而成纤维细胞排列疏松(100×);c.成纤维细胞包裹未纯化完全的上皮细胞(100×);d.纯化的上皮细胞呈鹅卵石样或铺路石样生长(100×);e.上皮细胞胞浆内有大小不一的空泡和泡状结构(100×);f.细胞向腔内生长,并出现拉丝样支架将两侧细胞连接起来,细胞沿着支架继续增殖可达到融合(200×);g.上皮细胞形成腺泡样结构(100×);h.上皮细胞的形态发生改变(100×);i.纯化的成纤维细胞呈旋涡状或放射状生长(100×)。
a.中央处上皮细胞深蓝染,细胞核为圆形或椭圆形,核仁清晰可见,胞浆内还可见许多大小不一的白色空泡;b.成纤维细胞为长梭形,呈旋涡状或放射状排列生长。
纤维细胞细胞 篇5
强脉冲光对培养的人成纤维细胞表达MMP-1和TIMP-1的影响
目的:观察强脉冲光照射对体外培养的成纤维细胞表达基质金属蛋白酶(MMP-1)和基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)的影响,探讨IPL嫩肤作用的.分子生物学机制.方法:采用能量密度分别为20、25、30J/cm2的强脉冲光对培养的人成纤维细胞进行照射,于照射后24h及48h应用ELISA法测定上清液中MMP-1和TIMP-1的表达并与对照组比较.结果:照射24h后25及30J/cm2组上清液中检测到的MMP-1、TIMP-1含量轻度升高;48h时各能量组MMP-1均升高,但各组间并无显著性差异.TIMP-1随能量的升高而含量增高.结论:强脉冲光照射成纤维细胞后可引起MMP-1,TIMP-1表达的增加,但是TIMP-1的增加远远大于MMP-1的增加,提示IPL嫩肤作用的生物学机制可能与成纤维细胞产生的TIMP-1增加有关.
作 者：王永贤 刘平应朝霞 葛文娱 WANG Yong-xian LIU Ping YING Zhao-xia GE Wen-Yu 作者单位：西安交通大学第二医院皮肤科,陕西,西安,710004刊 名：中国美容医学 ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF AESTHETIC MEDICINE年，卷(期)：16(7)分类号：Q813.1关键词：强脉冲光 成纤维细胞 MMP-1 TIMP-1
纤维细胞细胞 篇6
【关键词】 关节炎，类风湿；红刺老苞；成纤维滑膜细胞；体外培养
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一
种以慢性非化脓性关节炎为特征的全身性自身免疫性疾病。目前对本病的病因病机尚无定论，但是病理研究表明，病变关节出现明显的滑膜增生，其原因主要是成纤维滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLSs）数量异常增加和形态改变，侵蚀相邻软骨和骨组织。红刺老苞（Aralia echinocaulis Hand.Mazz.）是湖北土家族地区广泛用于治疗风湿病的民族药。本实验观察红刺老苞水提物对FLSs异常增殖的影响，以探讨其可能作用机制，为更好地开发利用该药物提供实验依据。
1 实验材料
1.1 滑膜组织来源 选取2014年在湖北民族学院附属民大医院行膝关节置换术的男性RA患者1例，
其诊断符合1987年美国风湿病学会（ACR）修订的RA诊断标准，标本获取已获得患者知情同意。
1.2 主要试剂 红刺老苞根皮（购自湖北民族学院附属民大医院中药房，水煎2次合并药液，过滤浓缩，以注射用水定容至含生药1 g·mL-1，过滤除菌，-20 ℃保存备用）；DMEM培养基（Invitrogen公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；噻唑蓝
（MTT，Sigma公司）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司）。
1.3 主要仪器 倒置显微镜（Olympus公司）；流式细胞仪（BD公司）；酶标仪（Thermo Fisher公司）；二氧化碳（CO2）培养箱（Thermo Fisher公司）。
2 实验方法
2.1 FLSs的培养及鉴定 将手术中取下的滑膜组织于30 min内在无菌条件下放入培养皿中，剔除脂肪及纤维组织后，用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗数遍，剪成1 mm3大小的组织块移入无菌培养皿
中；加入含质量分数0.25%的胰酶和2 mg·mL-1的
Ⅱ型胶原蛋白酶混合液消化3～4 h，200目筛过滤，滤液置于1 000 r·min-1离心机离心，弃上清；加入含质量分数10%胎牛血清的DMEM培养基，重悬细胞沉淀，移入培养瓶中，在37℃、体积分数5% CO2条件细胞培养箱中培养；等原代细胞生长至70%～80%融合时，按1∶3的比例传代培养，取第4代细胞用于实验。
培养细胞传至第4代时，取FLSs接种于6孔板中进行细胞培养，培养至细胞融合度达80%～90%。用质量分数0.25%的胰酶消化细胞，含血清培养基终止消化。PBS清洗2次后，用抗人CD90+的荧光抗体4 ℃结合30 min。PBS洗2次后，上流式细胞仪检测CD90的表达水平。
2.2 MTT比色法检测红刺老苞水提物对FLSs的增殖抑制作用 取第4代FLSs接种于96孔培养板中，调节细胞悬液含量为每孔6 000个·（100 μL）-1，
每个含量的细胞接种3个复孔；同时用100 mL培养液作空白对照，边缘孔用无菌PBS填充；37 ℃、体积分数5% CO2孵育至细胞贴壁，分别用培养基稀释的红刺老苞水提液稀释浓度为28.57，14.29，7.15，3.57，1.78，0.89 μg·mL-1（分别为各浓度组），与之共同孵育48 h后，弃上清；每孔加入质量分数0.5%MTT 10 mL，继续培养4 h后，弃培养液；每孔加入150 mL二甲基亚砜，摇床上低速震荡
10 min，酶标仪于490 nm处测量各孔的吸光度OD值。按公式[（1-治疗组OD值/空白组OD值）×100%]计算抑制率。
2.3 流式细胞术检测红刺老苞水提物对FLSs凋亡的影响 取第4代FLSs，接种于6孔板中，37 ℃、
体积分数5% CO2孵育至细胞贴壁，加入用培养基稀释的红刺老苞水提液稀释含量为10，20 μg·mL-1
（10，20 μg·mL-1浓度组），共培养48 h后，用PBS清洗2次，质量分数0.25%不含EDTA的胰酶消化细胞，移入离心管中，800 r·min-1离心
5 min，弃上清。再严格按照Annexin V/FITC试剂说明书处理后，上流式细胞仪进行分析。
2.4 统计学方法 采用SPSS 16.0软件进行统计分析。计量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），用最小显著差法（LSD）做两两比较。以P < 0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
3.1 FLSs培养鉴定 FLSs培养至第4代时，倒置显微镜下可见典型规则梭形细胞，贴壁性好，细胞核边界清晰，未见到其他悬浮细胞。流式细胞仪检测其特征性标记物CD90的表达结果> 99%。
3.2 MTT法 按所用的抑制率公式进行计算，各红刺老苞水提物处理组的增殖抑制率随药物含量增加表现出增长趋势，各处理组与空白对照组比较，差异均有统计学意义（P < 0.01）；组间比较发现，14.29 μg·mL-1浓度组与小药物浓度组比较，差异有统计学意义（P < 0.05），与28.57 μg·mL-1浓度组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。经直线相关分析药物含量与抑制率间有相关
nlc202309040647
关系（r = 0.88，P < 0.05），拟合直线回归方程
Y = 0.025 X + 0.207。估计IC50为11.72 μg·mL-1。由此可见红刺老苞水提物对RA FLSs具有增殖抑制作用，且随药物含量的增加而增强；当药物含量超过14.29 μg·mL-1以后，抑制效果达到平台期。
3.3 流式细胞法 通过红刺老苞水提物对FLSs细胞凋亡的影响可以看出，空白对照组在右下象限也表现出一定的自然凋亡率，随着红刺老苞水提物药物含量的增加，在右下象限所显示的凋亡细胞也出现增长的趋势。与空白对照组比较，
10 μg·mL-1浓度组、20 μg·mL-1浓度组的细胞凋亡率差异均有统计学意义（P < 0.01）；20 μg·mL-1
浓度组与10 μg·mL-1浓度组比较，凋亡率明显升高（P < 0.01）。
4 讨 论
根据WHO调查结果显示，全球1%的人患有RA，仅中国患者就达1 000多万。其基本病理改变是滑膜炎，然而由于病因及发病机制尚未完全明了，临床治疗没有特效药物，所以对其病因病机的研究和寻找新的抗RA有效药物一直是风湿病学界长期以来研究的热点[1]。
恩施土家族苗族自治州地处武陵山区，属于云贵川高原的延伸部分，四季日照少，雨雾多，为风湿病的易发地区。然其独特的地理环境特别适合药材的生长，养育了数千种中草药[2]，其中就包含数百种治疗风湿病的土家民族药。红刺老苞属五加科楤木属植物，是恩施常用的土家抗风湿民族药物之一，因其茎皮为紫红色，当地俗称红刺老苞，民间认为其抗风湿作用要好于其他的楤木。《土家族药物志》记载其可以祛风除湿、散瘀消肿，主治风湿性腰腿痛、关节痛等。近几年，笔者等先后用小鼠耳肿胀等常规抗炎实验及迟发性超敏免疫实验进行了红刺老苞的药效学研究，证实了红刺老苞根皮有明显的抗炎镇痛和免疫调节作用[3-4]。乔为平等[5]用贵州的红刺老苞水提物作用于佐剂性关节炎大鼠模型，认为其可以减轻和改善模型大鼠滑膜增生及关节软骨的炎症情况。
在对RA细胞水平的研究中，众多学者一致认为，导致滑膜组织出现炎症的一个重要原因是FLSs的异常增多。滑膜组织包裹在关节外面，在解剖上可分为滑膜内层和滑膜下层，滑膜内层直接和关节腔接触。FLSs就是滑膜内层的主要组成细胞，能大量分泌长链多聚透明质酸、糖蛋白润滑素和纤溶酶原活化因子，以润滑关节腔和阻止关节内纤维粘连，所以正常情况下FLSs对维持关节腔的环境稳态起着重要作用。然而在病理情况下，炎性介质会刺激FLSs产生大量的炎性细胞因子和基质降解酶，加重炎性反应的持续进行；同时异常增多的FLSs还会出现肿瘤样改变，导致关节腔的狭窄甚至关节的损坏[6-7]。现在体外培养FLSs的技术比较成熟[8]。本研究探讨了红刺老苞对RA FLSs异常增殖的影响，实验结果表明，体外培养RA患者FLSs，能表现出异常增殖的能力，其表面特征性标记物CD90的含量可以达到99%以上；用红刺老苞水提物作用48 h，能够明显地抑制RA患者FLSs的增殖，增加其凋亡率，并表现出治疗作用与药物剂量呈正相关。
诱导细胞增殖与凋亡的机制是多方面的，涉及细胞信号传导通路中多种信号传导细胞因子；因
此，对于红刺老苞具体是通过何种信号传导途径来调控RA FLSs异常增殖，还需要进一步深入研究。
5 参考文献
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收稿日期：2014-08-01；修回日期：2014-10-09
纤维细胞细胞 篇7
关键词：肌肉抑制素 (Myostatin) ,骨骼肌卫星细胞,成肌细胞,肌成纤维细胞,骨骼肌纤维化
骨骼肌卫星细胞是一种具有增殖、分化潜能并且能自我更新的肌肉干细胞, 在骨骼肌生长和损伤修复过程中被激活, 增殖、分化形成肌管, 对骨骼肌的生长及修复有重要作用。因此, 研究骨骼肌卫星细胞增殖、分化的机理可以为提高畜禽肉品质和治疗骨骼肌相关疾病提供理论依据。N.F.Gonzalez-Cadavid等[1]研究表明, 肌肉生长抑制素 (Myostatin, 也称为生长分化因子8, 缩写为GDF-8) 是Myostatin基因编码的蛋白质, 是一种分泌型的生长分化因子, 属于抑制转化生长因子β (TGF-β) 蛋白超家族成员, 它的主要作用是抑制肌肉分化和生长。Myostatin主要在骨骼肌细胞中产生, 在血液中循环, 并作用于肌肉组织[2,3]。利用Myostatin对体外分化培养的肌纤维进行处理, 可抑制蛋白合成和减小肌纤维体积;腹腔注射Myostatin可导致小鼠肌肉萎缩[4]。相反, 细胞外游离的绑定蛋白 (如卵泡素) 与Myostatin结合, 导致Myostatin不能与受体结合发挥作用, 从而造成肌肉肥大[5]。Myostatin同样能够抑制骨骼肌卫星细胞的增殖、分化能力, 导致骨骼肌再生障碍[6]。对骨骼肌卫星细胞的分化方面研究发现, TGF-β诱导骨骼肌卫星细胞分化为肌成纤维细胞[7], 有研究表明, Myostatin能够抑制骨骼肌卫星细胞增殖、分化, 同时导致骨骼肌萎缩。肌肉再生不良或萎缩时会出现纤维化现象, 但Myostatin是否直接导致骨骼肌卫星细胞分化为肌成纤维细胞产生纤维化过程未见报道。试验探讨Myostatin对骨骼肌卫星细胞分化方向及功能的影响。
1 材料与方法
1.1 主要材料
试验动物为3周龄C57小鼠30只, 购于维通利华公司。
主要试剂:2型胶原酶, Worthington Biochemical公司生产;反转录试剂盒Prime ScripRT-reagent Kit、Taq DNA Polymerase, Promega公司生产;DNaseⅠ、实时定量试剂盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ, Ta KaRa公司生产。DMEM/F12培养基、胎牛血清、孕马血清, Gbico公司生产;TRIzol, Invitrogen公司生产;其他试剂为进口或国产分析纯;抗α-SMA、Fibronectin、Myo D、Myogenin、GAPDH抗体, 均购自abcam公司;e My HC抗体, 购自Santa Cruz公司。
1.2 骨骼肌卫星细胞的培养
根据参考文献[8-9]描述的方法对骨骼肌卫星细胞进行分离并鉴定, 将骨骼肌分离并切碎, 用加有0.2%的2型胶原酶和1%双抗的DMEM在37℃条件下将骨骼肌组织消化30 min。通过100μm孔径的网筛滤过后使用40%/70%Percoll梯度分离, 在40%与70%之间的位置为骨骼肌卫星细胞, 置于培养皿中培养至贴壁, 利用Pax-7抗体进行鉴定, 95%的细胞为Pax-7阳性细胞。用含20%胎牛血清、1%双抗、40 mg/m L gentamicin和2%鸡胚提取物的DMEM进行培养至汇集度为80%~90%。
1.3 Myostatin处理骨骼肌卫星细胞
细胞汇集度达到80%~90%时, 将培养基换为含2%孕马血清、1%双抗、40 mg/m L gentamicin和2%的DMEM进行分化培养并分别加入0, 50, 100, 200 mg/m L的Myostatin进行刺激。每隔48 h换液1次, 于细胞分化第3天和第5天收集细胞, 提取总蛋白, 利用α-SMA、Fibronectin、Myo D、Myogenin和GAPDH抗体进行Western-blot检测。将第5天的细胞固定, 进行免疫荧光染色。
1.4 细胞免疫化学染色
骨骼肌卫星细胞载玻片上, 用4%的多聚甲醛固定5 min, 磷酸盐缓冲液 (PBS液) 冲洗2~3次, 分别加入My HC和α-SMA一抗, 放入湿盒中4℃过夜;37℃孵育30 min, PBS液冲洗2~3次, 加入FITC荧光标记的二抗作用60 min, PBS液冲洗;DAPI细胞核染色5 min, 封片, 拍照。
1.5 Western-blot分析
提取细胞的总蛋白, 采用Bradford法测定其浓度, 然后进行10%的SDS-PAGE电泳, 将目的条带转至NC膜上, 接着孵育一抗, 再用对应的800荧光标记二抗抗体孵育, 最后利用li-cor扫描仪进行扫描, 并用Quantity One分析软件分析蛋白相对表达量。
1.6 数据的统计分析
每个处理重复3次, 采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析 (One Way ANOVA) , 差异显著者再进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 骨骼肌卫星细胞分化过程中的形态学变化
在倒置显微镜下观察, 利用Myo D对骨骼肌卫星细胞贴壁后生长的第1天、第3天进行细胞免疫荧光染色, 利用My HC对第5天的样品进行染色, DAPI染核, 阳性的Myo D和My HC为绿色, 核为蓝色。贴壁生长1 d的骨骼肌卫星细胞呈梭形 (见228页彩图1A) ;第3天细胞变长、数量增加, 个别细胞融合 (见228页彩图1B) ;在分化培养基中培养至第5天时细胞融合形成长而粗的肌管 (见228页彩图1C) 。
2.2 不同浓度Myostatin对骨骼肌卫星细胞分化的影响
试验分别对汇集度达到80%~90%的骨骼肌卫星细胞给予0, 50, 100, 200 ng/m L的Myostatin进行刺激。每隔48 h换液1次, 于细胞生长第3天收集细胞, 提取总蛋白进行Western-blot检测, 结果表明, 随着Myostatin浓度的增加, 成肌细胞的标志性蛋白Myo D和Myogenin逐渐降低, 而肌成纤维细胞的标志性蛋白α-SMA和Fibronectin逐渐增强, 提示高浓度的Myostatin能够使骨骼肌卫星细胞向肌成纤维细胞方向分化, 见图2。
2.3 Myostatin对骨骼肌卫星细胞分化影响的免疫荧光结果
200 ng/m L Myostatin刺激分化5 d, 利用e My HC显示成肌细胞, α-SMA显示肌成纤维细胞, 结果表明, Myostatin组与正常对照组相比显著抑制了肌卫星细胞向成肌细胞分化 (见228页彩图3A) , 并且显著增加了其向肌成纤维细胞分化 (见228页彩图3B) 。
3 讨论
骨骼肌卫星细胞是一种肌源性干细胞, 在一定条件下 (生长因子、营养、年龄、运动等) 可选择性被激活、增殖形成成肌细胞, 并融合成肌管, 形成成熟的肌细胞, 使得肌纤维变大。肌纤维的组织学特性是畜禽肉品质的重要决定因素, 因此通过控制肌卫星细胞的分化可以有效改善畜禽肉品质。当肌卫星细胞的增殖、分化被抑制会导致肌肉萎缩, 大大降低肉品质。研究发现, Myostatin不仅抑制肌卫星细胞增殖、分化, 同时抑制肌肉生长, 造成肌肉萎缩, 而且还使骨骼肌卫星细胞分化为肌成纤维细胞分泌胶原等纤维化成分, 严重降低了肉用品质。目前, 对猪进行Myostatin基因敲除发现, 可以显著提高肌肉质量。在畜禽业中使用Myostatin抑制剂能有效改善肉用畜禽的肉品质。目前, 对肌卫星细胞控制肌纤维特性影响畜禽肉品质的研究还处于初步阶段, 研究发现, 骨骼肌卫星细胞在Myostatin作用下分化为肌成纤维细胞, 可能是导致肉用品质下降的另一原因, 为研究如何抑制Myostatin改善肉品质提供了基础。
绿色为Myo D或My HC免疫荧光染色, 蓝色为DAPI染核。
参考文献
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肾纤维化和肾成纤维细胞的起源 篇8
多数学者原来普遍认为间质成纤维细胞是细胞外基质的唯一来源。1867年, Cohnheim发表了关于炎症机制的经典文章, 其中说明了成纤维细胞 (当时被称为收缩细胞成分) 是白细胞的迁移后代。这一理论在一个多世纪内都被广泛地认同, 直到Ross等在联体大鼠实验中发现成纤维细胞来源于局部。最近的研究发现, 至少有一部分成纤维细胞来源于骨髓, 故成纤维干细胞的概念已被普及到骨髓来源。此外, 也可能来源于外膜周细胞和肾小管上皮细胞。
1 肌成纤维细胞和非肌成纤维细胞
多数学者认为成纤维细胞在纤维化过程中转换成所谓的肌纤维细胞 (由于表达仅限于血管平滑肌细胞中的平滑肌肌动蛋白) 。神经生长因子、血小板衍生生长因子-α和血小板衍生生长因子-β受体、CD90、exto-50-核苷酸和成纤维细胞特异性蛋白-1 (FSP-1) 被认为是肾皮质成纤维细胞的标志[1]。虽然确定这些细胞仍然具有挑战性, 但是典型的间充质细胞形态可以加以鉴定。在成纤维细胞转变成肌成纤维细胞的过程中, 平滑肌肌动蛋白的表达不是唯一的改变。此外, 表型的转变往往被低估, 从而使寻找这些细胞变得十分困难。正常和肾脏纤维化成纤维细胞之间的差异在于它们的增殖活性和基质合成的能力[2]。
如上所述, 细胞外基质的产生不是只有间质成纤维细胞参与。许多研究证实, 间质内有骨髓细胞存在[3]和骨髓细胞可以EMT为肾小管上皮细胞[4]。利用转基因标记成纤维细胞和肾小管上皮细胞发现, 来自骨髓的成纤维细胞约占正常小鼠肾间质细胞的12%[5]。在这项研究中, 有一个进展性肾脏病的实验模型, 成纤维细胞在肾间质细胞中所占的比例也没有改变。相反, 多达36%的分泌细胞外基质的细胞是来自于肾小管上皮细胞的EMT。EMT是脊椎动物胚胎分散细胞[6]和损伤组织形成成纤维细胞的公认机制[7]。EMT是一个动态的过程, 包括上皮细胞标志物减少与间质标志增加, 并且在迅速进展的慢性衰竭模型中表现较多。肾小管基底膜完整性的破坏是发生EMT的前提, 细胞外基质的组成影响肾小管上皮细胞的分化状态[8]。最近, Yamashita等[9]证实肾祖肾小管上皮细胞可能发生EMT, 并认为这些细胞是间质肌纤维细胞的来源。
2 肾成纤维细胞是否是肾脏疾病进展的起源
最近, Faulkner等[10]研究哈布毒液损伤后血管紧张素Ⅱ引起的肾纤维化模型中α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞的起源。联合血管紧张素Ⅱ和哈布毒液注射后14 d加速了肾纤维化和肾小球硬化模型。利用该模型, Faulkner等基本确定肾小管间质α-平滑肌肌动蛋白表达细胞是局部的来源。通过得克萨斯红葡聚糖标记发现肾小管基底膜的完整性没有被破坏, 近端肾小管上皮细胞也没有进入间质[10]。有趣的是, α-平滑肌肌动蛋白阳性的肌纤维细胞在血管周围早期即扩大。Wiggins等在抗肾小球基底膜抗体引起的肾炎和肾小球周区域也有相同的发现。这是否意味着在血管紧张素Ⅱ/哈布毒液模型中激活间质成纤维细胞是肌纤维细胞的唯一来源呢?事实并不是这样。首先, 正如有学者所认为EMT的可能仍然存在, 因为他们的重点是排除肾小管上皮细胞是EMT的来源, 但是EMT也可以发生在远端肾小管上皮细胞。第二, 骨髓来源的造血干细胞或间质干细胞的浸润没有被排除, 仍然存在可能性。第三, 如前所述, 仅利用α-平滑肌肌动蛋白的表达作为基质分泌细胞的标志是不能代表所有这些细胞的。Okada等[11]在多囊肾病小鼠模型中也发现相同的问题存在。最后, 笔者推测基质分泌细胞来源可能根据不同的模型是会变化的。
3 治疗的影响
对于以上结果, 现在还不能被临床医生所用, 但它们在临床抗纤维化治疗中的重要性很快会被证明。基质分泌细胞的来源根据潜在疾病和 (或) 肾纤维化的进程可能不同。基质分泌细胞的主要来源可能有治疗意义。例如, 间质成纤维细胞是转基因的首要目标[5]。另一方面, 成纤维细胞的增殖和刺激在某些慢性肾脏疾病如UUO模型中不是十分重要。UUO模型以及肾毒性血清肾炎模型都是通过EMT激活成纤维细胞。用骨形成蛋白 (BMP) -7或抑制肝细胞生长因子阻断EMT能抑制进展, 以及在应用BMP-7的情况下, 甚至可以还原这些模型中的基质沉积[12]。相反, 骨形态发生蛋白-7在没有或很少EMT如超载蛋白尿模型中其抗纤维化就会减弱或没有[13];但是关于人类的细胞来源, 激活成纤维细胞形成是一个刚刚开始研究的领域。因此, 如何将实验模型收集到的信息应用于临床研究将是非常有趣的。
4 结论
子宫恶性纤维组织细胞瘤1例 篇9
患者, 47岁, 因发现下腹部包块4月, 阴道流血5周余于2012年8月1日入院。患者月经初潮14岁, 3~4/28~31天, G3P3, LMP 2012年6月15日, 既往体健, 无特殊病史。入院前4个月无明显诱因出现下腹部包块, 呈进行性增大, 伴腰酸、下腹部坠胀3月余, 无明显腹痛。平素月经规律, 5周前出现阴道流血, 淋漓不断, 伴血块。入院查体:患者生命体征平稳, 腹膨隆, 下腹部可扪及一包块, 质地偏硬, 无压痛, 移动性浊音阴性;心、肺检查未见异常。妇科检查:阴道通畅, 血染, 宫颈光滑, 子宫前位, 盆腔检查触诊不满意。血常规示:Hb 73 g/L, RBC 2.97×1012/L, WBC及PLT未见异常。凝血及血生化检查基本正常。CA125121.3 U/ml。B超检查提示: (1) 盆腔巨大混合性包块; (2) 胆囊息肉样病变; (3) 副脾, 脾脏轻度肿大。胃镜检查示:慢性萎缩性胃炎。肠镜检查示:回盲部外压性改变。盆腔CT检查示:盆腔巨大囊实性占位, 多考虑卵巢癌, 腹腔转移可能。继行腹部增强CT检查示: (1) 腹腔、盆腔巨大囊性占位, 内见分隔, 与子宫分界不清, 子宫显示不清, 多考虑卵巢囊腺癌; (2) 大网膜及肠系膜可见结节影, 考虑转移; (3) 盆腔积液。于8月14日在全身麻醉下行剖腹探查术。术中见子宫体左后方一包块, 大小约30 cm×25 cm×25 cm, 有包膜, 形态不规则, 呈多囊样改变, 与子宫及左侧卵巢关系密切, 与大网膜及肠管粘连, 抽吸出血性液体约3000 ml, 瘤体质脆, 易出血。行盆腔恶性肿瘤细胞减灭术+大网膜切除术+腹膜活检术。术后病理检查示:子宫体正常结构被肿瘤组织破坏, 瘤实质由异型增生的纤维母细胞和数量不等的多核与单核瘤巨细胞 (含Touton巨细胞) 构成, 其内混杂少许炎症细胞;瘤细胞呈束状、席纹状或漩涡状排列, 病理性核分裂像易见;瘤组织浸润性生长, 部分区域可见片状出血坏死。免疫组化结果:波形蛋白 (Vim, +) , α-1抗糜蛋白酶 (AACT, +) , 巨噬细胞 (CD68, +) , 平滑肌肌动蛋白 (SMA, +) , 结蛋白 (Desmin, -) , 可溶性酸蛋白 (S-100, -) , 角蛋白 (CKP, -) , 细胞周期相关核蛋白 (Ki-67) 阳性 (>90%) 。病理诊断: (子宫体肿瘤组织) 恶性肿瘤, 形态学及免疫组化支持恶性纤维组织细胞瘤;另送大网膜未见瘤组织。最终诊断:子宫恶性纤维组织细胞瘤。术后患者拒绝进一步治疗, 于术后13天出院。随访患者于术后半年肿瘤复发、恶化而死亡。
2 讨论
恶性纤维组织细胞瘤 (malignant fibrous histiocytoma, MFH) 最先报道见于20世纪60年代, 组织来源及分化方向一直存有争议, 新版WHO软组织肿瘤分类认为MFH的本质是组织学来源及分化方向仍不明确的未分化多形性肉瘤 (undifferentiated pleomorphic sarcoma, UPS) 。MFH常发生于50~70岁, 多见于四肢软组织及后腹膜, 也见于腹部脏器及骨骼, 具有高度侵袭性, 发生于女性生殖系统尚属少见。本病例原发于子宫, 因缺乏特异性临床症状及影像表现, 与子宫平滑肌肉瘤及卵巢肿瘤鉴别困难, 术前误诊为卵巢囊腺癌, 但术后病理检查支持子宫MFH。
B超、CT检查有助于术前诊断, 病理检查结果仍是最终确诊标准, 近年来随着免疫组化及电镜技术的应用, 从病理学角度对MFH的诊断及其各种亚型有了更深认识。目前较多学者认为MFH可能是未分化软组织肿瘤进展的最终共同途径。
MFH尚缺乏统一的治疗方法, 可行手术加放化疗综合治疗。目前, 手术切除仍是所有软组织肿瘤的主要治疗手段, 但手术切除的范围尚存在争议, 有学者提出[1], 最大限度保留功能的同时行根治性切除并且切缘阴性 (R0, 包括切缘外2~5 cm) 是较合适的切除范围, 以达到较好的局部控制率。切缘外2 cm切除范围常受到邻近的神经血管等重要组织所限制, 当手术切缘不充分时, 需补充术后放疗, 当肿瘤<5 cm且可行广泛根治性手术切除时, 可不考虑行术后放疗治疗。放射治疗是控制局部复发的重要辅助治疗手段, 尤其当有镜下肿瘤残存阳性切缘 (R1) 或镜下病灶残存 (R2) 应补充放疗。有研究结果显示, 手术治疗辅助放射治疗手段 (术前或术后) 与单纯手术治疗手段相比, 患者的局部复发率得到明显改善, 但是无瘤生存率与总生存率未见明显差异。由于MFH患者多发生于中老年人, 应用化疗药物的风险高, 疗效亦尚存在争议[2]。有学者研究认为瘤内化疗对四肢MFH的疗效尚好[3]:瘤内注射吡柔比星行瘤内化疗, 可以提高肿瘤内化疗药物浓度, 起到抑制肿瘤生长的作用, 缓解疼痛等不适症状。分子生物学治疗的研究已取得一定进展。
因子宫MFH发病率低, 预后差, 为提高患者生存率, 故早期诊断及更有效的治疗方法仍需进一步研究和探索。
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外阴富于细胞性血管纤维瘤1例 篇10
患者, 46岁, 因发现外阴肿物6年, 肿物逐渐增大, 触痛明显3月于2012年12月5日收入院。患者于2006年因发现外阴肿物于当地医院行外阴肿物切除术 (具体不详) , 术后2个月在相同部位又发现肿块, 并逐渐增大, 触痛明显3月, 12月5日来我院进一步诊治。患者既往月经11～12/30天, 量时多时少, 无痛经, 未行激素治疗。G2P2, 1989年足月顺娩一女活婴, 现体健;1992年足月顺娩一男活婴, 先天聋哑;于1992年行输卵管结扎术。入院后查体:体温正常, 营养中等, 全身皮肤黏膜未见黄染、皮疹、出血点, 全身浅表淋巴结未扪及肿大。双肺呼吸音清, 未闻及干湿啰音。妇科检查:外阴已婚型, 左侧大阴唇可见一大小约10 cm×5 cm×5 cm的肿物, 蒂部较粗, 表面破溃, 无活动性出血, 阴道通畅, 宫颈轻度糜烂, 子宫前位, 大小正常, 右侧外凸一肌瘤结节, 直径约4 cm, 质中, 活动可, 无压痛, 双侧附件未扪及明显异常。辅助检查 (血常规、尿常规、BV、HPV、TCT, 肿瘤标志物CA125、CA199) 均无明显异常。入院诊断:①外阴肿物;②子宫肌瘤。完善术前准备, 12月7日于局部麻醉下行局部病灶切除术, 术中自肿物蒂部环形切开肿物部皮肤, 钝性完整剥离肿物, 电凝止血, 以4号丝线间断缝合切口, 无活动性出血。离体标本椭圆形, 质硬, 大小10 cm×5 cm×4 cm, 术后组织送病理检查。术后病理诊断:富于细胞性血管纤维瘤, 伴表面慢性溃疡形成。免疫组化:Ki-67呈阴性。见图1、图2。术后4天拆线, 伤口愈合良好, 予出院。术后6个月无复发, 目前正在随访中。
2 讨 论
富于细胞性血管纤维瘤 (cellular angiofibroma, CAF) 是近年来才认识的一类极少见的生物学行为良性、界限清楚、细胞高度密集、血管丰富的间叶性软组织肿瘤。1997年Nucci等[1]首次在中年女性外阴发现, 2002年这类肿瘤被正式命名为CAF。自Nucci报道了4例之后, 国外陆续有报道, 但目前国内报道资料较匮乏, 仅7例。本病好发于中年妇女 (39～50岁, 平均47岁) , 偶见于男性, 男女患者性别比例为1∶6.6[2]。本病常见于女性外阴浅表软组织及男性腹股沟阴囊区, 也有发生在肛周、尿道、腹膜后和胸壁皮下组织中。CAF的临床症状以皮下无痛性实性肿块为主, 偶伴轻度疼痛不适, 主要生长在浅表软组织内, 多为圆形、椭圆形、条索状或分叶状, 边界清楚, 有或无包膜, 质软或韧。肿瘤生长缓慢, 发生于女性外阴者一般直径<3 cm, 男性瘤体较大, 直径2.5～14 cm。本例患者肿瘤较大, 大小10 cm×5 cm×4 cm。
目前CAF病因尚不明确, 因肿瘤多发生在生殖区域, Lane等[3]也提到长期使用雌激素治疗可能与CAF发生有关;也有研究者认为CAF是由纤维细胞或成肌纤维细胞分化而来。CAF的治疗主要是局部病灶切除术, 尽可能的保证切缘阴性, 一般术后无复发。但Mc Cluggage等[4]报道了1例切缘阴性的局部病灶切除术后复发的CAF, 唐涛等[5]报道了1例可疑CAF复发的病例。本例患者于2006年行外阴肿物切除术 (具体不详) , 术后2个月在相同部位又发现肿物 (术后病理诊断为CAF) , 因此不能排除此次切除的CAF是最初肿物的复发。患者目前随访中, 未见复发。
CAF需与前庭大腺囊肿相鉴别, 二者均发生在女性外阴, 表现为无痛性肿块, 多呈椭圆形。前庭大腺囊肿, 位于患侧大阴唇下1/3囊性肿物, 触之有波动感, 与皮肤粘连, 腔内为黏稠脓液;CAF为实性肿物, 境界清楚。CAF还需与侵袭性血管黏液瘤、血管肌纤维母细胞瘤相鉴别, 三者均为外阴软组织肿瘤, 在临床、病理形态及免疫表型等方面有一定的相似性, 但三者生物学行为不完全相同, 治疗与预后不同, 故鉴别诊断十分重要。侵袭性血管黏液瘤边界不清, 无包膜, 部位深, 浸润性生长, 易复发, 细胞成分少, 有丰富的黏液基质;血管肌纤维母细胞瘤边界清, 有薄层纤维性假包膜, 主要位于女性外阴等浅表组织, 膨胀性生长, 不复发, 细胞丰富, 缺乏核分裂象, 细胞疏密交替和上皮样细胞成簇围绕血管。CAF边界清, 有包膜, 主要位于女性外阴等浅表组织, 膨胀性生长, 细胞丰富密集, 核分裂象易见, 细胞大小形态较一致, 分布较均匀, 间质有纤细胶原束及丛状脂肪细胞。可相鉴别。
参考文献
[1]Nucci MR, Granter SR, Fletcher CD.Cellular angiofibroma:benignneoplasm distinct from angiomyofibroblastoma and spindle cell lipoma[J].Am J Surg Pathol, 1997, 21 (6) :636-644.
[2]Hlaing T, Tse G.Angiomyofibroblastoma of the male perineum:anu-nusual location for a rare lesion[J].Int J Surg Pathol, 2000, 8 (1) :79-82.
[3]Lane JE, Walker AN, Mullis EN, et al.Cellular angiofibroma of the value[J].Gynecol Oncol, 2001, 81 (2) :326-329.
[4]Mc Cluggage WG, Perenyei M, Irwin ST.Recurrent cellular angiofi-broma of the value[J].J Clin Pathol, 2002, 55 (6) :477-479.
脂肪细胞歼灭战/脂肪细胞 篇11
吃过晚饭，悠闲坐沙发上看电视，每当面对眼前的薯片话梅巧克力，掐一把大腿上白花花的肉，你在痛苦地将头扭向一边时，会思考这些讨厌的赘
肉到底是什么组成的吗?
知己知彼百战不殆
众所周知，脂肪(又称脂肪组织)分布于人体的多个部位。一般而言，脂肪位于皮肤下方(皮下脂肪)，其间布满血管，也有一些脂肪分布于两个肾脏的顶部。除了脂肪组织外，一些脂肪会存储在肝脏中，还有一小部分脂肪甚至会分布在肌肉中。
脂肪组织由脂肪细胞形成。而脂肪细胞形成分为两个阶段第一个阶段是在妊娠期的最后三个月，此时婴儿正处于发育阶段；第二个阶段是在青春期到来时，此时正是性激素“破门而入”的阶段。男女之间的脂肪分布差异也就是在青春期开始形成的。还在困扰男人为什么不会形成丰乳肥臀的梨型身材了吗?还在骄傲于女人很少出现啤酒肚吗?其实就是性激素(雌激素和睾丸激素)造成脂肪分布位置不同。
神奇地是，青春期过后，脂肪细胞的数量保持不变，这可比性取向还要稳定。即使人体内存储的脂肪不断增多，脂肪细胞的数目也仍不再增加。只是每个脂肪细胞将不断变大。2008年瑞典卡罗林斯卡研究所(Karolinska Institute)的Kirsty Spalding及其同事证实了这一点——一个人体内的脂肪细胞数量在成年阶段始终保持恒定。
在研究中，Spalding小组对687位受试者进行了腹部脂肪活体切片，随后，研究人员记录下他们的性别、年龄、体重指数以及脂肪细胞的数量和大小。他们发现，脂肪细胞的平均数量在大约20岁之前会持续增加，之后就会保持相对恒定，并且与体重指数密切相关。此外，采样中还有进行过胃间隔手术(stomach stapling)来减少食物摄入的肥胖患者。研究人员发现，虽然这些人平均体重减少了18％，但脂肪细胞数量并未减少，仍然有800多亿个。因此，Spalding对减肥药嗤之以鼻：“我不认为这是简单的吃片药就能解决的问题。对家庭而言，最有用的信息就是保证小孩子有健康的生活方式。”
这也是为什么减肥对于许多人来说会那么困难。那么既然不能重返青春期，现代医学还能提供我们什么别的减肥方法?
好细胞坏细胞
脂肪细胞也不全是对人体有害，脂肪细胞主要分两个类。一类是白色脂肪细胞，主要用于代谢能量、保温和减震，体积较大，它含有非常少的细胞质(只占细胞体积的15％)、一个小细胞核以及一大滴脂肪(占细胞体积的85％)。另一边是褐色脂肪细胞，主要长在新生婴儿的肩膀之间；它们是重要的生热(生成热量)物质，体积稍小一些，其中含有线粒体以及一些小滴的脂肪。
因此，褐色脂肪细胞能够燃烧卡路里的特性正可以被我们利用。而产生我们深恶痛绝肥肉的存储器——白色脂肪细胞，却以绝对优势的比例数量存在于体内，它们无孔不入地广泛分布在皮下组织和内脏周围。但科学家的一系列实验证明，数量并不一定是取胜的关键，以少胜多在战场上从来不是偶然。
波士顿乔斯林糖尿病中心的Alen Cypess博士及其同事通过对近1800人进行高科技成像扫描，发现几乎所有成年人在他们的肩胛骨和脖颈处都保存有少量的褐色脂肪，其中，女人的平均存有量是男人的两倍。但即便如此，大多数妇女也只有15克的褐色脂肪。
荷兰的马斯特里赫特大学、芬兰医学中心和瑞典医学中心对24个健康的年轻男子进行了褐色脂肪活动研究，其中10人较瘦，其他人都超重。他们让这24个人呆在一间中等寒冷程度——18度的屋子里2小时，然后对他们进行PET扫描和CT扫描，以检查褐色脂肪沉积物的位置和代谢活性。他们的结论有：随着年龄的增长人们体内的褐色脂肪越来越少；胖人体内的褐色脂肪比瘦人少；在寒冷的屋子里要激活它只要一点点的时间。
Dana Farber癌症协会的Spiegelman博士和他的同事们发现，蛋白质PRDM16是决定是否形成褐色脂肪细胞的关键，PRDH蛋白只存在于褐色脂肪细胞中，所以他们目前打算让白色脂肪细胞内也生成PRDM16，从而将其转变为棕色脂肪细胞。
SpiegeIman把蛋白质PRDM16当做新式武器寄予厚望：“当了解更多的关于PRDM16的分子机制时，我们希望能够通过这种途径来调节体内新陈代谢，用以治疗肥胖症和糖尿病。”在科学是第一生产力的今天，脂肪大战鹿死谁手，这还真是个不好推测的谜团。
漫漫减肥路，谁不错几步
减肥误区
每个女人都在揽镜自视过感慨身材为什么没有T台上模特那么完美，就像每个女人都减肥失败过一样肯定。与其仰天长啸为问投胎前上帝不精心雕塑一下，不如来研究你是否问过以下的问题。
难以抵挡的食欲?
减肥的人也许都遇到过这样的情况，本来想将三顿餐减成两顿，可是越晚越饿，坚持不住还是要往嘴里塞东西吃。最烦的是，明明吃饱了，为什么还想吃呢?隔着几条街仿佛就能闻到面包房里泡芙的味道，必须菲吃不可。
平心而论，这个姑娘并不胖，只能算是稍微丰腴。这种对食物意犹未尽的“元凶”已被识破。澳大利亚迪肯大学的研究人员Russell Keast博士和博士生Jessica Stewart，在与阿德莱德大学、联邦科学与工业研究组织(CSIRO)以及新西兰梅西大学的同事们发现，除去人体现存的五种味觉即成、甜、苦、酸和辣以外，人体可能还有第六味觉脂肪味觉。
调查人员把奶油中脂肪含量分为四种，即0％、2％、6％和10％，被调查人员需找出他们认为最为油腻的奶油，并按脂肪含量进行排序。结果显示人体的脂肪敏感相差悬殊，与脂肪消化能力强身体指数高的人群相比，那些对脂肪昧觉极为敏感的人能更准确的分辨奶油中脂肪含量的差异。
Keaste博士认为，目前高脂食物已是家常便饭。而同时人体对脂肪味觉的敏感程度越来越低，以致一些人过度摄食高脂食物。“那些对脂肪味敏感，即使脂肪酸浓度极低也能察觉的人，比不敏感的人吃下更少脂肪，我们也发现这些人的体重指数(Body Mass Index，简称8MI)较低。”Keaste博士说。从这个角度上看，吃蛋糕喜欢吃奶油的姑娘，并不一定是坏事。而与此相对那些只吃下面蛋糕坯的姑娘，没了口福是自己的事情，也不要耿耿于怀对方为什么不胖了吧?
有没有无需运动节食又不用吸脂的减肉法?
对于这个问题，科学家和医学家在实验室不懈地探索，褐色脂肪细胞显然是一个突破口。
褐色脂肪细胞与白色脂肪细胞本身相生相克。褐色脂肪细胞有助于降低体重，与此形成鲜明对比，当人体内有更多的白色脂肪细胞时，体重将会增加。由此，纽约Albert Einsteln医药协会的Mark Czaja博士和他同事打起了通过技术手段来操作脂肪细胞的
发育的主意。使之转变为褐色脂肪细胞，而不是白色脂肪细胞，这将可能是治疗肥胖症的一种有效手段。他们通过调节老鼠体内的细胞生长过程，无法履行细胞的发育过程的自噬过程，比正常情况下产生了更多的棕色脂肪细胞和较少的白色脂肪细胞。因此，这些小老鼠要比正常情况下瘦弱。
无独有偶，前文讲过的波士顿乔斯林糖尿病中心的Cypess博士也在置身于如何提高褐色脂肪储存时限以及将其用于燃烧更多卡路里的办法。他指出，医生或许可以先从人体抽取少量的褐色脂肪，在试管中对其进行增强处理，然后再将其移植回人体。这样的话可能就必须一种药物来提高褐色脂肪的代谢率。而结果就是：你的体内形成一个热量自燃炉。也可能不需要药物。或许只要不总呆在恒温环境中，或者对那些生活在凉爽气候中的人们只要增加在户外的时间就可以提高褐色脂肪的代谢率。
Cypess说：“我们需要计算出坐在16、22和27度的家中，你燃烧的卡路里分别是多少。这可能是非常简单的减肥和保持健康的办法，也是一种环保办法。”但有个问题他没有说到，天气越冷，不会越饿吗?
Tips：
英国最新型的减肥方法——冷冻溶脂术受到热捧，其实也是走了脂肪细胞的老路子。不过与热量溶解白色脂肪细胞反其道行之，采取冷却手段锁定、冻结并最终分解白色细胞。纽约皮肤病学家David Goldberger解释说：“冷冻溶脂过程逐渐吸收皮下脂肪的热量。脂肪细胞的温度被降至零华氏度，也就是将它们冻结。低温在杀死脂肪细胞的同时不会影响皮肤或者肌肉。死亡的脂肪细胞随后通过肝脏被排出体外。”但缺点是治疗过程漫长，不能立刻看到效果：另外一个疑惑更为可怕，如果死亡的脂肪细胞没有全部排出体外怎么办?
自虐减肥法上瘾了吗?
类似于21天减肥法或者说绝食法减肥，几近于自虐。即使是需要在体重秤上吃苹果的芭蕾舞演员，也不会完全不进食，但还是有人乐于使用这种极端的方法。
其实这种案例并不在少数，疯狂减肥到内分泌紊乱甚至绝经的少女们也不是个例。各大论坛也经常重现苦劝不要过度减肥的过来人。医学家也在利用激素疗法控制肥胖的同时，也可以应用激素来治愈患有严重脂肪障碍的病人。典型案例是哈佛大学Christos Mantzoros及其同事治愈了一个由于身体脂肪非常少而停止月经的女田径运动员，使她恢复了正常的排卵期月经周期。
上个世纪90年代中期，洛克菲勒大学Jeff Friedman博士及其同事用定位克隆技术鉴定出一种受肥胖驱动的细胞激素——瘦素。缺乏瘦素的小白鼠代谢缓慢，但食物吸收却明显增加，呈现出肥胖的表征。这种激素不仅可以应用于糖尿病的治疗，也可以进行肥胖病。用重组人瘦素代替瘦素可以明显地降低食物吸收和身体重量。NIDDK Phil Gorden研究组和德克萨斯西南大学mAbhlmanyu Garg研究组已经将重组人瘦素应用于严重脂肪障碍的病人。据此，圣地亚哥的Amylin制药公司的研究人员Christian Weyer在文章中自信满满地写道：“瘦素对于处在某种‘低瘦素’状态的人可能有潜在治疗效应。”
纤维细胞细胞 篇12
1 材料与方法
1.1 主要试剂和载体
SalⅠ酶,宝生物工程(大连)有限公司生产;BamHⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、T4 DNA连接酶,Promega公司生产;胶回收试剂盒、TIANGEN脂质体Lipofect,天根生化科技(北京)有限公司生产; pUC57载体,南京金斯瑞生物科技公司生产。
1.2 小鼠MSTN基因RNA干涉载体的构建
采用前期工作[6]中筛选获得的小鼠MSTN基因RNA干涉载体pRNAT-M1,即根据GenBank中MSTN基因序列设计合成3种MSTN基因siRNA序列,将其与干涉载体连接获得3条snRNA序列M(M1、M2和M3),再连接到pUC57载体上后获得pUC57-M1、pUC57-M2和pUC57-M3。利用BamHⅠ和HindⅢ对pRNAT-U6.1/Neo质粒进行双酶切后获得酶切产物pRNAT-BH;利用BamHⅠ和HindⅢ分别对pUC57-M1、pUC57-M2和pUC57-M3进行双酶切获得M1、M2和M3;将pRNAT-BH分别与M1、M2和M3片段进行连接获得重组质粒pRNAT-M1、pRNAT-M2和pRNAT-M3,获得重组质粒通过293GP细胞检测,获得对MSTN基因的干涉效率最佳的pRNAT-M1。
1.3 小鼠骨骼肌特异性启动子RNA干涉载体的构建
1.3.1 SP启动子的合成
根据X.Li等[7]报道的骨骼肌特异性启动子SP序列,合成如下序列的启动子SP(由南京金斯瑞生物科技公司生产),并与pUC57载体连接,构建pUC57-SP载体。SP启动子序列为GAATTCCACCATTCCTCACGACACCCAAATATGGCGACGGGTGGTAAGGAGTGGCGAGATTTTTATTGAGGGGTGGTAAGGAGTGGGTTGTGGACGACGGACGGCGCTCTAAAAATAACTCCCGCGAGATTTTTATTGAGGGGTGGTAAGGAGTGGACACCCAAATATGGCGACGGCACCATTCCTCACCTGTGGGTTTATACCGCTGCCCCGGGGCCGCATTCCTGGGGGCCGGGCGGTGCTCCCGCCCGCCTCGATAAAAGGCTCCGGGGCCGGCGGCGGCCCAGGATCC。
1.3.2 SP启动子RNA干涉载体的构建
利用EcoRⅠ和BamHⅠ对上述的pUC57-SP载体进行双酶切处理,并利用胶回收试剂盒回收SP启动子序列;利用EcoRⅠ和BamHⅠ对pRNAT-M1进行双酶切,去除U6启动子;利用T4 DNA连接酶对SP启动子序列与去除U6启动子的pRNAT-M1载体进行连接,获得肌肉特异启动子RNA干涉载体重组质粒pRNAT-SP-M1;将pRNAT-SP-M1用SalⅠ酶经单酶切进行线性化。
1.4 转pRNAT-SP-M1小鼠成纤维细胞的筛选
1.4.1 成纤维细胞的原代和传代培养 采用刘欣等[8]选用的方法,利用妊娠第13.5天的ICR小鼠(编号分别为SCXK-J-2007-0003、SYXK-J-2007-029011)胎鼠皮肤获取成纤维细胞,并用每孔含500 μL培养液(含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、1%谷氨酰胺和1%非必需氨基酸的DMEM液)的24孔培养板置于二氧化碳培养箱(37 ℃、5%CO2、100%湿度)中进行原代和传代培养。
1.4.2 G418浓度的筛选 当经上述传代培养的小鼠成纤维细胞达到80%汇合时,向培养孔中以50,100,200,400,600,800,1 000 μg/mL的浓度添加 G418,并置于二氧化碳培养箱中续培养,每隔48 h用含有相应G418浓度的培养液更换原培养液,并观察细胞的形态和增殖情况,以筛选G418的最佳浓度。
1.4.3 成纤维细胞的转染与筛选 1)pRNAT-SP-M1转染。在转染前1天,用胰酶对传代培养的小鼠成纤维细胞进行消化,用不含抗生素的培养液制备细胞悬浮液,然后将其导入含有培养液(不含抗生素)的24孔培养板的孔中(500 μL培养液中含有0.5×105～2.0×105个细胞),并置于二氧化碳培养箱中进行培养;当培养的细胞达到50%～60%汇合时,采用Lipofect脂质体法将0.8 μg线性化质粒 pRNAT-SP-M1导入培养孔中,并续培养12 h;然后去除原培养液,再添加含有抗生素的培养液进行续培养。
2)阳性细胞的筛选。将经上述转染的小鼠成纤维细胞在续培养后的第48小时时,添加筛选的最佳G418浓度进行阳性细胞筛选。将获得的转基因阳性细胞通过挑克隆并进行续培养,当细胞达到80%以上汇合时进行传代培养,或采用常规方法进行冷冻保存(-196 ℃)并经解冻复苏后进行传代培养。
1.4.3 转基因细胞系的鉴定 将上述获得的转基因阳性细胞进行传代培养,观察其细胞形态、生长曲线、冷冻复苏后增殖特点等。此外,根据基因组DNA提取试剂盒说明提取上述筛选获得的转pRNAT-SP-M1的阳性细胞的基因组DNA。采用根据pRNAT-SP-M1干涉载体序列设计的引物(序列为5′-TTGGAGGTCGCTGAGTAGTG-3′,5′-TAGAAGGCACAG
TCGAGG-3′)对细胞基因组DNA进行PCR检测。
2 结果
2.1 骨骼肌特异性RNA干涉MSTN基因载体的构建结果
将pRNAT-SP-M1载体采用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳,结果约在300 bp处观察到目的条带(见图1)。
1.DNA MarkerⅢ;2.pRNAT-SP-M1酶切产物。
2.2 筛选转基因阳性细胞的最适G418浓度
将小鼠成纤维细胞分别用含有50,100,200,400,600,800,1 000 μg/mL G418的合成培养液进行培养。结果是G418为高浓度600,800,1 000 μg/mL时,培养的细胞快速死亡(9～10 d全部死亡);而当G418浓度较低(200,100,50 μg/mL)时,细胞死亡缓慢。推测G418浓度为300 μg/mL时,细胞经培养后第12天左右能达到全部死亡,因此以该浓度作为筛选骨骼肌特异性RNA干涉序列抗性细胞的适宜浓度(见图2)。
2.3 转基因阳性细胞的形态特征
将筛选的转基因阳性细胞经传代培养后,其细胞呈现原代培养的小鼠成纤维细胞的梭形(见189页彩图3),在倒置荧光显微镜下可观察到细胞发出绿色荧光(见189页彩图4)。
2.4 转基因阳性细胞的生长曲线
将转基因阳性细胞进行传代培养时,其细胞在贴壁后2 d内生长缓慢,在第3～6天细胞增殖较快,第7天后细胞的增殖变化趋于平缓,细胞生长曲线呈现正常细胞生长规律的“S”形(见图5)。
2.5 经冷冻保存的转基因细胞的形态和生长曲线
采用常规方法对转基因阳性细胞进行冷冻复苏和传代培养后,在倒置荧光显微镜下,细胞呈现与新鲜转基因阳性细胞相似的梭形(见189页彩图6),并在激发荧光时发出绿色荧光。此外,细胞生长符合一般细胞生长规律的“S”形(见图7)。
2.6 转基因阳性细胞的PCR鉴定结果
提取克隆并经传代培养获得的4株转基因阳性细胞的基因组DNA,并利用设计的pRNAT-SP-M1载体的特异性引物进行PCR扩增,其结果是阴性对照(正常小鼠基因组)未检测到目的条带,4株转基因阳性细胞扩增得到与阳性对照(pRNAT-SP-M1质粒)相同的约580 bp的目的条带(见图8)。
1.DL-2 000 Marker;2.阳性质粒PCR;3～6.阳性细胞株; 7.阴性对照。
3 讨论
据T.R.Magee等[9]和J.N.Artaza等[10]分别采用注射MSTN基因的siRNA质粒和整合有MSTN基因的siRNA逆转录病毒的方法,降低了小鼠MSTN基因的mRNA和蛋白质表达,并提高肌纤维长度和肌肉质量。但是,由于肌肉组织结构特点及其逆转录病毒感染细胞的随机重组,采用前者往往导致质粒不能到达靶细胞,而后者出现高频的镶嵌现象或逆转录病毒序列可能干扰转基因表达。
R.D.Palmiter等[11]获得能够在肝脏中特异表达人生长激素的带有白蛋白启动子的人生长激素基因的转基因鼠,说明如果选用适合的启动子并与目的基因连接构建组织特异表达的融合基因,利用通过转染体细胞获得及获得的转基因阳性细胞的核移植就能获得转基因动物。已有研究证实,许多转录因子调节成肌细胞分化,其中MyoD、Myf5、Myogenic和MRF4最为重要。MSTN蛋白影响这些转录因子的表达而抑制成肌细胞的增殖和分化[12],其中前2个因子主要在干细胞分化为成肌细胞过程中起作用,而后2个因子主要在成肌细胞分化为成熟肌纤维过程中起作用。另据报道,MSTN在脑、心脏、肾脏等组织中也有低表达,且MSTN与MyoD、Myf5、Myogenic和MRF4间具有密切的调控关系[13,14]。因此,这些因子基因的启动子不适合用于表达外源的MSTN基因siRNA。
迄今为止,尚未见到利用肌肉特异性启动子和MSTN基因的RNA干涉序列构建融合基因获得转基因动物的相关报道。为了筛选肌细胞特异表达MSTN基因RNA干涉序列的小鼠成纤维细胞株,本研究利用X.Li等[7]人工设计的高表达效率和序列明确的肌肉启动子序列,即合成肌肉启动子SP,连接前期工作中获得小鼠MSTN基因的RNA干涉载体pRNAT-M1,构建了小鼠肌肉特异的MSTN基因RNA干涉载体(见图1),将其线性化后转染小鼠成纤维细胞并通过最佳G418浓度筛选获得了转基因阳性细胞。将获得的阳性细胞采用细胞学方法观察细胞的形态、生长特性的同时,采用分子生物学方法对其基因组DNA进行了PCR鉴定,其结果说明转基因阳性细胞呈现正常小鼠成纤维细胞的梭形,且在荧光显微镜呈现出表达绿色荧光蛋白的绿色并且细胞生长规律符合“S”形曲线。对转基因阳性细胞进行冷冻后复苏,其生长曲线测定结果表明冷冻对细胞生长无影响,且基因组DNA中整合有pRNAT-SP-M1序列。上述结果表明,本研究成功获得了转肌细胞特异表达的MSTN基因RNAi干涉序列小鼠成纤维细胞株。能否利用该细胞采用核移植的方法获得肌细胞中MSTN表达下调的转基因鼠还有待于进一步探讨。
摘要：为了筛选肌细胞特异表达MSTN基因RNA干涉序列的小鼠成纤维细胞株,研究利用人工合成的小鼠肌肉启动子SP,连接前期工作中获得带有GFP基因的小鼠MSTN基因RNA干涉载体pR-NAT-M1,构建真核表达载体pRNAT-SP-M1,将pRNAT-SP-M1线性化后转染小鼠成纤维细胞并通过300μg/mL G418筛选获得转基因阳性细胞。结果表明:获得的转基因阳性细胞呈现正常的小鼠成纤维细胞的梭形,且在荧光显微镜下呈现出表达绿色荧光蛋白的绿色;转基因阳性细胞的生长曲线呈“S”形;转基因阳性细胞经冷冻复苏后,仍具有正常的细胞形态和增殖特性;PCR鉴定结果显示转基因阳性细胞基因组DNA中整合有pRNAT-SP-M1序列。说明成功获得了转肌细胞特异表达的MSTN基因RNA干涉序列小鼠成纤维细胞株。