外周血单核细胞

外周血单核细胞（通用8篇）

外周血单核细胞 篇1

巨噬细胞(Macrophage)能吞噬感染异物并诱导T细胞活化,启动免疫应答[1],在机体损伤修复、抵抗病原入侵[2]等方面起重要作用,是机体先天免疫的重要部分[3]。巨噬细胞属于无颗粒白细胞的一种,是由单核细胞(Monocyte)分化而来的。单核细胞来源于骨髓,成熟后释放进入血液并随外周血循环进入组织,分化成为巨噬细胞发挥相应的功能[4]。研究者可以对人外周血进行分离,获取单核细胞后进行体外分化,分化得到的巨噬细胞可用于进行各种功能研究。

目前常用的获取人外周血单核细胞的方法是密度梯度离心法。基于Ficoll-Hypaque的单次密度梯度离心可以将红细胞,粒细胞,血小板以及单个核细胞逐层分开。其中,外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC)主要包括淋巴细胞和单核细胞,进一步对PBMC离心清洗并用贴壁方法去除悬浮细胞后,可得到单核细胞[5]。但该方法对于液层吸取操作要求较高,获得的单核细胞中会存在较多淋巴细胞,粒细胞以及血小板的污染。通常的解决方法是用抗体标记结合免疫磁珠对PBMC中的单核细胞进行纯化富集。然而不论基于抗体阴选还是阳选的方法,都不可避免对单核细胞产生一定程度的免疫刺激或者机械损伤;分选操作过程较长,在实验过程中要对细胞进行反复洗涤离心等操作,也会造成目的细胞的遗失,对于少量的临床样品难以操作。另外也可以选择基于Percoll分层液的连续密度梯度离心分离法,可以直接将单核细胞与淋巴细胞、红细胞、粒细胞分层,但是操作繁琐,耗时较长,对试剂的消耗量也比较大。因此,寻找一种简便、快捷而又高效的单核细胞分离方式对于单核-巨噬细胞相关研究的开展至关重要。

单核细胞是体积最大的白细胞,其内容物的颗粒形状与淋巴细胞以及粒细胞等具有显著的差别。本文中尝试对外周血白细胞直接进行流式细胞分选,根据细胞组分的分群特征,直接获得其中的单核细胞,并通过单核细胞表面标志物CD14染色进行验证,该方法对于单核细胞的分选效率能达到85%以上,可以简单快捷的获得纯度较高的单核细胞用于实验。

1 材料与方法

1.1 实验材料和试剂

人外周血白细胞成分血来自军事医学科学院附属医院输血科。红细胞裂解液(10×,#420301)购自Biolegend公司。人CD14抗体(130—091—242)购自Miltenyi Biotec公司。流式细胞分离管购自BD公司。人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-SCF购自R&D公司。RPMI1640 培养液(C11875),进口胎牛血清,购于 Invitrogen 公司。

1.2 红细胞裂解

人外周血白细胞成分血中仍含有大量红细胞,在流式分选前需要进行红细胞裂解处理。将白细胞成分血与稀释为1×的红细胞裂解液按照1∶10的比例混合,避光室温裂解15 min,300 g 离心10 min,PBS洗涤一次。细胞计数,将细胞用流式缓冲液重悬(1×107细胞用500 μL缓冲液重悬)。

流式缓冲液:高压灭菌的PBS,pH值为7.2,加入0.5%的牛血清白蛋白以及 2 mol EDTA。

1.3 流式抗体标记

取1×106细胞,即50 μL上述细胞悬液,加入1 μL CD14-PE抗体,避光冰上标记10 min,向离心管中加入1 mL流式缓冲液终止染色,迅速离心去除上清后将细胞重新用100 μL 流式缓冲液悬起,通过细胞滤网后进行流式细胞分析。其余经红细胞裂解处理的细胞按照细胞计数结果直接用流式缓冲液重悬,通过细胞滤网后放置于冰上,准备进行流式分选。

1.4 流式细胞仪分选

本室购置的流式细胞仪为BD FACS AriaTMII 。根据外周血各个成分细胞的分群,确定单核细胞在流式细胞仪中的大小以及颗粒度等特征,限定分选条件,获取单核细胞。同时对CD14-PE抗体标记的细胞进行流式分析,确定单核细胞分群中CD14阳性的细胞所占比率。

1.5 单核细胞体外培养分化

上述分选得到的单核细胞经300 g离心后用含有10%进口胎牛血清以及双抗的RPMI—1640培养基重悬,种于细胞培养皿中,加入10 ng/mL GM-CSF 共培养(5~7)d,镜下观察分选得到的单核细胞体外分化的巨噬细胞形态。

2 实验结果

2.1人外周血流流式细胞检测分群以及CD14抗体预染分析

外周血白细胞成分血经过红细胞裂解处理并进行CD14抗体预染,流式细胞仪分析,结果见图1,左图为样品直接流式分群结果,其中左上角为粒细胞群,中间圈定细胞群(P1)为单核细胞,占白细胞总数的8%左右;居中偏下的为淋巴细胞群。右图为CD14抗体阳性细胞(P2),该阳性细胞群占左图中单核细胞分群(P1)的85%~90%左右。结果证明,根据目的细胞群的大小以及颗粒度的差异通过流式细胞分群方式可以分离并获取单核细胞。

2.2流式细胞仪直接分选得到的单核细胞CD14抗体标记分析

将其余的外周血白细胞成分血根据细胞分群直接选择单核细胞群进行分选。将分选得到的单核细胞进行CD14抗体标记后,再次进行流式分析。结果如图2,左图为分选后细胞经流式细胞仪直接分析,R1即分选得到单核细胞;右图显示该群单核细胞分选后CD14抗体标记的结果, CD14阳性的细胞占分选获得所有细胞的比例为85%左右。如在后期实验中进一步优化条件,预期可以获得纯度更高的单核细胞。

2.3流式细胞仪分选得到的单核细胞体外培养分化

上述流式分选得到的单核细胞经过体外分化培养7 d,镜下观察细胞形态与文献报道一致[6]。证明基于流式细胞分选得到的人外周血单核细胞分化正常,可以用于对巨噬细胞进一步的功能研究。

3 讨论

单核巨噬细胞的相关研究是当前免疫学研究的热点,2011年底,免疫学国际顶级期刊《Nature.Reviews Immunology》对近年来单核巨噬细胞的的相关研究进行专刊评述,对巨噬细胞的极化过程[7],巨噬细胞与感染和免疫[8]、巨噬细胞与机体保护和致病[9]以及巨噬细胞与重要疾病[10]的关系等列为免疫学的前沿领域的热点问题进行了全面的总结和述评。

传统方法对于单核细胞的分离过程需要反复离心清洗,会造成大量细胞在操作过程中的遗失,而且操作时需要对抗凝血作适当稀释,在血量较多时要分成数管进行离心,对于分离试剂的需求较大。如需获取纯度较高的单核细胞进行实验操作,则需要进一步利用抗体以及磁珠等技术方法加以纯化,增加了实验成本,而且获得的单核细胞容易被激活而给实验结果带来影响。

基于流式细胞仪的功能,根据细胞的大小以及颗粒度等特征,对白细胞直接进行分选获取人外周血中的单核细胞的方法,避免了多次重复离心,节省了梯度离心的试剂。经重复验证,本方法能够分选得到纯度在80%~90%之间的单核细胞用于实验。该方法可以用于在少量临床血液样本中获取高纯度的单核细胞,为深入研究单核-巨噬细胞与疾病之间关系提供了良好的技术平台。

参考文献

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外周血单核细胞 篇2

温热内蕴：多为溶血发作期，可见皮肤巩膜黄染、尿色红绛或呈酱油色、倦怠气短、舌淡胖苔赋。治以清热利湿，方用茵陈蒿汤或茵陈五苓散加减。

脾肾阳虚：面黄、头晕、心悸气短、腰痠腿软、或腹胀、浮肿、舌淡齿痕苔白、治予温补脾肾、益气养血。方用补中益气汤、大菟丝子饮、归脾汤或八珍汤加减。

瘀血阻络：本病迁延难愈，久病多瘀，多有黄疸、腰痛、尿色黑赤，易合并血栓形成，符合中医血瘀范畴，应在辨证论治基础上加活血化瘀法，选用活血药(木香、当归、赤芍、川芎、益母草、鸡血藤、丹参等)。

外周血单核细胞 篇3

1 资料与方法

1.1 临床资料

入选2005年6月—2007年6月住院的AMI患者162例。均为来院后接受静脉溶栓治疗者。溶栓治疗前常规嚼服阿司匹林300 mg, 3 d以后改为100 mg, 1次/日, 长期服用。此外患者常规接受静脉或皮下注射肝素抗凝, 口服β-受体阻断剂、血管紧张素转化酶抑制剂及他汀类药物治疗。急诊经皮冠状动脉腔内成形术 (PTCA) 或补救PCI患者未进行观察。两组患者年龄、性别比较无统计学意义 (P>0.05) 。

1.2 诊断及排除标准

诊断标准:心绞痛或与心绞痛相当症状持续30 min以上, 含服硝酸甘油不能缓解;心电图 (ECG) 至少两个相邻导联ST段抬高, 肢体导联≥1 mm, 胸导联≥2 mm;血清心肌坏死标志物升高至少2倍以上;发病至入院时间≤6 h, 或>6 h但≤12 h还有胸痛或S-T段抬高且无溶栓禁忌证者。排除标准:发病至入院时间>24 h;入院时有明确的感染并发症。溶栓治疗后梗死相关血管 (IRA) 开通的判断标准:溶栓后2 h内心电图抬高的S-T段下降> 50%;CK峰值提前至发病后14 h内;溶栓2 h内出现再灌注心律失常;溶栓2 h内胸痛缓解70%以上。符合2条以上标准者判断为IRA开通, 只符合后两项者不包括在内。

1.3 研究方法

按单核细胞峰值计数分为两组, 单核细胞计数<900/mm3组 (正常组) 与单核细胞计数≥900/mm3组 (增高组) 。所有患者于入院即刻取外周血, 用血细胞自动分析仪测定血常规。入院后每2 h采血动态测定血清肌酸激酶 (CK) 及肌酸激酶同工酶 (CK-MB) 值直到正常为止, 取峰值作统计学分析。

1.4 观察项目

记录住院期间心力衰竭、严重心律失常、梗死后心绞痛、死亡等心脏事件的发生情况。所有患者于发病2周内行超声心动图检查, 测量左室射血分数 (LVEF) 、左室短轴缩短率 (FS) 、左室收缩末容积 (LVESV) 和左室舒张末容积 (LVEDV) 。

1.5 统计学处理

采用SPSS 11.5统计软件包进行处理。计量资料以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示, 采用独立样本 t 检验。计数资料比较用χ2 检验。应用一元线性相关与回归分析单核细胞与心功能的相关性。P<0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组患者CK、CK-MB峰值及心脏事件的发生情况 (见表1)

2.2 两组患者溶栓后临床指标再通者心脏彩超结果

溶栓后临床指标再通患者, 增高组LVEF和FS均低于正常组 (P<0.05) , 而LVESV 和LVEDV明显高于正常组 (P<0.05) 。详见表2。应用一元线性相关与回归分析, 单核细胞计数与LVEF和FS呈负相关 (r分别为-0.146、-0.128, P<0.05) 与LVESV和LVEDV呈正相关 (r分别为0.10、0、18, P<0.05) 。

3 讨 论

Friedman等[2]描述了白细胞计数与冠心病的关系, AMI炎症反应逐渐成为人们研究的热点。AMI后全身和坏死心肌局部均有炎性细胞因子增加[3]。这些炎性细胞因子与患者溶栓、降脂、经皮冠状动脉内成形术等治疗及年龄、吸烟、高血压、糖尿病、血脂、肌酸激酶及其同工酶等无关[4]。Maekawa 等[5]报道外周血单核细胞增多与LVEDV呈正相关, 其峰值>900/mm3与AMI 后心力衰竭、室壁瘤、心律失常、死亡等心脏不良事件明显相关, 是其独立的预测因子。

AMI后单核细胞增多的机制可能是AMI后坏死心肌细胞线粒体释放富含磷脂和蛋白的膜碎片, 与补体C1 结合, 激活整个补体系统, 依次通过激活补体C4 、C2 、C3 直到激活C5 。补体C5 被C5转化酶裂解生成C5a和C5b两个片段。C5a是一种作用很强的细胞趋化因子, 吸引单核细胞向缺血区域游走、聚集。单核细胞浸润是引起斑块不稳定促进粥样斑块破裂的重要环节。其刺激斑块内血管新生, 并分泌基质金属蛋白酶, 降解纤维帽中的结构性基质, 进一步促使斑块的破裂和血管壁损伤。并可加重心肌损伤和扩大心肌梗死范围[6]。AMI患者的循环淋巴细胞能诱导单核细胞表达组织因子 (TF) 等致凝物质, 触发凝血系统, 形成血栓, 进一步加重心肌损伤[7,8]。血液中的单核细胞源于造血源细胞池, 并且与中性粒细胞的分化密切相关。中度的中性粒细胞增多常见于各种原因引起的炎症、感染、组织坏死等, 而单核细胞增多则是更特异的反应。AMI时, 坏死心肌组织可见中性粒细胞浸润, 而中性粒细胞无吞噬坏死组织的作用, 只能逐渐分解至消失。有效清除坏死组织的是单核细胞, 因此单核细胞在AMI后心肌组织的恢复方面起重要作用[9]。

本观察结果显示单核细胞增多患者CK和CK-MB峰值增高, 提示可能与梗死范围有关。溶栓后临床指标再通患者增高组LVEF和FS明显低于正常组, 而增高组LVESV和LVEDV明显高于正常组。单核细胞对AMI后有一定的促进心肌坏死组织吸收的作用, 但更重要的是加重心肌损伤和扩大心肌梗死范围, 故单核细胞与AMI后早期临床预后有关。单核细胞检测方法简单、易行, 可作为AMI后早期判断预后的重要指标。

摘要：目的探讨急性心肌梗死 (AMI) 患者外周血单核细胞水平变化对预后的影响。方法对2005年6月—2007年6月162例AMI患者进行分析, 于入院即刻查血常规和肌酸激酶 (CK) 、肌酸激酶同工酶 (CK-MB) , 并尽早接受静脉溶栓治疗, 于入院2周内行超声心动图检查, 依单核细胞水平分为增高组和正常组, 并记录溶栓开通情况及住院期间心脏事件发生情况, 评价外周血单核细胞增多对AMI患者预后的影响。结果增高组CK、CK-MB峰值较正常组增高 (P<0.05) 心力衰竭发生率为42.1%, 严重心律失常发生率为21.1%, 梗死后心绞痛发生率为21.1%, 病死率为13.1%均明显高于正常组 (P<0.05或P<0.01) 。溶栓后临床指标再通患者增高组射血分数 (LVEF) 和左室短轴缩短率 (FS) 均低于正常组 (P<0.05) ;而左室收缩末容积 (LVESV) 和左室舒张末容积 (LVEDV) 明显高于正常组 (P<0.05) 。结论单核细胞增高与AMI临床预后有关, 可能成为判断AMI近期预后的重要指标。

关键词：心肌梗死, 急性,单核细胞,肌酸激酶同工酶

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外周血单核细胞 篇4

肺泡巨噬细胞由外周血单核细胞迁移至肺分化而来。因此，本研究假设外周血单核细胞中HDAC活性低于健康对照，并观察外周血单核细胞中HDAC活性与COPD患者气流受限（肺功能）的关系，同时观察吸烟量与HDAC活性的关系，以观察HDAC活性是否受吸烟量的影响。

1 对象与方法

1.1 受试者基本情况

收集在武汉大学人民医院体检及就诊的稳定期COPD患者。正常对照为健康志愿者。经患者知情同意，抽取外周静脉血20 ml，加少量肝素抗凝，在4 h内进行外周血细胞分离。

1.2 稳定期COPD诊断及分级标准

参照GOLD(2006修订版）和中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组制订的慢性阻塞性肺病诊治指南（2002）。所有患者均除外心、脑血管、肝、肾疾病、糖尿病、肿瘤、风湿、结缔组织疾病，以及肺结核、支气管扩张、支气管哮喘及肺纤维化患者。

1.3 肺功能测定

所有受试者均行肺功能测定，采用Vmax6200(American Sensormedics,Vmax 229 series,Yorba Linda,California）肺功能系统检测FVC、FVC%、FEV1、FEV1%、FEV1/FVC，由同一熟练技师操作，以保证测试的一致性。每位被测试者肺功能测定前3 d内未使用支气管扩张剂，2周内未使用茶碱和激素。

测试方法：吸入200μg葛兰素后10 min，平静正常呼吸，遂后充分吸气至肺总量位，迅速用最大力呼气，呼气时间≥6 s，或时间-容量曲线显示呼气相平台出现且超过2 s后，用最快速度用力吸气至肺总量位。每个被测试者分别至少测定3次（一般最多不超过8次），每个被测试者最佳值与次佳值2次差异小于5%FVC或0.5 L）。

1.4 人外周血单核细胞分离

人外周血单核细胞分离用密度梯度离心法[2]。将静脉血与Hank's buffered salt solution(HBSS)1×缓冲液1∶1混合后共40 ml，装于50 ml试管中。将混合血与人淋巴细胞分离液（Lymphoprep,Norway,1.077 g/ml）以2∶1体积混合。配平后用TDL-40L高速水平离心机离心，2 000 r/min(1 100 g/min）,30 min。吸取中间白色薄雾层于新管。加HBSS于每管，将吸取液与HBSS混匀，HBSS体积大于1倍吸取液体积。配平后1 100 r/min，离心8 min。弃上清，加入HBSS吹打，移入一新试管中离心1 000 r/min,8 min，弃上清。将剩余液体混匀，吸取少量于细胞计数板计数，并用台盼蓝染色鉴定细胞活性。如果细胞总数大于1×107个/ml，活性大于95%，视为合格标本；用1 ml枪头吸取剩余液体于标记Ep管中，-70℃冻存。

1.5 直接组蛋白提取

组蛋白提取用HCl和H2SO44℃过夜法[3]。裂解液[10 mmol/L Tris-HCl,pH 6.5,50 mmol/L亚硫酸氢钠，1%Triton X-100,10 mmol/L MgCl2,8.6%蔗糖，完全蛋白酶抑制剂混合物（罗氏分子生化公司），20 min,4℃]；核冲洗缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl,13 mmol/L EDTA,pH 7.4）。

将细胞微离心5 min；用冰冻裂解缓冲液反复冲洗片状沉淀物，直至浮于表面的物质清除（每次离心7 500 g/min,5 min）。用核冲洗缓冲液冲洗核片状沉淀物，并且用50μl0.2 mol/L HCl和0.2 mol/L H2SO4在蒸馏水中悬浮。4℃过夜提取细胞核，微离心剩余物质10 min，用1 ml冰冻丙酮混合上清液，-20℃过夜。微离心样本10 min，用丙酮冲洗，干燥，并用蒸馏水稀释。含有组蛋白的上清液样品用Bradford protein kit(Bio-Rad）定量。Bradford法（考马斯亮蓝）测组蛋白浓度。

1.6 HDAC活性检测

细胞核提取物HDAC活性检测使用HDAC活性荧光分析试剂盒（Cayman,USA），严格按照试剂盒说明操作。

1.7 统计学处理

结果用SPSS 11.0统计学软件进行分析。数据以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析；相关性采用Spearman相关性分析；P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 一般资料

COPD患者26例，均为吸烟者，其中，1期7例，2期8例，3期8例，4期3例；健康吸烟者10例；健康非吸烟者13例，所有受试者均为男性，其身高、体重等无显著性差异（P>0.05）。COPD组与健康吸烟组吸烟量无显著性差异（P>0.05）。COPD组平均年龄高于健康吸烟组和健康非吸烟组（P<0.05），健康吸烟组和健康非吸烟组年龄无显著性差异（P>0.05）。

2.2 COPD患者外周血单核细胞中的HDAC活性

COPD患者外周血单核细胞总HDAC活性较健康非吸烟者低40%左右[（12.86±6.14）μmol/（L·μg）和（21.39±4.92）μmol/（L·μg）,P=0.000]；在1、2、3期达到显著性差异（图1）；其活性与健康吸烟者比较，无显著性差异[（12.86±6.14）μmol/（L·μg）和（12.50±4.27）μmol/（L·μg）,P=0.864]。健康吸烟者外周血单核细胞中的HDAC活性较健康非吸烟者低40%，与COPD患者比较，无显著性差异（P>0.05）。

2.3 COPD患者外周血单核细胞中的HDAC活性与肺通气功能的关系

COPD患者外周血单核细胞中HDAC活性与肺通气功能均无统计学相关（表1）。

2.4 吸烟受试者外周血单核细胞中HDAC活性与吸烟量的关系

外周血单核细胞中的HDAC活性与吸烟量（包年）呈负相关（在COPD患者中，r=-0.867,P=0.000；在所有吸烟者中，r=-0.607,P=0.000）（图2）。

(A:COPD患者;B:所有吸烟者)

(A:COPD patients;B:all subjects enrolled)

吸烟量超过35包年的COPD患者外周血单核细胞中的HDAC活性平均值明显低于吸烟量低于35包年者（图3）。

3 讨论

研究结果显示，COPD患者外周血单核细胞中的HDAC活性低于健康非吸烟者，与健康吸烟者比较，无显著性差异；COPD患者外周血单核细胞中HDAC活性的降低与COPD气流受限（肺功能）无明显相关，与患者吸烟量呈负相关，提示外周血单核细胞中的HDAC活性降低可能是吸烟的直接作用。

稳定期COPD患者外周血单核细胞中的HDAC活性降低与相同吸烟量的非COPD吸烟者的下降相同，而且两组研究对象随吸烟量增加，HDAC的下降更为明显，提示人外周血单核细胞中HDAC下降与吸烟密切相关。

吸烟也可以引起染色体重构[4]，影响NF-κB的表达，促使炎症基因表达[5]。吸烟时每喷烟雾中至少含有10种氧化分子[6]，这些氧化分子可以产生氧化应激（oxidative stress）。吸烟引起的氧化应激使细胞核HDAC活性降低，同时可以明显降低上皮细胞的HDAC2表达[7,8]，使炎症因子表达增加；这种氧激发可以被抗氧化物N-乙酰半胱氨酸所阻断[9]。健康吸烟者肺泡巨噬细胞HDAC活性低于健康不吸烟者[10]。氧化应激可以通过影响细胞核HDAC活性而影响炎症基因的表达。体外研究显示，氧化应激可以明显降低HDAC活性和上皮细胞HDAC2的表达[7]。

本研究通过提纯单核细胞核HDAC并测定其活性，提示外周血单核细胞中的HDAC活性与吸烟量呈负相关。因此，COPD患者外周血单核细胞HDAC活性降低可能系吸烟所致。

本研究显示，COPD患者外周血单核细胞中的HDAC活性降低与COPD气流受限（肺功能）零相关。

肺功能是目前COPD分级的主要依据，主要反映气道的阻塞程度，并不能反映COPD的炎症程度。Ito等[1]发现HDAC活性在COPD患者的支气管组织和肺泡巨噬细胞中降低，这种降低与COPD气流受限（FEV1、FEV1/FVC）呈正相关。而本研究并未发现外周血单核细胞中的HDAC活性降低与COPD气流受限（肺功能）相关，其原因可能与吸烟对肺部和全身的损害不同有关。

吸烟的烟雾中含有众多物质，可以引起直接和间接肺损害。有害成分可以直接影响HDAC的活性或破坏肺组织，引起肺组织的急性损害。只有部分物质可以进入血液（如氧自由基等）并长期在血液中停留。这些物质可以作用于单核细胞，通过抑制HDAC活性来促进炎症介质的产生。即使停止吸烟，炎症基因的表达维持了这种慢性炎症。炎症基因的表达受促炎症转录因子的调节，这些转录因子主导、放大并且维持了COPD的慢性炎症反应。肺部的局部急性炎症与肺功能（气流受限）呈正相关。而本研究显示，在稳定期COPD患者的外周血单核细胞中，HDAC活性与COPD肺功能（气流受限）无关，提示吸烟对肺部的直接损害与全身的间接损害可能源于不同的机制。

摘要：目的:观察慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)的活性及其与气流受限和吸烟量的关系。方法:募集COPD患者及吸烟和非吸烟健康志愿者并检测其肺功能。抽取所有被研究者外周静脉血,以密度梯度离心法分离出外周血单核细胞。提取组蛋白并测定HDAC活性。记录所有被研究者的肺功能及吸烟情况。结果:COPD患者外周血单核细胞总HDAC活性比健康非吸烟者低40%[(12.86±6.14)μmol/(L·μg)和(21.39±4.92)μmol/(L·μg),P=0.000],在1、2、3期均有显著性差异;健康吸烟者外周血单核细胞总HDAC活性较健康非吸烟者低40%[(12.50±4.27)μmol/(L·μg)和(21.39±4.92)μmol/(L·μg),P=0.000]。外周血单核细胞HDAC活性与吸烟量(包年)呈负相关(在COPD患者中,r=-0.867,P=0.000;在所有被研究者中,r=-0.607,P=0.000)。吸烟量达到35包年后的COPD患者外周血单核细胞HDAC活性平均值较吸烟量低于35包年者降低一半以上。结论:吸烟是造成COPD患者外周血单核细胞中HDAC活性下降的重要原因之一。COPD外周血单核细胞HDAC活性与肺通气功能(FEV1、FEV1%、FVC、FVC%和FEV1/FVC)零相关,提示吸烟对肺部的局部损害与全身损害可能有着不同的机制。

关键词：组蛋白去乙酰化酶,吸烟,慢性阻塞性肺病

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外周血单核细胞 篇5

1资料与方法

1.1研究对象为2013年3月—2013年12月山西医科大学第一医院心内科住院ACS患者38例,急性心肌梗死(AMI)18例,不稳定型心绞痛(UA)20例。 所有患者进行冠脉造影或心电图、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白等心肌标志物检查确诊。剔除:合并脑卒中、严重肝肾功能不全者;周围血管疾病或周围血管栓塞性疾病;恶性肿瘤和风湿性疾病;合并感染性疾病以及应用炎症抑制药物如非甾体类抗炎药、类固醇及鸦片类药物等。

1.2外周血单核源性巨噬细胞分离培养按照Taylor等[3]方法培养,流式细胞术检测CD14对其进行鉴定。将磁珠分选细胞调整细胞数至2×106/mL,用含20%新生牛血清的RPMI-1640培养液重悬接种于六孔板,加入10ng/mL重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)的1640培养液,培养7d后即获得单核细胞源性巨噬细胞。

1.3分组将分离培养的单核细胞源性巨噬细胞分为4组。1ACS:不加任何药物孵育24h;2氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)组:加入ox-LDL(50 mg/L) 刺激24h;3低浓度组:同时加入ox-LDL(50 mg/L, 广州中山医科大学)及10μmol/L阿托伐他汀(辉瑞公司)共刺激24h;4高浓度组:同时加入ox-LDL(50 mg/L)及40μmol/L阿托伐他汀共刺激24h。所有细胞培养均于37℃,5%CO2条件下进行,之后收集上清液冻存于-80℃备用,收集巨噬细胞用于下一步研究。

1.4实时定量RT-PCR检测Lp-PLA(2)mRNA的相对表达取收集的巨噬细胞,采用Trizol一步法抽提总RNA,利用TAKARA逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA,逆转录条件为50 ℃30 min,95℃15℃ min灭火逆转录酶;使用ABI7900实时定量PCR仪采用TAKARA SYBR-Green试剂盒进 行PCR反应。 引物均由上海生物工程公司合成,计算机分析得到Ct值。基因相对表达量以2-△△Ct值计算分析。

1.5 Western-blot法检测Lp-PLA(2) 蛋白的相 对表达BCA法测蛋白 浓度 ,Western-blot法检测Lp-PLA(2)蛋白的相对表达。

1.6 ELISA法检测细胞上清液Lp-PLA(2)及炎症因子的表达 试剂盒购 自Bender MedSystems公司。 采用双抗夹心法,标准曲线求得样品中Lp-PLA(2)、 超敏C反应蛋白(hsCRP)、单核细胞趋化因子(MCP-1)、 肿瘤坏死因子-6(TNF-α)、白介素-6(IL-6)的浓度。

1.7统计学处理采用SPSS13.0统计软件,计量资料以均数±标准差( ±s )表示,各组数据进行正态性和方差齐性检验,组间均数比较采用ANOVA方差分析,两两比较用SNK法检验。P <0.05为有统计学意义。

2结果

2.1各组巨噬细胞分泌Lp-PLA(2)及炎症因子水平ox-LDL可以诱导 冠心病患 者外周血 单核细分 泌Lp-PLA(2)及炎症因 子hsCRP、MCP-1、TNF-α、 IL-6的水平 (P <0.05),而阿托伐 他汀可以 显著降低 其诱导的Lp-PLA(2)及炎症因 子分泌 (P < 0.05),且此种效应呈浓度依赖性。详见表1。

与 ACS组相比,1)P <0.05,与ox-LDL组相比,2)P <0.05。

2.2各组巨噬细胞内Lp-PLA(2)mRNA的表达ox-LDL可以诱导ACS患者外周血单核细胞源性巨噬细胞内Lp-PLA(2)mRNA的表达(P <0.01),阿托伐他汀可以显著降低其诱导的Lp-PLA(2)mRNA表达(P <0.05或P <0.01),且此种效应呈浓度依赖性。 详见图1。

2.3各组巨噬细胞内Lp-PLA(2)蛋白的表达ox -LDL可以诱导 冠心病患 者外周血 巨噬细胞Lp-PLA(2)蛋白的表 达 (P <0.01),阿托伐他 汀可以显 著降低其 诱导的Lp-PLA(2)蛋白表达 (P < 0.05或P <0.01),且此种效应呈浓度依赖性。详见图2。

3讨论

慢性炎症能增加冠状动脉疾病风险。各种炎症细胞及炎症因子的局部浸润、循环中炎症细胞的活化,血小板的活化及黏附均可导致斑块破裂及ACS发生[4]。 Lp-PLA(2)是近年来新发现的与动脉粥样硬化密切相关的新型炎症因子,它不仅具有促进动脉粥样硬化的作用,同时与斑块的易损性密切相关,可作为独立预测冠心病事件的新的危险因子[5]。

Lp-PLA(2)属于磷脂酶A2超家族成员,主要由炎症细胞分泌,与磷脂酶A2家族其余成员不同的是, Lp-PLA(2)不依赖钙离子维持其催化活性。人循环中的Lp-PLA(2)可以以与 脂蛋白颗 粒结合的 形式存在 ,其中2/3与LDL结合 ,1/3与HDL/VLDL结合 。 Lp-PLA(2)可以通过水解Sn-2位含有多不饱和脂肪酰基的氧化磷脂,使循环中LDL相关Lp-PLA(2)复合物进入内膜,在内膜LDL被氧化,LDL上的卵磷脂变成氧化卵磷脂,而Lp-PLA(2)随即水解氧化卵磷脂生成溶血卵磷脂和氧化型游离脂肪酸,后两者均为促炎介质,能刺激黏附因子和细胞因子的产生,促进单核细胞 向巨噬细 胞的转化 及泡沫细 胞的形成 , Lp-PLA(2)具有促动 脉粥样硬 化形成的 作用 。 Lp-PLA(2)还有降解血小板活化因子的作用,减轻其促进血栓形成和炎症反应的作用而发挥抗炎和抗动脉粥样 硬化的作 用 。但临床及 实验室研 究均证实 , Lp-PLA(2)在血浆中占优势的作用是很强的促动脉粥样硬化形成作用[4]。最新流行病学和临床前瞻性研究发现,冠心病事件人群与正常对照组相比Lp-PLA(2) 表达及活性显著升高,从而提出Lp-PLA(2)质量或活性升高是冠状动脉粥样硬化或冠心病事件的独立危险因子[6,7,8]。因此,抑制Lp-PLA(2)的活性为治疗血管慢性炎症,减少心血管事件的风险提供了可能。

他汀类药 物是3-羟基3-甲基戊二 酰辅酶A (HMG-CoA)还原酶抑制剂,作为治疗冠心病的常规用药,大量的临床试验证实他汀类具有独立于降脂作用之外的多效性作用,包括抗炎、稳定斑块、改善血管内皮、抑制血管平滑肌的增殖、抑制血栓等作用,近年来其非调脂作用已越来越受到人们的重视[9]。辛伐他汀可以 明显减少 兔动脉粥 样硬化模 型中大动 脉内Lp-PLA(2)的表达及 其活性[10]。本研究结 果显示 , ox-LDL刺激可以明显增加Lp-PLA(2)转录水平及蛋白水平的表达,而给予阿托伐他汀共刺激后可以明显抑制ox-LDL诱导的Lp-PLA(2)及炎症因子的表达, 此效应呈浓度依赖性。

在人的单核细胞源性巨噬细胞中证实,阿托伐他汀可以 通过抑制ox-LDL诱导的新 型炎症因 子Lp-PLA(2)表达而起到调节免疫反应及稳定斑块的作用。

ox-LDL可以通过诱导单核细胞产生Lp-PLA(2) 而参与了冠心病的发生发展过程。而阿托伐他汀可以抑制该效应而起到稳定斑块的作用,为深入理解其作用机制及临床科学的应用提供了理论基础。

摘要：目的 观察阿托伐他汀对急性冠脉综合征(ACS)患者外周血单核细胞源性巨噬细胞脂蛋白相关磷脂酶A2[Lp-PLA(2)]的影响。方法 入选2013年3月—2013年12月ACS患者38例,分离培养ACS患者外周血单核细胞源性巨噬细胞,分为4组:空白对照组、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)组、阿托伐他汀低浓度组和阿托伐他汀高浓度组。分别给予不同处理,收集培养细胞上清液及巨噬细胞,实时定量RT-PCR法检测巨噬细胞Lp-PLA(2)mRNA表达,Western-blot法检测巨噬细胞Lp-PLA(2)蛋白表达,ELISA法检测培养细胞上清液Lp-PLA(2)、超敏C反应蛋白(hsCRP)、单核细胞趋化因子(MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素6(IL-6)水平。结果 ox-LDL刺激可以明显增加ACS患者外周血单核细胞源性巨噬细胞Lp-PLA(2)mRNA与蛋白的表达,而阿托伐他汀可以显著降低其诱导的Lp-PLA(2)表达增加及炎症因子分泌,且该反应呈浓度依赖性。结论 阿托伐他汀抑制ACS患者外周血单核细胞源性巨噬细胞Lp-PLA(2)的表达,从而起到调节炎症反应,稳定斑块作用。

外周血单核细胞 篇6

关键词：凋亡相关斑点样蛋白,半胱天冬酶-1,NLRP3,炎性体,痛风性关节炎

随着社会的发展,急性痛风性关节炎(acute gouty arthritis,AGA)患病率随年龄的增长有逐渐增高的趋势,且常伴有多种代谢病及心脑血管病,发病高峰年龄为40岁左右,临床上以男性患者多见,女性约占5%[1],且多为绝经期后妇女。近年来研究发现单核/巨噬细胞系统在AGA启动、进展及缓解中均发挥了关键作用,其中白细胞介素(interleukin,IL)-1β是单钠尿酸盐(monosodium urate,MSU)晶体诱导炎症的关键因子,NLRP3炎性体通过促进IL-1β的生成在AGA发作中发挥不可替代的作用[2]。对于AGA的治疗目前仍采用24 h内服用NSAIDs、COX-2抑制剂、秋水仙碱或类固醇药物等进行抗炎治疗[3]。本研究即对此进行研究、探讨,以期发现NLRP3炎性体在AGA启动、进展及缓解的各个阶段表达水平的变化及意义,指导AGA的早期防治及优化治疗方案。

1对象与方法

1.1研究对象。观察组(T):随机选取符合以下诊断标准和剔除标准的患者100例(男95例,女5例),年龄(47.25±10.99)岁,全部来自本院2014年8月至2016年2月的门诊患者。(1)急性痛风性关节炎诊断标准:应用美国风湿病协会(ACR)1997年制定的诊断标准。(2)入选和剔除标准:a.符合ACR诊断标准的急性原发性痛风性关节炎。b.排除心血管、肾脏、血液疾病、肿瘤疾病引起的继发性痛风。c.排除合并感染性疾病患者。d.排除自身免疫性疾病及全身系统疾病患者。e.年龄18~75岁。f.一般情况良好。g.未服用降尿酸药物治疗者。对照组(C):随机选取青岛本地居民健康查体者100例(男95例,女5例),年龄(46.15±11.80)岁,排除高尿酸血症患者。高尿酸血症的诊断标准:是指正常嘌呤饮食状态下,非同日2次空腹血清尿酸水平(37℃)男性>420μmol/L,绝经前女性>360μmol/L,绝经后女性的诊断标准同男性。

1.2治疗方案:在低嘌呤饮食、足量饮水前提下,AGA药物治疗方案:(1)镇痛:为主要治疗措施。秋水仙碱片,服药疗程14 d:前3天0.5毫克/次,3次/天,餐后服;然后0.5毫克/次,2次/天,餐后服,连续用药7 d;后4 d 0.5毫克/次,1次/晚,睡前服。依托考昔片,服药疗程10 d:前3 d 120毫克/次,1次/天,餐后服;3 d后60毫克/次,1次/天,餐后服,连续用药7 d。(2)碱化尿液:抑制尿酸在肾脏形成晶体,促进尿酸肾脏排泄。尿p H值维持在6.2~6.8。给予口服枸橼酸钾钠颗粒(逍适柠)2.5克/次,4次/天(三餐后及睡前)。治疗过程中若出现肝、肾功能异常及胃肠道反应则予以排除。

1.3观测指标:(1)测定两组的一般生理指标:年龄(A g e)、身高(BH)、体质量(BW)、收缩压/舒张压(SBP/DBP)、腰围(WC)、臀围(HC)。计算腰臀比(WHR)及体质量指数(BMI)。BMI=体质量(kg)/身高(m)2。(2)测定两组的空腹血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、尿酸(UA)、空腹血糖(FPG)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、C-反应蛋白(CRP)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)。测定两组全血白细胞总数(WBC)、中性粒细胞数(NEUT)、中性粒细胞百分比(NEUT%)。(3)测定观察组治疗前(第0天,D0)及治疗后第3天(D3)、第7天(D7)、第14天(D14)PBMCs中NLRP3 m RNA、ASC m RNA及caspase-1 m RNA。同时测定对照组上述指标,与观察组治疗前指标进行比较研究。

1.4主要检测方法:所有入选者由专人进行一般生理指标测量并记录。实验中血清ALT、AST、UA、FPG、TG、TC、LDL-C、HDL-C、CRP、Cr、BUN的检测用全自动生化分析仪。PBMCs中NLRP3、ASC及caspase-1 m RNA采用RT-PCR检测。血分析采用SYSMEX XT-2000i全自动血液分析仪检测。

1.5统计学处理:NLRP3炎性体m RNA在观察组与对照组间比较采用独立样本t检验,在观察组内不同时间对比采用配对样本t检验,一般生理指标、血生化指标及全血分析白细胞数等用独立样本t检验,计数资料采用χ2检验。计量资料用(±s)表示。采用IBM SPSS 19.0软件包对所有数据进行统计学分析,以P<0.05为有统计学差异。

2结果

2.1一般临床资料及实验室检查指标比较:观察组与对照组比较,两组性别、Age、AST差异均无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,观察组BH、BW、BMI、SBP、DBP、WC、HC、WHR、FPG、UA、ALT、Cr、BUN、TG、TC、LDL-C、HDL-C、C-RP、WBC、NEUT、NEUT%均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05~0.01),见表1。

2.2两组间NLRP3炎性体m RNA表达水平比较:观察组与对照组相比,NLRP3 m RNA及aspase-1 m RNA表达水平在D0、D3均显著降低,ASC m RNA表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);NLRP3 m RNA表达水平在D7显著降低,ASC m RNA表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);ASC m RNA表达水平在D14显著升高,差异有统计学意义(P<0.05;其他阶段与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

注:*观察组与对照组相比(T vs C)P<0.01,#观察组与对照组相比(T vs C)P<0.05

2.3观察组内NLRP3炎性体m RNA表达水平比较:治疗不同时间观察组内比较,D0与D3相比,NLRP3 m RNA、ASC m RNA及csapase-1m RNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05);D0与D7、D14相比,NLRP3 m RNA及csapase-1 m RNA表达水平明显降低,ASC m RNA表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。D3与D7、D14相比,NLRP3 m RNA及csapase-1 m RNA表达水平明显降低,ASC m RNA表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.01)。D7与D14相比,NLRP3 m RNA表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);ASC m RNA表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);csapase-1 m RNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

3讨论

痛风(Gout)是因嘌呤代谢障碍和(或)尿酸排泄减少、血UA持续升高而导致MSU晶体析出并沉积于组织或器官引起的一组临床症候群,属于代谢性风湿病[4]。报道显示,国内痛风的患病率目前在1%~3%,2009年山东沿海地区当地居民痛风患病率为1.96%,2007年~2008年美国痛风患病率上升至3.9%[5]。AGA可发生于任何年龄,发病高峰年龄为40岁左右,且常伴有糖尿病、肥胖、心脑血管病、肾脏病等,患病率随年龄的增长有逐渐增高的趋势。本研究中,与对照组相比,观察组BH、BW、BMI、SBP、DBP、WC、HC、WHR、FPG、UA、ALT、Cr、BUN、TG、TC、LDL-C、HDL-C均明显升高(P<0.01)亦支持上述观点。AGA临床上以男性患者多见,女性约占5%[1],且多为绝经期后妇女。AGA发作时疼痛剧烈,患者异常痛苦,严重影响日常工作和生活。目前尚无根治AGA的办法,及时有效的早期治疗,尤其是镇痛治疗,可以有效减少痛风的发作,使病情好转[6]。近年来研究发现单核/巨噬细胞系统在AGA启动、进展及缓解中均发挥了关键作用,其中IL-1β是MSU晶体诱导炎症的关键因子,NLRP3炎性体通过促进IL-1β的生成在痛风发作中发挥不可替代的作用。

NLRP3炎性体,即Nod样受体蛋白3(nod-like receptor protein 3,NLRP3)炎性体是位于细胞内的一种蛋白质复合体,主要功能为活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)以间接调控IL-lβ、IL-18[7]、和IL-33等的成熟和分泌,具有调控机体炎性反应的功能。NLRP3炎性体是由核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)家族成员NLRP3(NLR family,pyrin domain containing 3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosisassociated speck-like protein containing CARD,ASC)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cysteine-requiring aspartate protease-1,caspase-1)组成的复合体,是内源性或外源性危险信号的胞质内感受器,是活化caspase-1的分子平台,调控IL-lβ和白细胞介素18(IL-18)等促炎细胞因子的成熟和分泌。IL-lβ是一个经典的促炎性细胞因子,活化的IL-lβ与靶细胞上的IL-1受体结合,激活IL-1信号通路和髓样分化因子(myeloid differentiation factor,My D88)依赖的NF-κB通路,促进IL-1等促炎因子转录,诱导机体炎性反应。研究证实,IL-lβ是促进多种代谢性疾病发生发展的重要炎性因子,阻断其生物学效应能有效缓解代谢性疾病的进展。NLRP3是模式识别胞内受体Nod样受体蛋白家族的成员,广泛表达于树突细胞、单核细胞和巨噬细胞,具有识别病原体的功能。ASC是NLRP3炎性体的双重衔接蛋白,能够以某种桥梁的形式将NLRP3和caspase-1前体连接起来,最终形成具有酶活性的异二聚体caspase-1。caspase-1作为炎性体的效应蛋白,能够将无活性的IL-18和IL-1β前体剪切为成熟的IL-18和IL-1β,促进其成熟分泌。

目前研究认为,NLRP3炎性体是MSU导致痛风的核心机制。M a r t i n o n等[8]研究显示,NLRP3介导MSU诱导痛风发生发展,其机制可能与MSU诱导K+外流有关,还可能与线粒体来源的活性氧(reactive oxygen species,ROS)释放有关,溶酶体破裂也可能是MSU激活NLRP3炎性小体的机制之一。本研究结果显示,AGA发病时及治疗后第3天,ASC m RNA表达水平均显著高于对照组(P<0.01);NLRP3 m RNA及caspase-1 m RNA表达水平均显著低于对照组(P<0.01),说明在炎症早期,NLRP3炎性体参与了疾病过程。治疗后第7天,患者NLRP3 m RNA表达水平仍低于对照组(P<0.01),ASC m RNA表达水平仍高于对照组(P<0.01),caspase-1 m RNA表达水平与对照组无明显差异,提示在炎症持续存在期间,NLRP3炎性体持续参与炎症过程,随病程进行,炎症消退过程中,抑制炎症的调控因素可能逐渐出现。治疗第14天NLRP3 m RNA及caspase-1 m RNA表达水平与对照组无明显差异,ASC m RNA表达水平仍高于对照组(P<0.05),较前已明显降低,结果显示AGA炎症消退,趋于正常,ASC表达可能存在其他途径及意义。

本研究结果发现,给予AGA镇痛治疗不同时间,观察组内NLRP3炎性体m RNA表达水平,D0与D3相比,NLRP3 m RNA、ASC m RNA及csapase-1 m RNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05),提示在AGA发病初期,炎症启动及早期进展阶段,镇痛治疗并未完全抑制NLRP3炎性体发挥作用;D0与D7、D14相比,NLRP3 m RNA及csapase-1 m RNA表达水平明显降低,ASC m RNA表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.01);D3与D7、D14相比,NLRP3 m RNA及csapase-1 m RNA表达水平明显降低,ASC m RNA表达水平显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),表明在AGA进展阶段,镇痛治疗逐渐发挥作用,NLRP3炎性体作用逐渐减弱,炎症被抑并逐渐消退。D7与D14相比,NLRP3 m RNA表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);ASC m RNA表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.01);csapase-1 m RNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05),结果提示炎症进一步减弱,病情趋于稳定。

AGA的前炎性介质来源于常驻的滑膜细胞和迁移的单核巨噬细胞,而NEUT的侵入和活化是最重要的环节。发病时关节滑液和滑膜中出现的大量NEUT甚至可与急性化脓性关节炎时相当[9]。本研究中,发病时的WBC、NEUT、NEUT%及CRP均显著高于对照组,提示AGA发病时WBC及NEUT在炎症初期就参与了反应。

总之,本研究结果表明,NLRP3炎性体在AGA患者发病及镇痛治疗过程中水平异常,提示它们在AGA发病中参与了炎性反应过程,在炎症机制中可能发挥了重要作用。结果亦提示,NLRP3炎性体在炎症过程中存在负向调节,它们在炎症发生、进展及缓解中的负面作用亦可能存在,需要在今后的研究中进一步探讨。

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[8]Martinon F,Petrilli V,Mayor A,et al.Gout-associated uric acid crystals activate the NALP3 inf lammasome[J].Nature,2006,440(7081):237-241.

外周血单核细胞 篇7

1对象与方法

1.1研究对象

选取于2014年6月至2015年6月期间在深圳市第三人民医院就诊的104例肺结核患者为研究对象,其中男性65例,女性39例,平均年龄(36.5±13.7)岁。所有患者均符合2005年中华医学会《临床诊疗指南·结核病分册》中的诊断要求[5],且痰涂片阳性,结核菌特异性IFN-γElispot检测阳性,均为初治肺结核,无合并其它感染性疾病、遗传代谢性疾病和自身免疫性疾病等。本研究经深圳市第三人民医院伦理委员会批准,所有研究对象均签署知情同意书。

1.2试剂与仪器

人淋巴细胞分离液(批号:DKW-KLSH-0100)购自深圳达科微生物公司,RPMI 1640培养基(批号:11875-093)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,批号:10437-028)均购自美国Gibco公司,CD14免疫磁珠(货号130-097-052)购自德国Miltenyi公司,总RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit,批号:74106)购买自德国Qiagen公司,SYBR Green实时定量PCR试剂(批号:RR820A)购自日本TAKARA公司,q PCR引物委托深圳华大基因研究院合成,IL-1β、IL-1Ra细胞因子ELISA检测试剂盒(批号:DLB50、DRA00B)购自美国R&D公司。CO2细胞培养箱为美国Thermo Fisher公司产品,多功能酶标仪DTX880和细胞离心机为德国Beckman公司产品,ABI 7500实时定量PCR仪购自美国ABI公司,结核分枝杆菌裂解物由课题组前期自行制备并保存。

1.3中医诊断标准

依据国家中医药管理局《中医病证诊断疗效标准》[6],拟定肺阴亏虚、阴虚火旺、气阴两虚3个证型的主症和次症,根据其临床证侯、舌象、脉象进行中医辨证分型。所有病例的辨证分型均由两名专科中医师共同完成,分型结果不一致的病例予以剔除。由于阴阳两虚多见于病程日久、迁延难愈患者,且合并艾滋病患者居多,为避免不同疾病中医证型的相互干扰,本研究未纳入阴阳两虚患者。入选病例中肺阴亏虚33例、阴虚火旺36例、气阴两虚35例。不同中医证型人群在年龄、性别分布中差异无统计学意义(P>0.05)。

1.4外周血CD14+单核细胞的分选

用肝素锂抗凝管采集外周血5 m L,然后使用磷酸盐缓冲液(PBS)对比稀释,缓慢加入Ficoll淋巴细胞分离液上方,采用密度离心法分离出外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PB-MCs),取1×107个PBMCs与CD14免疫磁珠5μL置于4℃保存,孵育20分钟,再使用MACS自动磁珠分选仪获得CD14+单核细胞。

1.5结核杆菌刺激CD14+单核细胞

将来源于同一结核病患者的CD14+单核细胞一分为二,分别接种在24孔细胞培养板中两个细胞孔,细胞密度为2×105个/孔,加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基,并放置在5%CO2、37°C培养箱中孵育培养,12小时后,将其中一个细胞孔加入经煮沸处理的结核菌裂解物(Mtb lysate,20μg/m L)刺激。刺激12后分别收集细胞和培养上清,细胞裂解后提取总RNA,上清检测炎症因子IL-1β、IL-1Ra浓度。另外一个细胞孔则以无细菌刺激作为空白对照。

1.6总RNA的提取及实时定量PCR检测

根据RNeasy Mini Kit的说明书操作步骤,从CD14+单核细胞中提取总RNA。RNA的质量及浓度检测采用超微量分光光度计测定。取2μL RNA,使用oligo-T通用逆转录引物,在逆转录酶的作用下生成c DNA。使用IL1B和IL1RN基因特异性引物进行q PCR反应,引物序列见表1,反应体系如下:2×SYBR Premix Ex Taq 10μL,上、下游引物各0.8μL,ROX Reference DyeⅡ0.4μL,c DNA模板2μL,加双蒸水至20μL。反应条件:95°C 30秒,随后95°C 5秒,60°C 34秒,共40个循环。通过甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)内参基因Ct值进行标准化,最终以2-ΔΔCt值表示IL1B和IL1RN基因拷贝数。1.7 ELISA测定细胞上清IL-1β、IL-1Ra浓度

ELISA试剂盒测定IL-1β、IL-1Ra浓度。首先加入200μL样本至反应孔中,室温孵育2小时后,PBS洗涤3次,然后加入200μL酶标二抗室温孵育1小时,PBS洗涤3次,最后加入200μL底物显色,使用DTX880酶标仪读取光密度值(optical density,OD),根据标准曲线计算炎症因子浓度,然后比较不同中医证型患者之间表达水平差异。

1.8统计学处理

数据统计和图表制作均由Graph Pad 5.0软件完成。其中计量资料采用均数±标准差表示,对数据进行正态分布和方差齐性检验,符合正态分布且方差齐,组间比较运用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验进行。以P<0.05为差异有统计学意义,以P<0.01为有显著性统计学差异。

2结果

2.1应用实时定量PCR技术检测IL1B、IL1RN基因表达

如图1所示,q PCR扩增曲线图显示IL1B、IL1RN和GAPDH基因可以被有效扩增,而熔解曲线图显示不同基因具有特异性熔解曲线,而且曲线峰值单一,提示前期设计的引物具有很好的敏感性和特异性。

2.2不同中医证型肺结核患者CD14+单核细胞IL-1β表达水平差异

相对于空白对照,结核菌裂解物能显著刺激IL-1β分泌,其中肺阴亏虚组表达水平最高,显著高于阴虚火旺组和气阴两虚组,差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01),其中阴虚火旺组IL-1β分泌水平又显著高于气阴两虚组(P<0.05)。同时利用q PCR技术检测IL1B基因表达水平,与蛋白表达水平相一致,在肺阴亏虚、阴虚火旺、气阴两虚三组中IL1B基因表达水平依次降低,且组间比较差异均有统计学意义(P<0.05、P<0.01)。详见表2。

2.3不同中医证型肺结核患者CD14+单核细胞IL-1Ra表达水平差异

在无结核菌刺激的条件下,IL-1Ra分泌水平在肺阴亏虚、阴虚火旺、气阴两虚三组患者中差异无统计学意义(P>0.05),而结核菌刺激能够显著增加IL-1Ra分泌水平,其中气阴两虚组升高最为明显,显著高于肺阴亏虚组和阴虚火旺组,差异有统计学意义(P<0.05),而肺阴亏虚组和阴虚火旺组差异无统计学意义(P>0.05)。IL-1Ra的编码基因为IL1RN,在mRNA水平,气阴两虚组IL1RN表达水平显著高于其他两组,差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)。详见表3。

2.4肺结核患者中医证型与CD14+单核细胞IL-1β/IL-1Ra比值的相关性

根据上述细胞上清IL-1β和IL-1Ra浓度进一步计算IL-1β/IL-1Ra比值,如表4所示,与空白对照组比较,肺阴亏虚、阴虚火旺、气阴两虚三组IL-1β/IL-1Ra比值差异无统计学意义(P>0.05),而在结核菌刺激后,IL-1β/IL-1Ra比值在肺阴亏虚和阴虚火旺中显著增高,显著高于气阴两虚组,差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01)。详见表4。

3讨论

中医学对“肺痨”的认识历史悠久,早在《内经·灵枢》就有记载“咳,脱形,身热,脉小以疾”,详细描述了肺痨的主症和慢性消耗性特征。晋代《肘后备急方》首次创立“鬼注”“尸注”之名,并认识到本病具有传染性。宋代《三因极一病证方论》首次提出“痨瘵”之名,并与“虚劳”病证划清界限。《普济本事方》记载“肺虫居肺叶之内,蚀人肺体,故成瘥疾,咯血声嘶”,认为本病是由“肺虫”引起。《医学正传·劳极》确立了杀虫与补虚两大治疗原则。肺痨病位在肺,肺喜润恶燥,痨虫蚀肺,首耗肺阴,阴不制阳,则现阴虚火旺之候,若阴伤及气,或阴损及阳,则可出现气阴两伤或阴阳两虚之候[7]。因此朱丹溪提出“痨瘵主乎阴虚”之说,并倡导“滋阴降火”这一治则应贯穿肺痨治疗的始终。

多种微生物感染可以诱导IL-1β产生,如《Nature》报道[8]白色念珠菌通过激活NLRP3炎症小体而促进IL-1β产生并介导宿主抗真菌免疫应答。Mishra等[9]发现结核杆菌效应分子ESAT-6同样能够被NLRP3炎症小体识别并导致IL-1β分泌。动物实验证实IL1B基因敲除小鼠在感染结核菌后表现出更高的死亡率和肺脏细菌载量[10],提示IL-1β及其介导的信号通路在结核保护性免疫中发挥重要作用。IL-1Ra是一种有高度选择性的竞争性受体拮抗剂,它与受体结合但并不能激活受体,从而抑制IL-1β的多种生物学活性[4]。IL-1β/IL-1 Ra比值可以作为评估机体抗结核免疫应答的重要指标。

在本研究中,结核菌刺激能够显著诱导CD14+单核细胞分泌IL-1β和IL-1Ra,而以肺阴亏虚患者IL-1β表达水平最高,随着病机演变,阴虚火旺患者逐渐降低,至气阴两伤阶段,其表达水平最低,提示IL-1β表达水平与病机演变密切相关,而且IL-1β作为机体抗结核感染免疫的重要指标,也可以作为中医正气损伤的有效生物标识。此外,研究发现气阴两虚患者IL-Ra表达水平显著升高,因此推测对于肺痨后期患者,IL-Ra升高竞争性抑制IL-1β介导的抗结核免疫应答,从而导致病情迁延难愈。IL-Ra不仅可以作为气阴两虚证型的微观辨证标签,也有希望作为未来结核病治疗的分子靶点。

总而言之,本研究证实在肺结核早期(肺阴亏虚型),主要表现为高IL-1β、低IL-Ra表达;在疾病中期(阴虚火旺型),IL-1β水平逐渐降低;而在疾病后期(气阴两虚型),则呈现低IL-1β、高IL-Ra的临床表型。以上结果提示在肺结核病机演变过程中,IL-1β介导的宿主保护性免疫逐渐弱化,而IL-Ra介导的病理性免疫逐渐增强。根据本研究结果,在未来结核病治疗中,需要在中医辨证施治的基础上,适当配伍合适的免疫调节剂,如黄芪多糖和黄芪皂苷已被证实可以促进巨噬细胞分泌IL-1β[11],这是未来研究的主要方向。

摘要：目的 探讨肺结核患者不同中医证型与CD14+单核细胞白介素-1β(interleukine-1β,IL-1β)、白介素-1受体拮抗剂(interleukine-1 receptor anlagenist,IL-1Ra)表达水平的相关性。方法选取104例肺结核确诊患者为研究对象,其中肺阴亏虚33例,阴虚火旺36例,气阴两虚35例。采集抗凝血并利用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,与CD14+免疫磁珠孵育后获得单核细胞,使用结核杆菌裂解物刺激单核细胞,同时设立空白对照。12小时后收集细胞上清通过酶联免疫吸附法测定IL-1β、IL-1Ra水平,同时裂解细胞提取总RNA,利用实时定量PCR技术测定IL1B、IL1RN基因相对表达量。通过方差分析比较不同证型肺结核患者IL-1β、IL-1Ra表达水平的差异。结果(1)成功建立检测IL1B、IL1RN基因的实时定量PCR技术,靶基因可以被有效扩增,并且引物具有良好特异性;(2)结核菌刺激后IL-1β蛋白表达水平显著升高,其中肺阴亏虚组显著高于阴虚火旺组和气阴两虚组(P<0.05),阴虚火旺组IL-1β分泌水平又显著高于气阴两虚组(P<0.05)。IL-1B mRNA表达趋势与蛋白表达趋势一致,肺阴亏虚、阴虚火旺、气阴两虚三组中IL-1B基因表达水平依次降低,组与组之间差异均有统计学意义(P<0.05、P<0.01);(3)结核菌刺激能够显著增加IL-1Ra分泌水平,气阴两虚组显著高于其它两组(P<0.05),而肺阴亏虚组和阴虚火旺组差异无统计学意义(P>0.05)。同时,在mRNA层面气阴两虚组IL1RN表达水平显著高于其它两组,差异有统计学意义(P<0.05、P<0.01);(4)在结核菌刺激后,IL-1β/IL-1Ra比值在肺阴亏虚和阴虚火旺组中明显增高,显著高于气阴两虚组(P<0.01、P<0.05)。结论 IL-1β、IL-1Ra表达水平与肺结核中医病机演变密切相关,由此推测它们不仅可以作为肺结核中医微观辨证的生物标识,也可以作为未来结核病治疗的有效分子靶点。

外周血单核细胞 篇8

1 对象与方法

1.1 研究对象。观察组(T):随机选取符合以下诊断标准和剔除标准的患者100例(男95例,女5例),年龄(47.25±10.99)岁,全部来自本院2014年8月至2016年2月的门诊患者。①急性痛风性关节炎诊断标准:应用美国风湿病协会(ACR)1997年制定的诊断标准。②入选和剔除标准:a.符合ACR诊断标准的急性原发性痛风性关节炎。b.排除心血管、肾脏、血液疾病、肿瘤疾病引起的继发性痛风。c.排除合并感染性疾病患者。d.排除自身免疫性疾病及全身系统疾病患者。e.年龄18~75岁。f.一般情况良好。g.未服用降尿酸药物治疗者。对照组(C):随机选取青岛本地居民健康查体者100例(男95 例,女5 例),年龄(46.15±11.80)岁,排除高尿酸血症患者。高尿酸血症的诊断标准:是指正常嘌呤饮食状态下,非同日2次空腹血清尿酸水平(37℃)男性>420μmol/L,绝经前女性>360μmol/L,绝经后女性的诊断标准同男性。

注:*观察组与对照组相比(T vs C)P<0.01,#观察组与对照组相比(T vs C)P<0.05

注:*观察组与对照组相比(T vs C)P<0.01,#观察组与对照组相比(T vs C)P<0.05

1.2 治疗方案:

在低嘌呤饮食、足量饮水前提下,AGA药物治疗方案:①镇痛:为主要治疗措施。秋水仙碱片,服药疗程14 d:前3 d0.5毫克/次,3次/天,餐后服;然后0.5毫克/次,2次/天,餐后服,连续用药7 d;后4 d 0.5毫克/次,1次/晚,睡前服。依托考昔片,服药疗程10 d:前3 d 120毫克/次,1次/天,餐后服;3 d后60毫克/次,1次/天,餐后服,连续用药7 d。②碱化尿液:抑制尿酸在肾脏形成晶体,促进尿酸肾脏排泄。尿p H值维持在6.2~6.8。给予口服枸橼酸钾钠颗粒(逍适柠)2.5克/次,4次/天(三餐后及睡前)。治疗过程中若出现肝、肾功能异常及胃肠道反应则予以排除。

1.3 观测指标:

①测定两组的一般生理指标:年龄(A g e)、身高(BH)、体质量(BW)、收缩压/舒张压(SBP/DBP)、腰围(WC)、臀围(HC)。计算腰臀比(WHR)及体质量指数(BMI)。BMI=体质量(kg)/身高(m)2。②测定两组的空腹血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、尿酸(UA)、空腹血糖(FPG)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、C-反应蛋白(CRP)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)。测定两组全血白细胞总数(WBC)、中性粒细胞数(NEUT)、中性粒细胞百分比(NEUT%)。③测定观察组治疗前(第0天,D0)及治疗后第3天(D3)、第7天(D7)、第14天(D14)PBMCs中NLRP3 m RNA、ASC m RNA及caspase-1 m RNA。测定相应时间点的空腹血清TNF-α水平。同时测定对照组上述指标,与观察组治疗前指标进行比较研究。

1.4主要检测方法:所有入选者由专人进行一般生理指标测量并记录。实验中血清ALT、AST、UA、FPG、TG、TC、LDL-C、HDL-C、CRP、Cr、BUN的检测用全自动生化分析仪,TNF-α的检测采用ELISA试剂盒。PBMCs中NLRP3、ASC及caspase-1 m RNA采用RT-PCR检测。血分析采用SYSMEX XT-2000i全自动血液分析仪检测。

1.5 统计学处理:

观察组与对照组NLRP3炎性体m RNA比较采用独立样本t检验,一般生理指标、血生化指标及全血分析白细胞数等用独立样本t检验,计数资料采用χ2检验。计量资料用(±s)表示。采用IBM SPSS19.0软件包对所有数据进行统计学分析,以P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 一般临床资料及实验室检查指标比较:

观察组与对照组比较,两组性别、Age、AST差异均无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,观察组BH、BW、BMI、SBP、DBP、WC、HC、WHR、FPG、UA、ALT、Cr、BUN、TG、TC、LDL-C、HDL-C、C-RP、WBC、NEUT、NEUT%均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05~0.01),见表1。

注:*观察组与对照组相比(T vs C)P<0.01,#观察组与对照组相比(T vs C)P<0.05

2.2 两组NLRP3 m RNA表达水平比较:

观察组NLRP3 m RNA表达水平D0、D3及D7vs C显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),D14 vs C差异无统计学意义(P>0.05);观察组各阶段ASC m RNA表达水平与对照组相比显著升高,差异均有统计学意义,其中D0、D3及D7 vs C(P<0.01)、D14 vs C(P<0.05);观察组caspase-1 m RNA表达水平,D0及D3vs C显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),D7及D14 vs C差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3 两组TNF-α水平比较:

观察组D0、D3、D7血清TNF-α水平与对照组相比显著升高,差异有统计学意义(均为P<0.01)。D14与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

3 讨论

痛风(Gout)是因嘌呤代谢障碍和(或)尿酸排泄减少、血UA持续升高而导致MSU晶体析出并沉积于组织或器官引起的一组临床症候群,属于代谢性风湿病[3]。报道显示,国内痛风的患病率目前在1%~3%,2009年山东沿海地区当地居民痛风患病率为1.96%,2007年~2008年美国痛风患病率上升至3.9%[4]。AGA可发生于任何年龄,发病高峰年龄为40岁左右,且常伴有糖尿病、肥胖、心脑血管病、肾脏病等,患病率随年龄的增长有逐渐增高的趋势。本研究中,与对照组相比,观察组BH、BW、BMI、SBP、DBP、WC、HC、WHR、FPG、UA、ALT、Cr、BUN、TG、TC、LDL-C、HDL-C均明显升高(P<0.01)亦支持上述观点。AGA临床上以男性患者多见,女性约占5%[1],且多为绝经期后妇女。AGA发作时疼痛剧烈,患者异常痛苦,严重影响日常工作和生活。近年来研究发现单核/巨噬细胞系统在AGA启动、进展及缓解中均发挥了关键作用,发作涉及IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α等多种炎性因子,其中IL-1β是MSU晶体诱导炎症的关键因子,TNF-α作为一个重要的炎性因子,在AGA时大量释放到循环中,刺激全身的急性时相反应,可致全身不适、发热、WBC升高。

NLRP3炎性体,即Nod样受体蛋白3(Nod-like receptor protein 3,NLRP3)炎性体是位于细胞内的一种蛋白质复合体,主要功能为活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)以间接调控IL-lβ、IL-18[5]、和IL-33等的成熟和分泌,具有调控机体炎性反应的功能。NLRP3炎性体是由核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,NLRs)家族成员NLRP3(NLR family,pyrin domain containing 3)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosisassociated speck-like protein containing CARD,ASC)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(cysteine-requiring aspartate protease-1,caspase-1)组成的复合体,是内源性或外源性危险信号的胞质内感受器,是活化caspase-1的分子平台,调控IL-lβ和IL-18等促炎细胞因子的成熟和分泌。IL-lβ是一个经典的促炎性细胞因子,活化的IL-lβ与靶细胞上的IL-1受体结合,激活IL-1信号通路和髓样分化因子(myeloid differentiation factor,My D88)依赖的NF-κB通路,促进IL-1等促炎因子转录,诱导机体炎性反应。研究证实,IL-lβ是促进多种代谢性疾病发生发展的重要炎性因子,阻断其生物学效应能有效缓解代谢性疾病的进展。NLRP3是模式识别胞内受体Nod样受体蛋白家族的成员,广泛表达于树突细胞、单核细胞和巨噬细胞,具有识别病原体的功能。ASC是NLRP3炎性体的双重衔接蛋白,能够以某种桥梁的形式将NLRP3和caspase-1前体连接起来,最终形成具有酶活性的异二聚体caspase-1。caspase-1作为炎性体的效应蛋白,能够将无活性的IL-18和IL-1β前体剪切为成熟的IL-18和IL-1β,促进其成熟分泌。

目前研究认为,NLRP3炎性体是MSU导致痛风的核心机制。Martinon等[6]研究显示,NLRP3介导MSU诱导痛风发生发展,其机制可能与MSU诱导K+外流有关,还可能与线粒体来源的活性氧(reactive oxygen species,ROS)释放有关,溶酶体破裂也可能是MSU激活NLRP3炎性小体的机制之一。本研究结果显示,AGA发病时及治疗后第3天,NLRP3 m RNA、ASC m RNA及caspase-1 m RNA表达水平均显著高于对照组(P<0.01),说明在炎症早期,NLRP3炎性体参与了疾病过程。治疗后第7天,患者NLRP3 m RNA、ASC m RNA表达水平仍高于对照组(P<0.01),caspase-1 m RNA表达水平与对照组无明显差异,提示在炎症持续存在期间,NLRP3炎性体持续参与炎症过程,随病程进行,炎症消退过程中,抑制炎症的调控因素可能逐渐出现。治疗第14天NLRP3 m RNA及caspase-1 m RNA表达水平与对照组无明显差异,ASC m RNA表达水平仍高于对照组(P<0.05),较前已明显降低,结果显示AGA炎症消退,趋于正常,ASC表达可能存在其他途径及意义。

AGA的前炎性介质来源于常驻的滑膜细胞和迁移的单核巨噬细胞,而NEUT的侵入和活化是最重要的环节。发病时关节滑液和滑膜中出现的大量NEUT甚至可与急性化脓性关节炎时相当[7]。本研究中,发病时的WBC、NEUT、NEUT%及CRP均显著高于对照组,提示AGA发病时WBC及NEUT在炎症初期就参与了反应。

TNF-α是一种具有内毒素样抗肿瘤炎性细胞因子,可作用于T细胞、B细胞、NK细胞发挥多种生物学活性。TNF-α主要由巨噬细胞、单核细胞产生,中性粒细胞、内皮细胞、星状细胞、平滑肌细胞、杀伤细胞也可产生TNF-α。有研究表明[8],TNF-α在风湿性关节炎的血清和滑膜中大量增加,并刺激下丘脑体温调节中枢及巨噬细胞释放IL-1、IL-6。TNF-α主要作用是刺激机体产生炎性反应,减低基质中蛋白多糖、胶原物质的合成,诱导基质金属蛋白酶高表达,增加血管内皮细胞的通透性,刺激产生如IL-1、IL-6、IL-8等炎性细胞因子。研究显示,在炎症的早中期阶段,痛风患者关节液中IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子水平和白细胞水平明显升高。本研究中,观察组D0、D3、D7血清TNF-α水平与对照组相比显著升高,差异有统计学意义(均为P<0.01)。D14与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),表明在AGA炎症启动及进展阶段TNF-α水平升高,在炎症缓解阶段TNF-α水平逐渐降低,与国内有些研究结果相一致[9,10]。TNF-α可加速急性滑膜炎关节滑液内的NEUT凋亡过程,凋亡的NEUT可被巨噬细胞所吞噬[7]。关于TNF-α对NEUT凋亡影响的研究结论尚不一致。

总之,本研究结果表明,NLRP3炎性体及TNF-α在AGA患者发病及治疗过程中水平异常,提示它们在AGA发病中参与了炎性反应过程,在炎症机制中可能发挥了重要作用。结果亦提示,NLRP3炎性体及TNF-α在炎症过程存在与多种炎性因子的共同作用,相互影响,亦存在相关负向调节,它们在炎症发生、进展及缓解中的负面作用亦可能存在,需要在今后的研究中进一步探讨。

摘要：目的 检测急性痛风性关节炎(acute gouty arthritis,AGA)患者治疗前后外周血单核细胞(peripheral blood monocytes,PBMCs)中NLRP3炎性体[NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、半胱天冬酶-1(caspase-1)]m RNA表达水平及肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α水平的变化,探讨该炎性体及TNF-α在AGA发病中可能的作用机制。方法 用RT-PCR法检测100名健康查体者(对照组,C)和100例AGA患者(观察组,T)治疗前(D0)及应用药物治疗后第3天(D3)、第7天(D7)、第14(D14)天NLRP3炎性体m RNA表达水平,同时用ELISA法测定相应TNF-α水平。观察组与对照组比较采用独立样本t检验,一般生理指标及血生化指标用独立样本t检验,计数资料采用χ2检验。计量资料用(x-±s)表示。采用IBM SPSS 19.0软件包对所有数据进行统计学分析。结果 观察组NLRP3 m RNA表达水平D0、D3及D7vs C显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),D14 vs C差异无统计学意义(P>0.05);观察组各阶段ASC m RNA表达水平与对照组相比显著升高,差异均有统计学意义,其中D0、D3及D7 vs C(P<0.01)、D14 vs C(P<0.05);观察组caspase-1 m RNA表达水平,D0及D3 vs C显著升高,差异有统计学意义(P<0.01),D7及D14 vs C差异无统计学意义(P>0.05)。观察组D0、D3、D7血清TNF-α水平与对照组相比显著升高,差异有统计学意义(均为P<0.01)。D14与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论 NLRP3炎性体及TNF-α在AGA患者治疗过程中水平异常,提示它们在AGA发病中参与了炎性反应过程,在炎症机制中可能发挥了重要作用。

关键词：凋亡相关斑点样蛋白,半胱天冬酶-1,NLRP3,炎性体,痛风性关节炎

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