C6神经胶质瘤细胞（共6篇）
C6神经胶质瘤细胞 篇1
摘要：目的观察胶质瘤细胞在体外培养条件下对神经干细胞是否有诱导迁移的作用。方法①从新生1～2dSD大鼠脑皮层分离培养神经干细胞,进行神经干细胞及其增殖能力鉴定。②胶质瘤细胞与神经干细胞限定区域联合培养,观察神经干细胞的生长及其形态学变化。结果①所获得神经细胞球Nestin染色阳性,传代神经细胞球抗BrdU染色阳性。②可观察到神经干细胞球周围长出细胞突起,在靠近胶质瘤细胞的一侧,细胞突起的密度及长度均大于其他方向上的突起并且可见部分干细胞向胶质瘤细胞方向的移动。结论胶质瘤细胞在体外对神经干细胞有诱导迁移作用。
关键词：神经干细胞,胶质瘤细胞,细胞培养,细胞迁移
自从神经干细胞成功分离,为中枢神经系统疾病治疗上存在的诸多问题的解决提供了可行办法。但是,如何使移植神经干细胞准确有效的迁入其所需部位并分化是近年神经科学工作者所关注的一个热点。本实验通过研究胶质瘤细胞在体外对神经干细胞的迁移诱导作用,为将来神经干细胞的临床应用奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
SD大鼠由南通医学院实验动物中心提供,C6细胞株购自中科院上海细胞所,5-BrdU购自NEOMARKERS公司,Mouse Anti-Nestin IgG1购自CHEMICON公司,Mouse Anti-BrdU IgG1为NEOMARKERS公司产品。
1.2 方法
1.2.1 神经干细胞培养及传代
选用1～2d的SD大鼠,碘伏消毒后,在超净台下解剖暴露两侧大脑半球及小脑,取少许两侧大脑皮层组织,大小约1mm3,放入DMEM F12培养基洗涤两遍,尽量将组织剪碎;将皮层组织转移至10mL玻璃离心管并加入6～8mL DMEM/F12培养液,用毛细吸管将皮层组织机械分离成单细胞悬液,筛网过滤,离心(500r/min)5min,弃上清液并用bFGF2、B27、D MEM/F12培养基定容,细胞记数。按25cm2培养瓶中接种1×106个/4mL进行接种。将培养瓶放入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养,5～7d原代神经细胞球形成。3～4d更换培养液。
将原代神经球吹打制成单细胞悬液,接种至含Brdu(浓度为5μmol/L)的bFGF2、B27、DMEM/F12培养液中培养5～7d即可形成次代神经球。换液同前。
1.2.2 Nestin和Brdu免疫荧光检测
Nestin免疫荧光检测:(1)贴壁:将培养的原代神经细胞球吸出,接种至置于24孔培养板内的盖玻片(多聚赖氨酸包被),放入37℃、5%CO2培养箱培养2h,使神经细胞球贴壁。(2)固定:吸去培养液加入4%多聚甲醛少许,室温下固定30min,去除固定液,PBS洗涤3次,每次10min。(3)封闭:用含10%羊血清、0.3%Triton-100的0.01mol/L PBS液在37℃条件下孵育封闭10min。(4)检测:加一抗(小鼠抗Nestin IgG1按1∶500倍稀释),放入4℃冰箱过夜,吸去一抗,洗涤同前。再加入二抗(FITC标记的羊抗小鼠IgG,按1∶150倍稀释),避光,在37℃水浴箱内孵育30min,吸去二抗,洗涤同前。(5)观察记录:在激发光波长为490nm,滤色光波长为520nm的共聚焦显微镜下观察照相(图1)。
Brdu免疫荧光检测:(1)贴壁;(2)固定;(3)封闭。方法同Nestin检测。(4)检测:一抗为小鼠抗Brdu IgG1(按1∶1000倍稀释),二抗为FITC标记的羊抗小鼠IgG(按1∶200倍稀释),余操作同前。(5)观察记录(图2)。
1.2.3 胶质瘤细胞与神经干细胞联合培养
将C6胶质瘤细胞、神经干细胞分别接种在置于6孔培养板内的半圆盖玻片上(多聚赖氨酸已包被),用无血清培养基培养2～4h使细胞贴壁,将胶质瘤细胞所贴壁的盖玻片与神经干细胞贴壁的盖玻片一起放在24孔培养板培养,并设空白对照,观察神经干细胞的生长及其形态学变化(图3)。
2 结果
2.1 Nestin和Brdu免疫荧光检测
Nestin-FITC,Common Focus(20×)
图片左侧为:C6胶质瘤细胞,图片右侧为:神经干细胞球
Nestin即巢蛋白,是一种仅存于神经上皮干细胞的中间丝成分,可作为神经干细胞的标志物。我们通过免疫荧光检测,发现神经球内的几乎所有细胞均呈Nestin阳性。从而证明我们培养的细胞球是神经干细胞球。
5-BrdU免疫荧光检测:5-BrdU即5-溴-2脱氧尿苷,它是胸腺嘧啶核苷的替代品。在细胞分裂的DNA合成前期,可以作为底物结合到新合成的DNA中,从而可验证神经干细胞的增殖能力。我们将用含5-BrdU的培养液培养形成的次代神经细胞球进行抗-BrdU免疫荧光检测显示,绝大多数细胞呈BrdU阳性。
2.2 C6细胞与神经干细胞联合培养
C6细胞和神经干细胞联合培养,可观察到神经干细胞分化,长出细胞突起,神经细胞球周围的细胞突起的密度及长度在各个方向上有明显的差异,在靠近胶质瘤细胞的一侧,突起的密度及长度均大于在其他方向上的突起,并且可见部分干细胞向胶质瘤细胞方向移动了。
3 讨论
3.1 神经干细胞培养及鉴定
自1992年Reynolds等[1]首先报道自成年小鼠纹状体分离培养出能在体外不断增殖,具有多种分化潜能的神经干细胞以来,对神经干细胞的研究便成为热点。后来的研究又在海马齿状回、脊髓、隔区、纹状体的实质及人的大脑内均成功分离出神经干细胞[2,3,4]。近年,分离、培养干细胞的技术日臻成熟。从实验用神经干细胞获取的角度看,从胎脑的纹状体区和海马齿状回容易获得,但对动物和取材技术要求较高。用成熟大鼠取材对培养技术和培养基要求又较高,不易存活。我们从新生大鼠大脑皮层分离培养出了具有分裂增殖能力的神经干细胞,在体外培养条件下形成典型的神经细胞球。Nestin免疫荧光染色为Nestin阳性,并通过5-BrdU免疫荧光染色证实这些细胞具有分裂增殖能力。说明新生大鼠皮层可培养出神经干细胞。我们的体会是从新生大鼠皮层分离培养神经干细胞有实验动物容易获得、取材简单、一次可获得大量干细胞和干细胞易成活的优点。
BrdU-FITC,Common Focus(20×)
3.2 胶质瘤细胞和神经干细胞共培养
Qu等[5]将神经干细胞注入2岁大鼠的侧脑室,发现神经干细胞在鼠脑内出现对称性迁移并分化成神经元和胶质细胞;Corbin等[6,7]研究发现,神经元有两种不同的迁移方式,即放射状迁移和正切迁移。这些研究提示,在成年人脑内可能有特定的诱导神经干细胞迁移的机制和信号物质。Kim等[8]的研究初步证明了这一点,他们发现端脑的GABA类联络神经元和小脑的谷氨酸类神经元分泌至细胞外基质的一种名为Reelin的糖蛋白,在神经干细胞的迁移中起重要作用。更有趣的是,Karen等[9]发现将神经干细胞移植至有移植胶质瘤生长的鼠脑内,神经干细胞很快充满肿瘤,并沿着浸润的肿瘤细胞而分布,即使将神经干细胞接种在肿瘤的远隔部位,甚至把神经干细胞接种在对侧大脑半球和侧脑室,它们也可穿过正常脑组织移行入胶质瘤。这说明胶质瘤的生长环境中或胶质瘤细胞本身存在着引导神经干细胞迁移的信号物质。假设胶质瘤细胞产生这种信号物质,那么在体外培养的胶质瘤细胞也应该有这种作用,如果我们能证实这种作用,即说明胶质瘤细胞中存在引导神经干细胞迁移的物质。于是,我们首先设计了限定区域共培养的方法在体外培养条件下观察神经干细胞的生长及其形态学变化。在实验中,我们从形态学方面观察到与胶质瘤细胞共培养的神经干细胞出现迁移和分化现象,具体作用机制还有待进一步研究。但该研究已初步说明在体外培养条件下胶质瘤细胞具有诱导神经干细胞迁移作用。从而为进一步研究胶质瘤细胞诱导神经干细胞迁移的机制,并为神经干细胞应用于临床,提高脑及脊髓损伤、胶质瘤和中枢神经系统退行性疾病的治疗效果奠定了一定的基础。
参考文献
[1]Reynolds BA,Weiss S.Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system[J].Science,1992,255(5052):1707-1709.
[2]Temple S,Alvarez-Buylla A.Stem cells in the adult mammalian central nervous system[J].Curr Opin Neurobiol,1999,9(1):135-141.
[3]Doetsch F,Alvarez-Buylla A.Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(25):14895-14900.
[4]Eriksson PS,Perfilieva E,Bjork-Eriksson T,et al.Neurogenesis in the adult human hippocampus[J].Nat Med,1998,4(11):1313-1317.
[5]Qu T,Brannen CL,Kim HM,et al.Human neural stem cells improve cognitive function of aged brain[J].Neuro Report,2001,12(6):1127-1132.
[6]Corbin JG,Nery S,Fishell G.Telencephalic cells take a tangent:non-radial migration in the mammalian forebrain[J].Nat Neurosci,2001,4(Suppl):1177-1182.
[7]Marin O,Rubensiein JL.A long,remarkable journey:tangential migration in the telencephalon[J].Nat Rev Neurosci,2001,2(11):780-790.
[8]Kim HM,Qu T,Kriho V,et al.Reelin function in neural stem cell biology[J].Neurobiology,2002,99(6):4020-4025.
[9]Karen S,Aboody,Alice Brown,et al.Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain:Evidence from intracranial gliomas[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,97(23):12846-12851.
C6神经胶质瘤细胞 篇2
细胞疗法的目标是要在体内形成新的细胞以治疗疾病。两年前, 隆德大学的研究人员就对人类皮肤细胞 (成纤维细胞) 进行重编程, 使其直接变身为可产生多巴胺的神经细胞, 从而绕过了干细胞这一中间阶段, 当时这在世界上尚属首次。现在, 该小组又证实, 皮肤细胞和支持细胞都有可能直接在大脑中重编程为神经细胞。
研究人员使用一种被设计过的基因, 可通过药物激活或使其失活。这种基因被插入两种类型的人类细胞中:成纤维细胞和神经胶质细胞, 后者是自然存在于大脑中的支持细胞。随后, 研究人员将细胞移植进大鼠的大脑, 并在大鼠的饮用水中加入药物将基因激活。结果发现, 这些细胞开始向神经细胞转化。
在另一项实验中, 研究人员向小鼠大脑内注入同样的基因后, 也成功将小鼠自身的神经胶质细胞重新编程成为神经细胞。“这一发现是首个表明其他细胞有可能在大脑内经过重编程而转化为神经细胞的重要证据。”研究小组负责人马林·帕尔马说。
他表示:“研究结果有望开辟一条途径, 为将来的细胞疗法植入物找到替代品, 从而扫除以前遭遇的研究障碍, 比如难以让大脑接受外来细胞, 以及易形成肿瘤的风险等。”在大脑中直接对细胞重编程的新技术开启了新的可能性, 为更有效地替换帕金森氏症等患者已经死亡的脑细胞创造了条件。
“我们正在对这项技术进行开发, 以便用它来创建新的神经细胞, 取代受损细胞的功能。能够在体内进行重新编程也就意味着可以设想, 未来我们可以直接在人类大脑中形成新的细胞, 而无需绕行细胞培养和移植这条弯路。”帕尔马说。
这项研究让人们展开想象:其他细胞可以重新编程直接转化为神经细胞, 那么是否也可以转化为肌肉细胞、肝细胞等其他细胞?既然细胞可以实现转化, 那么转化细胞能否形成组织, 继而组成器官?尽管想象难以在短时间内成为现实, 但积跬步以至千里, 我们相信对细胞这一生命基本单位的这类研究必将成为揭开生命奥秘、改造生命和征服疾病的关键。
C6神经胶质瘤细胞 篇3
关键词：神经胶质瘤,干细胞样细胞,侧群细胞,干细胞标志蛋白
本次研究中, 出于对神经胶质瘤干细胞样细胞的分离鉴定及其生物学特性进行分析探讨, 采取流式细胞仪分选神经胶质瘤C6细胞中的侧群细胞和非侧群细胞进行了观察分析结果报告如下。
1材料与方法1.1
1.1实验试剂所需试剂包括有链霉素、青霉素、Hoechst33342、MTT、胎牛血清、干细胞培养基、PRMI 1640培养基、FITC-CD133抗体。
1.2细胞系取神经胶质瘤C6细胞, 在37℃、浓度为15%的二氧化碳条件下, 在含有10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100 IU/ml链霉素、PRMI 1640培养基中进行培养。
肿瘤的球囊培养采取干细胞无血清培养基, 按照说明书进行操作, 每3天加1次表皮细胞生长因子 (EGF) , 剂量为20 ng/ml, 碱性成纤维生长因子 (b FGF) 剂量为20 ng/ml, 1×B27。
1.3实验动物选择BALB/c-nu裸鼠20只, 鼠龄为5~6周, 体重20~25 g, 在没有特殊病原体的条件下进行饲养, 分选侧群与非侧群细胞, 分别取103、104、105、106四组, 每组中包括有5只裸鼠, 在裸鼠皮下接种, 1个月后将裸鼠处死, 并对成瘤率进行计算。
1.4流式细胞仪分选侧群细胞选择对数生长期的神经胶质瘤C6细胞, 将其制备成单细胞悬液, 并将细胞浓度调整至106/ml, 而后加入Hoechst 33342, 最终浓度为5 mg/L, 另外选取1 ml细胞, 加入维拉帕米, 最终浓度为50 mg/L, 反应30 min后, 继续加入Hoechst 33342作为对照。在37℃条件下, 避光染色9 min, 染色过程中不断摇晃, 将细胞摇匀, 避免发生沉淀。而后经流式细胞仪进行侧群细胞分选[1,2]。
而后经MTT法绘制细胞生长曲线, 平板克隆法对细胞克隆形成能力进行检测, 无血清悬浮培养对细胞的球囊形成能力进行观察, 裸鼠移植瘤实验对细胞的成瘤能力进行检测, 流式细胞仪对细胞CD133的表达水平进行检测。
2结果
2.1侧群细胞分选神经胶质瘤C6细胞中侧群细胞所占比例为 (4.32±1.41) %, 而加入维拉帕米进行抑制后, 侧群细胞所占比例在降至 (0.05±0.02) %。
2.2侧群细胞与非侧群细胞增殖速度侧群细胞与非侧群细胞在2、4 d的生长速度比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 在6、8、10 d时, 侧群细胞生长速度增加, 较非侧群细胞快 (P<0.05) 。见图1。
2.3侧群细胞与非侧群细胞球囊性生长以及克隆形成能力比较在无血清条件下, 侧群细胞存在明显的球囊形成特性, 非侧群细胞无此特性。常规条件下培养, 侧群细胞克隆形成率为 (32.08±6.1) %, 非侧群细胞的克隆形成率为 (9.56±3.11) %, 比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。
2.4侧群细胞与非侧群细胞CD133表达情况侧群细胞CD133表达水平为 (61.87±4.98) %, 非侧群细胞的CD133表达水平为 (1.02±0.76) %, 比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。
3讨论
神经胶质瘤具有明显的浸润特征, 中枢神经系统最为常见的一种恶性肿瘤, 手术治疗无法彻底根除, 即便是结合化疗、放疗, 依旧存在肿瘤复发的可能性。曾有调查显示[3], 神经胶质瘤在脑肿瘤中所占比例为40.00%~60.00%, 为神经系统最为常见的一种的肿瘤, 近几年关于肿瘤治疗的技术不断改进, 然而, 对胶质瘤治疗的预后无明显改善。目前关于神经胶质瘤的研究不断深入, 并获得较好的成效。
本次研究中, 采取流式细胞仪分选神经胶质瘤C6细胞中的侧群细胞和非侧群细胞, 并对其进行了观察分析, 细胞生长曲线进行绘制, 对细胞克隆形成能力、球囊形成能力、细胞成瘤能力以及细胞CD133的表达进行检测, 侧群细胞生长速度较非侧群细胞快 (P<0.05) ;在无血清条件下培养, 侧群细胞具有形成球囊的特性, 非侧群细胞无此特性;侧群细胞克隆形成率高于非侧群细胞 (P<0.05) ;侧群细胞CD133表达率高于非侧群细胞 (P<0.05) 。
总之, 在神经胶质瘤中存在有典型的侧群细胞, 且侧群细胞中干细胞标志蛋白CD133呈现为高表达, 可以在侧群细胞中分选富集神经胶质瘤干细胞样细胞, 值得关注。
参考文献
[1]陈宏颉, 王守森, 郑兆聪, 等.RNAi抑制STAT3对胶质瘤干细胞的生长抑制作用.中华神经外科杂志, 2011, 27 (9) :964-968.
[2]仇波, 张东勇, 陶钧, 等.一种简化改良的脑胶质瘤干细胞培养方法.中国神经肿瘤杂志, 2011, 9 (1) :7-11.
C6神经胶质瘤细胞 篇4
1 GSCs概述
随着肿瘤干细胞的发现及其生物学特征的了解，研究者提出了肿瘤发生发展的种子是TSC的假说。应用干细胞研究技术，人们陆续从白血病 (流体瘤) 、骨髓瘤和乳腺癌 (实体瘤) 中分离获得了TSC。
2003年，SINGH等[1]从人脑肿瘤组织中成功分离出了TSC，其表现出与NSC相似的特性，这些细胞被称之为胶质瘤干细胞 (GSCs) 或胶质瘤起始细胞 (glioma-initiating cells) 。其具有以下几个特点: (1) 能自我更新，持续增殖， (2) 具有肿瘤始动能力，在免疫缺陷大鼠颅内原位移植可产生脑肿瘤， (3) 表达神经干细胞标志物， (4) 具有多向分化能力，也就是可分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞3种不同的神经细胞。GSCs的存在对肿瘤组织的持续增长起着重要的作用，它具有放化疗耐受性，肿瘤的复发被认为是由残存的肿瘤干细胞所致。因此这些干细胞也就成了肿瘤治疗的一个重要目标。
随着GSC域的加深，其中不乏各种争议。现把近年来出现的一些新看法、新认识仅列举以下: (1) 测试致瘤能力的常用方法是，将有限密度的细胞接种到NOD/SCID (严重联合免疫缺陷) 大鼠从而使其荷瘤。KELLY等[2]的实验却发现，除了肿瘤干细胞外，其他细胞也有很高的致瘤率。 (2) CD133曾被认为是GSC的一个高度特异的标志物，但不是最理想的标志物，因为CD133阴性细胞同样具有自我更新并始动肿瘤的特性，只是致瘤率非常低，并且CD133阴性细胞在适当条件下还能逆分化成CD133阳性细胞而致瘤[3]。 (3) 集落生成实验被用来评价细胞的自我更新能力，它受细胞微环境的强烈影响，ZHENG等[4]实验显示血清能够极大促进集落生成。
微环境 (niche) 能调节肿瘤干细胞的生长特性，研究表明CD133标志物能被缺氧诱导产生[5]。由于易受外界因素调节，CD133并非GSC一个稳定表达的特性。有学者认为在肿瘤细胞中存在一个亚群，它们新陈代谢能力强，在微环境的调整下能够通过不同的能量通路进行转变，当肿瘤组织内不同分化状态的细胞并存时，这些细胞将会具有去分化和增殖的能力[6]。从理论上来说，只要剩余一个肿瘤干细胞就足可以导致肿瘤的复发。因此，肿瘤干细胞是肿瘤发生发展的源泉，只有杀死肿瘤干细胞才可能成功的治愈癌症。
2 如何以GSCs为靶向
肿瘤的靶向治疗通常依赖于肿瘤细胞特异分子的表达或者是能激活某种信号能量通路，从而提供一个有针对性的治疗方案。随着快速、高效、高通量分析方法的发展，研究人员在分子水平上对阐明肿瘤干细胞的遗传特点进行了卓有成效的研究，发现了更多的特异靶点，为研发选择性杀伤肿瘤干细胞的靶向药物奠定基础，从而成为肿瘤治疗新的突破点。
2.1 信号通路
NOTCH是调节NSC自我更新和分化的一个重要通路，研究发现与非干细胞样肿瘤细胞相比，GSCs激活的NOTCH更多。FAN等[7]应用γ分泌酶抑制剂 (GSIs) 成功阻断NOTCH信号通路传导，减少了CD133+GSCs，并抑制了肿瘤的发生和生长。WANG[8]等发现阻断NOTCH通路还能够进一步增加GSCs的放疗敏感性。
磷酸肌醇3激酶 (PI3K) 通路也是一个重要通路。PI3K是一种癌基因，其编码的蛋白质产物具有磷脂酞肌醇 (phosphatidylinosito, pl) 激酶活性，在肿瘤发生、发展方面起着重要的作用。Akt也称为蛋白激酶B (PKB) ，是一种在进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要位于胞浆，是PI3K的关键下游分子，可以调控转录、蛋白质合成、糖类和脂类的代谢。EYLER[9]的实验发现，小分子的Akt抑制剂能显著的减少GSC细胞的数量，抑制GSC的转移及侵袭，从而抑制肿瘤的生长。
Hedgehog传导通路在GSCs中起着重要作用，在多发性骨髓瘤和慢性髓性白血病的CSC细胞中均发现Hedgehog通路的活化。SMO是参与Hedgehog通路活化的重要中间分子，它的拮抗剂环王巴明 (cyclopamine) 可以抑制Hedgehog通路活化。BAR等[10]使用环王巴明治疗神经胶质细胞瘤和多发性骨髓瘤，发现肿瘤细胞的克隆能力明显下降。此外，另一种SMO拮抗剂GDC-0449已经完成了I期临床实验，并取得了较理想的效果。
锌指蛋白A20是NF-κB通路的调节剂，HJELMELAND等[11]发现它在胶质瘤干细胞的表达要高于非干细胞样肿瘤细胞。通过慢病毒sh RNA转染敲除A20能够减弱胶质瘤干细胞自我更新，生长和抗凋亡的能力。
WANG等[12]发现针对C-myc的慢病毒sh RNA转染能够减少GSCs的增殖，增加它的凋亡和减弱其致癌性。EZH2是Pc G (多梳基因蛋白) 基因家族的一员，它能够增加cmyc的表达，同时sh RNA介导的EZH2表达的下调，以及用s-adenosythomocystein水解酶抑制剂DZNep处理导致EZHZ蛋白表达的抑制，都能够减弱GSC的自我更新和成瘤能力。
白细胞介素6 (IL6) 通路的受体是IL6Rα和gp130。以IL6Rα或者IL6为靶的慢病毒sh RNA能在体外实验中阻止GSC的生长和神经球的形成，而在体内实验中敲除IL6Rα和IL6并且使用抗IL6抗体进行治疗能够抑制GSC诱导的肿瘤的生长[13]。
趋化因子CXCL12又称基质细胞衍生因子-1 (SDF-1) 或前B细胞刺激因子 (PBSF) ，其在调控造血环境中起重要作用，研究显示其配体是CXCR4，它们的相互作用与肿瘤的发生发展密切相关。研究发现GSC细胞群中有少部分细胞表达较高的CXCR4受体水平，而在非干细胞的胶质瘤细胞系中仅有个别细胞低表达。AMD3100是一种特异的CXCR4拮抗剂，在体外实验中能够抑制肿瘤细胞的迁移，在体内实验中能够减少高侵袭力的GSC细胞系异种移植的生长。
2.2 分化
诱导分化是GSCs靶向治疗的另外一个重要途径。骨形态形成蛋白 (BMPs) 在神经系统的发育分化中起着重要的作用。LIU A等[14]运用实验胚胎学和遗传学方法证明了BMP在神经组织的形成以及在对神经元形成的类型和数量都起一定的控制作用。LEE等[15]研究发现BMPs在不同的肿瘤干细胞株的分化中起到不同的作用，或者促进或者抑制肿瘤性星形细胞分化程序。运用RNA干扰筛选方式，令衔接子蛋白TRRAP (转化/转录域相关蛋白) 表达沉默，结果显示能诱导GSCs的分化。TRRAP的表达下调能够使细胞对凋亡刺激敏感，并阻止细胞周期的进展，从而抑制体内肿瘤的形成。这些现象说明，TRRAP能够保持GSCs处在一个干细胞样的致瘤状态。
研究发现维甲酸能够促进肿瘤细胞的分化，最近研究揭示其能作用于干细胞样胶质瘤细胞并发挥抗肿瘤的功效[16]。然而在临床研究中，关于全反式维甲酸和顺式维甲酸的确切机制只有较少报导，是否有某种特殊形式的维甲酸能够在联合化疗中使GSCs对细胞毒治疗致敏将是今后研究的热点问题。
2.3 放疗敏感性
胶质瘤对放化疗敏感性较差，GSC细胞通过DNA损伤检验点系统以及DNA修复能力，从而具有一定的放化疗抵抗能力。与CD133阴性细胞相比，CD133阳性GSCs无论在体内还是体外的放射线环境下都能较强的存活[17]。CD133+细胞能更有效地修复放射引起的DNA损伤，Chk1和Chk2 (细胞周期检测点激酶) 的特异性抑制剂能够逆转这种放射抗性。在GSCs领域研究DNA损伤检验点系统的反应或许能够提供一个可行的治疗方案。
2.4 GSC微环境 (niche)
niche是指干细胞周围的细胞和外部信号构成的特定的微环境，这个微环境维持着干细胞的特性，为干细胞的自我更新提供了合适的外部条件，并且抑制干细胞向成熟细胞的分化。与非干细胞样胶质瘤细胞相比，GSCs分泌高水平的VEGF (血管内皮生长因子) ，具有很强的促血管生成作用。这说明GSC与血管环境是相互依赖的。
贝伐单抗是一种抗VEGF抗体，能够有效的对抗血管形成，研究证实其能够阻止血管形成和GSC源性的异种移植物的生长。然而它对非GSC源性的异种移植物只有有限的功效。FOLKINS等[18]在细胞毒治疗中联合使用一种抗VEGF受体的抗血管形成治疗，结果GSC细胞明显减少，然而单独的抗血管形成的治疗却难以达到如此效果，说明微环境的破坏能够使GSCs对化疗敏感。
2.5 溶瘤病毒治疗
溶瘤病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制，造成细胞病理效应和机体免疫反应从而导致肿瘤细胞的裂解死亡，同时对正常细胞和组织却没有作用或影响较小。Delta-24-RGD是一种溶瘤腺病毒，它能选择性的进入肿瘤细胞内，通过Rb通路进行复制，尤其是在胶质瘤细胞中。使用Delta-24-RGD治疗脑内荷瘤大鼠，生存期明显延长。
2.6 粘附分子抑制
L1CAM是一类神经细胞粘附分子，属于免疫球蛋白超家族中的一员，它能够调节神经细胞的生长，生存，迁移，以及轴突的生长和神经突的伸展，在胶质瘤细胞以及其它肿瘤细胞中高度表达，因此可作为细胞表面靶的。L1ACM主要在CD133+胶质瘤细胞中表达，在CD133-中呈阴性。针对L1CAM的慢病毒sh RNA能阻止CD133+GSCs生长，干扰神经球的形成，诱导其凋亡[19]。
3 结语
C6神经胶质瘤细胞 篇5
1 小胶质细胞的性能
小胶质细胞是哺乳动物大脑在胚胎和新生发育时期, 由于一些趋化因子的作用, 血源性单核细胞透过发育不完全的血脑屏障而浸润到大脑内, 也有人认为小胶质细胞来源于中胚层的骨髓前体细胞 (即单核巨噬细胞系统) 。在成年期, 成为脑内固有的免疫细胞, 参与脑内的炎症及免疫反应。小胶质细胞是中枢神经系统 (CNS) 独特的细胞类型, 属胶质细胞的一种, 占脑细胞的10%左右, 正常状态下的小胶质细胞胞体较小, 具有向各个方向伸出的细胞突起, 且突起细而长, 同神经元和星形胶质细胞有着紧密联系。静息状态下小胶质细胞只是通过简单的吞饮起到清除代谢产物, 维护组织稳定的净化作用以及可能通过释放低水平的生长因子促进神经元和胶质细胞的生存。
2 小胶质细胞被激活的作用
小胶质细胞对神经元损伤的作用是转化为激活状态, 几乎所有导致脑细胞损伤的因素如感染、炎症外伤、缺血或毒性物质等刺激时都能使小胶质细胞迅速活化, 体积增大, 突起伸长、增多, 细胞表面表达的456 补体受体和784 分子水平上调, 合成和分泌多种细胞因子如肿瘤坏死因子2α (TNF2α) 、白细胞介素21α、21β ( IL21α、IL21β) 、和表皮生长因子、免疫反应性纤维结合素 (IFN2γ) 、类花生酸物质和兴奋性氨基酸, 以及通过释放还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH) 氧化酶衍生超氧化物自由基, 而上述细胞因子还可诱导星形细胞表达CD23 , 进而激活诱导型一氧化碳合成酶 (iNOS) 产生NO, NO与超氧阴离子 (O2-) 结合形成强氧化物质亚硝酸根离子 (ONOO-) , 直接损伤或分解为其他自由基, NO又可以刺激促炎因子的产生, 如TNF2α, 细胞因子也可以通过与细胞表面的细胞因子受体特异性结合, 如TNF2α通过活化其两种受体p55 (TNF2RI) 和p75 (TNF2RII) 而引起其生物学效应, 直接作用于神经元, 从而激活凋亡途径, 激活的小胶质细胞也可使前列环素限速酶COX-1、COX-2上调, 前列环素合成增加, 前列环素又是细胞N-甲基-D-天门冬氨酸 (NMDA) 谷氨酸受体突触后信号传递级联放大反应的一种中介物, 前列环素还通过抑制星形胶质细胞再摄取谷氨酸, 增强谷氨酸能神经元的传递, 小胶质细胞还可启动中枢神经系统的免疫应答对中枢神经系统产生损害作用, 细胞因子不仅对神经元产生毒性作用, 同时还刺激未活化的小胶质细胞活化, 扩大并增殖胶质细胞反应, 使炎症反应持续进行, 死亡的和即将死亡的神经元周围亦可见活化的小胶质正在吞噬多巴胺神经元和突触, 多途径的结果作用于周围的神经元, 最终导致神经元死亡[1]。但是小胶质细胞在活化的过程中同时也释放少量神经保护因子, 如胶质源性神经营养因子 (GDNF) 和白细胞介素210 (IL210) 等, GDNF对DA能神经元很强的营养和保护作用, 属转化生长因子-β (TGF-β) 家族, 它能特异性促进中脑DA能神经元存活、分化, 增加突触末梢对DA的摄取[2], 保护DA能神经元对抗6-羟多 (6-OHDA) 和1-甲基-4苯基-1, 2, 3, 6-四氢基吡啶 (MPTP) 等神经毒素的损伤[3], 明显阻止中脑黑质DA 能神经元数目的减少及使TH 阳性神经元数量显著增加等作用。IL210是具抗炎作用的细胞因子, 它能抑制小胶质细胞的活化和促炎因子的产生, 从而保护DA能神经元。
小胶质细胞在脑内的分布具有不均匀型性, 中脑黑质致密部的小胶质细胞分布密度明显高于其他脑区。实验发现中脑黑质内的神经元比其他脑区的神经元更易受到神经毒素的影响, 从而说明神经元对神经毒性的敏感程度可能取决于小胶质细胞的分布密度与数量[4]。Herrera 等[5]将脂多糖 (LPS) 注入脑内不同的区域, 通过免疫组化和原位杂交证实中脑黑质DA损伤的同时伴有明显的小胶质细胞激活。Liu等[6]用2.5 μg LPS注入中脑黑质使用小胶质细胞特异性标记物OX242 免疫组化分析, 6 h后一部分静止的小胶质细胞开始出现形态学的改变, 24 h后所有的小胶质细胞均被激活。周国庆等[7]发现, PD大鼠模型损伤侧黑质多巴胺区TNF2α和IL21 水平较对照组明显升高, Mogi等[8]发现, PD 病人尾状核、壳核处IL21β、IL22、IL26、TNF2α、转化生长因子2α (TGF2α) 和表皮生长因子 (EGF) 的浓度明显高于大脑皮质区及无神经疾病对照组的相应部位, 证实PD 病人DA能神经元的变性过程中确有细胞因子的改变。董丽华等[9]采用立体定向术将神经毒素6-OHDA注入大鼠右侧纹状体内, 制成帕金森病动物模型后, 发现模型组右侧黑质DA 能神经元的数量减少, 同时伴有星形胶质细胞和小胶质细胞的数量明显增高, TNF2A在模型组右侧黑质和纹状体内有阳性表达, 且主要分布在激活的小胶质细上。Agnieszka 等[10] 于2003 年用MPTP 制作PD小鼠模型, 也发现TNF2α在纹状体内很快增加, 在24 h达到峰值。在缺乏TNF2α受体的小鼠身上可以完全地对抗MPTP 所致的神经毒性, 在脂多糖处理的大鼠中脑原代培养体系中, 也发现有小胶质细胞的激活和细胞因子 ( TNF2α、IL21β) 表达的升高, 且伴随有多巴胺能神经元的死亡, TNF2α是一个具有潜在毒性的强有力的炎症介质, 在PD病人中可以发动及维持炎症反应过程, 这些结果说明TNF2α是多巴胺能神经元损害过程中一个必须因素。研究发现PD大鼠模型损伤侧黑质多巴胺区诱导型一氧化氮合成酶 (iNOS) 基因表达增加[7], PD病人黑质中CD23 阳性星形胶质细胞增多, 星形细胞在维持邻近神经元代谢中起重要作用, 小胶质细胞可干扰星形细胞代谢如 (iNOS) 最终造成神经元损伤变性。PD病人体内也存在自身抗体, 侯晓妹等[11]用免疫亲和层析法获得PD血清中抗大鼠黑质部膜蛋白的IgG抗体成分, 其对黑质多巴胺能神经元具有免疫损伤作用, 自身免疫反应可导致神经元大量死亡, 神经元碎片成分又可释放更多的抗原成分, 继而触发下一个恶性循环。在PD死亡者的黑质胶质细胞中还发现有前列环素及其合成酶, 环氧合酶22的表达[12], 前列腺素E2的含量也上升, 升高的细胞因子很可能诱导炎性反应, 并通过增加脑内一氧化氮 (NO) 水平、诱导细胞程序性死亡等多种途径损害黑质多巴胺神经元。
3 一些抗炎和抑制小胶质活性的药物
近年来不断有证据表明, 在PD 的发生发展过程中, 小胶质细胞不仅是简单的反应性增生, 而且参与很多神经退行性疾病的发生、发展过程乃至最后结局。因此调控小胶质细胞以及抗炎处理便成为近年治疗PD的新方向之一。在动物实验中, Castano等[13]发现地塞米松能干扰LPS注射引起的胶质细胞反应, 保护多巴胺神经元。免疫抑制剂环孢素A和FK506能通过其受体亲免素对MPTP 引起的小鼠多巴胺神经元死亡发挥神经保护作用, 其作用机制还不清楚, 但可能为免疫干预治疗提供新的思路。水飞蓟宾也可抑制LPS 诱导的小胶质细胞激活和神经毒性因子如TNF2α, 超氧化物和iNOS 衍生NO 的产生, 从而减少大鼠多巴胺神经元损害。研究表明, 植物雌激素金雀异黄酮可抑制LPS诱导的小胶质细胞激活, 减轻多巴胺能神经元的损伤。程晓馨等[14]实验证明免疫抑制剂雷公藤氯内酯醇 (T4 ) 对PD大鼠具有肯定的神经保护作用, 其作用的发挥与T4抵抗细胞因子在脑内过度升高而产生的毒性作用有关, 推测T4通过抑制激活的胶质细胞、下调细胞因子在脑内的异常升高而保护DA神经元, 减缓DA神经元的进行性死亡进程。纳洛酮是一种类吗啡样多肽受体拮抗剂, 部分资料显示纳洛酮也可能抑制LPS 诱导的小胶质细胞活化和超氧化物的产生, 保护多巴胺神经元抗LPS诱导的炎症损害, 但与吗啡样受体的拮抗作用无关。最近研究表明, 血管活性肠道多肽是一种明显的抗炎神经多肽, 能通过阻断小胶质细胞活化和抑制神经毒性介质iNOS、TNF2α、IL21表达, 减少MPTP诱导的黑质多巴胺通路中神经变性。茶叶中没食子儿茶素 (EGC) 也被证实可抑制小胶质细胞活化, 保护多巴胺能神经元。米诺环素亦可有效抑制小胶质细胞活化, 减少小胶质细胞衍生的神经毒性介质IL21, 抑制iNOS和NADPH氧化酶, 减轻MPTP和6-OHDA导致的黑质中DA能神经元变性和纹状体DA含量的下降。过氧化物酶体增殖物活化受体γ (PPARγ) 是一种核转录因子, 属由配体激活的Ⅱ型核受体超家族的成员, 参与炎症反应及免疫调节, PPARγ激动剂如吲哚美辛、双氯芬酸及氟芬那酸能通过PPARγ依赖或非依赖机制抑制活化的小胶质细胞、促进活化的小胶质细胞凋亡、抑制环氧合酶 (COX) 合成前列环素从而发挥神经保护作用。
4 展 望
C6神经胶质瘤细胞 篇6
关键词：神经生长因子,葛根素,脑缺血,神经胶质细胞,细胞培养
神经生长因子 (nerve growth factor, NGF) 是发现最早、最典型、研究最多的一种神经营养因子[1], 具有明显促进神经元发育生长的作用。20世纪80年代之前, 人们对NGF与外周神经系统的关系已了解较多。近年来, NGF与脑缺血的关系备受关注[2]。NGF是由神经元或胶质细胞产生、分泌, 主要为胶质细胞产生。神经胶质细胞是中枢神经系统重要的细胞, 其数目大约是神经元的10倍。脑缺血损伤时, 神经胶质细胞大量合成分泌NGF, 对缺血损伤神经元的再生修复起到重要作用[3]。葛根素 (Puerarin, Pue) 由豆科植物野葛干燥根中提取物制成, 自1959年柴田承二等分离得到葛根素以来, 对它的研究日渐增多, 作为改善心脑血管循环的药物, 葛根素因其毒性低、安全范围广、疗效好而广泛运用于治疗心肌梗死和缺血性中风[4]。目前众多Pue神经保护作用的研究是通过酶学或形态学、免疫组化等方法获得的。现将对缺血培养神经胶质细胞分泌NGF及葛根素对其影响进行的观察分析如下。
1 材料与方法
1.1 动物及试剂
Wistar大乳鼠, 出生后7 d, 遵义医学院珠海校区动物中心提供。Pue由海南斯达制药有限公司生产, 批号: 31105029;NGF试剂盒:帮定公司分装, 美国Sant Crus公司产品;常规试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 神经胶质细胞的培养
取出生7 d的Wistar大乳鼠, 用75% 乙醇消毒, 在无菌条件下断头、取脑, 分离出双侧海马和皮质, 置于一消毒平皿中, 用少许解剖液 (葡萄糖 3 g/L, 氯化钠18.0 g/L, 氯化钾 0.4 s/L, NaHPO4·7H2O 0.18 s/L, KH2PO4 0.03 g/L) 冲洗脑组织。用手术刀片切成的碎块组织。用热处理过的粗吸管吸脑组织于另一小平皿内, 加入适量的解剖液和胰酶, 使胰酶的浓度为0.25%。37 ℃CO2培养箱中消化30 min。将消化后的组织块吸入盛有适量种植培养液 (含20%胎牛血清, 80%DMEM, 10 mg/L谷氨酰胺) 的两支试管中, 用尖吸管吹散, 1 000 r/min离心使细胞下沉。除去上清。吸入10 mL接种液, 用尖吸管吹散至单个细胞。静置, 取以200目筛网过滤, 去除未消化的组织残渣。用血球计数板计数细胞, 0.4%台盼蓝镜检存活率大于95%。用种植培养液调节细胞密度为5×105/mL
1) 为珠海市科技计划基金项目 (No.PC20041029) , 珠海市医学重点专科建设资助项目
密度, 接种于涂有0.1% 多聚赖氨酸的24孔培养板中, 每孔500 μL, 置培养板于37 ℃, 5%CO2培养箱中, 24 h后吸掉种植培养液, 根据实验需要进行分组处理。
1.2.2 细胞的分组与处理
将培养的神经胶质细胞分为正常组、缺血组、Pue组。正常组加入含10% 牛血清的培养基0.5 mL, 缺血组加入无血清的培养基0.5 mL, Pue组每孔分别加入含Pue 1 μL/mL的培养基0.5 mL。继续培养72 h。作用时间完成后, 将上清移入无菌Eppendof小管, -20 ℃冷藏待测;同时将每孔细胞消化下来, 计算其细胞总数。
1.3 NGF的定量测定
培养基质中NGF含量采用双向ELISA法定量检测。用酶标仪于450 nm处以阴性对照凋零后测定每孔的光密度 (OD) 值, 根据NGF标准品和其对应OD值, 先得出标准曲线, 再求出回归方程, 然后依回归方程得出每孔样品的NGF含量, 最后NGF分泌量以72 h的“pg/105细胞”表示。
1.4 统计学处理
采用SPSS 10.0软件中ONE ANOVA程序进行方差检验。
2 结 果
缺血组神经胶质细胞NGF分泌量为 (13.18±1.91) pg/105, 与正常组的 (9.24±3.12) pg/105比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 说明缺血损伤可使神经胶质细胞NGF分泌量增加。Pue组神经胶质细胞分泌NGF的量为 (16.83±1.89) pg/105, 较缺血组明显增多 (P<0.05) , 说明Pue可上调缺血损伤导致的神经胶质细胞分泌NGF。
3 讨 论
NGF由118个氨基酸组成, 相对分子质量约为14×103, 是由神经元或胶质细胞产生、分泌, 主要为胶质细胞产生;主要通过酪氨酸激酶受体trkA自磷酸化进行信号转导, 发挥其生物学效应。NGF在脑内含量虽微, 但对神经细胞的发育成熟及存活起着极为重要的作用。神经元在发育过程中对NGF的有限供应存在着竞争关系, 能获取NGF的细胞存活, 反之则死亡[5]。病理情况下, NGF能保护神经元避免损伤, 提高存活。细胞培养研究 (用未成熟细胞) 表明, 当神经元暴露于兴奋毒性或刺激性缺血性应激时, NGF可产生保护作用[6]。
近年来, 众多报道表明, 脑缺血无论是短暂缺血或较长时间缺血, 均可出现NGF表达增加, 对脑缺血损伤有保护和治疗作用[7]。本实验研究发现脑缺血损伤后, 神经生长因子的分泌明显增加, 与上述研究相一致。NGF对脑缺血的神经保护机制可能包括:①提高自由基清除剂的活性。脑缺血损害时, 正常神经元的细胞膜受到破坏, 脑内氧自由基和脂质过氧化物明显增多。有实验显示, NGF能增加过氧化氢酶、超氧化物歧化酶 (SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶等自由基清除剂的活性[8]。②拮抗兴奋性氨基酸的神经毒性。如预先向脑室内注入NGF可防止鹅膏氨酸 (ibotenic acid) 对大鼠脑组织的不可逆损伤[9]。③稳定细胞内Ca2+浓度。自由基与兴奋性氨基酸损伤均可引起Ca2+超载。Ca2+超载预示着细胞破坏和死亡。NGF稳定细胞内Ca2+浓度的机制在于诱导钙结合蛋白的表达、影响Ca2+通道与Ca2+排出系统的表达与活化, 从而稳定细胞内Ca2+浓度。