神经前体细胞（共7篇）
神经前体细胞 篇1
神经前体细胞 (neural precursor cells, NPCs) 具有自我更新和增殖为神经元和胶质细胞的能力。脑梗死后NPCs可移行至缺血灶周围, 补充、修复神经元的缺失和功能损伤, 发挥内源性抗损伤修复作用[1]。本研究旨在动态观察急性脑梗死及电针治疗后梗死灶边缘Brdu阳性细胞数和DCX阳性细胞数, 探讨脑梗死后电针治疗对NPCs移行在中枢神经损伤修复中的作用。为卒中后神经功能恢复提供一种新思路。
1 材料与方法
1.1 动物来源及模型制备 选用2月～3月龄雄性SD大鼠 (山西医科大学实验动物中心提供) 60只, 体重80 g～120 g, 应用双肾双夹法复制易卒中型肾性高血压大鼠 (RHRSP) 模型。用大鼠心率血压计经尾部测血压, 肾动脉狭窄前测量1次, 狭窄后每周1次。造模后16周取血压≥180 mmHg且无脑卒中症状, 体重450 g～500 g的RHRSP大鼠, 参照Wahl等[2]的方法电凝MCA跨嗅束后的主干, 并于显微镜下见MCA供血中断, 制成凝闭大脑中动脉 (MCAO) 模型。
1.2 神经功能评分 依照Garcia等[3]的18分综合评分法。MCAO后12 h始每日 (1周后改为2次/周) 由2人同时评分, 其中1人不知观察鼠属于何组。
1.3 动物分组 采取随机分组。对照组:RHRSP 非MCAO (只作相同的开颅术, 但不凝闭大脑中动脉) 1周、2周、3周、4周, 每周组3只, 共12只;脑梗死组:RHRSP与MCAO模型成功1周、2周、3周、4周, 每周组6只, 共24只;电针组:RHRSP与MCAO模型成功行电针治疗1周、2周、3周、4周, 每周组6只, 共24只。
1.4 方法
1.4.1 Brdu标记 使用细胞增殖特异性标记物Brdu, 以10 mg/mL溶于生理盐水。各组于MCAO后24 h始腹腔注射Brdu (50 mg/kg) 标记处于增殖状态的NPCs。在注射日共注射3次, 间隔8 h。分组及在MCAO后注射时间为:1周组第6天;2周组第6、13天;3周组第6、13、20天;4周组第6、13、20、27天, 各组最后一次注射后12 h处死取脑。
1.4.2 电针治疗 选穴穴位参考《实验针灸学》[4]中常用实验动物的针灸穴位而确定, 针刺方法参考孟竞壁等[5]操作方法, MCAO后24 h, 用30号1寸毫针刺入病灶对侧, 相当于人的手三里、外关、伏兔及足三里, 进针深度2 mm～3 mm。针柄接至CMNS6-1型电子针灸治疗仪行电刺激, 1次/日。频率2Hz连续波, 输出强度3, 20 min/次。6 d一疗程, 停一天进行下一疗程。脑梗死组只做相同捆绑而不针刺。
1.4.3 病理学检查 经常规灌注后取脑, 固定, 脱水, 石蜡包埋, 由前向后作冠状切片, 片厚5 μm, 取经梗死灶周脑组织。行常规HE染色, 观察梗死灶周组织病变情况。梗死灶的计算: HE染色切片用Leica Q570图像分析检测。计算每张冠状切片上梗死灶的面积, 每个组织块梗死灶体积按下列公式计算:V=t1 (A 1 +A 2 ) /2+t 2 (A 2 +A 3 ) /2+…+t n-1 (An-1+A n ) /2 (注:V为体积, t为两相邻冠状面的间距, A为每一冠状面上梗死灶面积, n为冠状面序列号) 。
1.4.4 免疫荧光染色 分别检测各组不同时间点梗死灶周相同部位Brdu阳性细胞及DCX阳性细胞数。操作严格按照试剂盒说明进行, 烤片, 脱蜡, 抗原修复, 血清封闭, 滴加荧光标记二抗, 每张切片在灶周相同部位随机观察3个视野, 400倍荧光显微镜下计数Brdu阳性细胞及DCX阳性细胞数。
1.5 统计学处理 计量资料用均数±标准差
2 结 果
2.1 模型制作结果
RHRSP术前血压为110.08 mmHg±11.91 mmHg, 术后16周平均血压为198.37 mmHg±21.45 mmHg。
2.2 神经功能评分
对照组评分18分 (正常) 。MCAO后评分随时间逐渐增高, 5 d时恢复正常, 电针后2 d与3 d大鼠行为学评分较梗死组高 (与脑梗死组比较, 经t检验, P<0.05) 。
2.3 不同时间点各组脑组织病理变化情况
HE染色可见对照组神经元分布均匀, 间隙正常, 细胞核圆形蓝染。MCAO后1周梗死灶内脑组织软化, 细胞肿胀、胞浆液化, 细胞及小血管周围的间隙加宽。2周时上述区域为软化灶, 灶内有炎性细胞浸润。3周、 4周后病灶萎缩、深陷, 灶内、灶周有疤痕形成, 梗死后4周内随着时间延长梗死体积渐缩小。电针治疗后前3周梗死体积较脑梗死组缩小 (P<0.05) , 4周时无显著差别。脑梗死灶大小比较见表1。
2.4 不同处理组Brdu阳性和DCX阳性细胞数目
对照组Brdu阳性细胞数目很少, 排列稀疏。脑梗死及电针治疗后梗死灶边缘Brdu阳性细胞数目较对照组均增多 (P<0.05) , 且电针组多于脑梗死组 (P<0.05) , 随时间逐渐减少。脑梗死后脑内DCX阳性细胞数目增加, 缺血1周时细胞数增加达高峰, 之后逐渐减低;电针治疗1周末细胞数目明显增加, 2周～4周随时间延长数目较脑梗死组明显减少。DCX阳性细胞突起长, 有时连在一起似链状;有的细胞突起对称向各不同方向伸展。各组Brdu阳性和DCX阳性细胞数目详情见表2。
3 讨 论
在正常成年哺乳动物脑内, NPCs主要存在于脑室区和脑室下区 (SVZ) 、连接侧脑室和嗅球的区域以及海马齿状回。生理状态下, NPCs有固定的迁移途径, 经吻侧迁移流 (RMS) 迁移到嗅球分化成颗粒及球旁神经元。脑梗死后NPCs自SVZ呈链状穿过胼胝体、纹状体边缘到达缺血区, 发挥它们修复损伤的作用[6]。
Brdu为细胞增殖的标记物, 在中枢神经系统可作为增殖的NPCs的标记物。Doublecortin (DCX) 是神经细胞的重要微管相关蛋白, 在移行的神经元祖细胞有很强的表达, 可作为移行细胞标志物。Zhang等[7]在MCAO后7 d处死大鼠, 发现缺血灶周出现大量DCX阳性细胞。在脑缺血后, 脑损伤后的微环境使NPCs发生迁移。应用时间延迟拍摄显微镜发现DCX阳性细胞由SVZ多个方向移行至缺血灶周围, DCX可能作为一种内在蛋白来调节NPCs移行至缺血灶周围。本研究也证实, MCAO后灶周DCX阳性细胞数目明显增加, 在1周末最多, 之后逐渐减低。说明缺血可作为内源性因素诱导新生NPCs增殖并向梗死灶周围移行, 而缺血急性期为移行高峰期。Li等[8]观察大鼠脑梗死后14 d和30 d行外周胡须刺激, 发现DCX阳性细胞由SVZ移行至缺血灶周, 外周刺激组细胞数明显多于梗死组;外周刺激组梗死灶周围Brdu+/NeuN+细胞数明显多于梗死组, 提示外周刺激能够促进神经细胞移行, 同时也发现外周刺激显著增加血管内皮生长因子 (VEGF) 和基质衍生因子-1 (SDF-1) 在缺血灶周的表达。最近大量研究表明[9,10], VEGF 和 SDF-1在NPCs移行过程中发挥重要作用。
电针有改善神经功能缺损、保护脑缺血后神经元等作用。本实验结果显示, 电针治疗后3周内, 梗死灶体积较脑梗死组明显减小, 行为学评分明显低于脑梗死组, 说明电针可减小脑梗死体积, 促进神经功能恢复。MACO后各时间段电针组灶周Brdu阳性细胞数明显多于脑梗死组;DCX阳性细胞数1周末明显增加, 2周～4周随时间延长数目较脑梗死组明显减少。证实电针能促进脑梗死后内源性NPCs增殖和向梗死灶周移行, 且在梗死后一周效果最明显。提示电针可能在急性期通过改变脑内微环境, 影响VEGF、SDF-1等细胞因子来促使NPCs向灶周移行, 形成对病灶进行修复的物质基础。而随着电针治疗时间的延长, 病灶逐渐恢复, 推测可能影响移行的因子逐渐减少致使电针作用减弱。但电针与影响NPCs移行各因素的关系及具体作用机制, 还有待于进一步的深入研究。
参考文献
[1]Zhang RL, Zhang ZG, ZhangL, et al.Proliferation and differentia-tion of progenitor cells in the cortex and the subventricular zone inthe adult rat after focal cerebral ischemia[J].Neuroscience, 2001, 105 (1) :33.
[2]Wahl F, Allix M, Plotkine M, et al.Neurological and behavioraloutcomes of focal cerebral ischemia in rats[J].Stroke, 1992, 23:267-272.
[3]Garcia JH, Wagner S, Liu KF, et al.Neurological deficit and ex-tent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery oc-clusion in rats[J].Stroke, 1995, 26:627-635.
[4]邓春雷.实验针灸学[M].北京:人民卫生出版社, 1998:7.
[5]孟竞壁, 付卫星, 宋利明, 等.电针对实验性脑梗塞过程中脑氧代谢的影响[J].针刺研究, 1986 (3) :198-201.
[6]Luzzati F, De Marchis S, Parlato R, et al.New striatal neurons in amouse model of progressive striatal degeneration are generated inboth the subventricular zone and the striatal parenchyma[J].PlosOne, 2011, 6 (9) :e25088.
[7]Zhang RL, Chopp M, Gregg SR, et al.Patterns and dynamics ofsubventricular zone neuroblast migration in the ischemic striatumof the adult mouse[J].Cereb Blood Flow Metab, 2009, 29 (7) :1240-1250.
[8]Li WL, Yu SP, Ogle ME, et al.Enhanced neurogenesis and cell mi-gration following focal ischemia and peripheral stimulation in mice[J].Neurobiol, 2008, 68 (13) :1474-1486.
[9]Ohab JJ, Fleming S, Blesch A, et al.A neurovascular niche for neu-rogenesis after stroke[J].Neurosci, 2006, 26:13007-13016.
[10]Whitaker VR, Cui L, Miller S, et al.Whisker stimulation enhancesangiogenesis in the barrel cortex following focal ischemia in mice[J].Cereb Blood Flow Metab, 2007, 27:57-68.
神经前体细胞 篇2
神经干细胞的发现与应用为某些中枢神经系统疾病的治疗带来了新的曙光[1],但治疗的关键问题是要诱导神经干细胞定向分化为所需的神经元。因此,探求神经干细胞定向分化的最佳微环境成为研究的热点。本实验通过体外培养SVZa神经干细胞,然后分为对照组、BMP2组、ACM组、BMP2+ACM组分别予以诱导分化,研究SVZa神经干细胞在BMP2和ACM作用下分化为GABA能神经元的情况,希望为SVZa神经干细胞的定向分化研究提供一些实验资料。
1 材料和方法
1.1 材料
SPF级孕16 d Wistar大鼠及新生2 d的KM小鼠由第三军医大学实验动物中心提供。培养基及细胞因子:DMEM/F12(Hyclone)、BMP-2和bFGF(Peprotech)、B27(Gibco)、兔抗鼠GAD67(武汉博士德)、兔抗鼠GFAP多克隆抗体、山羊抗兔免疫组化SP检测试剂盒(SP-9001)、DAB显色剂及FITC标记山羊抗兔IgG(北京中杉)。
1.2 方法
1.2.1 SVZa神经干细胞的分离培养及鉴定
取SPF级孕16 d Wistar大鼠,经腹腔麻醉、备皮及消毒后,取出胎鼠。再次消毒后,固定于冰台,剪开头皮和软骨并剥离出整个鼠脑,清洗后在解剖显微镜下切取室管膜前下区脑组织。然后将切取的脑组织移入预置有2 m L无血清培养基的离心管内,用吸管轻轻吹打成单细胞悬液,调整细胞浓度后转移到75 m L培养瓶内,每瓶约1×106个活细胞,加入DMEM/F12(含20 u L/m L的B27和20 ng/mL的bFGF)无血清培养基5～7 m L,于37℃、5%二氧化碳、95%湿度孵箱内进行原代培养。此后根据细胞生长情况,一般每4、5 d传代1次。待细胞增殖形成悬浮球状克隆团后,免疫荧光染色法检测悬浮细胞球的nestin表达阳性。再用10%胎牛血清诱导分化后,分别检测NF、GFAP、CNP表达阳性,以验证其多分化潜能。
1.2.2 星形胶质细胞的纯化培养及ACM的制备
参照严稽文等[2]的方法,取新生2 d的KM小鼠大脑皮质进行原代培养,经差速黏附分离后按1×105个/cm2接种至用多聚赖氨酸包被过的培养瓶中。传代时,将培养瓶置摇床,振荡分离。传代后细胞按0.5×105个/cm2密度接种在培养瓶(培养板)中继续培养。传至第4代时进行细胞爬片,常规免疫组化染色鉴定。实验组的前期实验发现,在不停传代培养过程中,第3代的星形胶质分泌神经生长因子(NGF)、脑源性生长因子(BDNF)等的能力最强,传代培养后的第3～7天,NGF和BDNF的浓度较高。因此,本实验采用培养至第3代第5天的ACM,于收集前2天换入无血清DMEM培养基,收集的无血清ACM经离心后转入无菌玻璃瓶中,-20℃冻存待用。
1.2.3 免疫组化法镜下观察GAD67+细胞分化
取第3代纯化的SVZa神经干细胞,以5×104/m L密度接种于预先用1%多聚赖氨酸处理过的24孔培养板中,每孔1 m L,培养液为新鲜的含10%胎牛血清的DMEM/F12合成培养基,在此基础上分为对照组、BMP2组(加入10 ng/mL BMP2)、ACM组(培养液中含20%的ACM,80%的完全培养基[2])、BMP2+ACM组(在ACM组基础上加10ng/mL BMP2)分别诱导SVZa神经干细胞分化,每组设3个孔,第3、4天半量换液(换液时浓度同上),分化培养7 d后行常规GAD67免疫组化SP法DAB染色,在显微镜下观察分化情况。
1.2.4 流式细胞仪检测GAD67+细胞的比例
取第3代纯化的SVZa神经干细胞单细胞悬液,调整细胞浓度为1×105/m L接种于预先用1%多聚赖氨酸处理过的6孔培养板中,干预及分组情况同免疫组化法,每孔2 m L培养液。每个组设3孔,对照组共设6孔,其中3孔作为流式细胞仪检测的空白对照组。分化培养3d后行GAD67免疫荧光染色,用流式细胞仪检测阳性细胞数,每组3个标本,每个标本检测10 000个细胞,得到阳性细胞在总细胞中的所占比例。阳性率计算:阳性率=阳性细胞/(阳性细胞+阴性细胞)-对照组中的非特异结合率。
1.3 统计学分析
数据以表示,用SPSS 10.0软件进行统计,采用单因素方差分析,P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 SVZa神经干细胞的培养及鉴定
在无血清培养基中可见细胞呈球状克隆团样增殖,见图1,nestin表达阳性,见图2。再用10%胎牛血清诱导分化后,免疫荧光检测NF、GFAP、CNP表达阳性,说明所培养细胞不但能自我更新而且具有多分化潜能,属于神经干细胞。
2.2 免疫组化镜下观察
分化7d后免疫组化DAB染色可以发现,对照组中仅见少量的散在分布的GAD67+细胞,而实验组中GAD67+细胞数较对照组明显增加,尤其是BMP2+ACM组中GAD67+细胞数增加最明显,胞体呈卵圆形,有较长突起,细胞突起相互连接呈网状,见图3。
2.3 流式细胞仪检测分化率
SVZa神经干细胞分化为GAD67+细胞的比例为对照组(9.38±0.73)%,BMP2组(13.90±0.57)%,ACM组(16.85±0.59)%,BMP2+ACM组(20.45±0.94)%。各实验组的GAD67+细胞比例均明显高于对照组,其中BMP2+ACM组分化比例最高,单因素方差分析,P<0.05。
3 讨论
SVZa神经干细胞在体内背-腹信号控制下,不断沿着一条局限化的迁移通道-吻侧迁移流(rostral migratory stream,RMS)向嗅球(olfactory bulb,OB)迁移,最后在嗅球分化为具有OB表型特征的中间神经元,包括多巴胺能神经元和GABA能神经元。而SVZa神经干细胞除自我更新和多分化潜能外,还具有不同于其他神经干细胞的特点:可长距离定向迁移分向[3],故笔者选择SVZa神经干细胞作为研究GABA能神经元产生的细胞模型。
BMP2是转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员,对中枢神经系统的发育有着重要的作用。研究表明在E16d大鼠BMP2的免疫荧光染色显示,BMP2表达于从室管膜层(ventricular zone,VZ)到皮层的所有区域,这种表达方式同BMPR IA和BMPR IB的转录相吻合[4,5]。并且原位杂交显示,BMPR IA和BMPR IB广泛地在发育中的神经系统表达。这说明BMP2与神经干细胞的分化密切相关。MEHLER等[6]报道BMP2为1～10 ng/mL时促进祖细胞向神经元和星形胶质细胞分化,而在100 ng/mL时促进细胞凋亡。
神经干细胞在体内外的分化不仅受到自身基因的调控,而且更多地受到外来信号的影响,特别与其所处的微环境是密切相关的。星形胶质细胞是中枢神经系统内数量最多的一种胶质细胞,在结构和功能上是局部微环境理想的传感器和调控器。SONG等[7]发现星形胶质细胞可分泌神经生长因子(NGF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)等多种细胞因子,可以调控神经干细胞的分化,刺激神经元的产生。ACM作为星形胶质细胞体外培养时的细胞外液,其内含有丰富的可溶性生物活性物质,其促分化作用是单一神经营养因子所无法比拟的。NAKAYAMA[8]报道ACM中的可溶性因子是神经发育不可缺少的。
以往对GABA能神经元的研究多集中于海马来源的神经干细胞,而对于SVZa来源的神经干细胞分化为GABA能神经元报道较少。本研究结果显示BMP2和ACM均可促使SVZa神经干细胞向GABA能神经元分化,而且BMP2+ACM作用更显著(P<0.05),可获得正协同作用。其原因可能是:(1)两者促进神经干细胞向神经元分化的机制不同,存在互补作用。BMP2主要是与受体结合后激活Smad信号途径才能发挥生物学效应[9],而ACM中如GDNF主要是通过与GFR(1作用后促进GABA能神经元分化[10]。(2)有研究发现BMP2的诱导在作用初期较明显[11],而GDNF的作用时间窗较宽[10]。(3)JORDAN等[12]认为BMPs对神经元的作用是间接通过星形胶质细胞而产生,因此BMP2可能还有通过改变星形胶质细胞所分泌到细胞外液中的活性物质而达到调控GABA能神经元分化的作用。本研究为SVZa神经干细胞体外定向分化为GABA能神经元提供了基础研究资料。但BMP2与ACM促进神经干细胞向神经元分化的具体机制仍未完全阐明,有待进一步深入研究。
摘要：目的研究骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)及星形胶质细胞条件培养液(astrocyte-conditioned medium,ACM)在室管膜前下区(anterior subventricular zone,SVZa)神经干细胞分化为γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)能神经元中的作用。方法体外培养SVZa神经干细胞,分为对照组、BMP2组、ACM组、BMP2+ACM组分别予以诱导分化,通过免疫组化和流式细胞技术分别检测各组SVZa神经干细胞分化后GAD67+细胞的比例。结果各实验组的GAD67+细胞的比例均明显高于对照组,其中BMP2+ACM组尤其显著,差异有显著性(P<0.05)。结论BMP2及ACM可以促进SVZa神经干细胞向GABA能神经元分化,而且BMP2与ACM有正协同作用。
关键词：神经干细胞,细胞分化,GABA能神经元
参考文献
[1]蔡光先,刘柏炎,赖鼎元,等.神经干细胞移植对局灶性脑缺血大鼠神经功能的影响[J].中国现代医学杂志,2007,17(24):2971-2973.[1]CAI GX,LIU BY,LAI DY,et al.Effects of neural stem cellstransplantation on nervous function after focal cerebral ischemia in rat[J].China Journal of Modern Medicine,2007,17(24):2971-2973.Chinese
[2]严稽文,黄其林.星形胶质细胞条件培养液对缺氧损伤神经元的保护作用[J].神经解剖学杂志,2007,23(3):277-282.[2]YAN JW,HUANG QL.The protective effect of astrocyte-condi-tioned medium on anoxia damaged neurons[J].Chinese Journal of Neuroanatomy,2007,23(3):277-282.Chinese
[3]ALVAREZ-BUYLLA A,GARCIA-VERDUGO JM.Neurogenesis in adult subventricular zone[J].J Neurosci,2002,22(3):629-634.
[4]PANCHISION DM,PICKEL JM,STUDER L,et al.Sequential actions of BMP receptors control neural precursor cell production and fate[J].Genes DEV,2001,15(16):2094-2110.
[5]MING JE,ELKAN M,TANG K,et al.Type I bone morpho-genetic protein receptors are expressed on cerebellar granular neurons and a constitutively active form of the type IA receptor induces cerebellar abnormalities[J].Neuroscience,2002,114(4):849-857.
[6]MEHLER MF,MABIE PC,ZHU G,et al.Developmental changes in progenitor cell responsiveness to bone morphogenetic proteins differentially modulate progressive CNS lineage fate[J].Dev Neurosci,2000,22(1-2):74-85.
[7]SONG H,STEVENS CF,GAGE FH.Astroglia induce neurogen-esis from adult neural stem cells[J].Nature,2002,417(6884):39-44.
[8]NAKAYAMA T,MOMOKI-SOGA T,INOUE N.Astrocyte-de-rived factors instruct differentiation of embryonic stem cells into neurons[J].Neurosci Res,2003,46(2):241-249.
[9]ZWIJSEN A,VERSCHUEREN K,HUYLEBROECK D.New in-tracellular components of bone morphogenetic protein/Smad sig-naling cascades[J].FEBS Lett,2003,546(1):113-139.
[10]POZAS E,IBANEZ CF.GDNF and GFRalpha1promote differ-entiation and tangential migration of cortical GABAergic neurons[J].Neuron,2005,45(5):701-713.
[11]STULL ND,JUNQ JW,IACOVITTI L.Induction of a dopamin-ergic phenotype in cultured striatal neurons by bone morpho-genetic proteins[J].Brain Res Dev Brain Res,2001,130(1):91-98.
神经前体细胞 篇3
是具有高度自我更新能力并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经前体细胞, 能自我更新并能提供足够数量的神经细胞以供机体功能所需[1]。
自从1992年Reynolds和Weiss以及Ricbards 等先后从成年小鼠的纹状体和海马中分离出NSCs后, 彻底颠覆了以往认为成年哺乳动物C N S不再具有自我更新潜能的传统观念。NSCs移植为CNS损伤和神经退行性疾病的治疗提供了新的方向。因此, 对NSCs增殖和分化调控的研究显得尤其重要。
在对人胚胎期N S C s的研究中, 已先后从大脑皮质、海马、纹状体、嗅球、侧脑室、室管膜下层、小脑和脊髓等区域分离出NSCs[2]。成体哺乳动物脑内存在2个NSCs聚集区:位于侧脑室壁的室下区 (subven tricu lar zone, SVZ) 和海马齿状回的颗粒下层 (subgranular zone, SGZ) 。
2 神经营养素家族 (N G F家族)
包括:神经生长因子 (N G F) 、脑源性神经生长因子 (BDNF) 、神经营养素-3 (N T-3) 、神经营养素-4/5 (N T-4/5) 以及神经营养素-6 (N T-6) 。它们各自通过高亲和力受体酪氨酸激酶 (T r k-A、T r k-B和T r k-C) 和低亲和力受体g p 7 5起作用。其中, T r k-A优先结合N G F, Trk-B优先结合B D N F和N T-4/5, Trk C优先结合NT-3;而gp75能结合上述所有5种神经营养因子而发挥生物学效应。
2.1 神经生长因子 (NGF)
2.1.1 1NGF的特性和分布
NGF来源于中枢神经系统及外周神经系统的神经元、神经胶质细胞, 作为靶源性逆向营养因子而发挥作用。
2.1.2 NGF对NSCs分化的作用
有学者利用新生SD大鼠的脑组织进行单细胞悬液制备和原代培养, 经过分化培养后均能产生神经元特异烯醇化酶与胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞[3]。而在无血清的系统中, 利用单细胞克隆技术对小鼠胚胎纹状体组织进行分离和培养发现, NGF的干预可以诱导并增加神经前体细胞表达神经元标志物神经丝蛋白 (neurofialm ent protein, NF) 和星形胶质细胞标志物:胶质纤维酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein, GFAP) , 但没有少突角质细胞标志物 (oligodendrocyte marker) 。以上结果表明, NGF可促进体外培养的神经元前体细胞分化为成熟的神经元和成熟神经胶质细胞[4]。
还有研究表明, 对于利用无血清培养技术从胚鼠脑内获得的NSCs, 加入不同剂量的NGF后, 观察胆碱乙酰转移酶 (cholineacetyltransferase, CHAT) 阳性细胞分化的情况, 证实NGF还具有诱导NSCs向胆碱能神经元分化的作用[5]。而在体内, NGF亦可诱导NSCs向胆碱能神经元分化, 有学者给基底前脑胆碱能神经元受损的大鼠侧脑室注射EGF和b-FGF 14d后, 再改用NGF注射14d, 发现海马等处有较多的NSCs被诱导分化为胆碱能神经元[6]。
但NGF不能使人类中枢神经系统干细胞子代分化为神经元的细胞数量增加, 这与T r k-A在人类间脑干细胞的微弱表达是一致的, 表明N G F在人类间脑系统中对神经元分化没有起到积极的作用[7]。
2.2 脑源性神经生长因子 (BDNF)
2.2.1 BDNF的特性和分布
BDNF是一种具有防止神经元死亡功能的蛋白质。BDNF-mRNA广泛地存在于中枢神经系统和外周组织内。在中枢, 其广泛分布在大部分脑区, 上丘、大脑皮层和海马。在外周, 主要在肌肉组织中高表达, 而在心脏和肺组织中表达水平较低[8]。
2.2.2 BDNF对NSCs分化的作用
BDNF在体外可保持NSCs的活行和促进其向神经元分化。有研究表明, 应用出生2~3d大鼠脑皮质的神经干细胞, 通过免疫荧光技术分别观察BDNF组和对照组中β-tubulin阳性神经元数目, 结果发现BDNF组的阳性细胞数目明显多于对照组, 神经元的突起明显较对照组长[9]。且Wachs等研究认为, 当BDNF浓度为200ug/L时, 神经干细胞分化为神经元的比例最高[10、11]。
Vicario、Abejon等将中海马中分离细胞先培养在b-F G F中1 3-1 8 d, 再移B D N F中并检测神经元标志物微管相关蛋白-2 (microtublule associated protein-2, MAP-2) 、钙结合蛋白和突触蛋白, 发现M A P-2阳性细胞的数量增加2倍, 钙结合蛋白阳性细胞的数目增加3倍[12]。
Shimazaki 等亦发现, 只要将神经前体细胞暴露在BDNF中2h即可诱导完全的神经元分化, β-微管蛋白阳性细胞数目明显增多, 表明B D N F能促使有丝分裂后神经前体细胞向神经元样表型终末细胞分化[13]。体内实验亦获得了相同的结果, 将B D N F注入侧脑室, 不仅在注入侧的S V Z, 而且在沿侧脑室和第三脑室排列的特殊皮质结构, 如纹状体、下丘脑和海马中, 发现5-溴脱氧尿核苷 (5-bromod-eoxyuridine, 5-Brd U) 阳性细胞数目明显增多, 还能增加对吻侧迁移流和嗅球中新生神经元的数量, 表达神经元特异性标志物MAP-2和微管蛋白[14]。
2.3 神经营养素-3 (N T-3)
2.3.1 N T-3的特性和分布
NT-3是一种小分子量的碱性蛋白质, 与NGF和BDNF具有相似的一级结构。主要分布于海马、脑、脊神经节、脑干和脊髓等。
2.3.2 NT-3对NSCs分化的作用
体外研究表明, N T-3对交感神经元、感觉神经元、大脑皮层的上运动神经元、脊髓前角运动神经元以及大脑基底部的乙酰胆碱能神经元等均有维持存活的生物学作用。在体内, N T-3可以诱导神经干细胞分化, 调节其他神经营养因子的功能。
2.4 NT-4/5与NSCs分化的关系
神经营养素4/5 (neurotrophin-4/5, N T-4/5) 在中枢和外周分布很广, 对运动神经元、基底前脑的胆碱能神经元, 以及海马、下丘脑、延髓等处的神经元的生长、分化具有促进作用[15]。
3 NSCs的应用前景
3.1 细胞移植治疗
细胞移植技术用修复脑组织就是在体外培养和扩增NSCs或诱导其分化为定向祖细胞, 再移植到脑内, 以替代因疾病而丢失或缺损的神经细胞。应用于临床疾病如帕金森病 (parkinsonism disease, PD) , 亨廷顿病 (Huntington disease, HD) 以及阿尔茨海默病 (a1zheimer's disease, AD) 等[16]。
3.2 基因或药物治疗载体
动物实验表明, 经过基因修饰而携带有外源基因的NSCs移植到脑内后能迁移并整合于病变部位, 长时间表达外源基因产物。另外, 由于NSCs具有固有的迁移特性, 可用于中枢神经系统的肿瘤治疗。
4 问题及展望
对于NSCs的研究目前还处于起步阶段, 但随着分子生物学和细胞生物学技术的不断发展, 经过科学工作者几十年的努力研究, 在NSCs增殖分化的机制及应用等发面已经取得了初步成果, 但仍有一些问题尚待解决:
(1) 如何能够实现对NSCs准确的人工增殖和分化调控;
(2) 如何在脑损伤后创造内源性NSCs增殖和分化的内部条件;
(3) NSCs抑制后是否有肿瘤产生的可能等将影响NSCs增殖分化的影响因素彻底研究清楚后, NSCs必将会有一个广阔的应用前景。
摘要：神经干细胞 (NSCs) 是具有高度自我更新能力并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经前体细胞, 具有广阔的临床应用前景。神经营养素家族对神经干细胞的分化有一定影响。其包括:神经生长因子 (NGF) 、脑源性神经生长因子 (BDNF) 、神经营养素-3 (NT-3) 、神经营养素-4/5 (NT-4/5) 以及神经营养素-6 (NT-6) 。本文就目前神经营养素家族对NSCs分化的影响的研究现状进行综述。
神经前体细胞 篇4
1 材料与方法
1.1 实验动物
SD雄性大鼠购买自内蒙古医科大学实验动物中心, 共83只, 其中3只 (出生3 d内) 用于神经干细胞及嗅鞘细胞的培养取材。余80只大鼠用于实验。
1.2 主要试剂与仪器
试剂:DMEM/F12细胞培养液、B27、碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF) 、表皮生长因子 (EGF) 、兔抗鼠巢蛋白 (Nestin) 单抗、兔抗鼠P75单抗、兔抗鼠NT-3单抗、异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记羊抗兔二抗、NT-3染色SP试剂盒等;仪器:5%CO2培养箱、倒置荧光显微镜、垂直流洁净工作台、电热恒温水浴锅、玻璃细胞培养瓶等。
1.3 实验方法
1.3.1 细胞培养及鉴定
(1) 神经干细胞 (NSCs) 的培养及鉴定:新生 (出生3 d内) SD大鼠消毒后, 引颈法处死。无菌条件下, 充分暴露出嗅球、两侧大脑半球及小脑。外科显微镊剪断与海马有联系的大脑皮质或神经组织, 仔细剥离海马。垂直流洁净工作台内, 无菌条件下将海马表面的软脑膜剔除干净, 4℃生理盐水内清洗3次后, 将海马放入DMEM/F12细胞培养液中, 显微镜下用显微外科剪将其剪碎, 巴氏吸管先反复轻柔机械吹打分离, 不锈钢细胞滤网过滤后离心沉淀, 最后将沉淀加入含b FGF、EGF和B27的DMEM/F12细胞培养液内, 细胞培养瓶中悬浮培养, 置37℃、5%CO2培养箱中培养。3~4 d换液1次, 每次换50%培养液。传代一次约需5~7 d。第二代细胞用特异性Nestin抗原免疫荧光染色法鉴定NSCs。最后将细胞浓度调整为1×109/L, 备用。 (2) 嗅鞘细胞 (OECs) 的培养及鉴定:同样方法, 无菌条件下取大鼠两侧嗅球后培养OECs。3 d全部换液1次。传代1次约需16 d。第二代细胞用P75受体单抗免疫荧光染色法鉴定OECs。最后将细胞浓度调整为1×109个/L, 备用。
1.3.2 实验动物分组
SD雄性大鼠 (体重200~300 g) 80只, 按随机数字表法分为对照组 (假手术组) 15只、实验1组 (NSCs移植组) 20只、实验2组 (OECs移植组) 20只和实验3组 (OECs+NSCs联合移植组) 20只, 剩余5只大鼠备用。分组完成后将大鼠做好标记。
1.3.3大鼠急性脊髓损伤Allen’s模型的制备及术后一般情况和处理 (1) 模型制备:
腹腔注射麻醉大鼠起效后, 手术区备皮, 将大鼠俯卧固定于手术台上, 消毒、铺巾, 背部正中切口, 钝性剥离椎旁肌, 缝线牵拉开, 显露T10~12棘突、横突及椎板。切除T10棘突及椎板下部、T12棘突及椎板上部和全部T11棘突及椎板, 形成方形骨窗, 充分暴露相应脊髓节段 (T11) 的硬脊膜及椎管, 作为打击损伤区域。自制的改良Allen’s撞击器15 g自6 cm高度自由落下, 对T11段脊髓造成损伤, 制成急性脊髓损伤动物实验模型[3]。打击完成后, 4℃生理盐水冲洗2次, 依次逐层常规缝合切口。 (2) 术后一般情况和处理:术后大鼠禁食水数小时, 以后逐渐增加进食水量至正常。7 d内先单独饲养, 7 d后5只合笼饲养。术后7 d内青霉素2×105U肌注2次, 预防伤口、肺部感染, 每日饲喂呋喃坦啶水以预防泌尿系感染。大鼠术后出现尿潴留, 在其恢复之前, 每日应给予按摩膀胱协助排尿3次。
1.3.4 局部注射法行细胞移植
进行细胞移植之前, 先将部分NSCs与OECs混合, 用于实验3组的联合细胞移植。各组细胞移植均在急性脊髓损伤动物实验模型制作完成24 h以内进行。操作方法:造模成功以后, 4℃生理盐水冲洗后, 外科显微镊轻柔提起T11处硬脊膜, 1 m L无菌注射器针头在硬脊膜上刺一小洞, 垂直进针, 缓慢向该处硬脊膜下约3 mm、脊髓损伤方向插入, 缓慢注入细胞悬液0.1 m L (细胞数约为1×105个) 。关闭切口前, 小块可吸收明胶海绵微加压填塞于硬脊膜进针点处, 防止细胞移植液及大鼠脑脊液的渗漏。对照组生理盐水代替细胞移植液, 作阴性对照, 余操作步骤与实验组相同。
1.4 功能检测
1.4.1 行为学评价
术前和术后1、3、5、7、14、21 d和28 d, 随机抽取实验组15只大鼠及全部对照组大鼠, 采用BBB评分法、改良的Tralov评分法和斜板实验, 对大鼠后肢运动功能状况进行双盲法评分, 与手术之前相比较, 以了解受损脊髓功能恢复情况。
1.4.2 神经电生理检测
运动诱发电位 (MEP N1波) 的检测, 观察外周运动神经 (坐骨神经) 的功能状态。检测方法:大鼠麻醉起效后, 环形切开头后部皮肤, 剥离至骨膜, 细纹螺钉钻孔, 孔的大小以刚好将刺激电极放入为宜。根据MEP的产生原理, 刺激电极置于皮层, 记录电极置于后肢大腿后侧坐骨神经处, 参考电极置于硬腭下。刺激类型是:单脉冲粗电压, 强度3 V, 波宽1 ms、频率10 Hz, 滤波3000 Hz, 增益20倍, 时间常数0.01 s, 次数100次。检测完毕后缝合切口。
1.5大鼠灌注、取材、固定与免疫组织化学染色
各组随机抽取1只大鼠进行灌注、取材与固定, 免疫组织化学染色的方法测定NT-3标记阳性细胞指数, 检测NT-3在局部受损脊髓组织中的表达情况。操作方法:腹腔麻醉起效后, 开胸后经左心室主动脉插管, 剪开右心耳, 先快速灌注冰盐水, 清亮液体流出后, 再用多聚甲醛经心灌注、固定动物, 速度先快后慢。切取T10~T12脊髓节段上下各约1 mm脊髓节段, 立即放入中性福尔马林溶液内后固定, 再入蔗糖溶液内脱水, 置4℃下至沉底, 常规石蜡包埋, 切片机连续切片, 厚度为10 um。免疫组织化学染色按NT-3染色SP试剂盒操作说明进行 (操作步骤详见说明书) 。NT-3染色阳性的标志是细胞浆或细胞膜呈棕黄色。选取15张最优切片, 每张切片在10倍光镜下分别计数4个视野内染色阳性细胞, 测定各组染色阳性细胞在总计数细胞中所占比例 (即阳性细胞指数) , 重复5次, 求平均值。
1.6 统计学处理
采用SPSS 11.5统计学软件对数据进行处理, 计量资料以 (±s) 表示, 两两比较采用t检验, 不同时间点比较采用单因素方差分析 (ANOVA) , 以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后BBB评分变化
对照组及各实验组大鼠术后24 h内BBB评分均为0分, 随着实验的进行, 各组均表现出不同程度的恢复情况。其中实验组恢复速度及程度大于对照组 (P<0.05) ;1周后各组各时间点比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , 且有增大趋势;各实验组两两比较差异均有统计学意义 (P<0.05) 。见表1、图1。
2.2 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后改良的Tralov评分变化
所有大鼠模型制备完成后及术后任一检测时间点, Tralov评分均显著低于术前。随着实验的进行, 各组大鼠均表现出不同程度的恢复情况。与BBB评分的统计分析结果相似, 实验组Tralov评分均显著高于同一检测时间点的对照组 (P<0.05) ;1周后, 各组各时间点比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , 各实验组两两比较差异均有统计学意义 (P<0.05) 见表2、图2。
*与对照组比较, P<0.05;△与实验1组比较, P<0.05;#与实验2组比较, P<0.05
*与对照组比较, P<0.05;△与实验1组比较, P<0.05;#与实验2组比较, P<0.05
2.3 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后斜板实验角度变化
造模及细胞移植术后, 大鼠斜板实验角度大幅下降, 术后1 d由 (82.00±3.45) °降为 (12.73±1.34) °, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。随着实验的进行, 各实验组大鼠斜板实验角度逐渐增加, 以术后第7天增加非常明显。实验组与对照组术后1周以内大鼠斜板实验角度比较差异无统计学意义 (P>0.05) ;1周后, 实验组与对照组比较差异均有统计学意义 (P<0.05) ;各组各时间点比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 各实验组两两比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表3、图3。
2.4 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后MEP (N1波) 潜伏期变化
造模及细胞移植术后, 各组MEP (N1波) 潜伏期明显延长, 但各实验组N1波潜伏期短于对照组 (P<0.05) 。随着实验的进行, 实验组及对照组潜伏期均逐渐缩短, 但各实验组潜伏期缩短幅度大于对照组 (P<0.05) 。实验组间比较:3 d后, 各组各时间点比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , 各实验组两两比较差异均有统计学意义 (P<0.05) 。见表4、图4。
*与对照组比较, P<0.05;△与实验1组比较, P<0.05;#与实验2组比较, P<0.05
*与对照组比较, P<0.05;△与实验1组比较, P<0.05;#与实验2组比较, P<0.05
2.5 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后NT-3染色表达阳性的细胞数变化
造模及细胞移植术后, 各组大鼠受损脊髓组织中NT-3均有明显增高, 其中术后第3天达到高峰, 7 d内NT-3的表达维持在较高的水平, 此后逐步减少。自术后第5天 (包含5 d) 开始, 各实验组与对照组比较NT-3增高显著, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;各组各时间点比较差异均有统计学意义 (P<0.05) , 各实验组两两比较差异均有统计学意义 (P<0.05) 。见表5、图5。
*与对照组比较, P<0.05;△与实验1组比较, P<0.05;#与实验2组比较, P<0.05
3 讨论
治疗急性脊髓损伤必须要明确其受损机制, 从而针对其中的关键环节做出行之有效干预治疗措施。急性脊髓损伤的具体机制虽尚未被完全阐明, 但医学工作者的认识逐渐趋于统一, 认为脊髓损伤包括原发性损伤和继发性损伤[4]。基于这一认识, 目前急性脊髓损伤动物实验模型基础研究中所实验的新方法新技术和临床上治疗脊髓损伤的各种常用措施, 就是要及早正确的干预、减轻和预防可逆性的继发性损伤, 但取得的治疗效果却不甚理想。上世纪90年代初, Reynold等[5]在鼠纹状体中发现了具有多向分化潜能、不断进行分裂的细胞群, 后来Mckay将之命名为神经干细胞 (NSCs) 。他们的发现颠覆了人们以往认为成年中枢神经系统神经元不能够再生的认知, 为治疗脊髓损伤提供了新的治疗思路—细胞移植。自此, 各种细胞被尝试用来治疗神经系统损伤和脊髓损伤。在这些尝试中, 最成功的例子就是神经干细胞移植治疗帕金森病、癫痫、中风等神经系统疾病[6,7,8,9]。但急性脊髓损伤的机制更加错综复杂, 细胞移植虽然在基础实验研究及动物实验等方面取得了重大进展与突破, 但国内外人体临床试验尚未大规模开展, 这仍有待于研究者的进一步地探索研究。
神经干细胞 (NSCs) 是一类特定的干细胞, 它可以通过非对称分裂的方式分化成为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等。此外, 还可自分泌神经生长因子 (NGF) 、神经营养因子 (NTF) 等物质。自其被发现伊始, 神经干细胞就被医学工作者用来自体移植治疗神经系统损伤, 这样不仅可以避免免疫排斥反应的发生, 同时又解决了移植细胞的来源问题, 取得了满意的临床疗效, 可作为急性脊髓损伤治疗的重要参照[10]。
嗅鞘细胞 (OECs) 是目前所发现的极少数中枢神经系统内可以再生的细胞之一, 被认为是髓鞘化能力最强的胶质细胞, 其特点是具备终生再生分裂的能力, 它不仅能存活于中枢神经系统当中, 而且又可以促进外周神经元细胞轴突的生长。Sasaki等[11]研究就发现, 嗅鞘细胞移植后能够突出脊髓受损区达8 mm, 除了仍可保持再生分裂的能力外, 还可使已经脱髓鞘的神经元轴突重新髓鞘化。此外, 与NSCs相似, 嗅鞘细胞也能分泌多种神经营养因子, 这些可能都对神经元轴突的生长起着重要的促进作用[12]。
本实验中, 采用单种细胞或两种细胞联合移植治疗大鼠急性脊髓损伤, 将能够分泌NT-3的神经干细胞及嗅鞘细胞分别、共同移植于脊髓受损区, 以期可持续分泌NT-3, 这样就可避免外源性神经营养因子半衰期短和持续性作用差的弊端, 等同于NT-3、神经干细胞及嗅鞘细胞共同修复受损的脊髓, 改善大鼠急性脊髓损伤后运动功能的恢复[13]。实验中笔者观察到, 造模及细胞移植术后, 24 h内各组大鼠BBB评分及改良的Tralov评分均为0分, 斜板实验角度下降非常明显, 由实验前的 (82±3.45) °降为 (12.73±1.34) °, 各组MEP (N1波) 潜伏期明显延长。随着实验的进行, 各组均表现出不同程度的恢复情况, 各实验组BBB评分及改良的Tralov评分与对照组相比增高显著 (P<0.05) ;斜板实验角度也逐渐增加, 实验组增幅要大于对照组, 以术后第7天增加非常明显;各组MEP (N1波) 潜伏期均逐渐缩短, 且各实验组潜伏期缩短幅度大于对照组 (P<0.05) , 说明大鼠急性脊髓损伤后有一定的自我恢复作用, 细胞移植能够对受损脊髓产生修复治疗效应, 促进大鼠双后肢运动动能恢复。实验3组BBB评分和改良的Tralov评分在各实验组中增高最显著, 实验2组次之, 实验1组最弱, 表明细胞移植虽能促进大鼠伤后后肢运动动能的恢复, 但单种细胞移植或两种细胞联合移植后取得的治疗效果不甚相同。笔者还观察到, 急性脊髓损伤后NT-3表达量迅速增高, 术后第3天达到最高峰, 7 d内其浓度维持在一个较高的水平, 此后表达明显变弱, 趋于平缓。这说明, 大鼠急性脊髓损伤后机体本身NT-3合成增加, 推测NT-3可能在急性脊髓损伤的早期修复中发挥着重要作用。实验3组和实验2组与实验1组相比促进作用更显著 (P<0.05) , 实验3组与实验2组比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。这说明, OECs+NSCs联合移植促进NT-3分泌的作用最优, OECs移植次之, NSCs移植最弱。这与以上实验结果相一致。
神经前体细胞 篇5
急性脊髓损伤动物实验中新方法和临床中治疗措施是层出不穷,细胞移植是一非常有前途的修复策略。本实验对大鼠急性损伤脊髓局部注入神经干细胞,嗅鞘细胞,神经干细胞+嗅鞘细胞,通过BBB评分、斜板实验、运动诱发电位(MEP)及免疫组化检测BDNF表达情况,来评判各组受损脊髓恢复情况,比较两种细胞各自、联合对急性脊髓损伤修复的能力,以期可作为临床治疗的实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
SD大鼠88只,成年SD大鼠85只(80只实验,5只备用);另3只(出生3 d)SD大鼠为神经干细胞和嗅鞘细胞取材。随机分组(每组20只):对照组(假手术组)、NSCs移植组、OECs移植组、NSCs+OECs联合移植组(分别记为实验A、B、C组)。
1.2 试剂与仪器
兔抗鼠巢蛋白(Nestin)单抗、兔抗鼠P75单抗、异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗兔二抗、兔抗大鼠BDNF多克隆抗体、免疫组化SABC试剂盒、生物素标记羊抗兔Ig G二抗等试剂、IX71型倒置荧光显微镜、Thermo3110型5%CO2培养箱、TGL-16B型普通台式离心机等。
1.3 实验方法
1.3.1 新生SD大鼠海马和嗅球的取材
将(出生3 d)SD大鼠消毒后,引颈脱位法处死,无菌操作显露两大脑半球、嗅球和小脑。完全剥离海马,分离嗅球保持两侧嗅鞘完整。去除表面毛细血管等软组织,4℃下分别清洗后备用。
1.3.2 细胞培养及鉴定
1.3.2. 1 嗅鞘细胞的培养及鉴定
将嗅球入DMEM/F12培养液,剪碎吹打分离,细胞筛网过滤后离心沉淀,沉淀入DMEM/F12细胞培养液(按比例配入b FGF、EGF和B27),至培养箱(37℃、5%CO2)。每3天全换一次培养液,16 d传代1次。第二代细胞悬液入凹玻片,培养、弃液,PBS漂洗,固定,依步骤进行至滴兔抗鼠P75一抗(1∶200),PBS漂洗3次,滴羊抗兔二抗(1∶400),孵育封片。倒置荧光显微镜下观察。
1.3.2. 2 神经干细胞的培养及鉴定
将海马同法制备,每2~4天换半量培养液,传代1次约6~8 d。鉴定同样,兔抗鼠Nestin为一抗(1∶100),羊抗兔二抗(1∶200)。封片观察。
1.3.3 大鼠急性脊髓损伤Allen’s模型的制备及局部注射细胞移植
将大鼠麻醉见效,俯卧固定,术区备皮消毒,脊正中切口(约3 cm),显露T10~12棘突及椎板。定位切除T12棘突及椎板上半部分,T11全椎板和棘突,T10棘突及椎板下半部分[2],显露T11相应脊髓节段的硬脊膜,定为损伤区。自制改良Allen’s撞击器重物15 g高度6 cm自由落下,瞬间下落能量对T11段脊髓致伤即制为大鼠急性脊髓损伤实验模型[3],打击后重物停3 min,硬脊膜静脉充血增粗,局部紫红色,鼠尾痉挛摆动,后肢回缩抽动,即打击有效。造模后即行细胞移植(生理盐水植入对照组、NSCs植入实验A组、OECs植入实验B组、NSCs与OECs混合1∶1植入实验C组):用1 m L无菌注射器慢注入0.1 m L细胞悬液(数量约为1×105个)。逐层关闭伤口。术后禁食水数小时。
1.3.4功能检测在术后1、3、7、14 d和21 d,随机抽取对照组、实验组各15只大鼠,进行BBB评分,评分基本内容:双后肢可活动的关节数量、活动范围、步态、负重、前后肢协调性及尾部活动情况,共22个分数级别;斜板实验[4],实验时将大鼠头朝前,身体躯干与斜板平行,角度渐大,大鼠在板上停留5 s且不滑落,记录角度,测3次取平均值。两检测法对大鼠后肢运动功能进行双盲法评分来了解受损脊髓功能恢复情况;再行神经电生理运动诱发电位(motor evoked potentials,MEP)潜伏期检测,刺激电极穿骨膜置于皮层,记录电极置于暴露的坐骨神经,参考电极位于大鼠硬腭下。观察脊髓传导或外周运动神经功能状况。
1.3.5 大鼠灌注、取材、固定与免疫组化
每组随机抽一只大鼠麻醉开胸,用静脉针头经左心室入主动脉,待冰盐水从右心耳流出后灌注4%多聚甲醛。切取T10~12对应脊髓节段(损伤处为中心约1 cm),入10%福尔马林固定,脱水沉底后石蜡包埋,厚度10μm连续切片。按SABC试剂盒操作说明进行。按步骤进行,其中按步滴入一抗兔抗鼠BDNF多克隆抗体(1∶200)、生物素化标记的二抗羊抗兔Ig G。封片选最优切片15张。10倍光镜下分别计数4个视野内BDNF染色阳性细胞占总计数细胞比例,即为阳性细胞标记指数,染色阳性标志是细胞浆或细胞膜呈明显棕黄色。即检测BDNF在受损脊髓中表达情况。
1.4 统计学处理
实验结果采用SPSS 17.0软件处理,计量资料以(±s)表示,比较采用单因素方差分析(ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后BBB评分变化
除第1天外,各实验组恢复程度均明显大于对照组(P<0.05),第7天开始各实验组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1、图1。
2.2 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后斜板实验角度变化
第1周开始,四组中任意两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2、图2。
2.3 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植MEP(N1波)潜伏期变化
自第3天,四组中任意两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3、图3。
2.4 SD大鼠急性脊髓损伤细胞移植后BDNF染色表达阳性的细胞数变化
细胞移植后,各组大鼠受损脊髓中BDNF开始升高,第3天到高峰后减少。术后第3天开始,四组中任意两组比较均有统计学意义(P<0.05)。见表4、图4。
*与对照组比较,P<0.05;△与实验A组比较,P<0.05;#与实验B组比较,P<0.05
3 讨论
3.1 造模方法及脊髓损伤治疗方法的选择
实验中改良Allen’s重物打击挫伤法,不仅减小重物致伤力量延长挤压时间,还有稳定、简便、可重复性等优势,且实验中对脊髓阶段(T11)制损并未发生硬脊膜破损及脑脊液外渗等现象,与临床急性脊髓损伤更为相近,更贴切体现治疗方法及疗效对比。细胞移植在临床中对ASCI治疗国外已有报道,国内学者将嗅鞘细胞移植治疗SCI处于临床试验,效果颇为满意,有望推广。NSCs有多向性分化能力,OECs可调节受损脊髓局部微环境。将NSCs和OECs分别、联合移植到急性受损脊髓中发挥各自特性,观察比较效果,来体现对受损脊髓功能恢复的强弱。
3.2 各项实验结果分析
3.2.1 BBB评分和斜板实验结果分析
BBB评分法侧重双后肢运动的各行为细节,如关节、脚趾、尾部等,斜板实验注重双后肢肌力情况,两评法从不同角度分析对比,各有侧重又有弥补,评价更加客观。
实验中各组大鼠造模前BBB评分均21分,造模细胞移植后24 h全是0分,随实验进行有不同程度恢复,各实验组比对照组明显增高(P<0.05),说明细胞移植对急性脊髓损伤有修复作用,且大于脊髓损伤后自身恢复作用。NSCs+OECs组比OECs组、NSCs组的增高差异都有统计学意义(P<0.05),也说明NSCs+OECs联合移植对急性脊髓损伤后运动功能发挥最大恢复作用。这与损伤早期进行联合移植会有较好效果的研究假设相符合。
造模前,各组大鼠斜板实验平均角度(81.50±2.33)°,造模细胞移植后,第1天斜板实验角度降至(12.71±1.19)°,降低幅度之大与脊髓损伤导致后肢肌力减退呈直接关系,说明急性脊髓损伤造模成功。随实验进行各组斜板实验角度都回复增大,第7天开始实验组比对照组增大幅度更明显(P<0.05),NSCs+OECs组比OECs组、NSCs组增大幅度有统计学意义(P<0.05),OECs组次之,NSCs组最弱,再次证实单种或多种细胞移植对损伤脊髓均有不同程度修复且急性脊髓损伤后有一定自身恢复性。
3.2.2 运动诱发电位(MEP)检测结果分析
采用MEP(N1波)潜伏期为检测标准,反复刺激取平均值。造模细胞移植后各组大鼠MEP(N1波)潜伏期明显延长,对照组潜伏期延长幅度比三实验组都大,第3天开始三实验组缩短幅度大于对照组缩短幅度(P<0.05),说明细胞移植促进受损脊髓的运动传导功能,NSCs+OECs组缩短幅度比OECs组、NSCs组都大(P<0.05),OECs组次之,NSCs组最差,与BBB评分和斜板实验结果趋于一致。表明大鼠急性脊髓损伤后有些许修复作用,细胞移植促进修复效果应是由NSCs、OECs对轴突再生的促进,再髓鞘化及延长,建立新突触连接有助于传导束功能恢复。
3.2.3 BDNF染色表达阳性细胞数结果分析
实验观察发现,急性脊髓损伤后BDNF表达明显增大,术后第3天到高峰,后下降,说明大鼠脊髓受损早期会自我保护性的提高BDNF分泌,那么BDNF很可能参与损伤早期有限的恢复过程。三实验组BDNF表达量比对照组的增多部分,在第3、7、14、21天比较差异均有统计意义(P<0.05)。无论BDNF上升或下降,三实验组与对照组的变化趋势相一致基础上且表达要高,说明细胞移植对BDNF表达有明显促进。OECs+NSCs组与OECs组、NSCs组相比增大很明显(P<0.05),说明OECs+NSCs组产生BDNF最多,除OECs+NSCs分泌BDNF外脊髓损伤后自身也分泌,OECs组比NSCs组所表达BDNF要多(P<0.05),实验组中NSCs组表达BDNF最弱,OECs组较强,OECs+NSCs组最强。
OECs、NSCs移植可提高BDNF表达,且BDNF参与ASCI修复过程,作用机制可能降低继发性损伤的炎症反应,与神经生长抑制因子进行对抗及竞争,在ASCI中对受损神经元起改善和修复的生物效应及抗损伤性的保护作用,促进轴突塑造,引导干细胞分裂方向,减少自由基代谢及堆积,以调控到满足神经元再生所需微环境,促进脊髓损伤后功能恢复。
3.3 NSCs与OECs移植修复ASCI
神经前体细胞 篇6
组织工程神经支架是替代自体神经移植的一种有前途的产物,通过外科手术将其植入神经断端之间,促进神经再生。神经支架可成功连接短距离周围神经损伤已被许多学者认可,但是缺乏雪旺细胞( Schwann cells,SC) 或内部支架支撑的神经支架无法有效地修复长距离的周围神经缺损[1]。作者对近年来雪旺细胞与组织工程神经支架用于周围神经再生的相关研究进展作一综述。
1SC的功能特点
SC是周围神经系统中主要的神经胶质细胞,也是第一个且最广泛用于组织工程神经支架移植的细胞, 在PNI中,SC对神经元的生存和功能、神经纤维的再生和神经传导功能的恢复起着不可或缺的作用。
在PNI的应答中,SC的表型迅速发生变化为轴突再生提供了一个通道,这是神经再生的关键。SC还能产生各种高水平的生长因子,如神经生长因子、脑源性神经营养因子、胰岛素样生长因子、神经胶质源性生长因子等。另外,SC还具有吞噬作用,参与初步清理髓鞘碎片。在SC被植入PNI损伤的位点后,用遗传标记技术可追踪到其积极地参与了神经再生[2]。
2SC的来源
2.1同种异体SC
在20世纪80年代,同种异体SC首次被用于支持细胞用于PNI的修复。因为SC移植后会产生排斥反应,所以必须同时应用免疫抑制药物。
2.2同源性SC
由于免疫排斥反应的存在,使用同源性SC似乎是一个更好的选择。Tohill等就同种异体SC和同源性SC对修复大鼠间距为10 mm的坐骨神经损伤的效果进行比较,结果表明,在移植的第6周,同种异体SC被宿主所排斥,而同源性SC仍被认同; 同种异体SC和同源性SC增加轴突再生的距离是一样的,但同源性SC轴突再生的数量更多一些[3]。
2.3自体SC
自20世纪90年代以来,自体SC已经开始尝试作为支持细胞使用。接种有自体SC的神经支架已被证明可以有效地修复大鼠正中神经的缺口,实现和自体神经移植一样的结果[4]。
2. 4 SC 系
因为初代SC的分离和培养是一个耗时的过程, 永生化的雪旺细胞系已被纳入研究人员的实验考虑中。据报道,SC TM41细胞系近似于初代雪旺细胞。 然而,与含有初代SC的移植物相比,含有SC系TM41的移植物轴突再生显著减少。即使脑源性神经营养因子转导的TM41细胞系神经再生反应比亲代的TM41细胞系更强,但还是达不到和初代SC相同的程度[5]。
3各种神经支架材料的研究现状
3.1同种异体或异种组织类
除了自体神经移植,自体非神经组织( 如肌肉、血管、肌腱和神经外鞘等) 的移植一直被尝试作为神经支架来连接周围神经间距,虽然已显示出成功的修复[6], 但是存在来源不足和宿主排斥的问题。Alberti等将脱细胞的牛肌腱与SC结合,体外联合背根神经元共培养证明其可以促进神经再生[7]。
3.2天然生物聚合物类
3. 2. 1胶原和其他细胞基质成分大多数细胞在多细胞生物中都是由复杂而混合的无生命材料包裹,这些无生命材料称为细胞外基质( extracellular matrix, ECM) ,包括胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白等,在轴突再生中起到重要的作用。
例如,由猪Ⅰ型胶原蛋白溶液形成的、晶体定向控制的、具有导向作用的多孔支架,经实验证明再生的神经通过直径在20 ~ 120 mm、纵向紧密包装的管道,可延长至整个支架的长度[8]。
3. 2. 2甲壳素、壳聚糖等天然多糖类甲壳素是继纤维素之后,在自然界发现的第二大富产的多糖,它可以从甲壳类动物的外壳、昆虫的外骨骼及真菌的细胞壁中提取出来。壳聚糖和甲壳素一样,作为生物材料具有良好的生物特性,且更容易处理。它们已经被越来越多地应用于神经组织工程之中[9]。
3. 2. 3丝素蛋白和其他天然蛋白质天蚕丝一直在医学上被用作手术缝合线,直到最近蚕丝蛋白的发现。 蚕丝蛋白是天蚕丝的一种核心蛋白质,已经被迅速应用于生物医学领域,因为它可以免除不良的机体免疫反应。同样地,从头发、羊毛、指甲和羽毛中提取出的角蛋白和其他基质蛋白也被尝试作为新型支架材料用于PNI的修复。
3.3合成材料
3. 3. 1非降解合成材料从历史上看,非降解合成材料的尝试都早于可降解合成材料。自20世纪60年代硅胶被用于周围神经修复的研究以来,因其惰性和弹性使硅胶管成为制造神经支架的第一个和最常用的合成材料。非降解支架也使用塑料制造,如丙烯酸聚合物、聚乙烯、弹性体等[10,11,12].
3. 3. 2可降解合成材料为了克服非降解合成材料的缺点,科学家们开始使用可降解合成材料制作神经支架。此类材料要求在合适的时间内完成降解,并且其降解产物可以被机体吸收,仅伴有轻微的异物反应。
脂肪族聚酯是一类常见的可降解合成聚合物,其中聚乳酸、聚乙醇酸、聚已酸内酯和它们的共聚物,已经被批准成为在医疗器械领域使用的生物材料之一。 除此之外,聚磷酸酯、聚氨酯和一些带电聚合物也一直在试图用于制作神经支架[13]。
4SC的应用
在周围神经再生的动物实验中,很多研究者将SC作为支持细胞来研究组织工程神经支架对周围神经再生的作用。现将近年来的一些相关动物实验归纳总结如表1所示。
神经前体细胞 篇7
1.1 NSCs的定义
Reynolds[1]等于1992年从小鼠纹状体分离出能在体外不断分裂增殖并具有多种分化潜能的细胞群, 第一次提出了神经干细胞的概念。1997年McKay[2]正式将神经干细胞的概念总结为:一类具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力, 能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞。
1.2 NSCs的来源
1.2.1 胚胎干细胞
胚胎干细胞是指当受精卵分离发育成囊胚时内细胞团的细胞, 它具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。1981年, Evans和Kaufman[3]首次成功分离小鼠胚胎干细胞, 而后国内外研究人员进行了大量的研究, 而且证明在体外, 胚胎干细胞能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型, 为胚胎干细胞向神经干细胞的诱导分化打下了基础。目前, 胚胎干细胞向神经细胞的诱导分化的方法主要有以下几种: (1) Bain[4]等在维甲酸或生长因子处理下, 悬浮培养形成胚状体, 由此得到神经前体细胞或者神经细胞。然后用免疫细胞化学方法证实其是神经细胞, 并且在基因转录水平也同样检测证实。另外, 有研究表明将胚胎干细胞通过该方法诱导分化得到的神经干细胞移植到视网膜下腔后, 神经干细胞进一步分化为神经元网络结构和神经胶质细胞[5]。该方法的缺点是神经干细胞的产物中可能并存其他细胞谱系。 (2) 胚胎干细胞与中胚层来源的基质细胞共培养系统。Nakayama[6]等将鼠胚胎干细胞与神经胶质细胞共同培养, 得到大量的神经干细胞。 (3) 利用碱性成纤维细胞生长因子选择性扩增神经前体细胞的培养体系。碱性成纤维细胞生长因子能够促进早期神经前体细胞的增殖, Okabe[7]等根据这一特性建立利用碱性成纤维细胞生长因子选择性扩增神经前体细胞的培养体系。该方法解决了Bain方法的缺点, 是目前胚胎干细胞诱导分化为神经干细胞公认的方法。胚胎干细胞因受伦理道德、法律、潜在致瘤性和组织相容性等问题困扰, 限制了胚胎干细胞的来源和应用。
1.2.2 成体神经组织来源的神经干细胞
成体神经干细胞存在于成人中枢神经系统内, 如海马齿状回的颗粒下层、侧脑室的室管膜下区、纹状体等部位。来自侧脑室室管膜下区的新生神经元可以远距离迁徙到达嗅球形成嘴侧迁移流[8,9]。成体神经干细胞在不同因素的刺激下, 可分化为不同类型的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。不同部位来源的细胞进行增殖和分化需要的条件也不相同。如来自脑皮质的神经干/祖细胞在体外增殖、分化为神经元需要碱性成纤维细胞生长因子;而来自视网膜的神经干/祖细胞则不需要任何丝裂原。
1.2.3 成体非神经组织来源的神经干细胞
间充质干细胞具有分化成间质起源的任意组织的潜能, 包括向神经元样细胞、软骨、造血基质及骨等分化成熟的特征[10,11]。间充质干细胞不仅存在于骨髓中, 也可以从脐血、外周血中分离[12], 有研究者从脐带静脉内皮下层也分离出间充质干细胞[13]。Miller[14]等应用表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子2培养基, 从新生鼠和成年鼠的真皮细胞层内成功培养出NSCs。但是间充质干细胞定向诱导分化为神经干细胞缺点是:需要较高的条件, 往往分化为神经干细胞的比例很低, 脑内表达为神经细胞的数量较少, 致使间充质干细胞的研究仍只限于动物实验。优点是:其来源广泛, 不受伦理等问题的束缚, 所以仍是目前研究的热点。
1.3 NSCs的生物特性
NSCs的主要生物特性包括: (1) 多向分化潜能:神经干细胞可以向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化。 (2) 自我更新:神经干细胞具有对称分裂及不对称分裂两种分裂方式。通过对称分裂产生两个干细胞或者2个祖细胞, 通过不对称分裂产生一个新的干细胞和一个祖细胞。 (3) 低免疫源性:神经干细胞是未分化的原始细胞, 不表达成熟的细胞抗原, 不被免疫系统识别。 (4) 组织融合性好:可以与宿主的神经组织良好融合, 并在宿主体内长期存活。
1.3 神经干细胞体内分化调控机制
目前绝大多数研究者认为NSCs的分化调控机制主要有两种:自身基因调控和外源性信号调控。基因调控是指NSCs自身的转录因子及其他功能蛋白对其发育的调控。许多转录因子参与了NSCs的增殖、分化过程。如bHLH (basic helix-loop-helix) 转录因子家族[15], 其中家族中的MASH-1 (mammalian aehaete-scute homolog-1) 基因的表达使干细胞向神经元前体细胞分化;Ngn1和Ngn2基因促使干细胞向神经元方向分化;Olig基因决定少突胶质细胞的分化;该家族还包括Mash1、NeuroD等因子。除此以外, 转录抑制因子N-coR (the nuclear receptor Co-repressor) 能抑制神经干细胞向胶质细胞分化[16];Notch基因抑制干细胞向神经元方向分化;Wnt[17]基因在NSCs增殖分化中也起重要调节作用。
外源性信号调控指微环境对NSCs发育的调控, 包括细胞因子、骨形态形成蛋白 (BMPs) 、微环境等多个方面。大量实验表明, 细胞因子如表皮生长因子 (EGF) 和成纤维细胞生长因子 (FGF) 都能维持神经干细胞的自我更新能力。其他神经因子如血小板生长因子 (PDGF) 、脑源性神经营养因子 (BDNF) 、白细胞介素 (IL-1) 、淋巴细胞抑制因子 (LIF) 均起协同调节作用。另一种就是骨形态形成蛋白 (BMPs) , BMPs在神经系统发育过程中发挥多种作用, 并对神经营养因子的作用产生影响。在胚胎早期, 可抑制细胞增生;在后期, 低浓度的BMPs促进神经细胞和星形胶质细胞的增生, 但在发育的所有时期, BMPs抑制少突胶质细胞的产生[18]。微环境指能对NSCs分化产生影响的周围结构成分。人们发现:促进血管内皮细胞增殖的因素可以促进神经元的增殖, 提示NSCs的发生与内皮细胞的发生也有一定关系;同时神经元的发生亦受到其他神经细胞的影响, 如来源于成人海马区的星形胶质细胞可以促进NSCs的增殖和分化[19];而来源于脊髓的星形胶质细胞并不能促进神经的发生, 进一步证明局部的微环境对NSCs的影响。自身基因调控和外源性信号调控相互作用, 共同调节控制干细胞的增殖和分化。
2 神经干细胞移植
2.1 神经干细胞移植的可行性
神经干细胞能够应用于研究视网膜缺血再灌注损伤, 主要与眼球的局部特点密不可分。 (1) 眼球的解剖结构清晰, 屈光物质透明, 眼球体积小、组织结构严密、与体循环相对分离等特点, 有利于操作、定位和观察。 (2) 眼球具有免疫赦免机制, 能诱导免疫偏离, 产生免疫耐受。眼球的免疫赦免使得视网膜下腔和玻璃体腔对外来基质的相对无反应状态都为神经干细胞移植治疗视网膜缺血再灌注损伤提供了免疫学基础。但是, 眼球的免疫赦免是相对的, 在移植过程中, 视网膜色素上皮细胞、小胶质细胞以及视网膜微血管内皮细胞等相关APC均参与了免疫排斥反应。使用免疫抑制剂和免疫耐受状态的产生可以有效地降低细胞移植后免疫排斥反应的发生[20]。
2.2 神经干细胞移植方式
目前, 神经干细胞移植视网膜主要通过两条途径实现:一是玻璃体腔移植, 一般将带有玻璃微型针头的微量注射器在角膜巩膜缘扁平部插入玻璃体腔, 抽出1.5μL左右的玻璃体, 再注入等体积的神经干细胞悬液。另一种方法是视网膜下腔移植, 通常是在光学显微镜下, 使用微型刀片在视网膜赤道部做一个小切口, 然后用带30号针头的微量注射器穿巩膜、脉络膜进入视网膜下腔, 注入3~4μL细胞悬液。由于移植的干细胞具有迁移整合能力, 通过上述两种方法, 细胞均可整合入视网膜, 但实验观察到视网膜下腔注射损伤较大, 且容易造成视网膜脱离。
2.3 神经干细胞移植后的作用
Nishida[21]等将大鼠海马来源的神经干细胞移植入机械性损伤的大鼠玻璃体腔内, 分别于1、2、4周做组织化学检查, 发现移植细胞已长入宿主视网膜, 并表达Map2ab、Map5、GFAP, 结果表明神经干细胞移植有助于修复损伤的视网膜。Suzuki[22]等将海马来源的神经干细胞移植入新生小鼠眼内, 发现移植细胞整合到宿主的神经节细胞层、内丛状层和内核层。免疫组化显示多数细胞能表达巢蛋白, 并表现出微管相关蛋白的免疫活性。证明神经干细胞能向神经元和星形胶质细胞分化, 同时也发现脑衍生神经生长因子 (BDNF) 能促进神经干细胞的分化和提高其成活率。Wang等[23]将NGF基因修饰的神经前体细胞移植到玻璃体腔和视网膜下腔, 观察其对视神经轴浆流中断视神经病变的治疗作用, 发现:NGF基因修饰的神经前体细胞注入玻璃体腔和视网膜下腔, 均能够表达NGF, 最长时间达1个月之久。在7d和15d分泌神经营养因子对损伤下的视网膜节细胞起到明显的保护作用。Dong等[24]用转化生长因子β3诱导海马来源的NSCs后移植入视网膜后发现部分细胞可表达成熟视网膜细胞标志。最近有学者将加强绿色荧光蛋白表达的海马祖细胞 (AHPCs) 通过玻璃体腔内注射移植到高压损伤眼, 免疫组织化学分析AHPCs在损伤的视网膜环境中存活并分化, 表达神经元和神经胶质标志。但是瞳孔对光反射和视网膜电流图分析在受体眼中未见分化出功能性产物。Tropepe等发现成年小鼠视网膜内存在NSCs, 打破了认为哺乳动物视网膜内不存在NSCs的传统观点。Chacko等[25]向出生2周大鼠视网膜下腔移植培养的来源于视网膜的NPC, 发现移植的细胞能与视网膜整合并表达感光细胞的标志物Opsin和Arrestin。较其他用于视网膜移植的干细胞而言, 来源于视网膜的NSCs一直处于视网膜的生长、发育环境中, 具有更大的向视网膜细胞分化的潜能。在国内, 柳浩然[26]等观察了神经干细胞移植能促进视神经损伤大鼠视网膜表达脑源性神经营养因子以及神经干细胞移植入视神经损伤大鼠玻璃体腔后可提高视网膜神经节细胞的存活率、对受损的节细胞具有一定的保护作用。同时研究发现NSCs移植入视神经损伤大鼠视网膜后作闪光视觉诱发电位显示, P1波幅显著下降, 1周内下降速度较快, 2周至4周下降幅度渐趋于平缓;P1波峰潜时逐步上升, 到4周时显示回落趋势, 说明髓鞘功能有开始恢复的迹象。闪光视觉诱发电位反映里视神经损伤及NSCs移植后的视神经传导功能的变化, 发现NSCs早期移植可减缓视网膜节细胞的凋亡, 有效促进损伤视神经传导功能的修复。最近Wang[27]等从人胚胎大脑皮层分离获得神经干细胞, 然后移植入出生后21d大鼠的玻璃体腔内, 并在出生后不同时间点检测大鼠的空间频率敏感度和亮度阈值。空间频率敏感度显示在出生后90d为 (0.54±0.04) 周期/度, 这个数字可以达到正常值的90% (0.6周期/度) , 亮度阈值为3.0对数单位;而未植入神经干细胞的大鼠在出生后90d仅为 (0.16±0.05) 周期/度, 亮度阈值仅0.6对数单位。在出生后150d和270d也空间频率敏感度可以达到 (0.49±0.05) 和 (0.22±0.02) 周期/度, 分别是正常值的82%和37%。实验证实人胚胎大脑皮层来源的神经干细胞能够有效地延缓大鼠视力的进一步恶化, 并且这种持续治疗作用可以达6个月。
3 问题及展望