胶质瘤细胞

胶质瘤细胞（精选9篇）

胶质瘤细胞 篇1

摘要：目的观察胶质瘤细胞在体外培养条件下对神经干细胞是否有诱导迁移的作用。方法①从新生1～2dSD大鼠脑皮层分离培养神经干细胞,进行神经干细胞及其增殖能力鉴定。②胶质瘤细胞与神经干细胞限定区域联合培养,观察神经干细胞的生长及其形态学变化。结果①所获得神经细胞球Nestin染色阳性,传代神经细胞球抗BrdU染色阳性。②可观察到神经干细胞球周围长出细胞突起,在靠近胶质瘤细胞的一侧,细胞突起的密度及长度均大于其他方向上的突起并且可见部分干细胞向胶质瘤细胞方向的移动。结论胶质瘤细胞在体外对神经干细胞有诱导迁移作用。

关键词：神经干细胞,胶质瘤细胞,细胞培养,细胞迁移

自从神经干细胞成功分离,为中枢神经系统疾病治疗上存在的诸多问题的解决提供了可行办法。但是,如何使移植神经干细胞准确有效的迁入其所需部位并分化是近年神经科学工作者所关注的一个热点。本实验通过研究胶质瘤细胞在体外对神经干细胞的迁移诱导作用,为将来神经干细胞的临床应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

SD大鼠由南通医学院实验动物中心提供,C6细胞株购自中科院上海细胞所,5-BrdU购自NEOMARKERS公司,Mouse Anti-Nestin IgG1购自CHEMICON公司,Mouse Anti-BrdU IgG1为NEOMARKERS公司产品。

1.2 方法

1.2.1 神经干细胞培养及传代

选用1～2d的SD大鼠,碘伏消毒后,在超净台下解剖暴露两侧大脑半球及小脑,取少许两侧大脑皮层组织,大小约1mm3,放入DMEM F12培养基洗涤两遍,尽量将组织剪碎;将皮层组织转移至10mL玻璃离心管并加入6～8mL DMEM/F12培养液,用毛细吸管将皮层组织机械分离成单细胞悬液,筛网过滤,离心(500r/min)5min,弃上清液并用bFGF2、B27、D MEM/F12培养基定容,细胞记数。按25cm2培养瓶中接种1×106个/4mL进行接种。将培养瓶放入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养,5～7d原代神经细胞球形成。3～4d更换培养液。

将原代神经球吹打制成单细胞悬液,接种至含Brdu(浓度为5μmol/L)的bFGF2、B27、DMEM/F12培养液中培养5～7d即可形成次代神经球。换液同前。

1.2.2 Nestin和Brdu免疫荧光检测

Nestin免疫荧光检测:(1)贴壁:将培养的原代神经细胞球吸出,接种至置于24孔培养板内的盖玻片(多聚赖氨酸包被),放入37℃、5%CO2培养箱培养2h,使神经细胞球贴壁。(2)固定:吸去培养液加入4%多聚甲醛少许,室温下固定30min,去除固定液,PBS洗涤3次,每次10min。(3)封闭:用含10%羊血清、0.3%Triton-100的0.01mol/L PBS液在37℃条件下孵育封闭10min。(4)检测:加一抗(小鼠抗Nestin IgG1按1∶500倍稀释),放入4℃冰箱过夜,吸去一抗,洗涤同前。再加入二抗(FITC标记的羊抗小鼠IgG,按1∶150倍稀释),避光,在37℃水浴箱内孵育30min,吸去二抗,洗涤同前。(5)观察记录:在激发光波长为490nm,滤色光波长为520nm的共聚焦显微镜下观察照相(图1)。

Brdu免疫荧光检测:(1)贴壁;(2)固定;(3)封闭。方法同Nestin检测。(4)检测:一抗为小鼠抗Brdu IgG1(按1∶1000倍稀释),二抗为FITC标记的羊抗小鼠IgG(按1∶200倍稀释),余操作同前。(5)观察记录(图2)。

1.2.3 胶质瘤细胞与神经干细胞联合培养

将C6胶质瘤细胞、神经干细胞分别接种在置于6孔培养板内的半圆盖玻片上(多聚赖氨酸已包被),用无血清培养基培养2～4h使细胞贴壁,将胶质瘤细胞所贴壁的盖玻片与神经干细胞贴壁的盖玻片一起放在24孔培养板培养,并设空白对照,观察神经干细胞的生长及其形态学变化(图3)。

2 结果

2.1 Nestin和Brdu免疫荧光检测

Nestin-FITC,Common Focus(20×)

图片左侧为:C6胶质瘤细胞,图片右侧为:神经干细胞球

Nestin即巢蛋白,是一种仅存于神经上皮干细胞的中间丝成分,可作为神经干细胞的标志物。我们通过免疫荧光检测,发现神经球内的几乎所有细胞均呈Nestin阳性。从而证明我们培养的细胞球是神经干细胞球。

5-BrdU免疫荧光检测:5-BrdU即5-溴-2脱氧尿苷,它是胸腺嘧啶核苷的替代品。在细胞分裂的DNA合成前期,可以作为底物结合到新合成的DNA中,从而可验证神经干细胞的增殖能力。我们将用含5-BrdU的培养液培养形成的次代神经细胞球进行抗-BrdU免疫荧光检测显示,绝大多数细胞呈BrdU阳性。

2.2 C6细胞与神经干细胞联合培养

C6细胞和神经干细胞联合培养,可观察到神经干细胞分化,长出细胞突起,神经细胞球周围的细胞突起的密度及长度在各个方向上有明显的差异,在靠近胶质瘤细胞的一侧,突起的密度及长度均大于在其他方向上的突起,并且可见部分干细胞向胶质瘤细胞方向移动了。

3 讨论

3.1 神经干细胞培养及鉴定

自1992年Reynolds等[1]首先报道自成年小鼠纹状体分离培养出能在体外不断增殖,具有多种分化潜能的神经干细胞以来,对神经干细胞的研究便成为热点。后来的研究又在海马齿状回、脊髓、隔区、纹状体的实质及人的大脑内均成功分离出神经干细胞[2,3,4]。近年,分离、培养干细胞的技术日臻成熟。从实验用神经干细胞获取的角度看,从胎脑的纹状体区和海马齿状回容易获得,但对动物和取材技术要求较高。用成熟大鼠取材对培养技术和培养基要求又较高,不易存活。我们从新生大鼠大脑皮层分离培养出了具有分裂增殖能力的神经干细胞,在体外培养条件下形成典型的神经细胞球。Nestin免疫荧光染色为Nestin阳性,并通过5-BrdU免疫荧光染色证实这些细胞具有分裂增殖能力。说明新生大鼠皮层可培养出神经干细胞。我们的体会是从新生大鼠皮层分离培养神经干细胞有实验动物容易获得、取材简单、一次可获得大量干细胞和干细胞易成活的优点。

BrdU-FITC,Common Focus(20×)

3.2 胶质瘤细胞和神经干细胞共培养

Qu等[5]将神经干细胞注入2岁大鼠的侧脑室,发现神经干细胞在鼠脑内出现对称性迁移并分化成神经元和胶质细胞;Corbin等[6,7]研究发现,神经元有两种不同的迁移方式,即放射状迁移和正切迁移。这些研究提示,在成年人脑内可能有特定的诱导神经干细胞迁移的机制和信号物质。Kim等[8]的研究初步证明了这一点,他们发现端脑的GABA类联络神经元和小脑的谷氨酸类神经元分泌至细胞外基质的一种名为Reelin的糖蛋白,在神经干细胞的迁移中起重要作用。更有趣的是,Karen等[9]发现将神经干细胞移植至有移植胶质瘤生长的鼠脑内,神经干细胞很快充满肿瘤,并沿着浸润的肿瘤细胞而分布,即使将神经干细胞接种在肿瘤的远隔部位,甚至把神经干细胞接种在对侧大脑半球和侧脑室,它们也可穿过正常脑组织移行入胶质瘤。这说明胶质瘤的生长环境中或胶质瘤细胞本身存在着引导神经干细胞迁移的信号物质。假设胶质瘤细胞产生这种信号物质,那么在体外培养的胶质瘤细胞也应该有这种作用,如果我们能证实这种作用,即说明胶质瘤细胞中存在引导神经干细胞迁移的物质。于是,我们首先设计了限定区域共培养的方法在体外培养条件下观察神经干细胞的生长及其形态学变化。在实验中,我们从形态学方面观察到与胶质瘤细胞共培养的神经干细胞出现迁移和分化现象,具体作用机制还有待进一步研究。但该研究已初步说明在体外培养条件下胶质瘤细胞具有诱导神经干细胞迁移作用。从而为进一步研究胶质瘤细胞诱导神经干细胞迁移的机制,并为神经干细胞应用于临床,提高脑及脊髓损伤、胶质瘤和中枢神经系统退行性疾病的治疗效果奠定了一定的基础。

参考文献

[1]Reynolds BA,Weiss S.Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system[J].Science,1992,255(5052):1707-1709.

[2]Temple S,Alvarez-Buylla A.Stem cells in the adult mammalian central nervous system[J].Curr Opin Neurobiol,1999,9(1):135-141.

[3]Doetsch F,Alvarez-Buylla A.Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(25):14895-14900.

[4]Eriksson PS,Perfilieva E,Bjork-Eriksson T,et al.Neurogenesis in the adult human hippocampus[J].Nat Med,1998,4(11):1313-1317.

[5]Qu T,Brannen CL,Kim HM,et al.Human neural stem cells improve cognitive function of aged brain[J].Neuro Report,2001,12(6):1127-1132.

[6]Corbin JG,Nery S,Fishell G.Telencephalic cells take a tangent:non-radial migration in the mammalian forebrain[J].Nat Neurosci,2001,4(Suppl):1177-1182.

[7]Marin O,Rubensiein JL.A long,remarkable journey:tangential migration in the telencephalon[J].Nat Rev Neurosci,2001,2(11):780-790.

[8]Kim HM,Qu T,Kriho V,et al.Reelin function in neural stem cell biology[J].Neurobiology,2002,99(6):4020-4025.

[9]Karen S,Aboody,Alice Brown,et al.Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain:Evidence from intracranial gliomas[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,97(23):12846-12851.

胶质瘤细胞 篇2

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSCs)在体外诱导为神经源性细胞的可行性,并探讨其作用机制. 方法从Wistar大鼠骨髓中获得rMSCs.纯化培养传代后用不同浓度的`bFGF诱导,经MTT法检测bFGF对rMSCs生长的影响;用倒置光显微镜、透射电镜、免疫组化和RT-PCR等方法鉴定诱导后细胞行为改变与snail mRNA表达.结果 bFGF对rMSCs具有促增殖作用,在倒置光显微镜和透射电镜下可见到有神经胶质样细胞形成, 免疫组化证明GFAP的表达较对照组显著增高(P<0.01).RT-PCR结果表明,诱导组细胞snail mRNA明显表达.结论 bFGF促进rMSCs转分化为GFAP阳性的神经胶质样细胞,转录因子Snail可能与转化过程有关.

作 者：陈莉 买霞 扎拉嘎胡 陈小义 徐瑞成 CHEN Li MAI Xia ZHA La-gahu CHEN Xiao-yi XU Rui-cheng  作者单位：中国人民武装警察部队医学院,细胞生物学教研室,天津,300162 刊 名：解剖科学进展  ISTIC英文刊名：PROGRESS OF ANATOMICAL SCIENCES 年，卷(期)：2008 14(3) 分类号：Q257 R392.2+1 关键词：骨髓间充质干细胞   碱性成纤维细胞生长因子   细胞分化   Snail   大鼠  

★ 细胞分化人教版教学设计

胶质瘤的“照妖镜” 篇3

胶质瘤是一种最常见的原发颅内肿瘤，世界卫生组织把它分成四级，级数越高，恶性程度也越高。而且，胶质瘤发病于中枢神经系统，其恶性进展往往伴随运动、语言、感觉等多种功能受损，会影响到患者以后的生活和生存质量。

目前，临床上胶质瘤手术治疗切除的范围为肿瘤影像学显示的边界，但一般的影像学显示比较难于精确分辨肿瘤边界与功能区之间的位置关系，手术后一般需要辅以放疗、化疗和生物治疗等综合治疗。约80%的胶质瘤复发病灶在原发灶周围2厘米之内，是影响胶质瘤患者生存率的一大障碍。

医生告诉老王，胶质瘤的肿瘤组织像树的根须一样，长在正常脑组织里，手术很难彻底切除干净。如果手术中盲目扩大切除范围会导致神经功能的缺失。近年来，国际最先进的黄荧光显微镜问世，提供了一种最新的手术方法——荧光引导下脑胶质瘤切除术。胶质瘤在浸润性生长的过程中，颅内的血脑屏障遭到破坏。手术时将荧光染料由静脉途径给药，荧光染料通过破坏的血脑屏障进入肿瘤组织内，使肿瘤组织着色，从而可清楚地分辨出肿瘤组织和正常脑组织的界限，让医生能够客观实时地判断胶质瘤应该切除的准确边界，为肿瘤（特别是功能区恶性胶质瘤）最大程度的切除提供了帮助，为胶质瘤患者提供了一种新的治疗手段。目前德国、日本的神经外科已经将此技术应用于临床，我国少数医院也已经开展。

老王接受了医生的建议，决定进行手术治疗。手术中，医生先在“超级显微镜”的一般档位下切除了肿瘤组织，进行快速病理切片，报告显示为胶质瘤2级。随后，医生立即把手上的“超级显微镜”换一个档位，残存在脑组织里的胶质瘤组织立即清晰地出现在眼前，在肿瘤组织和脑组织水乳交融的地方，黄荧光显微镜像“照妖镜”一样，清晰地显示出肿瘤组织。为了不损伤功能区的神经细胞，医生把黄色肿瘤组织一点一点地清除掉，术中出血不多，但手术时间却比以往延长了一倍。

手术进行得很顺利，术后第一天，老王就能喝点稀饭了，精神也好得很，四肢活动自如，左手能够握着水杯举过头顶。十天后，老王行走自如，康复出院。

节细胞胶质瘤1例 篇4

讨论:节细胞胶质瘤 (Ganglioglioma, GG) 是一种既有神经元又含有胶质的肿瘤, 临床上极其罕见, 好发于儿童和青少年, 常见于30岁前。其发生率占整个神经系统肿瘤的0.4%～6.25%[1,2]。但它是混合性神经元-神经胶质肿瘤中最常见的类型[3]。是中枢神经系统少见的低级别肿瘤, 生长缓慢, 临床过程偏于良性肿瘤, 通常手术切除预后良好。Luyken 等[4]对86 例神经节细胞胶质瘤患者在肿瘤切除后7年随访, 仅有1例复发, 86%幕上神经节细胞胶质瘤患者术后无癫痫发作。CT、MRI是临床诊断节细胞胶质瘤的最重要方法之一。但是在对肿瘤的定性和定位诊断上, MRI 检查效果明显优于CT, 故MRI检查为肿瘤的术前准备提供了有利的依据 , 早期治疗对其预后改善有重要意义。肿瘤主要见于幕上大脑半球, 以颞叶最常见, 其次是额叶和顶叶, 偶见与脑室、桥小脑角区、脑干、丘脑等, 发病部位比较广泛。肿瘤通常单发, 多发极其少见。神经节细胞胶质瘤没有特征性的CT 表现, 肿块通常呈低密度或等密度, 有20% ～ 50%的病例可以出现钙化[5]。节细胞胶质瘤MRT1加权图像常表现为不均匀低信号或等信号, T2加权图像一般表现为高信号。CT平扫常表现为低密度或等密度, 少数为高密度可以有囊变及钙化, CT和MR增强扫描半数以上囊壁有轻中度强化, 囊性为主型常表现是囊变伴强化壁结节。完全囊性者可无强化。按病理特点将其分为囊性、囊实性和实性。肿瘤囊变较常见, 完全囊变可仅由单个或多个囊组成。附壁结节和钙化为节细胞胶质瘤的重要的影像学征象。典型的节细胞胶质瘤影像学表现很有特点, 即单个大囊加壁结节钙化。本病还应与胶质瘤相鉴别, 后者MRI信号多不均匀, 瘤内出血和坏死比较常见, 而钙化少见, 灌注MRI和MRS利于两者鉴别.囊实性神经节细胞胶质瘤需与胚胎发育不良性神经上皮肿瘤、血管母细胞瘤以及毛细胞型星形细胞瘤相鉴别. 实性为主、周边可见小囊变区者需与分化较好的星形细胞瘤相鉴别. 实性神经节细胞胶质瘤: 需要与脑炎相鉴别, 灌注MRI和MRS利于两者鉴别。

参考文献

[1]Matsumoto K, Tamiya T, Ono Y, et al.Cerebral gangliogliomas;clinical characteristics, CT and MRI[J].Acta Neurochir (Wien) , 1999, 141:135

[2]沈天真, 陈星荣, 主编.神经影像学[M].上海:上海科技教育出版社, 2004, 698

[3]张冬, 邹利光, 冯晓源, 等.颅内节细胞胶质瘤的MRI特征分析[J].临床放射学杂志, 2008, 27:865

[4]Luyken C, Blumcke I, Fimmers R, et al.Supratentorial gangli-ogliomas:histopathologic grading and tumor recur-rence in 184patients with a median follow-up of 8 years[J].Cancer, 2004, 101 (1) :146-155

胶质瘤细胞 篇5

关键词：神经胶质瘤,干细胞样细胞,侧群细胞,干细胞标志蛋白

本次研究中, 出于对神经胶质瘤干细胞样细胞的分离鉴定及其生物学特性进行分析探讨, 采取流式细胞仪分选神经胶质瘤C6细胞中的侧群细胞和非侧群细胞进行了观察分析结果报告如下。

1材料与方法1.1

1.1实验试剂所需试剂包括有链霉素、青霉素、Hoechst33342、MTT、胎牛血清、干细胞培养基、PRMI 1640培养基、FITC-CD133抗体。

1.2细胞系取神经胶质瘤C6细胞, 在37℃、浓度为15%的二氧化碳条件下, 在含有10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100 IU/ml链霉素、PRMI 1640培养基中进行培养。

肿瘤的球囊培养采取干细胞无血清培养基, 按照说明书进行操作, 每3天加1次表皮细胞生长因子 (EGF) , 剂量为20 ng/ml, 碱性成纤维生长因子 (b FGF) 剂量为20 ng/ml, 1×B27。

1.3实验动物选择BALB/c-nu裸鼠20只, 鼠龄为5~6周, 体重20~25 g, 在没有特殊病原体的条件下进行饲养, 分选侧群与非侧群细胞, 分别取103、104、105、106四组, 每组中包括有5只裸鼠, 在裸鼠皮下接种, 1个月后将裸鼠处死, 并对成瘤率进行计算。

1.4流式细胞仪分选侧群细胞选择对数生长期的神经胶质瘤C6细胞, 将其制备成单细胞悬液, 并将细胞浓度调整至106/ml, 而后加入Hoechst 33342, 最终浓度为5 mg/L, 另外选取1 ml细胞, 加入维拉帕米, 最终浓度为50 mg/L, 反应30 min后, 继续加入Hoechst 33342作为对照。在37℃条件下, 避光染色9 min, 染色过程中不断摇晃, 将细胞摇匀, 避免发生沉淀。而后经流式细胞仪进行侧群细胞分选[1,2]。

而后经MTT法绘制细胞生长曲线, 平板克隆法对细胞克隆形成能力进行检测, 无血清悬浮培养对细胞的球囊形成能力进行观察, 裸鼠移植瘤实验对细胞的成瘤能力进行检测, 流式细胞仪对细胞CD133的表达水平进行检测。

2结果

2.1侧群细胞分选神经胶质瘤C6细胞中侧群细胞所占比例为 (4.32±1.41) %, 而加入维拉帕米进行抑制后, 侧群细胞所占比例在降至 (0.05±0.02) %。

2.2侧群细胞与非侧群细胞增殖速度侧群细胞与非侧群细胞在2、4 d的生长速度比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 在6、8、10 d时, 侧群细胞生长速度增加, 较非侧群细胞快 (P<0.05) 。见图1。

2.3侧群细胞与非侧群细胞球囊性生长以及克隆形成能力比较在无血清条件下, 侧群细胞存在明显的球囊形成特性, 非侧群细胞无此特性。常规条件下培养, 侧群细胞克隆形成率为 (32.08±6.1) %, 非侧群细胞的克隆形成率为 (9.56±3.11) %, 比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。

2.4侧群细胞与非侧群细胞CD133表达情况侧群细胞CD133表达水平为 (61.87±4.98) %, 非侧群细胞的CD133表达水平为 (1.02±0.76) %, 比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。

3讨论

神经胶质瘤具有明显的浸润特征, 中枢神经系统最为常见的一种恶性肿瘤, 手术治疗无法彻底根除, 即便是结合化疗、放疗, 依旧存在肿瘤复发的可能性。曾有调查显示[3], 神经胶质瘤在脑肿瘤中所占比例为40.00%~60.00%, 为神经系统最为常见的一种的肿瘤, 近几年关于肿瘤治疗的技术不断改进, 然而, 对胶质瘤治疗的预后无明显改善。目前关于神经胶质瘤的研究不断深入, 并获得较好的成效。

本次研究中, 采取流式细胞仪分选神经胶质瘤C6细胞中的侧群细胞和非侧群细胞, 并对其进行了观察分析, 细胞生长曲线进行绘制, 对细胞克隆形成能力、球囊形成能力、细胞成瘤能力以及细胞CD133的表达进行检测, 侧群细胞生长速度较非侧群细胞快 (P<0.05) ;在无血清条件下培养, 侧群细胞具有形成球囊的特性, 非侧群细胞无此特性;侧群细胞克隆形成率高于非侧群细胞 (P<0.05) ;侧群细胞CD133表达率高于非侧群细胞 (P<0.05) 。

总之, 在神经胶质瘤中存在有典型的侧群细胞, 且侧群细胞中干细胞标志蛋白CD133呈现为高表达, 可以在侧群细胞中分选富集神经胶质瘤干细胞样细胞, 值得关注。

参考文献

[1]陈宏颉, 王守森, 郑兆聪, 等.RNAi抑制STAT3对胶质瘤干细胞的生长抑制作用.中华神经外科杂志, 2011, 27 (9) :964-968.

[2]仇波, 张东勇, 陶钧, 等.一种简化改良的脑胶质瘤干细胞培养方法.中国神经肿瘤杂志, 2011, 9 (1) :7-11.

胶质瘤细胞 篇6

1 GSCs概述

随着肿瘤干细胞的发现及其生物学特征的了解，研究者提出了肿瘤发生发展的种子是TSC的假说。应用干细胞研究技术，人们陆续从白血病 (流体瘤) 、骨髓瘤和乳腺癌 (实体瘤) 中分离获得了TSC。

2003年，SINGH等[1]从人脑肿瘤组织中成功分离出了TSC，其表现出与NSC相似的特性，这些细胞被称之为胶质瘤干细胞 (GSCs) 或胶质瘤起始细胞 (glioma-initiating cells) 。其具有以下几个特点: (1) 能自我更新，持续增殖， (2) 具有肿瘤始动能力，在免疫缺陷大鼠颅内原位移植可产生脑肿瘤， (3) 表达神经干细胞标志物， (4) 具有多向分化能力，也就是可分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞3种不同的神经细胞。GSCs的存在对肿瘤组织的持续增长起着重要的作用，它具有放化疗耐受性，肿瘤的复发被认为是由残存的肿瘤干细胞所致。因此这些干细胞也就成了肿瘤治疗的一个重要目标。

随着GSC域的加深，其中不乏各种争议。现把近年来出现的一些新看法、新认识仅列举以下: (1) 测试致瘤能力的常用方法是，将有限密度的细胞接种到NOD/SCID (严重联合免疫缺陷) 大鼠从而使其荷瘤。KELLY等[2]的实验却发现，除了肿瘤干细胞外，其他细胞也有很高的致瘤率。 (2) CD133曾被认为是GSC的一个高度特异的标志物，但不是最理想的标志物，因为CD133阴性细胞同样具有自我更新并始动肿瘤的特性，只是致瘤率非常低，并且CD133阴性细胞在适当条件下还能逆分化成CD133阳性细胞而致瘤[3]。 (3) 集落生成实验被用来评价细胞的自我更新能力，它受细胞微环境的强烈影响，ZHENG等[4]实验显示血清能够极大促进集落生成。

微环境 (niche) 能调节肿瘤干细胞的生长特性，研究表明CD133标志物能被缺氧诱导产生[5]。由于易受外界因素调节，CD133并非GSC一个稳定表达的特性。有学者认为在肿瘤细胞中存在一个亚群，它们新陈代谢能力强，在微环境的调整下能够通过不同的能量通路进行转变，当肿瘤组织内不同分化状态的细胞并存时，这些细胞将会具有去分化和增殖的能力[6]。从理论上来说，只要剩余一个肿瘤干细胞就足可以导致肿瘤的复发。因此，肿瘤干细胞是肿瘤发生发展的源泉，只有杀死肿瘤干细胞才可能成功的治愈癌症。

2 如何以GSCs为靶向

肿瘤的靶向治疗通常依赖于肿瘤细胞特异分子的表达或者是能激活某种信号能量通路，从而提供一个有针对性的治疗方案。随着快速、高效、高通量分析方法的发展，研究人员在分子水平上对阐明肿瘤干细胞的遗传特点进行了卓有成效的研究，发现了更多的特异靶点，为研发选择性杀伤肿瘤干细胞的靶向药物奠定基础，从而成为肿瘤治疗新的突破点。

2.1 信号通路

NOTCH是调节NSC自我更新和分化的一个重要通路，研究发现与非干细胞样肿瘤细胞相比，GSCs激活的NOTCH更多。FAN等[7]应用γ分泌酶抑制剂 (GSIs) 成功阻断NOTCH信号通路传导，减少了CD133+GSCs，并抑制了肿瘤的发生和生长。WANG[8]等发现阻断NOTCH通路还能够进一步增加GSCs的放疗敏感性。

磷酸肌醇3激酶 (PI3K) 通路也是一个重要通路。PI3K是一种癌基因，其编码的蛋白质产物具有磷脂酞肌醇 (phosphatidylinosito, pl) 激酶活性，在肿瘤发生、发展方面起着重要的作用。Akt也称为蛋白激酶B (PKB) ，是一种在进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要位于胞浆，是PI3K的关键下游分子，可以调控转录、蛋白质合成、糖类和脂类的代谢。EYLER[9]的实验发现，小分子的Akt抑制剂能显著的减少GSC细胞的数量，抑制GSC的转移及侵袭，从而抑制肿瘤的生长。

Hedgehog传导通路在GSCs中起着重要作用，在多发性骨髓瘤和慢性髓性白血病的CSC细胞中均发现Hedgehog通路的活化。SMO是参与Hedgehog通路活化的重要中间分子，它的拮抗剂环王巴明 (cyclopamine) 可以抑制Hedgehog通路活化。BAR等[10]使用环王巴明治疗神经胶质细胞瘤和多发性骨髓瘤，发现肿瘤细胞的克隆能力明显下降。此外，另一种SMO拮抗剂GDC-0449已经完成了I期临床实验，并取得了较理想的效果。

锌指蛋白A20是NF-κB通路的调节剂，HJELMELAND等[11]发现它在胶质瘤干细胞的表达要高于非干细胞样肿瘤细胞。通过慢病毒sh RNA转染敲除A20能够减弱胶质瘤干细胞自我更新，生长和抗凋亡的能力。

WANG等[12]发现针对C-myc的慢病毒sh RNA转染能够减少GSCs的增殖，增加它的凋亡和减弱其致癌性。EZH2是Pc G (多梳基因蛋白) 基因家族的一员，它能够增加cmyc的表达，同时sh RNA介导的EZH2表达的下调，以及用s-adenosythomocystein水解酶抑制剂DZNep处理导致EZHZ蛋白表达的抑制，都能够减弱GSC的自我更新和成瘤能力。

白细胞介素6 (IL6) 通路的受体是IL6Rα和gp130。以IL6Rα或者IL6为靶的慢病毒sh RNA能在体外实验中阻止GSC的生长和神经球的形成，而在体内实验中敲除IL6Rα和IL6并且使用抗IL6抗体进行治疗能够抑制GSC诱导的肿瘤的生长[13]。

趋化因子CXCL12又称基质细胞衍生因子-1 (SDF-1) 或前B细胞刺激因子 (PBSF) ，其在调控造血环境中起重要作用，研究显示其配体是CXCR4，它们的相互作用与肿瘤的发生发展密切相关。研究发现GSC细胞群中有少部分细胞表达较高的CXCR4受体水平，而在非干细胞的胶质瘤细胞系中仅有个别细胞低表达。AMD3100是一种特异的CXCR4拮抗剂，在体外实验中能够抑制肿瘤细胞的迁移，在体内实验中能够减少高侵袭力的GSC细胞系异种移植的生长。

2.2 分化

诱导分化是GSCs靶向治疗的另外一个重要途径。骨形态形成蛋白 (BMPs) 在神经系统的发育分化中起着重要的作用。LIU A等[14]运用实验胚胎学和遗传学方法证明了BMP在神经组织的形成以及在对神经元形成的类型和数量都起一定的控制作用。LEE等[15]研究发现BMPs在不同的肿瘤干细胞株的分化中起到不同的作用，或者促进或者抑制肿瘤性星形细胞分化程序。运用RNA干扰筛选方式，令衔接子蛋白TRRAP (转化/转录域相关蛋白) 表达沉默，结果显示能诱导GSCs的分化。TRRAP的表达下调能够使细胞对凋亡刺激敏感，并阻止细胞周期的进展，从而抑制体内肿瘤的形成。这些现象说明，TRRAP能够保持GSCs处在一个干细胞样的致瘤状态。

研究发现维甲酸能够促进肿瘤细胞的分化，最近研究揭示其能作用于干细胞样胶质瘤细胞并发挥抗肿瘤的功效[16]。然而在临床研究中，关于全反式维甲酸和顺式维甲酸的确切机制只有较少报导，是否有某种特殊形式的维甲酸能够在联合化疗中使GSCs对细胞毒治疗致敏将是今后研究的热点问题。

2.3 放疗敏感性

胶质瘤对放化疗敏感性较差，GSC细胞通过DNA损伤检验点系统以及DNA修复能力，从而具有一定的放化疗抵抗能力。与CD133阴性细胞相比，CD133阳性GSCs无论在体内还是体外的放射线环境下都能较强的存活[17]。CD133+细胞能更有效地修复放射引起的DNA损伤，Chk1和Chk2 (细胞周期检测点激酶) 的特异性抑制剂能够逆转这种放射抗性。在GSCs领域研究DNA损伤检验点系统的反应或许能够提供一个可行的治疗方案。

2.4 GSC微环境 (niche)

niche是指干细胞周围的细胞和外部信号构成的特定的微环境，这个微环境维持着干细胞的特性，为干细胞的自我更新提供了合适的外部条件，并且抑制干细胞向成熟细胞的分化。与非干细胞样胶质瘤细胞相比，GSCs分泌高水平的VEGF (血管内皮生长因子) ，具有很强的促血管生成作用。这说明GSC与血管环境是相互依赖的。

贝伐单抗是一种抗VEGF抗体，能够有效的对抗血管形成，研究证实其能够阻止血管形成和GSC源性的异种移植物的生长。然而它对非GSC源性的异种移植物只有有限的功效。FOLKINS等[18]在细胞毒治疗中联合使用一种抗VEGF受体的抗血管形成治疗，结果GSC细胞明显减少，然而单独的抗血管形成的治疗却难以达到如此效果，说明微环境的破坏能够使GSCs对化疗敏感。

2.5 溶瘤病毒治疗

溶瘤病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制，造成细胞病理效应和机体免疫反应从而导致肿瘤细胞的裂解死亡，同时对正常细胞和组织却没有作用或影响较小。Delta-24-RGD是一种溶瘤腺病毒，它能选择性的进入肿瘤细胞内，通过Rb通路进行复制，尤其是在胶质瘤细胞中。使用Delta-24-RGD治疗脑内荷瘤大鼠，生存期明显延长。

2.6 粘附分子抑制

L1CAM是一类神经细胞粘附分子，属于免疫球蛋白超家族中的一员，它能够调节神经细胞的生长，生存，迁移，以及轴突的生长和神经突的伸展，在胶质瘤细胞以及其它肿瘤细胞中高度表达，因此可作为细胞表面靶的。L1ACM主要在CD133+胶质瘤细胞中表达，在CD133-中呈阴性。针对L1CAM的慢病毒sh RNA能阻止CD133+GSCs生长，干扰神经球的形成，诱导其凋亡[19]。

3 结语

胶质瘤细胞 篇7

关键词：人脑胶质瘤,细胞,培养的,细胞培养/方法

在中枢神经系统肿瘤中,以胶质瘤的发生率为最高,在国内占35.26%～60.96%(平均44.69%),国外也类似这个比例[1]。目前胶质瘤的治疗仍以手术切除为主,辅以放疗、化疗等综合治疗,但总体疗效仍不满意,复发率高,预后差。

恶性增长的胶质瘤细胞是致病的根源,良好的胶质瘤细胞体外培养模型的建立是研究肿瘤致病机制、抗肿瘤药物的敏感性、肿瘤细胞的分子生物学特性的重要手段。我们分别采用组织块培养法和酶消化法进行胶质瘤细胞的原代培养,比较两种方法的培养成功率,探索建立人脑胶质瘤细胞体外培养模型的适宜方法。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集我院神经外科2007年6月-2008年6月的胶质瘤患者新鲜手术标本16例进行细胞培养,所有标本均经术后病理确诊。16例患者中,男12例,女4例,年龄范围13岁～66岁,平均年龄38.6岁。按照2000年WHO有关神经系统肿瘤分类方法对肿瘤进行分级,其中Ⅰ～Ⅱ级有9例,Ⅲ级4例,Ⅳ级3例。

1.2 主要实验仪器与试剂

医用净化工作台(SW-CJ-2FD),苏州安泰空气技术有限公司;CO2培养箱(1815TC),SHEL-LAB;倒置显微镜(COIC XDS-1B),重庆光电仪器有限公司;低速离心机(LD5-2A),北京医用离心机厂;手术器械(眼科剪、镊子等,经高压消毒);四季清胎牛血清,杭州四季青生物公司;DMEM培养基,Hy Clone公司;胰蛋白酶,SIGMA公司。

1.3 人脑胶质瘤细胞原代培养

1.3.1 组织块法原代培养

在无菌条件下取我科手术切除的神经胶质瘤组织(术前诊断),放入过酸并经高压蒸汽消毒的无菌瓶中,同时用注射器加注适量PBS液,尽快送实验室。在超净工作台上,手术标本放入无菌培养皿中,加入PBS液,反复清洗,尽量洗净标本上的血渍、手术中电刀和双极电凝所烧焦的组织。用眼科镊子、剪刀等器械,在培养皿中把新鲜肿瘤组织尽可能分离成0.5 mm3～1 mm3的小块后,加入1～2 ml细胞培养液,用吸管轻轻吹打,使组织块悬浮。用吸管分次吸取组织块悬液,使其均匀排在培养瓶底壁上,加入2～3 ml培养液(要能淹没组织块),放入37℃5%CO2的孵箱中箱内,次日在倒置显微镜下观察组织块是否贴壁,并更换培养液。每天观察组织块周边细胞生长情况,视情况更换培养液。

1.3.2 酶消化法原代培养

将无菌条件下取的新鲜人脑胶质瘤组织送至实验室,PBS液清洗,用眼科镊子、剪刀在培养皿中把新鲜肿瘤组织尽可能分离成1 cm3的小块,然后用小吸管或者眼科镊子小心移入15 ml无菌离心管里,在离心管中加入0.25%胰酶约4～5 ml,然后封口,轻轻振荡15 min,观察离心管中液体的透明度,可见液体逐渐变得浑浊,而管内的组织块则逐渐减小。然后,1 500转/min离心5 min,用小吸管移去上层清液,然后加入含10%胎牛血清的DMEM8～10 ml,用小吸管轻轻吹打,然后静置5 min。用小吸管把上层的DMEM液(含有消化下的肿瘤细胞)小心移入培养瓶中,然后补加入至适量的DMEM液。把培养瓶放置37℃5%CO2的孵箱中,次日在倒置显微镜下观察肿瘤细胞是否贴壁,并更换培养液。若培养瓶中红细胞较多,可用PBS液小心清洗1～2次,然后再加注含10%胎牛血清的DMEM液适量。以后每天观察细胞生长情况,每2 d～3 d更换1次培养液。

1.4 原代细胞的传代

待细胞长满瓶底后,倒去旧培养液,用PBS液清洗1遍,移去PBS液,加入0.25%胰酶1～2 ml,盖上培养瓶盖,轻轻拍打震荡,同时在倒置显微镜下观察,待镜下见细胞全部从瓶底上消化下来时,在培养瓶中加入含10%胎牛血清的DMEM8～10 ml,然后把瓶中的液体移入离心管中。经计数板镜下计数,调节细胞密度至5×104个/cm2,接种于25 cm2培养瓶中传代培养。

1.5 胶质瘤细胞的定性

对培养成功的肿瘤细胞进行细胞爬片后,利用细胞免疫组化检测胶质酸性蛋白(GFAP)的表达,结果全为阳性表达,结合其病理诊断的依据,证明所培养的细胞即为胶质瘤细胞,阴性对照采用PBS液代替GFAP一抗(见图1、图2)。

1.6 原代培养细胞生长曲线的测定

细胞计数法:取对数生长期细胞,调细胞浓度为3×105/ml接种于24孔培养板,37℃5%CO2常规培养7 d,每天取1组(3个平行孔)细胞,消化后计数。实验重复3次,取均数绘制细胞生长曲线。

2 结果

2.1 人脑胶质瘤细胞原代培养细胞的形态学

肿瘤细胞异形性明显,细胞核大小不一呈圆形或椭圆形,核染色较深,核分裂象易见,病理确诊为星形细胞瘤(见图3)。经胰酶消化的肿瘤细胞最初呈圆形,分散悬浮于培养液中,细胞悬液培养4 h,即见细胞贴壁,呈椭圆形,24 h后见细胞伸展,48 h～96 h后细胞增殖旺盛。肿瘤细胞形态多样,大小不一,以梭形为主,间有三角形、多角形及不规则形,细胞突起较小。细胞核大小差别较大,多呈椭圆形,位于细胞中央或偏位(见图4)。

2.2 原代培养细胞的生长曲线

培养成功的原代胶质瘤细胞,增殖较快,传代后的细胞生长旺盛,状态良好,性状稳定,测细胞的生长曲线,有明显的对数生长期(见图5)。

2.3 人脑胶质瘤细胞原代培养结果

本实验共收集新鲜人脑胶质瘤标本16例,均采用组织块和酶消化两种培养方法。结果组织块培养法成功率较低为43.8%,而酶消化培养法成功率明显增高为87.5%,恶性程度高的胶质瘤培养成功率较高,而恶性程度低的胶质瘤则培养成功率低(见表1)。

3 讨论

胶质瘤原代培养是指从直接取自患者的肿瘤组织开始的培养。应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点:可以长时间直接观察细胞的形态结构和生命活动;研究的条件可以人为控制;研究的样本比较均一;研究的内容便于观察、检测和记录;可以用于许多领域的研究;相对而言比较经济。但是它也有缺点,如长期培养可使细胞生物学特性发生改变;体外实验所得的结果不能完全代表体内的情况,应与体内试验结合研究更为合理等。目前,国外早已开始进行人脑胶质瘤细胞原代培养的研究[2,3],其中以胶质母细胞瘤的培养最多[4,5,6],而国内则研究较少。

目前常用的肿瘤细胞原代培养有两种方法,一种是组织块法,另一种是酶消化法。组织块法是将培养的组织剪切成小块后,直接接种于培养瓶的方法;酶消化法是通过酶消化液把已剪切成小块的组织进一步松散,直接获得细胞进行培养的方法。我们分别采用组织块培养法和酶消化法对人脑胶质瘤细胞进行原代培养,分析比较两种方法在脑胶质瘤原代培养中的实验结果,总结出胶质瘤原代培养中应注意的问题。

3.1 人脑胶质瘤细胞的取材方法

(1)取术后新鲜标本,要尽早浸入无血清培养液保鲜,尽快进行培养。尽可能去除血渍、电灼及坏死组织,避免细菌、霉菌污染,可在培养前用含两性霉素B 2μg/ml,青霉素200～1 000 U/ml,链霉素500μg/ml的培养液浸泡标本10 min～20 min,用洗液反复冲洗干净后,再做培养。(2)应尽量选择术前未行放疗和化疗的标本,因为放、化疗抑制了胶质瘤的生长,培养成功率低。(3)培养材料应取自胶质瘤细胞集中、活力较好的部分。(4)培养效果与胶质瘤的恶性程度密切相关。不论采用组织块培养法还是酶消化法,恶性程度高的胶质瘤培养效果均明显高于恶性程度低的胶质瘤。

3.2 人脑胶质瘤细胞培养过程中应注意的问题

(1)培养过程中的各个环节均应注意防止细菌和霉菌污染,一旦发现细胞被污染,应及时丢弃,防止污染扩大。(2)选择合适的培养基。我们采用的是10%胎牛血清DMEM培养基,培养效果较好。(3)定期观察细胞,及时更换培养液。(4)原代培养细胞需要较长时间(通常24 h～96 h或更长时间)才能恢复增殖活性。我们在培养中发现,脑胶质瘤的潜伏期约为48 h,对数生长期一般为5 d,以后进入停滞期,细胞的倍增时间因肿瘤恶性程度不同而有所差异。当胶质瘤细胞没有生长到足够的量时,应耐心等待,坚持换液,不要急于传代。

3.3 人脑胶质瘤细胞培养方法的选择

胶质瘤细胞原代培养的效果与培养方法的选择密切相关。我们的实验结果显示,组织块培养法成功率较低为33.3%,而酶消化培养法成功率明显增高为83.3%。表明人脑胶质瘤原代培养,酶消化法要明显优于组织块培养法。组织块培养法虽然操作环节少,需要组织量小,但组织块培养法中组织贴壁率较低,导致原代培养的成功率低。酶消化培养法虽然培养成功率和细胞产量较高,但也有步骤繁琐、易污染和需要组织量大的缺点。实际应用中应根据不同的实验目的、实验条件来选择。

我们的实验分别采用组织块培养法和酶消化法对人脑胶质瘤细胞进行了原代培养,结果酶消化法要明显优于组织块消化法,且成功率较高,通过形态学观察等确定细胞的形态特点;测定了原代培养细胞的生长曲线,研究体外培养细胞的生长特性。生长曲线显示,人脑胶质瘤体外原代培养细胞在一定时间内增殖活跃,状态稳定,有明显的对数生长期,可以建立体外培养模型。为我们从细胞水平上研究肿瘤细胞的结构与功能,从基因及分子水平上研究癌变的发生机制,以及快速筛选抗肿瘤药物和研究耐药机制提供了更好的方法和途径。

参考文献

[1]王忠诚.王忠诚神经外科学[M].武汉:湖北科学技术出版社.2005,512

[2]Gerlach B,Harder AH,Hulsebos TJ,et al.Radio sensitivity and TP53,EGFR amplification and LOH10analysis of primaryglioma cell cultures[J].Strahlenther Onkol,2002,178(9):491～496

[3]Harland J,Papanastassiou V,Brown SM.HSV1716 persistence in primary human glioma cells in vitro[J].Gene Ther,2002,9(17):1194～1198

[4]Das A,Tan WL,Teo J,et al.Expression of Survivin in primary glioblastomas[J].J Cancer Res Clin Oncol,2002,128(6):302～306

[5]Laerum OD,Nygaar SJ,Steine S,et al.Invasiveness in vitro and biological markers in human primary glioblastomas[J].J Neurooncol,2001,54(1):1～8

胶质瘤细胞 篇8

Singh等[4]报道了应用液体无血清神经干细胞 (neural stem cell, NSC) 培养基从胶质瘤和髓母细胞瘤中分离出具有NSC性质的肿瘤细胞, 并证实其为胶质瘤干细胞 (glioma stem cell, GSC) 。近年来研究表明, GSC的存在可能是脑肿瘤耐药的主要原因。本研究根据这一理念以及国内外的资料, 从胶质瘤中分离培养GSC, 并从化疗敏感性分析的角度出发, 探求GSC与胶质瘤细胞化疗敏感性的差异。

1 材料与方法

1.1 材料

胶质瘤细胞株SHG- 44、U251、U87MG购自上海细胞库, DMEM培养基、DMEM/F12 (1 ∶1) 培养基、B27添加剂、胰酶购自Gibco公司, 人表皮生长因子 (EGF) 、人碱性成纤维生长因子 (bFGF) 购自PeproTech公司, 逆转录试剂盒购自美国Promiga公司, Taq酶购自日本TaKaRa公司, CCK8购自碧云天公司, 顺铂 (cisplatin, CDDP) 购自齐鲁制药厂, 长春新碱 (vincristine, VCR) 购自广州明兴制药厂。

1.2 方法

1.2.1 3株胶质瘤细胞的培养和传代

3株胶质瘤细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基, 置于在37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中, 2～3 d后按1 ∶2的比例传代。

1.2.2 分离提取GSC和传代

待胶质瘤细胞长至瓶底的80%后消化离心, 换成含2μg·ml-1EGF、bFGF及2%B27添加剂的DMEM/F12培养基, 隔日待培养基中悬浮的单克隆细胞呈团状、体积较大后, 弃去瓶底的贴壁细胞并离心后半量换液, 培养4～5 d后吹打成单细胞悬液, 按1 ∶2传代。

1.2.3 扫描电镜观察GSC

收集第3次传代3～4 d后的3株GSCs, 以1 000 r·min-1离心5 min, 弃上清得细胞沉淀物, 用0.1 mmol·L-1的PBS冲洗5 min×3次, 2.5%戊二醛室温固定30 min, 0.1 mmol·L-1的PBS漂洗5 min×3次, 1%锇酸固定1.5 h, 0.1 mmol·L-1的PBS漂洗, 然后50%、70%、90%、100%丙酮逐级脱水。醋酸异戊酯置换, 临界点干燥仪干燥, 镀膜, 扫描显微镜观察。

1.2.4 GSC的鉴定

收集106的3种GSCs, 采用RT- PCR法检测胶质纤维酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein, GFAP) 及CD133的表达。所用的引物为:GFAP上游5′- CGAAGC CAACGACTACCG- 3′, 下游5′- TCTTCACCACGATGTTCCTC- 3′ (产物395 bp) ;CD133上游5′- AGT GAGAAAGTGGCATCG- 3′, 下游5′- CCTTGTAGACCCAGAAACTA- 3′ (产物302 bp) ;β- actin上游5′- TATGACTTAGTTGCGTTACACC- 3′, 下游5′- CCTTCACCGTTCCAGTTT- 3′ (产物155 bp ) 。按试剂说明书加样, 进行热循环扩增, 反应条件为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s, 50 ℃ (以引物后退火温度为准) 复性45 s, 72 ℃延伸1 min, 循环35次;72 ℃延伸10 min。取10 μl扩增产物与2 μl 6×loading缓冲液混合后, 在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳, 柯达UV- 2000紫外分析仪观察和扫描分析。

1.2.5 细胞活性CCK8检测

选取对数生长期3株胶质瘤细胞及其干细胞接种于96孔板, 每孔100 μl, 8 000 个·ml-1, 培养12 h, 弃去培养基, 用无血清培养基洗2遍, 加入含5%胎牛血清培养基配制的药物CDDP和VCR, CDDP的浓度依次为0.005、0.05、0.5、5、50 μmol·L-1, VCR的浓度依次为1、5、10、50、100 ng·L-1, 各加100 μl, 并设置空白对照组及阴性对照组, 每组设4个平行孔。药物处理24及48 h后, 每孔加入CCK8 10 μl, 继续培养2 h, 用酶联检测仪于450 nm波长处测定每孔OD值, 计算细胞生长抑制率。抑制率 (%) =[1- (实验组-空白组) /对照组]×100%。

1.3 统计学处理

全部统计资料均用单因素方差分析, P<0.05表示差异有统计学意义, 由SPSS 16.0统计软件包进行分析。

2 结果

2.1 GSC细胞球的形成

更换干细胞培养基后, 大部分细胞成单细胞悬浮状态, 24 h内有一部分细胞贴壁;另一部分细胞发生非特异性聚集, 形成形状不规则的细胞团, 悬浮于培养基中, 培养基显得浑浊。24～48 h后显微镜下开始有大小不一的球状细胞团形成, 悬浮于培养基中, 但仍有一部分贴壁细胞;弃去贴壁细胞, 离心, 半量换液后继续培养, 48 h后形成较大的细胞团, 多为圆形或卵圆形;晃动培养瓶时可见细胞球滚动;细胞球由上百个细胞构成, 球内细胞呈圆形, 大小不一, 相差显微镜下透亮、折光性较强, 此时形成的细胞球可称GSC球;同时培养基中仍存在大量悬浮的单细胞和一些形状不规则的非特异性聚集细胞, 但较接种明显减少 (图1) 。

2.2 传代后肿瘤干细胞

GSCs一般4～5 d可以传代, 当GSCs的数量逐渐增多、体积增大后即可传代。传代后的GSCs与原代GSCs比较, 形状与原代相似, 但更为规则, 细胞球内的细胞形态与原代无异, 培养基中悬浮单细胞、细胞碎屑及非特异性聚集的细胞团较原代减少。当培养至14 d后, 细胞团开始变黑, 凋亡增加。

2.3 扫描电镜观察结果

扫描电镜下可见GSCs呈圆形或椭圆形, 大小中等, 均匀一致, 众多细胞互相靠近, 细胞表面褶皱较多, 突起较短小且较少, 见图2。

2.4 GSCs的鉴定

用RT- PCR法分析3株GSCs中GFAP及CD133表达情况 (图3) , GSCs基本不表达GFAP, 高表达CD133 (图4) 。

2.5 CCK8检测细胞活性结果

不同浓度CDPP对3株胶质瘤及其干细胞有抑制作用, 其对细胞抑制率随作用时间的延长和浓度上升而增高 (图5) , 但胶质瘤细胞组抑制率明显高于GSC组 (P<0.05) 。

不同浓度VCR对3株胶质瘤及其干细胞有抑制作用, 其对细胞抑制率随作用时间的延长和浓度上升而增高 (图6) 。普通胶质瘤细胞组抑制率明显高于GSC组 (P<0.05) 。

3 讨论

脑胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤, 由于脑组织功能的特殊性, 手术难以扩大切除范围。因此化疗是脑胶质瘤治疗的重要环节, 可进一步杀灭残留肿瘤细胞, 对手术后复发的肿瘤起到很重要的作用, 但其效果很不理想, 相当一部分胶质瘤对化疗药物耐药, 严重影响化疗效果。原因除了有血脑屏障存在使药物很难进入神经系统外, 最新研究发现, 脑肿瘤中存在具有自我更新特性的细胞亚群即GSC, 是引发肿瘤并维持其生长的根源, 并在肿瘤的复发过程中起着决定性作用[2]。作为肿瘤干细胞的一类, GSC与其它实体肿瘤干细胞以及造血系统肿瘤干细胞相同, 是肿瘤组织中一个特殊的细胞亚群。它们具有以下特点: (1) 它只占全部肿瘤细胞的一部分, 甚至很小的比例; (2) 具有其他肿瘤细胞所不具备的无限增殖能力, 能够自我复制以达到数量的扩增, 能够在体外培养中形成单细胞克隆并生长、传代; (3) 具有不同于分化细胞的特殊表型; (4) 具有多向分化的能力, 能够分化产生肿瘤组织中其它细胞亚群; (5) 具有致瘤能力。本实验主要证明了前3点。GSC虽然在脑肿瘤细胞中只占极少数, 但它是脑肿瘤发生、耐药、复发及转移的根源[5]。本实验采用Singh无血清培养基法体外培养出GSC。B27添加剂含有多种神经细胞生长所需的营养物质, 是NSC培养中最常用的培养基添加剂之一[6], EGF和bFGF对GSC具有强大的促有丝分裂性, 在GSC增殖过程中发挥重要作用。

目前主要利用已知的神经干细胞表面标志物 (如CD133) 对GSC进行分离和鉴定。CD133是一个单拷贝基因产物, 该基因位于4号染色体 (4p15) , 包含37个外显子;CD133糖蛋白是细胞表面蛋白超家族中的一员, 相对分子质量为117 000。CD133的一个显著特点就是, CD133的表达随着细胞的分化迅速下调, 使它成为一个独特的分离和鉴定干细胞和祖细胞的分子标志[7]。2003年Singh等[4]以CD133为分子标志从一系列脑肿瘤分离出肿瘤干细胞。CD133+细胞有显著的增殖能力, 自我更新能力和分化能力, 将100个CD133+细胞接种到重症联合免疫缺陷 (nonobese diabetic/severe combined immunodeftcient, NOD/SCID) 小鼠脑组织中即可形成肿瘤, 且与患者原发肿瘤表型相同;而将1×105个CD133- 细胞接种NOD/SCID小鼠后仅能在注射部位形成一条胶质瘢痕。随后Hemmati等[8]在小儿脑部肿瘤的研究中也得出了相似的结果。GFAP为位于细胞质和细胞突起的中间丝蛋白, 被认为是星形胶质细胞及其发生肿瘤的最佳特征性标记物[9]。本实验结果表明, GFAP在星形胶质瘤中表达阳性, 却不表达于GSC中, 与Singh等的研究结果[4]一致。

CDDP属细胞周期非特异性药物, 主要作用靶点为DNA, 作用于DNA链间及链内交联形成DDP- DNA复合物, 干扰DNA复制, 进而诱导凋亡发生, 是治疗胶质瘤的常用药物[10]。本实验中用不同浓度CDDP干预胶质瘤细胞及其干细胞, CCK8法检测细胞活性结果提示, CDDP对3株胶质瘤细胞均有不同程度的细胞毒作用, 药物作用24及48 h后, 3株细胞对药物的敏感性为U251

胶质瘤细胞 篇9

细胞疗法的目标是要在体内形成新的细胞以治疗疾病。两年前, 隆德大学的研究人员就对人类皮肤细胞 (成纤维细胞) 进行重编程, 使其直接变身为可产生多巴胺的神经细胞, 从而绕过了干细胞这一中间阶段, 当时这在世界上尚属首次。现在, 该小组又证实, 皮肤细胞和支持细胞都有可能直接在大脑中重编程为神经细胞。

研究人员使用一种被设计过的基因, 可通过药物激活或使其失活。这种基因被插入两种类型的人类细胞中:成纤维细胞和神经胶质细胞, 后者是自然存在于大脑中的支持细胞。随后, 研究人员将细胞移植进大鼠的大脑, 并在大鼠的饮用水中加入药物将基因激活。结果发现, 这些细胞开始向神经细胞转化。

在另一项实验中, 研究人员向小鼠大脑内注入同样的基因后, 也成功将小鼠自身的神经胶质细胞重新编程成为神经细胞。“这一发现是首个表明其他细胞有可能在大脑内经过重编程而转化为神经细胞的重要证据。”研究小组负责人马林·帕尔马说。

他表示:“研究结果有望开辟一条途径, 为将来的细胞疗法植入物找到替代品, 从而扫除以前遭遇的研究障碍, 比如难以让大脑接受外来细胞, 以及易形成肿瘤的风险等。”在大脑中直接对细胞重编程的新技术开启了新的可能性, 为更有效地替换帕金森氏症等患者已经死亡的脑细胞创造了条件。

“我们正在对这项技术进行开发, 以便用它来创建新的神经细胞, 取代受损细胞的功能。能够在体内进行重新编程也就意味着可以设想, 未来我们可以直接在人类大脑中形成新的细胞, 而无需绕行细胞培养和移植这条弯路。”帕尔马说。

这项研究让人们展开想象:其他细胞可以重新编程直接转化为神经细胞, 那么是否也可以转化为肌肉细胞、肝细胞等其他细胞?既然细胞可以实现转化, 那么转化细胞能否形成组织, 继而组成器官?尽管想象难以在短时间内成为现实, 但积跬步以至千里, 我们相信对细胞这一生命基本单位的这类研究必将成为揭开生命奥秘、改造生命和征服疾病的关键。