神经干细胞分化（共9篇）
神经干细胞分化 篇1
1 神经干细胞 (neural stem cells, NSCs)
是具有高度自我更新能力并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经前体细胞, 能自我更新并能提供足够数量的神经细胞以供机体功能所需[1]。
自从1992年Reynolds和Weiss以及Ricbards 等先后从成年小鼠的纹状体和海马中分离出NSCs后, 彻底颠覆了以往认为成年哺乳动物C N S不再具有自我更新潜能的传统观念。NSCs移植为CNS损伤和神经退行性疾病的治疗提供了新的方向。因此, 对NSCs增殖和分化调控的研究显得尤其重要。
在对人胚胎期N S C s的研究中, 已先后从大脑皮质、海马、纹状体、嗅球、侧脑室、室管膜下层、小脑和脊髓等区域分离出NSCs[2]。成体哺乳动物脑内存在2个NSCs聚集区:位于侧脑室壁的室下区 (subven tricu lar zone, SVZ) 和海马齿状回的颗粒下层 (subgranular zone, SGZ) 。
2 神经营养素家族 (N G F家族)
包括:神经生长因子 (N G F) 、脑源性神经生长因子 (BDNF) 、神经营养素-3 (N T-3) 、神经营养素-4/5 (N T-4/5) 以及神经营养素-6 (N T-6) 。它们各自通过高亲和力受体酪氨酸激酶 (T r k-A、T r k-B和T r k-C) 和低亲和力受体g p 7 5起作用。其中, T r k-A优先结合N G F, Trk-B优先结合B D N F和N T-4/5, Trk C优先结合NT-3;而gp75能结合上述所有5种神经营养因子而发挥生物学效应。
2.1 神经生长因子 (NGF)
2.1.1 1NGF的特性和分布
NGF来源于中枢神经系统及外周神经系统的神经元、神经胶质细胞, 作为靶源性逆向营养因子而发挥作用。
2.1.2 NGF对NSCs分化的作用
有学者利用新生SD大鼠的脑组织进行单细胞悬液制备和原代培养, 经过分化培养后均能产生神经元特异烯醇化酶与胶质原纤维酸性蛋白阳性细胞[3]。而在无血清的系统中, 利用单细胞克隆技术对小鼠胚胎纹状体组织进行分离和培养发现, NGF的干预可以诱导并增加神经前体细胞表达神经元标志物神经丝蛋白 (neurofialm ent protein, NF) 和星形胶质细胞标志物:胶质纤维酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein, GFAP) , 但没有少突角质细胞标志物 (oligodendrocyte marker) 。以上结果表明, NGF可促进体外培养的神经元前体细胞分化为成熟的神经元和成熟神经胶质细胞[4]。
还有研究表明, 对于利用无血清培养技术从胚鼠脑内获得的NSCs, 加入不同剂量的NGF后, 观察胆碱乙酰转移酶 (cholineacetyltransferase, CHAT) 阳性细胞分化的情况, 证实NGF还具有诱导NSCs向胆碱能神经元分化的作用[5]。而在体内, NGF亦可诱导NSCs向胆碱能神经元分化, 有学者给基底前脑胆碱能神经元受损的大鼠侧脑室注射EGF和b-FGF 14d后, 再改用NGF注射14d, 发现海马等处有较多的NSCs被诱导分化为胆碱能神经元[6]。
但NGF不能使人类中枢神经系统干细胞子代分化为神经元的细胞数量增加, 这与T r k-A在人类间脑干细胞的微弱表达是一致的, 表明N G F在人类间脑系统中对神经元分化没有起到积极的作用[7]。
2.2 脑源性神经生长因子 (BDNF)
2.2.1 BDNF的特性和分布
BDNF是一种具有防止神经元死亡功能的蛋白质。BDNF-mRNA广泛地存在于中枢神经系统和外周组织内。在中枢, 其广泛分布在大部分脑区, 上丘、大脑皮层和海马。在外周, 主要在肌肉组织中高表达, 而在心脏和肺组织中表达水平较低[8]。
2.2.2 BDNF对NSCs分化的作用
BDNF在体外可保持NSCs的活行和促进其向神经元分化。有研究表明, 应用出生2~3d大鼠脑皮质的神经干细胞, 通过免疫荧光技术分别观察BDNF组和对照组中β-tubulin阳性神经元数目, 结果发现BDNF组的阳性细胞数目明显多于对照组, 神经元的突起明显较对照组长[9]。且Wachs等研究认为, 当BDNF浓度为200ug/L时, 神经干细胞分化为神经元的比例最高[10、11]。
Vicario、Abejon等将中海马中分离细胞先培养在b-F G F中1 3-1 8 d, 再移B D N F中并检测神经元标志物微管相关蛋白-2 (microtublule associated protein-2, MAP-2) 、钙结合蛋白和突触蛋白, 发现M A P-2阳性细胞的数量增加2倍, 钙结合蛋白阳性细胞的数目增加3倍[12]。
Shimazaki 等亦发现, 只要将神经前体细胞暴露在BDNF中2h即可诱导完全的神经元分化, β-微管蛋白阳性细胞数目明显增多, 表明B D N F能促使有丝分裂后神经前体细胞向神经元样表型终末细胞分化[13]。体内实验亦获得了相同的结果, 将B D N F注入侧脑室, 不仅在注入侧的S V Z, 而且在沿侧脑室和第三脑室排列的特殊皮质结构, 如纹状体、下丘脑和海马中, 发现5-溴脱氧尿核苷 (5-bromod-eoxyuridine, 5-Brd U) 阳性细胞数目明显增多, 还能增加对吻侧迁移流和嗅球中新生神经元的数量, 表达神经元特异性标志物MAP-2和微管蛋白[14]。
2.3 神经营养素-3 (N T-3)
2.3.1 N T-3的特性和分布
NT-3是一种小分子量的碱性蛋白质, 与NGF和BDNF具有相似的一级结构。主要分布于海马、脑、脊神经节、脑干和脊髓等。
2.3.2 NT-3对NSCs分化的作用
体外研究表明, N T-3对交感神经元、感觉神经元、大脑皮层的上运动神经元、脊髓前角运动神经元以及大脑基底部的乙酰胆碱能神经元等均有维持存活的生物学作用。在体内, N T-3可以诱导神经干细胞分化, 调节其他神经营养因子的功能。
2.4 NT-4/5与NSCs分化的关系
神经营养素4/5 (neurotrophin-4/5, N T-4/5) 在中枢和外周分布很广, 对运动神经元、基底前脑的胆碱能神经元, 以及海马、下丘脑、延髓等处的神经元的生长、分化具有促进作用[15]。
3 NSCs的应用前景
3.1 细胞移植治疗
细胞移植技术用修复脑组织就是在体外培养和扩增NSCs或诱导其分化为定向祖细胞, 再移植到脑内, 以替代因疾病而丢失或缺损的神经细胞。应用于临床疾病如帕金森病 (parkinsonism disease, PD) , 亨廷顿病 (Huntington disease, HD) 以及阿尔茨海默病 (a1zheimer's disease, AD) 等[16]。
3.2 基因或药物治疗载体
动物实验表明, 经过基因修饰而携带有外源基因的NSCs移植到脑内后能迁移并整合于病变部位, 长时间表达外源基因产物。另外, 由于NSCs具有固有的迁移特性, 可用于中枢神经系统的肿瘤治疗。
4 问题及展望
对于NSCs的研究目前还处于起步阶段, 但随着分子生物学和细胞生物学技术的不断发展, 经过科学工作者几十年的努力研究, 在NSCs增殖分化的机制及应用等发面已经取得了初步成果, 但仍有一些问题尚待解决:
(1) 如何能够实现对NSCs准确的人工增殖和分化调控;
(2) 如何在脑损伤后创造内源性NSCs增殖和分化的内部条件;
(3) NSCs抑制后是否有肿瘤产生的可能等将影响NSCs增殖分化的影响因素彻底研究清楚后, NSCs必将会有一个广阔的应用前景。
摘要：神经干细胞 (NSCs) 是具有高度自我更新能力并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经前体细胞, 具有广阔的临床应用前景。神经营养素家族对神经干细胞的分化有一定影响。其包括:神经生长因子 (NGF) 、脑源性神经生长因子 (BDNF) 、神经营养素-3 (NT-3) 、神经营养素-4/5 (NT-4/5) 以及神经营养素-6 (NT-6) 。本文就目前神经营养素家族对NSCs分化的影响的研究现状进行综述。
关键词：神经干细胞,神经营养素家族,分化
神经干细胞分化 篇2
目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSCs)在体外诱导为神经源性细胞的可行性,并探讨其作用机制. 方法从Wistar大鼠骨髓中获得rMSCs.纯化培养传代后用不同浓度的`bFGF诱导,经MTT法检测bFGF对rMSCs生长的影响;用倒置光显微镜、透射电镜、免疫组化和RT-PCR等方法鉴定诱导后细胞行为改变与snail mRNA表达.结果 bFGF对rMSCs具有促增殖作用,在倒置光显微镜和透射电镜下可见到有神经胶质样细胞形成, 免疫组化证明GFAP的表达较对照组显著增高(P<0.01).RT-PCR结果表明,诱导组细胞snail mRNA明显表达.结论 bFGF促进rMSCs转分化为GFAP阳性的神经胶质样细胞,转录因子Snail可能与转化过程有关.
作 者：陈莉 买霞 扎拉嘎胡 陈小义 徐瑞成 CHEN Li MAI Xia ZHA La-gahu CHEN Xiao-yi XU Rui-cheng 作者单位：中国人民武装警察部队医学院,细胞生物学教研室,天津,300162 刊 名：解剖科学进展 ISTIC英文刊名：PROGRESS OF ANATOMICAL SCIENCES 年，卷(期)：2008 14(3) 分类号：Q257 R392.2+1 关键词：骨髓间充质干细胞 碱性成纤维细胞生长因子 细胞分化 Snail 大鼠★ 细胞分化人教版教学设计
神经干细胞分化 篇3
1 资料与方法
1.1 材料及试剂
DMEM/F12基础培养基、B27无血清添加剂为Gibco公司产品;表皮生长因子 (EGF) 和碱性成纤维生长因子 (b FGF) , BDNF为Pepro Tech公司产品;Brd U及其小鼠抗体购自Sigma公司;羊抗小鼠Ig G-FITC购自Zymed公司;兔抗大鼠神经丝 (NF) 多克隆抗体, 兔抗大鼠胶质纤维酸性蛋白 (GFAP) 多克隆抗体, 羊抗兔Ig G-CY3均购自Chemicon公司。新生SD大鼠 (<24 h) 4只和SD雄性大鼠 (体重250~300 g) 16只均购于中山大学医学院动物实验中心。
1.2 试验方法
1.2.1 海马NSCs的培养
无菌条件下分离出新24h内的SD大鼠海马组织, 仔细剔除血管, 机械剪碎, 加入D-Hank’s液反复吹打, 经200目滤网过滤后制成单细胞悬液, 计数后以5×104/m L的密度接种于含10 m L DMEM/F12的25 m L培养瓶中, 再加入终浓度为2%B27, 10 ng/m L b FGF, 10 ng/m L EGF, 放置在37℃, 5%二氧化碳的饱和湿度培养箱内培养。每天镜下观察, 待原代克隆形成后机械分离成单细胞悬液, 按上述条件继续培养细胞。以后每5~7 d分离克隆传代一次, 方法同前。经过几次传代, NSCs即可得到纯化。
1.2.2 AD模型的建立及分组
采用经典的穹隆-海马伞切断来建立AD模型[6], 具体方法如下:SD大鼠用1%戊巴比妥钠 (40 mg/kg) 经腹腔注射麻醉后, 采用平头颅位固定于大鼠脑立体定位仪上。参照包新民等的大鼠脑立体定位图谱, 以前囟为零点, 确定左侧海马伞的切割范围为: (1) 前囟后1.4 mm、正中线左旁开1 mm; (2) 前囟后1.4 mm、正中线左旁开3mm两点之间。手术过程分三步:第一步, 刀尖按前囟后1.4 mm、正中线左旁开3 mm插入, 深5.4 mm (以脑膜为准) , 往上抽动刀片, 再回到原处, 幅度为3 mm, 如此抽动10次;第二步, 把刀尖上升1 mm, 内进2 mm, 同样往上抽动刀片, 再回到原处, 幅度为3 mm, 如此抽动10次;第三步, 刀片按进刀轨迹退回至第一步入刀处, 再往上抽出刀片。
将建立好AD模型的SD大鼠16只随机分成对照组和BDNF组两组, 每组8只, 即刻行NSCs移植。
1.2.3 NSCs移植
移植前向培养瓶中加入Brd U (6ng/m L) , 培养48 h。移植时用25μL微量注射器吸取细胞悬液5μL (1×104个/μL) , 同样参照包新民等的大鼠脑立体定位图谱, 按左侧基底前脑坐标:前囟前0.6 mm, 正中线左旁开0.6 mm进针, 深6.5 mm。每分钟注入细胞悬液0.5μL, 10 min注射完毕, 留针5 min, 最后在10 min内缓慢拔出针头。伤口消毒, 缝合皮肤, 单独饲养。对照组单独移植NSCs, BDNF组则在移植的细胞悬液中加入终浓度为100 ng/m L的BDNF。
1.2.4 取材及染色
每组8只大鼠在移植后第2周灌注固定, 从移植位点冠状切面切片开始, 前后每5张 (100μm) 取1张切片, 片厚20μm, 取7张组成1套切片, 取2套切片分别行NF+Brd U和GFAP+Brd U免疫荧光双标染色以检测NSCs在体内的分化情况。
1.3 计数及统计学分析
在200倍视野下对每张染色切片进行双标阳性细胞数的计数。对于每只动物, 从7张切片获得一个总数值。统计学分析软件采用SPSS 13.0。结果用均数±标准差 (±s) 表示, 组间的差异用t检验进行分析。P<0.05被认为差异存在显著性。
2 结果
2.1 移植细胞的存活
通过Brd U免疫荧光染色能对移植前被其标记的NSCs进行示踪。结果表明大部分均能够在体内良好存活, 表现为细胞胞核圆, 部分呈单个散在分布, 部分呈团块状分布, 估计由单个细胞增殖而成或几个细胞团聚一起。也有少数移植细胞呈现凋亡特征, 表现为浓染致密的颗粒块状荧光或碎片状荧光。
2.2 移植细胞的分化
移植后第2周, 两组切片在移植处或移植处周围均可见GFAP+Brd U免疫荧光双标染色 (图1) 和NF+Brd U免疫荧光双标染色 (图2) 阳性的细胞, 表明移植的细胞在体内可以分化为胶质细胞和神经元。其中, GFAP+Brd U免疫荧光双标染色阳性细胞较多, 与体内反应性的GFAP阳性细胞夹杂在一起, 形态上有明显较多的突起, 胞核圆, 胞浆着色明显。而NF+Brd U免疫荧光双标染色阳性细胞较少, 表现为在胞体中央有一个大而圆的核, 胞浆少, 可见延伸较长的轴突。
A~C:对照组染色结果;D~F:BDNF组染色结果
2.3 统计学分析
对两组切片的NF+Brd U免疫荧光双标阳性细胞进行计数, BDNF组双标阳性数为 (86.0±13.6) , 对照组为 (59.5±12.2) , 行t检验分析, t=3.56, 两组相比差异有显著性 (P<0.05) 。而对GFAP+Brd U免疫荧光双标阳性数进行计数, BDNF组双标阳性数为 (475.2±22.2) , 对照组为 (452.3±27.9) , 行t检验分析, t=1.57, 两组相比并未呈现明显差异 (P>0.05) 。
A~C:对照组染色结果;D~F:BDNF组染色结果
3 讨论
因为神经元才是神经系统结构和功能的基本单位, 对于像AD和PD等退行性病变, 神经元的变性、坏死是其功能障碍的主要原因, 本实验用穹隆-海马伞切断来建立AD模型, 很好地模拟了AD基底前脑胆碱能神经元的大量死亡, 是已被广泛实验研究应用的经典模型[6]。对于移植到脑内的NSCs, 人们总是希望它们能更多地分化为神经元, 更好地达到替代治疗受损神经元的目的。然而影响NSCs分化的因素同样十分复杂, 何种物质诱导NSCs分化为何种特定表型神经元目前尚无定论。所以对于NSCs分化方向的控制已成为当今神经科学研究的一个热点问题[7]。
研究表明, NSCs具有很强的可塑性, 其分化不局限于来源区域, 内环境在其中起着有极其重要的地位。FRICKER等[8]将人胚前脑NSCs移植到室下带、海马和纹状体的不同区域, 结果发现移植的细胞可分化成这些区域的特异神经元, 提示局部区域存在诱导NSCs分化成特定神经元的信号。因此, 在NSCs的移植治疗中, 应充分认识和利用NSCs的强可塑性, 结合改变植入的微环境来操控其分化, 达到治疗目的。
细胞的分化教案 篇4
知识目标
⑴说出细胞分化的概念及在生物个体发育中的意义。
⑵举例说明细胞的全能性在生产实践与科学研究中的作用，说出细胞全能性的实质及植物细胞和动物细胞全能性的不同点，能够区分具体细胞全能性的大小。
能力目标
⑴在教师的引导下，师生共同探究，使学生学会学习，培养分析、归纳的思维能力和自主学习的能力。
⑵探究细胞分化的特点，细胞全能性的概念，培养学生的科学探究方法和生物学素养。
情感态度价值观
⑴通过细胞分化的学习，确立辩证唯物主义的自然观，逐步树立科学的世界观。
⑵通过细胞全能性的学习，进行有关干细胞研究进展资料的搜集和分析，养成关注生物科学发展、关注生命健康、关注社会热点等问题。
重点难点分析
细胞分化既是细胞生命历程中的重要阶段，又在个体发育过程中占有重要的地位。细胞全能性的知识涉及植物组织培养和克隆技术等，内容较抽象，学生缺乏一定的感性认识，细胞分化的概念是本节的重点和难点。
教学设计思想和教材分析
在教学设计中，本着自主学习与合作学习的教育理念，采用半开放式的课堂教学，引导学生结合图像信息、多媒体课件及相关的阅读资料、思考讨论题等，在教师的指导下完成本课的探究教学，从而增大了学生学习活动的空间，使其更加主动地参与到学习中来，养成爱学、会学的学习习惯。本课内容涉及细胞分化的概念及在个体发育中的意义，由高度分化的细胞能否继续进行分化引出细胞的全能性，在细胞全能性的教学中，尽量结合生产实际，把与之相关的内容展现在学生的面前，以使学生更易于理解。
教学策略
细胞分化是多细胞生物个体发育的基础，学习中要注意理解细胞分裂和细胞分化在个体发育中的不同作用。一般多细胞生物体的发育起点是受精卵，通过细胞分裂可以增加细胞的数量，但需经过细胞分化才能使生物体中的细胞形成具有特定形态、结构、功能的组织和器官，并最终发育成性成熟的个体。细胞分化的原因，是细胞中相关基因的打开与关闭的结果。对于本课的教学，教师应结合图像信息、多媒体课件等形势，把细胞的形态结构多样、功能多样以感性材料的形式展现在同学们面前，让他们通过听、看、思考等形式去领悟分化的内涵，区分分化与分裂的不同。同时教师应设计出本部分的探究思考题，引导学生自主的学习探究。由分裂的结果，染色体和DNA数目不变来分析细胞的全能性问题。一般来说，生物体都是由一个受精卵细胞经过细胞的有丝分裂繁殖而来，已分化的细胞都有一套和受精卵相同的染色体，携带具有本物种特征的DNA分子。因此分化的细胞仍具有发育成完整新个体的潜能。在一定的条件下，有些分化的细胞具有恢复分裂、重新分化的能力。在教学中，应结合当前的社会热点问题，如克隆羊多莉、胚胎移植、干细胞移植等引起学生的兴趣，从而有利于本节的教学。
课时安排 1课时
教学过程
引言：通过前面的学习，我们知道细胞主要是经过有丝分裂产生的。那么一个受精卵，如果只进行细胞的分裂，能形成我们这些具有一定形态、结构和生理功能的生物体吗?(学生回答：不能)细胞除了要进行细胞分裂之外，还需要进行怎样的变化呢?(细胞分化)今天我们就一起来探究这个问题。
(板书) 第二节 细胞的分化
一、细胞分化及其意义
请同学们结合新学案学习探究1、2、3、4，阅读教材P117-118页，并思考下列问题
1.你能举出一些细胞分化的实例吗?
2.构成不同组织和器官的细胞，为何形态、结构和功能多样?
3.细胞分化的特点和意义有哪些?
4.细胞的分裂与细胞的分化有哪些异同点?
5.细胞出现了分化，是不是遗传物质发生了改变?(或各种细胞具有完全相同的遗传信息，为什么会出现细胞的分化呢?)
教师结合多媒体课件，给学生提供大量的有关细胞形态、结构多样的图像信息，要求学生认真观察，引发思考，相互讨论，以解决第1和第2 个思考题。并进一步引发学生思考，到底什么是细胞的分化?(同学们讨论解决)老师要走入学生当中，了解学生在学习过程中暴露出来的问题和思想动态。学生通过自主学习，比较、归纳等方法，可以答出细胞分化的概念及细胞分化的特点及意义，也就是第3个思考题。第1、2、3小题的答案如下：
1.细胞分化的实例：如根尖的分生区细胞不断的分裂、分化，形成成熟区的输导组织细胞、薄壁组织细胞、根毛细胞等;胚珠发育成种子，子房发育成果实;受精卵发育成蝌蚪，再发育成青蛙;骨髓造血;皮肤再生等都包涵着细胞的分化。
2.因为不同的组织和器官的细胞，在分化过程中，要执行不同的功能。为了使结构与功能相适应，所以在结构和形态上也有了变化，具有了多样性。
3.细胞分化的特点是持久的、稳定的渐变过程，是不能逆转的过程。细胞分化是生物个体发育的基础;细胞分化使多细胞生物体中的细胞趋向专门化，有利于提高各种生理功能的效率。
接着教师要引导学生比较细胞分裂和细胞分化的问题了，由于在前面的章节中，刚刚讲过关于细胞分裂的问题，在引出细胞分化的时候，也涉及细胞的分裂，因此教师可以从细胞发生的变化、发生的时间、在个体发育过程中的意义角度，通过列表的形式来进行分析。同时也起到了温故知新的目的，提高了学生的学习兴趣，增强了信心。列表如下：即第4小题的答案
细胞分裂 细胞分化
细胞变化
数量增多 细胞形态、结构、生理功能发生稳定性差异，且这种变异是不可逆转的
发生时间 从受精卵开始，有些部位的细胞终生保持分裂能力，有的细胞发育到一定的时期就停止分裂。 胚胎早期开始出现细胞分化，是一种持久性的变化，在胚胎期达到最大限度。 在个体发育中的意义 保持了亲代和子代之间遗传性状的稳定性。 没有细胞分化，生物体就不能进行正常的发育。
通过细胞分化的概念分析，我们知道细胞分化的结果是产生了稳定的变异，这种变异是不是遗传物质发生了改变呢?这个问题自然而然的由学生提出来了。然后教师引导学生来解决这个问题，鼓励学生大胆的设想，以培养其科学研究的方法和科学创新的精神。答案如下：
5.不是;虽然各种细胞具有完全相同的遗传信息，但在个体发育过程中，不同的细胞中遗传信息的执行情况是不同的，在某些细胞中，控制性状的基因是打开的，而控制另外一些性状的基因是关闭的，所以出现了功能不同的细胞，也就是细胞的分化。
神经干细胞分化 篇5
关键词：神经干细胞,分化,干细胞,研究进展
干细胞 (Stem Cells, SCs) 是指具有无限的自我更新能力和多向分化潜能的一类细胞, 具有广泛的临床治疗应用价值。随着干细胞理论的提出, 为脑梗死、亨廷顿病、阿尔茨海默病等神经系统疾病的细胞移植治疗带来了新的希望。对于干细胞的替代治疗, 最早提出的是利用神经干细胞 (Neural Stem Cells, NSCs) 进行替代, 但NSCs取材困难, 且存在着较多的伦理学问题, 于是不少学者将目光转向了其他干细胞。目前, 研究发现大多数组织中均存在干细胞, 根据其部位不同可分别命名为胚胎干细胞 (Embryonic Stem Cells, ESCs) 、 骨髓间充质干细胞 (Bone Marrow Mensenchmal Stem Cells, BMSCs) 、脐带血间充质干细胞 (Umbilical Mensenchmal Stem Cells, UMSCs) 、 脂肪干细胞 (Adipose Tissue Stem Cells, ATSCs) 以及外周血干细胞 (Peripheral Blood Stem Cells, PBSCs) 。本文就近些年来不同组织源性干细胞向神经细胞分化情况作一综述。
1 神经干细胞
神经干细胞 (NSCs) 是指分布于神经系统的、具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能的一类细胞。其在神经系统中主要作为一种储备细胞, 即当神经系统受到损伤时, 如急性缺血性脑梗死、神经退行性疾病等, 这些干细胞便开始增殖、迁移及分化为相应的组织细胞, 以便实现结构和功能的代偿。NSCs不仅存在于哺乳动物的胚胎时期, 同时也存在于成年动物的脑组织内。其进一步分化可形成神经祖细胞 (progenitor) 、胶质前体细胞 (precursor) 及相应的神经元 (Neuron) , 但是物理或化学环境的不同, 其向神经细胞分化的能力也不同。Zhao等[1]将小鼠神经前体细胞 (Neural Precursor Cells, NPCs) 置于含20 ng/m L EGF、10 ng/m L b FGF、0.73 U/m L肝素的无血清培养基 (SFMC) 中培养, 第9 天时发现NPCs分化为星形胶质细胞 (astrocyte) 、 少突胶质细胞 (oligodendrocyte) 及神经元 (Neuron) 的比例分别为 (59.4±3.6) %、 (8.7±0.6) % 及 (8.2±2.2) %;随后在该分化条件下施加一直流电场 (115 v/m) , 实验组为施加连续2 d的电场, 持续2 h/d, 对照组未施加电场, 培养第9 天时发现实验组与对照组Nestin阳性比例分别为 (13.6±2.0) %、 (30.8±5.2) %, Nestin阳性比例下降提示施加一直流电场后显著提高了NSCs的分化效率, 比较差异有统计学意义 (P<0.05) 。此外, 在分化所得的神经细胞中, 实验组与对照组中 β-tubulinⅢ的表达分别为 (16.9±5.3) % 和 (8.2±2.2) %, 比较差异有统计学意义 (P<0.01) ;而GFAP及Olig2 方面比较差异则无统计学意义 (P>0.05) , 提示该直流电场可以促进NSCs向神经元方向分化, 而对于星形胶质细胞和少突胶质细胞则无明显影响。此外, 物理性因素对干细胞分化也有一定程度的影响[2]。Arulmoli等[3]在诱导成年大鼠NSCs分化时, 通过硅酮弹性体薄膜向NSCs施加适当的牵引力, 结果发现, NSCs向神经元和星形胶质细胞方向的分化并未受到明显的影响, 而向少突胶质细胞方向的分化明显减少, 比较差异有统计学意义 (P=0.001) , 提示机械牵引可以降低NSCs向少突胶质细胞的分化。尽管对于NSCs的研究已取得很大的成果, 但就目前而言, 干细胞移植仍然存在着诸多的问题亟待解决, 主要包括: (1) 如何让干细胞在体外完整的保存, 以及如何控制其进一步分化的机制尚不完善; (2) 干细胞移植尚无标准的方法及植入后相应的评价体系仍缺乏; (3) 尚无有效的方法针对植入宿主后发生的免疫反应进行干预; (4) 如何选择运载体并使目的基因按预期表达尚无定论。
2 胚胎干细胞
胚胎干细胞 (ESCs) 是指来源于着床前囊胚期的内细胞团 (Inner Cell Mass, ICM) 或早期胚胎原始生殖嵴的原始生殖细胞 (Primordial Germ Cell, PGC) 中的一种多潜能细胞, 在体外具有无限增殖和自我更新两大特征。有研究表明, 在一定的诱导环境下, ESCs可定向分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞及神经元[4,5]。Noisa等[6]成功将h ESCs转化得到人胚胎干细胞- 神经前体细胞 (h ES-NPS) , 将所得h ES-NPS置于含1%FCS的N2、B27 培养基中培养, 2 周后发现 β-tubulinⅢ和GFAP均呈阳性。若在N2 培养基中改加弗斯可林 (Forskolin) 、血小板源性生长因子 (PDGF) 、三碘甲状腺氨酸 (T3) 及维生素C, 则少突胶质细胞标志物Olig4 呈阳性。此外, 研究者将实验组h ES-NPS置于含SHH、FGF8 培养基中进行培养, 并加入20 ng/m L BDNF、20 ng/m L GDNF、160 μmol/L维生素C及0.5 μg/m L层粘蛋白, 免疫荧光下可见MAP2/TH阳性成熟神经元样结构, 实验组与对照组 (未加任何生长因子) MAP2/TH双阳性细胞分别占 (10.6±1.2) %及 (3.8±1.2) %, 同时还证实所得多巴胺神经元表达NURR1, PITX3 及EN1, 推测其为中脑DA神经元, 为h ESCs用于临床提供了理论依据。Lee等[7]抑制了h ESCs表面的一种糖蛋白Pr PC (Prion Protein) , 然后将其置于DMEM中培养40 d后发现, 所得细胞TH、Olig1、GFAP的表达较对照组明显降低, 比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 结果说明抑制Pr PC表达时, h ESCs向神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的分化会明显减少。此外, 实验还观察了h ESCs的分化与具体抑制Pr PC时间点的关系, 通过观察Syn、Olig1、GFAP的表达发现, h ESCs的分化程度与Pr PC被抑制的具体时间点无关, 而与抑制持续的时间长短有关, 当Pr PC被全程抑制时, 其Syn、Olig1、GFAP表达均呈阴性。由此说明, h ESCs不仅可以分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞, 而且在分化过程中Pr PC的表达起着重要的作用。此外, Stacpoole等[8]对不同氧浓度环境下h ESCs向神经细胞分化的效率作了研究。实验发现, h ESCs诱导形成Hb9 阳性运动神经元时, 3%氧气环境下所得细胞的Olig2 表达是20% 氧气环境下的2 倍。同样, 当诱导其形成中脑多巴胺能神经元时, 其表达情况为3% 氧环境下所得细胞EN1 表达是20% 氧环境下的5 倍。说明h ESCs在诱导分化时, 3% 氧气环境下比20% 氧气环境下分化为神经细胞的效率更高。这一结论对ESCs用于临床有极大的使用价值。但目前将ESCs应用于临床替代治疗仍然存在着一些问题, 如ESC的致癌性及是否形成畸胎瘤等。此外, 临床应用ESCs替代治疗时, 一定会涉及到细胞克隆技术及利用到人类早期胚胎等伦理学问题。诸多问题的限制, 使ESC目前仅用于科研, 难以临床推广。
3 骨髓间充质干细胞
间充质干细胞 (Mensenchmal Stem Cells, MSCs) 是一种具有多向分化潜能的成体干细胞, MSCs来源于中胚层间充质, 主要存在于结缔组织及间质中, 以骨髓组织中含量最高。目前, BMSCs跨胚层分化的具体机制仍然不太清楚, 但有研究表明, BMSCs可以向神经细胞分化[9,10]。Hermann等[11]发现人BMSCs不仅可以分化为神经前体细胞, 并且能够高水平表达原神经基因Neuro D1、Neurog2、MSl1、otx1 及Nestin, 并且前体细胞可继续分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞和神经元。Qiu等[12]将Trk C、NT-3 基因分别导入大鼠BMSCs体内, 将转基因BMSCs置于含5%FBS的DMEM中培养14 d, 结果发现NT-3-MSCs和Trk C-MSCs共培养组Tju-1 为 (88.25±4.31) % 明显高于其他组, 比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 此外, 还观察到突触结构, 推测转基因BMSCs已向神经元分化。Bonaventura等[13]将人BMSCs置于DMEM中进行悬浮培养, 并添加0.5 m M异丁甲基黄嘌呤 (IBMX) 、1 m M双丁酰环磷腺苷 (dbc AMP) 、20 ng/m L人表皮生长因子 (h EGF) 、40 ng/m L碱性成纤维生长因子 (b FGF) 、10 ng/m L神经营养因子 (NGF) 以及10 ng/m L脑源性神经营养因子 (BDNF) , 10 d后免疫荧光检测发现GFAP和Nestin呈阳性, 推测有神经细胞形成。Nandy等[14]在诱导h BMSCs向多巴胺能神经元分化时发现, 向培养基中加入10 ng/m L FGF2 所得多巴胺浓度为 (69.1±3.9) pg/m L明显高于加入0.1 μmol/L的ATRA所得多巴胺浓度时。此外, 两种培养基中GFAP阳性率分别为5.5%和8.3%, 提示培养基中有星形胶质细胞形成。说明BMSCs在分化为神经细胞的过程中, 加入的生长因子不同, 其进一步向神经细胞分化的能力也有差异。虽然以上实验均证明BMSCs可以向神经细胞分化, 但BMSCs在诱导分化过程中仍有不足之处, 比如其特异性标记物目前尚缺乏、没有标准化的分离、培养及鉴定的方法等, 此外, 其分化效率也不太理想, 以及分化所得的神经样细胞, 是否具有神经电生理功能等尚处于未知, 这些问题仍有待解决。
4 脐带血间充质干细胞
脐带血间充质干细胞 (UMSCs) 是指来源于围生期组织的一类不同于造血干细胞的、处于未分化状态的多潜能干细胞, 在不同的诱导环境下, UMSCs可以分化为任何组织细胞。尽管UMSCs在形态学上及分化性能上与BMSCs有较多的相似之处, 但是由于BMSCs的分化能力受到供者年龄的影响, 所以相比之下UMSCs比BMSCs更优越。有研究表明, UMSCs在一定环境下可以分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞[15]。Bonaventura等[13]将h UMSC进行悬浮培养, 并向培养基中加入1 mol/L dbc AMP、0.5 mol/L IBMX、20 ng/m L h EGF、40 ng/m L b FGF、10 ng/m L NGF及10 ng/m L BDNF, 培养第6 天时发现, 培养基中呈现出两类细胞群:一类为胶质细胞, 包括星形胶质细胞和少突胶质细胞;另一类在免疫荧光染色证实为神经样结构, 细胞数量较少, 体积较小、呈圆形, 推测为双极神经元样细胞。第10 天时, 大约70% 的细胞表现为GFAP、Nestin阳性。有研究将NTN基因和Lmx1a基因导入h UMSC中, 并将其先后置于神经元前体细胞培养基和神经元诱导培养基中进行培养, 第7 天时发现, 神经元前体细胞特异性蛋白 (Nestin) 表达呈阳性, 第21 天时, 成熟神经元相关的特异性蛋白 (NSE、MAP-2、β-tubulinⅢ) 及多巴胺能神经元特异性抗原均呈阳性, 而且此时Nestin表达明显降低[16]。提示h UMSC可以分化为神经细胞, 而且在分化的过程中, 先是形成神经前体细胞, 然后再分化为神经元。此外, 实验还将所得多巴胺神经元移植入PD猴模型体内, 移植后猴PD症状明显缓解, 推测移植的多巴胺神经元分泌了多巴胺。UMSCs在干细胞领域已经占据越来越重要的地位, 由于其来源相对简便, 免疫排斥反应相对较弱, 无论是在科研领域还是用于临床, 均有着广阔的应用前景。尤其是对于神经退行性疾病, 目前临床仍无有效的治疗方案, UMSCs可以作为临床治疗的种子细胞之一, 但治疗后的远期效果尚需观察, 其安全性还有待进一步临床考证。
5 脂肪源性干细胞
脂肪源性干细胞 (ADSCs) 是存在于脂肪组织中的、具有无限增殖、多向分化潜能的一类干细胞。ADSCs来源于中胚层, 在特定的环境下, 可以分化为骨组织、软骨组织、肌肉组织和脂肪组织及包括神经组织在内的多种组织细胞。ADSCs体外培养相对简单, 增殖周期短、来源较为丰富, 且无伦理学及法律方面的限制, 是一种理想的备选细胞。自2001 年Zuk等[17]发现并命名脂肪干细胞以来, ADSCs因为其众多优点而成为了继骨髓源干细胞以后的又一大热门研究。近年来, 大量的实验证明ADSCs可以向神经细胞分化[18]。Wrage等[19]将小鼠ADSCs首先置于含10%FBS的DMEM培养基中培养3 d, 3 d后更换为10%FBS的NDM培养基, 并向培养基中加入120 μmol/L吲哚美辛、3 mg/L胰岛素、300 μmol/L IBMX, 结果发现可检测到Nestin、GFAP、NSE及Tuj1, 提示得到了神经样细胞。随后, 应诚诚等[20]在Wrage实验的基础上进行了改善, 向培养基中加入EGF、b FGF及BDNF培养后发现, GFAP、β-tubulin表达阳性率分别为 (74.0±3.3) % 和 (65.3±2.1) %。 此外, Han等[21]将h ADSCs和h BMSCs向神经元分化的能力进行了比较。实验将h ADSCs和h BMSCs先置于含1%FCS、10 ng/m L b FGF和10 ng/m L EGF的H-DMEM培养基中培养24 h, 然后在含20 ng/m L BFGF、20 g/m L EGF、20 ng/m L睫状神经营养因子 (Ciliary Neurotrophic Factor, CNTF) 和6 mg/m L RA的H-DMEM中培养30 d后观察发现: 在0~7 d, h ADSCs与h BMSCs的MSCs形态特征开始逐渐消失, Nestin呈高表达状态, 两者尼氏体含量分别是 (2.1±2.5) %、 (16.4±2.1) %;7 d后, Nestin表达逐渐减少, h ADSCs与h BMSCs中 β-tubulinⅢ表达最高水平分别是 (61.7±1.9) % 和 (63.9±0.8) %, 说明h ADSCs已经向神经细胞分化, 而且与h BMSCs相比, 其分化为成熟神经元的速度相对较慢。虽然目前关于ADSCs的分化研究较多, 但是对于ADSCs用于临床替代治疗仍然存在许多问题, 比如脂肪干细胞分化的机制仍不明确、如何持续保留ADSCs分化特性及移植的细胞是否有致瘤性等问题。然而, 虽然存在众多问题, 但其有着来源丰富、无伦理学及法律方面的限制等优势, 这些研究必将被深入细化, 随着细胞分子生物学的迅速发展, ADSCs在干细胞领域的移植治疗必定有着广阔的前景, 无可替代。
6 外周血干细胞
外周血干细胞 (PBSCs) 是指释放到血液中的造血干细胞, 通常仅占干细胞0.06%。外周血中造血干细胞即外周血干细胞同样具有干细胞的特点, 具有分离获取较为简单、免疫源性相对较弱、无伦理学争议等一系列优点。目前已有研究的PBSCs主要为:CD34+造血干细胞 (hematopoietic stem cells, HSCs) 、外周血间充质干细胞 (PBMSCs) 和单核细胞 (peripheral blood mononuclear cells, PBMCs) 。文献[22] 报道, PBSCs在适当的微环境下可以分化为神经细胞。Wang等[23]将人外周血CD34+细胞通过病毒转染技术及培养后得到NSC, 将所得NSC置于适宜的培养基中培养一段时间后分别得到了神经元 (β-tubulinⅢ+) 、星形胶质细胞 (GFAP+) 和少突胶质细胞 (O4+) , 并证实 β-tubulinⅢ (+) 神经元为谷氨酸能神经元、GABA能神经元及多巴胺能神经元。Nichols等[24]从人外周血中分离出CD133+、ABCG2+、CXCR4+MSCs, 将其置于DMEM-LG中培养, 并向培养基中添加10% 人血清、10-3Mβ-ME、5×10-7M RA, 第7 天时发现, 实验组较对照组MSCs体积明显延长, 并伴有较多的细胞突起, TH (45.2±9.7) %、Tuj1 (35.23±7.9) % 和NEUN (28.2±11.1) % 均明显高于对照组, GFAP (4.88±2.4) % 稍高于对照组的 (3.49±0.7) %, 说明h PBMSCs在适宜的诱导环境下可向神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞方向分化。目前对于PBSCs的研究相对较少, 仍有众多问题亟待解决, 比如如何提高PBSCs在体内存活率, 如何有效的控制其定向分化, 分化所得的神经样细胞是否具备电生理功能及PBSCs的安全性如何等。尽管如此, 随着PBSCs研究的逐步深入, 以及其操作相对简单、易获取且无伦理学限制等一系列优点, 必将为基础及临床研究所青睐, 成为神经系统疾病治疗中的另一个核心。
7 其他
除以上所述的干细胞外, 近些年来造血干细胞 (Hematopoietic stem cells) 、表皮干细胞 (Epidermal stem cells) 、羊水源性干细胞 (Human amniotic fluid stem cells) 和子宫内膜干细胞 (Human endometrium stem cells) 等向神经细胞分化也有报道[13]。
神经干细胞分化 篇6
1 材料与方法
1.1 实验动物
新生Wistar大鼠, 由广西医科大学动物实验中心提供。
1.2 主要试剂
一抗为鼠抗巢蛋白 (Nestin) 、神经元核心抗原 (NeuN) 和髓鞘碱性蛋白 (MBP) 单克隆抗体以及胶原纤维酸性蛋白 (GFAP) 多克隆抗体 (Sigma) ;ABC试剂盒、FITC羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.3 药物制备
壮通饮:扶芳藤30 g, 三七10 g, 黄花倒水莲25 g。药材去除杂质切制后, 按组方剂量配比, 加入生药材10倍量的水, 浸泡60 min后, 用TC-15套式恒温器250V电压加热煎煮。沸腾后将电压调低至150 V, 保持微沸状态煎煮1 h, 滤取煎液。药渣再加入生药材8倍量的水, 同法煎煮1 h, 滤取煎液。合并两次煎液, 于恒温水浴锅 (100 ℃) 蒸发去水分至浓稠状, 转入恒温烘箱 (60 ℃) 干燥, 得干浸膏, 称重, 收膏率为36.80%, 4 ℃保存, 备用。临用前使用蒸馏水溶解浸膏至生药材含量为2.0 g/mL。
1.4 方法
1.4.1 原代培养
取新生当天Wistar大鼠, 乙醇消毒后断头取脑, 取双侧大脑海马区于D-Hanks液中, 剥离出脑膜及血管, 用眼科剪剪碎成糊状, 加DMEM/F12培养液 (Hyclone) , 用细口吸管机械吹打, 200目金属滤网过滤后获得单细胞悬液并计数, 以5×105/mL的细胞浓度接种到培养瓶中, 加入2% B27、终浓度为20 ng/mL的EGF和bFGF (均为Gibco产品) 后置37℃、5% CO2恒温孵箱中培养每3 d～4 d进行半量补液。培养7 d～9 d后, 机械分离神经球进行传代[3]。
1.4.2 传代培养
将原代培养7 d～9 d形成的神经球 (50～200个细胞/球) 悬液移至离心管, 低速离心后吸弃上清液, 机械吹打制成单细胞悬液后, 再以5×105/mL细胞密度接种培养。以后每6 d～8 d传代1次[4]。
1.4.3 神经干细胞分化及壮通饮诱导作用
培养的第2代神经球收集, 以约2×105/mL的细胞密度接种于24孔培养板各孔中。孔底放置预先用100 mg/L多聚赖氨酸处理过的盖玻片, 每块培养板分对照组和20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L壮通饮组, 每组6孔。对照组培养液为原有培养液去除bFGF及EGF, 另加10%胎牛血清 (FBS) 配制。壮通饮组培养液是在对照组培养液基础上加入壮通饮, 浓度分别为20 mg/L、40 mg/L和80 mg/L。将培养板置饱和湿度、37 ℃、5%CO2孵箱中培养。
1.4.4 神经干细胞鉴定
以神经干细胞标志物Nestin鉴定增殖期NSC, 并检测各组分化培养7 d时Nestin以及NeuN、GFAP和MBP (分别为神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞标志物) 表达情况。取出24孔培养板各孔中的盖玻片, 以4%多聚甲醛固定后, 0.01 mol/L PBS冲洗。检测Nestin用免疫荧光方法, 加一抗37℃孵育60 min, FITC标记的二抗孵育30 min, 甘油缓冲液封片后荧光显微镜下观察。余采用免疫细胞化学ABC改良法。DAB或BCIP/NBT显色, 着棕黄色或紫蓝色的细胞为阳性。其中小鼠抗NeuN及兔抗GFAP为1∶500、小鼠抗MBP为1∶200。Olympus倒置显微镜及普通光学显微镜下观察并拍照。在200倍数下, 每个盖玻片上随机选5个视野, 计算平均阳性细胞数。
1.5 统计学处理
实验数据以均数±标准差
2 结果
2.1 NSC的体外原代及传代培养
培养1 d细胞呈圆形亮点, 2 d～3 d可见有数个细胞形成的哑铃样结构, 4 d～5 d可以见到几十个细胞形成的神经细胞球 (neurosphere) , 6 d可见神经球明显增大, 直径达100 μm～150 μm, 8 d～10 d大的神经球直径已达到150 μm～200 μm。原代及多次传代培养 (目前在本实验室条件下已传10代) 形成克隆球的细胞圆润饱满, 边界清晰, 活力状态佳, 经鉴定Nestin表达阳性。
2.2 壮通饮对体外培养神经干细胞分化的影响
在去除bFGF及EGF, 加10%胎牛血清配制的培养基培养7 d后, 神经干细胞部分分化为NeuN染色阳性的神经元、GFAP染色阳性的星形胶质细胞和MBP染色阳性的少突胶质细胞。NeuN阳性神经元的胞体呈圆形或锥体形, 有较长轴突。GFAP阳性星形胶质细胞的胞体稍小, 胞突长而直, 分支较少。MBP阳性少突胶质细胞的胞体更小, 呈扁平状, 突起比神经元样细胞和星形胶质样细胞的少。添加壮通饮培养7 d后表达Nestin抗原的阳性细胞数较对照组明显增加 (P<0.05) , 而且表达NeuN (P<0.05) 、GFAP及MBP的阳性细胞数较对照组也明显增多 (P<0.01) 。随壮通饮浓度增加NeuN阳性细胞数逐渐增多 (P<0.01) , 但GFAP及MBP阳性细胞数壮通饮各剂量组无统计学意义。详见表1。
3 讨论
近年来研究发现[5], 在哺乳动物中枢神经系统存在NSC, 主要分布在海马、纹状体、脑室下区、嗅球以及发育过程中的大脑皮质和脊髓。本实验应用无血清培养技术从新生大鼠大脑海马中分离、培养成细胞悬浮球, 经鉴定呈Nestin阳性。 Nestin[6,7,8]即巢蛋白, 又名神经上皮干细胞蛋白, 属于中间丝蛋白, 主要在神经干细胞内一过性表达, 当干细胞向着终末细胞分化完成后, 其表达停止, 成熟细胞有着特异的表达标志物, 所以巢蛋白被广泛用于神经干细胞的标记物质, Nestin阳性表明为神经干细胞分化。
体外培养的神经干细胞与其所处微环境关系密切, 其中主要因素就是培养基质中的各种细胞因子, 这些因子的成分和浓度能决定神经干细胞的增殖及其分化方向[9,10]。因此, 利用某种药物对体外神经干细胞进行定向诱导增殖和分化, 为中枢神经系统损伤修复的治疗带来了新的希望。壮通饮中的扶芳藤对小鼠外周血造血干细胞有明显的动员作用, 并具有作为有效干细胞动员剂的潜力[11];三七总皂甙可以提高脑梗死患者骨髓干细胞动员率[12];三七总皂甙能够促进新生大鼠海马神经干细胞分化, 有促进干细胞增殖的作用[13], 但这些都是拘于对该方中单味药进行研究, 壮通饮是否能够诱导大脑海马区NSC增殖分化, 迄今缺乏明确的实验证据。本实验研究发现, 在NSC分化期, 添加壮通饮后, 表达Nestin抗原的细胞数较对照组明显增加, 同时表达NeuN、GFAP和MBP的阳性细胞数量显著增多。其中NeuN (神经元核心抗原) 在神经元分化成熟后开始表达, 是成熟神经元的特殊标志物[14,15];胶原纤维酸性蛋白是星形胶质细胞的特征性标志物[16];髓鞘碱性蛋白是少突胶质细胞的特征性标志物[17]。壮通饮能够促进新生大鼠大脑海马NSC的分化和增殖。在相同接种密度下对比三种不同剂量壮通饮组分化产生的阳性细胞数, 可以看出在本实验剂量范围内, 壮通饮浓度越大, 分化形成的神经元细胞越多, 而壮通饮对NSC分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞虽有促进作用, 但与其浓度的关系不大。提示壮通饮对NSC尚具有一定的定向诱导分化作用。
本实验证实, 壮通饮能诱导大脑海马区NSC分化, 具有一定的促进神经再生的作用。
摘要：目的 探讨壮通饮对体外培养大鼠大脑海马区内源性神经干细胞 (NSC) 分化作用的影响。方法 利用无血清DMEM/F12 (含20ng/mL bFGF和EGF及2%B27) 体外培养技术从新生Wistar大鼠大脑海马区中培养NSC, 在NSC分化过程中添加不同剂量 (20mg/L、40mg/L和80mg/L) 壮通饮进行干预, 以免疫荧光及细胞化学方法对NSC及其分化后的细胞进行鉴定。结果 从大脑海马区分离培养的NSC能够表达巢蛋白 (Nestin) , 并具有分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的能力。在同一接种密度条件下, 不同剂量壮通饮干预组Nestin阳性细胞表达数分别为:20mg/L组 (20.2±1.4) ;40mg/L组 (23.6±1.9) ;80mg/L组 (32.8±2.2) , 与对照组 (16.7±1.5) 比较明显增加 (P<0.05) 。壮通饮各剂量组表达神经元核心抗原 (NeuN) 、胶原纤维酸性蛋白 (GFAP) 、髓鞘碱性蛋白 (MBP) 的阳性细胞数较对照组明显增加 (P<0.05) 。结论 壮通饮能诱导大脑海马区NSC分化, 具有一定的促进神经再生的作用。
神经干细胞分化 篇7
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
红景天甙 (编号:110818, 中国药品生物制品检定所) ;BDNF、兔抗鼠Nestin一抗、兔抗鼠NSE一抗 (北京博奥森生物技术有限公司) ;Brdu试剂、驴抗鼠Brdu一抗、兔抗鼠GAD65一抗 (武汉博士德生物工程有限公司) ;EGF、bFGF (U.S.A) 等;胎牛血清 (国产) ;倒置荧光显微镜 (重庆蔡康公司) , TC2323型二氧化碳培养箱 (美国SHELDON公司) 等。
1.2 动物及分组
新生24h内Wistar大鼠2只 (佳木斯大学实验动物中心提供) , 以培养传3代的神经干细胞为材料设含10%胎牛血清培养液为对照组、10%胎牛血清培养液分别加BDNF、红景天甙、BDNF和红景天甙为实验组, 培养3d、7d、14d。红景天甙最终浓度10μg/mL通过预实验得。
1.3 原代培养及鉴定
取大鼠海马组织, 立即用Hank’s 液漂洗去除血渍, 快速剪碎并吹打成单细胞悬液, 过400目筛网, 离心弃上清, 调至密度为5×105个/mL后, 转入含无血清培养液的25cm2培养瓶中培养。37℃, 5% CO2, 80% 湿度的条件下培养约5～7d, 约2～3d换半量的培养液, 约5～7d传代1次。传2代后进行神经干细胞Nestin免疫荧光鉴定:①将细胞接种于涂有多聚赖氨酸的无菌盖玻片上, 放入六孔培养板内, 再加无血清培养液继续培养;②待贴片后吸去培养液;③0.01M PBS液漂洗5min×3次;④4%多聚甲醛固定30min;⑤0.01M PBS液漂洗5min×3次;⑥0.3%TritonX-100在室温下孵育15min;⑦0.01M PBS液漂洗5min×3次;⑧5%正常山羊血清室温30min;⑨加入Nestin一抗 (1:400) , 放入冰箱4℃过夜; (10) 0.01M PBS液漂洗5min×3次; (11) 加入Cy3二抗 (1:60) 室温下孵育1h; (12) 0.01M PBS液漂洗5min×3次; (13) 50%甘油封片, 立即荧光观察照相。见图1。
1.4 分化培养
Nestin鉴定成功后, 将传3代的神经干细胞接种于六孔培养板中, 分4组, 每组6孔。各组细胞分别用含血清、BDNF、红景天甙、BDNF和红景天甙培养液培养, 各自培养3d、7d、14d, 然后进行Brdu、NSE、GAD65免疫荧光鉴定 (Brdu用FITC免疫荧光法显色为绿色, NSE、GAD65用Cy3免疫荧光法显色为红色) , 方法同Nestin鉴定。
1.5 分化率的计算
同一视野下分别对Brdu/NSE、Brdu/GAD65阳性细胞和明视野下的总细胞计数, 分化率为Brdu/NSE、Brdu/GAD65阳性细胞数/明视野下的总细胞数, 同一张片子选取四个不同视野, 取平均值。
1.6 统计学分析
计数资料用χ2检验, 计量资料undefined多组间比较用方差分析, 两两比较用q检验, 所有数据用SPSS11.0统计分析软件处理及Excel2003软件处理, P<0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Brdu/NSE阳性分化率的比较
组内比较:BDNF组、红景天甙组Brdu/NSE阳性分化率7d与3、14d相比差异有统计学意义 (P<0.05) , BDNF和红景天甙组Brdu/NSE阳性细胞分化率7、14d与3d相比差异有统义学意义 (P<0.05) , 但7d和14d比无统计学意义;组间比较:红景天甙组、BDNF和红景天甙组在7、14d与对照组、BDNF组比差异有统计学意义 (P<0.05) , 其中BDNF和红景天甙组14d的分化率明显高于红景天甙组具有统计学意义 (P<0.05) 。见表1及图2。
2.2 Brdu/GAD65阳性分化率的比较
组内比较:BDNF组7d与3d比较差异有统计学意义 (P<0.05) , BDNF和红景天甙组7、14d与3d相比差异有统计学意义 (P<0.05) , 而14d与7d比差异有统计学意义 (P<0.05) ;组间比较:7dBDNF组、BDNF和红景天甙组与其他两组相应时间点比较差异有统计学意义 (P<0.05) , 而前两者之间比较无统计学意义, BDNF和红景天甙组14d与其他三组相对应时间点比差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表2及图3。
注:#:组内比较P<0.05, △:组间比较P<0.05, △△:与红景天甙组14d时比较P<0.05。
注:#:组内比较P<0.05, #a:与BDNF组3d时比较P<0.05, ##:与BDNF和红景天甙组7d时比较P<0.05;△:组间比较P<0.05
3 讨论
BDNF有通过其特异性受体酪氨酸激酶参与细胞的增殖分化、黏着与成熟, 促进中枢神经元的发育[1]等作用。目前认为, BDNF在诱导神经干细胞向神经元表型方向分化方面起着重要的作用。Vicario-AbeJón等[2]发现BDNF可使E16海马bFGF反应性神经干细胞分化为GABA能神经元的比例增高。另外, 谢青松[3]等人的实验可以得知, BDNF 还有促进bHLH基因的表达作用, 有利于神经干细胞的定向分化。有研究显示:在bHLH基因家族成员中的Mash1基因有明显的诱导GABA能神经元生成的作用;而红景天甙有抑制细胞的Ca2+超载、抗凋亡, 抗自由基, 上调海马中bFGF的表达, 营养神经细胞, 促进神经干细胞向神经元方向分化的能力[4,5,6]。本实验结果表明BDNF和红景天甙联合有利于神经干细胞向神经元方向分化;此外二者联合有利于GABA能神经元的分化, 可能机制:红景天甙可能是通过上调bFGF的表达, 增加bFGF反应性神经干细胞的数目, 再通过BDNF诱导使分化GABA能神经元的比例升高或促进BDNF增强对bHLH基因表达的促进作用, 使GABA能神经元数目增加, 或者通过其他途径增加BDNF诱导GABA能神经元分化的比例, 从而促进神经干细胞定向分化, 但具体作用机制尚待进一步研究。
参考文献
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[3]谢青松, 李立新.脑源性神经营养因子促进bHLH基因的表达和神经干细胞的定向分化[J].中国神经精神疾病杂志, 2006, 32 (6) :540-542
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神经干细胞分化 篇8
1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器
DMEM高糖型培养基(Gibco公司,美国),胎牛血清、胰蛋白酶、Ⅰ型胶原酶、dispase(sigma公司),RA、bFGF;MAP- 2、NSE、GFAP(proptech公司),CO2孵箱(Heraeus公司,德国),YJ- 875型超净2工作台(苏州净化设备厂),倒置相差显微镜、台式低温高速离心机、荧光显微镜(Nikone800)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养[1]
收集健康人(15～29 岁)因正畸或阻生拔除的新鲜第一前磨牙或第三磨牙,无菌条件下取出牙髓,常规组织块法以及Ⅰ型胶原酶和dispase酶消化法行原代培养,培养液为含体积分数为20%胎牛血清的高糖型DMEM。3 d观察见细胞呈集落状生长,多数似成纤维状,少数为椭圆形或多角形。细胞生长达80%汇合时,0.25%胰酶传代进行克隆化培养。
1.2.2 人牙髓干细胞免疫荧光染色鉴定
取生长良好的克隆化第3 代细胞爬片,进行STRO- 1检测。4%中性甲醛液固定 15 min, 0.1% Triton透化15 min, 5% BSA封闭30 min,STRO- 1 抗体37 ℃孵育2 h, FITC标记IgM荧光二抗37 ℃作用 30 min, DAPI染核, 每步均用PBS缓冲液正常冲洗,牙髓成纤维细胞作为对照,水性封片剂封片, 荧光显微镜下观察。
1.2.3 MTT法检测不同时间FGF、RA单独作用DPSCs的增殖情况
将第3 代DPSCs以2×104接种于5 块96 孔板,每孔100 μl。调零孔不含细胞。12 h后各孔换为诱导液,每日换液。分组如下:空白对照组,bFGF 5、10、 20、 30 ng/ml组、RA 0.125、 0.25、 0.5、 1 μg/ml组,每组设5 个复孔,分别于诱导后1、 3、 5、 7、 10 d加入20 μl MTT,37 ℃静置4 h,吸弃上清液,加入150 μl DMSO,37 ℃震荡10 min。用酶标仪测各孔A492值。
1.2.4 MTT法检测不同时间FGF、RA联合作用DPSCs的增殖情况
确定2 因子单独作用最佳促增殖浓度后,分组如下:A组: 空白对照, B组: bFGF 20 ng/ml,C组: RA 0.5 μg/ml,D组: bFGF 20 ng/ml与RA 0.5 μg/ml联合,每组设5 个复孔,方法同上。
1.2.5 bFGF、RA单独诱导人DPSCs分化
分别将第3 代DPSCs以2×104接种于铺片的24 孔板中,12 h后加入不同浓度诱导液。第一块板:空白对照、bFGF 5、 10、 20、 30 ng/ml;第二块板:空白对照、RA 0.125、 0.25、 0.5、 1 μg/ml;诱导后1、 3、 5、 7、 10 d,倒置相差显微镜观察细胞形态。用4%多聚甲醛固定20 min, 0.1% Triton透化15 min,5% BSA封闭30 min,加入抗MAP- 2、NSE、GFAP单克隆一抗,4 ℃过夜,加入羊抗鼠IgG,37 ℃反应1 h,每步都用PBS清洗后滴加DAPI,以未诱导牙髓干细胞作阴性对照。分别计算阳性表达率。细胞阳性率计算公式:阳性细胞数/细胞总数×100%
1.2.6 bFGF、RA联合诱导人DPSCs分化
确定RA单独作用具有促分化作用后,分组如下:A组:空白对照,B组:bFGF 20 ng/ml,C组:RA 0.5 μg/ml,D组:bFGF 20 ng/ml与RA 0.5 μg/ml联合。 方法同上。
1.2.7 DPSCs诱导后透射电镜标本制作
取克隆的牙髓干细胞诱导后7 d形成的细胞, 扩大培养至约 1×106～1×107 /ml, 0.01 mol/L PBS 洗一遍, 胰酶消化,培养液重悬,收集至尖底塑料小离心管中, 2 000 r/min离心10 min, 弃上清, 将细胞团块用2.5%戊二醛 4 ℃固定2 h 后, 常规透射电镜标本固定、脱水、包埋、切片、染色、观察。
1.3 统计学处理
采用SPSS 17.0 软件进行分析。实验数据用undefined表示。每种染色指标在每张片上随机选取10 个视野观察细胞。
2 结 果
2.1 细胞生长和形态
采用胶原酶消化法及过滤法得到的单细胞悬液,贴壁缓慢,12 h可见细胞呈不规则形,未完全伸展,24 h细胞呈类成纤维状,少数为多角形及不规则形。7 d后见细胞呈集落状生长,中心部位密集(图 1)。消化传代后,细胞仍呈集落样生长(图 2)。
2.2 STRO- 1的表达
荧光显微镜下观察,克隆生长的人牙髓干细胞出现STRO- 1阳性表达,细胞质内出现明亮的绿色荧光(图 3),对照组细胞仅出现模糊的暗绿色背景。
2.3 MTT法检测结果
各浓度RA单独作用时以0.5 μg/ml促增殖作用最强,作用7 d与10 d差异没有统计学意义(表 1)。各浓度bFGF单独作用时以30 ng/ml促增殖作用最强,20 ng/ml与30 ng/ml bFGF的差异没有统计学意义。20 ng/ml bFGF作用7 d与10 d差异没有统计学意义(表 2)。0.5 μg/ml RA与20 ng/ml bFGF联合作用7 d时,明显强于二者单独作用(表 3)。
2.4 诱导后细胞生长和形态
各组细胞诱导后5 d可出现突起伸长、胞体回缩、立体感和折光感增强等形态学变化,诱导后7 d出现典型的神经细胞形态(图 4)。部分细胞在诱导后并没有出现明显的形态学变化。提示只有一部分DPSCs发生分化。
①与培养液组比较, P<0.05; ②与RA 1 μg/ml组比较, P<0.05; ③与前一时间段比较, P<0.05
①与培养液组比较, P<0.05; ②与bFGF 30 ng/ml组比较, P<0.05; ③与前一时间段比较, P<0.05
①与培养液组比较, P<0.05; ②与D组比较, P<0.05
2.5 免疫荧光染色结果
诱导7 d bFGF单独各组及对照组(图 5)均未检测出抗MAP- 2、NSE阳性细胞。RA各组均出现抗MAP- 2、NSE、GFAP阳性细胞, 0.5 μg/ml RA诱导后百分率较其余浓度高(图 6～8,P<0.05,表 4)。 进一步实验发现0.5 μg/ml RA、 20 ng/ml bFGF 2 种因子联合诱导后阳性细胞较前者多(表 5)。
2.6 透射电镜结果
对照组(图 9A)可见DPSCs细胞形态不规则、表面有大量的微绒毛,细胞核大、梭形不整,胞核胞质比例大、核仁大而明显、常染色质占大部分,细胞质内线粒体嵴清晰、基质密度增加,核旁可见胞质丝结构丰富、粗面内质网扩张囊、粗面内质网腔内见蛋白粒子胞质丝。bFGF诱导后(图 9B)细胞体积变小、核内异染色质呈斑块状、细胞器数量增加、胞质丝增加。0.5 μg/ml RA、20 ng/ml bFGF 2 种因子联合诱导后(图 9C)DPSCs细胞体积增加,有伪足、核小、核仁明显、细胞质内有大量的高尔基体,分化的细胞内可见粗面内质网聚集。
①与对照组比较, P<0.05; ②与RA 1 μg/ml比较, P<0.05
①与对照组比较, P<0.05; ②与C组比较, P<0.05
A:原代人培养的hDPSCs(×5 000);B:bFGF诱导后的hDPSCs(×10 000); C:RA和bFGF联合诱导后的hDPSCs(×10 000)
A:Primary culture (×5 000);B:hDPSCs induced by bFGF (×10 000);C:hDPSCs induced by RA and bFGF combination (×10 000)
3 讨 论
Gronthos等[1]研究发现人牙髓组织中存在一类未分化前体细胞,并证明它们可分化为成牙本质细胞,并分泌细胞基质。将其与骨髓基质干细胞比较发现,它们同样具有成体干细胞横向分化的潜能,并将其命名为牙髓干细胞。随着进一步研究[2],又有学者发现DPSCs又可以向其它胚层的细胞如脂肪细胞、肌细胞、软骨细胞等方向分化。向神经细胞方向的分化成为近年来研究的热点。诱导成体干细胞向神经细胞分化方法主要有:①化学诱导,Lu 等[3]认为化学试剂诱导会使细胞出现毒性改变; ②基因转染或修饰; ③组织上清液诱导; ④中药成分诱导; ⑤细胞因子诱导,其可以部分模拟体内环境,但各种因子的组合、时间、先后顺序的选择仍不理想。
Yu等[4]用二甲基亚砜、丁羟茴醚和环磷酸腺苷, 3- 异丁基- 1- 甲基黄嘌呤体外诱导2 种牙髓细胞向神经定向分化。Agens等[5]发现使用细胞因子EGF、bFGF可以诱导成人DPSCs向成熟神经元分化。但目前寻找有效的生长因子组合及合理的时序仍在探索之中,也是诱导DPSCs分化需要解决的关键问题之一。
bFGF是中胚层和神经外胚层来源细胞的有丝分裂原。 Zhang等[6]研究发现bFGF能诱导 MSCs分化为神经元样细胞。bFGF的受体系统为双受体系统。 Tassi等[7]认为bFGF必须先后与细胞表面低、高亲和力bFGF受体结合,使其出现自磷酸化,再激活下游信号转导分子,激活的 bFGF受体被转接蛋白连接到 RAS/MAPK,完成细胞外信息向细胞内传递。RA是脊椎动物神经系统发育中重要的形成素,也对中枢神经系统早期分化起重要作用。低浓度的 RA 诱导神经腹侧表型,高浓度的RA主要诱导背侧表型[8]。Fahrenholz等[9]的研究表明维甲酸在治疗神经系统的阿尔茨海默病方面是一种有价值的方法。
Nakashima等[10]认为牙髓干细胞可能是牙齿发育过程中残留在组织中的神经嵴来源的干细胞群。神经嵴细胞的迁移和分化主要受多种信号分子调控,主要有维甲酸、FGF、内皮素、和Wnt家族。但RA在DPSCs的研究尚未深入,而且二者联合在DPSCs的增殖和分化方面的研究未见报道。
MTT测定发现各浓度RA单独作用时均有促增殖作用,随着浓度的增加,A492值也逐渐增大。各组与对照组差异有统计学意义,以0.5 μg/ml RA促增殖能力最强(P<0.05),但0.5 μg/ml RA作用7 d与10 d差异没有统计学意义(表 1)。各浓度bFGF单独作用7 d时以20 ng/ml的A492值最大,与其它组的差异有统计学意义(P<0.05)(表 2)。以往研究也表明[11]生长因子作用在细胞膜上的受体, 但其数量有限,当生长因子与相应受体结合达到饱和后, 即使再增加浓度也不能增强其作用,故认为0.5 μg/ml RA与20 ng/ml bFGF单独作用7 d时增殖作用最强,而0.5 μg/ml RA与20 ng/ml bFGF联合作用明显优于二者单独作用(表 3)。说明这2 种因子能在细胞间传递信息,可以协同促进DPSCs生长。
免疫荧光检测发现各浓度RA诱导后出现神经元特异性标记NSE和MAP- 2及神经胶质细胞标记GFAP的表达(表 4)。但各浓度bFGF诱导后及对照组均未出现相应阳性细胞。因20 ng/ml bFGF能与RA产生协同作用,故选其与各浓度RA组合,进一步研究2因子的促分化作用,发现20 ng/ml bFGF、0.5 μg/ml RA联合诱导后促分化作用明显优于其他各组(P<0.05)(表 5),是DPSCs向神经细胞方向分化较好的诱导方式。
透射电镜观察DPSCs(图 8)表现出干细胞的特点:核大、胞核胞质比例大、核仁大而明显,常染色质占大部分、细胞质内线粒体嵴清晰,核旁可见粗面内质网扩张囊。尼氏体由聚集的粗面内质网与核糖体组成,是神经元样细胞的典型标志。bFGF诱导(图 9B)后见细胞体积变小、核内异染色质呈斑块状、细胞器数量增加,未见尼氏体形成。0.5 μg/ml RA 单独作用及0.5 μg/ml RA与20 ng/ml bFGF联合作用(图 9C)观察到疑似神经元的表现,即见粗面内质网聚集,可认为幼稚尼氏体形成。
综上所述, 20 ng/ml bFGF、 0.5 μg/ml RA具有促DPSCs增殖的作用,且二者联合促其向神经细胞分化率显著提高,为最佳诱导浓度。本实验诱导出神经细胞分化的形态学改变,并有相应神经细胞标志蛋白的表达及超微结构出现疑似神经元的改变,但这种神经样分化的细胞是否具有神经元细胞电生理、生物化学等功能和结构特点,尚有待于进一步的研究来确定。
参考文献
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神经干细胞分化 篇9
神经干细胞的发现与应用为某些中枢神经系统疾病的治疗带来了新的曙光[1],但治疗的关键问题是要诱导神经干细胞定向分化为所需的神经元。因此,探求神经干细胞定向分化的最佳微环境成为研究的热点。本实验通过体外培养SVZa神经干细胞,然后分为对照组、BMP2组、ACM组、BMP2+ACM组分别予以诱导分化,研究SVZa神经干细胞在BMP2和ACM作用下分化为GABA能神经元的情况,希望为SVZa神经干细胞的定向分化研究提供一些实验资料。
1 材料和方法
1.1 材料
SPF级孕16 d Wistar大鼠及新生2 d的KM小鼠由第三军医大学实验动物中心提供。培养基及细胞因子:DMEM/F12(Hyclone)、BMP-2和bFGF(Peprotech)、B27(Gibco)、兔抗鼠GAD67(武汉博士德)、兔抗鼠GFAP多克隆抗体、山羊抗兔免疫组化SP检测试剂盒(SP-9001)、DAB显色剂及FITC标记山羊抗兔IgG(北京中杉)。
1.2 方法
1.2.1 SVZa神经干细胞的分离培养及鉴定
取SPF级孕16 d Wistar大鼠,经腹腔麻醉、备皮及消毒后,取出胎鼠。再次消毒后,固定于冰台,剪开头皮和软骨并剥离出整个鼠脑,清洗后在解剖显微镜下切取室管膜前下区脑组织。然后将切取的脑组织移入预置有2 m L无血清培养基的离心管内,用吸管轻轻吹打成单细胞悬液,调整细胞浓度后转移到75 m L培养瓶内,每瓶约1×106个活细胞,加入DMEM/F12(含20 u L/m L的B27和20 ng/mL的bFGF)无血清培养基5～7 m L,于37℃、5%二氧化碳、95%湿度孵箱内进行原代培养。此后根据细胞生长情况,一般每4、5 d传代1次。待细胞增殖形成悬浮球状克隆团后,免疫荧光染色法检测悬浮细胞球的nestin表达阳性。再用10%胎牛血清诱导分化后,分别检测NF、GFAP、CNP表达阳性,以验证其多分化潜能。
1.2.2 星形胶质细胞的纯化培养及ACM的制备
参照严稽文等[2]的方法,取新生2 d的KM小鼠大脑皮质进行原代培养,经差速黏附分离后按1×105个/cm2接种至用多聚赖氨酸包被过的培养瓶中。传代时,将培养瓶置摇床,振荡分离。传代后细胞按0.5×105个/cm2密度接种在培养瓶(培养板)中继续培养。传至第4代时进行细胞爬片,常规免疫组化染色鉴定。实验组的前期实验发现,在不停传代培养过程中,第3代的星形胶质分泌神经生长因子(NGF)、脑源性生长因子(BDNF)等的能力最强,传代培养后的第3～7天,NGF和BDNF的浓度较高。因此,本实验采用培养至第3代第5天的ACM,于收集前2天换入无血清DMEM培养基,收集的无血清ACM经离心后转入无菌玻璃瓶中,-20℃冻存待用。
1.2.3 免疫组化法镜下观察GAD67+细胞分化
取第3代纯化的SVZa神经干细胞,以5×104/m L密度接种于预先用1%多聚赖氨酸处理过的24孔培养板中,每孔1 m L,培养液为新鲜的含10%胎牛血清的DMEM/F12合成培养基,在此基础上分为对照组、BMP2组(加入10 ng/mL BMP2)、ACM组(培养液中含20%的ACM,80%的完全培养基[2])、BMP2+ACM组(在ACM组基础上加10ng/mL BMP2)分别诱导SVZa神经干细胞分化,每组设3个孔,第3、4天半量换液(换液时浓度同上),分化培养7 d后行常规GAD67免疫组化SP法DAB染色,在显微镜下观察分化情况。
1.2.4 流式细胞仪检测GAD67+细胞的比例
取第3代纯化的SVZa神经干细胞单细胞悬液,调整细胞浓度为1×105/m L接种于预先用1%多聚赖氨酸处理过的6孔培养板中,干预及分组情况同免疫组化法,每孔2 m L培养液。每个组设3孔,对照组共设6孔,其中3孔作为流式细胞仪检测的空白对照组。分化培养3d后行GAD67免疫荧光染色,用流式细胞仪检测阳性细胞数,每组3个标本,每个标本检测10 000个细胞,得到阳性细胞在总细胞中的所占比例。阳性率计算:阳性率=阳性细胞/(阳性细胞+阴性细胞)-对照组中的非特异结合率。
1.3 统计学分析
数据以表示,用SPSS 10.0软件进行统计,采用单因素方差分析,P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 SVZa神经干细胞的培养及鉴定
在无血清培养基中可见细胞呈球状克隆团样增殖,见图1,nestin表达阳性,见图2。再用10%胎牛血清诱导分化后,免疫荧光检测NF、GFAP、CNP表达阳性,说明所培养细胞不但能自我更新而且具有多分化潜能,属于神经干细胞。
2.2 免疫组化镜下观察
分化7d后免疫组化DAB染色可以发现,对照组中仅见少量的散在分布的GAD67+细胞,而实验组中GAD67+细胞数较对照组明显增加,尤其是BMP2+ACM组中GAD67+细胞数增加最明显,胞体呈卵圆形,有较长突起,细胞突起相互连接呈网状,见图3。
2.3 流式细胞仪检测分化率
SVZa神经干细胞分化为GAD67+细胞的比例为对照组(9.38±0.73)%,BMP2组(13.90±0.57)%,ACM组(16.85±0.59)%,BMP2+ACM组(20.45±0.94)%。各实验组的GAD67+细胞比例均明显高于对照组,其中BMP2+ACM组分化比例最高,单因素方差分析,P<0.05。
3 讨论
SVZa神经干细胞在体内背-腹信号控制下,不断沿着一条局限化的迁移通道-吻侧迁移流(rostral migratory stream,RMS)向嗅球(olfactory bulb,OB)迁移,最后在嗅球分化为具有OB表型特征的中间神经元,包括多巴胺能神经元和GABA能神经元。而SVZa神经干细胞除自我更新和多分化潜能外,还具有不同于其他神经干细胞的特点:可长距离定向迁移分向[3],故笔者选择SVZa神经干细胞作为研究GABA能神经元产生的细胞模型。
BMP2是转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员,对中枢神经系统的发育有着重要的作用。研究表明在E16d大鼠BMP2的免疫荧光染色显示,BMP2表达于从室管膜层(ventricular zone,VZ)到皮层的所有区域,这种表达方式同BMPR IA和BMPR IB的转录相吻合[4,5]。并且原位杂交显示,BMPR IA和BMPR IB广泛地在发育中的神经系统表达。这说明BMP2与神经干细胞的分化密切相关。MEHLER等[6]报道BMP2为1～10 ng/mL时促进祖细胞向神经元和星形胶质细胞分化,而在100 ng/mL时促进细胞凋亡。
神经干细胞在体内外的分化不仅受到自身基因的调控,而且更多地受到外来信号的影响,特别与其所处的微环境是密切相关的。星形胶质细胞是中枢神经系统内数量最多的一种胶质细胞,在结构和功能上是局部微环境理想的传感器和调控器。SONG等[7]发现星形胶质细胞可分泌神经生长因子(NGF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、脑源性神经营养因子(BDNF)等多种细胞因子,可以调控神经干细胞的分化,刺激神经元的产生。ACM作为星形胶质细胞体外培养时的细胞外液,其内含有丰富的可溶性生物活性物质,其促分化作用是单一神经营养因子所无法比拟的。NAKAYAMA[8]报道ACM中的可溶性因子是神经发育不可缺少的。
以往对GABA能神经元的研究多集中于海马来源的神经干细胞,而对于SVZa来源的神经干细胞分化为GABA能神经元报道较少。本研究结果显示BMP2和ACM均可促使SVZa神经干细胞向GABA能神经元分化,而且BMP2+ACM作用更显著(P<0.05),可获得正协同作用。其原因可能是:(1)两者促进神经干细胞向神经元分化的机制不同,存在互补作用。BMP2主要是与受体结合后激活Smad信号途径才能发挥生物学效应[9],而ACM中如GDNF主要是通过与GFR(1作用后促进GABA能神经元分化[10]。(2)有研究发现BMP2的诱导在作用初期较明显[11],而GDNF的作用时间窗较宽[10]。(3)JORDAN等[12]认为BMPs对神经元的作用是间接通过星形胶质细胞而产生,因此BMP2可能还有通过改变星形胶质细胞所分泌到细胞外液中的活性物质而达到调控GABA能神经元分化的作用。本研究为SVZa神经干细胞体外定向分化为GABA能神经元提供了基础研究资料。但BMP2与ACM促进神经干细胞向神经元分化的具体机制仍未完全阐明,有待进一步深入研究。
摘要：目的研究骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP2)及星形胶质细胞条件培养液(astrocyte-conditioned medium,ACM)在室管膜前下区(anterior subventricular zone,SVZa)神经干细胞分化为γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)能神经元中的作用。方法体外培养SVZa神经干细胞,分为对照组、BMP2组、ACM组、BMP2+ACM组分别予以诱导分化,通过免疫组化和流式细胞技术分别检测各组SVZa神经干细胞分化后GAD67+细胞的比例。结果各实验组的GAD67+细胞的比例均明显高于对照组,其中BMP2+ACM组尤其显著,差异有显著性(P<0.05)。结论BMP2及ACM可以促进SVZa神经干细胞向GABA能神经元分化,而且BMP2与ACM有正协同作用。
关键词：神经干细胞,细胞分化,GABA能神经元
参考文献
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