胶质瘤干细胞（精选10篇）
胶质瘤干细胞 篇1
摘要：目的观察胶质瘤细胞在体外培养条件下对神经干细胞是否有诱导迁移的作用。方法①从新生1～2dSD大鼠脑皮层分离培养神经干细胞,进行神经干细胞及其增殖能力鉴定。②胶质瘤细胞与神经干细胞限定区域联合培养,观察神经干细胞的生长及其形态学变化。结果①所获得神经细胞球Nestin染色阳性,传代神经细胞球抗BrdU染色阳性。②可观察到神经干细胞球周围长出细胞突起,在靠近胶质瘤细胞的一侧,细胞突起的密度及长度均大于其他方向上的突起并且可见部分干细胞向胶质瘤细胞方向的移动。结论胶质瘤细胞在体外对神经干细胞有诱导迁移作用。
关键词：神经干细胞,胶质瘤细胞,细胞培养,细胞迁移
自从神经干细胞成功分离,为中枢神经系统疾病治疗上存在的诸多问题的解决提供了可行办法。但是,如何使移植神经干细胞准确有效的迁入其所需部位并分化是近年神经科学工作者所关注的一个热点。本实验通过研究胶质瘤细胞在体外对神经干细胞的迁移诱导作用,为将来神经干细胞的临床应用奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
SD大鼠由南通医学院实验动物中心提供,C6细胞株购自中科院上海细胞所,5-BrdU购自NEOMARKERS公司,Mouse Anti-Nestin IgG1购自CHEMICON公司,Mouse Anti-BrdU IgG1为NEOMARKERS公司产品。
1.2 方法
1.2.1 神经干细胞培养及传代
选用1～2d的SD大鼠,碘伏消毒后,在超净台下解剖暴露两侧大脑半球及小脑,取少许两侧大脑皮层组织,大小约1mm3,放入DMEM F12培养基洗涤两遍,尽量将组织剪碎;将皮层组织转移至10mL玻璃离心管并加入6～8mL DMEM/F12培养液,用毛细吸管将皮层组织机械分离成单细胞悬液,筛网过滤,离心(500r/min)5min,弃上清液并用bFGF2、B27、D MEM/F12培养基定容,细胞记数。按25cm2培养瓶中接种1×106个/4mL进行接种。将培养瓶放入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养,5～7d原代神经细胞球形成。3～4d更换培养液。
将原代神经球吹打制成单细胞悬液,接种至含Brdu(浓度为5μmol/L)的bFGF2、B27、DMEM/F12培养液中培养5～7d即可形成次代神经球。换液同前。
1.2.2 Nestin和Brdu免疫荧光检测
Nestin免疫荧光检测:(1)贴壁:将培养的原代神经细胞球吸出,接种至置于24孔培养板内的盖玻片(多聚赖氨酸包被),放入37℃、5%CO2培养箱培养2h,使神经细胞球贴壁。(2)固定:吸去培养液加入4%多聚甲醛少许,室温下固定30min,去除固定液,PBS洗涤3次,每次10min。(3)封闭:用含10%羊血清、0.3%Triton-100的0.01mol/L PBS液在37℃条件下孵育封闭10min。(4)检测:加一抗(小鼠抗Nestin IgG1按1∶500倍稀释),放入4℃冰箱过夜,吸去一抗,洗涤同前。再加入二抗(FITC标记的羊抗小鼠IgG,按1∶150倍稀释),避光,在37℃水浴箱内孵育30min,吸去二抗,洗涤同前。(5)观察记录:在激发光波长为490nm,滤色光波长为520nm的共聚焦显微镜下观察照相(图1)。
Brdu免疫荧光检测:(1)贴壁;(2)固定;(3)封闭。方法同Nestin检测。(4)检测:一抗为小鼠抗Brdu IgG1(按1∶1000倍稀释),二抗为FITC标记的羊抗小鼠IgG(按1∶200倍稀释),余操作同前。(5)观察记录(图2)。
1.2.3 胶质瘤细胞与神经干细胞联合培养
将C6胶质瘤细胞、神经干细胞分别接种在置于6孔培养板内的半圆盖玻片上(多聚赖氨酸已包被),用无血清培养基培养2～4h使细胞贴壁,将胶质瘤细胞所贴壁的盖玻片与神经干细胞贴壁的盖玻片一起放在24孔培养板培养,并设空白对照,观察神经干细胞的生长及其形态学变化(图3)。
2 结果
2.1 Nestin和Brdu免疫荧光检测
Nestin-FITC,Common Focus(20×)
图片左侧为:C6胶质瘤细胞,图片右侧为:神经干细胞球
Nestin即巢蛋白,是一种仅存于神经上皮干细胞的中间丝成分,可作为神经干细胞的标志物。我们通过免疫荧光检测,发现神经球内的几乎所有细胞均呈Nestin阳性。从而证明我们培养的细胞球是神经干细胞球。
5-BrdU免疫荧光检测:5-BrdU即5-溴-2脱氧尿苷,它是胸腺嘧啶核苷的替代品。在细胞分裂的DNA合成前期,可以作为底物结合到新合成的DNA中,从而可验证神经干细胞的增殖能力。我们将用含5-BrdU的培养液培养形成的次代神经细胞球进行抗-BrdU免疫荧光检测显示,绝大多数细胞呈BrdU阳性。
2.2 C6细胞与神经干细胞联合培养
C6细胞和神经干细胞联合培养,可观察到神经干细胞分化,长出细胞突起,神经细胞球周围的细胞突起的密度及长度在各个方向上有明显的差异,在靠近胶质瘤细胞的一侧,突起的密度及长度均大于在其他方向上的突起,并且可见部分干细胞向胶质瘤细胞方向移动了。
3 讨论
3.1 神经干细胞培养及鉴定
自1992年Reynolds等[1]首先报道自成年小鼠纹状体分离培养出能在体外不断增殖,具有多种分化潜能的神经干细胞以来,对神经干细胞的研究便成为热点。后来的研究又在海马齿状回、脊髓、隔区、纹状体的实质及人的大脑内均成功分离出神经干细胞[2,3,4]。近年,分离、培养干细胞的技术日臻成熟。从实验用神经干细胞获取的角度看,从胎脑的纹状体区和海马齿状回容易获得,但对动物和取材技术要求较高。用成熟大鼠取材对培养技术和培养基要求又较高,不易存活。我们从新生大鼠大脑皮层分离培养出了具有分裂增殖能力的神经干细胞,在体外培养条件下形成典型的神经细胞球。Nestin免疫荧光染色为Nestin阳性,并通过5-BrdU免疫荧光染色证实这些细胞具有分裂增殖能力。说明新生大鼠皮层可培养出神经干细胞。我们的体会是从新生大鼠皮层分离培养神经干细胞有实验动物容易获得、取材简单、一次可获得大量干细胞和干细胞易成活的优点。
BrdU-FITC,Common Focus(20×)
3.2 胶质瘤细胞和神经干细胞共培养
Qu等[5]将神经干细胞注入2岁大鼠的侧脑室,发现神经干细胞在鼠脑内出现对称性迁移并分化成神经元和胶质细胞;Corbin等[6,7]研究发现,神经元有两种不同的迁移方式,即放射状迁移和正切迁移。这些研究提示,在成年人脑内可能有特定的诱导神经干细胞迁移的机制和信号物质。Kim等[8]的研究初步证明了这一点,他们发现端脑的GABA类联络神经元和小脑的谷氨酸类神经元分泌至细胞外基质的一种名为Reelin的糖蛋白,在神经干细胞的迁移中起重要作用。更有趣的是,Karen等[9]发现将神经干细胞移植至有移植胶质瘤生长的鼠脑内,神经干细胞很快充满肿瘤,并沿着浸润的肿瘤细胞而分布,即使将神经干细胞接种在肿瘤的远隔部位,甚至把神经干细胞接种在对侧大脑半球和侧脑室,它们也可穿过正常脑组织移行入胶质瘤。这说明胶质瘤的生长环境中或胶质瘤细胞本身存在着引导神经干细胞迁移的信号物质。假设胶质瘤细胞产生这种信号物质,那么在体外培养的胶质瘤细胞也应该有这种作用,如果我们能证实这种作用,即说明胶质瘤细胞中存在引导神经干细胞迁移的物质。于是,我们首先设计了限定区域共培养的方法在体外培养条件下观察神经干细胞的生长及其形态学变化。在实验中,我们从形态学方面观察到与胶质瘤细胞共培养的神经干细胞出现迁移和分化现象,具体作用机制还有待进一步研究。但该研究已初步说明在体外培养条件下胶质瘤细胞具有诱导神经干细胞迁移作用。从而为进一步研究胶质瘤细胞诱导神经干细胞迁移的机制,并为神经干细胞应用于临床,提高脑及脊髓损伤、胶质瘤和中枢神经系统退行性疾病的治疗效果奠定了一定的基础。
参考文献
[1]Reynolds BA,Weiss S.Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system[J].Science,1992,255(5052):1707-1709.
[2]Temple S,Alvarez-Buylla A.Stem cells in the adult mammalian central nervous system[J].Curr Opin Neurobiol,1999,9(1):135-141.
[3]Doetsch F,Alvarez-Buylla A.Network of tangential pathways for neuronal migration in adult mammalian brain[J].Proc Natl Acad Sci USA,1996,93(25):14895-14900.
[4]Eriksson PS,Perfilieva E,Bjork-Eriksson T,et al.Neurogenesis in the adult human hippocampus[J].Nat Med,1998,4(11):1313-1317.
[5]Qu T,Brannen CL,Kim HM,et al.Human neural stem cells improve cognitive function of aged brain[J].Neuro Report,2001,12(6):1127-1132.
[6]Corbin JG,Nery S,Fishell G.Telencephalic cells take a tangent:non-radial migration in the mammalian forebrain[J].Nat Neurosci,2001,4(Suppl):1177-1182.
[7]Marin O,Rubensiein JL.A long,remarkable journey:tangential migration in the telencephalon[J].Nat Rev Neurosci,2001,2(11):780-790.
[8]Kim HM,Qu T,Kriho V,et al.Reelin function in neural stem cell biology[J].Neurobiology,2002,99(6):4020-4025.
[9]Karen S,Aboody,Alice Brown,et al.Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain:Evidence from intracranial gliomas[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,97(23):12846-12851.
胶质瘤干细胞 篇2
目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSCs)在体外诱导为神经源性细胞的可行性,并探讨其作用机制. 方法从Wistar大鼠骨髓中获得rMSCs.纯化培养传代后用不同浓度的`bFGF诱导,经MTT法检测bFGF对rMSCs生长的影响;用倒置光显微镜、透射电镜、免疫组化和RT-PCR等方法鉴定诱导后细胞行为改变与snail mRNA表达.结果 bFGF对rMSCs具有促增殖作用,在倒置光显微镜和透射电镜下可见到有神经胶质样细胞形成, 免疫组化证明GFAP的表达较对照组显著增高(P<0.01).RT-PCR结果表明,诱导组细胞snail mRNA明显表达.结论 bFGF促进rMSCs转分化为GFAP阳性的神经胶质样细胞,转录因子Snail可能与转化过程有关.
作 者：陈莉 买霞 扎拉嘎胡 陈小义 徐瑞成 CHEN Li MAI Xia ZHA La-gahu CHEN Xiao-yi XU Rui-cheng 作者单位：中国人民武装警察部队医学院,细胞生物学教研室,天津,300162 刊 名：解剖科学进展 ISTIC英文刊名：PROGRESS OF ANATOMICAL SCIENCES 年，卷(期)：2008 14(3) 分类号：Q257 R392.2+1 关键词：骨髓间充质干细胞 碱性成纤维细胞生长因子 细胞分化 Snail 大鼠★ 细胞分化人教版教学设计
胶质瘤的“照妖镜” 篇3
胶质瘤是一种最常见的原发颅内肿瘤，世界卫生组织把它分成四级，级数越高，恶性程度也越高。而且，胶质瘤发病于中枢神经系统，其恶性进展往往伴随运动、语言、感觉等多种功能受损，会影响到患者以后的生活和生存质量。
目前，临床上胶质瘤手术治疗切除的范围为肿瘤影像学显示的边界，但一般的影像学显示比较难于精确分辨肿瘤边界与功能区之间的位置关系，手术后一般需要辅以放疗、化疗和生物治疗等综合治疗。约80%的胶质瘤复发病灶在原发灶周围2厘米之内，是影响胶质瘤患者生存率的一大障碍。
医生告诉老王，胶质瘤的肿瘤组织像树的根须一样，长在正常脑组织里，手术很难彻底切除干净。如果手术中盲目扩大切除范围会导致神经功能的缺失。近年来，国际最先进的黄荧光显微镜问世，提供了一种最新的手术方法——荧光引导下脑胶质瘤切除术。胶质瘤在浸润性生长的过程中，颅内的血脑屏障遭到破坏。手术时将荧光染料由静脉途径给药，荧光染料通过破坏的血脑屏障进入肿瘤组织内，使肿瘤组织着色，从而可清楚地分辨出肿瘤组织和正常脑组织的界限，让医生能够客观实时地判断胶质瘤应该切除的准确边界，为肿瘤（特别是功能区恶性胶质瘤）最大程度的切除提供了帮助，为胶质瘤患者提供了一种新的治疗手段。目前德国、日本的神经外科已经将此技术应用于临床，我国少数医院也已经开展。
老王接受了医生的建议，决定进行手术治疗。手术中，医生先在“超级显微镜”的一般档位下切除了肿瘤组织，进行快速病理切片，报告显示为胶质瘤2级。随后，医生立即把手上的“超级显微镜”换一个档位，残存在脑组织里的胶质瘤组织立即清晰地出现在眼前，在肿瘤组织和脑组织水乳交融的地方，黄荧光显微镜像“照妖镜”一样，清晰地显示出肿瘤组织。为了不损伤功能区的神经细胞，医生把黄色肿瘤组织一点一点地清除掉，术中出血不多，但手术时间却比以往延长了一倍。
手术进行得很顺利，术后第一天，老王就能喝点稀饭了，精神也好得很，四肢活动自如，左手能够握着水杯举过头顶。十天后，老王行走自如，康复出院。
胶质瘤干细胞 篇4
1 GSCs概述
随着肿瘤干细胞的发现及其生物学特征的了解，研究者提出了肿瘤发生发展的种子是TSC的假说。应用干细胞研究技术，人们陆续从白血病 (流体瘤) 、骨髓瘤和乳腺癌 (实体瘤) 中分离获得了TSC。
2003年，SINGH等[1]从人脑肿瘤组织中成功分离出了TSC，其表现出与NSC相似的特性，这些细胞被称之为胶质瘤干细胞 (GSCs) 或胶质瘤起始细胞 (glioma-initiating cells) 。其具有以下几个特点: (1) 能自我更新，持续增殖， (2) 具有肿瘤始动能力，在免疫缺陷大鼠颅内原位移植可产生脑肿瘤， (3) 表达神经干细胞标志物， (4) 具有多向分化能力，也就是可分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞3种不同的神经细胞。GSCs的存在对肿瘤组织的持续增长起着重要的作用，它具有放化疗耐受性，肿瘤的复发被认为是由残存的肿瘤干细胞所致。因此这些干细胞也就成了肿瘤治疗的一个重要目标。
随着GSC域的加深，其中不乏各种争议。现把近年来出现的一些新看法、新认识仅列举以下: (1) 测试致瘤能力的常用方法是，将有限密度的细胞接种到NOD/SCID (严重联合免疫缺陷) 大鼠从而使其荷瘤。KELLY等[2]的实验却发现，除了肿瘤干细胞外，其他细胞也有很高的致瘤率。 (2) CD133曾被认为是GSC的一个高度特异的标志物，但不是最理想的标志物，因为CD133阴性细胞同样具有自我更新并始动肿瘤的特性，只是致瘤率非常低，并且CD133阴性细胞在适当条件下还能逆分化成CD133阳性细胞而致瘤[3]。 (3) 集落生成实验被用来评价细胞的自我更新能力，它受细胞微环境的强烈影响，ZHENG等[4]实验显示血清能够极大促进集落生成。
微环境 (niche) 能调节肿瘤干细胞的生长特性，研究表明CD133标志物能被缺氧诱导产生[5]。由于易受外界因素调节，CD133并非GSC一个稳定表达的特性。有学者认为在肿瘤细胞中存在一个亚群，它们新陈代谢能力强，在微环境的调整下能够通过不同的能量通路进行转变，当肿瘤组织内不同分化状态的细胞并存时，这些细胞将会具有去分化和增殖的能力[6]。从理论上来说，只要剩余一个肿瘤干细胞就足可以导致肿瘤的复发。因此，肿瘤干细胞是肿瘤发生发展的源泉，只有杀死肿瘤干细胞才可能成功的治愈癌症。
2 如何以GSCs为靶向
肿瘤的靶向治疗通常依赖于肿瘤细胞特异分子的表达或者是能激活某种信号能量通路，从而提供一个有针对性的治疗方案。随着快速、高效、高通量分析方法的发展，研究人员在分子水平上对阐明肿瘤干细胞的遗传特点进行了卓有成效的研究，发现了更多的特异靶点，为研发选择性杀伤肿瘤干细胞的靶向药物奠定基础，从而成为肿瘤治疗新的突破点。
2.1 信号通路
NOTCH是调节NSC自我更新和分化的一个重要通路，研究发现与非干细胞样肿瘤细胞相比，GSCs激活的NOTCH更多。FAN等[7]应用γ分泌酶抑制剂 (GSIs) 成功阻断NOTCH信号通路传导，减少了CD133+GSCs，并抑制了肿瘤的发生和生长。WANG[8]等发现阻断NOTCH通路还能够进一步增加GSCs的放疗敏感性。
磷酸肌醇3激酶 (PI3K) 通路也是一个重要通路。PI3K是一种癌基因，其编码的蛋白质产物具有磷脂酞肌醇 (phosphatidylinosito, pl) 激酶活性，在肿瘤发生、发展方面起着重要的作用。Akt也称为蛋白激酶B (PKB) ，是一种在进化上高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要位于胞浆，是PI3K的关键下游分子，可以调控转录、蛋白质合成、糖类和脂类的代谢。EYLER[9]的实验发现，小分子的Akt抑制剂能显著的减少GSC细胞的数量，抑制GSC的转移及侵袭，从而抑制肿瘤的生长。
Hedgehog传导通路在GSCs中起着重要作用，在多发性骨髓瘤和慢性髓性白血病的CSC细胞中均发现Hedgehog通路的活化。SMO是参与Hedgehog通路活化的重要中间分子，它的拮抗剂环王巴明 (cyclopamine) 可以抑制Hedgehog通路活化。BAR等[10]使用环王巴明治疗神经胶质细胞瘤和多发性骨髓瘤，发现肿瘤细胞的克隆能力明显下降。此外，另一种SMO拮抗剂GDC-0449已经完成了I期临床实验，并取得了较理想的效果。
锌指蛋白A20是NF-κB通路的调节剂，HJELMELAND等[11]发现它在胶质瘤干细胞的表达要高于非干细胞样肿瘤细胞。通过慢病毒sh RNA转染敲除A20能够减弱胶质瘤干细胞自我更新，生长和抗凋亡的能力。
WANG等[12]发现针对C-myc的慢病毒sh RNA转染能够减少GSCs的增殖，增加它的凋亡和减弱其致癌性。EZH2是Pc G (多梳基因蛋白) 基因家族的一员，它能够增加cmyc的表达，同时sh RNA介导的EZH2表达的下调，以及用s-adenosythomocystein水解酶抑制剂DZNep处理导致EZHZ蛋白表达的抑制，都能够减弱GSC的自我更新和成瘤能力。
白细胞介素6 (IL6) 通路的受体是IL6Rα和gp130。以IL6Rα或者IL6为靶的慢病毒sh RNA能在体外实验中阻止GSC的生长和神经球的形成，而在体内实验中敲除IL6Rα和IL6并且使用抗IL6抗体进行治疗能够抑制GSC诱导的肿瘤的生长[13]。
趋化因子CXCL12又称基质细胞衍生因子-1 (SDF-1) 或前B细胞刺激因子 (PBSF) ，其在调控造血环境中起重要作用，研究显示其配体是CXCR4，它们的相互作用与肿瘤的发生发展密切相关。研究发现GSC细胞群中有少部分细胞表达较高的CXCR4受体水平，而在非干细胞的胶质瘤细胞系中仅有个别细胞低表达。AMD3100是一种特异的CXCR4拮抗剂，在体外实验中能够抑制肿瘤细胞的迁移，在体内实验中能够减少高侵袭力的GSC细胞系异种移植的生长。
2.2 分化
诱导分化是GSCs靶向治疗的另外一个重要途径。骨形态形成蛋白 (BMPs) 在神经系统的发育分化中起着重要的作用。LIU A等[14]运用实验胚胎学和遗传学方法证明了BMP在神经组织的形成以及在对神经元形成的类型和数量都起一定的控制作用。LEE等[15]研究发现BMPs在不同的肿瘤干细胞株的分化中起到不同的作用，或者促进或者抑制肿瘤性星形细胞分化程序。运用RNA干扰筛选方式，令衔接子蛋白TRRAP (转化/转录域相关蛋白) 表达沉默，结果显示能诱导GSCs的分化。TRRAP的表达下调能够使细胞对凋亡刺激敏感，并阻止细胞周期的进展，从而抑制体内肿瘤的形成。这些现象说明，TRRAP能够保持GSCs处在一个干细胞样的致瘤状态。
研究发现维甲酸能够促进肿瘤细胞的分化，最近研究揭示其能作用于干细胞样胶质瘤细胞并发挥抗肿瘤的功效[16]。然而在临床研究中，关于全反式维甲酸和顺式维甲酸的确切机制只有较少报导，是否有某种特殊形式的维甲酸能够在联合化疗中使GSCs对细胞毒治疗致敏将是今后研究的热点问题。
2.3 放疗敏感性
胶质瘤对放化疗敏感性较差，GSC细胞通过DNA损伤检验点系统以及DNA修复能力，从而具有一定的放化疗抵抗能力。与CD133阴性细胞相比，CD133阳性GSCs无论在体内还是体外的放射线环境下都能较强的存活[17]。CD133+细胞能更有效地修复放射引起的DNA损伤，Chk1和Chk2 (细胞周期检测点激酶) 的特异性抑制剂能够逆转这种放射抗性。在GSCs领域研究DNA损伤检验点系统的反应或许能够提供一个可行的治疗方案。
2.4 GSC微环境 (niche)
niche是指干细胞周围的细胞和外部信号构成的特定的微环境，这个微环境维持着干细胞的特性，为干细胞的自我更新提供了合适的外部条件，并且抑制干细胞向成熟细胞的分化。与非干细胞样胶质瘤细胞相比，GSCs分泌高水平的VEGF (血管内皮生长因子) ，具有很强的促血管生成作用。这说明GSC与血管环境是相互依赖的。
贝伐单抗是一种抗VEGF抗体，能够有效的对抗血管形成，研究证实其能够阻止血管形成和GSC源性的异种移植物的生长。然而它对非GSC源性的异种移植物只有有限的功效。FOLKINS等[18]在细胞毒治疗中联合使用一种抗VEGF受体的抗血管形成治疗，结果GSC细胞明显减少，然而单独的抗血管形成的治疗却难以达到如此效果，说明微环境的破坏能够使GSCs对化疗敏感。
2.5 溶瘤病毒治疗
溶瘤病毒能够选择性地在肿瘤细胞中复制，造成细胞病理效应和机体免疫反应从而导致肿瘤细胞的裂解死亡，同时对正常细胞和组织却没有作用或影响较小。Delta-24-RGD是一种溶瘤腺病毒，它能选择性的进入肿瘤细胞内，通过Rb通路进行复制，尤其是在胶质瘤细胞中。使用Delta-24-RGD治疗脑内荷瘤大鼠，生存期明显延长。
2.6 粘附分子抑制
L1CAM是一类神经细胞粘附分子，属于免疫球蛋白超家族中的一员，它能够调节神经细胞的生长，生存，迁移，以及轴突的生长和神经突的伸展，在胶质瘤细胞以及其它肿瘤细胞中高度表达，因此可作为细胞表面靶的。L1ACM主要在CD133+胶质瘤细胞中表达，在CD133-中呈阴性。针对L1CAM的慢病毒sh RNA能阻止CD133+GSCs生长，干扰神经球的形成，诱导其凋亡[19]。
3 结语
脑胶质瘤治疗须打“组合拳” 篇5
近30年来，原发性恶性脑肿瘤发生率逐年递增，年增长率约为1 2％，中老年人群尤为明显。据文献报道，中国脑胶质瘤年发病率为3-6人／10万人，年死亡人数达3万人。
脑胶质瘤易复发
脑胶质瘤特点概括起来为，生长快，易复发、不转移，难切除。
脑胶质瘤生长迅速，活性细胞的细胞周期往往只有几天，即今天十万个活性胶质瘤细胞，几天后就变成二十万个，所以恶性度最高的胶质母细胞瘤即使经过手术和放化疗，平均生存期也只有一年，很多只有几个月。
胶质瘤系浸润性生长物，和正常脑组织没有明显界限，如同树根的根丝样张牙舞爪般生长，因此难以完全切除，对放疗化疗不甚敏感，非常容易复发。如同割韭菜一样，切除一茬，没过多长时间，又长出新的一茬。因此脑胶质瘤至今仍是全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一。胶质瘤按照恶性程度，被分为、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个级别，Ⅰ、Ⅱ级是低级别胶质瘤，Ⅲ、Ⅳ级是高级别胶质瘤。级别越高，恶性程度、治疗难度也就越大，术后生存期也就越短。一般Ⅲ级者生存2-3年，Ⅳ级(胶质母细胞瘤)者仅能生存一年左右，生存率在全身所有恶性肿瘤中为倒数第二，仅好于胰腺癌。
MRI排查最准确
很多检查手段对脑胶质瘤的诊断有帮助，如脑脊液检查、B超、脑电图检查、放射性同位素扫描、CT及M1LI等，以核磁共振(简称M1KI)扫描的诊断价值最大，CT作为对脑胶质瘤的筛查有很大意义，定性诊断正确率可达90％以上，可显示肿瘤的部位、范围、形状、脑组织反应情况及脑室受压移位情况等。核磁共振对脑瘤的诊断较CT更为准确，影像更为清楚，可发现CT所不能显示的微小肿瘤。所有的检查仍需结合临床综合考虑，以便明确诊断。
出现三类症状需警惕
记者：据了解，胶质瘤不像其他疾病，病情发展快，症状明显，而是发病缓慢，少数可达数年，那么出现哪些情况我们需要警惕是胶质瘤?
陈谦学：的确，胶质瘤大多发病缓慢，但它也有征兆。如果在日常的生活和工作中发现以下现象，就需要提高警惕了，可能是胶质瘤的前期症状：①头痛、视力减退，复视；②呕吐；③一部分肿瘤病人有癫痫症状，并可为早期症状，发病于成年后，大多为脑瘤所致。药物不易控制或发作性质有改变者，都应考虑有脑瘤存在。④有些肿瘤特别是位于额叶者可逐渐出现精神症状，如性格改变、淡漠、言语及活动减少，注意力不集中，记忆力减退，对事物不关心，不知整洁等，此时就需要及时向医生咨询，切不可大意，以免贻误最佳治疗时机。
脑胶质瘤几乎不转移
记者：据了解，脑胶质瘤的恶性度仅次于胰腺癌，那它是否也会像其他肿瘤那样到处转移，甚至转移后表现得更猖狂?
陈谦学：与其他恶性肿瘤不同的是，虽然脑胶质瘤早期就可以表现出广泛的侵袭，远处转移却罕见，大多数都是原位生长，原位复发。有少部分可通过脑脊液在中枢神经系统内播散。所谓广泛侵袭，是指它像藤蔓，到处攀爬，与正常脑组织亲密接触。这也是导致手术无法切除干净的重要原因之一。也正因为如此，脑胶质瘤是目前全身肿瘤中预后最差的肿瘤之一。
手术是治疗主要手段
记者：胶质瘤该怎么治疗呢?
目前国内外对于胶质瘤的治疗普遍为手术、放疗、化疗、x刀、r刀等。目前认为采取手术为主，放化疗为辅，综合治疗是治疗胶质瘤的最佳手段。
最大限度延长生存期
记者：既然胶质瘤无法切除干净，您会通过什么措施来提高胶质瘤患者的生存期及生存质量?
陈谦学：这是神经外科医生面临的最大难题。影响胶质瘤预后有很多因素，比如患者年龄、组织病理学类型、手术切除范围、肿瘤部位和个体神经功能伤残状态对预后都有影响。只有手术切除范围是外科医生唯一可以控制的因素，因此在一定条件下，综合或部分应用术前的各种影像学检查和术中冰冻病理学检查、术中影像学检查(术中MRI、术中B超)、神经导航、术中荧光造影、术中电生理监测、唤醒麻醉技术等手段，结合显微神经外科手术操作技术，可以获得更满意的切除范围，从而获得更好的疗效。
在保证患者功能的前提下，最大限度的切除肿瘤，同时依据患者的情况，选择合适的术后辅助治疗措施，才是保证患者获得最长生存期的重要基础。
治疗必须“联合作战”
记者：脑胶质瘤手术是否为唯一的治疗手段？
陈谦学：单纯用任何一种方法均不能彻底根治胶质瘤，术后选择合适的辅助治疗手段是延缓复发的有效方法。外科手术仅仅是治疗工作的开始，还必须根据肿瘤生物学、细胞动力学、放射治疗学、药物学和免疫学等多学科的有关知识，分阶段应用多种方法进行综合治疗，才能获得较好的疗效。尤其是随着分子生物学的发展，许多新的治疗方法层出不穷，因此，资源整合、化散为整的方式更有利于胶质瘤治疗。
神经外科医生绝不能满足于切除了肿瘤就完成任务。目前，武汉大学人民医院神经外科已经向国际治疗规范看齐，充分整合神经外科、放化疗科、肿瘤科、核医学科、神经病理科和神经影像科等学科资源，实现脑胶质瘤的诊断与治疗的规范化和个体化，与国际接轨。
手机辐射可能是诱因之一
记者：我们为何会得脑瘤?
陈谦学：在医学上至今没有十分明确的病因。但多数学者认为是由多种因素综合作用的结果。归纳起来有：①脑胚胎组织发育异常；②遗传因素，近年来认为胶质瘤有遗传倾向；③理化因素；④生物学因素，如病毒感染等。
记者：长时间使用手机接听电话是否会致脑胶质瘤?
陈谦学：2009年，瑞典及多个欧洲国家便已经有相关研究，研究表明用手机10年以上，可能会增加患脑胶质瘤和口腔癌的危险。而荷兰的一项研究则显示，手机辐射与失眠、老年痴呆症、儿童行为问题、男性不育等有密切关系。
胶质瘤干细胞 篇6
Singh等[4]报道了应用液体无血清神经干细胞 (neural stem cell, NSC) 培养基从胶质瘤和髓母细胞瘤中分离出具有NSC性质的肿瘤细胞, 并证实其为胶质瘤干细胞 (glioma stem cell, GSC) 。近年来研究表明, GSC的存在可能是脑肿瘤耐药的主要原因。本研究根据这一理念以及国内外的资料, 从胶质瘤中分离培养GSC, 并从化疗敏感性分析的角度出发, 探求GSC与胶质瘤细胞化疗敏感性的差异。
1 材料与方法
1.1 材料
胶质瘤细胞株SHG- 44、U251、U87MG购自上海细胞库, DMEM培养基、DMEM/F12 (1 ∶1) 培养基、B27添加剂、胰酶购自Gibco公司, 人表皮生长因子 (EGF) 、人碱性成纤维生长因子 (bFGF) 购自PeproTech公司, 逆转录试剂盒购自美国Promiga公司, Taq酶购自日本TaKaRa公司, CCK8购自碧云天公司, 顺铂 (cisplatin, CDDP) 购自齐鲁制药厂, 长春新碱 (vincristine, VCR) 购自广州明兴制药厂。
1.2 方法
1.2.1 3株胶质瘤细胞的培养和传代
3株胶质瘤细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基, 置于在37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中, 2～3 d后按1 ∶2的比例传代。
1.2.2 分离提取GSC和传代
待胶质瘤细胞长至瓶底的80%后消化离心, 换成含2μg·ml-1EGF、bFGF及2%B27添加剂的DMEM/F12培养基, 隔日待培养基中悬浮的单克隆细胞呈团状、体积较大后, 弃去瓶底的贴壁细胞并离心后半量换液, 培养4～5 d后吹打成单细胞悬液, 按1 ∶2传代。
1.2.3 扫描电镜观察GSC
收集第3次传代3～4 d后的3株GSCs, 以1 000 r·min-1离心5 min, 弃上清得细胞沉淀物, 用0.1 mmol·L-1的PBS冲洗5 min×3次, 2.5%戊二醛室温固定30 min, 0.1 mmol·L-1的PBS漂洗5 min×3次, 1%锇酸固定1.5 h, 0.1 mmol·L-1的PBS漂洗, 然后50%、70%、90%、100%丙酮逐级脱水。醋酸异戊酯置换, 临界点干燥仪干燥, 镀膜, 扫描显微镜观察。
1.2.4 GSC的鉴定
收集106的3种GSCs, 采用RT- PCR法检测胶质纤维酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein, GFAP) 及CD133的表达。所用的引物为:GFAP上游5′- CGAAGC CAACGACTACCG- 3′, 下游5′- TCTTCACCACGATGTTCCTC- 3′ (产物395 bp) ;CD133上游5′- AGT GAGAAAGTGGCATCG- 3′, 下游5′- CCTTGTAGACCCAGAAACTA- 3′ (产物302 bp) ;β- actin上游5′- TATGACTTAGTTGCGTTACACC- 3′, 下游5′- CCTTCACCGTTCCAGTTT- 3′ (产物155 bp ) 。按试剂说明书加样, 进行热循环扩增, 反应条件为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性45 s, 50 ℃ (以引物后退火温度为准) 复性45 s, 72 ℃延伸1 min, 循环35次;72 ℃延伸10 min。取10 μl扩增产物与2 μl 6×loading缓冲液混合后, 在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳, 柯达UV- 2000紫外分析仪观察和扫描分析。
1.2.5 细胞活性CCK8检测
选取对数生长期3株胶质瘤细胞及其干细胞接种于96孔板, 每孔100 μl, 8 000 个·ml-1, 培养12 h, 弃去培养基, 用无血清培养基洗2遍, 加入含5%胎牛血清培养基配制的药物CDDP和VCR, CDDP的浓度依次为0.005、0.05、0.5、5、50 μmol·L-1, VCR的浓度依次为1、5、10、50、100 ng·L-1, 各加100 μl, 并设置空白对照组及阴性对照组, 每组设4个平行孔。药物处理24及48 h后, 每孔加入CCK8 10 μl, 继续培养2 h, 用酶联检测仪于450 nm波长处测定每孔OD值, 计算细胞生长抑制率。抑制率 (%) =[1- (实验组-空白组) /对照组]×100%。
1.3 统计学处理
全部统计资料均用单因素方差分析, P<0.05表示差异有统计学意义, 由SPSS 16.0统计软件包进行分析。
2 结果
2.1 GSC细胞球的形成
更换干细胞培养基后, 大部分细胞成单细胞悬浮状态, 24 h内有一部分细胞贴壁;另一部分细胞发生非特异性聚集, 形成形状不规则的细胞团, 悬浮于培养基中, 培养基显得浑浊。24～48 h后显微镜下开始有大小不一的球状细胞团形成, 悬浮于培养基中, 但仍有一部分贴壁细胞;弃去贴壁细胞, 离心, 半量换液后继续培养, 48 h后形成较大的细胞团, 多为圆形或卵圆形;晃动培养瓶时可见细胞球滚动;细胞球由上百个细胞构成, 球内细胞呈圆形, 大小不一, 相差显微镜下透亮、折光性较强, 此时形成的细胞球可称GSC球;同时培养基中仍存在大量悬浮的单细胞和一些形状不规则的非特异性聚集细胞, 但较接种明显减少 (图1) 。
2.2 传代后肿瘤干细胞
GSCs一般4～5 d可以传代, 当GSCs的数量逐渐增多、体积增大后即可传代。传代后的GSCs与原代GSCs比较, 形状与原代相似, 但更为规则, 细胞球内的细胞形态与原代无异, 培养基中悬浮单细胞、细胞碎屑及非特异性聚集的细胞团较原代减少。当培养至14 d后, 细胞团开始变黑, 凋亡增加。
2.3 扫描电镜观察结果
扫描电镜下可见GSCs呈圆形或椭圆形, 大小中等, 均匀一致, 众多细胞互相靠近, 细胞表面褶皱较多, 突起较短小且较少, 见图2。
2.4 GSCs的鉴定
用RT- PCR法分析3株GSCs中GFAP及CD133表达情况 (图3) , GSCs基本不表达GFAP, 高表达CD133 (图4) 。
2.5 CCK8检测细胞活性结果
不同浓度CDPP对3株胶质瘤及其干细胞有抑制作用, 其对细胞抑制率随作用时间的延长和浓度上升而增高 (图5) , 但胶质瘤细胞组抑制率明显高于GSC组 (P<0.05) 。
不同浓度VCR对3株胶质瘤及其干细胞有抑制作用, 其对细胞抑制率随作用时间的延长和浓度上升而增高 (图6) 。普通胶质瘤细胞组抑制率明显高于GSC组 (P<0.05) 。
3 讨论
脑胶质瘤是最常见的颅内原发性肿瘤, 由于脑组织功能的特殊性, 手术难以扩大切除范围。因此化疗是脑胶质瘤治疗的重要环节, 可进一步杀灭残留肿瘤细胞, 对手术后复发的肿瘤起到很重要的作用, 但其效果很不理想, 相当一部分胶质瘤对化疗药物耐药, 严重影响化疗效果。原因除了有血脑屏障存在使药物很难进入神经系统外, 最新研究发现, 脑肿瘤中存在具有自我更新特性的细胞亚群即GSC, 是引发肿瘤并维持其生长的根源, 并在肿瘤的复发过程中起着决定性作用[2]。作为肿瘤干细胞的一类, GSC与其它实体肿瘤干细胞以及造血系统肿瘤干细胞相同, 是肿瘤组织中一个特殊的细胞亚群。它们具有以下特点: (1) 它只占全部肿瘤细胞的一部分, 甚至很小的比例; (2) 具有其他肿瘤细胞所不具备的无限增殖能力, 能够自我复制以达到数量的扩增, 能够在体外培养中形成单细胞克隆并生长、传代; (3) 具有不同于分化细胞的特殊表型; (4) 具有多向分化的能力, 能够分化产生肿瘤组织中其它细胞亚群; (5) 具有致瘤能力。本实验主要证明了前3点。GSC虽然在脑肿瘤细胞中只占极少数, 但它是脑肿瘤发生、耐药、复发及转移的根源[5]。本实验采用Singh无血清培养基法体外培养出GSC。B27添加剂含有多种神经细胞生长所需的营养物质, 是NSC培养中最常用的培养基添加剂之一[6], EGF和bFGF对GSC具有强大的促有丝分裂性, 在GSC增殖过程中发挥重要作用。
目前主要利用已知的神经干细胞表面标志物 (如CD133) 对GSC进行分离和鉴定。CD133是一个单拷贝基因产物, 该基因位于4号染色体 (4p15) , 包含37个外显子;CD133糖蛋白是细胞表面蛋白超家族中的一员, 相对分子质量为117 000。CD133的一个显著特点就是, CD133的表达随着细胞的分化迅速下调, 使它成为一个独特的分离和鉴定干细胞和祖细胞的分子标志[7]。2003年Singh等[4]以CD133为分子标志从一系列脑肿瘤分离出肿瘤干细胞。CD133+细胞有显著的增殖能力, 自我更新能力和分化能力, 将100个CD133+细胞接种到重症联合免疫缺陷 (nonobese diabetic/severe combined immunodeftcient, NOD/SCID) 小鼠脑组织中即可形成肿瘤, 且与患者原发肿瘤表型相同;而将1×105个CD133- 细胞接种NOD/SCID小鼠后仅能在注射部位形成一条胶质瘢痕。随后Hemmati等[8]在小儿脑部肿瘤的研究中也得出了相似的结果。GFAP为位于细胞质和细胞突起的中间丝蛋白, 被认为是星形胶质细胞及其发生肿瘤的最佳特征性标记物[9]。本实验结果表明, GFAP在星形胶质瘤中表达阳性, 却不表达于GSC中, 与Singh等的研究结果[4]一致。
CDDP属细胞周期非特异性药物, 主要作用靶点为DNA, 作用于DNA链间及链内交联形成DDP- DNA复合物, 干扰DNA复制, 进而诱导凋亡发生, 是治疗胶质瘤的常用药物[10]。本实验中用不同浓度CDDP干预胶质瘤细胞及其干细胞, CCK8法检测细胞活性结果提示, CDDP对3株胶质瘤细胞均有不同程度的细胞毒作用, 药物作用24及48 h后, 3株细胞对药物的敏感性为U251
胶质瘤干细胞 篇7
1 材料与方法
1.1 试剂
青霉素、链霉素、Hoechst 33342、MTT为美国Sigma公司产品,胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司,干细胞培养基购自美国Millopore公司,PRMI 1640培养基购自英韦创津公司,FITC-CD133抗体为美国R&D公司产品。
1.2 细胞系及培养
神经胶质瘤C6细胞在37℃5%二氧化碳条件下培养于含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素及100IU/mL链霉素的PRMI 1640培养液中。
肿瘤的球囊培养(sphere):使用干细胞无血清培养基,按照说明书操作,每3天加1次EGF(20ng/mL)、b FGF(20 ng/mL)和1×B27(无维生素A)。
1.3 实验动物以及裸鼠成瘤实验
BALB/c-nu裸鼠购自省医学实验动物中心,鼠龄5~6周,体重20~25 g,无特殊病原体(SPF)条件下饲养。分选的SP和NSP细胞分为103、104、105和1064组,每组5只裸鼠,每只裸鼠皮下接种两个部位,1个月后处死裸鼠计算成瘤率。
1.4 侧群(SP)细胞的流式细胞仪分选
参照林琳等[4]的方法,简述如下:取对数生长期的神经胶质瘤C6细胞,制成单细胞悬液调整细胞浓度为106/m L,加入Hoechst 33342至终浓度5mg/L,另取1 m L细胞加入维拉帕米至终浓度50mg/L作用30 min后再加入Hoechst 33342作为对照,37℃水浴避光染色90 min,其间不断摇匀细胞避免细胞沉淀。FACS AriaⅡ流式细胞仪(美国BD公司产品)IL6和IL7双通道做门,结合维拉帕米的对照样品分选SP细胞。
1.5 生长曲线绘制
将分选的SP和NSP细胞接种到96孔板每孔1 000个细胞,常规含血清培养基培养,于2、4、6、8和10 d后加入MTT,酶标仪570 nm波长测定OD值,每个时间点设置3个复孔,每个孔计数3次,参照郝新保等[5]的方法制作OD值与细胞数标准曲线,然后在标准曲线上计算出所测OD值对应的细胞数,取平均值绘制细胞时间—生长曲线。
1.6 克隆形成能力检测
将分选的SP和NSP细胞接种到46孔板每孔400个细胞,常规含血清培养基培养,2周后计数细胞多于50个的克隆,计算克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。
1.7 CD133表达的流式细胞仪检测
按照抗体试剂盒的说明书操作,分选的SP和NSP细胞调整细胞浓度至106/m L,取400μL,BAS封闭细胞1 h,加入FITC-CD133抗体10μL,避光染色30 min,同型对照调零,流式细胞仪IL-1通道处检测细胞CD133的表达量。
1.8 统计分析
实验数据连续性资料以表示,应用SPSS12.0统计软件处理数据,两样本均数比较采用t检验,多组间均数比较采用方差分析,P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 神经胶质瘤C6细胞侧群(SP)细胞的流式细胞仪检测和分选
神经胶质瘤C6细胞中SP细胞的比例为(4.24±1.36)%,加入维拉帕米抑制后SP细胞的比例变为(0.04±0.02)%(下图1),说明所选定的区域可以用于分选,使用建立的方法我们得到了纯度>95%的SP细胞。
2.2 SP和NSP细胞增殖速度的比较
从图2可以看出SP和NSP细胞在第2、4天生长差异无显著性(P>0.05),到第6、8、10天SP细胞的生长速度显著快于NSP细胞(P<0.05)。
2.3 SP和NSP细胞球囊性生长和克隆形成能力的比较
图3A显示在无血清条件下培养SP细胞有形成球囊的特性,而NSP细胞无球囊性生长的特性。在常规培养条件下SP细胞的克隆形成率为(31.24±6.48)%,NSP细胞的克隆形成率为(9.63±1.16)%,二者之间差异有显著性(P<0.01)。
2.4 SP和NSP细胞裸鼠成瘤能力的比较
103、104、105和106个SP细胞接种裸鼠皮下,成瘤率分别为40.00%、60.00%、80.00%和100.00%,而NSP细胞的成瘤率分别为0.00%、0.00%、60.00%和70.00%,两组之间差异有显著性(P<0.05)。
2.5 SP和NSP细胞CD133表达的比较
流式细胞仪检测显示SP细胞CD133表达的量为(61.74±7.32)%,NSP细胞CD133表达的量为(1.06±0.81)%,二者之间差异有显著性(P<0.01)。
3 讨论
最近的研究显示肿瘤细胞内存在有一小群具有高增生潜能和自我更新潜能的起始细胞被称为肿瘤干细胞,随后的研究证实了正是这一小群起始细胞是肿瘤复发的根源,并且对传统的化疗药物不敏感成为化疗失败原因之一[6]。
1996年Goodell等研究小鼠造血干细胞时发现有一小群对Hoechst 33342拒染的细胞,分离这群细胞后检测发现其造血能力是普通骨髓的1千多倍,因这群细胞在流式细胞仪检测中位于细胞主群的一侧,故称为侧群(SP)细胞[7]。随后的研究发现肿瘤细胞中也存在这样一群干细胞样细胞,目前肿瘤干细胞的分选主要有免疫标记、球囊培养富集、SP分选3种,因为肿瘤干细胞的特异性标记蛋白在一些肿瘤肿瘤中并不明确,无血清悬浮培养耗时太多而且培养条件比较苛刻,所以SP细胞分选已成为大多数肿瘤干细胞分选的常用方法[8,9]。本组使用Hoechst 33342染色神经胶质瘤C6细胞流式细胞仪检测显示约有4.24%的SP细胞,加用维拉帕米后这群细胞消失,证明了神经胶质瘤细胞中存在少量的SP细胞。随后笔者分选了这群细胞,生物活性检测显示SP细胞较NSP细胞具有较强的增殖、克隆形成、球囊性生长、致裸鼠成瘤能力,上述结果说明本组分离得到的SP细胞具有干细胞的特性,可以用于神经胶质瘤干细胞的研究。
CD133是已被大多数实验证实的神经胶质瘤干细胞的免疫标志物,并且CD133已被研究者作为神经胶质瘤复发和预后监控的一个评估指标[10,11,12]。本组分选的神经胶质瘤SP细胞检测显示CD133表达量高达60.00%以上,而NSP细胞基本测不出CD133的表达,进一步证实了神经胶质瘤SP细胞具有干细胞样特性。
综上所述,本研究在神经胶质瘤细胞中发现了SP细胞的存在,SP细胞具有干细胞的特性且高表达CD133,这种肿瘤干细胞的富集方法为以后神经胶质瘤干细胞的研究提供了有力的保障。
摘要：目的 分选神经胶质瘤C6细胞中的侧群(SP)细胞,探讨其相关生物学特性。方法 Hoechst33342染色流式细胞仪分选SP细胞,另取非侧群(NSP)细胞作为对照。MTT法绘制细胞生长曲线,平板克隆法检测细胞克隆形成能力,无血清悬浮培养观察细胞的球囊形成能力,裸鼠移植瘤实验检测细胞的成瘤能力,流式细胞仪检测细胞CD133的表达。结果 神经胶质瘤C6细胞中SP细胞的比例为(4.24±1.36)%。SP细胞的生长速度显著快于NSP细胞(P<0.05)。SP细胞在无血清条件下培养有形成球囊的特性,而NSP细胞无球囊性生长的特性。SP细胞的克隆形成率为(31.24±6.48)%显著高于NSP细胞的(9.63±1.16%)(P<0.01)。103、104、105、106个SP细胞接种裸鼠皮下,成瘤率分别为40.00%、60.00%、80.00%和100.00%,而NSP细胞的成瘤率分别为0、0、60.00%和70.00%,两组之间差异有显著性(P<0.05)。SP细胞CD133表达的量为(61.74±7.32)%显著高于NSP的(1.06±0.81)%(P<0.01)。结论 神经胶质瘤中存在SP细胞,SP细胞高表达干细胞标志蛋白CD133,SP细胞分选可以富集神经胶质瘤肿瘤干细胞样细胞。
关键词：神经胶质瘤,肿瘤干细胞,侧群细胞,CD133
参考文献
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节细胞胶质瘤1例 篇8
讨论:节细胞胶质瘤 (Ganglioglioma, GG) 是一种既有神经元又含有胶质的肿瘤, 临床上极其罕见, 好发于儿童和青少年, 常见于30岁前。其发生率占整个神经系统肿瘤的0.4%～6.25%[1,2]。但它是混合性神经元-神经胶质肿瘤中最常见的类型[3]。是中枢神经系统少见的低级别肿瘤, 生长缓慢, 临床过程偏于良性肿瘤, 通常手术切除预后良好。Luyken 等[4]对86 例神经节细胞胶质瘤患者在肿瘤切除后7年随访, 仅有1例复发, 86%幕上神经节细胞胶质瘤患者术后无癫痫发作。CT、MRI是临床诊断节细胞胶质瘤的最重要方法之一。但是在对肿瘤的定性和定位诊断上, MRI 检查效果明显优于CT, 故MRI检查为肿瘤的术前准备提供了有利的依据 , 早期治疗对其预后改善有重要意义。肿瘤主要见于幕上大脑半球, 以颞叶最常见, 其次是额叶和顶叶, 偶见与脑室、桥小脑角区、脑干、丘脑等, 发病部位比较广泛。肿瘤通常单发, 多发极其少见。神经节细胞胶质瘤没有特征性的CT 表现, 肿块通常呈低密度或等密度, 有20% ～ 50%的病例可以出现钙化[5]。节细胞胶质瘤MRT1加权图像常表现为不均匀低信号或等信号, T2加权图像一般表现为高信号。CT平扫常表现为低密度或等密度, 少数为高密度可以有囊变及钙化, CT和MR增强扫描半数以上囊壁有轻中度强化, 囊性为主型常表现是囊变伴强化壁结节。完全囊性者可无强化。按病理特点将其分为囊性、囊实性和实性。肿瘤囊变较常见, 完全囊变可仅由单个或多个囊组成。附壁结节和钙化为节细胞胶质瘤的重要的影像学征象。典型的节细胞胶质瘤影像学表现很有特点, 即单个大囊加壁结节钙化。本病还应与胶质瘤相鉴别, 后者MRI信号多不均匀, 瘤内出血和坏死比较常见, 而钙化少见, 灌注MRI和MRS利于两者鉴别.囊实性神经节细胞胶质瘤需与胚胎发育不良性神经上皮肿瘤、血管母细胞瘤以及毛细胞型星形细胞瘤相鉴别. 实性为主、周边可见小囊变区者需与分化较好的星形细胞瘤相鉴别. 实性神经节细胞胶质瘤: 需要与脑炎相鉴别, 灌注MRI和MRS利于两者鉴别。
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胶质瘤干细胞 篇9
骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,BMSCs)具有很强的分化能力,在合适的条件下可以分化成骨、软骨、脂肪组织等多种组织细胞[2,3,4]。BMSCs的这一特点及其靶向迁徙的能力[5]使它在基因治疗中具有了独特的价值。BMSCs可作为理想的分子载体,通过外源治疗基因TRAIL修饰后的BMSCs可以向受损组织趋化及发挥修复作用。由此可知,BMSCs经过肿瘤杀伤基因修饰后有可能携带治疗性物质靶向杀伤肿瘤细胞。本实验将TRAIL的选择性杀伤细胞作用与BMSCs的肿瘤细胞迁徙性相结合,探究TRAIL转染骨髓干细胞后靶向治疗脑胶质瘤的潜在价值。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1细胞和主要试剂
人骨髓间充质干细胞购于美国Millipore公司,U251胶质瘤细胞株购自南京凯基生物公司,血清和DMEM培养基均购于美国Millipore公司,RT-PCR(Reverse Transcription-Polym erase Chain Reaction,逆转录-聚合酶链反应)试剂盒,美国BIO-RAD公司,Trizol试剂,Invitrogen公司,质粒提取盒,天根生化科技有限公司,转染试剂(Trans IT-2020),Invitrogen公司,流式试剂,美国BD公司,一抗、二抗,英国Abcam公司,质粒由加拿大UBC大学实验室提供。
1.1.2细胞培养与传代
取出BMSC(U251)冷冻保存细胞于37℃水浴锅中迅速复苏,将细胞液移于离心管中离心、收集细胞,再加入含10%胎牛血清(fatal bovine serum,FBS)的完全培养基,充分吹打悬浮细胞,移于培养瓶中,置于37℃、5%二氧化碳孵育箱培养,待细胞长到80%~90%时,用0.25%胰酶消化、收集细胞,进行传代培养。
1.2 实验方法
1.2.1 BMSCs向肿瘤细胞迁徙的体外实验
利用8μm孔径的Transwells小室进行BMSCs迁徙实验。将1×105个/ml BMSCs置于上室,U251胶质瘤细胞置于下室,然后置于37℃、5%二氧化碳培养箱中24 h,取下滤膜,用PBS冲洗2遍,并用细胞铲刮除黏附的细胞,甲醛固定30 min,风干后用0.1%结晶紫染色30 min,随机选取5个视野在显微镜下观察、计数。
1.2.2质粒的扩增与提取
质粒属于绿色荧光蛋白的分泌型TRAIL真核表达质粒,内含有目的基因TRAIL以及抗AMP(ampicillin,氨苄青霉素)片段,置于-20℃保存备用。取质粒与感受态细胞(由实验室提供)冰上解冻,将两者混匀后于42℃水浴90 s,加入LB培养基(Luria-Bertani培养基),摇床振荡复苏细胞;在选择性培养板(AMP)上涂板,过夜培养。挑取单菌落加入含AMP的LB培养基中振荡培养,待LB变浑,采用高纯度质粒小提中量试剂盒(tiangen)进行提取,具体参照试剂盒说明书,提取的质粒置于-20℃冰箱保存备用。
1.2.3质粒转染BMSC细胞
待细胞达80%左右时进行转染,转染前细胞用无双抗培养基培养24 h。将含TRAIL的质粒溶于Opti-MEM培养基中混匀,另取转染试剂Trans IT-2020溶于Opti-MEM培养基混匀,将两溶液吹打混匀后立即加入细胞中,并边加边摇,置于37℃、5%二氧化碳孵育箱中培养,6 h后换成完全培养基。培养24~48 h后于显微镜下观察。
1.2.4质粒转染的BMSCs中目的基因的表达
应用PCR检测TRAIL基因的表达情况,培养24 h后收集各组BMSC细胞,用PBS(phosphate belanced solution,磷酸缓冲液)冲洗3次,加入Trizol裂解细胞,严格按照说明书提取总RNA(ribonucleic acid,核糖核酸)。引物序列通过Olig 6软件设计,由宝生物公司合成。扩增TRAIL基因编码序列的引物:正向5'-TGACTGTGGCTGTGACTTA-3';反向5'-ACTCCCAGGTTTCTATCTT-3'。β-actin的正向5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3';反向5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。PCR扩增条件:共30个循环,每个循环包括94℃30 s,55℃30 s,72℃60 s。同时扩增管家基因β-actin作为对照验证。每孔加5μl样品,并在一侧加入5μl的2 000 Marker,进行琼脂糖凝胶电泳,20 min后获取图片,并对数据进行分析。
应用Western blot法检测相关蛋白的表达水平,β- actin作为内参。培养48 h后收集各组细胞蛋白产物,取50μl样本与5×SDS- PAGE缓冲液混合,电泳后经转膜仪将样本转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,经漂洗、封闭、一抗(抗TRAIL)孵育、二抗孵育,检测结果并通过Image J2X软件扫描图像及定量分析。
1.2.5流式细胞仪检测U251细胞的凋亡率
各实验组细胞处理48 h后,收集培养基到新的离心管中,加PBS冲洗3次,将冲洗液吸取到相应离心管中(避免丢失悬浮的凋亡细胞影响实验结果)。用0.25%胰酶消化、收集细胞到相应的离心管,1 000r/min,离心5 min。用预冷的PBS冲洗3次,然后用1×bind buffer将细胞配成(1-5)×104/ml的细胞悬液,取100μl加入新的EP管中,每管加5μl Annexin V-FITC和5μl PI(propidium iodide),暗环境培养15 min后加入400μl 1×bind buffer,立即用流式细胞仪检测,1 h内完成,并分析实验结果(实验需设置3组质控样本)。
1.3 统计学方法
采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析,计量资料用均数±标准差(±s)表示,用配对资料t检验,各组数据均符合正态分布,转染后的BMSCs细胞对U251 细胞的增抑制率及凋亡率比较,P <0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 BMS Cs向U251 细胞的迁徙能力
应用Transwell法验证BMSCs向肿瘤细胞的迁徙能力,BMSCs与U251 细胞共培养48 h后,随机选取5 个视野在显微镜下观察、计数,可见U251 细胞培养液可刺激更多的BMSCs发生迁徙,与生理盐水及培养基比较,差异有统计学意义(P <0.05)(见图1)。荧光显微镜下发现,BMSCs主要聚集于U251细胞周围,而在无U251 细胞的培养基周围仅散在少量BMSCs(见图2)。由此可证明,BMSCs向肿瘤细胞迁徙的特异性。
2.2 RT- P CR及We s te rn blot检测目的基因表达
通过PR- PCR扩增,将扩增的目的基因分别加样进行琼脂糖电泳,经20 min后观察结果并成像(见图3)。结果显示条带随培养时间的延长依次由淡变亮,表明TRAIL在BMSCs内成功表达。应用Western blot法检测转染组与未转染组目的基因的表达情况,可见转染组的TRAIL表达与PCR结果有相同效果,随着培养时间的延长表达量相继增加,β-actin在不同细胞的表达量无差异。见图4。
2.3 流式细胞仪检测U251 细胞的凋亡率
采用Annexin V/PI双染色法进行检测各组U251 细胞的凋亡情况并记录数据,U251 细胞的凋亡率取右下象限(见图5),即Annexin V- FITC(+)/PI(-),由表1 可见转染组诱导U251 细胞的凋亡率与空白组比较差异有统计学意义(P <0.05),而未转染组与空白组比较差异不明显(P >0.05)。TRAIL对BMSCs的凋亡作用见图6。 由表2 可见转染的TRAIL对BMSCs无明显毒性作用(P >0.05)。
生理盐水及培养基仅诱导少量的BMSCs发生迁徙比较,U251细胞培养液可刺激更多的BMSCs发生迁徙(P<0.05)
质粒属于绿色荧光蛋白的分泌型TRAIL真核表达质粒,转染后的BMSCs置于上室,U251胶质瘤细胞置于下室,共培养48 h后,可见BMSCs透过Transwell小室,且主要聚集于U251细胞周围,而无U251细胞的地方较少
A:β-actin组;B:TRAIL组。TRAIL组又分为24、48和72 h组。可见TRAIL条带的表达量随时间呈递增趋势
取未转染的BMSCs培养48 h后提取TRAIL表达蛋白产物行Western blot检测作为对照组;以转染后的BMSCs表达产物作为实验组,并依次分为24、48和72 h组,证明TRAIL的表达量随时间递增
A:实验以BMSCs TRAIL+U251作为实验组;B:BMSCs+U251作为阴性对照;C:单纯U251细胞作为空白对照组。共同培养48 h后收集细胞于新的离心管,分别加入Annexin V/PI试剂后行流式细胞检测,可见BMSCs TRAIL+U251组U251细胞凋亡率明显高于对照组(P<0.05)
A:实验以BMSCsTRAIL作为实验组;B:单纯BMSCs作为对照组。共同培养48 h后行流式细胞检测,可见两组BMSCs的细胞凋亡率比较(P>0.05),证明TRAIL对BMSCs无影响
(%,n=3,±s)
注:1)与BMSCs+U251 组比较,P <0.05;2)与空白对照组比较,P >0.05
(%,n=3,±s)
3 讨论
人脑胶质瘤是神经外科最常见恶性肿瘤,发病迅速,致死率高[6,7],目前针对脑胶质瘤的治疗有放疗、化疗、手术治疗,但治愈率很低,术后极易复发[8],5年生存率也不足20%。因此,对脑胶质瘤是治愈要探索新的治疗手段,众所周知,细胞的分化受到基因的严密调节,能否选择一种方法在肿瘤细胞的生长分化过程中杀伤肿瘤细胞呢?许多专家已经证实肿瘤坏死因子和抑癌基因在调控细胞生长分化中至关重要[9],所以,基因治疗脑胶质瘤可能成为根治胶质瘤的有效方法。
TRAIL是肿瘤坏死因子家族的最新成员,可与肿瘤细胞膜上的DR5 结合,再通过一系列级联反应组成DR5- FADD- Caspase 8(DISC)死亡诱导信号复合体,激活Caspase 8,诱导肿瘤细胞发生凋亡[10],而对正常细胞无影响[11]。另外,也有相关文献证明TRAIL联合放化疗可显著增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性,增加耐药性肿瘤的凋亡,因此,TRAIL日益受到人们的重视,但是TRAIL在肿瘤治疗中的应用较为局限,原因有:1TRAIL在血浆内的半衰期极短,大约小于1 h[12];2具备生物活性的TRAIL必须以三聚体的形式存在,故难以透过血脑屏障发挥作用;3应用腺病毒基因疗法体外能诱导数种人肿瘤细胞凋亡,但体内有引起宿主抗病毒免疫反应的可能。BMSCs的肿瘤迁徙性已在许多文献中被证实,可能是肿瘤细胞分泌相关性因子,从而诱导BMSCs发生迁徙,BMSCs的这一特性为靶向杀伤肿瘤细胞提供了理想的载体。BMSCs可以向肿瘤组织趋化,定位于其间质中增殖、分化[13],所以将目的基因转染入骨髓干细胞,通过骨髓干细胞将治疗基因带入肿瘤组织,由于治疗基因的存在及分泌杀伤物质从而达到肿瘤的抑制作用。本实验主要是探究TRAIL基因作为目的基因转染骨髓干细胞后对U251 胶质瘤细胞的体外靶向抗瘤作用。
实验构建TRAIL的表达载体转染骨髓干细胞,转染成功后,通过PCR及Western blot检测转染后TRAIL的表达,由图3、4 可知转染后的TRAIL基因在BMSCs中表达,且TRAIL的表达量随时间延长而增加。选择第3 天的转染组与U251 胶质瘤细胞共培养,并利用流式细胞仪检测U251 细胞的凋亡率,发现实验组U251 细胞的凋亡率明显增加,BMSCs作为基因载体诱导肿瘤细胞凋亡,自身却不发生凋亡。由此推断,BMSCs作为有效的基因载体,不仅克服TRAIL基因在血浆中半衰期短的难题,而且TRAIL修饰后的BMSCs具备靶向抗瘤的作用,这为恶性胶质瘤的治疗提供了新的途径。
胶质瘤干细胞 篇10
细胞疗法的目标是要在体内形成新的细胞以治疗疾病。两年前, 隆德大学的研究人员就对人类皮肤细胞 (成纤维细胞) 进行重编程, 使其直接变身为可产生多巴胺的神经细胞, 从而绕过了干细胞这一中间阶段, 当时这在世界上尚属首次。现在, 该小组又证实, 皮肤细胞和支持细胞都有可能直接在大脑中重编程为神经细胞。
研究人员使用一种被设计过的基因, 可通过药物激活或使其失活。这种基因被插入两种类型的人类细胞中:成纤维细胞和神经胶质细胞, 后者是自然存在于大脑中的支持细胞。随后, 研究人员将细胞移植进大鼠的大脑, 并在大鼠的饮用水中加入药物将基因激活。结果发现, 这些细胞开始向神经细胞转化。
在另一项实验中, 研究人员向小鼠大脑内注入同样的基因后, 也成功将小鼠自身的神经胶质细胞重新编程成为神经细胞。“这一发现是首个表明其他细胞有可能在大脑内经过重编程而转化为神经细胞的重要证据。”研究小组负责人马林·帕尔马说。
他表示:“研究结果有望开辟一条途径, 为将来的细胞疗法植入物找到替代品, 从而扫除以前遭遇的研究障碍, 比如难以让大脑接受外来细胞, 以及易形成肿瘤的风险等。”在大脑中直接对细胞重编程的新技术开启了新的可能性, 为更有效地替换帕金森氏症等患者已经死亡的脑细胞创造了条件。
“我们正在对这项技术进行开发, 以便用它来创建新的神经细胞, 取代受损细胞的功能。能够在体内进行重新编程也就意味着可以设想, 未来我们可以直接在人类大脑中形成新的细胞, 而无需绕行细胞培养和移植这条弯路。”帕尔马说。
这项研究让人们展开想象:其他细胞可以重新编程直接转化为神经细胞, 那么是否也可以转化为肌肉细胞、肝细胞等其他细胞?既然细胞可以实现转化, 那么转化细胞能否形成组织, 继而组成器官?尽管想象难以在短时间内成为现实, 但积跬步以至千里, 我们相信对细胞这一生命基本单位的这类研究必将成为揭开生命奥秘、改造生命和征服疾病的关键。