平滑肌细胞凋亡

平滑肌细胞凋亡（精选7篇）

平滑肌细胞凋亡 篇1

摘要：目的 研究葛根通脉饮对同型半胱氨酸 (homocysteinemia, HCY) 诱导增殖大鼠血管平滑肌细胞 (vascular smooth muscle cell, VSMC) 的促凋亡作用。方法 制备葛根通脉饮含药血清, 大鼠VSMC原代培养、鉴定, 分为空白组、HCY组、葛根通脉饮组、瑞舒伐他汀 (可定) 组、葛根通脉饮联合可定组。药物干预后, Annexin/PI双染法检测细胞凋亡率。结果 与空白组比较, HCY组细胞凋亡率显著降低 (P<0.01) ;与HCY组比较, 葛根通脉饮组、可定组、葛根通脉饮联合可定组细胞凋亡率显著升高 (P<0.05, P<0.01) 。结论 葛根通脉饮可促进HCY诱导增殖的大鼠VSMC凋亡, 可能是其抗动脉粥样硬化 (atherosclerosis, AS) 作用机制之一。

关键词：葛根通脉饮,同型半胱氨酸,血管平滑肌细胞,细胞凋亡

血管平滑肌细胞 (vascular smooth muscle cell, VSMC) 过度增殖是动脉粥样硬化 (atherosclerosis, AS) 形成的主要病理机制之一, 抑制VSMC增殖是防止AS病变发生发展、减轻血管重构的的关键[1]。本实验通过观察我院的院内制剂葛根通脉饮对同型半胱氨酸 (homocysteinemia, HCY) 诱导增殖大鼠VSMC的促凋亡作用, 探讨其抗动脉粥样硬化的机制, 为葛根通脉饮临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 葛根通脉饮和瑞舒伐他汀 (可定) 含药血清制备

葛根通脉饮由葛根30 g、山楂15 g、太子参12 g、当归尾6 g、淫羊藿6 g、赤芍6 g、川芎6 g、甘草6 g等组成, 药材购自河南中医学院第一附属医院中药房并由制剂室制备成中药汤剂。瑞舒伐他汀 (可定) , 阿斯利康制药有限公司, 国A2002002。新西兰大白兔给药剂量为临床用药剂量的5倍, 每日剂量分2次灌胃, 连续5 d, 末次给药后1 h, 腹主动脉取血, 离心、分离备用。

1.1.2 主要仪器与试剂

CO2恒温培养箱 (德国Heraeus公司) ;FACS Calibur流式细胞仪 (BD.USA公司产品) ;FLUOVIEW FV100共聚焦荧光显微镜 (日本OLYMPUS公司) ;DMEM、胰蛋白酶 (Gibco BRL.USA产品) ;Ⅱ型胶原酶 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ;α-SMA抗体 (武汉博士德公司产品) ;Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 (南京凯基生物公司产品) 。

1.2 方法

1.2.1 大鼠VSMC原代培养

雄性wistar大鼠, 体质量200~250 g, 购自湖北省动物实验中心。戊巴比妥钠腹腔麻醉后迅速分离、取出腹主动脉, 小心剥除血管外膜, 纵行剪开血管。PBS洗两次, 剪成0.5~2 mm大小的组织块, 放入含有1 mg/m LⅡ型胶原酶溶液的离心管中, 37℃温箱中消化30 min。剧烈震荡离心管, 除去内皮细胞, 将取出的组织块放入1 mg/m L II型胶原酶溶液中, 37℃温箱中消化4~6 h, 待组织块呈絮状后终止消化。离心, 去上清, 重悬细胞, 转入培养瓶中。待细胞长至75%汇合度时, 消化传代, 取2~5代细胞用于实验。

1.2.2 原代培养的大鼠VSMC免疫组织化学检测

细胞接种到6孔板中, 培养72 h, 去上清, PBS洗3次, 4%多聚甲醛固定15 min, 加入0.3%Triton X-100, 倒掉后再加入Triton X-100室温透化15 min, 滴加30μL血清封闭液 (二抗宿主来源) , 室温封闭30 min。加入一抗α-SMA抗体 (1∶50) , 4℃孵育过夜。加入FITC标记羊抗小鼠二抗 (1∶100) , 37℃孵育30 min, 同时加4’, 6二脒基-2-苯吲哚盐酸 (4’, 6-diamino-2-phenylindole, DAPI) 染细胞核, 37℃孵育30 min, 封片后荧光显微镜下观察。

1.2.3 细胞分组与药物干预

取生长状态良好的细胞胰酶消化, 制备细胞悬液, 调整细胞浓度为1×106/m L。将处理好的盖玻片放入6孔板各孔中, 每孔准确接种900μL细胞悬液, 继续培养后将细胞分为空白组、HCY组、葛根通脉饮组、瑞舒伐他汀 (可定) 组、葛根通脉饮联合可定组。除空白组外, 各组均加入剂量为10-4 mol/L同型半胱氨酸, 培养24 h后, 葛根通脉饮组加入葛根通脉饮含药血清, 可定组加入可定含药血清, 葛根通脉饮联合可定组同时加入葛根通脉饮、可定含药血清, 培养48 h后, 收集细胞。

1.2.4 Annexin V-PI法检测细胞凋亡率

各组细胞用PBS洗涤, 0.125%胰蛋白酶消化, 转移至离心管, 加培养液, 混匀, 1000 r/min离心, 弃上清, 加PBS, 重悬细胞, 调整细胞浓度为106/m L, 取0.5 m L细胞悬液, 1000 r/min离心4 min, 弃上清, 加0.5 m L Binding Buffer, 重悬细胞, 加1μL荧光标记的annexin V试剂, 混匀, 室温下避光孵育20 min, 加入PI 5μL, 混匀后4℃下避光孵育5 min, 加入Binding Buffer 500μL, 随即用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率, 用Flow max 2.4软件进行数据处理。

1.2.5 数据统计与分析

各组细胞测定值以均数±标准差 (±s) 表示, 使用SPSS10.0软件包进行单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD法。

2 结果

2.1 原代培养的大鼠VSMC形态及免疫组织化学检测结果

倒置相差显微镜观察, 培养的细胞多数呈长梭形, 核大, 细胞核呈蓝色, 细胞质呈现绿色, 可见明显的肌丝纤维。免疫组化结果显示, 细胞胞质内特异性标志蛋白α-SMA表达呈阳性者超过98%的, 提示培养细胞为VSMC。

2.2 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测结果

与空白组 (4.36±0.25) 比较, HCY组 (1.17±0.15) 细胞凋亡率显著降低 (P<0.01) , 提示HCY可诱导VSMC增殖;葛根通脉饮、可定均可显著促进VSMC凋亡, 葛根通脉饮组 (3.08±0.14) 、可定组 (2.35±0.24) 、葛根通脉饮联合可定组 (3.23±0.22) 大鼠VSMC凋亡百分率与HCY组相比较, 差异均有统计学意义 (P<0.05, P<0.01) 。

3 讨论

AS及其所致的冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑卒中是目前世界范围内两大主要死亡原因[2]。研究证实, AS的主要病理形态学特征之一是VSMC向动脉内膜的迁移和增殖。脂质代谢紊乱、高HCY血症等AS危险因素可损伤血管内皮细胞, 引起血小板和单核巨噬细胞黏附、聚集, 血小板释放的细胞因子促使VSMC迁移至血管内膜, 在内膜增殖后, VSMC和巨噬细胞荷脂形成泡沫细胞, VSMC还可合成胶原纤维等基质, 进而形成AS斑块, 因此, 抑制VSMC迁移和增殖, 对于延缓或阻止AS病变发生发展及心血管病防治具有重大意义[3]。

我们的前期研究发现[4,5,6], 作为单体的葛根素具有保护血管内皮细胞, 调节血脂水平, 抑制VSMC增殖等良好的抗AS作用, 葛根素预防性给药能明显抑制兔主动脉AS病变, 其机制与调控细胞周期、影响内质网应激水平、抑制AS过程中炎性反应等密切相关。在前期工作的基础上, 根据临证经验, 我们以葛根为主药, 将葛根通脉饮方剂应用于临床, 治疗AS及其所致心脑血管疾病。方中葛根升阳解痉, 通利血脉为君;赤芍、川芎行血活血, 山楂活血散瘀、化痰行气, 共助葛根散瘀通脉为臣;淫羊藿、太子参升提脾肾之阳气, 当归补血养血, 三药同用, 达气帅血行, 通而不滞之功, 为佐药;炙甘草补中益气, 固护脾胃, 调和诸药为使。本实验中, 葛根通脉饮组和葛根通脉饮联合可定组大鼠VSMC凋亡百分率显著高于HCY组, 提示葛根通脉饮可显著促进VSMC凋亡, 可能是其抗AS作用机制之一。

参考文献

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平滑肌细胞凋亡 篇2

1 材料与方法

1.1 动物分组和预处理

选用4～6月龄,质量为25～35 kg的小型猪6只,随机分为TES组和BES组,手术前1 d给予阿司匹林300 mg、氯吡格雷300 mg顿服。

1.2 支架和涂层

TES组的TES是由金属裸支架(BMS)经喷涂川芎嗪单体(四甲基砒嗪纯度为99%,购于上海华美制药厂)制成,为双涂层,其内层为甲基丙烯酸甲酯共聚物及川芎嗪颗粒,质量比为50∶50,涂层厚度为210～310 μm,含川芎嗪200 μg,外层为聚乙醇酸(PGA)。BMS组采用相同结构金属裸支架。两组支架均为不锈钢316 L金属管形网状支架,支架大小均为(2.5～3.0)/16 mm。

1.3 冠脉内支架植入

猪术前予氯胺酮12 mg·kg-1肌肉注射基础麻醉,3%戊巴比妥钠20 mg·kg-1术前和术中间断静脉注射强化麻醉。备皮及皮肤消毒后穿刺股动脉,插入6 F动脉鞘,注入肝素150～200 U·kg-1,常规行冠状动脉造影,为避免局部药物释放干扰,对同一头猪左前降支中段及回旋支各植入2枚相同类型的支架,支架球囊与血管直径比值为(1.1～1.2)∶1,10～15 atm(1 atm=101.325 kPa)扩张30 s,形成冠状动脉狭窄模型[2]。术后每日喂阿司匹林100 mg、氯吡格雷75 mg,并予普通饮食喂养。

1.4 支架内再狭窄的分析

术后第28天行冠状动脉造影后处死动物,剥离冠状动脉,固定24 h后切片、染色。对内膜、中膜和外膜进行组织学分析,应用计算机图像分析系统测定血管狭窄程度。

1.5 免疫组化测定增殖细胞核抗原(PCNA)

组织切片脱蜡至水,用3%H2O2灭活内源性过氧化物酶,PBS洗涤,置入柠檬酸盐缓冲液中放入微波炉,95 ℃维持10 min。滴加1∶50稀释的鼠抗人PCNA(DaKo公司产品)4 ℃过夜,PBS洗涤后滴加EnVision TM试剂(DaKo公司产品),37 ℃放置30 min,PBS洗涤,滴加0.05% DAB后再加0.01% H2O2,显色5～15 min,镜下控制终止显色反应。最后苏木素衬染,常规脱水,封片镜检。每个标本观察8个高倍镜视野,计数阳性细胞数占总观察细胞数的百分比。

1.6 TUNEL法测定VSMC凋亡

组织切片常规脱蜡,加入蛋白酶K(20 U·ml-1),消化后洗涤,滴加TUNEL标记液(Roche公司产品),TdT酶和荧光素标记的dUTP混合液(1∶29),37 ℃湿盒中孵育1 h,PBS洗涤。缓冲甘油封片,置荧光显微镜下观察。计算VSMC的凋亡数(取10个视野的平均值)。

1.7 统计学方法

两组数值均采用undefined表示,两组间用独立样本t检验,用SPSS 12.0统计软件进行分析。

2 结果

2.1 支架植入情况

6只猪均成功在左前降支及左回旋支冠状动脉中段各植入支架2枚,支架植入术后即刻行冠状动脉造影证实管腔通畅,无充盈缺损、管壁夹层、栓塞、支架移位或远端冠状动脉痉挛,无急性血栓形成。所有动物均顺利完成术后第28天的复查。

2.2 支架植入第28天冠状动脉内膜增殖情况

见表1。TES组与BMS组相比,支架内面积无显著差异。但管腔面积、新生内膜面积、平均面积狭窄百分比两组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 PCNA及平滑肌细胞凋亡情况比较

TES组内膜PCNA阳性率较BMS组明显减少[(17.00±2.28)% vs (22.83±1.94)%],差异有统计学意义(P<0.01),见图1。TES组较BMS组单位面积内VSMC凋亡数明显增加[(16.67±3.88)vs (6.33±2.42)],差异有统计学意义(P<0.01),见图2。

3 讨论

川芎嗪是中药川芎(ligusticum Chuanxiong)的有效成分四甲基吡嗪,它具有多种药理作用,可以与其它中药组成方剂,广泛用于高血压、冠心病等的防治。已有临床试验证实,PCI术后经6～12个月随访,口服芎嗪组再狭窄发生率明显低于对照组,提示口服芎嗪具有防治PCI术后再狭窄的良好临床效果[3]。动物实验亦显示,TES组与BMS组相比,新生内膜面积明显减少,管腔面积明显增大,TES能抑制内膜增殖,无致栓性,具有良好的生物相容性[4]。PCI术后由于内皮损伤,VSMC增殖并呈激活状态,细胞凋亡减少,PCNA、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原、血小板源生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、Bcl-2和c-myc的表达增高,而Bax表达降低。血管内皮损伤后VCMC的迁移、增殖、凋亡及细胞外基质的分泌和堆积,受到多种细胞因子、生长因子和基因调控的介导,参与了局部血管重建和再塑过程[5]。而川芎嗪具有典型钙离子拮抗剂的特性,通过拮抗Ca2+,降低细胞内钙调蛋白(CaM)、钙调神经磷酸酶(CaN)活性,干预CaN依赖的信号转导途径,进而下调细胞内c-myc、PCNA表达水平,从而显著抑制VSMCs增殖[6]。c-myc基因表达DNA结合蛋白,可促进与细胞增殖有关的基因开放,从而产生细胞增殖效应,c-myc基因的激活被认为是增殖的始动环节之一,而川芎嗪能够抑制凝血酶诱导的VSMC表达c-myc基因[7]。川芎嗪通过抑制VSMC Ⅰ型和Ⅳ型胶原、FGF、PDGF表达,抑制c-myc基因表达,达到抑制VSMC增殖的作用[8]。VSMC迁移增殖的前提是局部基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)活性增强,降解VSMC周围的细胞外基质。MMP的活性可被组织型金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases,TIMPs)所抑制,局部过表达TIMP可以抑制新生内膜的形成[9]。而川芎嗪具有提高受损动脉管壁TIMP-1 mRNA表达的作用,因此推测川芎嗪通过增加受损动脉管壁TIMP-1 mRNA表达来提高TIMP-1含量,拮抗MMPs对细胞外基质的降解,从而在早期抑制新生内膜的形成[10]。平滑肌细胞中骨桥蛋白mRNA的表达量与平滑肌细胞的迁移能力有密切关系,PDGF刺激了骨桥蛋白mRNA高表达,其中PDGF-BB作用是最强的,川芎嗪也可以通过下调PDGF-BB刺激的骨桥蛋白mRNA的表达,削弱VSMC的迁移能力而防治PCI后再狭窄的发生[11]。本实验亦证实,内膜PCNA阳性率TES组较BMS组明显减少,提示TES可以抑制新生内膜VSMC的增殖及迁移。

支架植入的早期VSMC增殖活性较高,后期伴随VSMC的持续增殖,逐渐出现VSMC凋亡,从而抑制VSMC的进一步增加,提示在支架植入后早期阶段对凋亡进行适当的诱导有可能抑制支架内再狭窄的发生[12]。细胞凋亡的调节有赖于促凋亡基因(如bax、bad)和抗凋亡基因(如bcl-2、bcl-x1)的平衡。内皮损伤后Bcl-2的表达增高,而Bax表达降低,川芎嗪通过抑制bcl-2的表达,促进Bax的表达,从而促进VSMC的凋亡[5]。本实验亦证实,TES组较BMS组单位面积内VSMC凋亡数明显增加,提示TES能够诱导VSMC凋亡。

由本实验可知,TES通过抑制VSMC增殖、迁移并促进VSMC凋亡的作用,降低支架植入术后再狭窄的发生,这是一种防治再狭窄的新策略。

摘要：目的观察川芎嗪洗脱支架(TES)对平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。方法在6只小型猪冠状动脉分别植入TES与金属裸支架(BMS),术后第28天处死动物,用组织病理学方法检测内膜增殖情况,用免疫组化和TUNEL法观察TES对平滑肌细胞增殖和凋亡的影响。结果TES组较BMS组冠状动脉管腔面积增加、支架内新生内膜面积和面积再狭窄百分比减小(P<0.05),BMS组较TES组增殖细胞核抗原(PCNA)细胞阳性率明显增加(P<0.05),TES组较BMS组单位面积内平滑肌细胞(VSMC)凋亡数明显增加(P<0.05)。结论与EMS相比,TES可明显降低支架内再狭窄,显著抑制VSMC增殖、迁移并促进VSMC凋亡。

关键词：川芎嗪,药物洗脱支架,再狭窄

参考文献

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平滑肌细胞凋亡 篇3

1 材料与方法

1.1 实验动物和试剂:

SD大鼠由山西医科大学动物实验中心提供。吡格列酮 (沈阳施德) , GW9662 (sigma公司) , DMEM高糖型培养基 (Gibco) , 胎牛血清 (杭州四季青公司) , 特异性小鼠抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白 (武汉博士德) DAB显色试剂盒 (武汉博士德) , 钙离子定量检测试剂盒和碱性磷酸酶 (ALP) 检测试剂盒 (南京建成生物工程研究所) , TUNEL试剂盒 (罗氏公司) SP免疫组化试剂盒 (北京博奥森) , 余为市售分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 VSMCs培养及鉴定:

采用无菌方法取160 g左右Sprague-Dawley雄性大鼠胸主动脉中膜, 将中膜剪成约1 mm×1 mm大小, 贴培养皿底部, 放入含20%胎牛血清的DMEM培养基, 置于37℃、5%CO2的孵箱中培养, 用0.125%胰蛋白酶消化传代。实验选用第5~10代细胞。经SMα-actin免疫细胞化学染色确定为平滑肌细胞。

1.2.2 分组及处理:

取上述平滑肌细胞生长至融合状态后, 分别置于六孔板中进行试验。本实验分6组: (1) 空白对照组 (加入10%DMEM细胞培养液) ; (2) 钙化组 (加入钙化培养基, 钙化培养基是在常规培养基中加入10 mmol/Lβ-甘油磷酸 (β-GP) 和10 mmol/L丙酮酸钠) ; (3) 钙化+PPAR-γ抑制剂 (加入钙化培养基、25 mmol/L GW9662) ; (4) 钙化+PIO (10、50、100μmol/L) 组 (加入钙化培养基中以及加入不同浓度 (10、50、100μmol/L吡格列酮) 。每组设3个复孔, 细胞每隔两天换液1次, 连续培养15 d[4]。

1.2.3 VSMCs钙化的染色鉴定:

取1.5 cm×0.5 cm的盖玻片数枚放入6孔板内, 以1.2×105接种密度进行细胞爬片。分别制作实验组和对照组的细胞爬片。取出盖玻片先用预冷4℃的PBS缓冲液洗涤2次, 浸入冰丙酮中固定20 min。 (1) 将细胞玻片放入1%茜素红S溶液内染色30 min, 用0.2%醋酸溶液快速冲洗l次, 滤纸吸干。系列酒精脱水, 二甲苯固定、封片。显微镜下钙盐沉积处被染为橘红色。 (2) Von Kossa染色:将细胞玻片放入5%硝酸银溶液避光孵育15 min, 紫外灯照射10 min, 洗涤后浸入1%硫代硫酸铵溶液1 min, 洗涤后碱性品红复染。显微镜下观察钙盐沉积处为黑色。

1.2.4 VSMCs的钙含量测定:

弃上层培养基, 用PBS缓冲液冲洗细胞2次, 加入适量0.6 N盐酸, 37℃去钙化作用24 h。采用钙离子定量检测试剂盒测定。剩余细胞用PBS洗3次, 加入0.05 mol/L Na OH/0.1%SDS细胞裂解液, 30 min后提取胞质蛋白, 用BCA法蛋白分析试剂盒测定总蛋白, 钙含量用蛋白含量标准化。

1.2.5 VSMCs的碱性磷酸酶活性测定:

弃上层培养基, 用PBS缓冲液冲洗细胞2次, 加入适量含1%Triton X-100的生理盐水, 置于4℃冰箱24 h。用超声波处理25 s后反复吹打, 使细胞充分破裂 (倒置显微镜下观察到细胞破碎、无完整的细胞结构) , 离心后取上清用碱性磷酸酶 (ALP) 检测试剂盒测定ALP活性。测量时提取胞质蛋白并测定总蛋白含量, 用其校正细胞层ALP活性。

1.2.6 流式细胞术检测VSMCs凋亡率:

各组细胞用0.25%胰酶 (无EDTA) 消化, 血清终止消化后转移至离心管, 1000 rpm离心10 min, 弃上清, 用PBS冲洗2~3次, 弃上清, 每管500μL buffer重悬, 分别加入Annexin V-FITC, PI染液各5μL, 避光反应15 min, 流式细胞仪检测细胞凋亡百分率。

1.2.7 TUNEL法检测VSMCs凋亡率:

弃上层培养基, 收集细胞, 采用细胞凋亡原位检测试剂盒, 即TUNEL法进行检测, 之后用DAPI染液染色封片, 荧光倒置显微镜下观察。TUNEL阳性呈绿色荧光, DAPI呈蓝色荧光。每个细胞爬片观察4个独立视野, 计算每100个细胞的凋亡个数, 计算凋亡率。

1.2.8 RT-PCR测定GRP-78, caspase-12和PPAR-γm RNA的表达:

见表1。应用RNA提取试剂盒提取RNA, 并用微量分光光度计进行检测其吸光度在1.8~2.0, 其后取5μL RNA按照反转录试剂盒制备c DNA后, 进行PCR扩增。

1.3 统计学处理:

数据用 (±s) 表示, 采用SPSS 13.0统计软件进行处理, 组间比较采用单方差分析, 多重比较采用LSD法。

2 结果

2.1 血管平滑肌鉴定:

倒置显微镜下观察, 可见原代平滑肌细胞从组织块边缘游出 (图1A) 血管平滑肌细胞呈梭型, 逐渐呈现束状排列, 出现典型的“峰谷样”样生长。经特异性免疫组化SMα-actin染色, 可见胞质内SMα-actin表达丰富, 细丝状排列, 符合血管平滑肌细胞特征。

2.2 钙化的血管平滑肌细胞鉴定:

倒置显微镜下观察, 可见血管平滑肌细胞透明度下降, 表现为多层生长状态, 部分细胞脱死亡。空白对照组与单纯钙化组相比:茜素红S染色时, 钙化组 (A2) 与对照组 (A1) 比较可见橘红色区域, 散装分布, 证实有钙盐沉积;Von Kassa染色时, 钙化组 (B2) 与对照组 (B1) 比较可见黑色沉积区域, 证实有钙盐沉积。

图1原代培养大鼠VSMCs及鉴定 (×200) A, B为原代大鼠VSMCs, C为大鼠VSMCs SMα-actin免疫细胞化学染色

图2茜素红S染色细胞结节处可见橘红色沉积;Von Kossa染色细胞结节处可见黑色颗粒沉积

2.3 吡格列酮对VSMCs钙含量、碱性磷酸酶活性:

见表2。与对照组相比, 钙化组的钙含量、ALP活性含量均升高 (P<0.01) ;不同浓度吡格列酮组的钙含量、ALP活性与钙化组相比较均明显升高 (P<0.05) , 且呈剂量依赖。

注:a为P<0.01, 与空白对照组相比;b为P<0.05, 与钙化组相比

2.4吡咯咧酮对VSMCs凋亡的影响:

钙化组与对照组相比, 出现大量细胞凋亡, 差异显著 (P<0.01) ;不同浓度吡咯列酮处理后在流式图中B4区和B2区的细胞分布均明显增多, 即促进了细胞钙化造成的凋亡和坏死, 凋亡率均较钙化组明显减低 (P<0.05) , 且吡咯列酮的作用呈现剂量依赖关系 (表3和图3) 。

注:a为P<0.01, 与对照组比较;b为P<0.05, 与钙化组比较

2.5 TUNEL法检测各组VSMCs凋亡率:

倒置荧光显微镜下观察, 可见TUNEL阳性信号呈绿色荧光, 而所有细胞核经DAPI荧光染料复染后, 呈蓝色。与对照组相比, 钙化组和钙化+PIO处理组凋亡细胞增多, 差异显著 (P<0.01) ;PIO处理组与钙化组相比, 细胞凋亡率显著增高 (P<0.05) 。见图4。

注:倒置荧光显微镜下观察, 可见TUNEL阳性信号呈绿色荧光, 而所有细胞核经DAPI荧光染料复染后, 呈蓝色。柱状图中:1正常组;2钙化组;3钙化+10μmol/L PIO;4钙化+50μmol/L PIO;5钙化+100μmol/L PIO;6钙化+GW9662;a为P<0.05与正常对照组比较;b为P<0.05与钙化组比较。

2.6 GRP-78、caspase-12及PPAR-γm RNA的表达:

与空白组比较, 钙化组和钙化组+PIO处理组, GRP-78、caspase-12及PPAR-γm RNA表达增高, 差异显著 (P<0.01) ;与钙化组比较, 钙化+PIO处理组GRP-78、caspase-12及PPAR-γm RNA表达显著增高 (P<0.05) , 且呈剂量依赖。见图5。

3 讨论

血管钙化与冠心病、心肌梗死、脑卒中等多种疾病相关, 是发生心、脑血管急症的重要危险因子。以往认为VC是钙盐在细胞内和细胞外基质的被动沉积, 近年来研究发现VC是一种与骨发育类似的主动的、可调控的生物学过程, 类似于骨和软骨形成过程中的骨化, 主要特征是血管细胞尤其是血管平滑肌细胞成骨样表型转换[5,6]。随血管平滑肌细胞组织钙化的进展, 原有的细胞功能发生改变, 具备了骨细胞的特征和功能, 呈现出骨细胞特异性蛋白及基因表达。

图5各组VSMCs m RNA表达的比较a为P<0.01, 与空白对照组相比;b为P<0.05, 与钙化组相比。

内质网应激是内质网内环境在外界环境影响下, 内质网折叠蛋白质发生未折叠或者异常蛋白蓄积, 导致“未折叠蛋白反应。”已有研究证实内质网应激参与细胞凋亡的过程, 通过上调GRP78来发挥作用[7], 同时GRP78被公认为内质网应激的标志。caspase-12的激活是促发内质网凋亡的重要途径。Proudfoot等[8]实验发现:人体VSMC在钙化发生前就出现细胞凋亡特征, 其培养l周后出现来源于VSMC凋亡小体的基质囊泡 (基质囊泡是正常软骨内骨钙化的生发中心) ;进而说明了凋亡小体的功能类似骨基质囊泡, 其能够蓄积钙, 促进VSMC骨相分化。

吡格列酮作为PPAR-γ激活剂已广泛应用于临床糖尿病的治疗, 除此之外, 有报道称该类药物可减轻动脉粥样硬化和促进血管平滑肌细胞凋亡的作用, 其机制可能是通过快速激活TGFβ1, 进而引起细胞凋亡[9]。研究发现, PPAR-γ激活时, 凋亡相关基因p53和bal-2出现异常表达, 促进平滑肌细胞凋亡[10]。但吡咯咧酮是否通过激活PPAR-γ, 进而影响血管平滑肌细胞凋亡, 促进血管平滑肌细胞钙化鲜有报道。因此, 本实验采用体外BGP诱导血管平滑肌细胞钙化, 观察比格咧酮对血管平滑肌细胞钙化的影响及机制。结果发现离体的血管平滑肌细胞可以形成明显的矿化结节, 钙含量及ALP活性较对照组明显增加, 标志着局部细胞已发生成骨细胞样化。血管平滑肌细胞钙化后, 凋亡率明显增加, 内质网应激指标GRP78及caspase-12m RNA水平明显增加;同时比格咧酮处理后, 上述改变加重。结果证实比格咧酮可以促进PPAR-γ的表达, 促进血管平滑肌细胞钙化, 促使血管平滑肌细胞向成骨样细胞表型转化, 其机制可能是作用于内质网, 通过上调GRP78及caspase-12, 促使内质网应激状态加重, 引起过度内质网应激, 加重细胞钙化。但抑制PPAR-γ活性作为很有前途的抗血管钙化手段, 还需对其在VC中的作用做进一步研究。

摘要：目的 探讨吡咯列酮通过内质网应激致凋亡途径对大鼠血管平滑肌细胞钙化影响。方法 利用β-甘油磷酸钠联合丙酮酸钠制备钙化血管平滑肌细胞模型, 予不同浓度 (10、50、100μmol/L) 吡咯咧酮干预。用Von Kossa染色及茜素红S染色观察细胞钙化程度, 用甲基百里香酚蓝法测定各组细胞中钙含量, 磷酸苯二钠法测定细胞中碱性磷酸酶 (ALP) 活性。采用流式细胞术及TUNEL法检测细胞凋亡率, 实时荧光定量RT-PCR检测各组细胞PPAR-γ、GRP78和caspased-12表达。观察吡咯列酮通过内质网应激致凋亡对大鼠血管平滑肌细胞钙化影响及其可能的分子机制。结果 钙化血管平滑肌细胞其钙含量、ALP活性较普通细胞增多 (P<0.01) , 而吡格列酮呈剂量依赖性地促进钙化大鼠血管平滑肌细胞的钙含量、ALP活性, 以及PPAR-γ、GRP78、caspase-12m RNA表达 (P<0.05) 。结论 吡咯列酮通过内质网应激致凋亡途径作用可促进β-磷酸甘油诱导的血管平滑肌细胞钙化, 其作用可能与PPAR-γ及GRP78、caspase-12表达上调有关。

关键词：血管钙化,内质网应激,血管平滑肌细胞,吡咯列酮

参考文献

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[3]Kapustin AN, Davies JD, Reynolds JL, et al.Calcium regulates key components of vasculμLar smooth muscle cell-derived matrix vesicles to enhance mineralization[J].Circ Res, 2011, 109 (1) :e1-12.

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[5]Sasaki T, Nakamura K, Sasada K, et al.Matrix metalloproteinase-2deficiency impairs aortic atherosclerotic calcification in ApoEdeficient mice[J].Atherosclerosis, 2013, 227 (1) :43-50.

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[7]Proudfoot D, Skepper JN, Hegyi L, et al.The role of apoptosis in the initiation of vascular caleification[J].Z Kardiol, 2001, 90 (3) :43-46.

[8]Xin W, Li X, Niu K, et al.Involvement of endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in a heart failure model induced by chronic myocardial ischemia[J].Int J Mol Med, 2011, 27 (4) :503-509.

[9]刘厂辉, 李建平, 阳辉.罗格列酮对高脂血症大鼠平滑肌细胞凋亡的影响及机制探讨[J].中国动脉硬化杂志, 2012, 20 (3) :199.

平滑肌细胞凋亡 篇4

1 材料与方法

1.1 一般材料

1.1.1 实验动物

清洁级SD雄性大鼠, 体重250~300 g, 周龄2~5周, 购于常州卡文斯实验动物有限公司。

1.1.2 主要试剂和仪器

姜黄素 (长沙华锦生物科技有限公司) , 大鼠MCP-1 ELISA试剂盒 (上海凯博生化试剂有限公司) , Western-blot化学发光试剂盒 (贝博生物) , 总DNA提取盒 (广州健仑生物科技有限公司) , 逆转录试剂盒 (广州健仑生物科技有限公司) , PCR扩增试剂盒 (上海生工生物科技有限公司) 。二氧化碳培养箱 (无锡精创科技有限公司) , 凝胶成像分析系统 (法国Vilber) , 低温冷冻高速离心机 (德国Hettich) , 蛋白电泳仪 (日本ATTO株式会社公司) , 基因扩增仪 (上海西朴生物科技有限公司) , 多功能酶标仪 (美国Bio Tek公司) 。

1.1.3 主要试剂配制

姜黄素溶液:姜黄素粉末溶于二甲基桠枫, 配成的原液浓度为50 mmol/L, 低温保存, 需要时配制成需要的浓度。PBS平衡盐溶液配制:8 g氯化钠, 0.2 g氯化钾, 磷酸氢钠2.9 g, 磷酸氢钾0.2 g加蒸馏水, 陪成1 L, 调整p H值7.3~7.5, 分装, 低温保存。培养基:DMEM干粉加去离子水溶解, 定容1000 m L, 加双抗, 调节p H为7.0, 过滤除菌后分装, 4℃保存。MTT (噻唑蓝) 工作液:MTT溶于PBS液中, 配制浓度为5 mg/m L, 过滤除菌, 4℃保存。

1.2 研究方法

1.2.1 大鼠原代主动脉平滑肌细胞培养传代

SD大鼠处死后分离大鼠主动脉, 在青霉素无血清DMEM中漂洗3~4次, 分离中膜层, DMEM培养基清洗3次, 放入培养皿, 加胎牛血清。剪碎中膜层, 放入培养瓶中, 加入含20%胎牛血清的DMEM培养基, 翻转培养瓶, 使组织块贴壁, 放入培养箱中, 37℃, 5%CO2, 培养3h。翻转培养瓶, 次日观察无污染, 继续培养5~7天, 见原代血管平滑肌细胞。当细胞覆盖率达到80%~90%, 细胞单层融合, 进行消化传代。每2天换1次液。传至2~3代冻存。

1.2.2 姜黄素对Ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞 (VSMCs) MCP-1分泌的影响研究方法

取出平滑肌细胞进行解冻、培养并传代, 取传3~8代细胞, 通过免疫组化法鉴定为血管平滑肌细胞用于实验。根据作用药物及浓度不同进行分组。对照组 (不加任何药物) , Ox-LDL 100μg/m L组, Ox-LDL 100μg/m L+姜黄素5μmol/L组, Ox-LDL 100μg/m L+姜黄素10μmol/L组, Ox-LDL 100μg/m L+姜黄素30μmol/L组。采用ELISA和RT-PCR检测细胞上清中MCP-1的浓度以及细胞MCP-1 m RNA的表达情况。

1.2.3 姜黄素对Ox-LDL诱导大鼠VSMCs增殖的影响研究方法

冻存细胞解冻, 培养, 传代, 鉴定为平滑肌细胞。根据作用药物浓度进行分组, 对照组 (不加任何药物) , Ox-LDL 100μg/m L组, Ox-LDL 100μg/m L+姜黄素20μmol/L组, Ox-LDL 100μg/m L+姜黄素40μmol/L组, Ox-LDL 100μg/m L+姜黄素80μmol/L组。采用MTT法检测OD值测定细胞增殖程度。

1.2.4 姜黄素对VSMCs诱导凋亡作用的研究方法

取冻存细胞解冻, 培养传代, 鉴定为平滑肌细胞。按照加入药物浓度进行分组, 对照组 (不加任何药物) 姜黄素50μmol/L组, 姜黄素100μmol/L组, 姜黄素120μmol/L组, 检测细胞凋亡情况, 采用Western-blot方法检测细胞caspase-8p10表达水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 15.0统计学软件数据处理, 正态分布计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 多组间比较采用方差分析, 两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素对Ox-LDL诱导VSMCs MCP-1分泌及MCP-1 m RNA表达的影响

Ox-LDL 100μg/m L组MCP-1分泌及MCP-1m RNA表达水平较对照组显著升高, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。Ox-LDL 100μg/m L+姜黄素10μmol/L组和Ox-LDL 100μg/m L+姜黄素30μmol/L组MCP-1分泌及MCP-1 m RNA表达水平较Ox-LDL 100μg/m L组显著下降, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。OxLDL 100μg/m L+姜黄素30μmol/L组MCP-1分泌水平又显著低于Ox-LDL 100μg/m L+姜黄素5μmol/L组和Ox-LDL 100μg/m L+姜黄素10μmol/L组, 差异均有高度统计学意义 (P<0.01) 。见表1。

2.2 姜黄素对Ox-LDL诱导的VSMCs增殖影响

对照组OD值为 (0.326±0.039) , 见图1。Ox-LDL100μg/m L组OD值为 (0.548±0.074) , Ox-LDL 100μg/m L+姜黄素20μmol/L组OD值为 (0.522±0.072) , Ox-LDL100μg/m L+姜黄素40μmol/L组OD值为 (0.442±0.061) , Ox-LDL 100μg/m L+姜黄素80μmol/L组OD值为 (0.379±0.066) 。各组之间比较, 差异有高度统计学意义 (F=12.977, P<0.01) 。其中Ox-LDL 100μg/m L组OD值显著高于对照组, 而Ox-LDL 100μg/m L+姜黄素40μmol/L组OD值和Ox-LDL 100μg/m L+姜黄素80μmol/L组OD值较Ox-LDL 100μg/m L组OD值显著下降, 差异均有高度统计学意义 (P<0.01) 。

注:与对照组比较, *P<0.01;与Ox-LDL 100μg/m L组比较, △P<0.01;与Ox-LDL 100μg/m L+姜黄素5μmol/L组比较, ▲P<0.01;与Ox-LDL 100μg/m L+姜黄素10μmol/L组比较, #P<0.01;Ox-LDL:氧化型低密度脂蛋白;MCP-1:单核细胞趋化蛋白-1

A组:Ox-LDL 100μg/m L组;B组:Ox-LDL 100μg/m L+姜黄素20μmol/L组;C组为Ox-LDL 100μg/m L+姜黄素40μmol/L组;D组:Ox-LDL 100μg/m L+姜黄素80μmol/L组;与对照组比较, *P<0.01;与A组比较, △P<0.01;Ox-LDL:氧化型低密度脂蛋白

2.3 姜黄素对大鼠平滑肌细胞凋亡及caspase-8p10表达的影响

姜黄素50μmol/L组、姜黄素100μmol/L组、姜黄素120μmol/L组大鼠平滑肌细胞凋亡率、caspase-8p10表达较对照组显著升高, 姜黄素100μmol/L组和姜黄素120μmol/L组显著高于姜黄素50μmol/L组, 而姜黄素120μmol/L组又显著高于姜黄素100μmol/L组, 差异均有高度统计学意义 (P<0.01) 。见表2。提示随着姜黄素浓度的升高, 凋亡率及caspase-8p10表达升高越明显。

注:与对照组比较, *P<0.01;与姜黄素50μmol/L组比较, △P<0.01;与姜黄素100μmol/L组比较, ▲P<0.01

3 讨论

冠心病是中国首要的致死原因, 由冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞, 造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致。冠状动脉粥样硬化, 导致管腔狭窄、板块破裂是导致冠心病的病理基础。大量研究显示血管平滑肌在动脉粥样硬化的发生和发展中发挥了重要的作用。动脉粥样硬化的板块中存在来自血液的炎性细胞、免疫细胞、中性粒细胞, 还包括来自血管壁的内皮细胞以及血管平滑肌细胞等[6]。血管内皮功能障碍, 促进细胞和脂质的渗透, 脂质蛋白氧化, 血管平滑肌细胞增殖, 血小板活化, 血栓形成, 导致粥样硬化的启动。细胞因子在动脉粥样硬化的发生和发展过程中也发挥重要的作用, TF是凝血级联反应中重要的启动子, TF抗原、TFm RNA存在于多种细胞中, 包括血管平滑肌细胞、内皮细胞等[7]。环氧化酶-2在动脉粥样硬化组织中的表达显著升高, 特别表达于炎性巨细胞以及中层VSMCs中[8]。

低密度脂蛋白胆固醇 (LDL) 是血浆胆固醇主要的转运体。Ox-LDL是氧化修饰的低密度脂蛋白, 被认为是动脉粥样硬化关键的启动因素[9]。LDL中不饱和脂肪酸中的脂质分子被氧化, 产生大量的脂质氧化物, 脂质氧化产物共价修饰apo B蛋白, 产生乙醛类复合物, 这些乙醛类的复合物进一步氧化修饰脂蛋白氨基酸残基, 生成各种加合物, 最终形成Ox-LDL[10,11]。Ox-LDL是一类经化学修饰的脂蛋白颗粒的混合物, 而不是单一成分。LDL氧化修饰机制包括金属离子氧化法, 髓过氧化物酶氧化作用, 糖化LDL, 一氧化氮及其氧化机制。在动脉粥样硬化剂血管性疾病的发病机制中, Ox-LDL必不可少。Ox-LDL可引起细胞内皮细胞结构和功能的变化, 从而导致内皮细胞变性、坏死、脱落, 导致血管内皮完整性遭到破坏[12]。单核细胞以及LDL通过血管内皮进入内膜下, 形成脂质条纹。Ox-LDL还能刺激单核细胞、内皮细胞、巨噬细胞等分泌大量的言行因子、黏附因子、趋化因子, 促使单核细胞核内皮细胞分化为巨噬细胞。遗传性高脂血症兔模型血浆Ox-LDL水平显著升高, 抗氧化剂能够降低Ox-LDL水平, 减轻动脉粥样硬化的进程。心绞痛患者血液中Ox-LDL水平显著升高, 外周血NF-κB活性升高, 而在体外培养的单核细胞中加入OxLDL, 能够显著增加NF-κB活性, 这提示Ox-LDL能增加NF-κB活性, 从而增加患者的氧化应激反应[13,14]。重组人Ig G1抗体是针对Ox-LDL表位DNA修饰的apo B-100表位的抗体, 研究证明其能显著降低小鼠血液中Ox-LDL水平, 说明Ox-LDL抗体在降低血液中Ox-LDL水平, 从而阻止动脉粥样硬化进程而发挥作用。

细胞趋化蛋白是一个蛋白质家族, 由十余种结构有较大同源性、分子量多为8~10 k D的蛋白组成。单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1) 是β亚家族的代表, 可趋化单核细胞。由内皮细胞、血管平滑肌细胞等产生。MCP-1提高VSMC中MCPIP1 m RNA水平, 并呈剂量和时间依赖性地上调MCPIP1蛋白表达[15]。和MCP-1处理的VSMC相比, MCPIP1基因沉默后VSMC的细胞数量、细胞活力及细胞DNA合成率均明显降低, S期细胞数量下降;MCPIP1基因沉默可抑制MCP-1或PDGF对c-fos m RNA的上调作用。单核细胞趋化蛋白-1诱导蛋白通过介导单核细胞趋化蛋白-1诱导的血管平滑肌细胞的增殖[16]。MCP-1基因-2518A/G多态性与心肌梗死易感性具有密切的相关性[17]。

姜黄素是从姜科、天南星科中的一些植物的根茎中提取的一种化学成分, 具有降血脂、抗肿瘤、抗炎、利胆、抗氧化等作用。姜黄为常用中药, 其主要生物活性成分为姜黄素类和挥发油。前者具有降血脂、抗凝、抗氧化、利胆、抗癌等作用;而后者主要起抗炎、抗菌以及止咳作用[18,19,20]。姜黄素具有诱导肿瘤细胞凋亡、诱导肿瘤细胞分化、抑制肿瘤细胞生长等作用, 从而发挥抗癌作用。姜黄素对心血管疾病、关节炎、关节肿大等也具有临床疗效[18,19,20,21,22]。姜黄素能够调节血脂水平, 抑制细胞增殖, 抗脂质过氧化, 抑制脂质斑块的形成, 抗炎、抗凝血, 抑制心肌重构等。姜黄素能够抑制人冠状动脉内皮细胞膜表面血栓调节蛋白和内皮细胞活化蛋白的表达, 还能够抑制TNF-α介导的人冠状动脉内皮细胞膜表面TM、EPCR m RNA的表达, 从而达到抑制和减少血栓形成的作用。

既往研究显示Ox-LDL能够促进血管平滑肌细胞MCP-1的分泌而参与动脉粥样硬化的发生。在本研究中, Ox-LDL作用的大鼠血管平滑肌细胞MCP-1的分泌显著增加, 并且MCP m RNA的表达也显著增加, 这与既往的研究结果一致。而姜黄素具有抑制Ox-LDL诱导的大鼠血管平滑肌细胞MCP-1的分泌以及MCP m RNA的表达, 并且这种抑制作用随着姜黄素弄高度的升高, 作用越强。Ox-LDL能够显著诱导大鼠血管平滑肌细胞的增殖, 而血管平滑肌细胞的增殖、迁徙与动脉粥样硬化的发生关系密切。在本次研究中, 姜黄素对Ox-LDL诱导的大鼠血管平滑肌细胞的增殖具有显著的抑制作用, 并且随着姜黄素弄得的升高, 抑制作用越明显, 说明这样的抑制作用具有浓度依赖性。平滑肌细胞凋亡不足时动脉粥样硬化早期进展的主要因素, 因此诱导平滑肌细胞凋亡可能会成为防治动脉粥样硬化的方法之一。在本研究中, 姜黄素对大鼠血管平滑肌细胞具有显著的诱导凋亡作用, 并且随着浓度的升高, 这样的诱导作用也逐渐增强, 说明姜黄素诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡具有浓度依赖性。Caspase-8是凋亡的启示因子, 能够启动细胞凋亡的细胞外途径和细胞内途径。在本研究中, 姜黄素能够显著上调Caspase-8的表达, 这可能是其诱导细胞凋亡的主要机制。

综上所述, Ox-LDL能够上调大鼠血管平滑肌细胞MCP-1的表达以及MCP m RNA的表达, 诱导大鼠血管平滑肌细胞增殖, 姜黄素对Ox-LDL诱导的大鼠血管平滑肌细胞MCP-1、MCP m RNA的表达, 以及细胞增殖具有抑制作用, 且能诱导大鼠血管平滑肌细胞凋亡。

摘要：目的 探讨姜黄素对大鼠血管平滑肌细胞单核细胞趋化蛋白-1表达、增殖和凋亡的影响。方法 分离SD大鼠血管平滑肌细胞进行培养传代, 采用不同浓度的姜黄素作用于氧化型低密度脂蛋白 (Ox-LDL) 诱导的大鼠平滑肌细胞, 根据作用药物浓度进行分组, 对照组 (不加任何药物) , Ox-LDL 100μg/mL组, Ox-LDL 100μg/mL+姜黄素20μmol/L组, Ox-LDL 100μg/mL+姜黄素40μmol/L组, Ox-LDL 100μg/mL+姜黄素80μmol/L组。分析姜黄素对大鼠血管平滑肌细胞单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1) 的表达、对细胞的增殖的影响。按照加入药物浓度进行分组, 对照组 (不加任何药物) , 姜黄素50μmol/L组, 姜黄素100μmol/L组, 姜黄素120μmol/L组, 分析姜黄素对细胞凋亡的影响。结果 Ox-LDL 100μg/mL组MCP-1分泌[ (812.6±78.7) ng/L]及MCP-1 mRNA表达水平[ (1.18±0.11) ]较对照组[ (91.3±6.1) ng/L, (0.16±0.04) ]显著升高, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。姜黄素对OxLDL诱导的大鼠血管平滑肌细胞MCP-1分泌及MCP-1 mRNA表达、细胞增殖具有显著的抑制作用, 对细胞凋亡有诱导作用, 并且随着姜黄素浓度的增加, 作用越明显 (P<0.01) 。结论 姜黄素能够抑制Ox-LDL诱导的大鼠细胞平滑肌细胞MCP-1表达以及细胞增殖, 诱导大鼠细胞平滑肌细胞凋亡。

平滑肌细胞凋亡 篇5

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

SPF级SD大鼠 (雄性, 200~250 g) 由广西医科大学实验动物中心提供;I型胶原酶、木瓜蛋白酶、胰酶、戊巴比妥钠、卵清白蛋白、氢氧化铝凝胶、大鼠TN F-α蛋白、四甲基偶氮唑蓝 (M TT) 、二甲基亚砜 (D M SO) 、PD TC为美国Sigm a公司产品;灭活的百日咳杆菌有北京生物所提供;胎牛血清 (Fetal Bovine Serum, FBS) 、D M EM培养基、PBS、D-H ank's液购自美国G ibcol公司;脂质体购自英伟公司;Taq D N A聚合酶、d N TPs、逆转录酶 (M-M LV) 、随机引物 (R andom Prim er) 、琼脂糖、焦碳酸二已酸均由大连宝生公司提供, PCR引物、内参照β肌动蛋白 (β-actin) 引物及特异性引物由上海生物工程有限公司合成;Tunnel试剂盒为南京凯基生物有限公司产品;N F-κB ELISA试剂盒为上海西塘生物有限公司产品。

1.2 仪器与设备

H era cell 150二氧化碳培养箱为美国Therm o公司产品;A xioert 40倒置显微镜为德国ZEISS公司产品;450型ELISA酶标仪为BIO R A D公司产品;PCR仪为美国M J R esearch Co公司产品;低温高速离心机为美国Beckm an公司产品, 紫外分光光度仪为美国Biochrom公司产品;G BO X H R型全自动图像分析仪为德国产品;402A I型超声雾化器为江苏省鱼跃医疗设备有限公司产品;小动物解剖器械一套由上海医疗器械 (集团) 有限公司手术器械厂提供;BG-SU BM IN I水平电泳仪、BG-V ER M IN I垂直电泳仪为北京BA Y G EN E公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 哮喘大鼠模型的建立

第1、8天将每只大鼠于皮下注射10 m g卵清蛋白 (O V A) 和200 m g氢氧化铝凝胶 (混合于1 m L的PBS中) , 同时腹腔注射5×109个灭活百日咳杆菌。于第15天开始激发:将大鼠置于一密闭容器中, 用超声雾化器给予2%O-V A磷酸盐缓冲液 (O V A.PBS) 50 m L雾化吸入刺激, 每天1次, 每次30 m in。诱喘成功后大鼠表现为前8、9 m in烦躁不安, 进而出现呼吸加快、加深、静伏不动、弓背, 严重者伸颈、缩胸、收缩呈喘息状, 有的大小便失禁等。对照组则以磷酸盐缓冲液 (PBS) 代替致敏原注射和雾化吸入。

1.3.2 哮喘大鼠支气管平滑肌细胞的分离、培养及鉴定

按2.1方法建立哮喘大鼠模型, 取哮喘4周大鼠, 腹腔注射3%戊巴比妥钠 (45 m g/kg) 麻醉, 开胸后迅速取出左肺、右中肺及右下肺叶置于预冷的D-H ank's液中, 沿着支气管的走向分离出主支气管, 在解剖显微镜下, 用显微镊剥离支气管平滑肌周围的肺动脉、肺静脉、神经纤维、结缔组织等, 去除内腔面的上皮组织。以上操作均在冰浴中进行。将获得的单层A SM剪成1 m m×1 m m的小块后, 将组织块转入含有下列成分的D-H ank's液中:胶原酶2m g/m L, 木瓜蛋白酶3 m g/m L, 胰酶2 m g/m L, 37℃5%二氧化碳培养箱中消化40~50 m in, 用吸管轻轻地吹打组织块, 100目不锈钢网过滤除去残余组织块, 800 r/m in离心后, 去上清, 加入含20%FBS、青霉素 (100 u/m L) 、链霉素 (0.1 m g/m L) 的D M EM培养液悬浮所分离的单细胞, 种于25 m L培养瓶中, 37℃5%二氧化碳培养箱中培养。原代培养细胞生长约3周后融合, 用0.25%胰蛋白酶消化传代。以含10%FBS、青霉素 (100 u/m L) 、链霉素 (0.1 m g/m L) 的D M EM培养液传代培养, 每3、4天换液1次, 约5、6d细胞长满后传代, 实验用第4~8代细胞。培养的A SM Cs经免疫组织化学方法鉴定平滑肌细胞特有的α-肌动蛋白。

1.3.3 分组

(1) 空白对照组:取培养的4~6代哮喘大鼠气道平滑肌细胞, 不加任何干预剂; (2) TN F-α组:加入TN F-α (终浓度为20 ng/m L) ; (3) (TN F-α+PD TC) 组:PD TC (终浓度为100μm ol/L) 预处理30 m in后, 加入TN F-α (终浓度为20ng/m l) ; (4) (TN F-α+TLR 4) 抗体组:TLR 4抗体 (终浓度为50μg/L) 预处理30 m in后, 加入TN F-α (终浓度为20 ng/m L) 每组做4个复孔, 每组重复实验2次。各组加入不同试剂培养24h后收集细胞及培养上清液, 进行以下实验。

1.3.4 四甲基偶氮唑蓝 (M T T) 微量比色法测定A SM C s增殖

哮喘大鼠A SM Cs按1×106/m L的密度接种于96孔培养板, 培养及分组如前述, 培养结束时每孔加入20μL M TT (5 m g/m L) , 继续培养4h, 弃培养液。再加入D M SO 150μL, 微量振荡器振荡10 m in, 使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪490nm波长处测定各孔吸光度 (A) 值。

1.3.5 T U N N EL法检测A SM C s凋亡

6孔培养板中加入盖玻片, 哮喘大鼠A SM Cs按1×106/m L的密度接种, 细胞长满盖玻片后按上述步骤加药、培养。培养结束后收集盖玻片, PBS液冲洗, 纯丙酮固定8m in, 制成细胞爬片。制细胞爬片后按TU N N EL试剂盒操作说明步骤进行TU N N EL法检测A SM Cs凋亡。凋亡细胞呈深棕色。凋亡率为每个高倍视野中凋亡细胞所占百分比, 计数5个视野取平均值。

1.3.6 ELISA试剂盒检测N F-κB的蛋白含量

哮喘大鼠A SM Cs4-6代细胞按1×106/m L的密度接种于6孔培养板, 培养及分组如前述, 培养48 h后, 离心, 取细胞上清液用ELISA试剂盒检测N F-κB的蛋白含量, 操作步骤按试剂盒说明进行。

1.3.7 逆转录聚合酶链式反应 (R T-PC R) 检测T LR 4的m R N A水平

各组哮喘大鼠A SM Cs按1×106/m L接种于50 m L细胞培养瓶中, 培养及分组如前述。培养结束后PBS洗涤, 0.25%胰蛋白酶消化收集细胞 (每瓶细胞数约为107) , 然后加入TR I-zo1 1m L抽提R N A (按试剂盒说明书操作) , 于-80℃保存, 用于一步法R T-PCR。

(1) TLR 4 R T-PCR扩增反应。TLR 4引物序列, 上游5'-CG CTTTCA CCTCTG CCTTCA CTA CA G-3', 下游5'-A CA CTA CCA CA A TA A CCTTCG G CTC-3', 此对引物扩增出270 bp的片段。β-actin引物序列:上游5'-G A TTA CTG CTCTG G CTCCTG C-3', 下游5'-G A CT CA TCG TA CTCCTG CTTG C-3', 此对引物扩增出150bp的片段。严格按大连宝生生物公司D R R 024A一步法R T-PCR反应体系说明书逐步操作, TLR 4上、下游引物各1μL, β-actin上、下游引物各1μL, 扩增产物置进行琼脂糖电泳。 (2) 琼脂糖电泳反应成功后, 取5μL PCR产物加1μL D N A上样缓冲液和PCR M arker (分子量标准) , 点样在2%琼脂糖凝胶的样板孔中, 凝胶中含有0.5μg/m L的溴化乙锭 (EB) 显色, 电泳电压0.8 V/cm, 时间30 m in。电泳结束后, 采用G BO X H R型全自动图像分析仪对电泳结果进行分析:分别测定每1个目的基因及看家基因β-actin的吸光度值, 取目的基因与β-actin吸光度值的比值。

1.3.8 W estern-Blot检测各组A SM C s中T IR 4的表达

参照《分子克隆》方法:A SM Cs培养结束后, 按通用蛋白裂解液的使用说明提取细胞总蛋白, 用Bradford法测定总蛋白浓度, 适量分装, 置-80℃冰箱冻存, 待测。聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤如下:取40μg蛋白质样品 (使用前, 煮沸变性10 m in) 上样后, 先以10 V/cm电泳, 待染料前沿进入分离胶后, 将电压提高到18 V/cm, 继续电泳直至溴酚蓝达到分离胶底部 (约需2 h) 。分离胶用于电转膜, 依次安装半干式电转移仪后, 根据凝胶面积按0.2 m A/cm 2接通电流, 在电转移液中电转移35 m in。取下硝酸纤维素膜, 放入塑料袋中, 根据滤膜面积以0.1 m L/cm 2加入膜封闭液, 密闭袋口, 并放入摇床上室温孵育1h。弃去封闭液, 立即将硝酸纤维素膜放入塑料袋中, 按0.1 m L/cm 2的量加入一抗稀释溶液 (兔抗鼠TLR 4抗体:一抗稀释液为1∶1 000, 平放在摇床上室温孵育4 h。剪开塑料袋, 弃去稀释液和抗体, 用TBST漂洗滤膜3次, 每次10 m in。然后, 按滤膜面积加入0.1 m L/cm 2 TBS及1∶100辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G, 置摇床上室温孵育2 h。取出滤膜, 在TBST中室温平缓摇动, 每次孵育10 m in, 共3次。最后把滤膜按滤膜面积加入0.1 m L/cm 2的底物显色液, 于室温轻轻摇动, 待蛋白条带颜色深度适当 (约3~5 m in) , 即用PBS漂洗, 将滤膜用G BO X H R凝胶成像分析系统进行扫描读取各条带的吸光度 (A) 值。

1.3统计学分析

应用统计分析软件包SPSS17.0版本进行统计分析。实验数据用均数±标准差 (x±s) 表示, 用方差分析检测组间的总差异, 各两两组间差异比较用q检验完成, 以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 原代哮喘大鼠气道平滑肌细胞鉴定

镜下观察经原代培养的哮喘大鼠A SM Cs和正常大鼠A SM Cs均呈梭形, 有较长的突起, 细胞核位于细胞中央, 呈疏密相间、典型的“峰与谷”样生长, 见图1。采用兔抗鼠α-actin单克隆抗体进行免疫组织化学染色, 免疫反应产物呈棕黄色。98%细胞α-actin染色阳性, 证明所培养的为平滑肌细胞, 见图2。

2.2 四甲基偶氮唑蓝 (M TT) 微量比色法测定A S M C s增殖

TN F-α组A SM Cs的增殖反应与对照组相比差异有显著性 (t=3.2, P<0.05) , (TN F-α+PD TC) 组、 (TN F-α+TLR 4) 抗体组A SM Cs增殖反应显著低于TN F-α处理组 (t=7.62, t=6.86, 均P<0.01) , (TN F-α+PD TC) 组与对照组相比差异无显著性 (t=0.74, P>0.05) , (TN F-α+TLR 4) 抗体组A SM Cs增殖反应显著低于对照组 (t=3.94, P<0.01) , 见表1。

2.3 各组A S M C s细胞凋亡分析

TU N N EL法结果显示:TN F-α处理组细胞凋亡率显著低于对照组 (t=6.37, P<0.01) 。 (TN F-α+PD TC) 组、 (TN F-α+TLR 4) 抗体组细胞凋亡率显著高于TN F-α组、对照组 (t=20.75, t=20.01, t=14.72, t=18.03, 均P<0.01) 。见表1和图3。

注:1) 与TN F-α比较, P<0.01;2) 与对照组比较, P<0.05;3) 与对照组比较, P<0.01

2.4 E LIS A测定各组哮喘大鼠A S M C s的N F-κB的蛋白含量

比较各组细胞培养上清液N F-κB蛋白含量可见:TN F-α组N F-κB含量显著高于对照组、 (TN F-α+PD TC) 组及 (TN F-α+TLR 4) 抗体组 (t=24.91, t=37.51, t=24.64, 均P<0.01) ;对照组N F-κB含量显著低于T (N F-α+PD TC) 组 (t=4.09, P<0.01) ;对照组与 (TN F-α+TLR 4) 抗体组之间差异无显著性 (t=1.57, P>0.05) , 见表2。

注:1) 与TN F-α组比较, P<0.01;2) 与对照组比较, P<0.01

2.5 逆转录聚合酶链式反应 (R T-P C R) 检测各组哮喘大鼠A S M C s的TLR 4的m R N A水平

各组电泳图经扫描发现:TN F-α组TLR 4m R-N A表达水平显著高于对照组及 (TN F-α+TLR 4) 抗体组 (t=6.06, t=7.64, P<0.01) ; (TN F-α+TLR 4) 抗体组TLR 4表达水平与对照组之间差异无显著性 (t=1.03, P>0.05) 。见表3、图4。

2.6 W estern blot检测各组哮喘大鼠A S M C s的TLR 4的蛋白表达水平

各组电泳图经扫描发现:TN F-α组TLR 4表达水平显著高于对照组及 (TN F-α+TLR 4) 抗体组 (t=39.22, t=86.62, 均P<0.01) ;对照组TLR 4表达水平显著高于 (TN F-α+TLR 4) 抗体组 (t=8.58, P<0.01) 。见图5。

3 讨论

支气管哮喘的重要病理特征之一是气道重构, 其中气道平滑肌细胞在疾病的发生、发展中起着重要作用。气道平滑肌细胞增殖在气道重构中占有十分重要的地位, 气道平滑肌增生, 不仅使支气管对刺激的收缩反应更强烈, 加重气道高反应性, 而且增殖的A SM C使气道壁增厚, 导致基础气道阻力增加和不可逆性气流阻塞的发生。

TLR s作为介导固有免疫和获得性免疫的天然细胞膜受体, 在受到前炎症因子及各种配体刺激时能被激活并将信号传递到下游通路从而激活炎症反应。激活的TLR不仅诱导炎症反应, 而且促进抗原特异性获得性免疫反应的分化和成熟[1]。N F-κB是一种重要的、多向性的核转录因子, 普遍存在于细胞质中的快速反应转录因子, 位于TLR s下游信号通路的枢纽位置参与免疫反应及细胞增殖与分化等过程。TLR s识别配体后经过细胞内的一系列信号转导过程最后活化N F-κB, 诱导靶基因表达[2,3,4,5]。有关TLR-N F-κB的信号转导过程主要来自对TLR 2和TLR 4的研究[6], 促进细胞因子合成与释放是TLR s/N F-κB最突出的生物学功能。所以, 笔者推测TN F-α可能通过激活TLR 4后将信号转导至下游激活N F-κB这一转录因子, 从而在哮喘A SM Cs的增殖、凋亡中起作用。因此, 本实验用TN F-α刺激哮喘大鼠A SM Cs, 利用TLR 4抗体及N F-κB特异性拮抗剂PD TC为工具药, 探讨TLR 4/N F-κB在哮喘大鼠A SM Cs中的表达及对A SM Cs增殖凋亡的影响。

本实验发现:TN F-α组TLR 4的m R N A及蛋白表达、N F-κB蛋白含量显著高于对照组; (TN F-α+TLR 4) 抗体组TLR 4的m R N A及蛋白表达、N F-κB含量显著低于对照组和TN F-α组, 笔者推测TLR 4可能通过激活N F-κB后产生一系列生物效应, 这与其他学者的研究结果一致。

A SM Cs的增殖在哮喘气道重构中起重要作用[7,8]。作为效应细胞的A SM Cs受到长期慢性的炎性刺激可出现增生肥大, 从而导致气道壁增厚、气道重构。本实验发现:TN F-α组TLR 4的m R N A及蛋白表达、N F-κB含量显著高于对照组, 同时TN F-α组A SM Cs的增殖反应与对照组相比有增加, 而 (TN F-α+TLR 4) 抗体组A SM Cs增殖反应显著低于TN F-α组及对照组, (TN F-α+TLR 4) 抗体组A SM Cs凋亡率显著高于对照组和TN F-α组。由此推测, TLR 4可能参与调控哮喘A SM Cs的增殖反应和细胞凋亡。在实验中还发现:TN F-α+PD TC组与对照组相比增殖反应差异无显著性, (TN F-α+PD TC) 组增殖反应显著低于TN F-α组;这与BR A R等[9]研究的N F-κB人气道平滑肌细胞增殖的结果一致。A SM Cs的细胞凋亡不足是气道重构的另一重要原因。实验结果显示: (TN F-α+PD TC) 组细胞凋亡率显著高于TN F-α处理组及对照组。因此, 笔者推测, 哮喘大鼠A SM Cs的TLR 4可能调控N F-κB活性从而促进细胞的增殖, 抑制细胞凋亡, 从而参与哮喘的气道重构。

综上所述, 本研究结果显示TLR 4/N F-κB可能参与哮喘大鼠气道平滑肌细胞的增殖、凋亡的调节, 从而在哮喘大鼠气道重构中起重要作用。TLR 4可能成为哮喘治疗干预靶点。

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平滑肌细胞凋亡 篇6

1材料与方法

1.1 实验动物及分组

雄性SD大鼠54只, 体重 (200±20) g, 由浙江中医药大学动物实验中心提供, 随机分为6组, 正常对照组、模型组、血府逐瘀汤预防组、血府逐瘀汤治疗组、硝苯地平预防组、硝苯地平治疗组, 每组9只。

1.2 实验药物及试剂

血府逐瘀汤:按照《医林改错》原方组成药味, 由浙江中医药大学中药制剂室制成流浸膏, 生药含量2.2g/ml;硝苯地平片:浙江万马药业有限公司, 批号:080103。MCT:Sigma公司;PCNA抗:丹麦DAK0公司;Caspase-3抗:美国LabVision (Thermo scientfic) 公司。

1.3 造模与给药方法

将野百合碱充分溶解于2∶8乙醇生理盐水中, 配制成1%浓度。模型组、血府逐瘀汤预防组、血府逐瘀汤治疗组、硝苯地平预防组和硝苯地平治疗组按60mg/kg剂量腹腔一次性注射野百合碱溶液, 正常组腹腔注射等剂量的2∶8乙醇生理盐水, 两预防组从造模第2天开始分别予血府逐瘀汤 (8.75g/kg·d-1) 和硝苯地平 (10mg/kg·d-1) , 直到第28天;两治疗组从造模第15天开始分别予血府逐瘀汤 (8.75g/kg·d-1) 和硝苯地平 (10mg/kg·d) -1, 直到第28天, 正常组及模型组予等量生理盐水。均采用灌胃给药, 每日1次。末次给药后1小时采集标本。实验过程中模型组大鼠死亡1只。

1.4 观察指标检测

1.4.1 肺小动脉病理形态学观察

取右下叶肺组织, 右肺门横断取材, 常规石蜡制片, HE染色观察肺小动脉形态学改变, 采用图象分析仪测量与终末细支气管伴行的肺小动脉管腔内径 (ID) 、外径 (ED) , 管腔面积 (VA) , 血管总面积 (TAA) , 然后分别计算出管壁厚度 (WT) =管腔外径-内径, 管壁面积 (MA) =血管总面积-管腔面积, 最后计算管壁厚度与血管外径比值 (WT%) 和管腔面积与血管总面积比值 (VA%) , 每张切片均选取3个小动脉进行定量分析, 并取其平均值进行统计学分析。

1.4.2 PCNA蛋白表达的检测

免疫组织化学染色方法检测。利用图像分析系统 (Image-ProPlus 5.0) 在200倍光镜下观察PCNA免疫组化染色切片, 每份标本随机观察20根管径在15～100μm的血管, 计数血管壁上所有细胞数和PCNA染色阳性细胞数。PCNA增殖度 (%) = (PCNA染色阳性细胞数/总细胞数) ×100%。

1.4.3 Caspase-3蛋白表达的检测

免疫组织化学染色方法检测。利用图像分析系统, 200倍光镜下, 观察Caspase-3免疫组化染色切片, 每份标本随机观察20根管径在15～150μm的血管, 计数血管壁上所有染色阳性细胞数和血管壁总细胞数。 Caspase-3染色阳性率 (%) = (血管壁上染色阳性细胞数/血管壁总细胞数) ×100%。

1.5 统计方法

所得数据以均数±标准差undefined表示, 采用SPSS13.0统计软件包进行处理。多样本均数比较采用单因素方差分析, 方差齐性两两比较采用SNK法检验, 方差不齐性则两两比较采用Tamhane’s T2法;以P<0.05作为差异具有统计学意义。

2实验结果

2.1 各组大鼠肺小动脉病理形态学比较

光镜下见正常组大鼠肺小动脉管壁薄, 内皮细胞扁平连续, 厚薄较一致;模型组大鼠肺小动脉管腔变小、不规则, 内皮细胞变性肿胀, 平滑肌细胞增生肥厚明显;各药物组大鼠肺小动脉血管壁稍增厚、管腔略有变窄, 见图1～6。

各组大鼠图像分析结果显示:模型组小动脉管壁增厚、管腔狭窄明显, WT%明显增大, VA%则明显减小, 与正常组比较有统计学意义 (P<0.01) ;与模型组比较, 各药物组管壁增厚、管腔狭窄不明显, 肺小动脉 WT%均明显降低, VA%均明显增大, 其差异均有统计学意义 (P<0.01～0.05) ;各药物组间差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。

与正常组比较△P<0.05, △△P<0.01;与模型组比较*P<0.05, **P<0.01

2.2 各组大鼠肺血管壁PCNA、Caspase-3蛋白表达的比较 见表2。

与正常组比较△P<0.05, △△P<0.01;与模型组比较*P<0.05, **P<0.01

与正常组比较, 模型组PCNA增殖度明显升高, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;与模型组比较, 各药物组PCNA增殖度明显减少, 差异有统计学意义 (P<0.01) , 各药物组之间差异无统计学意义 (P>0.05) 。

与正常组比较, 模型组Caspase-3染色阳性率明显下降, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;与模型组比较, 各药物组Caspase-3染色阳性率明显升高, 差异有统计学意义 (P<0.01～0.05) , 各药物组之间差异无统计学意义 (P>0.05) 。

3讨论

目前认为肺血管重构是肺动脉高压不可逆发展的基本因素, 如何阻止肺血管重构是治疗肺动脉高压的关键所在[3], 内皮细胞功能紊乱和肺动脉平滑肌细胞增殖是导致血管重构进而出现肺动脉高压的主要原因。在正常情况下, 肺动脉平滑肌细胞的增殖和凋亡之间保持着一种相对平衡, 当血管平滑肌细胞增殖凋亡失衡后, 会出现一系列病理改变, 是肺血管发生重构的重要因素, 因此抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖、促进其凋亡是干预肺血管重构的研究方向之一。增殖细胞核抗原 (PCNA) , 不仅和DNA的复制和修复有关, 而且在细胞周期的调控中起重要作用[4], 是反映细胞增殖状态的良好指标;Caspase-3是一种效应Caspase, 活化后可直接切割细胞内广泛的蛋白质递质, 引发细胞凋亡, 是各条凋亡通路的枢纽[5]。本实验结果提示模型组大鼠PCNA增殖度明显升高, Caspase-3阳性率明显下降, 而血府逐瘀汤各组均能逆转两者的失衡, 故能达到干预肺血管重构的目的。

肺血管重构, 中医认为属肺脏久病, 肺肾两虚, 病邪由气入血而病络, 或邪气直接扩散入于肺络, 络气亏虚, 气虚无力推动血及津液的正常运行而致血停成瘀, 津聚为痰, 痰浊、瘀血有形之邪阻塞肺络, 致肺络改变, 病理因素主要为是“痰”和“瘀”, 故活血化瘀法应贯穿于各证型治疗之中。

血府逐瘀汤出自《医林改错》, 是清代王清任用以治疗“胸中血府血瘀”所致诸症的经验方。方中以桃红四物汤活血化瘀而养血, 防纯化瘀之伤正, 四逆散疏理肝气, 使气行则血行;加桔梗引药上行达于胸中, 并宣肺祛痰, 牛膝引瘀血下行而通利血脉;诸药相合, 构成理气活血之剂。本方具有活血化瘀而不伤血, 理气而不耗气的特点, 广泛用于由瘀血阻滞所致的各种病证[6,7,8,9]。通过本实验观察发现血府逐瘀汤能有效减轻肺血管重构, 病理上表现为减轻管壁增厚及管腔狭窄, 其机制可能与调节平滑肌细胞增殖与凋亡有关。

摘要：目的:观察血府逐瘀汤 (XFZYT) 对野百合碱 (MCT) 诱导肺血管重构大鼠肺血管平滑肌细胞增殖与凋亡的干预作用, 并探讨其作用机制。方法:雄性SD大鼠54只, 随机分为正常对照组、模型组、血府逐瘀汤预防组、血府逐瘀汤治疗组、硝苯地平预防组、硝苯地平治疗组, 采用一次性腹腔注射MCT (60mg/kg) 复制肺血管重构大鼠模型。药物干预后观察各组大鼠肺血管病理形态学变化, 并采用免疫组化技术检测大鼠肺血管增殖细胞核抗原 (PCNA) 及Caspase-3蛋白表达情况。结果:与模型组比较, 各药物组均能使肺小动脉管壁有不同程度变薄、管腔变大 (P<0.05～0.01) ;血管增殖细胞核抗原 (PCNA) 增殖度下降, Caspase-3蛋白阳性率升高 (P<0.05～0.01) 。结论:血府逐瘀汤能有效减轻大鼠肺血管重构, 其机制可能与调节平滑肌细胞增殖与凋亡有关。

关键词：血府逐瘀汤/药理学,肺血管重构/病理学,肌, 平滑, 血管/药物作用,细胞凋亡,大鼠

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平滑肌干细胞研究进展 篇7

平滑肌祖细胞是指能够单向分化为平滑肌细胞的一类细胞。

过去认为, 出生后血管壁的形成和重构仅仅通过来自胚胎期已经分化形成的分化完全的内皮细胞和平滑肌细胞的增殖和迁移。但是, 最近的关于出生后血管形成的研究证明血循环和外周组织, 包括骨髓和其他组织中的心血管祖细胞对组织生长和修复过程中新生血管形成也起作用。鉴定出生后组织中的心血管祖细胞, 并且阐明它们的动员, 分化为心血管细胞以及整合成功能血管的机制, 将会对促进或抑制生命中组织血管化作用有利。同样, 传统假说认为动脉粥样硬化损伤部位中新生内膜中的平滑肌细胞来自中膜平滑肌细胞迁移, 现在, 这种假说正在受到质疑。

1 骨髓来源平滑肌干细胞

直到最近几年, 骨髓还被认为是成体中有自我更新和不同细胞系分化能力的所谓的“true stem cell”的唯一定居部位。成体骨髓中有两种不同类型的干细胞——造血干细胞和间质干细胞。最近的研究表明骨髓也包含有在心血管受到急性损伤或心血管疾病过程中可以生成心血管细胞的前体细胞。通过对一个包含了动脉粥样硬化, 血管形成术后再狭窄和移植后血管病变等三种血管病变的动物模型的研究, sata等[1]认为, 来自已事先全骨髓标记的细胞构成血管损伤后新生内膜和中膜SMA阳性细胞的25%~50%。另一个相似的实验, 将主动脉移植入已经事先稳定进行Lac Z标记骨髓移植的受体, 揭示11%血管中层SMA阳性细胞发现有Lac Z阳性, 表明它们来自骨髓。Caplice等通过检查宿主供体异性别骨髓移植术后的病人的心血管标本, 支持动脉粥样硬化部位早期平滑肌细胞可能来自骨髓。

为了尝试确定究竟是骨髓中的哪种细胞引起血管平滑肌细胞的再生, sata等检查了全骨髓中c-kit+/Sca-/+/lin-的这部分细胞的平滑肌细胞分化潜能, 这些细胞以前被认为是造血干细胞, 在股动脉机械损伤后这些细胞对血管中层SMA表达细胞生成的作用与全骨髓相同, 表明造血干细胞具有全骨髓所具有的血管平滑肌细胞的再生能力。但是, 与他们的结果相反, Goodell等研究表明, 高度纯化的骨髓来源造血干细胞 (SP cells, c-kit+/Sca-/+/CD45+/CD34neg/lo/lin-) 分化为内皮细胞而不是血管平滑肌细胞。在上面的两个研究中, 损伤的类型并不相同 (缺血后损伤和机械损伤) , 可能骨髓和其它组织中的干细胞和祖细胞对新生血管作用依赖于损伤的类型和疾病的过程。

尽管骨髓细胞参与生理和病理出生后血管再生, 它们与组织定居的祖细胞以及与已经形成的血管结构的关系并不清楚。骨髓来源的可作为心血管祖细胞的细胞的表型并不清楚, 甚至它们是来自造血干细胞还是间质干细胞目前都并不清楚。

2 血液循环中的平滑肌祖细胞

有显著的证据表明不是骨髓干细胞而是它们进一步向造血干细胞分化的子代生成平滑肌细胞。Hillebrands等的研究表明, 主动脉或心血管移植物新生内膜SMA阳性细胞是受体来源的, 而且它们的迁移入供体血管的过程可以被环孢素A治疗, 这提示因为移植物诱导的免疫损伤而聚集的炎症细胞是SMA阳性细胞的来源。

Simper等提供了血循环中存在平滑肌祖细胞的进一步的证据。他们从人血中分离单个核细胞, 并将它们培养在包含有PDGF-BB的培养基中, 发现生长在这种培养基中的细胞S M A, 肌球蛋白重链, caponin染色阳性, 但是, CD34, Flt-1, Flk也可以检测到, 后三者被认为很少在平滑肌细胞表达, 而通常只在内皮细胞及其祖细胞表达。因为这个实验针对不是单个细胞来源的克隆, 所以很难精确的确定是哪一种细胞分化为平滑肌细胞。不过可以肯定的是, 循环血液中的平滑肌祖细胞存在于单个核细胞中。

Hirschi等[7]的研究认为, 循环血液中的祖细胞并不都是直接来自骨髓, 一部分组织定居的祖细胞也可以释放入血.

3 其它组织中的平滑肌祖细胞

除了骨髓和循环血液之外, Hu等报道在apo E缺陷的小鼠动脉壁外膜发现许多干细胞标记如sca-1, c-kit染色阳性的祖细胞, Mayr等[2]通过实验检测血管移植后中膜细胞的凋亡和坏死是否会导致血管外膜心血管祖细胞在新生血管内膜中的聚集。他们的研究支持这个假说:外膜中的干/祖细胞经过滋养血管的迁移参与动脉粥样硬化损伤部位平滑肌细胞的聚集。

已经在骨骼肌和心肌中发现平滑肌祖细胞, 在骨骼肌中发现两种不同的祖细胞, 都来自骨髓, 一种SP (side population cells) 在新生血管中可形成内皮细胞, 另一种非SP细胞在新生血管中可形成平滑肌细胞, 从骨骼肌中分离的平滑肌祖细胞显示具有胚胎间充质细胞的表型——这些细胞可以粘附而且表达SMA和PDGFRβ。这些细胞也表达c-met (肝细胞生长因子受体) , 而c-met被认为是具有再生骨骼肌细胞能力的卫星细胞的特征。最近研究发现脂肪组织中也存在可以分化为表型和功能都相似于平滑肌细胞的祖细胞。

4 平滑肌祖细胞的表型

研究平滑肌祖细胞所使用的分子标记大多是干细胞标记, 至今未能找到平滑肌祖细胞区别于其他干细胞的特异性的分子标记。Torsney E在动脉粥样硬化斑块中检测到的平滑肌祖细胞的表型为CD34, sca-1, c-kit和VEGFR2阳性, 不表达CD133。Deb等报道平滑肌祖细胞高表达β1整合素, 中度表达α1整合素, 低水平表达ανβ3, ανβ5, β2, α2β1或α4β1整合素。

5 平滑肌祖细胞的动员, 聚集

平滑肌祖细胞如何动员和聚集到受损血管部位仍不清楚。研究认为:血管损伤时, 血管平滑肌细胞间质来源因子1α (SDF-1α) 表达上调可以造成血中平滑肌祖细胞的聚集, 在这个过程中, 血管内皮e NOS的缺失可导致平滑肌祖细胞聚集的增加。血小板可通过分泌SDF-1引起平滑肌祖细胞聚集到损伤部位, 平滑肌祖细胞与血小板P选择素和GpⅡb整合素结合, 从而认为血小板在平滑肌祖细胞聚集中起重要作用。研究表明:高分子量激肽原可抑制平滑肌祖细胞的聚集。整合素α4β1 (VLA-4) 促进平滑肌祖细胞向VCAM和细胞纤维结合素的粘附[3]。

6 平滑肌祖细胞的分化

在体外培养中, 单独使用转化生长因子β (TGF-β) 或与血小板源性生长因子BB (PDGF-BB) 联合的无血清培养基可诱导鼠, 猪和人骨髓多功能祖细胞分化为平滑肌细胞。研究表明:他汀类发现可以抑制血中平滑肌祖细胞分化为平滑肌细胞。FGFR2的缺少则可减少平滑肌细胞向平滑肌细胞的分化[4]。

7 平滑肌祖细胞的治疗意义

通过抑制一些趋化因子的作用, 减少平滑肌祖细胞在血管病变的聚集和分化, 这也许可以成为防治冠心病的一种方法。

有研究表明, Fas配体基因转染内皮细胞能减少动物移植后造血细胞的聚集, 这提示可以局部导入能抑制平滑肌祖细胞聚集, 分化的基因, 以防治移植后血管病变及血管成形术后再狭窄[5]。

8 展望

平滑肌祖细胞参与了生理和病理的出生后血管新生, 但我们对它在心血管疾病中的动员, 聚集, 粘附和分化的具体机制知之甚少。其次, 平滑肌祖细胞缺少特异标记物, 从而使分离和纯化困难。平滑肌祖细胞参与心血管疾病的过程需要我们进一步的探索。

参考文献

[1]Sata M, Saiura A, Kunisato A, Tojo A, et al.Hematopoietic stem cells differentiate into vascular cells that participate in the pathogenesis of atherosclerosis[J].Nat Med, 2002, 8:403～409.

[2]Mayr M., Li C., Zou Y., Huemer U, et al.Biomechanical stress-induced apoptosis in vein grafts involves p38mito-gen-activated protein kinases[J].FASEB J, 2000, 14:261～270.

[3]Jin H, Aiyer A, Su J, et al.A homing mechanism for bone marrow-derived progenitor cell recruitment to the neovasculature[J].J Clin Invest.2006, 116 (3) :652～6.

[4]De Langhe SP, Carraro G, Warburton D, et al.Levels of mesenchymal FGFR2signaling modulate smooth muscle pro-genitor cell commitment in the lung[J].Dev Bio21, 2006, 299 (1) :52～62.