神经细胞凋亡（共12篇）
神经细胞凋亡 篇1
骨肉瘤好发于青少年, 恶性程度高, 预后较差。给社会及家庭造成很大的负担。使用联合辅助化疗5年生存率在70%左右[1], 多药耐药是骨肉瘤化疗失败的最主要原因[2]。因此研究骨肉瘤的发病机制, 对其早期诊断、治疗有十分重要的意义。然而目前对骨肉瘤发病机制的分子通路及其调控尚不十分清楚, 对骨肉瘤凋亡蛋白有部分研究, 但尚不全面深入。为了更好的研究骨肉瘤的发病机制, 我们采取人类细胞凋亡芯片进行检测未经化疗骨肉瘤组织及癌旁组织中表达异常的凋亡相关蛋白。
1 资料与方法
1.1 一般材料
1.1.1 标本选取
选取临床上怀疑骨肉瘤且未经化疗的病例, 行穿刺活检术。分别取瘤体组织和癌旁组织。取出标本一部分放入冻存管立即置于液氮中保存, 一部分送中南大学湘雅二医院病理科行病理检查。选用病理结果诊断为骨肉瘤的标本4例进行实验。
1.1.2 主要试剂及仪器
Protease inhibitor (上海世仪生物科技有限公司) , Proteome ProfilerTM ANTIBODY AR-RAYS kit (美国R&D Systems公司) , 摇床 (WD-9405A型, 北京市六一仪器厂, 沃德生物医学仪器公司) , 离心机 (Thermo BR4i, 美国) , 蛋白质浓度测定仪 (DUR800, BECKMAN COULTER, 美国) , Aprotinin (Sigma, Catalog#A6279) Leupeptin (Sigma, Catalog#L8511) , Pepstatin (Sigma, Catalog#P4265) , X-ray film (Kodak BioMax ML, Catalog#1788207) , ImageJ1.42图像处理软件, Photoshop图像处理软件。
1.2 方法
1.2.1 提取蛋白
a) 配制核蛋白-40裂解缓冲液 (10mm Hepes, pH7.5;142.5mM KCl;5mM MgCl2;1mM EDTA;1%NP-40) , 加入蛋白酶抑制剂 (1mg/mL Aprotinin;1mg/mL Pepstatin;1mg/mL Leupeptin;1mm PMSF) 和磷酸酶抑制剂 (2mm sodium orthovanadate;5mm sodium fluoride) 置冰上备用。b) 分别取未经化疗的病理组织活检确定的骨肉瘤组织及癌旁组织约80mg, 放到预冷的研钵中加入液氮研磨。研磨成微细均匀的粉末即可。加入上述混合液, 充分溶解后移入EP管中。4℃, 重悬、轻柔旋转30 min。14 000g, 离心5min, 取上清液移入EP管中。c) 蛋白质浓度测定。取400μg总蛋白上样。
1.2.2 人类细胞凋亡芯片检测
人类细胞凋亡芯片是一种快速、灵敏、经济的工具, 可以同时筛选35种凋亡相关蛋白的相对表达水平, 而不用进行大量的免疫沉淀反应和Western Blots操作。每个捕获抗体用已知靶蛋白的细胞株的细胞提取物进行精心的筛选。
按照说明书操作, 简要介绍如下:a) 用2.0mL的缓冲液1 (在Proteome ProfilerTM ANTIBODY ARRAYS kit中) 在摇床上孵育1h, 在250μg稀释的裂解缓冲液中摇床上2~8℃孵育过夜。b) 加入Detection Antibody Cocktail (在Proteome ProfilerTM ANTIBODY ARRAYS kit中) 在摇床上孵育1h, 蒸馏水反复冲洗3遍, 每一遍10min。c) 加入稀释的Streptavidin-HRP (在Proteome ProfilerTM ANTIBODY ARRAYS kit中) 在摇床上孵育30 min, 蒸馏水反复冲洗3遍, 每一遍10min。X-ray胶片显影, 扫描胶片。
1.2.3 图像处理
应用Photoshop图像处理软件进行图片剪切, 应用ImageJ1.42图像处理软件计算每个点的灰度值。
1.3 统计学分析
应用SPSS 13.0统计软件, 同种蛋白在癌组织和癌旁组织中表达差异采用两个独立样本t检验, α=0.05作为检验标准。
2 结果
2.1 病理组织结果临床怀疑骨肉瘤的患者行穿刺手术取活体组织标本, 送中南大学湘雅二医院病理科诊断 (见图1) 。
2.2 蛋白芯片分析结果, 见图2~6。
2.3 不同蛋白表达数据分析结果, 见图7。
3 讨论
蛋白质芯片技术是一种新型的用于样本蛋白分析的生物芯片技术。因具有高通量、髙灵敏度、高特异性、应用广泛等特点[3], 备受医学领域关注。目前用于肿瘤标记物的筛选, 包括消化系统、呼吸系统、生殖系统, 但是在骨肉瘤中应用较少。从细胞凋亡的角度来看, 恶性肿瘤的发生是凋亡机制受到抑制, 肿瘤细胞减少受阻所致[4]。骨肉瘤属于恶性程度极高的肿瘤。本研究证实抑制凋亡蛋白Bcl-2、cIAP、Clusterin、HSP27、Survivin在骨肉瘤组织中表达上调。目前研究抑制细胞凋亡通过两个途径:a) 与肿瘤坏死因子 (TNF) 受体结合抑制核转录因子NF-κB;b) 与各种参与凋亡的因子 (生长因子、细胞因子等) 结合。
图7癌旁组织和骨肉瘤组织Bcl-2、cIAP-2、Clusterin、HSP27、Survivin蛋白的表达 (P<0.05)
Bcl-2是Bcl家族中主要的抑制凋亡基因之一。线粒体在细胞的凋亡过程中发挥了核心的作用, Bcl-2蛋白位于线粒体膜上、核膜和粗面内质网, 不促进细胞增殖, 而是延长细胞寿命, 是一个明确的生存信号, 但当有其他癌基因如C-myc被激活, 细胞就会不断增殖[5]。主要的机制如下:a) Bcl-2能改变线粒体巯基的氧化还原状态来控制其膜电位, 从而调控细胞凋亡。b) 在细胞凋亡过程中, caspase可使线粒体PT (permeability transition pore) 通道打开, 导致线粒体内的细胞色素C释放到胞质中, Bcl-2蛋白可能是线粒体PT孔道的组成成分, 它在较高PH条件下能形成离子通道, 一般情况下它能封闭孔道的活性, 使一些小分子不能自由通透, 从而保护细胞免于凋亡。c) Bcl-2能将凋亡蛋白前体Apaf-1等定位至线粒体膜上, 使其不能发挥凋亡作用[6]。Zhao等[7]通过慢病毒诱导Bcl-2的表达下调, 提高阿霉素对骨肉瘤细胞的敏感性, 证实Bcl-2抑制骨肉瘤细胞的凋亡作用。Liu等[8]证实在骨肉瘤细胞中, 紫杉醇和吡柔比星可以在G2/M或G0/G1期阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡, 而这个过程依赖Bcl-2/Bax。王大平等[9]发现Bcl-2蛋白在骨肉瘤的表达水平明显高于骨良性肿瘤, 认为Bcl-2蛋白高度表达与骨肉瘤的发生有关。本研究发现Bcl-2蛋白在骨肉瘤组织中的表达水平明显高于癌旁组织。刘金洋等证实Bcl-2可能通过抑制Fas蛋白的表达来引起骨肉瘤的发生[10]。高天等[11]证实Bcl-2、凋亡指数 (AI) 可能成为评估骨肉瘤预后的一项重要指标。
cIAP-2和Survivin属于凋亡抑制蛋白家族。一方面它们可以抑制Caspase的作用来抑制凋亡, cIAP-2可以直接抑制Caspase的作用, 而有研究报道survivin并不能直接抑制caspase, 而是通过与凋亡抑制剂 (Smac) 相互作用抑制其发挥促进凋亡功能[12]。另一方面cIAP-2、Survivin和Clusterin可以通过TNF受体激活核转录因子NF-kB, 导致细胞增殖分化, 发挥抗凋亡作用[13]。劳克诚等[14]研究证实Survivin基因可能在骨肉瘤的发生发展中起重要作用, 可能为骨肉瘤的基因治疗提供了新的靶点。刘国辉等[15]研究证实Survivin mRNA在骨肉瘤组织中特异性表达, 可能在骨肉瘤的发生发展中起重要作用, 阻断Survivin mRNA的表达可为骨肉瘤的治疗提供新的途径。高嵩等[16]研究证实survivin蛋白表达与骨肉瘤发生发展密切相关, survivin蛋白可作为判断骨肉瘤发生发展的良好指标, 并为以survivin基因为靶点进行基因治疗提供理论依据。有研究表明Survivin mRNA高表达骨肉瘤患者的预后不良[17]。Survivin蛋白被阻断后明显抑制了骨肉瘤细胞系MG-63的分化和入侵[18]。在骨肉瘤细胞中, 通过小干扰RNA使clusterin基因沉默表达从而诱导自然凋亡、降低生长能力、降低细胞对遗传毒性和氧化应激的敏感性, 说明clusterin蛋白抑制骨肉瘤细胞凋亡的作用[19]。
HSP27为小分子热休克蛋白家族的主要成员, 在多种肿瘤表达增高, 与肿瘤的预后密切相关, 但在不同肿瘤, 其意义有所不同。可能的机制如下:a) 抑制热休克过程中蛋白的合成, 使真核细胞中未折叠的蛋白的量减少, 从而减弱对细胞的破坏作用。b) HSP 27可以防止热休克后肌动蛋白 (Actin) 的破坏, 维护细胞骨架的稳定, 增加对热的耐受性[20]。c) 在热休克后刺激RNA及蛋白质的合成, 协助细胞在死亡之前修复热休克造成的损伤, 使细胞尽快恢复正常生理功能[21]。d) 维持谷胱甘肽水平, 可以减少细胞间的活性氧 (ROS) , 维持线粒体膜电势稳定, 阻止细胞色素c的释放, 从而阻止细胞色素c依赖的细胞凋亡途径[22]。HSP-27可以和与Caspase-3结合, 抑制其活性, 从而抑制细胞凋亡的发生[23]。
本实验选取的标本是未经化疗的骨肉瘤组织和癌旁组织, 与处理过的组织相比更能说明疾病的发生状态。结果显示抑制凋亡蛋白Bcl-2、cIAP-2、Clusterin、HSP27、Survivin在骨肉瘤组织中表达上调, 并且具有相同或相似的调节通路, 说明它们可能在骨肉瘤发病机制中同时发挥作用。本实验存在的不足:a) 样本例数较少;b) 人类细胞凋亡芯片虽然具有髙灵敏度、高特异性特点, 但同时也是高通量的, 需要相关的实验方法如免疫组化、PCR、细胞培养等进行证实。在接下来的研究中我们会对其它的凋亡相关蛋白表达进行分析、探讨。
摘要：目的 通过人类细胞凋亡芯片筛选骨肉瘤中表达异常的凋亡相关蛋白, 为近一步深入功能机制研究奠定基础。方法 应用人类细胞凋亡芯片, 筛选骨肉瘤组织及癌旁组织中表达有差异的凋亡相关蛋白。应用ImageJ1.42图片处理软件求出每个孔的灰度值, 进行统计分析。结果 凋亡相关蛋白Bcl-2、cIAP-2、Clusterin、HSP27、Survivin在骨肉瘤组织中和癌旁组织中都有表达, 且其在骨肉瘤组织中的表达水平大于癌旁组织 (P<0.05) 。结论 凋亡蛋白Bcl-2、cIAP-2、Clusterin、HSP27、Survivin在骨肉瘤组织中表达上调, 可能参与骨肉瘤的发病机制。
关键词：凋亡,骨肉瘤,凋亡相关蛋白
神经细胞凋亡 篇2
一、定性和定量研究
只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）
进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳。
二、区分凋亡和坏死
可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测等。
不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等。
三、样品来源不同选择 组织：主要用形态学方法(HE染色，透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳)。
四、细胞凋亡检测
1、早期检测: 1)PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测 2)细胞内氧化还原状态改变的检测 3)细胞色素C的定位检测 4)线粒体膜电位变化的检测
2、晚期检测：
细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。
对于晚期检测通常有以下方法：
1)TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记)2)LM-PCR Ladder(连接介导的PCR检测)3)Telemerase Detection(端粒酶检测)
3、生化检测：
1）典型的生化特征：DNA 片段化
2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等 3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）4）通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP（多为dUTP）间接或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。
4、LM-PCR Ladder(连接介导的PCR检测)当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。
上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。需结合其它的方法来检测细胞凋亡。其它方法：
1）Telemerase Detection(端粒酶检测)端粒酶是由RNA和蛋白组成，它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。2）mRNA水平的检测
研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞（cytotoxic T cells）等靶细胞。Bcl-2 和bcl-X(长的)作为抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。用荧光定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确。通过检测fas, bax-alpha 和 bcl-X(长的)基因的 mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。
5、细胞内氧化还原状态改变的检测：
正常状态下,谷光苷肽(GSH)作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。
6、细胞色素C的定位检测
细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆，结合Apaf-1（apoptotic protease activating factor-1）后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。
7、线粒体膜电位变化的检测：
1）线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系
2）近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。而一旦线粒体跨膜电位耗散，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。
3）在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变，这是由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道(PT孔道)能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡。线粒体在细胞凋亡作用中的进一步证据：
1）若将纯化的正常的线粒体与纯化的细胞核在一起保温，并不导致细胞核的变化。但若将诱导生成PT孔道的线粒体与纯化的细胞核一同保温，细胞核即开始凋亡变化。2）形态学观察，看到细胞数目有限，统计学上的准确性受影响；
3）凝胶电泳检测DNA破坏了细胞的完整性也不能测出凋亡细胞占总细胞的比例； 4）流式细胞术可检测细胞、亚细胞及分子水平的特征性变化。用于流式细胞仪检测的染料：
PI、Hoechst、EB、DAPI、丫啶橙等，其中PI、Hoechst最常用。PI和Hoechst33342双标：
PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。
故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。PI和Annexin-V双标：
磷脂酰丝氨酸（PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期（或细胞损伤时）PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。
Annexin-V（green）可以和磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合。因此细胞处于调亡或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期的坏死细胞可能为阴性）。但是只有坏死的细胞PI是阳性
五、形态学观察
1、普通光学显微镜观察
2、透射电子显微镜观察
3、荧光显微镜观察
1、普通光镜下观察：
1)用苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失
2)Giemsa染色法、瑞氏染色法等，正常细胞核的色泽均一，凋亡细胞染色变深，坏死细胞染色浅或没染上颜色 直接用倒置显微镜观察： 1）细胞体积变小，全面皱缩；
2）凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。
2、透射电子显微镜观察
凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。
细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样，部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
3、荧光显微镜
常用的荧光染料：丫啶橙、PI、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等
Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。1）PI双染色法基本原理
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
注意事项：细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。
六、细胞凋亡的分子生物学检测方法: 细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²+和Mg²+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。过氧化物酶标记测定法
原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。
毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1％，若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后，则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。
本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。(一)试剂配制
1、磷酸缓冲液PBS（pH7.4）：磷酸钠盐 50mM，NaCl 200mM。
2、蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。
3、含2%H2O2的PBS缓冲液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS缓冲液 98.0ml。
4、TdT酶缓冲液（新鲜配）：Trlzma碱 3.63g用 0.1N HCl调节pH至 7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠 29．96g和氯化钴0.238g。
5、TdT酶反应液：TdT酶32μl；TdT酶缓冲液 76μl，混匀，置于冰上备用。
6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠 17.4g；柠檬酸钠 8.82g；ddH2O 1000ml 7、0.05％二氨基联苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4, 临用前过滤后，加过氧化氢至0.02%。8、0.5％甲基绿（pH4.0）：甲基绿0.5g；0.1M乙酸钠100ml。9、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。
10、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（ONCOR）
（二）实验步骤
1、标本预处理：（1）石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min。用无水乙醇洗两次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室温水解15min，去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次，每次2min，然后按下述步骤2进行操作。
（2）冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％中性甲醛中，于室温固定10min后，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃处理5min，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。
（3）培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约 5 × 107个/ml细胞于 4％中性甲醛室温中固定 10min。在载玻片上滴加 50～100μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。
2、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS，于室温反应5min。用PBS洗两次，每次5min。
3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴 TdT酶缓冲液，置室温1～5min。
4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反应液，置湿盒中于37C反应 1hr（注意：阴性染色对照，加不含TdT酶的反应液）。
5、将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30min，每10min将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。
6、组织切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min。
7、用PBS洗4次，每次5min。
8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05％DAB溶液，室温显色3～6min。
9、用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。
10、于室温用甲基绿进行复染10min。用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30s。依同样方法再用100％正丁醇洗三次。
11、用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。
（三）注意事项
例析细胞衰老、凋亡和癌变 篇3
生长和衰老、出生和死亡，都是生物界的普遍现象，生物的个体如此，作为基本生命系统的细胞也是如此。
例1 下图为人体某细胞所经历的生长发育各个阶段示意图，图中①~⑦为不同的细胞，a~c表示细胞所进行的生理过程。据图分析，下列叙述正确的是（ ）
A．与①相比，②③④的分裂增殖能力加强，分化能力减弱
B．⑤⑥⑦的核基因相同，细胞内的蛋白质种类和数量也相同
C．②③④细胞的形成过程中发生了基因分离和自由组合
D．进入c过程的细胞，酶活性降低，代谢减慢继而凋亡
解析 随细胞分裂次数的增加，细胞的分裂增殖能力减弱；⑤⑥⑦是由同一细胞分化而来的，细胞内的核基因相同，但由于基因选择性表达，细胞内的蛋白质种类和数量不一定相同；基因分离和自由组合发生在减数分裂中，②③④的形成是有丝分裂。
答案 D
点拨 个体衰老与细胞衰老有关，但二者不能划等号。（1）个体衰老的过程是组成个体细胞普遍衰老的过程。（2）对单细胞生物体说，细胞的衰老或死亡就是个体的衰老或死亡。（3）对多细胞生物来说，细胞的衰老或死亡不等于个体的衰老或死亡，如幼年个体中每天都有细胞衰老、死亡。个体的衰老不等于细胞的衰老，如老年个体中每天有新细胞产生。
二、细胞衰老的特征
细胞衰老的过程是细胞的生理状态和化学反应发生复杂变化的过程，最终表现为细胞的形态、结构和功能发生变化。
例2 关于衰老细胞特征的描述，不正确的是（ ）
A．细胞内的水分减少，结果使细胞萎缩。中年人鱼尾纹的出现就缘于此，所以中年妇女设法皮肤保水以葆青春
B．细胞内的色素会随着细胞衰老而逐渐积累，体现在老年人身上的是皱纹的出现
C．细胞膜通透性改变，物质运输功能降低，体现在老年人身上的是吸收能力下降
D．细胞内多种酶的活性降低，体现在老年人身上的是头发变白
解析 细胞内的色素会随着细胞衰老而逐渐积累，体现在老年人身上就是出现“老年斑”，皱纹的出现则是细胞内水分减少、细胞萎缩导致的。
答案 B
点拨 细胞衰老是细胞内发生的生理生化过程，衰老细胞在形态、结构和功能上都发生明显的变化。①形态上的变化：细胞内水分减少，细胞萎缩，体积变小；②结构上的变化：细胞核体积增大，染色质收缩，溶酶体数目增加；③功能上的变化：线粒体数目减少，使呼吸速率减慢，一些酶的活性降低，细胞膜通透性功能改变。
三、细胞凋亡的本质
基因决定细胞自动结束生命的过程，叫细胞凋亡。细胞凋亡严格受到由遗传机制决定的程序性调控，对维持内部环境稳定，以及抵御外界各种因素干扰都起着非常关键的作用。
例3 2002年，诺贝尔生理学和医学奖分别授予了英国科学家悉尼·布雷内、美国科学家罗伯特·霍维次和英国科学家约翰·苏尔斯顿，以表彰他们发现了在器官发育和“程序性细胞死亡”过程中的基因规则。“程序性细胞死亡”是细胞的一种生理性、主动性的自觉自杀行为，这些细胞死亡很有规律，似乎是按照编好的“程序”进行的，犹如秋天片片落叶的凋落。所以这种细胞死亡又称为“细胞凋亡”。以下说法错误的是（ ）
A．在人体发育成熟之前的阶段，总体来说，细胞“诞生”的多，“死亡”的少
B．发育成熟后，人体内细胞的诞生和死亡处于一个动态的平衡阶段
C．应该死亡的细胞没有死亡是机体抗性强的表现
D．“程序性细胞死亡”是基因调控的结果
解析 本题考查同学阅读资料，结合所学知识进行信息加工的能力。细胞的程序性死亡是基因调控的结果，在不同的生长发育阶段，新生细胞和死亡细胞的相对数量不同，发育成熟之前，新生细胞比死亡细胞多，发育成熟后，二者处于动态平衡，机体开始衰老时，死亡细胞比新生细胞多。细胞的衰老和死亡是一种正常的生命现象，如果该死亡的细胞没有死亡，可能细胞发生了癌变。
答案 C
四、细胞癌变的主要特征
正常机体内细胞的生长、分裂、分化和凋亡都是在机体的精确调控之中的。但有的细胞受到致癌因子的作用，细胞中的遗传物质发生变化，变成不受机体控制的、连续分裂的恶性增殖细胞，这种细胞就是癌细胞。
例4 使原癌基因和抑癌基因发生突变，导致正常细胞的生长和分裂失控而变成癌细胞。下列关于癌细胞的叙述，错误的是（ ）
A．癌细胞具有无限增殖的能力
B．细胞癌变可以由病毒感染引发
C．原癌基因只存在于癌细胞中
D．癌细胞的转移与细胞间黏着性下降有关
答案 C
点拨 癌细胞的主要特征包括：①适宜条件下，无限增殖；②癌细胞的形态结构发生了变化，例如体外培养中的正常成纤维细胞呈扁平梭形，转化成癌细胞后变成球形；③癌细胞的表面发生了变化，由于细胞膜上糖蛋白等物质减少，细胞间黏着性显著降低，导致癌细胞容易在体内到处游走分散，进行分裂、繁殖，形成肿块。
原癌基因与抑癌基因的关系：①原癌基因是维持机体正常活动所必需的基因，在细胞分裂过程中它负责调节细胞周期，控制细胞生长和分裂的进程。只有当原癌基因突变成癌基因（或称激活、活化）后，细胞才会恶性增殖；②抑癌基因是一类抑制细胞过度生长、增殖，从而遏制肿瘤形成的基因，抑癌基因的丢失或失活，可能导致肿瘤发生；③抑癌基因和原癌基因共同对细胞的生长和分化起着调节作用。
1．下列有关细胞衰老主要特征的描述，属于结构改变并且错误的是（ ）
A．细胞膜通透性改变，使物质运输功能降低
B．细胞核体积增大，染色质收缩
C．核孔是离子、水分子等的运输通道
D．人的衰老细胞萎缩，体积变大、
2．下列关于细胞凋亡和细胞坏死的叙述中，错误的是（ ）
A．细胞凋亡是主动的，细胞坏死是被动的
B．细胞凋亡是生理性的，细胞坏死是病理性的
C．细胞凋亡是由基因调控的，细胞坏死是由外界因素引起的
D．细胞凋亡是急性的，细胞坏死是慢性的
3．衰老的红细胞具有以下哪些特征（ ）
①水分减少，细胞萎缩 ②新陈代谢的速度减慢 ③某些酶的活性降低 ④呼吸速率上升 ⑤色素积累增多 ⑥呼吸速率减慢 ⑦细胞核的体积增大 ⑧细胞膜的通透性功能发生改变
A．①②③④⑤⑥ B．①②③④⑤⑥⑦⑧
C．①②③⑤⑥⑧ D．①②③④⑤⑧
4. 下面为动物机体的细胞凋亡及清除示意图。
[凋亡诱导因子][凋亡相关基因][细胞凋亡][消除凋亡细胞][凋亡信号][膜受体][结合][激活][执行][吞噬细胞][①][②]
据图分析，不正确的是（ ）
A．①过程表明细胞凋亡是特异性的，体现了生物膜的信息传递功能
B．细胞凋亡过程中有新蛋白质合成，体现了基因的选择性表达
C．②过程中凋亡细胞被吞噬，表明细胞凋亡是细胞被动死亡过程
D．凋亡相关基因是机体固有的，在动物生长发育过程中发挥重要作用
细胞凋亡的研究进展 篇4
1 APO研究简史
APO的研究可以追溯到19世纪中叶。早在1858年, 病理学家Virchow就发现正常组织中存在着持续的、不同于病理性坏死的细胞死亡现象。20世纪初, Graper指出APO是生物体保持自稳态的一种重要方式。20世纪50年代发育生物学家Gliicksman首次观察到了脊椎动物胚胎在正常发育过程中出现细胞正常死亡现象;60年代Lockshin等认为这是一种生理性细胞死亡, 称之为程序性细胞死亡 (programmed cell death, PCD) ;70年代病理学家kerr等在光镜和电镜下均发现细胞的这种生理性死亡的形态学特征与病理性的细胞死亡不同, 并首次提出了apoptosis的概念。80年代, 由于Wyllie等建立了淋巴细胞体外凋亡实验模型, 证明核酸内切酶反应是APO的重要步骤, 从而扩展了APO的研究领域。进入90年代, 分子生物学技术的应用加速了APO的研究进程, 开始阐明APO的生物学规律及其在许多疾病中的作用。
2 APO的生物学特性
细胞死亡是指细胞生命活动的终止与消亡。目前已知, 多细胞生命过程中存在着两种不同的细胞死亡形式:一种称为坏死 (Necrosis) , 指细胞受到来自体外的损伤因子, 如物理及化学损伤、微生物感染、组织缺氧、缺血等作用后发生的细胞死亡。其形态学改变表现在细胞体肿胀, 细胞器破坏, 核染色质崩解, 胞浆内容物溢出细胞外, 引起炎性细胞聚集, 累及周围组织, 出现典型的炎症反应过程。坏死是被动的细胞死亡过程, 属细胞病理性死亡。另一种细胞死亡形式则是APO, 指有核细胞在一定条件下通过启动内部死亡机制, 按特定的基因程序自行结束生命的过程。APO的典型形态学改变表现为, 开始细胞体变圆、胞浆量减少、核染色质浓缩、核仁裂解, 继之细胞膜内陷, 胞体自行分割成许多由膜包裹的超微结构完整的细胞体, 称凋亡小体 (Apoptoticbody) , 最后凋亡小体被邻近组织识别、吞噬或自行脱落, 离开生物体。凋亡过程生物膜完整, 无溶酶体和线粒体等成分外溢, 不伴有周围组织的炎症反应。APO是一种主动的细胞自杀过程, 属细胞的生理性死亡。目前文献中常将PCD与APO通用, 严格讲二者在概念和生物学特征上均存在一定的区别。PCD主要代表功能概念, 指生理性的细胞死亡;APO则强调细胞死亡的形态学改变, 可以是生理性的细胞死亡, 也可指病理性细胞死亡。细胞增殖和细胞死亡之间的平衡是维持生物体自身稳定的必要条件, 是生命存在的基础。正常情况下生物体具有自我更新能力, 衰老的细胞和发生突变的细胞可通过启动自身调节机制自我消亡或通过免疫系统被清除掉, 从而保持自身的正常功能。APO不仅在哺乳动物胚胎的发育、成熟, 血液细胞的分化、更新, 生殖细胞的发生、进化和机体生物功能的维持中具有重要作用, 而且与某些疾病的发生和发展密切相关。
3 Caspase家族与细胞凋亡
细胞凋亡发生的机制是蛋白溶解系统活化, 涉及一组蛋白酶家族, 称为半胱氨酰天冬酸特异性蛋白 (Cysteinyl aspartate specific protease, 简称Caspases) 。细胞凋亡时, 先出现没有活性的Caspases前体, 前体可以激活蛋白酶激发因子, 然后作用于底物蛋白, 蛋白分解引起凋亡。
Caspase是一类天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶, 在人类细胞中Caspase的超量表达和激活均会引起细胞凋亡, 因此又称死亡蛋白酶。迄今为止, 在哺乳动物中已经发现至少有13种Caspase成员参与了细胞凋亡。Caspase在细胞内通常以无活性的酶原形式存在, 其内部特定的天冬氨酸残基部位蛋白质的裂解加工可导致酶原激活, 引发细胞凋亡。Caspase家族是整个细胞凋亡过程的关键, 它们通过与众多蛋白质 (激活因子或抑制因子) 的相互作用来调控细胞的生存与死亡。
3.1 Caspase的激活
尽管存在少数Caspase非依赖性细胞凋亡, 但是绝大多数细胞凋亡依赖于Caspase的激活。根据Caspase在细胞凋亡中的不同功能, 可以将其分为两类:第一类Caspase直接对细胞的功能蛋白进行水解并导致细胞解体, 称为效应Caspase;第二类Caspase参与上游事件的调节并启动蛋白酶解级联反应, 称为启动Caspase。在细胞凋亡过程中, 作为传感器的细胞表面死亡受体接受由死亡配体发出的死亡信号, 并传递到胞内, 激活Caspase家族成员, 借助凋亡信号结构域 (DED、CARD等) 导致Caspase成员的相继激活, 进而降解特定的靶蛋白, 最终导致细胞死亡。在细胞凋亡中, Caspase的激活是关键的一步, 目前关于Caspase激活的机制主要有2种, 即“Caspase级联”机制和“诱导临近”机制。
大量的遗传学和生物化学证据都支持“Caspase级联”激活机制。活化Caspase的蛋白酶首先激活启动Caspase, 再由活化的启动Caspase激活下游的效应Caspase, 最后由效应Caspase水解一系列底物, 造成细胞生化性质的改变而进入死亡共同通路。不同的启动Caspase可以介导不同的凋亡信号, Caspase-8介导死亡受体传递的凋亡信号, 而Caspase-9参与基因毒试剂诱导的死亡信号。Caspase激活的另外一种策略是“诱导临近”策略, 即通过形成一个死亡诱导的信号复合体来诱导Caspase-8酶原分子聚集, 导致Caspase-8酶原局部浓度的升高, 进而驱动Caspase-8酶原分子之间的酶促激活。活化的Caspase-8通过Caspase募集结构域 (Caspaserecruitmentdomain, CARD) 作用激活下游的效应Caspase, 进而导致细胞凋亡。
3.2 Caspase诱导细胞凋亡的机理
在细胞凋亡中, Caspase可以采用不同策略有效地水解维持细胞基本结构和功能的蛋白质, 从而杀死细胞。首先, Caspase可以直接拆卸细胞结构, 破坏支持核膜和染色质组织化的刚性结构——核板。核板由核纤层蛋白头尾聚合而成。在凋亡过程中Caspase特异性地切割核纤层蛋白, 引起核板倒塌, DNA降解。其次, Caspase能通过灭活细胞凋亡的抑制因子而杀死细胞。例如, 小鼠淋巴细胞中受Caspase激活的DNase (Caspase-activatedde-oxyribonuclease, CAD) 可以与其抑制因子ICAD结合。ICAD抑制了CAD的DNase活性和核定位信号, 使CAD位于细胞质中。凋亡信号激活Caspase后, Caspase-3水解ICAD, 释放CAD进入细胞核, 发挥DNase活性降解染色体DNA, 导致细胞解体。
细胞凋亡的许多关键事件集中在线粒体, 包括Caspase激活子的释放、电子传递链的解体、氧化磷酸化、胞内氧化-还原电位的改变以及Bcl-2家族蛋白的参与等。因此, Caspase的激活受到线粒体的严谨调控。Caspase主要受其激活因子和抑制因子的调节。Bcl-2通过与凋亡蛋白酶活化因子-1 (apop-toticproteaseactivatingfactor-1, Apaf-1) 的相互作用, 阻止CytC对Caspase的激活, 从而延迟细胞凋亡。但当Bcl-2与Bax形成异源二聚体时, 则又启动死亡周期。此外, 调控启动Caspase与辅助因子的相互作用也能实现对细胞凋亡的调节。而细胞凋亡抑制因子 (inhibitorsofapoptosis, IAPs) 则是通过抑制Caspase效应分子的活性来阻止凋亡。
4 细胞凋亡与细胞坏死的区别
细胞凋亡的识别, 早期以病理形态学检查 (光镜和电镜) 为主, 近年发展的TUNEL (终端脱氧核糖基转换酶传递三磷酸脱氧尿苷生物素终端切口标记) 技术、DNA梯状图谱标记技术及流式细胞仪技术, 使对细胞凋亡的研究更加深入。
5 细胞凋亡的阶段
5.1 信号传递
诱导细胞凋亡的因素很多, 各种诱导凋亡因子进入细胞内需经过信号传递阶段, 进入细胞内的途径主要是受体介导。接受凋亡信号的受体位于细胞表面, 称为死亡受体 (deathreceptors, DR) , 包括肿瘤坏死因子受体、CD95和DR系列。死亡受体位于膜和胞质两区域, 前者传导死亡信号, 后者称死亡区域, 它参与激发蛋白酶系列和细胞凋亡调节机制。
5.2 中央调控
凋亡激发因子作用在线粒体, 使线粒体内死亡基因ced-3/白细胞介素1β转化酶 (ICE) 和ced-4以及死亡抑制基因ced-9/bcl-2激活, 两者中一方居优势, 即决定细胞存活或凋亡。当ced-9/bcl-2和ced-4 (连接蛋白) 和ced-3/ICE相结合, ced-3不能活化, 防止一连串Caspases级联反应, 细胞存活;当ced-9/bcl-2被促凋亡因子EGL-1结合, bcl-2失活, ced-4使ced-3/ICE活化引起细胞凋亡。
5.3 细胞结构改变
在前两阶段基础上, 凋亡细胞出现特异的形态变化, 如细胞皱缩、核致密、微绒毛消失。细胞核的改变, 是Caspases活化的DNA酶 (CAD) 进入细胞核内使染色体的DNA断裂引起细胞死亡。CAD的抑制因子ICAD拮抗CAD。
5.4 影响细胞凋亡的因素
诸多因素可影响凋亡的发生, 一些因子、基因表达产物对凋亡有促进作用。某些因素有普遍诱导作用, 如放射线、紫外线照射导致DNA损伤, 诱导多种细胞凋亡发生。在影响凋亡的基因中, bcl-2原癌基因、myc基因、P53基因研究较多。bcl-2基因对凋亡有明显抑制作用, 且与细胞存在周期无关, 其作用于细胞丢失方面, 并非在于刺激细胞增殖。在培养的B细胞中, 去除IL2或IL6, bcl-2抑制凋亡作用丧失, 说明bcl-2抑制细胞凋亡需要某些因子 (IL2、IL6等) 的参与。myc基因既有刺激细胞增殖, 又有刺激细胞凋亡的作用, 结果取决于细胞接受的外来信号, 若为存活刺激信号, 细胞便增殖, 否则出现凋亡。外来信号对myc作用的详细机制尚不清。P53基因是一种抗癌基因, 正常的P53基因 (野生型) 与突变型均参与细胞凋亡的调节, 野生型对凋亡有促进作用, 突变型有抑制作用。某些病毒感染靶细胞后, 为了延长宿主细胞的寿命, 以利其自身的复制, 则抑制宿主细胞发生凋亡。如EB病毒在感染的宿主细胞中诱导bcl-2表达, 并编码bcl-2基因的同类物。腺病毒的E1B19KDE蛋白具有抑制细胞凋亡的作用。细胞因子APO/Fas、TGFβ1等参与凋亡的调节。
6 细胞凋亡在疾病防治中的可能性应用
Caspases理论及凋亡发生机理探索防治疾病的方法, 正在从动物实验和临床两方面进行, 其疾病防治的机理主要有两种:通过启动或抑制Caspases系统来促进或抑制细胞凋亡。
6.1 抑制细胞凋亡对疾病的防治
过度凋亡所致的疾病, 如神经退行性病变、视网膜退行性病变、移植排斥、肝炎等疾病以及脑缺血神经细胞凋亡引起的新生儿窒息、老年脑缺血、老年痴呆症均可以用Caspases抑制剂预防。有些病毒感染可以阻止细胞凋亡, 使病毒得以在活细胞中繁殖, 可利用病毒或者企蛋白抑制Caspases系统来防止凋亡或利用小分子多肽来防止凋亡。
6.2 促进细胞凋亡对疾病的防治
肿瘤细胞常呈凋亡不足, 放疗和化疗可以诱导肿瘤细胞凋亡, 通过活化Caspases酶系统或活化死亡受体启动Caspases系统可以促进凋亡。另外, 某肿瘤细胞可能是bcl-2表达过度、p53表达不足或者突变使肿瘤细胞死亡减少, 也可以据此来设计治疗策略。另外, 某些病毒为了逃避被感染宿主的防御, 可以表达一种蛋白来破坏被感染细胞对凋亡的正常调节。如HBx蛋白是一种可影响转录和细胞生长的多功能调节因子, 与肝癌的发生密切相关, 当HBx表达质粒与其它致癌基因 (Haras、V-src、V-myc、V-fos等) 共同转染NIH3T3细胞时, HBx的引入完全废除了这些致癌基因的病灶形成能力, 而当凋亡抑制因子bcl-2与这些致癌因子共转染时则不影响其功能, 说明HBx是通过诱导凋亡来抑制病灶形成的。由于对有关疾病产生细胞凋亡机制的了解, 可以应用于疾病的防治, 成为一个全新的治疗理论, 因此, 细胞凋亡的理论研究将有广阔的应用前景。
参考文献
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细胞凋亡与肝脏疾病 篇5
[关键词] 细胞 肝脏疾病
健康网讯:
神经细胞凋亡 篇6
Department of Physical Education，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710049，Shaanxi，China
引发脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)的主要原因有交通事故(45.4%)、高处坠落(16.8%)和运动损伤(16.3%)等，而运动引起的SCI主要出现在跳水、摔跤、体操等项目上［1］。由于SCI是一种严重的神经系统损伤疾病，其损伤机制历来是骨外科、神经外科、运动医学等学科研究的热点。多数学者认为SCI涉及多个环节，如缺血、生化改变、神经细胞凋亡、毒性刺激物、神经递质的积聚、脂质过氧化和自由基的产生和炎症反应等［2］。尤其是近年来研究认为SCI机制中细胞凋亡是十分重要的因素之一，但其机制仍不明确。
细胞凋亡(Apoptosis)亦称为程序细胞死亡，是机体在自身基因控制下的细胞有序死亡方式。研究表明，SCI后神经细胞死亡的方式不仅仅是坏死，同时还广泛存在细胞凋亡［3］。神经细胞的凋亡不仅参与了SCI过程，而且与多种基因的调控有关，如:Bcl－2家族、Caspase 家族及 p38MAPK 等［4－6］。如何抑制神经细胞凋亡，减轻继发性SCI，从而促进运动功能恢复，是SCI的治疗策略之一。白藜芦醇(Resveratrol，Res)具有抗氧化、抑制血小板聚集、调节血脂代谢、抗炎、抗肿瘤等广泛的生理药理学作用［7］。我们前期的研究证实Res对SCI具有保护作用［8］，但Res通过抗凋亡治疗SCI的程度及作用机制还不清楚。本研究通过采用改良Allen’s重物打击法，制成中度脊髓损伤动物模型，观察Res对SCI后神经细胞凋亡及其通路的影响，探讨Res对SCI的抗凋亡作用及其机制，为防治SCI提供理论依据及新思路。
1 材料与方法
1.1 动物及分组
健康SD大鼠27只，体质量(280～320)g，雌雄不限，由西安交通大学医学院动物实验中心提供。实验时间:2011年9～12月;实验地点:西安交大医学院科研中心。将实验动物随即分为3个组:假手术组(Sham组);损伤组(Control组);白藜芦醇处理组(Res组)，每组9只。Sham组仅行手术暴露，不给予打击及治疗;Control组、Res组采用Allen’s打击法建立脊髓中度损伤模型，术后即刻分别给予等量的生理盐水及Res 200 mg·kg－1。Control组注射次数和 Res组一致，每天一次，第3天处死大鼠。实验过程中对动物的处置参照国家科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》［9］。
1.2 脊髓打击损伤模型的建立
大鼠以10%水合氯醛(300 mg·kg－1)腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于手术台，常规术区备皮，碘伏消毒皮肤，铺无菌手术洞巾。以T8棘突为中心，取后正中纵行切口长约3 cm，蚊钳咬除T8棘突和椎板及相邻T7－9上下各半个椎板，暴露硬脊膜。采用改良的Allen’s装置以25 gcm(10 g×2.5 cm)损伤力度行重物打击法制作大鼠SCI模型。造模成功的判定标准:损伤处脊髓出血、水肿，双下肢呈回缩性扑动，其尾巴出现痉挛性摆动，麻醉清醒后双下肢呈弛缓性瘫痪。术后0号线逐层缝合，即刻给予背外侧肌群肌肉注射青霉素5万U预防感染，每天1次，持续3 d。分笼饲养，自由取食，术晨禁食水。每日膀胱按摩2次致自主排尿反射建立。组中动物如有死亡，随时补充。
1.3 主要试剂及仪器
主要试剂:白藜芦醇(Sigma公司，批号:R5010100112K5216);10%水合氯醛(青岛宇龙海藻有限公司，批号:H37022673);青霉素注射液(苏州二叶制药有限公司，批号:H32021320);Bcl－2、Bax、Capase－3、p38 MAPK多克隆抗体;免疫组化SP试剂盒及DAB显色试剂盒(北京博奥森公司);放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitationassay，RIPA)总蛋白提取试剂盒(日本 Takara公司);倒置显微镜(日本Olympus公司);EM902透射电镜(美国Carl Zeiss公司);ECL发光液及NC膜(北京中杉金桥公司)。主要仪器:Allen’s脊髓损伤打击器(西安交大第二附属医院骨科);实验手术器械(上海手术器械厂);Milli－QUF纯水工作站(美国Millipore公司);石蜡切片机(德国LEICA公司)，低温离心机(法国JOUAN公司)，80℃超低温冰箱(美国REVECO公司)，电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技公司)，SDS－PAGE凝胶电泳仪、转移电泳槽(美国BIO－RAD公司);倒置显微镜(日本Olympus公司)。
1.4 观测指标
1.4.1 电镜观察
术后72h各组取3只大鼠，给予过量乙醚麻醉处死后，取T8损伤节段脊髓组织损伤节段脊髓组织，将标本修成1 mm3的小块并置于2.5%戊二醛固定液中，4℃固定6 h;磷酸盐缓冲液冲洗(pH=7.4)，1%四氧化锇固定1 h;依次用乙醇、丙酮逐级递增浓度脱水;环氧树脂包埋，70℃下聚合48 h;超薄切片机连续切片，片厚60 nm;用醋酸双氧铀和柠檬酸铅溶液进行双重染色;透射电镜观察、拍照。
1.4.2 免疫组织化学检测
术后72 h各组取3只大鼠，同法取 T8损伤节段脊髓组织石蜡包埋、5 μm厚切片。常规脱蜡、后;热修复抗原;每张切片加50 μl内源性过氧化酶阻断剂，室温孵育10 min;PBS冲洗后，每张切片加50 μl正常非免疫动物血清，室温孵育10 min;甩去血清，每张切片加50 μl的兔抗鼠一抗:Bcl－2(1:100)或Bax(1:200)或Caspase－3(1:100)或p38MAPK(1:200)，4℃过夜;PBS冲洗后，每张切片加50 μl生物素的羊抗兔IgG二抗，室温下孵育30 min;PBS冲洗后，每张切片加50 μl辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素溶液，室温孵育20 min。PBS冲洗后，每张切片加100 μl新鲜配置的DAB，显微镜下观察3 min，棕色为阳性;纯化水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固。显微观察阳性表达位置及强度。
1.4.3 免疫印迹法(Westen blot)检测
术后72 h各组取3只大鼠，同法取 T8损伤节段脊髓组织，RIPA试剂盒提取总蛋白，10000 g离心取上清，定量并分装;(4:1比例样品/上样缓冲液)混合样品100℃加热变性5 min;配制10%分离胶和4%浓缩胶，上样，10%SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳;根据MARKER的位置切胶，根据胶的大小裁剪 PVDF膜和滤纸，并将膜和滤纸于转膜缓冲液中浸15 min，之后按滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸的顺序叠放于转膜板上夹紧，25 mV转膜2.5h;转膜后将 PVDF膜蛋白面朝上于8% 脱脂奶粉液中37℃ 封闭1 h。TBST漂洗三遍。弃去TBST，加一抗Bcl－2或Bax或Caspase－3或p38 MAPK(兔抗大鼠，1:200);37℃摇床摇动2 h，4℃冰箱过夜;弃去一抗，TBST漂洗三遍;加二抗(HRP标记山羊抗兔IgG，1:800);摇床温和摇动3 h;弃去二抗，TBST漂洗三遍，共30 min;ECL发光液发光、凝胶成像系统采集及分析。
1.5 统计学分析
2 结果
2.1 电镜观察
Sham组未检测到凋亡细胞，Control组检测到大量的凋亡细胞，Res组未检测到凋亡细胞，Sham组神经细胞核膜完整，核染色质颗粒细致，分布均匀，线粒体膜无凹陷，粗面内质网未见扩张改变，细胞核圆，未见凋亡小体产生。Control组神经细胞缩小、变形，胞浆空泡化，线粒体嵴断裂(消失)，内质网扩张。核膜内陷，染色质有边集现象，有凋亡小体产生。Res组神经细胞较Control组结构清晰，染色质较均匀，核膜清晰，少见核膜凹陷，粗面内质网结构正常，线粒体结构正常。电镜结果提示Res能明显抑制脊髓神经细胞的凋亡(图1)。
图1 脊髓损后电镜观察
2.2 免疫组织化学检测
Sham组Bax呈极少量表达，Control组Bax则大量表达，Res组Bax较Control组表达明显降低;Sham组Bcl－2呈极少量表达，Control组Bcl－2则呈极少量表达，Res组 Bcl－2表达较 Control组表达有所提高;Sham组Caspase－3、p38MAPK呈极少量表达，Control组Caspase－3、p38MAPK大量表达，Res组与 Control组相比，Caspase－3、p38MAPK表达明显降低(图2)。免疫组化染色提示Res对SCI组织中神经细胞凋亡相关蛋白的表达有较好的调控作用。
2.3 免疫印迹法(westen blot)检测
Sham组Bcl－2、Bax呈极少量表达。Bax在Control组脊髓组织中大量表达(P＜0.05)，而Bcl－2表达较低(P＜0.05)，两者比例失调;Caspase－3及p38 MAPK明显激活(P＜0.05)，神经细胞凋亡增加显著。与Control组相比，Res组Bax蛋白表达明显降低(P＜0.05)，Bcl－2 表达则显著升高(P ＜0.05)，Caspase－3及p38MAPK的激活明显受到抑制(P＜0.05)。提示脊髓组织超微结构损害有所改善，神经细胞凋亡显著减少(图3、图4)。
图3 Westen blot检测凋亡相关蛋白的表达
图4 凋亡相关蛋白表达水平的检测
3 讨论
SCI后，损伤部位除创伤造成的直接损伤外系列级联放大式的继发性病理改变(水肿、出血、钙离子内流、脂质过氧化、微循环障碍、细胞凋亡等)是导致SCI难以治愈的关键。继发性损伤不仅具有可逆性而且具有可调控性，这使得SCI的恢复具有可能［10］。此外，继发性SCI是渐进性的过程，为药物治疗SCI提供了机会，及时有效的干预或治疗可使病变局限，从而促进神经功能恢复。
随着研究的深入，SCI的研究方向已从形态学领域向分子生物学领域发展。研究表明，凋亡不仅发生在发育过程中，也可发生在脑以及SCI后［11］。其后研究证实了细胞凋亡是继发性SCI细胞死亡的重要方式［12］。影响细胞凋亡的因素有多种，如缺血、缺氧、氧自由基等，而且细胞凋亡的调控与多种基因的表达有关，如p38 MAPK信号通路、Bcl－2家族及caspase家族等。目前已知道有多种基因，如Bax、Bcl－2、Fas等均与细胞凋亡相关［13－14］，特别是 Bcl－2和 Bax基因与凋亡的调控关系更为密切，二者是相互拮抗的两个基因，在细胞凋亡的调控中起着重要作用［15］。Bcl－2是主要的抗凋亡基因，它可以抑制多种途径的凋亡。Bax是Bcl－2的拮抗基因，与Bcl－2具有45%的同源性，两者都属于Bcl－2基因家族成员，通过编码相应功能蛋白起作用。Bax可直接和线粒体膜结合，形成线粒体跨膜通道，促进细胞色素C释放，激活Caspase系统，进而促使细胞发生凋亡。Bax/Bcl－2异源二聚体形成的调节是细胞凋亡中非常重要的一个环节，Bax/Bcl－2比值决定细胞的存亡，SCI后Bax/Bcl－2比值增加。研究表明［16］SCI后Bcl－2蛋白仅有少量表达，而Bax蛋白大量表达，提示SCI后促进凋亡因子将会占优势，而保护因子的明显不足，使得神经细胞向凋亡方向发展。
Caspases蛋白酶是目前研究的热点之一，它的激活被作为细胞凋亡的标志。在正常情况下，Caspase－3蛋白是以活性很低的酶原形式存在，Caspase－3被激活后，其构象发生变化，从而发挥凋亡效应，导致凋亡的发生［17］。研究发现［18］SCI后出现细胞凋亡、Caspase－3的激活等，继而脊髓内神经元发生一系列形态及功能变化。研究证实［19］，Caspase－3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分。因此，SCI研究中 Bax，Bcl－2，Caspase途径是极其重要的研究途径。有丝分裂原激酶(MAPKs)是一组参与介导细胞外信号由胞外向胞内传递的重要介质，它们在细胞分化、发育、成活和凋亡过程中发挥重要作用。p38MAPK的激活是SCI引起凋亡的重要信号转导通路之一，参与Bcl－2、Bax、iNOS和caspase有关细胞凋亡基因的调控。SCI激活p38MAPK，进而活化下游的转录因子、MAPKAPK2，3及Caspase家族成员，活化的转录因子与顺式作用元件相结合，引起大量与凋亡有关的基因表达，与细胞延迟性死亡密切相关。
继发性SCI是渐进性的过程，继发性损伤不仅具有可逆性，同时具有可调控性，这为药物治疗SCI提供了机会。脊髓继发性损伤引起的微环境变化不是单一因子作用，而是多因子、多因素联合作用的生物共济环，任何侧重于某一方面的药物都无法在整体上解决SCI后的修复。中药作为传统治疗，由于其具有多靶点的综合效应且副作用较小等优势，近年来在SCI机理机制研究方面应用广泛［20－21］。Res化学名为 3，5，4’－三羟基－反－均二苯代乙烯，是广泛存在于葡萄、花生等植物中的一种多酚类化合物，其作为植物药，具有广泛的生理药理学作用［22］。本实验电镜学观察结果显示Res可明显抑制脊髓神经细胞的凋亡。另根据 Bax，Bcl－2，Caspase－3及 p38MAPK 免疫组化染色分析及相关蛋白Western Blot检测，我们可以初步认为，SCI后脊髓组织内Bcl－2表达明显减少，Bax蛋白表达增加，诱导了caspase－3表达，从而导致了神经细胞凋亡。Res可明显对抗上述变化。由此推测Res通过上调Bcl－2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，抑制Caspase－3激活，参与对脊髓神经细胞凋亡的保护。另外，损伤脊髓组织中p38MAPK的蛋白表达水平显著增高，由此证明了损伤脊髓神经细胞的凋亡有p38 MAPK通路介入;在给予Res处理后，p38 MAPK表达下降，提示Res可抑制p38 MAPK激活，从而阻断p38 MAPK介导的信号转导通路，延缓损伤脊髓组织中凋亡的发生，最终及时有效的干预凋亡病变，促进神经功能恢复。
4 结论
本研究结论表明，Res通过提高Bcl－2/Bax蛋白表达比，抑制p38MAPK及Caspase－3的激活，使大鼠脊髓组织超微结构损害有所改善，神经细胞凋亡显著减少，并且可阻断 p38MAPK介导的信号转导通路。提示Res对大鼠SCI组织的神经细胞凋亡有较好的调控作用。
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神经细胞凋亡 篇7
1 实验材料
1.1 动物
清洁级健康SD大鼠,雌雄不拘,鼠龄3~4个月,体重250~300 g。由河南省实验动物中心提供。
1.2 药物和试剂
脑心通胶囊粉由陕西咸阳步长制药有限公司提供(批号:20050619),1 g粉含饮片1 g,临用时以蒸馏水制成需要浓度的混悬液;红四氮唑(TTC)为北京化学试剂公司产品;Caspase-3-抗:兔抗鼠单克隆抗体,DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
2 实验方法
2.1 造模及神经功能行为学评分
模型的制备参照Zea Longa[2]线栓法制作大鼠脑缺血再灌注模型。
2.2 分组与取材
造模成功的实验动物120只随机平均分为4组,即假手术组、模型组、低剂量组(100 mg/kg)和高剂量组(400 mg/kg)。每组按24、48、72、96 h分为不同的时间点,每时间点6只。动物先连续灌胃3 d,每天2次,第4天造模。术后继续灌胃直至相应的时间点断头取脑。假手术组和模型组依同样的方法给予生理盐水灌胃,直至断头取脑。脑组织固定后石蜡包埋,切片待用。另取12只相应分成4组,每组3只,均在造模24 h后断头取脑做TTC染色。
2.3 脑梗死体积的测定
大鼠在脑缺血再灌注后24 h断头取脑,2%TTC染色,数码照相摄影,计算机图像分析系统分析梗死体积。
2.4 免疫组化染色
Caspase-3免疫组化染色采用SABC法。相邻切片行常规HE染色,光镜观察组织学变化情况。
2.5 结果判定
脑片TTC染色后可见正常脑组织为玫瑰红色,缺血梗死区为苍白色。免疫阳性细胞被染成棕黄色,Caspase-3阳性细胞为胞浆染色,少数胞核也染色。
记数方法:每个大鼠随机任选2张切片,任选脑缺血半暗带区5个视野进行摄像分析,测量每个视野单位面积内阳性细胞数,再记算该切片平均阳性细胞数。
2.6 统计分析
应用SPSS 10.0统计软件包进行数据处理分析。
3 实验结果
3.1 脑心通对脑缺血再灌注大鼠的病理改变的影响
HE染色假手术组未见梗死灶,神经元形态结构正常;模型组镜下见缺血中心区无神经元,仅见少量胶质细胞,细胞间质空泡样改变。低剂量脑心通组与高剂量脑心通组镜下见缺血中心区变小,边缘区神经元变性、坏死减少,多数存活细胞形态相对正常。
3.2 脑心通对脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积的影响
与模型组大鼠相比较,低剂量组和高剂量组在缺血2 h再灌注24 h均明显减少大鼠的脑梗死体积,结果见表1。
注:与模型对照组相比*P<0.05,**P<0.01。
3.3 脑心通对脑缺血再灌注大鼠Caspase-3蛋白表达的影响
与模型组相比,高、低剂量组除0h外,Caspase-3阳性细胞表达减少,结果见表2。
4 讨论
Caspase-3是细胞凋亡程序中关键的同源半胱氨酸蛋白酶,在细胞凋亡过程中属中心地位。最近研究报道,Caspase家族在细胞凋亡中具有中心效应,Caspase-3处于表面死亡受体被激活或细胞内死亡信号存在的情况下,始动的Caspase-3活化并引发下游效应,Caspase蛋白水解激活的级联反应,使一系列骨架蛋白及细胞修复酶等靶蛋白裂解导致细胞凋亡,Caspase-3的表达表明细胞必定死亡。因此Caspase-3被称为死亡蛋白酶,是哺乳动物凋亡的关键酶。
脑心通由黄芪、丹参、当归等16味中药组成,具有益气活血、化瘀通络、醒脑开窍、宣痹止痛之功效,临床用于治疗脑梗死、冠心病、血管性痴呆等取得了较好的疗效。用药后患者神经功能改善明显,生活质量提高,血液流变学有明显改变,为临床防治脑卒中的有效药物[3]。
结果表明高、低剂量的脑心通均能明显减轻脑缺血再灌注大鼠脑缺血区神经细胞损伤,减轻病变区神经细胞凋亡,且神经细胞凋亡与Caspase-3的表达呈正相关,提示脑心通减少大鼠缺血半暗带区神经细胞的凋亡和减少Caspase-3的表达有关。
注:与模型对照组相比*P<0.05,**P<0.01。
参考文献
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藤黄酸诱导A375细胞凋亡 篇8
关键词：藤黄酸,黑素瘤,凋亡,Bax,Bcl-2
黑素瘤是黑素细胞的恶性肿瘤,是致死性最大的皮肤肿瘤,近年来其发病率呈明显上升趋势。黑素瘤恶性程度高,预后差。因其生长方式的侵袭性以及预后的不良性已越来越受到重视[1]。尽管最近化疗、放疗和手术治疗等水平的提高,但是黑素瘤的致死率并没有太大改善。越来越多的研究集中到发现和研制新药,特别是针对凋亡过程相关机制的药物。
藤黄为藤黄科植物藤黄树的树干被割伤后流出的胶状树脂,具有多种用途,临床上已用于治疗恶性肿瘤、宫颈糜烂、单纯疱疹及带状疱疹、生殖器疱疹和局部急性炎症等疾病[2]。藤黄酸(gambogic acid,GA)是藤黄的主要成分,实验研究结果表明[3~7],藤黄酸对多种肿瘤显示较强的抗肿瘤活性,在肿瘤组织中有较高的分布和较长的持续时间,并在有效剂量范围内毒副作用比较小,对肿瘤细胞的抑制有非常高的选择性,能选择性的杀死癌细胞,而对正常动物造血系统和免疫功能没有影响[8],这是目前肿瘤化疗药物所不具备的。
然而,藤黄酸是否具有抗黑素瘤效应,目前未见相关报道。因此,本实验用体外肿瘤细胞培养的方法,观察了藤黄酸对人黑素瘤细胞株的抑制和诱导凋亡作用,以挖掘治疗黑素瘤的新药物。
1 材料和方法
1.1 细胞培养
恶性黑素瘤细胞株A375购自上海细胞生物研究所细胞库。在含10%胎牛血清(杭州四季青)的DMEM培养基(GIBCO)(37℃,5%二氧化碳孵箱)中培养。每2、3 d胰酶消化传代1次,取对数期的细胞用于实验。
1.2 MTT比色法
取1×104/m L的活细胞接种于96孔培养板中,每孔加入100μL,设5个复孔,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入不同浓度(0~7.5μg/m L)的藤黄酸,置于37℃、5%二氧化碳的培养箱中培养至预定时间,每孔加入20μL MTT溶液(5 mg/m L,即0.5%MTT),继续培养2 h。终止培养,小心吸去孔内培养液。每孔加入150μL二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。在Bio-Rad3350酶标仪波长540 nm处测量各孔的吸光值(OD)。按下列公式计算细胞生长抑制率:抑制率(%)=(1-加药孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100%。实验共重复3次。
1.3 Hoe chs t 33342检测细胞凋亡
A375细胞加入不同浓度(0~7.5μg/m L)的藤黄酸36 h,将实验组和正常对照组96孔培养板中培养液吸出,加入50μg/m L Hoechst 33342(Invitrogen),室温作用5 min,吸出荧光染液,激光共聚焦显微镜(Olympus,日本)下快速观察细胞。Hoechst33342可渗入细胞膜对活细胞和凋亡细胞的DNA进行染色。正常细胞胞核呈均匀一致的蓝色,而凋亡的细胞核呈亮蓝色伴有核固缩、碎裂等特征。每组实验重复3次。凋亡百分率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。
1.4 Anne xin V/P I双染细胞凋亡率检测
分别收集藤黄酸处理和未处理细胞1×106个,冷PBS洗涤后依次加200μL Binding Buffer、10μL AnnexinⅤ-FITC和5μL PI(南京博泰),避光室温反应15 min,再加300μL Binding Buffer后在双变量流式细胞仪(美国BD公司)进行检测,激发光波长用488 nm,用一波长为515 nm通带滤器检测FITC荧光,另一波长>560 nm的滤器检测PI。
1.5 We s te rn blot分析
将不同浓度藤黄酸处理和未处理的细胞(2×107/m L)置于裂解液(50 mmol/L Tris,p H 7.10,1mmol/L EDTA,1 mmol/L PMSF,1∶1 000蛋白酶抑制剂混合物)中裂解和超声破碎,冰中静止30 min后离心(12 000 r/min,15 min,4℃),吸取上清作为样品。用分光光度计检测样品蛋白含量(Bradford法),取等量蛋白样品用12%SDS-PAGE进行电泳,恒压将蛋白转至醋酸纤维膜。室温下将膜在含5.0%奶粉的PBS中封闭1 h,各加入小鼠抗人Bcl-2、Bax单克隆抗体(1∶500,Sigma)4℃过夜,在过氧化物酶标记的羊抗小鼠Ig G(1∶10 000,Jackson Immuno Research Laboratory)中孵育1 h,以上两步骤间用PBS充分漂洗。免疫反应后的醋酸纤维膜在化学发光试剂(ECL plus Western Blotting Detection System,Amersham)中反应5 min(避光),然后将X光片曝光2 min,冲洗胶片。以同样方法用小鼠抗γ-tubulin单克隆抗体(1∶20 000,Sigma)和过氧化物酶标记的羊抗小鼠Ig G对γ-tubulin进行检测,作为内参。
2 结果
2.1 藤黄酸减少A375细胞活力
MTT结果显示,藤黄酸对A375细胞的生长抑制作用具有明显的时效性和剂量依赖性。加入不同浓度(0~7.5μg/m L)的藤黄酸24 h引起细胞活力减少,细胞生长抑制率为12.0%~25.0%。加药36 h,细胞活力进一步减少,细胞生长抑制率达到27%~53%,加药48 h,细胞生长抑制率为38.0%~59.0%,见图1。细胞给药24、36和48 h后,IC50值分别为(1.57±0.05),(1.31±0.20)和(1.12±0.19)μg/m L。由于A375细胞经藤黄酸处理36 h细胞活力明显减少。因此,这个时间点被选择作为藤黄酸抑制A375细胞增殖的后续研究。
2.2 藤黄酸诱导A375细胞凋亡
2.2.1 Hoechst33342荧光染色
激光共聚焦显微镜下观察到不同浓度(0~7.5μg/m L)藤黄酸处理后,正常细胞核呈均匀一致的蓝色,凋亡的细胞核呈亮蓝色伴有核边集、核固缩、核碎裂等。细胞凋亡数量呈剂量依赖性增加,变化范围从5.0%~45.0%,见图2。
2.2.2 流式细胞术检测
FCM对藤黄酸诱导A375细胞凋亡做进一步定量分析,A375细胞经FITC和PI染色,FCM检测结果显示,不同浓度(2.5~7.5μg/m L)藤黄酸处理36 h后,早期凋亡细胞数量以剂量依赖性方式增加27.6%~41.9%,而对照组仅增加3.5%,见图3。
2.3 藤黄酸减少Bcl-2的表达并增加Ba x的表达
Western blot结果显示,0~7.5μg/m L藤黄酸处理36 h后,Bcl-2蛋白水平明显低于对照组细胞,且随用药浓度的增加而逐渐减少。Bax与Bcl-2蛋白表达情况正好相反,其蛋白水平随用药浓度的增加而逐渐升高,结果Bcl-2/Bax的比值随用药浓度的增加而明显逐渐减少,见图4。
3 讨论
黑素瘤恶性度高,极易发生转移。目前,对中晚期患者的治疗仍以化疗为主。以藤黄酸为代表的天然药物来源广泛、价格低廉、毒副作用小,在肿瘤研究方面极受重视。对构效关系的深入研究使设计合成藤黄酸衍生物类的药物成为可能。藤黄酸作为抗肿瘤一类新药在2004年确定为国家863计划第三批新立项项目,目前正在进行消化道肿瘤的相关临床试验。
然而,藤黄酸抗肿瘤作用的机理仍然不够明确。近年来的研究表明,藤黄酸在体外及体内均有较强的抗肿瘤活性能诱导多种肿瘤细胞凋亡,如肝癌、胃腺癌、肺癌和乳腺癌等[3~7],同时对正常组织损伤较小,其机制至少包括细胞周期阻滞、诱导凋亡、抑制人端粒酶逆转录酶基因表达等方面[9~12]。
本研究结果证实藤黄酸能在体内以时间和剂量依赖方式抑制A375细胞的增殖。同时,藤黄酸诱导A375细胞凋亡呈剂量依赖性。抑制凋亡被认为是肿瘤发展的一个可能的机制,许多化学预防剂被显示是通过诱导凋亡来抑制肿瘤发生。因此,诱导A375细胞凋亡可能是藤黄酸抗黑素瘤效应的机制之一。细胞凋亡受细胞内多种基因的控制,是一个级联式基因表达的结果。Bcl-2蛋白为抗凋亡蛋白,Bax蛋白为凋亡蛋白,Bcl-2蛋白具有抑制Bax的功能。OLTVAI等[13]认为,决定细胞命运的关键因素是抑制与促进凋亡因素间的比率,如Bcl-2与Bax。Bcl-2水平较高时促进细胞存活,而Bax水平较高时则促进细胞死亡。Bax和Bcl-2形成了细胞凋亡的正负调控,两者比例决定了细胞是否趋向凋亡。若Bcl-2/Bax比例增高,则抑制细胞凋亡,反之,则促进细胞凋亡[14]。笔者观察到藤黄酸以剂量依赖效应上调A375细胞前凋亡蛋白Bax,下调了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。Bcl-2/Bax对诱导凋亡是关键性的,Bcl-2/Bax比率下降导致caspase3的激活,并决定了细胞对凋亡的敏感性。除了Bax和Bcl-2,藤黄酸是否影响并怎样影响其他基因,或者还有其他的机制参与细胞凋亡中的变化,这将在笔者将来的研究中进一步探索。
神经细胞凋亡 篇9
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物来源
新生3d内清洁级SD大鼠的乳鼠[动物质量许可证号:SYXK(辽)2003-0011],雌雄不限,由辽宁医学院实验动物中心提供。
1.1.2 主要试剂
低糖DMEM(Gibco公司,美国);胎牛血清(杭州四季青公司);Ⅱ型胶原酶、Ⅱ型分散酶(Sigma公司,美国);α-平滑肌肌动蛋白、Caspase-9抗体、二抗试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司);活性氧检测试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司);超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);Pifithrin-α(p53抑制剂)、抗氧化剂NAC(碧云天生物技术研究所);线粒体提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。
1.1.3 主要仪器设备
荧光显微镜(NIKON OPTIPHOT,日本);倒置相差显微镜(OLYMPUS IMT-413,日本);Thermo高速低温离心机型(Heraus公司,德国);CO2培养箱(Scientific.Inc 3731型,美国);医用超净工作台(江苏吴县市净化技术研究所);电子分析天平(FA2104型,中国);高压蒸汽消毒锅(GYZ-2000型,中国);Coulter Elite ESP型流式细胞仪(SD公司,USA)。
1.2 方法
1.2.1 心肌细胞培养
取日龄三天内的SD大鼠乳鼠,浸入75%的医用酒精中消毒,无菌条件下剪取心脏,仔细剥离心房及大血管组织,用PBS液漂洗2-3次,将心脏移入一小平皿,用眼科剪剪成乳糜状1mm×1mm×1mm;加入混合酶(Ⅱ型胶原酶和Ⅱ型分散酶)2m L于37℃消化,60min,每隔10min吹打5min;加入1m L胎牛血清终止消化,反复吹打后200目筛网过滤,收集滤液,1000 r/min离心8min,室温静置5min弃上清液,细胞团块用生长培养基(含15%胎牛血清的低糖DMEM)重悬,移入培养瓶中。37℃、5%CO2培养箱中孵育1 h后,差速贴壁,将细胞悬液移入另一培养瓶,于37℃、饱和湿度、体积分数为5%CO2细胞培养孵箱中培养。每2-3d换液一次。
1.2.2 实验分组
将培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞随机分为四组:对照组(甘露醇25mmol/L)、高糖组(葡萄糖浓度为25mmol/L)、高糖+抗氧化剂组(抗氧化剂浓度为10mmol/L)和高糖+p53抑制剂组(p53抑制剂浓度为50μmol/L)。1.3统计学分析采用SPSS16.0统计软件包,所有计量数据均径正态性检验,符合正态分布、方差齐的数据以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组心肌细胞流式细胞仪检测结果
应用Annexin V-PI双染法检测各组心肌细胞凋亡的情况。与对照组相比,高糖培养基作用24h后,高糖组心肌细胞凋亡率明显增高[(5.66±0.31)%比(9.04±0.18)%,P<0.01]。而与高糖组相比,高糖+抗氧化剂组的心肌细胞凋亡率明显降低[(7.71±0.28)%,P<0.01]。与高糖组相比,高糖+p53抑制剂组的心肌细胞凋亡率也明显降低[(7.83±0.30)%,P<0.01](附表)。
2.2 细胞内ROS的检测
与对照组相比,高糖培养基作用24h后,高糖组心肌细胞产生的ROS明显增高[(163.77±10.98)比(207.84±8.13),P<0.01]。而与高糖组相比,高糖+抗氧化剂的心肌细胞ROS明显降低[(180.98±9.44),P<0.01]。与高糖组相比,高糖+p53抑制剂组的心肌细胞产生的ROS明显降低[(192.58±4.77),P<0.05](附表)。
2.3 细胞培养上清液中SOD的含量
与对照组相比,高糖培养基作用24h后,高糖组上清液中的SOD含量明显降低[(2.38±0.17)比(1.77±0.13),P<0.01]。而与高糖组相比,高糖+抗氧化剂组的上清液中SOD明显升高[(2.21±0.09),P<0.01]。与高糖组相比,高糖+p53抑制剂组的上清液中SOD也升高[(1.97±0.07),P<0.05](附表)。
2.4 心肌细胞p53和Casepase 9蛋白的表达
高糖作用24h后,提取线粒体蛋白,Western blot分析p53的细胞定位。与对照组相比,高糖组p53蛋白表达增多[(32.12±2.07)%比(67.94±2.18)%,P<0.01]。与高糖组相比,高糖+抗氧化剂组p53蛋白表达明显降低[(41.96±2.47)%,P<0.01]。与高糖组相比,高糖+P53抑制剂组p53蛋白表达明显降低[(42.39±2.16)%,P<0.01]。
提取总蛋白,Western blot分析Casepase 9的表达。与对照组相比,高糖组Casepase-9表达增多[(26.41±1.37)%比(67.89±2.51)%,P<0.01]。与高糖组相比,高糖+抗氧化剂组Casepase 9表达明显降低[(36.82±1.73)%,P<0.01]。与高糖组相比,高糖+p53抑制剂组Casepase 9表达明显降低[(42.37±2.35)%,P<0.01]。
3 讨论
DCM是糖尿病患者致死致残的主要原因之一,研究表明,多种因素参与了DCM的发生发展,其中ROS是诱导心肌细胞凋亡的一个重要的信号分子。已经有研究发现,高血糖可以诱导氧化应激产生ROS,介导心肌细胞凋亡[5]。SOD是人体防御内外环境中超氧负离子对自身侵害的重要的抗氧化酶,它可催化超氧负离子氧化还原生成水与分子氧,是线粒体内对抗活性氧的关键酶,其活性的高低可间接反映出机体清除氧自由基的能力。本研究发现:高糖作用后,心肌细胞产生的ROS升高,而SOD降低,说明高糖诱导产生ROS,SOD清除氧自由基的能力下降。其机制可能为高糖可通过引起蛋白质的非酶氧化作用,激活醛糖还原酶进入多元醇途径,激活蛋白激酶C,激活已糖胺途径等引起氧化应激,导致细胞凋亡。
P53是一个重要的抑癌基因,它调控着细胞周期和凋亡信号通路,与细胞凋亡的发生密切相关[6]。在本研究中,给予高糖24h后,Western blot检测发现心肌细胞线粒体p53蛋白表达增多,心肌细胞的凋亡率增加。这说明高糖可能通过影响P53转位到线粒体,引起心肌细胞的凋亡。而抗氧化剂不仅减少了ROS的产生,同时也抑制了P53的线粒体转位,这说明ROS可能了介导p53转位到线粒体。
那么转位到线粒体的p53是如何引起细胞凋亡的呢?P53作为一个重要的促凋亡因子,主要通过转录依赖和转录非依赖两种途径促进细胞凋亡。一方面,作为转录因子,P53特异诱导细胞凋亡的靶基因的表达,如Bax,Noxa,PUMA,p53AIPI等,并通过这些蛋白参与内源和外源凋亡途径;另一方面,转录非依赖的方式于1994年首次发现,P53蛋白能够从细胞浆转位到线粒体,通过激活内源性的线粒体途径发挥促凋亡作用。高糖作用后,Western blot还发现Caspase-9蛋白表达增多。给予P53抑制剂后,Caspase-9表达降低。线粒体损伤途径(内源性途径)是细胞内凋亡途径之一。许多凋亡刺激能够诱导线粒体释放细胞色素C,释放到细胞质中的细胞色素C与Apaf-1结结合激活Caspase-9,再激活下游的Caspase-3,-6,-7等,启动线粒体凋亡通路。因此Caspase-9是由线粒体凋亡通路所激活。所以我们认为p53转位到线粒体后,激活了线粒体凋亡通路,引起心肌细胞凋亡,是否通过转录非依赖的方式引起细胞凋亡,这还需要进一步的研究。
本实验结果还发现,给予P53抑制剂提前干预后,不仅抑制了P53的线粒体转位,同时活性氧的水平亦有所降低,这说明ROS介导了P53的线粒体转位,P53也影响到了心肌细胞内ROS的累积,对ROS有一个负反馈作用,我们推测ROS可能也参与了P53介导的心肌细胞凋亡,有报道认为p53可通过调节线粒体SOD的表达部分地影响线粒体ROS的产生,但是具体机制尚不清楚,还需要进一步的研究。
综上所述,本实验结果揭示了ROS和P53在高糖诱导的心肌细胞凋亡中的作用,为糖尿病心肌病发病机制的研究和防治提供了实验基础。
摘要：目的 探讨氧化应激和p53介导的线粒体凋亡通路在高糖诱导乳鼠心肌细胞凋亡的作用。方法 将培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞随机分为四组:对照组、高糖组(葡萄糖浓度为25mmol/L)、高糖+抗氧化剂组(抗氧化剂浓度为10mmol/L)和高糖+p53抑制剂组(p53抑制剂浓度为50μmol/L)。荧光分光光度计检测细胞内的活性氧,分光光度计检测上清液中的超氧化物歧化酶,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot对各组细胞p53和Caspase-9进行半定量分析。结果 与对照组相比,高糖组心肌细胞凋亡率(P<0.01)和ROS明显升高(P<0.01),上清液中的SOD含量明显降低(P<0.01),Caspase-9(P<0.01)和线粒体蛋白p53表达增多(P<0.01)。与高糖组相比,高糖+抗氧化剂组心肌细胞凋亡率(P<0.01)和ROS明显降低(P<0.01),上清液中SOD明显升高(P<0.01),Caspase-9(P<0.01)和线粒体蛋白p53表达减少(P<0.01)。与高糖组相比,高糖+p53抑制剂组的心肌细胞凋亡率(P<0.01)和ROS明显降低(P<0.05),上清液中SOD含量升高(P<0.05),Caspase-9(P<0.01)和线粒体蛋白p53表达减少(P<0.01)。结论 高糖可能通过产生的活性氧介导p53转位到线粒体激活线粒体凋亡通路,引起心肌细胞凋亡。
关键词：高糖,活性氧,p53,心肌细胞
参考文献
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神经细胞凋亡 篇10
1.1 材料
1.1.1 实验动物
健康SD (Sprague Dawley) 大鼠70只,
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组
SD大鼠70只, 适应性喂养3d后, 随机分为7组, 每组9只。A组 (假手术对照组) ;B组 (颅脑损伤模型对照组, 简称损伤对照组) , 再根据伤后时间段分为伤后6h、24h、72h组;C组 (颅脑损伤+氯胺酮干预组, 简称氯胺酮治疗组) , 再根据伤后时间段分为伤后6h、24h、72h组。
1.2.2 动物模型的建立
实验采用改进的Feeney自由落体硬膜脊外撞击方法。常规喂养, 到不同组别设定的时间后取材。假手术对照组仅切开头皮和颅骨开窗, 不用击锤致脑损伤, 术后6h处死。
1.2.3 实验取材、观察指标及检测方法
脑组织SOD、MDA检测:分别采用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法测定SOD和MDA。用靠马斯亮蓝进行蛋白定量, 计算脑组织中每毫克蛋白的MDA和SOD含量。
2 氯胺酮对颅脑损伤大鼠脑组织中MDA、SOD的影响
大鼠造成颅脑损伤模型后, 脑组织中SOD活性明显降低, MDA值明显升高, 损伤对照组与假手术对照组比较, 不同时间段的测量值均有明显差异 (P<0.01) 。而使用氯胺酮治疗后能使SOD活性下将和MDA值的升高幅度有所降低, 氯胺酮治疗6h组、24h组、72h组与同时间段的损伤对照6h组、损伤对照24 h组、损伤对照72h组比较, 差异明显 (P<0.05) , 见表1。
注:与假手术对照组比较, aP<0.01;与同时段模型对照组比较, bP<0.05
3 讨论
氯胺酮对颅脑损伤大鼠脑组织SOD及MDA的影响:氯胺酮可能是通过抑制自由基的产生或直接清除自由基, 抑制脂质过氧化反应, 减少SOD的消耗, 从而降低自由基代谢终产物MDA的值, 起到保护脑组织, 减轻继发性损伤。
4 结论
神经细胞凋亡 篇11
子宫内膜异位症（endometriosis，EMT）是指子宫内膜组织（腺体和间质）出现在子宫体外的部位，简称内异症，是育龄期妇女的一种常见疾病，近年来发病率呈上升趋势，主要引起不孕、慢性盆腔炎、痛经、甚至急腹症等症状，严重影响育龄期妇女的生育年龄及生活质量，由于其在生物学上的行为具有类似恶性肿瘤的特点，因此被称为“有恶性行为的良性疾病”。近年发现细胞凋亡的异常在EMT的发生、发展中起到重要的作用[1]。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是机体维持内环境稳定的一种基本生理机制，由多个细胞因子及一些基因产物参与的一种自主的、有序的细胞凋亡形式。通过细胞凋亡，机体可以去除损伤、衰老和突变的细胞来维持机体内环境的稳定。子宫内膜的周期性增生与脱落就是通过细胞增殖与凋亡的方式来实现的。如此过程出现异常，则导致细胞堆积而引起疾病。本文将对细胞凋亡在EMT的研究进展作一综述。
1 细胞凋亡与正常子宫内膜
目前有研究认为EMT的发生、发展与子宫内膜细胞凋亡的减少密切相关，证实细胞凋亡是子宫内膜细胞保持稳定的重要因素。正常的子宫内膜呈周期性增生与脱落，是通过细胞增殖与凋亡的方式实现的。
2 细胞凋亡与EMT
2.1 细胞凋亡与在位内膜
EMT患者正常位置的子宫内膜称为在位内膜，近年来的研究发现在位内膜作为异位内膜的来源，在EMT的发病过程中起重要的作用，在位内膜与异位病灶有相同的改变，如细胞凋亡率的降低、芳香化酶表达异常等，而这些改变在非EMT患者的正常子宫内膜组织中不存在，使研究者意识到在位内膜的异常改变在EMT的发生中起重要作用[2]。Meresman [3]等采用TUNEL技术，通过对EMT与非EMT者的在位内膜中凋亡因子的检测发现，前者较后者子宫内膜凋亡率低，且与月经周期无关，凋亡蛋白的表达在增生期显著升高。研究已证实在位内膜本身对内异症的发生起至关重要的作用。
2.2 细胞凋亡与异位内膜
Gebel等通过对16例EMT女性的在位及异位内膜悬液中的独立的凋亡因子进行检测及对比，发现异位内膜细胞的凋亡率明显低于正常内膜细胞的凋亡率，且与月经周经不相关，其异位内膜细胞凋亡率比相对应的在位内膜更低。Dmowski等通过运用TUNEL法检测EMT及非EMT的内膜中腺上皮细胞和间质细胞的凋亡结果表明：内异症异位内膜的腺上皮细胞凋亡率明显低于正常子宫内膜，且与月经周期无关，而间质细胞中凋亡率与正常内膜的表达无明显差异。Braun[4]等通过EMS模型，研究在免疫选择过程中细胞凋亡的情况，结果表明，异位细胞本身具备对抗凋亡、消除免疫反应产物、从而获得能量建立异位病灶的能力，最终导致EMS的发生。
3 细胞凋亡在EMT中研究的意义
近年来EMT的发病率有明显的上升趋势，细胞凋亡为研究提供了新思路，可以通过药物和相关细胞因子促进异位內膜细胞凋亡，抑制细胞增殖，使灶消退以达到治愈目的。对于EMT与细胞凋亡关系的深入研究及其调控机制的进一步探讨，将有利于EMT发病机制的阐明，并为子宫内膜异位症的诊断、治疗提供新的思路。
参考文献：
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[4] Braun D，Ding J，Dmowski W.peritoneal fluid-mediated enhancement of eutopic and ectopic endometrial cell proliferation is dependent on tumor necrosis factor-alpha in women with endometriosis.Fertil Steril，2002，78：727-731
SDZ诱导肺癌A549细胞凋亡 篇12
1资料与方法
1.1 资料
SDZ是黑龙江省大兴安岭地产药材树舍, 人参及黄芪等多种药材组成的复方抗癌药物, 临用前过滤除菌用生理盐水稀释至所需浓度;肺癌A549细胞由哈尔滨医科大学肿瘤研究所提供。
1.2 方法
取对数生长期细胞培养, 加入SDZ溶液使其终浓度为1000 μg/ml, 阴性对照组加等量生理盐水, 阳性对照组加等量紫杉醇。连续培养3 d, 每天取一组细胞, PBS洗涤后加入染液 (每孔含hoechst、PI染液各2 μl, 缓冲液200 μl) , 荧光显微镜下观察, 照相。
2结果
荧光染色形态学观察:1000 μg/mlSDZ作用于肺癌A549细胞24 h后, 可见蓝色深染的凋亡细胞 , 并可见细胞核碎裂, 细胞体积缩小 , 细胞凋亡率为31.7%;紫杉醇对照组细胞凋亡率为33.1%;生理盐水对照组细胞核为低蓝色, 细胞体积大小一致, 细胞凋亡率为2.3%。实验组与阴性对照组比较有显著性差异 (P<0.05) , 实验组与紫杉醇对照组比较无显著性差异 (P>0.05) 。
3讨论
肺癌是常见的恶性肿瘤之一, 其发病率和死亡率居各种恶性肿瘤之首[1], 70%～80%肺癌患者到确诊时已丧失了最佳的根治性切除机会, 因此化疗是治疗肺癌不可缺少的手段之一, 但由于细胞毒性作用, 同时也损伤了宿主机体的免疫系统, 所以肿瘤的治疗过程中杀伤肿瘤细胞与保护机体的免疫功能具有同等重要作用, 高效低毒或无毒的治疗方法一直是肿瘤治疗的难点[2]。经过几十年的探索与实践, 中医药治疗肺癌取得了肯定的疗效[3], 逐渐成为晚期肿瘤的主要治疗方法之一。天然植物药以其疗效广泛、确切、毒性低, 受到国际广泛的关注。近年来, 关于中草药抗癌作用机制的研究不断发展[4], SDZ (S树舌, D多糖, Z皂苷) 抗癌药物是黑龙江省大兴安岭地产药材树舌, 人参及黄芪等多种药材组成的复方药物。该项目在组方中充分发挥了中药的协调作用, 即能抗癌又能提高机体的抗病能力, 且低毒性。在提取分离和制剂研究中, 采用了新的技术, 这是中药现代化国际化所必须的, 药物中复方的抗癌成分和免疫活性成份组合是它的创新之处。
近年来众多的研究表明, 肿瘤的发生、发展不仅与肿瘤细胞分化异常、细胞增殖过度有关, 而且与细胞凋亡减少有关。目前临床上应用很多的抗肿瘤药如5-FU、顺铂、丝裂霉素等被发现均可诱导肿瘤细胞凋亡, 诱导凋亡是其抗肿瘤的重要机制之一。化疗药物主要通过诱导肿瘤细胞凋亡而产生抗癌作用, 因此是否能引起肿瘤细胞凋亡已成为评价化疗药物优劣的一个重要指标。由于肿瘤细胞较正常细胞对药物诱导的细胞凋亡更为敏感, 在药物设计时可研究更特异性诱导肿瘤细胞凋亡的药物。近年来, 关于中药诱导肿瘤细胞凋亡的研究越来越多, 有学者发现, 一些从中药中提取的生物碱能有效抑制肿瘤细胞生长, 并且能诱导肿瘤细胞凋亡。目前用于肺癌的化疗药层出不穷, 但探求高效、低毒、经济的化疗药仍是许多学者坚持不懈的追求目标。SDZ中的几位中药均为传统治疗肺癌较为有效的中药。实验表明该药体外有抑制肺癌细胞增殖和诱导其凋亡的作用, 用现代的研究方法揭示诱导凋亡是其抗肿瘤的重要机制之一, 也显示了SDZ在肺癌治疗方面具有一定潜力。本实验证实SDZ抗癌药物能引起肺癌细胞凋亡, 为本药用于肺癌的治疗提供了实验依据。
摘要：目的旨在探讨SDZ体外对肺癌A549细胞生长的作用。方法采用hoechst染色、荧光显微镜下观察SDZ诱导肺癌A549细胞凋亡的作用。结果经SDZ 1000μg/m l作用24 h肿瘤细胞即可发生凋亡, 凋亡率达31.7%。结论SDZ体外可诱导肺癌A549细胞凋亡。
关键词：SDZ,肺癌A549,细胞凋亡
参考文献
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