外周血干细胞

外周血干细胞（共12篇）

外周血干细胞 篇1

摘要：目的:探讨和研究外周血造血干细胞移植治疗血液病的临床效果。方法:回顾性分析22例血液病患者的临床资料, 其中4例采用异基因外周血造血干细胞移植, 18例采用自体外周血造血干细胞移植。结果:以上患者均能成功造血重建, 未发生严重移植物抗宿主病, 无移植相关死亡, 随访2年, 自体基因移植组患者3例因复发死亡, 异基因移植组患者无复发或死亡。结论:外周血造血干细胞移植对于血液病的治疗有着造血重建快, 移植相关并发症和死亡率低, 是治疗血液病的一种安全有效的方法。

关键词：血液病,外周血肝细胞移植,造血重建

随着社会的发展和科技的进步, 在治疗血液病方面也卓有建树, 外周血造血干细胞移植 (PBSCT) 已经作为一种治疗血液病的有效手段被临床所重视。笔者就我院近年来22例经PBSCT治疗的血液病患者的临床资料进行了回顾性分析, 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取我院自2008年4月—2010年4月期间所收治的22例血液疾病患者的临床资料作为研究对象, 其中男性16例, 女性6例, 年龄在12～66岁之间, 平均年龄 (47.4±12.9) 岁。根据移植细胞来源分为两组, A组4例患者采用异基因外周血造血干细胞移植 (allo PBSCT) , 其中急性淋巴细胞白血病1例, 急性重度再生障碍性贫血1例, 慢性粒细胞白血病2例;B组18例患者采用自体外周血造血干细胞移植 (auto PBSCT) , 其中淋巴瘤15例, 急性淋巴细胞白血病2例, 多发性骨髓瘤1例。

1.2 方法

(1) A组患者采用异基因外周血造血干细胞移植治疗, 急性淋巴细胞白血病患者给予移植前7天白消安1mg/kg, 每6h一次, 连续用药4d, 氟达拉滨25mg/m2·d, 连续用药3d, 移植前1天给予患者全身放疗3Gy/次;慢性粒细胞白血病患者给予移植前10天羟基脲80mg/kg, 移植前9天阿糖胞苷2g/m2, 移植前8天给予白消安1mg/kg, 每6h一次, 连续用药3d, 环磷酰胺1.8g/m2·d, 连续给药2d, 司莫司汀250mg/m2。急性重度再生障碍性贫血患者给予移植前5天氟达拉滨30mg/m2·d, 连续用药5d, 移植前2天期给予环磷酰胺60mg/kg·d, 连续2d。

(2) B组患者采用自体外周血造血干细胞移植治疗, 淋巴瘤患者移植前6天给予卡莫司汀300mg/m2·d静滴给药, 移植前5天起给予依托泊苷400mg/m2·d静滴, 阿糖胞苷1.5g/m2·d静滴, 移植前1天给予马法兰140mg/m2·d口服或静滴;急性白血病患者在移植前7天起给予白消安1mg/kg, 每6h一次, 连续给药4d, 移植前3天起给予环磷酰胺60mg/kg·d, 连续给药2d;多发性骨髓瘤患者给予大剂量马法兰治疗, 马法兰200mg/m2·d。

(3) A组供者外周血造血干细胞动员采用粒细胞集落刺激因子10mg/kg·d进行皮下注射, 连续用药5d, 在用药4d之后利用血细胞分离机进行造血干细胞的采集, 每次采集血量为10L;B组采用化疗联合G-CSF动员造血干细胞, 在白细胞数>10×109/L时进行外周血造血干细胞的采集, 将采集液和细胞冷冻保护液以1∶4的比例混合, 冷冻保存。

(4) 两组患者在预处理结束当天进行干细胞回输。在输入前30min给予患者地塞米松5mg静注, 5%碳酸氢钠液250mL静滴, 细胞液经40℃水浴回温后迅速输入。B组患者在移植3d后给予G-CSF300mg/d皮下注射, 直至白细胞计数达10×109/L停止用药。

1.3 统计学方法

使用SPSS13.0软件对以上数据进行统计分析, 数据计量以 (珚x±s) 来表示, 组间比较则采用t检验;计量数据以百分比显示, 组间比较使用χ2来检验, P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

以上患者干细胞动员均一次成功, 采集一般在1～2次, 两组对比无统计学意义 (P>0.05) 。两组患者均能够成功获得造血重建, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。A组患者在造血重建后经检测均为完全嵌合体, 血型转为供血者血型。治疗过程中有21例患者出现并发症, 其中12例发生口腔溃疡, 14例出现低热, 3例出现轻度皮疹, 2例出现头痛、嗜睡现象, 经对症处理后均迅速好转。在骨髓移植抑制期无患者出现GVHD、感染等严重并发症。随访2年, A组患者未见移植相关并发症或死亡现象;B组患者2例骨髓瘤复发、1例急性白血病髓外复发导致患者死亡。

3 讨论

PBSCT相较于骨髓移植术有着造血重建快、抗生素使用少、费用低及住院时间短等优点, 同时也有利于扩大供者来源[1]。目前就恶性淋巴瘤细胞疾病而言, 化疗联合PB-SCT是最为常用的治疗手段, 有文献指出, 50%左右的霍奇金淋巴瘤复发患者可以接受allo PBSCT而长期生存[2]。从本文数据也可以看出, PBSCT移植相关的复发和死亡率均较低, 而且对于移植常见的并发症也有较好的预防措施, 使造血功能能够更好地得到重建。

参考文献

[1]SUREDAA.Autologous and allogeneic stemcell transplanta-tion inHodgkin’s lymphoma[J].Hematol Oncol Clin NorthAm, 2007, 21 (5) :943-960.

[2]CASHENAF, BARTLETTNL.Therapy of relapsed Hodgkinlym-phoma[J].Blood Rev, 2007, 21 (5) :233-243.

外周血干细胞 篇2

红鳍笛鲷外周血细胞的显微结构观察

报道了红鳍笛鲷(Lutjanus erythopterus)外周血细胞的显微结构,血涂片经过Wright染色液染色,可区分出:红血细胞、血栓细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等5种血细胞,无嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞.白血细胞中:血栓细胞体积最小,单核细胞体积最大;血栓细胞数目最多,嗜中性粒细胞和单核细胞数目最少;淋巴细胞有大中小3种类型:大淋巴细胞、中淋巴细胞和小淋巴细胞.此外,在外周血液中还观察到少量幼稚的红细胞,偶而可见正在分裂的红细胞,提示红细胞也可在外周血直接分裂.

作 者：曹伏君 朱晓燕 CAO Fu-jun ZHU Xiao-yan 作者单位：湛江海洋大学,水产学院,广东,湛江,524025刊 名：海洋科学 ISTIC PKU英文刊名：MARINE SCIENCES年，卷(期)：30(5)分类号：Q461 S943关键词：红鳍笛鲷(Lutjanus erythopterus) 血细胞 显微结构

外周血干细胞 篇3

血栓闭塞性脉管炎（thromboangiitis obliterans，TAO）是一种以中、小动脉节段性，非化脓性炎症和动脉腔内血栓形成为特征的慢性闭塞性疾病，多发生于青壮年男性，绝大多数有吸烟史，病变主要累及患肢的中小动脉，使动脉腔狭窄、闭塞，缺血严重最终可能导致截肢致残，严重影响患者生活质量。我院2008年4月～2012年4月采用自体外周血干细胞移植治疗血栓闭塞性脉管炎所致下肢缺血60例（72条患肢），现报道如下。

1 临床资料与方法

1.1 一般资料

本组60例，男50例，女10例，年龄27～42岁，平均35.3岁。所有病例均有吸烟史，6～25年，病程3～26个月，全部患者均有足部和（或）下肢发凉、疼痛，曾出现间歇性跛行50例，发展为静息痛46例，足趾溃疡10例。右下肢21例，左下肢27例，双下肢12例，共72条肢体。24例下肢动脉造影，48例下肢动脉CTA检查，均有股动脉狭窄、腘动脉闭塞，膝关节以下没有流出道。全部患者经过各种药物治疗效果不佳。

病例选择：确诊为血栓闭塞性脉管炎，动脉造影或CTA检查显示腘动脉闭塞，膝关节以下没有流出道者；或者经过其他方法治疗无效者。下肢有感染病灶、过去5年内明确有恶性肿瘤疾病或血中肿瘤标记物（AFP，CEA，PSA，CA19-9，CA125）水平明显升高者、目前仍在吸烟又不准备戒烟者除外。

2 自体外周血干细胞移植术的原理

外周血干细胞移植：硬膜外或椎管内麻醉下患肢沿血管走行区点状深部肌肉注射（深度1.0～1.5cm），每个点0.5ml～1.0ml单个核细胞悬液，点距2～3cm。移植后常规应用抗凝和抗血小板药物。

3 整体护理

3.1术前护理

3.1.1 心理护理

由于下肢缺血性静息痛甚至溃疡、组织坏疽，病程长，久治不愈，长期遭受疼痛的折磨，活动少，睡眠质量差，情绪也可能变得易激惹或抑制[1]。护理人员要针对病人的疼痛、焦虑程度，对病人进行耐心细致的护理，与患者沟通，向患者讲解手术的方法、基本原理、预后情况、目前治疗慨况等，恢复患者战胜疾病的信心，清除患者对手术的恐惧，使患者积极配合治疗。

3.1.2术前宣教

（1）告知患者吸烟是主要危险因素，烟草中的烟碱和尼古丁使血管痉挛更加严重，告诫患者绝对戒烟，以免病情加重；再次，高浓度的乙醇对血管内皮细胞有一定的刺激和损伤，加重动脉硬化，并可导致血栓形成，引起慢性肢体缺血的急性发作[1]，因此，要求患者绝对戒烟、禁酒。

（2）指导患者饮食上要清淡，进高蛋白、高维生素、低脂低盐饮食，少食动物内脏，以新鲜果蔬、豆类、粗粮等易消化食品为主食，多食纤维素、新鲜蔬菜瓜果及黑木耳等降低血液粘滞度的食物，忌食辛辣油腻食物[2]。

（3）告知患者避免用热水洗浴，以免增加组织代谢，加重症状。

（4）适当保暖，避免过冷、过热，肢体严重缺血后，宜平放，避免加压，限制活动，以利于侧支循环建立[1].

3.1.3术前检查护理

（1）动脉血管造影前向患者讲解造影的必要性。术前4小时禁食，做碘过敏试验、备皮，术前1小时测血压、血糖，异常时对症处理。造影后平卧，患肢制动，穿刺处加压包扎24小时，沙袋压迫6小时。观察穿刺点有无渗血、肢体远端皮肤温度、颜色及动脉搏动情况；观察有无造影剂迟发过敏反应。动脉血管造影后鼓励患者多饮水，促进造影剂排泄。

（2）患者做好各项化验检查，尤其是凝血功能测定，与术中、术后治疗的检测结果对照。

（3） 术前应用多普勒检查踝肱指数，了解患肢血流情况。

（4）术前外周血干细胞的动员：使用重组人粒细胞集落刺激因子（rhGCSF，惠尔血）150μg/d，皮下注射5天，動员过程中常规低分子肝素抗凝。

（5）术前外周血干细胞采集：用血细胞分离机作连续单个核细胞（MNC）采集，循环总量为10000 ml～13000ml，采集终体体积（120～260）ml，MNC总量（2.3～3.6）×1010个。

（6）术前皮肤准备：术前一天按常规备皮。

3.2术后护理

3.2.1执行全麻或硬膜外麻醉术后护理常规。

3.2.2观察病情 ：

（1）生命体征监测：观察血压、脉搏、呼吸、体温情况。

（2）血管通畅度：手术的目的是改善肢体血液循环，因此术后要密切观察肢端的血液循环，主要是足趾的颜色、温度、运动及足背、胫后动脉的搏动情况。

（3）切口观察：观察切口有无渗血、红肿等的发生。

3.2.3活动指导：指导患者床上做足背伸屈活动，以利小腿深静脉血液回流。术后3天可离床活动。

4 讨论

自体外周血干细胞移植治疗是血栓闭塞性脉管炎最新的一种简单、安全、有效的方法。我科60例接受自体外周血干细胞移植治疗血栓闭塞性脉管炎的患者中，经临床随访9～36个月，所有患者行走距离增加，症状减轻，疗效较好。干细胞移植能有效地增加患者下肢血流，使患者疼痛得到了快速而显著的改善，溃疡也逐渐愈合，最终成功地挽救了患肢[3]统化的整体护理有助于提高病人的满意度，促进疾病的康复。

参考文献

[1] 张鸿颖，单爱静，施娅雪.123例Fontaine IV级重症下肢动脉缺血的护理.护理研究，2007，21（11）：2883-2885.

[2]柏曙霞.下肢动脉硬化闭塞症患者行人造血管旁路移植术的护理.护理学报，2008，15（1）：36-37.

外周血干细胞 篇4

1 一般护理

1.1 术后接病人至病房

急救物品处于完备状态, 设专人护理, 密切观察病人意识、面色、表情的变化, 查看穿刺创口情况, 局部是否有血肿、渗出以及末梢肢体温度和术侧足背动脉搏动情况, 保证输液管路通畅, 阅读护理记录单并记录。应用监护仪监测各项生命体征。每4 h测体温1次, 体温如果不超过38.5℃, 且患者能耐受, 不需要做特殊处理, 鼓励其适量饮水, 一般可自行消退。体温超过39.0℃, 可遵医嘱给予物理降温及对症处置。出汗较多时应及时更换衣裤和床单, 同时保持皮肤干燥、舒适, 防止因大汗发生虚脱。对于继发性感染引起的发热应及时应用抗生素并给予抗高热处理。

1.2 心理护理

因多年的疾病折磨, 患者心理状态复杂, 变得脆弱、过分地关注自我。护理人员要根据患者的心理承受能力同家属一起帮助患者了解术后配合的重要性, 详细介绍各项护理的目的、方法、注意事项以及患者如何配合医护人员开展工作, 以缓解患者由于专业知识的缺乏而带来的心理紧张, 把心理状况调整好, 使其能以较舒适、平静的心境和较强的毅力去面对困难。多与患者沟通, 转移其注意力以缓解不适症状, 满足病人的各种合理需求, 避免因机体的不适而产生恐惧心理, 让其感觉到在需要帮助时会及时得到有关人员的帮助, 以取得最大限度的配合。

1.3 饮食护理

病人介入治疗后, 为防止腹胀、排便困难, 24 h内应忌食重油肥腻、粗糙、生冷刺激性食物, 口腔护理每日3次。慢性肝衰竭的病人多数全身状况差, 并伴有低蛋白血症, 应合理安排膳食结构以提高机体免疫功能, 给病人食新鲜水果和绿叶蔬菜, 进食切勿过热、过饱。患者食欲不振, 进食量少, 宜食开胃降逆的清淡食物, 如藕粉、玉米糊和山楂糕等食物[1]。必须提高膳食的热量, 宜进食易消化吸收的脂肪, 如蜂蜜、蜂王浆、蔗糖和植物油等, 多吃富含蛋白质的食物, 尤其是优质蛋白质, 如瘦肉、蛋类、豆类和奶类等, 以防止白蛋白减少。但肝功能不好时, 要控制蛋白质的摄人, 以免过多进食蛋白质诱发肝性脑病。

1.4 体位的护理

术后24 h必须卧床, 取仰卧位, 要求严格的术侧肢体制动, 这种体位会影响患者的生活秩序与生理功能, 如不习惯床上排便导致排尿困难, 害怕穿刺部位出血不敢挪动身体导致腰背酸痛、肢体麻木, 极易引起患者烦躁、焦虑等负性情绪。责任护士可在患者腰部垫小枕, 每2 h取放1次, 告知患者健侧下肢可自由屈伸, 并随时按摩受压部位, 更换体位的时间根据患者的耐受程度决定。在夜间时由于护理人员少, 为避免患者熟睡后不由自主地翻身, 术后在征得其同意的情况下可用约束带固定穿刺侧下肢, 以保证体位要求。沙袋去除后, 嘱其术侧肢体伸直, 协助其侧卧, 之后与平卧位交替, 体位变动以患者舒适为主。制动体位24 h后穿刺部位无出血及血肿方可撤除。

2 并发症的护理

2.1 观察术侧动脉血液循环

成品干细胞植入过程中由于导管管径粗或在血管内停留时间长及植入后有可能造成远端肢体动脉栓塞, 术后患肢制动、血流缓慢等均可导致血栓形成, 故术后24 h内要15~30 min巡视1次, 注意观察患者术侧肢体的足背动脉搏动情况及肢体皮肤的颜色、温度, 有无肢体麻木、疼痛、感觉异常、活动障碍等现象, 并与对侧肢体对比[2]。如果出现肢端苍白, 小腿剧烈疼痛、感觉迟钝、皮肤温度下降, 则提示有股动脉栓塞可能, 应及时报告医生采取措施, 同时嘱患者卧床休息, 给予下肢抬高, 局部保暖热敷。

2.2 出血的观察及预防

肝病至终末期肝脏受损严重, 合成凝血因子减少, 血小板降低, 因此要特别加强出血倾向的观察与护理。术后腹股沟穿刺点压迫止血15~20 min后再加压包扎, 并用500 g沙袋压迫止血24 h, 观察沙袋是否滑脱。不同的患者止血时间差异较大, 穿刺侧下肢平伸制动24 h, 72 h内避免剧烈活动。由于术中持续应用抗凝剂, 术后早期需要密切观察切口有无渗血, 避免用力排便使腹压增高致继发出血。另外, 消化道出血是肝病患者常见的并发症, 注意观察有无黑便, 一旦出现消化道穿孔、出血, 应及时通知医生。术后24 h更换敷料时应严格无菌操作。在停止压迫时先轻轻掀起无菌纱布, 仔细观察股动脉穿刺点有无出血或血肿形成, 如果发现有出血或血肿形成, 应立即用纱布压住穿刺点稍上部位, 并通知医师及时处理, 直至局部不再看到渗血, 无皮下血肿, 方可解除加压包扎。

2.3 预防感染

因术前应用集落刺激因子诱导使机体免疫功能下降, 易发生感染, 所以要密切观察病情的变化, 尽可能排除各种诱发感染的危险因素, 严格做好消毒隔离工作, 执行无菌操作技术, 保持室内空气新鲜, 温湿度适宜。室内每日2次用空气消毒机消毒, 每次2 h;每日2次消毒液病室物体表面擦拭消毒, 减少陪床探视, 防止病菌带入, 避免交叉感染的发生。做好皮肤护理防压疮, 指导患者有效咳嗽预防流感。

2.4 疼痛的护理

术后有的患者会有不同程度的腹痛, 对于腹痛的护理要视其轻重而用不同的方法, 让病人正确对待疼痛。告知病人烦躁和紧张只会令疼痛加重, 要保持心境平和, 同时, 护士要关心体贴病人, 让患者说明疼痛部位、性质、程度及持续时间。大多数患者表现为穿刺部位肿胀, 或右上腹胀痛, 有的甚至痛感影响睡眠和饮食, 应指导其放松腹肌;对疼痛不能自行缓解的患者, 可遵医嘱予镇痛、镇静药物, 使之情绪平稳, 随着病情恢复, 不适症状亦会逐渐减轻。

2.5 碘过敏反应

发生率极少, 术前一定要认真执行碘过敏试验, 双人核对试敏结果, 术后及时发现有无碘造影迟发反应, 如迟发性皮疹, 有寒战的感觉, 要准确判断碘造影反应, 及时报告医生及时处理[3]。为防止发生造影剂肾病, 术前应常规检查肾脏功能, 肾功纠正后再进行手术。术后仍需进行肾功的监测, 注意观察尿量、尿色、电解质、酸碱平衡及肾功能等指标的变化。若出现造影剂肾病, 必要时可进行水化疗法, 24 h饮水超过1 500 ml或遵医嘱静点生理盐水, 严重时可行血液透析, 注意透析并发症的观察及肾功的恢复情况。

3 做好出院指导

重视远期随访, 认真制订护理计划给予出院指导, 满足病人对促进疾病康复相关知识的需求。指导病人提高自我护理能力, 做到定期随访, 使患者感到安全感, 因此项手术远期效果好, 要鼓励患者在康复过程中建立自信心, 为恢复自己的健康保持乐观情绪, 建立积极的生活方式, 纠正不良的生活习惯, 不吸烟, 不喝酒, 防寒保暖, 以增强体质, 避免有害的应激源造成的不良影响。需要继续服药者严格遵医嘱用药, 忌滥服损肝药物。告知患者术后半个月后回院复诊, 之后遵医嘱定期返院复查血常规及肝脏功能, 教会患者及家属掌握观察机体异常表现并及时与医生沟通进行对症处理, 如出现不适随时来院检查。

在肝病患者应用干细胞移植治疗技术过程中, 尽管可能出现一些术后不良反应或并发症, 但通过严密观察及时处理, 对患者实施合理的康复指导, 系统的健康教育和出院后的进一步跟踪指导, 可以随时发现问题, 及时给予处理, 顺利渡过术后恢复期, 避免了一些并发症的发生, 肝脏功能得到明显改善, 提高了生活质量和生存率, 有效的术后护理对手术成功具有重要意义。

参考文献

[1]韦艳红.造血干细胞移植的护理[J].全科护理, 2010, 8 (21) :1945-1946.

[2]程永素, 黄冰, 程永红, 等.肝动脉灌注化疗并栓塞治疗原发性肝癌的护理[J].护士进修杂志, 2010 (18) :21.

外周血干细胞 篇5

焦炉工GSTM1、GSTT1基因多态性和外周血淋巴细胞DNA损伤的关系

[目的]探讨GSTM1和GSTT1基因多态性与外周血淋巴细胞DNA损伤的关系.[方法]选择某焦化厂248名焦炉作业工人,其中炉顶区作业工人99人,炉侧作业78人,炉底作业71人.120名与之相匹配的对照人群选自该厂非职业多环芳烃(PAHs)暴露者.采用单细胞凝胶电泳实验观察外周血淋巴细胞DNA损伤;运用多重PCR方法检测GSTM1、GSTT1基因多态性.同时,通过问卷调查的方式了解被调查者的`年龄、吸烟、饮酒和个人职业暴露史.[结果]炉顶和炉侧区作业工人外周血淋巴细胞的Olive尾矩(Olive Tail Moment,OTM)经对数转换后分别为1.37±1.16和1.46±0.97,均明显高于炉底区和对照组(OTM分别为0.98±1.18、0.56±0.99),差异显著(P＜0.05).经调整年龄、吸烟、暴露等级等因素后,焦炉作业组中GSTM1(-)基因型和GSTM1(+)基因型的外周血淋巴细胞DNA损伤分别为1.36±1.15和1.15±1.10,差异无显著性(P＞0.05).其中炉顶区作业工人GSTM1(-)基因型OTM明显高于GSTM1(+)基因型(分别为1.56±1.08、1.09±1.25,P＜0.05).此外,在焦炉作业组中,GSTM1(-)GSTT1(+)基因型OTM为1.44±1.13,明显高于GSTM1(+)GSTT1(+)基因型0.94±1.06,差异具有显著性(P＜0.05);GSTM1(+)GSTT1(-)和GSTM1(-)GSTT1(-)基因型OTM分别为1.36±1.10、1.28±1.17,两者差异无显著性.[结论]在炉顶作业工人中,GSTM1基因型可以明显影响外周血淋巴细胞DNA损伤程度.GSTM1和GSTT1基因存在交互作用,同时携带GSTM1(+)和GSTT1(+)基因型的焦炉作业工人淋巴细胞DNA损伤水平较低.

作 者：白云 商慧珍 柴栋梁 李雅彬 杨晓波 王红 谭皓 邬堂春 BAI Yun SHANG Hui-zhen CHAI Dong-liang LI Ya-bin YANG Xiao-bo WANG Hong TAN Hao WU Tang-chun  作者单位：白云,杨晓波,王红,谭皓,邬堂春,BAI Yun,YANG Xiao-bo,WANG Hong,TAN Hao,WU Tang-chun(华中科技大学,同济医学院,公共卫生学院,教育部环境与健康国家重点实验室,武汉,430030)

商慧珍,柴栋梁,李雅彬,SHANG Hui-zhen,CHAI Dong-liang,LI Ya-bin(太原钢铁(集团)有限公司疾病,控制中心,太原,030027)

刊 名：环境与职业医学  ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF ENVIRONMENTAL AND OCCUPATIONAL MEDICINE 年，卷(期)：2006 23(6) 分类号：Q786 关键词：焦炉工   GSTM1   GSTT1   基因多态性   DNA损伤  

外周血干细胞 篇6

[摘要]目的 探讨胃癌患者根治术后化疗对外周血T 细胞亚群及NK细胞的影响， 了解化疗对机体免疫功能的影响。 方法 选择我院2007年6月～2010年6月32例胃癌根治术后行化疗的患者作为观察组，另选32例健康体检者作为对照组，分别检测两组外周血T 淋巴细胞亚群CD3+ T、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD4+/CD8+及NK细胞的变化情况。 结果 32例胃癌术后化疗患者完全缓解（CR）17例，部分缓解(PR)8例、无变化（SD）5例，进展（PD）2例，总有效率78.1%（25/32）。 胃癌根治术后化疗前32例患者CD4+T细胞、CD4+/CD8+、NK细胞明显低于健康对照组，术后进行3个周期的化疗后，与化疗前比较，32例胃癌患者CD4+T细胞、CD4+/CD8+、NK細胞明显升高（P ＜ 0.05）。 结论 胃癌根治术化疗可以提高患者的临床疗效，化疗后可以提高机体CD4+T细胞、CD4+/CD8+及NK细胞的表达水平。

[关键词] 胃癌根治术；FOLFOX化疗方案；T 淋巴细胞亚群；NK细胞

[中图分类号] R735.2[文献标识码] B[文章编号] 1673-9701（2012）09-0159-02

外周血干细胞 篇7

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 外周血干细胞悬液

签署知情同意、进行细胞免疫治疗的患者, 经粒细胞集落刺激因子G￣CSF皮下注射, 第4.5d和5.5d用MCS PLUS血细胞分离机采集PBSC, 一半用于新鲜培养, 一半冻存用于后期培养。同期留取自体血浆, ￣20℃冷冻, 4℃复融, 反复冻融3次, 高速离心20min, 留取上清置￣80℃保存备用。

1.1.2 主要试剂

抗CD3单克隆抗体 (北京同立海源生物) , 重组人白介素￣2 (IL￣2, 山东泉港药业) , 重组人干扰素γ (IFN￣γ, 上海凯茂生物) , 人外周血淋巴细胞分离液 (中国医学科学院生物工程研究所) , 二甲基亚砜 (DMSO, SIGMA) ;CD3、CD4、CD8、CD56等荧光抗体购自BD;AIM￣V培养基购自GIBCO, RPMI￣1640培养基购自赛默飞世尔。

1.2 方法

1.2.1 外周血干细胞悬液分两组冷冻于￣80℃保存

(1) 外周血干细胞悬液冻存组, 按照干细胞悬液:20%人血白蛋白:6%羟乙基淀粉:DMSO为1:0.25:1.4:0.15的比例冻存; (2) PBM-NCs冻存组, 部分PBSC经淋巴细胞分离液分离洗涤后, 用含10%的自体血浆和10%DMSO的1640培养基重悬后放于冻存盒中直接冻存。1个月后42℃复苏细胞, 1%台盼蓝染色后计数细胞存活率。

1.2.2 CIK细胞诱导培养

(1) 外周血干细胞悬液冻存组, 取出后42℃水浴轻微摇动复溶, 等体积小心加于淋巴细胞分离液层面上, 2000转离心20min, 收集单个核细胞层, 生理盐水洗涤2次后, 用含25%的自体血浆、100ng/ml的抗CD3单抗、2000U/ml的IFN￣γ、1000U/ml的IL￣2及肝素的AIM￣V培养基重悬, 调节细胞浓度至1~3×106/ml种于10cm的培养皿中; (2) PBMNCs冻存组, 取出后42℃水浴轻微摇动复苏细胞, 离心去除DMSO冻存液后, 加入细胞因子浓度同前组的培养基种于培养皿中。置于37℃、5.0%CO2、饱和湿度环境下扩增14~21d, 同时观察细胞增殖状况, 每2~3d补/换液或增甁培养, 并补充IL￣2。培养结束后, 收获细胞检测。

1.2.3 CIK细胞免疫表型分析

分别取诱导培养前PBMNCs悬液和诱导培养第14d的CIK细胞悬液, 调节细胞浓度为5×106/ml, 分别加入各荧光标记抗体染色, 流式细胞仪上机分析, 计算阳性细胞百分率。

1.3 统计学处理

数据采用SPSS 15.0统计学软件进行处理。计量资料采用±s表示, 行t检验。P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 复苏PBMNCs细胞存活率

细胞复苏后, 两组悬液均肉眼观有絮状团块, 细胞涂片瑞式染色后油镜下可见大量破损细胞。 (1) 外周血干细胞悬液冻存组, 台盼蓝染色72.4±2.2%; (2) PBMNCs冻存组, 台盼蓝染色74.2±2.5%, 两组细胞存活率差异不显著 (P>0.05) , 与新鲜培养的细胞存活率差异显著。

2.2 CIK细胞诱导扩增

(1) 外周血干细胞悬液冻存组, 经14~21d培养后CIK细胞总数可达到5.94±1.2×109; (2) PBM-NCs冻存组, 经14~16d培养后CIK细胞总数可达到6.39±1.6×109。两组扩增细胞总数无显著差异 (P>0.05) , 台盼蓝染色活细胞率均超过95%, 但在培养总时间上, PBMNCs冻存组为15.2±0.92d, 干细胞悬液组为18.2±2.35d, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。

2.3 CIK细胞免疫表型分析

比较诱导前PBMNCs和培养的CIK细胞表面标志。见附表。两组CIK细胞均可见总T细胞、CD8+T细胞、CD3+CD56+细胞均较诱导前显著升高, CD4+、CD19+细胞则较前减少。诱导后CIK细胞与诱导前PBMNCs相比较 (P<0.05) 。而外周血干细胞悬液冻存组与PBMNCs冻存组两组间比较 (P>0.05) 。

3 讨论

CIK细胞是一类非主要组织相容性复合物 (MHC) 和非T细胞受体 (TCR) 限制性、以CD3+CD56+和CD3+CD8+为主的效应T细胞群, 其兼具有T细胞强大的杀瘤活性及NK细胞的非MHC限制性杀瘤的特点。细胞免疫治疗与其他肿瘤治疗相比, 对正常骨髓造血功能影响很小, 现已广泛用于黑色素瘤、肝癌、胃癌、肾癌等多种恶性肿瘤的治疗[2]。CIK可通过多种途径发挥抗肿瘤作用: (1) 直接杀伤作用, CIK在与肿瘤细胞结合后, 能够分泌含有大量BLT酯酶的细胞质颗粒, 直接穿透靶细胞膜导致肿瘤细胞的裂解; (2) 进入体内活化的CIK细胞可分泌多种细胞因子 (IFN￣γ、TNF￣α等) , 不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用, 而且还可通过调节免疫系统间接杀伤肿瘤细胞; (3) 可诱导肿瘤凋亡及坏死[3]。

CIK细胞的培养一般是通过血细胞分离机采集患者的外周血单个核细胞进行体外扩增获得, 但恶性肿瘤患者在接受放化疗等治疗手段后, 常存在骨髓造血机能受损、免疫功能低下、身体虚弱、血管穿刺条件差等弊端, 因而寻找多种方法培养足够量的CIK细胞进行过继免疫治疗是必须的。本文结果可见, 细胞复苏后两种方式冻存的悬液均可见有絮状团块及破损细胞, 台盼蓝染色细胞存活率约在70%左右, 发现经过低温保存后细胞均有一定数量的丢失。经体外扩增后, 两组方式培养的CIK细胞总数均可达到6×109左右, 但在培养总时间上, PBMNCs冻存组较干细胞悬液组短, 差异有统计学意义。研究中发现, 干细胞悬液组在复苏后初期培养时有较多的絮状物生成, 导致部分细胞死亡及培养时间延长, 考虑原因可能是冻存时干细胞悬液中含有较多的纤维蛋白原及血小板, 需在培养液中加入少量的肝素以防止絮状物的增多影响细胞扩增。综上所述, 通过在血细胞分离机分离采集单个核细胞时留取部分干细胞悬液冻存后复苏进行CIK细胞培养, 也可以获取有效的输注数量, 省去了反复取材、分离细胞的麻烦, 同时对肿瘤患者来说, 可以作为一种补充手段, 减少细胞采集时的痛苦和大量血液成分的丢失, 也减轻了患者的经济负担。

参考文献

[1]Dudley ME1, Wunderlich JR, Yang JC, et al.Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma[J].J Clin Oncol.2005, 23 (10) :2346-2357.

[2]施明, 王福生, 张冰, 等.自体CIK细胞治疗肝癌的安全性和有效性评价[J].解放军医学杂志, 2004, 29 (4) :333-335.

外周血干细胞 篇8

1临床资料

本组患者40例, 男29例, 女11例, 年龄30～62岁。其中肝炎后肝硬化 34例, 酒精性肝硬化5例, 自身免疫性肝硬化1例。

2术前护理

2.1 心理护理

肝硬化患者病程长, 反复发作, 易出现急躁厌烦情绪。因此护理人员要主动与患者沟通, 观察其举止言谈, 了解其心理, 有针对性地对进行心理疏导[1];鼓励患者多与他人交流, 引导护理人员听舒缓、优美的乐曲, 以克服抑郁、忧伤、悲观情绪, 达到心情舒畅。耐心向患者讲解干细胞移植的作用, 减轻或消除护理人员心理疑虑, 能够积极接移受干细胞移植。 (2) 入院时即指导患者严格戒烟酒, 每日口服乳果糖保持每日大便2～4次。选择营养丰富、清淡易消化、低脂低盐的饮食;进食时要细嚼慢咽, 定时定量, 避免暴饮暴食及粗纤维、煎炸食品;限制烫食、甜食、咖啡、浓茶及生冷、辛辣食物摄入[2]。摄入适当水果与蔬菜, 保持大便通畅, 避免食道静脉曲张破裂出血, 预防肝性脑病。 (3) 讲解身体对由自身抽取的干细胞没有排斥反应, 创伤小, 而且干细胞移植到肝脏后能促进肝脏细胞的再生, 使肝功能逐步恢复, 以消除患者的紧张、恐惧心理, 增强其对治疗的信心[3]。 (4) 术前3d分别于9时皮下注射特尔津300μg, 16时注射150μg。每日复查血常规。采血前1h复查血常规。 (5) 采血前指导患者训练床上大小便及沐浴更衣, 会阴部备皮, 置采血管, 同时做好各项护理记录。

2.2 术后护理

以下介绍在数字减影造影术 (DSA) 下经肝动脉干细胞植入后的护理。开腹手术干细胞植入术后护理同普外科护理常规。 (1) 嘱患者术后患肢制动12h, 绝对卧床24h, 下床活动后避免剧烈下蹲, 向患者及家属说明重要性。 (2) 注意观察足背动脉博动情况, 以防穿刺部位包扎过紧, 压力过大而影响术肢血液循环。 (3) 术后按时遵医嘱松解压力圈, 完全松解压力圈后勿强拆穿刺点敷料, 注意查看穿刺部位有无渗血。注意观察生命体征的变化, 必要时予以心电监护及吸氧。 (4) 观察患者有无黄疸、腹水, 记录24h尿量, 按时复查肝功能、血常规。 (5) 指导患者出院后保持良好的生活习惯, 劳逸结合, 保持良好心境, 遵医嘱按时服药, 定期复查, 不适随诊等。出院时发放出院须知1份。

3讨论

自体外周血干细胞治疗肝硬化有其独特的优势: (1) 自体外周血干细胞来源于患者本身, 无免疫排斥反应; (2) 获得途径快捷、简单、方便, 无需等待肝源; (3) 移植术采用微创技术, 创伤小, 患者康复快; (4) 自体细胞无突变发展成肿瘤的危险性; (5) 移植后的细胞容易成活, 中长期的疗效好。目前还没有治疗肝硬化的特效方法, 自体干细胞移植治疗肝硬化是一种新方法, 然而也有不符合纳入标准的患者:患者年龄<20岁或>65岁, 肝脏有恶性肿瘤或有其他部位的肿瘤病史、反复的上消化道大出血病史、自发性腹膜炎、有活动性感染 (病毒或细菌) 、孕妇、严重出血倾向凝血功能极差的患者。

通过对自体外周血干细胞植入术患者的围手术期护理, 笔者认为做好术前准备, 术后密切观察病情变化, 对患者实施有效的护理, 可减轻患者的恐惧心理, 增强患者治疗的依从性, 可增强患者的自我保护能力, 具有良好的效果, 同时降低了治疗费用, 提高了好转率, 对延缓肝硬化的进程减少并发症的发生也起到了一定的作用。

关键词：肝硬化,干细胞移植,围手术期,护理

参考文献

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[2]罗伟香, 朱惠明, 黄勋.内镜下钛夹封闭治疗胃十二指肠急性穿孔的护理[J].中国实用护理杂志, 2004, 20 (11) :31.

外周血干细胞 篇9

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组

3个月龄雄性新西兰大白兔, 体重2.5~3.5 kg, 由第四军医大学动物实验中心提供。将兔随机分为3组, 其中10只为实验组, 接受共培养细胞膜片复合HA移植治疗;10只为BM-MSC对照组, 接受单纯BM-MSC细胞膜片复合HA移植;5只为空白对照组, 不接受任何治疗。

1.1.2 实验试剂及仪器

α-MEM培养基, 青、链霉素 (Gibco, 美国) ;胎牛血清 (FBS, GE Healthcare, 美国) ;Percoll分离液, 抗坏血酸, 地塞米松, 戊巴比妥钠, 羟基磷灰石 (Sigma, 美国) ;谷氨酰胺 (Invitrogen, 美国) ;兔CD34抗体 (Bioss Inc., 美国) ;人重组粒细胞刺激因子 (齐鲁制药, 山东) 。流式细胞仪 (Beckman-Coulter, 美国) , 二氧化碳恒温孵箱 (Thermal, 美国) , 体视显微镜 (Leica MZ9.5, 法国) , 倒置相差显微镜及照相系统 (Olympas, 日本) 。

1.2 方法

1.2.1 兔PB-CD34+细胞的分离

采血前给予兔皮下注射人重组粒细胞刺激因子10μg/kg, 1次/d, 于第5天采血。采用心脏取血的方法, 每只兔取血约80ml。将取得的静脉血与等体积的PBS充分混匀, 采用Percoll分离液分离得到单个核细胞。依据说明书加入抗体标记细胞, 将细胞悬液置于4℃冰箱中孵育30min, 利用流式细胞仪分选PB-CD34+细胞。将分选好的细胞调整密度为1×106/ml, 接种于25 cm2的一次性培养瓶中, 放置二氧化碳孵箱 (5%CO2) 中孵育, 备用。

1.2.2 兔BM-MSC的分离

抽取兔股骨骨髓血, 采用密度梯度离心法分离骨髓血中的MSC[2]。调整细胞密度接种于25 cm2的一次性培养瓶中, 放置二氧化碳孵箱 (5%CO2) 中孵育。24 h后换液, 去除悬浮、未贴壁的细胞, 之后每3 d更换培养液。待细胞生长至80%~90%融合时, 以0.25%胰蛋白酶消化, 按1∶2比例传代培养。

1.2.3 共培养体系的建立

取对数生长期P3 r BM-MSC接种于6孔培养板内, 每孔细胞数量为1×105, 过夜培养贴壁。培养基为含10%胎牛血清的低糖α-MEM培养液, 加入谷氨酰胺2 mmol/L, 青霉素钠和链霉素各100 U/ml。将PB-CD34+细胞加入培养板内, 每孔数量为5×105, 每孔细胞数目之比为PB-CD34+细胞∶BM-MSCs=5∶1。之后1周内培养液不更换, 第2周时培养液每3 d更换1次。共培养14 d后, 弃去未贴壁的细胞。

1.2.4 共培养细胞与单纯BM-MSC成膜诱导

取共培养满14 d的细胞 (于9 cm培养皿中, 2种细胞添加比例同前) 以成膜诱导液 (含10%FBS的α-MEM, 加入地塞米松10 mmol/L、抗坏血酸50μg/ml、谷氨酰胺2 mmol/L、青霉素钠和链霉素各100 U/ml) 继续培养14 d, 每3 d换液1次。相同方法培养单纯BM-MSC。

1.2.5 细胞膜片复合羟基磷灰石移植物的制备

以眼科镊配合细胞刮刀轻轻地收获细胞膜片。将预先在基础培养液中湿润过夜的羟基磷灰石粉末100 mg轻撒于膜片中央, 小心地将其包裹于细胞膜片中, 再将其放入基础培养液, 置于二氧化碳孵箱中孵育4 h, 使其膜缩收紧团块。分别制备共培养细胞及单纯BM-MSC细胞膜片复合物备用。

1.2.6 兔颅骨极限缺损模型的建立和修复

实验动物均接受1%戊巴比妥钠1 ml/kg静脉注射麻醉。麻醉显效后头部剪毛备皮, 用碘酒、酒精交替消毒皮肤。于颅顶部设计舌形切口, 手术刀切开皮肤、皮下组织, 暴露颅骨, 将骨膜翻起, 以手机钻头比照直径15 mm圆形塑料圆片制备全层缺损, 此过程中持续以生理盐水降温, 并注意保护颅骨下的硬脑膜组织。之后共培养实验组及BM-MSC对照组移植事先制备好的移植物, 去除骨膜组织后小心缝合伤口。空白对照组直接缝合伤口。

1.2.7 观察指标

术后, 所有动物继续饲养8周。术后4、6、8周行CT扫描并三维重建。8周后以过量麻醉剂 (1%戊巴比妥钠2 ml/kg) 处死动物, 收集颅骨标本进行检测。

1.2.7. 1 大体观察

活体触诊动物颅骨修复情况。肉眼观察取出标本缺损区修复情况。

1.2.7. 2 影像学观察

所有实验动物术后4、6、8周给予头颅常规CT扫描, 并行三维重建, 比较各组动物颅骨缺损修复情况。

1.2.7. 3 组织学观察

将标本以4%多聚甲醛固定2d后, 17%EDTA (p H 7.0) 脱钙2周, 流水冲洗2 h, 石蜡包埋, 切片, 常规HE染色。

1.2.7. 4 新生骨定量分析

选择通过标本中心、切面完整、染色清晰的切片, 以图像分析软件 (Image-Pro Plus, Media Cybernetics, 美国) 定量检测染色切片, 计算缺损修复率, 公式为新生骨面积/缺损区面积, 结果以x珋±s标准差表示。

1.2.8 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件分析数据, 2组数据之间比较采用双侧t检验, P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 共培养体系的建立及细胞膜片形成

成功分离出兔PB-CD34+细胞及BM-MSC。共培养14 d后, 倒置显微镜下观察共培养细胞呈复层贴壁生长状态, 细胞形态为成纤维样, 细胞之间的形态无明显差异。2种细胞成膜诱导培养7 d左右开始形成薄膜样物质, 并逐日增厚, 14 d后, 于培养皿底部可见一层白色薄膜即为细胞膜片。以细胞刮刀小心自薄膜边缘沿培养皿底部刮下膜片, 此过程中可以发现膜片具有一定弹性及机械性能。倒置显微镜下观察见膜片内细胞呈梭形, 密集、重叠生长 (图1) 。2种细胞膜片从形态学上无明显差别。

A:剥离的细胞膜片;B:培养14 d后膜片中的细胞

2.2 实验动物情况及大体观察

所有动物均对手术、麻醉耐受良好, 无并发症及术后感染。术后8周, 触诊实验组及BM-MSC对照组动物颅顶部缺损处可触及硬组织生成, 质地无明显区别。空白对照组动物颅顶部可触及明显缺损。肉眼观察标本发现, 实验组及BM-MSC对照组动物颅顶缺损区均有骨性组织生成, 空白对照组动物颅顶部仅见纤维性组织生长。

2.3 常规CT扫描并重建结果

所有实验动物术后4、6、8周给予头颅常规CT扫描并行三维重建。可以观察到:空白对照组仅缺损边缘有少量新骨生长;BM-MSC对照组生成的新骨量明显大于空白对照组, 但所生成新骨大部分位于缺损边缘, 而缺损中央部分并不明显;共培养细胞组缺损边缘及中央均有明显的新骨生成, 且术后8周影像显示, 缺损已基本修复 (图2) 。

2.4 组织学观察及定量分析

所取得的标本均行HE染色检查 (图3) , 结果显示:共培养细胞组的成骨效果明显高于2对照组。以图像分析软件定量检测HE染色切片, 各组新生骨修复率为:空白对照组6.3%±1.2%;BM-MSC对照组为14.7%±2.1%;共培养细胞组为29.5%±5.6%, 共培养细胞组与BM-MSC对照组及共培养细胞组与空白对照组之间的差别均有统计学意义 (P<0.05, 图4) 。

3 讨论

细胞共培养是上个世纪80年代发展起来的新技术, 它是将2种或2种以上的细胞混合置于同一环境中进行培养, 以最大限度地模拟体内环境、维持培养体系性状以及观察细胞之间的相互作用。共培养体系建立的目的在于, 利用一种辅助细胞的存在, 诱导另一种目的细胞的分化、增殖及细胞活性的维持等。由于共培养技术能够更好地模拟细胞在体内的生长环境, 因此取得了比单一细胞培养更好的实验效果。国内外的许多研究已经证实, 共培养的不同细胞之间通过“对话”, 能够起到诱导分化、维持和促进细胞活性等作用。Bhandari等[3]将大鼠肝细胞与成纤维细胞共培养发现, 相比单独培养的肝细胞, 18 d后只有共培养体系的肝细胞仍能保存细胞活性与功能。Sorrell等[4]将人皮肤纤维样细胞与血管内皮细胞共培养后发现, 前者通过释放成纤维细胞生长因子和VEGF-A维持了血管内皮细胞的完整性。

在本实验中, 我们采用了直接接触共培养的方法, 以PB-CD34+细胞为辅助细胞, 以BM-MSC为目的细胞。BM-MSC是目前骨组织工程中的应用最广泛的种子细胞, 其促进成骨的能力已得到众多实验的证实[5,6]。以往CD34+细胞均自骨髓血中获得, 但是近年来, 外周血CD34+细胞越来越受到研究者青睐。主要原因是外周血收集方便, 若应用于临床, 还可以使患者省去麻醉及骨髓穿刺之苦。虽然外周血CD34+细胞数量相对较少, 但应用粒细胞集落刺激因子等细胞因子和/或化疗药物刺激之后, 通常能将足够数量的细胞动员至外周血中。根据相关文献的报道, PB-CD34+细胞具有很强的诱导促进血管发生的作用[7,8], 同时其本身也可以分化为MSC而贴壁生长[9,10]。本文的结果证明, 经过PB-CD34+细胞的诱导, BM-MSC的成骨效应可以进一步增强。

细胞膜片技术最初是为了解决组织工程中种子细胞的流失而产生的, 它的原理是通过各种细胞因子、药物等的诱导, 使被培养的细胞分泌大量的细胞外基质而形成的薄膜状细胞聚合体。这一技术由Okano等[11]于1993年首次报道。由于细胞膜片技术保留了一些重要的细胞表面蛋白, 如细胞与细胞间离子通道、连接蛋白、生长因子受体等[12], 使其拥有很多优点, 包括良好的生物相容性;适宜的机械强度和可操作性;细胞接种成功率高、基质丰富;可量化控制, 能够根据实验的需要调整膜片大小和厚度;可以直接用于组织构建, 也可以联合有效的支架材料一起应用。我们采用将细胞膜片包裹培养液预培养的羟基磷灰石粉末修复颅骨缺损, 既能提高移植细胞的利用率, 又能有效地利用羟基磷灰石的骨诱导活性, 在实验中也取得了良好的修复效果。

另外, 我们的研究还存在一些缺点和不足。首先, 没有使用细胞示踪技术, 进一步证明移植的外源性细胞在成骨中发挥了重要作用。其次, 应用流式细胞仪分选外周血CD34+细胞的成本较高, 限制了其临床应用。

综上所述, 我们通过应用共培养细胞修复兔颅骨极限缺损模型, 验证了共培养细胞可以作为一种优秀的种子细胞应用于骨组织工程。通过运用细胞膜片技术复合HA支架材料, 我们有效地修复了兔颅骨极限缺损, 为临床治疗颅骨缺损提供了一种新的思路和方法。

参考文献

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[4]Sorrell JM, Baber MA, Caplan AI.Human dermal fibroblast subpopulations;differential interactions with vascular endothelial cells in coculture:Nonsoluble factors in the extracellular matrix influence interactions[J].Wound Repair Regen, 2008, 16 (2) :300-309.

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[9]Chen JL, Hunt P, McElvain M, et al.Osteoblast precursor cells are found in CD34+cells from human bone marrow[J].Stem Cells, 1997, 15 (5) :368-377.

[10]Mifune Y, Matsumoto T, Kawamoto A, et al.Local delivery of granulocyte colony stimulating factor-mobilized CD34-positive progenitor cells using bioscaffold for modality of unhealing bone fracture[J].Stem Cells, 2008, 26 (6) :1395-1405.

[11]Okano T, Yamada N, Sakai H, et al.A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide) [J].J Biomed Mater Res, 1993, 27 (10) :1243-1251.

外周血干细胞 篇10

1 资料与方法

1.1 主要试剂和材料

比重 (1.077±0.001) 的聚蔗糖-泛影葡胺 (商品名为淋巴细胞分离液) (Pharmacia公司) 。Live/Dead cell-mediated cytotoxicity kit (Invitrogen公司) 。10%小牛血清RP-MI1640 (Gibco公司) , Hank's液 (无Ca2+、Mg2+) , 青霉素100IU/mL, 链霉素100IU/mL, 苔盼兰均系国产, 5mL肝素抗凝管、离心管及5mL带刻度毛细滴管、培养瓶等 (BD公司) 。

1.2 主要实验仪器

研究用生物显微镜, 恒温培养箱, 生物安全柜, 低温离心机及水平式离心机, 流式细胞仪 (gallios, Beckman Coulter, USA) 。

1.3 靶细胞培养

该试验以人红白血病细胞株K562作为靶细胞, 培养液由90%不完全1640培养液, 青霉素、链霉素 (各10 000U) 1mL, 和10%新生牛血清组成, 用于培养靶细胞K562。

1.4 样本采集

收集川崎病患儿入院时血液2mL, 在室温静置2~4h后备用, 同时收集正常儿童外周血作为正常对照。

1.5 Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞

在离心管中加入适量的淋巴细胞分离液, 取收集的川崎病患儿肝素抗凝静脉血2mL与等量Hank's液充分混匀, 然后用滴管将稀释好的外周血沿离心管管壁缓慢加于淋巴细胞分离液上, 水平离心, 300g, 20min。离心后管内分为3层, 上层为血浆和Hank's液, 下层主要为红细胞和粒细胞, 中层为淋巴细胞分离液, 在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带, 单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。用毛细血管将悬浮于上、中层界面白色单个核细胞层吸出, 置入另一离心管中, 加入5倍以上体积的Hank's液, 300g×10min, 洗涤细胞2次。末次离心后, 弃上清液, 加入含有10%小牛血清的RPMI1640, 重悬细胞。

1.6 细胞毒实验 (DIOC18 (3) /碘化丙锭 (PI) 荧光标记法)

首先用DIOC18 (3) (3, 3, -dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate) 标记靶细胞膜, 将收集的靶细胞K562计数后加入适量DIOC18 (3) , 混匀后, 置于恒温培养箱中孵育20min, 然后将K562用PBS洗两遍, 离心400g, 10min, 并再次计数细胞, 同时将分离的患儿外周血单个核细胞 (PBMC) , 计数, 并按效靶比将患儿外周血单个核细胞和靶细胞K562混在一起, 总量为1×106, 然后用红色荧光核染料PI (propidium iodide) 标记效应细胞和死亡靶细胞, 置于恒温培养箱中孵育4h, 孵育后用PBS洗涤, 400g, 10min, 3次。最后通过流式细胞仪分析, 可清楚区分2类细胞 (即PBMC和K562) 。

1.7 统计学方法

靶细胞死亡百分比结果以均值±SEM表示, 组间比较用t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 样本采集

收集7例川崎病患儿外周血, 5例正常小孩外周血。川崎病患儿诊断标准参照《诸福棠实用儿科学》。

2.2 川崎病患儿外周血单个核细胞细胞毒效应与效靶比呈正相关

我们将收集的外周血单个核细胞与靶细胞按照不同的效靶比25∶50∶100混合, 结果表明外周血单核细胞 (PB-MC) 作效应细胞时可观察到靶细胞死亡百分数与不同E∶T比之间存在良好相关。效靶比25组与50组靶细胞死亡率均值分别为18.5%、29.6% (P<0.006) , 效靶比50组和100组靶细胞死亡率均值分别为29.6%、36.4% (P<0.05) , 效靶比25组和100组统计学差异更加显著 (P<0.0001) 。

川崎病患儿外周血单个核细胞的细胞毒效应与效靶比呈正相关, 此图为流式细胞仪检测的细胞毒效应的结果图, 其中横坐标为PI, 纵坐标为DIOC18 (3) , 其中Q2细胞群 (DI-OC18 (3) +PI+) 为死亡的靶细胞K562, 其数字为其死亡细胞百分率。这三幅图从左至右分别为:E/T=25, E/T=50和E/T=100。

2.3 川崎病患儿外周血单个核细胞细胞毒效应

为进一步验证和分析上述川崎病患儿淋巴细胞细胞毒效应, 我们同时收集了6例正常幼儿的外周血。以效靶比为100为例, 通过流式细胞仪检测并分析了淋巴细胞细胞毒效应, 结果表明, 相较于正常幼儿, 川崎病患儿外周血淋巴细胞细胞毒效应明显升高, 其均值分别为25.0%和36.5% (P<0.05) , 具有统计学差异。

2.4 川崎病患儿外周血单个核细胞细胞毒效应与性别的相关性

川崎病好发于男性, 为分析川崎病患儿外周血单个核细胞细胞毒效应是否与性别相关, 我们将病例按照性别进行分类比较, 发现川崎病患儿血液中单个核细胞细胞毒效应与性别有一定相关性, 在不同的效靶比都可以得出相似结果。在效靶比为25组, 男女患儿血液中单个核细胞细胞毒效应均值分别为20.8%、17.4%, 在效靶比为50组, 其细胞毒效应均值分别为32.3%、24.5%, 在效靶比为100组, 男性细胞毒效应为36.6%, 而女性为33.15%, 见图1。

3 讨论

川崎病 (Kawasaki diseaes) , 又称皮肤粘膜淋巴结综合征 (muco-cuta-meous lymph node syndrome MCLS) , 是儿童最常见的全身性血管炎综合征之一。川崎病有自愈性, 但若不及时治疗, 冠脉会受累。现今, 川崎病发病率有不断上升的趋势, 且川崎病已取代风湿热成为我国小儿后天性心脏病的主要病因之一。该病发病率以亚洲较为显著, 特别是日本, 1967年由日本川崎富作医生首次报道。虽然目前对川崎病流行病学、发病机制、诊断标准和治疗方法的临床研究取得了重大进展, 但其发病原因和机理至今仍不清楚。目前, 多数研究认为川崎病是一种免疫介导的血管炎, 是一种免疫异常导致的疾病。我们收集了入院的川崎病患儿外周血以做进一步的分析研究, 结果表明川崎病患儿外周血淋巴细胞参与了细胞毒效应, 以应对外来抗原的入侵, 并且效靶比越高, 其细胞毒效应越强。

由于川崎病好发于幼儿, 且男性发病率高于女性 (1.5∶1) , 因此我们根据患儿的临床信息和实验结果, 进一步分析了患儿外周血细胞毒效应与性别、年龄的关系, 表明患儿外周血细胞毒效应和年龄、性别有一定相关性, 但无显著差异。究其原因, 可能与我们收集分析的案例过少有关, 需加大样本量的分析。因此, 我们可以推测出川崎病与免疫相关, 加大样本量的分析, 更有助于得出可靠数据, 指导临床。参考文献:

参考文献

[1]沈文婷, 蒋利萍, 李淑娟, 等.川崎病急性期患者Th17细胞检测及意义[J].中国免疫学杂志, 2010, 26 (5) :3 215-3 218.

[2]李瑞燕, 李晓辉, 吴泰相, 等.川崎病与病原微生物关系的meta分析[J].临床儿科杂志, 2013, 31 (1) :172-174.

[3]江载芳.实用儿科学[M].北京:人民卫生出版社, 2008:1235.

[4]桂永浩, 川崎病临床研究的现状与展望[J].中华儿科杂志, 2006, 5 (44) :881-882.

[5]申绍夫.川崎病36例临床特点分析[J].临床误诊误治, 2010, 23 (1) :1 384-1 386.

[6]姚倩东, 杨春, 郑敏文, 等.双源CT诊断川崎病冠状动脉病变[J].中国医学影像技术, 2011, 27 (1) :117-119.

外周血干细胞 篇11

摘要：血液学检查在临床检验中所占比重很大，在临床诊断与治疗观察中占有一定的地位。近年来，自动化的血细胞分析仪在我国已相当普及，它不仅大大提高了临床检验效率，减轻劳动强度，在一定程度上也提高了检验的精密度和准确性，但过分依赖血细胞分析仪而忽略显微镜检查，易导致漏报、漏诊。

关键词:血细胞分析；形态学检验；临床价值

中图分类号:R446.11+3文献标识码:A文章编号:1004-4949(2013)05-075-01 血细胞分析仪因为操作简单、检测快捷、工作效率高而被各医院的实验室运用于日常检验工作中，导致了血细胞形态学镜检这一基本技能逐渐被忽视［1］，因为这类仪器在鉴别血细胞的形态和内部结构等方面仍不够完善，并存在一定的缺陷，它尚不具备识别红细胞、白细胞、血小板形态的能力，也不能完全替代显微镜对血细胞形态学的检查，因此，在利用血细胞分析仪进行血常规检验的同时，辅助外周血细胞形态学镜检，能弥补自动化分析仪本身所存在的缺陷与不足，这对于提高医院检验科血常规工作质量是非常有价值的。

1血细胞分析仪白细胞分类相对单一

目前国内所使用三分类血细胞分析仪基本上都是根据白细胞体积大小而分类，只能将白细胞分为淋巴细胞百分率，中间细胞群百分率，粒细胞百分率三个群，对嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞和单核细胞则不能很好地区分与识别，更不能辨认原始细胞、幼稚细胞及异常淋巴细胞。五分类血细胞分析仪虽然在一定程度上弥补了三分类血细胞分析仪所存在的一些缺陷与不足，但是也只能提供正常血液标本中各种白细胞数目的大致分布情况，仍不能准确辨别各类原始细胞、幼稚细胞以及细胞的内部结构，如核的形态、染色质的粗细、有无核仁、胞浆着色性、浆内颗粒性质有无内含物等，而这对于临床诊断与治疗却是十分重要的。传统的血细胞涂片镜检虽然操作繁琐，但是它可以直观的区分和鉴定各类细胞形态学上的改变，有效的弥补了上述两种血细胞分析仪自身的缺陷与不足，为临床提供更为有效的血细胞参数。

2血细胞分析仪难以识别异常血细胞形态

严重传染病、化脓性感染、中毒、放射性肿瘤或造血系统性疾病等因素是导致白细胞形态改变的常见原因［2］，然而在这些疾病中，异常的血细胞形态变化在血细胞分析仪检测中往往难以体现，如急性感染时外周血中性粒细胞会显著增多，出现明显的核左移或核右移［3］，血细胞体积大小不均、中毒颗料、空泡、杜勒体及核变性等，某些原因引起的大淋巴细胞或大片成簇血小板，红细胞在各种类型的贫血中不仅表现在数量改变，也会出现异常的形态学变化，如点彩红细胞、嗜多色性红细胞、有核红细胞等，在传染性单核细胞增多症，某些病毒感染、过敏状态等会出现异形淋巴细胞。上述疾病中所导致的血细胞形态学改变，仅仅依赖全自动血细胞分析仪检测将难以获取准确有效的临床参数，因此，通过传统的血细胞涂片染色镜检，获取更为直观的血细胞形态学上的改变，将对各种疾病的诊断、治疗、预后等方面有极其重要的临床价值［4］。

3血细胞分析仪不能识别异常血小板

对于某些疾病，虽然血小板计数正常，但临床表现有出血体征，那么通过血细胞涂片观察血小板形态变化来辅以诊断，显得尤为重要。在血细胞涂片上，血小板有无大小不均，形态有无改变，胞质的染色性质，颗粒的有无、多少、粗细以及血小板的分布情况等，这些特别有临床意义的血小板形态学变化，更有利于巨核细胞或血小板相关疾病的诊断。

综上所述，全自动血细胞分析仪是一种筛查，不能完全代替血细胞形态学检查，细胞形态检查作为血常规检测的重要部分，是对血细胞分析仪缺陷与不足的重要补充，因此，在用全自动血细胞分析仪进行分析检测时与显微镜检查有效结合，这对疾病的诊断与治疗有着重要的参考价值。

参考文献

［1］刘芳.外周血细胞形态学检测的临床价值检验［J］.医学与临床2012,4.

［2］刘志平.从Kx-21血细胞分析仪测得结果看血涂片的重要性［J］.医学信息中旬刊,2010,5(10):2817-2818.

［3］孙燕,王雷,杨红英.骨髓涂片常规检验的经验体会［J］.医学检验与临床,2008:l9(5):87.

［4］李子胜,孙梅,刘宇平,张静.外周血细胞形态学检查的临床应用价值［J］.中国当代医药,2009,10,(16):64

外周血干细胞 篇12

关键词：乙肝患者,流式细胞仪,外周血,T淋巴细胞亚群

乙肝是由乙肝病毒 (HBV) 所引起的, 在世界范围内流行, 我国是HBV感染流行区, 乙肝已是我国最重要的公共卫生问题之一[1]。乙肝病毒不会直接对肝脏造成损害, 而是通过诱发机体免疫反应间接损害。在肝细胞损害中有着决定性作用的是细胞免疫, 通过T细胞对患者抗原激活和识别产生趋化因子和调节因子, 进而影响病程及预后[2]。我们选择流式细胞仪和基因芯片技术对不同亚型的乙肝患者外周血淋巴细胞进行检测, 分析其相关性和正常健康患者的比较, 探求一种科学的检测方法, 为乙肝诊治提供依据。现将有关情况汇报如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2011年7月—2012年3月来我院进行肝病检查治疗的患者120例, 其中慢性乙型肝炎患者 (CHB) 、肝炎肝硬化患者 (LC) 、慢性重型肝炎患者 (SH) 各30例, 正常健康患者30例作为对照组。患者的诊断均符合我国制定的病毒性肝炎诊断和预防标准[3], 肝病患者中, 男42例, 女48例;患者的年龄在17岁~68岁之间, 平均年龄 (38.2±18.5) 岁。对照组中, 男患者17例, 女患者13例;患者的年龄在20岁~72岁之间, 平均年龄 (39.6±20.5) 岁。2组性别、年龄以及病程方面均没有显著性差异 (P>0.05) , 具有可比性。所有患者均在知情且自愿的情况下参与此次研究。

1.2 方法

选择美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪对患者进行外周血淋巴细胞 (主要是CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+) 检测, 采用杭州博赛基因诊断有限公司研制生产的试剂进行HBV基因型别、HBV P区204、552位点、HBV C区1762、1764位点变异的检测, 同时检测白细胞介素、HBV-DNA、抗核抗体、免疫球蛋白Ig G、Ig A、Ig M, 转氨酶等实验室指标, 并观察患者以上指标与临床的相关性。

在患者入院后的次日清晨抽取空腹静脉血, 并采用2 m L的EDTA抗凝血进行保存, 选择分层液的密度梯度进行离心, 将制备好淋巴细胞的悬液在6 h内进行分析。在试管中加入120μL抗体及50μL抗凝全血, 3 s振荡摇匀, 在室温下避光放置约20 min后加入1 m L的溶血素, 振荡摇匀后在室温下放置10 min, 避光, 进行4 min离心, 1 200转/min, 弃上清液, 并加入1 m L的PBS, 进行1 200转/min离心, 弃上清液, 并加入400μL的PBS上机进行检测, 分析数据。HBV-DNA的检测采用聚合酶链式反应 (PCR) 进行, 每次设立每毫升浓度为107、106、105、104等4个标准品, 还要设立阴性、强阳性、临界阳性以空管等对照。

1.3 观察指标

用流式细胞仪进行CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+检测, 观察数据, 得出计数, 将其与对照组计数进行比较。乙肝病毒脱氧核糖核酸 (HBV-DNA) 的检测中, 灵敏度100拷贝/m L在1.0×103拷贝/m L以上为阳性, 观察患者与对照组之间的差异。

1.4 统计学方法

使用SPSS15.0统计学软件进行数据统计, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHB患者外周血T淋巴细胞亚群的比较

CHB患者的T淋巴细胞亚群较对照组而言有所减少, 2组比较差异具有显著性 (P<0.05) 。见表1。

2.2 LC患者外周血T淋巴细胞亚群的比较

LC患者的T淋巴细胞亚群低于对照组患者, 2组比较差异具有显著性 (P<0.05) 。见表2。

2.3 SH患者外周血T淋巴细胞亚群的比较

SH患者的T淋巴细胞亚群较明显少于对照组患者, 2组比较差异具有显著性 (P<0.05) 。见表3。

3 讨论

HBV是一种非细胞毒性的病毒, 其进入机体之后会引起一系列较复杂的免疫反应, 而患者机体会针对HBV编码的各种抗原成分而产生强弱不等的免疫应答, 与感染HBV不同的临床结果之间有密切的关系。在感染HBV和肝脏损伤的过程中, T细胞反应强度将决定病毒在急性的感染后是被清除还是潜伏背景下继续存在, 后者可能会导致患者肝癌的发生。所以, 对患者使用流式细胞术进行检测可以及时了解乙肝感染状况和免疫情况, 为临床诊断治疗提供了很大的帮助。

FCM可以测量患者染色细胞的荧光强度, 是从单细胞分析及分选基础上发展起来的, 对化学、物理等性质进行快速检测, 如密度、大小、DNA、RNA、内部结构、蛋白质等[4]。随着荧光色素化学、单克隆抗体技术的发展, 流式细胞术已成为现代技术杂交体。正常免疫学正在不断涉足其他领域, 相应的流式细胞学以其灵活、定量、快速等特点在免疫学研究中得到广泛的应用, 也在不断地改进和完善[5]。它不仅补充了荧光显微镜的功能, 还兼具二者的优点, 进而在各个方面发挥着重要的作用。在肝病研究中, 它可以动态检测患者辅助诱导性T细胞和抑制杀伤性T细胞比值变化, 进而判定细胞免疫平衡状态;其次, 流式细胞术可以对患者肝组织细胞DNA含量的变化进行检测, 从而对恶性肿瘤进行早期预测;急性重症肝炎患者在早期多伴有T淋巴细胞活化, 对患者T细胞活化状态进行检测, 可以预测肝坏死;对患者不同发病时期的细胞因子分泌状态进行研究检测, 观察患者细胞因子在肝病发展中的变化。在我们的研究中发现, CHB、LC、SH患者的外周血淋巴细胞CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+较正常患者而言有明显减少, 差异非常显著。

综上所述, 流失细胞仪具有高准确性、高灵敏度、高重复性等优点, 其操作简单、使用安全、清洁无毒, 对环境不会带来危害, 为疾病诊治提供准确的依据, 值得在临床上推广使用。

参考文献

[1]刘妍, 许智慧, 刘立明, 等.我国患者多重耐药乙肝病毒感染的基因型和表型特点[J].解放军医学杂志, 2012, 37 (6) :539-543.

[2]叶红珍, 李志勇.不同类型HBV感染人群T细胞对HBV抗原蛋白免疫应答的差异分析[J].免疫学杂志, 2013, 29 (11) :984-987.

[3]刘金涛.自身抗体在临床自身免疫性肝病中的作用和诊断意义[J].中国免疫学杂志, 2013, 29 (6) :669-672.

[4]丁宁, 黄丽利, 刘妍, 等.乙肝患者HBV特异性细胞毒T淋巴细胞的分析[J].解放军医学杂志, 2011, 36 (4) :361-364.