人脑血管平滑肌细胞

人脑血管平滑肌细胞（共7篇）

人脑血管平滑肌细胞 篇1

常染色体隐性遗传性脑动脉病伴皮质下梗死和白质脑病( cerebral autosomal recessive arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy,CARASIL) 是一种罕见的遗传性脑小血管病,它的特征是在成年早期发病,伴皮质下梗死、脱发和颈椎病的非高血压性脑小血管病[1—3]。神经病理学检查显示脑小血管出现动脉硬化伴随着内膜增厚和致密的胶原纤维,血管平滑肌细胞损失和中膜透明变性[1,3,4]。到目前为止,大多数CARACIL患者在日本报道,此外还有3 个中国家庭[5—7]、2个白人家庭[8],1 个土耳其家庭[9]已被确定患有CARASIL。研究发现CARASIL是由编码Htr A丝氨酸蛋白酶1( HTRA1) 的基因突变引起[10],其确切的机制尚不完全明确。2007 年,我们报道了国内第一个CARASIL家系[11],之后又对此家系进行了基因检测分析,发现了在外显子6 上的一个新的HTRA1 基因突变位点: 1091T > C( 点突变) ,属于错义突变,具有很强的致病性[5]。目前的理论认为HTRA1 基因的突变与CARASIL患者的各种临床表现有关。活性氧对血管疾病的发展有重要的作用,包括动脉粥样硬化、高血压、高脂血症、糖尿病等[12,13]。血管内活性氧产物对于这些疾病至关重要,也可以维持正常血管内环境的平衡。CARASIL的小血管病变类似于动脉粥样硬化性改变,从而我们通过构建慢病毒表达载体,将HTRA1及其突变基因感染入人脑血管平滑肌细胞( human brain vascular smooth muscle cells,HBVSMC) ,观察细胞内氧化应激水平的变化,以期对于CARASIL的发病机制有进一步了解。

1 材料与方法

1. 1 实验材料

GV287 载体质粒及病毒包装系统购自上海吉凯基因化学技术有限公司,HBVSMC、SMCM培养基购自Sciencell Research Laboratories,Lipofectamine2000 购自Invitrogen公司,DMEM培养基购自Gibco公司,DMSO、胰蛋白酶购自Sigma公司,In-FusionTMPCR Cloning Kit购自Clontech公司,Plasmid Mini Kit购自Promega公司,DNA回收试剂盒购自Tiangen公司,α-SMA、NOX4 抗体购自博士德生物公司,鼠二抗购自Santa-Cruz公司,活性氧检测试剂盒DCFH-DA购自Solarbio公司,293T细胞株、DH5α感受态、Hoechst、Giemsa、抗体封闭液等其余试剂来自济南军区神经内科实验室。

1. 2 实验方法和步骤

1. 2. 1 HBVSMC的培养及鉴定

采用75 cm2培养瓶,SMCM培养基,在37 ℃,CO25% 条件下培养。细胞复苏后的第二天换新鲜的培养基。正常细胞培养每隔一天换一次培养液,直至培养达到50% 左右的融合面积后,每天换一次培养基直至90% 。对数生长期的细胞进入传代时,细胞接种到预先L-polylysine包被的玻板上,爬片后的细胞进行固定、通透、蛋白封闭,α-SMA抗体稀释后覆盖,4 ℃过夜后复温并加入二抗60 min,Hoechst稀释液复染,封片后荧光显微镜下观察并采集图像。

1. 2. 2 慢病毒表达载体的构建及转染

利用NCBI Genbank数据库设计并构建HTRA1基因的引物并采用PCR法钓取并扩增野生型和突变型HTRA1 基因备用。酶切慢病毒载体GV287,并将扩增的HTRA1、HTRA1-Mut重组入线性化GV287载体,并转化预先制备好的E. coli DH5α 感受态细胞,挑选阳性克隆并进行鉴定。经Qiagen试剂盒抽提纯化后,病毒包装系统p Helper1. 0,p Helper2. 0 分别与GV287 空载体、GV287 重组载体混合后,利用Lipofectamine 2000 共转染入293T细胞。转染后24h,收集含有病毒的细胞上清液。待HBVSMC细胞密度长至40% ,弃去培养液。对照组( NC) 、HTRA1野生组( OE-WT) 及HTRA1 突变组( OE-MU) 分别加入阴性对照病毒、HTRA1 和HTRA1-Mut病毒液,12h后更换为正常培养基。荧光显微镜下观察细胞形态及荧光表达情况。

1. 2. 3 细胞内活性氧检测

人脑血管平滑肌细胞培养、分组方法同上。聚左旋赖氨酸包被6 孔板及细胞玻片,将细胞接种到6 孔板上; 按照1∶ 1 000 用无血清培养液稀释DCFHDA,使终浓度为10 μmol / L。去除细胞培养液,加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜; 37 ℃ 细胞培养箱内孵育20 min;PBS洗涤细胞三次,以充分去除未细胞表面的DCFH-DA; 荧光显微镜下( 波长为525 nm) 观察细胞内DCF荧光强度,每组随机选择5 个视野拍照,分析图像并计算平均荧光强度。荧光强度通过以下公式计算: AFD( average fluorescence density) = [integrated density – ( total area × mean fluorescence of background readings) ]/ total area。计算出的荧光强度反应细胞内活性氧的平均水平。

1. 2. 4 RT-PCR

进行RT-PCR需要用到的内参基因和目的基因引物由上海吉凯基因公司设计和合成,引物信息如表1。

收集转染后生长良好的各组HBVSMC,经反复离心进行RNA提取,提取到的RNA加入反应体系经逆转录获得c DNA之后,RT-PCR采用两步法检测NOX4 基因在RNA水平的表达情况。

1. 2. 5 Western Blot

收集转染后生长良好的各组HBVSMC,裂解细胞后进行总蛋白提取,取20 μL样本上样到SDS-PAGE凝胶( 10 cm × 10 cm,10% ) ,并转膜至硝基纤维膜( 0. 2 μm孔径) 上。之后,经过膜封闭和NOX4 抗体孵育,使用ECL系统检测NOX4 蛋白表达水平,膜去除多余水分( 不能干燥) ,用塑料膜包裹后X线摄像。

1. 3 统计学方法

采集数据,通过SPSS20. 0 进行统计分析,多样本间均数比较采用one-way ANOVA方差分析检验,p < 0. 05 有统计学意义。

2 结果

2. 1 成功培养HBVSMC

HBVSMC培养后的第三天光镜下观察可见细胞生长良好,形态成同质梭形; 对细胞行 α-SMA抗体荧光染色,Hoechst复染细胞核,细胞荧光表达良好,证实为HBVSMC。见图1。

2. 2 HTRA1 / HTRA1-Mut慢病毒表达载体成功感染HBVSMC

图2 示病毒感染72 h后荧光显微镜下观察细胞形态及荧光表达情况。其中阴性对照病毒组、HTRA1 组、HTRA1-Mut组有荧光表达,荧光显示说明有EGFP报告基因的表达,并且荧光率达80% 以上。空白组无荧光表达。

(a)、(c)、(e)、(g)为明场照片,(b)、(d)、(F)、(h)为荧光照片,以上倍数均为200×,其中(a)、(b)为空白对照,(c)、(d)为阴性对照病毒,(e)、(f)为HTRA1-Mut组,g、h为HTRA1组

2. 3 DCFH-DA检测细胞内活性氧水平

在正常的人脑血管平滑肌细胞中ROS水平表达较低,而OE-WT组和OE-MU组的ROS水平增高,在OE-MU组表现更为明显,结果见图3。

NC vs OE-WT p<0.05;NC vs OE-MU p<0.05;OE-WT vs OE-MU p<0.05

2. 4 RT-PCR检测NOX4 的RNA表达水平

以GAPDH为内参,对NOX4 基因进行转录水平的检测,采用2-ΔΔCt法数据分析,统计图如下,分析RT-PCR结果得出,人脑血管平滑肌细胞中,OEMU组NOX4 基因表达丰度是NC组的2. 015 倍,OE-WT组NOX4 基因的表达丰度是NC组的1. 993倍,而OE-MU组与OE-WT组相比,没有明显差异( p > 0. 05) ( 见图4) 。

NC vs OE-WT p<0.05,NC vs OE-MU p<0.05

2. 5 Western blot检测NOX4 的蛋白表达水平

以GAPDH为内参,对NOX4 基因进行蛋白水平的检测,测三次结果,统计后纳入分析,得到统计图如下,从Western blot结果可以看出,在NC组细胞中NOX4 蛋白水平表达较低,而OE-WT组和OEMU组的NOX4 蛋白表达水平增高( 如图5) 。

3 讨论

氧化应激是一种活性氧产物( reactive oxygen species,ROS) 和生物系统解毒能力不平衡的病理状态,参与多种血管重建过程。ROS代表一个高化学反应活性的氧衍生分子的家族[14],是调节细胞内许多生理和病理过程的重要分子。包括超氧阴离子( O2―) ,过氧化氢( H2O2) ,羟自由基( ·OH) ,过氧自由基( ROO·) ,烷氧基化物自由基( RO·) ,臭氧( O3) ,和单线态氧(1O2) 等[15,16]。现在有明确的证据表明,过量的活性氧参与了许多疾病的发展,其范围从神经系统疾病如帕金森病[17]和阿尔茨海默氏病[18],到精神障碍如精神分裂症[19]、双相性精神障碍[20],还有大多数心血管疾病[21,22]。许多实验模型和临床研究报告显示过量的ROS与动脉粥样硬化血管壁上的不稳定斑块,高血压及心脏衰竭的发展均有关系[23—25]。

ROS的来源包括细胞内细胞器( 如线粒体) 和各种酶,如黄嘌呤氧化酶、髓过氧化物酶( MPO) 、乳过氧化物酶( LPO) 、耦合的一氧化氮合酶( NOS) 、环氧化酶( COX) 、脂氧合酶( LO) 、血红蛋白( Hb) 、细胞色素P450( CYP) 和NADPH氧化酶[26—30]。在这其中,NADPH氧化酶最初产生的ROS触发了其他途径ROS的释放,对于协调其他酶系统的激活和失活发挥核心作用[16,29]。

NADPH氧化酶家族包括多种同系物: NOX1-5,DUOX1 /2[31]。其中,NOX4 主要存在于人类冠状动脉的血管中层[29],NOX的活性是由各种因素调节,如细胞因子( TNF-α,BNF-β,IL-1) ,生长因子( EGF,FGF-β,IGF-1,PDGF,TGF-β1,VEGF) 和激素( 如胰岛素)[9]。此外,血液剪切应力、层流、凝血酶、5-羟色胺、内皮素、血管紧张素II、组胺、缓激肽、溶血磷脂酸、卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯( PMA) 、前列腺素F( PGF2α) 和鞘氨醇1-磷酸也对NOX的活性存在影响[32]。NOX4 参与介导转化生长因子 β( TGF-β)诱导的细胞分化[33]、胰岛素信号[34],氧传感器[35],心肌细胞分化[36]和转录调控[37]等过程。TGF-β 通过NOX4 产生ROS诱导血管SMC和内皮细胞转化和增殖[33,38]; 低密度脂蛋白( LDL) 的主要成分7-酮胆甾醇可以刺激NOX4 的表达,促进VSMC的凋亡[39]。NOX4 过表达导致依赖NADPH氧化酶的ROS的升高,引起细胞外信号调节激酶1 /2 和核转录因子Elk-1 磷酸化增加。因此,NOX4 可能对于核信号的调节和DNA损伤有重要的病理生理作用,然而,其在血管生物学中的作用有待进一步阐明。

氧化应激广泛存在于人体的各个组织、细胞等,活性氧的产生是由多种原因引起,它也会产生多种不同的生物学效应。我们推断HTRA1 突变型基因感染人脑血管平滑肌细胞后,细胞内部的氧化还原系统的平衡被破坏,继而影响了细胞的增殖、迁移及凋亡。因此通过检测细胞内ROS水平,结果得到了验证。考虑NADPH氧化酶是协调其他酶系统激活和失活的核心,而其家族中NOX4 是在血管平滑肌细胞中大量表达,因此我们进一步将NOX4 在RNA水平和蛋白水平进行检测。RT-PCR的结果提示NOX4 在突变型和野生型人脑血管平滑肌细胞中的表达无明显差别,而Western-Blot结果提示,突变型HTRA1 基因的HBVSMC中的NOX4 表达明显高于野生型HBVSMC,这提示HTRA1 基因突变是在蛋白水平影响NOX4 有关的氧化还原反应。但我们仍有很多疑问,是HTRA1 基因突变还是HTRA1 蛋白酶失活引起的上述改变,HTRA1 基因突变对于HBVSMC的增殖、凋亡、迁移的影响是否与氧化应激有关,这种氧化应激是直接作用还是通过信号通路,NOX4 氧化应激相关的上游及下游通路是怎样的,NADPH氧化酶家族其他成员是否也发挥作用等,还需我们进一步的实验验证。

摘要：检测HTRA1及HTRA1-Mut基因慢病毒载体转染HBVSMC后,HBVSMC内氧化应激水平的变化。以HTRA1及HTRA1-Mut基因慢病毒载体转染HBVSMC后,在特定的时间点收集NC、OE-WT HTRA1及OE-MU HTRA1三组细胞的总RNA及总蛋白,分别用RT-PCR和Western Blot的方法检测三组细胞的NOX4 mRNA及蛋白水平的表达情况;用DCFH-DA法检测三组细胞内的活性氧水平。从定量PCR结果可以看出,人脑血管平滑肌细胞中,OE-MU组NOX4基因表达丰度是NC组的2.015倍。从Western blot结果可以看出,在正常的人脑血管平滑肌细胞中NOX4蛋白水平表达较低,而在慢病毒LV-HRTA1及LV-HRTA1-MUT感染后NOX4蛋白表达水平增高。在正常的人脑血管平滑肌细胞中ROS水平表达较低,而在慢病毒LVHRTA1及LV-HRTA1-MUT感染后ROS蛋白表达水平增高,在突变型病毒感染细胞组表现更为明显。说明:1HTRA1突变型基因感染人脑血管平滑肌细胞后,细胞内活性氧产量增加,NOX4 mRNA水平的表达正常细胞升高,但较HTRA1野生型基因无明显差别;NOX4在蛋白水平表达较其他两组均升高;2HTRA1突变型基因感染的人脑血管平滑肌细胞出现增殖减少、迁移活力降低以及凋亡增加可能与细胞内的氧化应激有关,为进一步研究CARASIL发病机制奠定基础。

关键词：HTRA1,人脑血管平滑肌细胞,活性氧,NADPH,NOX4

人脑血管平滑肌细胞 篇2

Apelin是一种新的生物活性肽, 孤儿G蛋白耦联受体APJ的内源性配体[5]。肥胖者血浆apelin水平明显增高, 与胰岛素抵抗以及高胰岛素水平相关。近年研究显示apelin-APJ系统已成为一种有力的心血管调节因子介导对生理性应激以及疾病的适应性。最近也有研究结果显示apelin-APJ系统主动调节主动脉瓣钙化的病理生物学过程, 这个过程类似血管钙化。但apelin对血管钙化的作用目前仍不清楚。

我们的研究旨在了解apelin-APJ信号系统是否参与VSMCs向成骨细胞分化的调控。为阐明apelin对VSMCs钙化的作用, 以及其中的调节机制。

1 方法与材料

人钙化型血管平滑肌细胞来源于肾脏移植术的多余血管供体, 脂肪组织来源于乳房整形术患者。以逆转录聚合酶链式扩增 (RT-PCR) 方法检测APJ基因在体外培养的CVSMCs中的表达。以免疫印迹方法检测APJ蛋白在体外培养的CVSMCs中的表达。在体外培养的CVSMCs中检测ALP活性以及骨钙素分泌。以茜素红染色方法检测基质矿化形成。RNA干扰方法沉默APJ。1 nM apelin干预CVSMCs5～60min后以免疫印迹方法检测促分裂素原活化蛋白激酶 (MAPK) 和PI3-K/Akt信号的活化。检测apein抑制CVSMCs向成骨细胞分化过程中的信号转导通路。以单因素方差分析方法进行统计学分析。P值<0.05被认为有显著统计学意义。实验重复至少3次以上。

2 结果

2.1 体外培养的CVSMCs表达APJ

应用RT-PCR技术, 我们证实CVSMCs表达APJ mRNA。皮下脂肪组织作为APJ mRNA表达的阳性对照。应用免疫印迹分析, 我们证实CVSMCs表达APJ蛋白。皮下脂肪组织作为APJ蛋白表达的阳性对照。应用siRNA-APJ干扰后未检测到CVSMCs表达APJ。我们的结果表明体外培养的CVSMCs表达APJ。

2.2 Apelin抑制CVSMCs向成骨细胞分化以及矿化

近来已有的研究表明动脉钙化与骨矿化过程类似, 表达骨相关分子。ALP以及骨钙素是具有代表性的成骨细胞表型标记物。Apelin预处理CVSMCs呈剂量依赖性显著抑制ALP的活性以及骨钙素生成。1 nM apelin使Runx2蛋白表达显著降低。10ng/mL TNF-a使培养的CVSMCsAL活性增加, 而这种作用被apelin抑制 (图1) 。基质矿化是成骨样分化和功能的标志, 以茜素红染色检测矿化结节的形成多少来评估。Apelin孵育12dCVSMCs矿化结节形成明显较对照组少, 钙含量也较对照组少。

(A、B) 分别以阴性对照 (无血清DMEM) 、10 pM、100 pM、1nM以及10 nM apelin干预细胞。检测ALP活性和骨钙素分泌 (以总蛋白校正) 。 (C) 不同剂量apelin对10 ng/mL TNF-α所引起CVSMCs ALP活性变化的影响。条柱代表平均值±SD (与control相比##表示P<0.01;与TNF-α干预而无apelin组比较**代表P<0.01, n=3) 。 (D) 分别以阴性对照 (无血清DMEM) 以及1 nM apelin干预细胞检测RUNX2蛋白。

2.3 Apelin作用的细胞内信号机制

MAPK以及PI3-K/Akt信号途径对调控细胞分化起关键作用。Apelin作用于CVSMCs 5min时开始激活Akt以及MAPK中的ERK信号磷酸化, 15分达活化峰值。但未检测到c—jun氨基末端激酶 (JNK) 以及丝裂原活化蛋白激酶 (p38) 信号活化。以50 mM H2O2为阳性对照。ERK抑制剂PD98059以及PI3-K抑制剂LY29400可分别阻滞apelin对ERK以及Akt信号的激活。这些结果显示apelin激活了CVSMCs中ERK以及PI3-K/Akt信号转导途径 (图2) 。

(A) 1 nM apelin干预细胞5～60min, 50µM H2O2干预15 min作为阳性对照。 (B) PD98059 (10µM) 或LY294002 (10µM) 预处理2h后1 nM apelin干预15 min。 (C) 乱序APJ siRNA或APJ siRNA转染细胞以1 nM apelin干预。

2.4 Apelin通过APJ/ERK和APJ/PI3-K/Akt信号途径抑制CVSMCs向成骨细胞分化

ERK抑制剂PD98059以及PI3-K抑制剂LY294002预处理细胞取消了1 nM apelin对ALP活性增高的抑制作用。RNA干扰能有效沉默CVSMCs APJ。应用siRNA-APJ沉默APJ也能取消了1 nM apelin对ALP活性增高的抑制作用, 乱序siRNA (scrambled siRNA) 作为对照。这些结果提示apelin通过APJ/ERK以及APJ/PI3-K/Akt信号途径抑制CVSMCs向成骨细胞分化 (图3) 。

以PD98059 (10µM) 或LY 294002 (10µM) 孵育细胞2h后以1 nM apelin干预细胞。乱序APJ siRNA或APJ siRNA转染细胞以1 nM apelin干预。与对照组比较**代表P<0.01。

3 讨论

本研究最重要的发现是apelin能直接抑制体外培养的CVSMCs钙化, 后者与骨钙化具有共同的调节因子。Apelin抑制CVSMCs矿化是通过降低ALP活性起的作用, 后者是促进基质矿化的关键酶。Apelin抑制CVSMCs向成骨细胞分化是通过APJ/ERK和APJ/PI3-K/Akt途径介导的。这些结果证实CVSMCs是apelin直接作用的靶细胞。

动脉钙化是一种主动调节过程, 与成骨过程类似。VSMCs向成骨细胞表型转分化过程在动脉钙化过程中起关键作用。钙化型血管平滑肌细胞” (CVMSCs) , 这是VSMCs的一种特异, 表达成骨样表型基因并形成钙化结节。钙化的血管细胞是VSMCs的一种亚型, 可自发成骨细胞化以及矿化。这种细胞模型特别适用于分析动脉钙化的机制, 已被广泛用于动脉钙化的研究。我们的实验以CVSMCs为研究对象, 揭示了apelin与动脉钙化的关系。

Apelin在1998年作为人孤儿G蛋白耦联受体APJ的内源性配体而被发现, 后者最早于1993年被认为是7次穿膜G蛋白耦联受体超家族中的一员。Apelin肽已被证实能影响哺乳动物的多种生物功能, 包括神经内分泌、心血管以及免疫系统。Apelin和APJ在广泛分布于机体各个系统。在心血管系统, 内皮以及血管平滑肌细胞表达apelin和APJ, 这提示在血管系统apelin存在旁分泌以及自分泌调节模式。已有研究结果提示apelin具有对心血管系统具有保护功能。

我们应用RT-PCR以及免疫印迹方法, 我们确定了CVSMCs表达APJ, 并是apelin的作用靶位。我们的结果显示apelin降低ALP活性以及骨钙素分泌, 这两者是成骨分化的早期指标, 在CVSMCs向成骨细胞分化过程中升高。同时, apelin直接抑制矿化结节的形成。TNF-a升高ALP活性, 但这种作用被apelin干预体外培养的CVSMCs所抑制。本研究还证实apelin降低CVSMCs表达Runx2, 后者是成骨细胞分化的转录因子, 进一步支持apelin抑制CVSMCs向成骨细胞分化的结论。

为进一步了解关于apelin抑制CVSMCs向成骨细胞分化的作用机制, 我们检测了细胞内转导信号途径。MAPK和PI3-K/Akt已被证实对调控细胞分化其重要作用。我们的研究证明了apelin诱导CVSMCs ERK和Akt信号活化。PI3-K抑制剂预处理能阻滞CVSMCs Akt活化, 提示Akt磷酸化依赖于PI3-K。siRNA沉默APJ阻滞了apelin对ERK和Akt的激活, 提示ERK和PI3-K/Akt的活化是经由APJ介导。而且, APJ沉默、PI3-K/Akt以及ERK活化的阻滞使apelin不表现降低ALP活性的作用。这提示apelin通过APJ/ERK以及APJ/PI3-K/Akt信号途径抑制CVSMCs向成骨细胞分化。

我们的发现显示apelin对抑制VSMCs向成骨细胞分化起重要作用, APJ/ERK和APJ/PI3-K/Akt两个信号转导系统参与其中。我们的研究结果提示apelin可能对动脉钙化有保护作用。

摘要：目的 研究apelin对VSMCs向成骨细胞分化的作用以及作用机制。方法 以体外培养的钙化型血管平滑肌细胞 (CVMSCs) 作为血管钙化的研究模型, 通过检测碱性磷酸酶 (ALP) 活性以及骨钙素的分泌观察apelin与VSMCs向成骨细胞分化之间的关系, 应用细胞外调节蛋白激酶 (ERK) 抑制剂、磷脂酰激醇3-激酶 (PI3-K) 抑制剂以及APJ的小干扰RNA (APJ siRNA) 观察涉及的信号通路。结果Apelin抑制ALP活性、骨钙素分泌以及矿化结节的形成。CVSMCs表达APJ蛋白。Apelin激活ERK和蛋白激酶B (AKT, PI3-K的下游子) 。应用siRNA沉默APJ取消了apelin对ERK和Akt活化的抑制作用。而且, 抑制APJ表达、ERK或PI3-K的活化逆转了apelin对ALP活性的影响。结论 Apelin通过APJ/ERK和APJ/PI3-K/AKT信号途径抑制CVSMCs向成骨细胞分化。Apelin可能对动脉钙化有保护作用。

关键词：动脉钙化,血管平滑肌细胞,apelin

参考文献

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人脑血管平滑肌细胞 篇3

目前心血管疾病已经成为危害人们健康的一类严重性疾病,血管平滑肌细胞异常增殖在各种心血管疾病中普遍存在,尤其是冠状动脉粥样硬化性心脏病、高血压病、支架植入后再狭窄等病的基本病理变化,抑制VSMC增殖是心血管疾病防治的一个重要靶点[1]。QKI蛋白是STAR蛋白(信号转导与活化蛋白)中的一种,由qking基因编码合成,大量存在于脑、心脏、肺脏、血管等组织中。QKI蛋白对神经髓鞘形成和胚胎发育都有至关重要的作用。QKI对于髓鞘形成的调节和髓鞘脂本身的成熟产生少突胶质细胞和施万细胞均是必需的,在转录后水平的各个方面调节着髓鞘形成蛋白的合成和表达。同时QKI蛋白参与心脏和肌肉的发育。近年来又发现QKI对血管的发育非常重要。若大基因发生突变,会引起卵黄囊血管重塑障碍及胚胎中期血管发育异常[2,3]。因此QKI与VSMC增殖是否存在什么相关性是值得我们研究的,我们用血清刺激VSMC的体外增殖模型,检测其与QKI表达的相关性及QKI对其的影响,为血管平滑肌增殖机制提供新的认识。

1材料与方法

1.1材料

雄性SD大鼠(150—200 g)由第四军医大学动物中心提供。DMEM培养基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶购自Gibco公司,MTT购自北京中杉公司,PCNA抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司,兔抗QKI抗体由本实验室生产。

1.2方法

1.2.1细胞培养

雄性SD大鼠(150 g—200 g),采用组织贴块法原代培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,原代培养基为含20%FBS、青霉素1×105U/L、链霉素1 g/L的DMEM。2周左右即可首次传代,培养基换为10%FBS的DMEM。待细胞传代至3—7代,即可用于实验[4]。

1.2.2用Western blot检测VSMC增殖时QKI的变化

将细胞制成单细胞悬液,种至6孔板,24 h后用0.5%FBS的DMEM液48 h,重换为10%FBS的DMEM液,分别于不同时间用细胞裂解液(RIPA)收集裂解液,加入6×loading buffer混匀,煮沸5 min,-20℃冻存蛋白质样品。用Western blot检测[5,6]。

1.2.3 MTT实验

将细胞制成单细胞悬液,计数后将细胞浓度调整为1×104个/m L,接种于96孔培养板。用10%FBS的DMEM培养液培养24 h,分别加入病毒EGFP、QKI5、QKI6过表达24 h,然后每个孔加入20μL、5 mg/m L的MTT液,置培养箱中继续培养4 h,吸弃上清,每孔加入DMSO 150μL,振荡器上摇匀10 min,在吸收波长570 nm条件下测值[D(570)]。每隔24h收取一组样本,每组4个复孔,实验重复3次。[7—9]

1.2.4用Wstern blot检测过表达QKI对血管平滑肌细胞增殖的影响

将细胞制成单细胞悬液,种至6孔板,分别过表表达EGFP、QKI5、QKI6,24 h后将培养液换为0.5%FBS的DMEM培养液同步化,48 h后重换为10%FBS的DMEM。分别于不同时间收取蛋白质样品。用Wstern blot检测[10—12]。

2结果

2.1血清刺激血管平滑肌细胞增殖时QKI的变化

将VSMCs平铺于6孔板中的8个孔后,第1孔用10%FBS培养基换液,其余7个孔均换为0.5%FBS培养基进行同步化,48 h后收样第1、2孔,其余6孔均换为10%FBS培养基,分别于4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h后收样,用Western blot检测。结果见图1。

S(+)为10%FBS培养基48h,S(-)为0.5%FBS培养基同步化48 h,4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h分别为0.5%FBS培养基同步化48 h后,换为10%FBS培养液不同时间收取的样品。

2.2MTT实验

将VSMC制成单细胞悬液,分别按1×104 个/mL接种于4块96孔培养板,每块板分3组,每组4个复孔,分别过表达EGFP(为对照组)、QKI5、QKI6 24 h,每隔24 h收样一块96孔板,先后加入MTT与DMSO后,振荡10 min测D(570)值,求每组平均值,用EXCEL做折线图。见图2。

图2中蓝线、粉红线、黄线分别为过表达EGFP、QKI5、QKI6的细胞数的曲线。

2.3过表达QKI对血管平滑肌细胞增殖的影响

将VSMC平铺于六孔板的15个孔中,每3个孔为一组,分别加入EGFP、QKI5、QKI6病毒进行过表达,24 h后培养液换为0.5%FBS培养液同步化48 h,后再换液为10%FBS培养液,分别于0 h、6 h、12 h、18 h、24 h收蛋白样,做western blot检测。

将VSMC平铺于六孔板的15个孔中,每3个孔为一组,分别加入EGFP、QKI5、QKI6病毒进行过表达,24 h后培养液换为0.5%FBS培养液同步化48 h,后再换液为10%FBS培养液,图中0 h、6 h、12 h、18 h、24 h分别为不同时间收取的蛋白样品,做western blot检测。

3讨论

血管平滑肌细胞增殖是动脉粥样硬化、高血压病、支架植入后再狭窄等疾病的重要环节。血管壁的力学特性主要是由中膜决定的,而中膜的唯一细胞成分是VSMC,因此在血管活动中VSMC占有极其重要的地位。

本实验显示血清可增加MTT实验中D(570)值,同时观察到过表达QKI5、QKI6可明显降低D(570)值;另外,血清可增加PCNA的表达,而过表达QKI5、QKI6可明显抑制PCNA的表达。提示血清可促进血管平滑肌细胞增殖,而过表达QKI5、QKI6可明显抑制血清刺激的VSMCs增殖速度,

在动物与人体内,完整的VEC与VSMC之间形成肌-内皮连接,VEC通过释放生长因子和血管活性物质、调节脂代谢来影响VSMCs的生物学功能,使VSMCs增殖与凋亡处于平衡状态。只有当上述平衡失衡时,才有可能发生VSMCs的异常增殖。另外,在体内VSMCs增殖并非是血清刺激,而是由各种生长因子、血管紧张素Ⅱ等多种刺激因素共同参与的结果。

QKI能够抑制体外培养的大鼠血管平滑肌细胞的增殖,并呈时间依赖性。理论上可降低高血压病、动脉粥样硬化、支架植入后再狭窄等疾病的发生率,为治疗该类疾病提供新的切入点。但由于体外平滑肌细胞增殖与体内存在一定的差异,同时也受到很多条件的限制,所以仍需进一步动物实验研究QKI在体内环境中对血管平滑肌增殖的效果。

参考文献

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人脑血管平滑肌细胞 篇4

1 材料与方法

1.1 大鼠颈总动脉损伤后再狭窄模型的建立

Wistar系大鼠(雄性,12周龄,体质量220～250 g),苯巴比妥钠(45 mg/kg,静脉注射)麻醉[4]。显露右颈内、外动脉分支部,将2 F球囊导管(Baxter Healthcare Co.,USA)从颈外动脉插入右颈总动脉近端,使球囊膨胀至动脉外径2倍,向远侧提拉旋转3次,使内皮剥离,中膜过度扩张(Reidy等方法)。假手术组只结扎颈外动脉而不插入球囊导管。

1.2 分组

1.2.1 动脉损伤后VSMC的增殖

大鼠随机分为8组。实验组分别于损伤后1～7 d处死,假手术组于损伤后7 d处死。每时间点3只大鼠。

1.2.2 替莫普利对损伤动脉VSMC增殖的影响

大鼠随机分为3个剂量组和对照组,每组5只大鼠。损伤前1 d开始每天早晚给予盐酸替莫普利(山东宏富达公司,每200 mg溶于1 L含Na HCO3和KHCO3各1 g的溶剂中)灌胃各1次,各组剂量分别为5、10及20 mg/(kg·d)。均于损伤后7 d处死。

1.2.3动脉损伤后不同时期给予替莫普利对VSMC增殖的影响

大鼠随机分为5组,每组5只。自损伤前1 d开始每天早晚给予10 mg/(kg·d)替莫普利或其溶剂灌胃各1次。1组与2组分别给予药物和药物溶剂至损伤后2 d。3组与4组分别给予药物和药物溶剂至损伤后7 d。5组给予药物至损伤后2、3 d时开始给予药物溶剂至损伤后7 d。均于7 d时处死。

1.2.4 替莫普利对损伤动脉VSMC的PDGF-B和PDGF(R)β的影响

大鼠随机分为PDGF-B和PDGF(R)β的实验组与对照组。自损伤前1 d开始,每天早晚给予10 mg/(kg·d)替莫普利或其溶剂灌胃各1次,于损伤后2 d和5 d处死,每时点5只大鼠。

1.3 免疫组织化学染色

动物处死后立即进行心脏穿刺,用PBS以110mm Hg的压力进行血管灌注,然后用甲醇-Carnoy氏液(甲醇∶氯仿∶乙酸=6∶3∶1)灌流固定。每只大鼠摘除动脉后,取其中心部切成2 mm长共5段,制成5张石蜡切片[5],进行HE、EMT(elastica-masson trichrome)和免疫组织化学染色。免疫组织化学染色:对PDGF-B和PDGF(R)β组以抗PDGF-B抗体(PGF007,1∶100,Santa Cruz Biotechnology,Inc)和抗PDGF(R)β抗体(polyclone,1∶200,Santa Cruz Biotechnology,Inc)进行染色,对其他组处死前30 min静脉注射BrdU(bromodeoxyuridine),以抗BrdU抗体(Sigma,USA,Inc)进行染色。采用抗链球菌卵白素-生物素-过氧化物酶复合体法(SBC法)、常规DAB发色、亮绿或苏木精染细胞核。

1.4 数据采集和统计分析

采用SPSS 17.0统计软件,计量数据以均数±标准差(x±s)记录。VSMC的BrdU阳性率计为BrdU阳性VSMC数除以VSMC总数。多组间比较用F检验,两组间比较用t检验。并以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 动脉损伤后VS MC的增殖

假手术组动脉未见BrdU阳性VSMC。球囊损伤后1 d偶尔可见BrdU阳性VSMC,但数量极少。损伤后2 d BrdU阳性VSMC形成一个高峰达5.6%,尤以中膜内层为多,损伤后3 d又迅速减少至0.5%,5 d时再次升高达2.6%。此后,VSMC的BrdU阳性率急剧下降,到损伤后7 d接近于0。球囊损伤后VSMC有2个增殖期,分别出现在损伤后2 d和5d,第1增殖期比第2增殖期更加显著和迅速。详见图1。

2.2 替莫普利对损伤动脉VS MC增殖的影响

替莫普利各剂量组与对照组比较,VSMC的BrdU阳性率均显著降低(P<0.01)。其中,10 mg/(kg·d)组相对5 mg/(kg·d)组降低更为显著(P=0.00),但20 mg/(kg·d)组相对10 mg/(kg·d)组则未见到显著降低(P=0.95)。10 mg/(kg·d)为抑制VSMC增殖的最佳剂量,继续增大剂量并不能得到更好的效果。详见表1。

注:F=239.531,覮与对照组比较,P<0.01

2.3 动脉损伤后不同时期给予替莫普利对VS MC增殖的影响

损伤动脉VSMC的BrdU阳性率1组显著低于2组(P=0.00);3组显著低于4组(P=0.00),而与1组接近(P=0.57);5组显著低于3组(P=0.00),而与4组接近(P=0.19)。此结果说明,仅在损伤动脉VSMC的第1增殖期给药能够达到两增殖期全程给药同样的效果,而仅在第2增殖期给药则与不给予药物效果相同,即不能抑制VSMC的增殖(表2和图2)。

注:F=87.154,P<0.01;1组vs 2组,3组vs 4组;1组vs 5组,3组vs 5组;P>0.05:1组vs 3组,2组vs 5组,4组vs 5组。

2.4 替莫普利对损伤动脉VS MC的P DGF-B和P DGF(R)β的影响

替莫普利实验组损伤动脉VSMC的PDGF-B和PDGF(R)β阳性细胞率在损伤后2 d和5 d均显著低于对照组。替莫普利能够显著抑制损伤动脉PDGF-B和PDGF(R)β的表达(表3和图3)。

3 讨论

损伤动脉VSMC呈现两个增殖期,分别出现在损伤后2 d和5 d。第1增殖期给药能够得到与两增殖期均给药同样的治疗效果,而仅在第2增殖期给药则未见再狭窄被抑制。这一结果提示,第2增殖期可能是第1增殖期的继发反应,是第1增殖期VSMC分泌的生长因子(growth factor,GF)通过自分泌和旁分泌途径作用于自身,诱导其表型由收缩型转变为合成型继而持续释放GF而形成。

血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor,ACEI)替莫普利能够将血管紧张素(angiotensin,Ang)I转化为Ang II[6,7],Ang II可诱导VSMC产生PDGF、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)和转化生长因子[8](transforming growth factor,TGF),从而导致VSMC增生和迁移。另外,激肽受体拮抗剂Hoe140可显著降低ACEI对再狭窄的抑制,提示ACE还是激肽和缓激肽的激肽降解酶。ACEI抑制血浆和血管壁内的ACE、激肽和缓激肽降解酶使激肽和缓激肽水平升高,从而激活血管壁内的NO合成酶使NO水平增高[9],NO再通过升高环鸟苷酸(cyclic guanosine monophosphate,c GMP)水平而抑制SMC增生。以上结果说明,ACEI是通过降低Ang II的产生和提高激肽和缓激肽水平两个途径发挥作用的。

PDGF的表达与VSMC增殖密切相关,PDGF-A原位杂交和BrdU免疫组织化学双重染色发现,BrdU阳性细胞均有PDGF-A m RNA的强烈表达,PDGF-B和增生细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)免疫组织化学双重染色发现,大多数PCNA阳性细胞均伴有PDGF-B蛋白表达[10]。另外,增生活跃的VSMC向内膜的迁移性也增高,峰值出现在损伤后2 d和3 d。并且其表型由收缩型转变为合成型,特别是内层VSMC与细胞外基质连接稀疏,基底膜、胶原纤维和弹性纤维消失。同时,迁移至内膜的VSMC呈现高增殖性。其次,损伤动脉VSMC周围弹性纤维连接数量显著减少,说明弹性蛋白酶、胶原蛋白酶等基质降解酶与SMC的迁移有关。最后,ACEI抑制MMP-1(间质胶原酶)、MMP-9(明胶酶B)[11]及弹性蛋白酶ⅢB的活性可能也是通过调控PDGF来实现。在VSMC增生的信号传导途径中,PDGF受体与磷酸肌醇特异的磷酸脂酶C-γ或磷酸肌醇3激酶结合,在迁移中则同时与两者结合[12]。

参考文献

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人脑血管平滑肌细胞 篇5

关键词：葛根通脉饮,同型半胱氨酸,血管平滑肌细胞,细胞凋亡

血管平滑肌细胞 (vascular smooth muscle cell, VSMC) 过度增殖是动脉粥样硬化 (atherosclerosis, AS) 形成的主要病理机制之一, 抑制VSMC增殖是防止AS病变发生发展、减轻血管重构的的关键[1]。本实验通过观察我院的院内制剂葛根通脉饮对同型半胱氨酸 (homocysteinemia, HCY) 诱导增殖大鼠VSMC的促凋亡作用, 探讨其抗动脉粥样硬化的机制, 为葛根通脉饮临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 葛根通脉饮和瑞舒伐他汀 (可定) 含药血清制备

葛根通脉饮由葛根30 g、山楂15 g、太子参12 g、当归尾6 g、淫羊藿6 g、赤芍6 g、川芎6 g、甘草6 g等组成, 药材购自河南中医学院第一附属医院中药房并由制剂室制备成中药汤剂。瑞舒伐他汀 (可定) , 阿斯利康制药有限公司, 国A2002002。新西兰大白兔给药剂量为临床用药剂量的5倍, 每日剂量分2次灌胃, 连续5 d, 末次给药后1 h, 腹主动脉取血, 离心、分离备用。

1.1.2 主要仪器与试剂

CO2恒温培养箱 (德国Heraeus公司) ;FACS Calibur流式细胞仪 (BD.USA公司产品) ;FLUOVIEW FV100共聚焦荧光显微镜 (日本OLYMPUS公司) ;DMEM、胰蛋白酶 (Gibco BRL.USA产品) ;Ⅱ型胶原酶 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ;α-SMA抗体 (武汉博士德公司产品) ;Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 (南京凯基生物公司产品) 。

1.2 方法

1.2.1 大鼠VSMC原代培养

雄性wistar大鼠, 体质量200~250 g, 购自湖北省动物实验中心。戊巴比妥钠腹腔麻醉后迅速分离、取出腹主动脉, 小心剥除血管外膜, 纵行剪开血管。PBS洗两次, 剪成0.5~2 mm大小的组织块, 放入含有1 mg/m LⅡ型胶原酶溶液的离心管中, 37℃温箱中消化30 min。剧烈震荡离心管, 除去内皮细胞, 将取出的组织块放入1 mg/m L II型胶原酶溶液中, 37℃温箱中消化4~6 h, 待组织块呈絮状后终止消化。离心, 去上清, 重悬细胞, 转入培养瓶中。待细胞长至75%汇合度时, 消化传代, 取2~5代细胞用于实验。

1.2.2 原代培养的大鼠VSMC免疫组织化学检测

细胞接种到6孔板中, 培养72 h, 去上清, PBS洗3次, 4%多聚甲醛固定15 min, 加入0.3%Triton X-100, 倒掉后再加入Triton X-100室温透化15 min, 滴加30μL血清封闭液 (二抗宿主来源) , 室温封闭30 min。加入一抗α-SMA抗体 (1∶50) , 4℃孵育过夜。加入FITC标记羊抗小鼠二抗 (1∶100) , 37℃孵育30 min, 同时加4’, 6二脒基-2-苯吲哚盐酸 (4’, 6-diamino-2-phenylindole, DAPI) 染细胞核, 37℃孵育30 min, 封片后荧光显微镜下观察。

1.2.3 细胞分组与药物干预

取生长状态良好的细胞胰酶消化, 制备细胞悬液, 调整细胞浓度为1×106/m L。将处理好的盖玻片放入6孔板各孔中, 每孔准确接种900μL细胞悬液, 继续培养后将细胞分为空白组、HCY组、葛根通脉饮组、瑞舒伐他汀 (可定) 组、葛根通脉饮联合可定组。除空白组外, 各组均加入剂量为10-4 mol/L同型半胱氨酸, 培养24 h后, 葛根通脉饮组加入葛根通脉饮含药血清, 可定组加入可定含药血清, 葛根通脉饮联合可定组同时加入葛根通脉饮、可定含药血清, 培养48 h后, 收集细胞。

1.2.4 Annexin V-PI法检测细胞凋亡率

各组细胞用PBS洗涤, 0.125%胰蛋白酶消化, 转移至离心管, 加培养液, 混匀, 1000 r/min离心, 弃上清, 加PBS, 重悬细胞, 调整细胞浓度为106/m L, 取0.5 m L细胞悬液, 1000 r/min离心4 min, 弃上清, 加0.5 m L Binding Buffer, 重悬细胞, 加1μL荧光标记的annexin V试剂, 混匀, 室温下避光孵育20 min, 加入PI 5μL, 混匀后4℃下避光孵育5 min, 加入Binding Buffer 500μL, 随即用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率, 用Flow max 2.4软件进行数据处理。

1.2.5 数据统计与分析

各组细胞测定值以均数±标准差 (±s) 表示, 使用SPSS10.0软件包进行单因素方差分析, 组间两两比较采用LSD法。

2 结果

2.1 原代培养的大鼠VSMC形态及免疫组织化学检测结果

倒置相差显微镜观察, 培养的细胞多数呈长梭形, 核大, 细胞核呈蓝色, 细胞质呈现绿色, 可见明显的肌丝纤维。免疫组化结果显示, 细胞胞质内特异性标志蛋白α-SMA表达呈阳性者超过98%的, 提示培养细胞为VSMC。

2.2 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪检测结果

与空白组 (4.36±0.25) 比较, HCY组 (1.17±0.15) 细胞凋亡率显著降低 (P<0.01) , 提示HCY可诱导VSMC增殖;葛根通脉饮、可定均可显著促进VSMC凋亡, 葛根通脉饮组 (3.08±0.14) 、可定组 (2.35±0.24) 、葛根通脉饮联合可定组 (3.23±0.22) 大鼠VSMC凋亡百分率与HCY组相比较, 差异均有统计学意义 (P<0.05, P<0.01) 。

3 讨论

AS及其所致的冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑卒中是目前世界范围内两大主要死亡原因[2]。研究证实, AS的主要病理形态学特征之一是VSMC向动脉内膜的迁移和增殖。脂质代谢紊乱、高HCY血症等AS危险因素可损伤血管内皮细胞, 引起血小板和单核巨噬细胞黏附、聚集, 血小板释放的细胞因子促使VSMC迁移至血管内膜, 在内膜增殖后, VSMC和巨噬细胞荷脂形成泡沫细胞, VSMC还可合成胶原纤维等基质, 进而形成AS斑块, 因此, 抑制VSMC迁移和增殖, 对于延缓或阻止AS病变发生发展及心血管病防治具有重大意义[3]。

我们的前期研究发现[4,5,6], 作为单体的葛根素具有保护血管内皮细胞, 调节血脂水平, 抑制VSMC增殖等良好的抗AS作用, 葛根素预防性给药能明显抑制兔主动脉AS病变, 其机制与调控细胞周期、影响内质网应激水平、抑制AS过程中炎性反应等密切相关。在前期工作的基础上, 根据临证经验, 我们以葛根为主药, 将葛根通脉饮方剂应用于临床, 治疗AS及其所致心脑血管疾病。方中葛根升阳解痉, 通利血脉为君;赤芍、川芎行血活血, 山楂活血散瘀、化痰行气, 共助葛根散瘀通脉为臣;淫羊藿、太子参升提脾肾之阳气, 当归补血养血, 三药同用, 达气帅血行, 通而不滞之功, 为佐药;炙甘草补中益气, 固护脾胃, 调和诸药为使。本实验中, 葛根通脉饮组和葛根通脉饮联合可定组大鼠VSMC凋亡百分率显著高于HCY组, 提示葛根通脉饮可显著促进VSMC凋亡, 可能是其抗AS作用机制之一。

参考文献

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人脑血管平滑肌细胞 篇6

关键词：子痫前期,平滑肌细胞,钙离子,血管痉挛

全身小血管痉挛性收缩是子痫前期 (preeclampsia, PE) 主要病理改变, 平滑肌细胞是血管病变的主要靶器官, 而细胞内钙离子聚集是平滑肌细胞收缩的分子基础。研究发现低钙可能与PE发病密切相关[1], PE患者血钙水平低于正常妊娠, 钙离子拮抗剂可降低血管痉挛使血压下降, 那么低血钙是PE发病原因, 还是PE血清中某些活性物质导致细胞外钙离子内流引起血清钙离子浓度下降呢?本研究检测129例重度PE患者分娩前后血钙变化及血压的变化, 分析血钙与血压之间的联系, 体外建立内皮细胞与平滑肌细胞共培养体系, 探讨重度PE血清中是否平滑肌细胞内钙离子浓度增加?如果能够增加钙离子浓度, 那么是细胞外钙离子内流还是细胞内钙库释放引起, 旨在为重度PE血管痉挛性收缩的分子机制提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

2009年1月至2013年10月在本院产科住院分娩的129例重度PE孕妇 (重度PE组) , 其中早发型重度PE 61例, 晚发型重度PE 68例, 按《妇产科学》第7版标准诊断[2];另取同期孕28~34周正常孕妇60例和孕34~41周正常孕妇60例作为对照 (正常对照组) 。PE组孕妇年龄25~38岁, 平均26.5±3.4岁, 孕周26~34周, 平均29.8±3.2周;正常对照组孕妇年龄24~38岁, 平均26.3±3.6岁, 孕周28~34周, 平均30.2±3.5周。两组孕妇年龄、孕周比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 所有孕妇均排除内科合并症和其他产科并发症, 具有可比性。

1.2 血浆采集

重度PE组孕妇采集血液在入院后治疗前和产后1个月时, 正常对照组孕妇采集血液在门诊产前检查孕中期 (26~34周) 、孕晚期 (34~40周) 和产后1个月时。所有孕妇均取肘静脉血4 ml, 置于肝素抗凝管中, 室温下以3000 r/min离心10分钟, 血浆保存待测, 用全自动生化分析仪测定血钙水平。

1.3 血压测量

重度PE组和正常对照组孕妇在入院未做任何治疗时测量血压, 所有孕妇均安静平卧30分钟后, 振波法检测血压, 测量3次, 每次间隔6小时, 取3次血压平均值为所测血压值。

1.4 孕妇外周血清制备细胞培养

收集剖宫产孕妇40例 (正常足月臀位, 前次剖宫产史择期剖宫产妊娠20例, 新发重度PE 20例, 所有血清为外周血, 均为入院治疗前留取) 外周血各10 ml, 置无菌离心管, 37℃孵育4小时, 4000 r/min离心30分钟, 收集上清置-20℃保存。两组孕妇的年龄、孕周、孕产次比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 患者均无肝肾及其他心血管疾病史。

1.5 脐动脉内皮细胞与脐动脉平滑肌细胞株共培养及分组和测定

1.5.1 共培养

细胞共培养参考前期研究文献[3], 冰浴下用改良杜氏伊格尔培养基 (DMEM) 将基底膜基质Matrigel 1∶1稀释, 20μl/孔包被微孔直径0.4μm Transwell上室滤膜。Transwell小室 (小室孔径0.4 mm) 上室加入600μl密度为5×105脐动脉内皮细胞, 下室加入600μl密度为5×105脐动脉平滑肌细胞, 用5%胎牛血清的DMEM培养基进行培养, 分组进行后续实验。

1.5.2 分组

正常孕妇血清处理组 (A组) :上、下室加入正常对照组孕妇 (20例) 血清 (10%) 的培养基孵育;PE血清处理组 (B组) :上、下室加入子痫前期孕妇 (20例) 血清 (10%) 的培养基孵育;共培养平滑肌细胞内钙离子释放通道阻断后PE血清处理组 (C组) :三磷酸肌醇受体-Ⅰ小干扰RNA (IP3R-ⅠsiRNA) 转染[4]+斯里兰卡肉桂碱预处理平滑肌细胞, 即采用2×105脐动脉平滑肌细胞接种于六孔板Transwell小室下室, 待长满60%~70%后脂质体转染终浓度2μmol的IP3R-ⅠsiRNA或非特异性-siRNA (scramble-siR-NA) (Santa Cruz) , 继续培养24小时, 换5%胎牛血清的DMEM培养基培养, 加斯里兰卡肉桂碱 (终浓度10μmol/L) [5]处理30分钟后, 上、下室加入PE孕妇 (20例) 血清 (10%) 的培养基孵育4小时, 各组实验均进行时间配对。

1.5.3 IP3R-ⅠsiRNA转染效率测定

IP3R-ⅠsiR-NA转染后分为正常对照组 (Ctr组) 、脂质体转染组 (Lip2000组) 、非特异性-siRNA脂质体转染组 (scramble-siRNA组) 和IP3R-ⅠsiRNA脂质体转染组 (IP3R-ⅠsiRNA组) 。采用Western blot检测4组转染效率和MTT检测4组细胞活力, 结果以±s表示, n=3。

1.6 血管平滑肌细胞钙离子的测定

按文献[6]所述方法进行。细胞内与钙离子结合的荧光指示剂Fluo-3/AM可被波长为488 nm的氩离子激光激发, 发射526 nm的荧光, 由于荧光强度 (fluorescence intensity, FI) 与游离钙离子浓度呈正比, 故可反映胞内钙离子的相对水平。将细胞接种于盖玻片上, 待A组、B组、C组细胞密度长满75%, 将Fluo-3/AM (美国Sigma) 加入培养液中, 使终浓度为5μmol/L, 37℃下避光负载30分钟后, 以细胞生理外液洗涤2次后, 每组选取20个活的细胞, 以激光共聚焦显微镜 (MRC-1024, BioRad, 美国) 来观察细胞内Fluo-3/AM的荧光强度。每个细胞间隔2秒扫描1次, 共扫描15次, 记录这15次的荧光强度, 取平均值代表该细胞的钙离子浓度。细胞外液的组成为:Na Cl (141 mmol/L) +KCl (4.7 mmol/L) +Mg Cl2 (1.2 mmol/L) +Ca Cl2 (1.8 mmol/L) +葡萄糖10 (mmol/L) +Hepes (10 mmol/L) ;通以95%O2和5%CO2的混合气体, 以Na OH调节p H到7.4。

1.7 统计学处理

采用SPSS 13.0软件进行相关分析, 定量数据以 (±s) 表示, 组间比较采用t检验分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PE组与正常对照组钙离子浓度及血压比较

早发、晚发重度PE患者产前血钙水平明显低于其产后1月血钙水平 (P<0.05) ;早发、晚发重度PE产前血钙水平明显低于正常对照组孕中期、孕晚期血钙水平 (P<0.05) ;早发、晚发重度PE产后1月血钙水平与正常对照组产后1月水平比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 见图1。早发重度PE收缩压高于晚发重度PE, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;早发重度PE舒张压与晚发重度PE比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。见图2。

①与正常对照组孕中期、孕晚期、产后1月及早发、晚发重度PE产后1月比较, P<0.05;②与正常对照组产后1月比较, P>0.05

2.2重度PE组血清钙离子浓度变化与血压的相关性

分娩前早发重度PE患者血钙水平与收缩压呈负相关趋势, 但差异无统计学意义 (r=-0.126, P=0.3344) ;晚发重度PE和重度PE患者血钙水平与收缩压呈负相关 (r=-0.263, P=0.0304;r=-0.211, P=0.0163) ;重度PE患者血钙水平与舒张压呈负相关趋势, 但差异无统计学意义 (r=-0.117, P=0.1859) , 见图3。

2.3 IP3R-ⅠsiRNA转染效率的测定结果

由图4可见, 终浓度2μmol的IP3R-ⅠsiRNA组IP3R-Ⅰ蛋白表达明显低于正常对照组 (P<0.05) , 可以阻断平滑肌细胞83%的IP3R-Ⅰ蛋白表达;而scramble-siRNA组及Lip2000组IP3R-Ⅰ蛋白表达与Ctr组 (正常对照组) 间比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。4组间细胞活力比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。

①与早发重度PE收缩压比较, P<0.05;②与早发重度PE舒张压比较, P>0.05

2.4 血清中共培养平滑肌细胞内游离钙离子浓度比较

由图5可见, B组与C组共培养平滑肌细胞内钙离子浓度明显高于A组, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;B组与C组共培养平滑肌细胞内钙离子浓度比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) 。

4A:转染后4组平滑肌细胞IP3R表达条形图;4B:转染后4组Western blot检测图;4C:转染后4组平滑肌细胞活力比较

①与A组比较, P<0.05;②与B组比较, P>0.05

3 讨论

3.1 重度PE患者存在外周血低钙状态

血管平滑肌细胞痉挛性收缩是子痫前期主要特征性的病理改变, 钙离子作为细胞内第二信使在维持血管平滑肌细胞正常舒缩及病理性收缩过程中起关键作用, 血管平滑肌细胞内游离钙离子增高是血管平滑肌细胞收缩的首要条件, 而细胞内钙离子聚集主要通过两大途径即细胞外钙内流与细胞内钙离子释放。本研究发现, 早发、晚发重度PE患者产前血钙水平明显低于正常妊娠孕妇 (P<0.05) , 且产后血钙水平恢复正常, 提示重度PE患者血清存在低血钙状态。同时, 重度PE和晚发重度PE孕妇收缩压与血钙水平呈明显负相关 (P<0.05) , 提示钙离子与PE血管痉挛性收缩的病理过程关系密切, PE孕妇可能存在血管平滑肌细胞外钙离子内流的病理生理改变, 进而血管平滑肌细胞发生痉挛性收缩, 导致PE血管病变发生。本研究中早发重度PE患者血钙水平与收缩压成负相关趋势, 但无相关性, 是否与样本数较少有关还需要进一步深入研究。同时, 本研究还发现早发子痫前期患者收缩压明显高于晚发子痫前期, 可能与疾病发生孕周早, 血管内皮细胞损伤严重, 血管活性物质释放过多, 引起血压异常增高有关。

PE血清低血钙状态是不争的事实, 有研究者提出低血钙可能是PE发病原因[1], Askie等[7]对12项随机对照研究共15528例受试者进行Meta分析, 结果发现补钙并不能防止PE的发生, 孕早期补钙只能对钙离子摄入过少孕妇发生PE有一定的保护作用, 临床研究数据也显示, PE发病后不是补钙而是用钙离子拮抗剂进行治疗, 如硫酸镁、佩尔地平、硝苯地平对PE起有效的降压作用[8], 提示平滑肌细胞钙离子内聚的病理生理变化。细胞内钙离子是维持舒张期血管张力的分子基础, 细胞内钙离子浓度增高会导致平滑肌细胞舒张期张力增加, 即舒张压增加, 本研究虽然发现子痫前期血清钙离子与舒张压呈负相关趋势, 但差异无统计学意义, 可能与样本数少有关, 子痫前期血清低钙与舒张压关系需进一步深入研究。

3.2 PE患者血清可促进血管平滑肌细胞外钙内流可能是低钙状态的原因之一

本研究中体外对内皮细胞与平滑肌细胞共培养发现, B组 (PE血清处理组) 共培养平滑肌细胞内钙离子浓度明显高于A组 (正常孕妇血清处理组) , 差异有统计学意义 (P<0.05) , 说明PE血清明显增加共培养平滑肌细胞内钙离子浓度, 提示平滑肌细胞内钙离子增加在PE血管痉挛性收缩的病理过程中起重要作用。而细胞钙离子聚集主要通过两大类钙离子通道, 即电压依赖性钙离子通道和受体依耐钙离子通道。平滑肌细胞受体介导的钙离子浓度升高主要包括:细胞膜L型钙离子通道介导的细胞外钙离子内流;肌浆网上1, 4, 5三磷酸肌醇受体 (inositol 1, 4, 5 trisphosphate receptor, IP3R) 与雷诺定受体 (ryanodine receptor, RyRs) 介导的细胞内钙池钙离子释放。那么PE血清增加平滑肌细胞钙离子是细胞外钙离子内流引起还是细胞内钙库释放引起?我们先用IP3R-ⅠsiRNA沉默平滑肌细胞83%的IP3R蛋白表达, 再用大剂量的斯里兰卡肉桂碱 (终浓度10μmol/L) [5]阻断肌浆网上IP3R与RyRs介导的细胞内钙池钙离子释放, 再用PE血清处理共培养平滑肌细胞, 结果发现C组 (共培养平滑肌细胞内钙离子释放通道阻断后PE血清处理组) 钙离子浓度与B组比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 提示在阻断平滑肌细胞内钙释放途径后, PE血清可促进平滑肌细胞外钙离子内流。2000年Green等研究也提示, 妊娠期高血压疾病患者外周血可提高兔平滑肌细胞内游离钙离子浓度, 提示平滑肌细胞内钙离子增加与血管张力的维持有关系, 与我们实验结果一致。

总之, PE患者血钙降低与平滑肌细胞外钙离子内流有关, 而平滑肌细胞钙离子内流与血管平滑肌细胞痉挛性收缩的病理过程密切相关, 因此, 对PE血清内某些 (种) 血管活性物质以及活性物质促进平滑肌细胞钙离子内聚分子机制的进一步研究, 有助于PE发病机制的阐明, 为PE的防治提供新的思路与治疗靶点。

参考文献

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[2]乐杰主编.妇产科学[M].7版.北京:人民卫生版社, 2008:92-101.

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[4]Arguin G, Caron AZ, Elkoreh G, et al.The transcription factors NFAT and CREB have different susceptibilities to the reduced Ca2+responses caused by the knock down of inositol trisphosphate receptor in HEK 293A cells[J].Cell Physiol Biochem, 2010, 26 (4-5) :629-640.

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[6]Li SJ, Sun NL.Regulation of intracellular Ca2+and calcineurin by NO/PKG in proliferation of vascular smooth muscle cells[J].Acta Pharmacol Sin, 2005, 26 (3) :323-328.

[7]Askie L, Duley L, Henderson-Smart D.Antiplatelet agents for prevention of pre-eclampsia:A meta-analysis of individual patient data[J].Lancet, 2007, 369 (9575) :1791-1798.

人脑血管平滑肌细胞 篇7

1 材料

DMEM培养液 (GIBCO公司) , 胎牛血清 (NQBB) , 0.25%胰蛋白酶消化液 (美国Sigma公司) , 小鼠抗人平滑肌α-肌动蛋白单克隆抗体 (ZM-0003, 中山公司) , PS法免疫组织化学试剂盒 (中山公司) , DAB显色试剂盒 (中山公司) , 中性树胶。MTS (Promega公司) , 拉西地平 (中检所, 100741-200802) 、福辛普利钠 (中检所, 100942-200701) 、坎地沙坦酯 (中检所, 100685-200401) 。

2 方法

2.1 HUASMCs体外培养

经患者及家属同意, 取无菌新生儿脐带 (约10cm) , 置于预先放有D`Hanks液的无菌容器中, 于分娩后2h内送至细胞培养室。在超净工作台中, 用无菌的D`Hanks反复冲洗脐带, 从脐带上分离脐动脉, 剔除动脉外膜, 纵行剪开脐动脉, 轻轻刮除血管内膜后, 将其剪成约1mm3的组织块。将组织块按5~6块/cm2密度平放于25cm2培养瓶中, 翻转培养瓶, 使贴有植块的瓶壁朝上, 在培养瓶内加20%胎牛血清DMEM高糖培养液 (20%FBS, 100U/mL青霉素、100U/mL链霉素) 4mL, 然后保持有植块的瓶壁朝上, 拧紧瓶盖, 放入37℃、5%CO2培养箱内贴壁培养3h后, 将培养瓶轻轻翻转, 使植块浸入培养液中。在37℃、5%CO2培养箱内静置培养。3d后换新鲜培养液, 以后每2~3d更换培养液1次, 每次更换2/3量, 保留1/3的原液, 培养至植块周围细胞移出并细胞间融合率在90%以上时, 即可传代培养。

2.2 HUASMCs的免疫组化鉴定

将常规盖玻片经0.1M盐酸浸泡过夜, 次日双蒸水冲洗, 无水乙醇浸泡2h, 擦净。置60mm玻璃培养皿内高压消毒30min, 备用。细胞爬片:将培养至第3代的HUASMCs, 用0.25%胰蛋白酶消化, 制成细胞悬液, 调整细胞数为1.0×105个/mL, 接种于含盖玻片的培养皿中, 静置于细胞培养箱24h, 使细胞贴在盖玻片上, 更换培养液。待细胞增殖到合适密度, 倾去培养液, 0.01MPBS (pH7.4) 清洗2次后, 在2~10℃甲醇中浸泡5min固定, 自然风干后即可用于分析或放置-70℃冰箱备用。按照PS法免疫组织化学试剂盒说明书步骤操作, 然后中性树胶封片镜检。

2.3 MTS法检测不同浓度拉西地平、福辛普利钠、坎地沙坦酯对HUASMCs增殖的影响

2.3.1 实验分组

拉西地平、福辛普利钠、坎地沙坦酯的实验分组, 见表1。

2.3.2 检测操作

按照实验要求每孔 (96孔板) 铺入适量受试细胞 (细胞量为105个/孔) , 培养体系体积调整至100μL。设置正常培养细胞 (无血清培养液) 为对照孔, 5孔设置本底对照孔 (仅加水, 无细胞孔) 。细胞培养至实验设定的时间, 取出One Solution Reagent溶液, 37°加热至溶解, 每孔加入20μL MTS复合溶液, 把96孔板置于摇床上摇动1min, 以充分混匀待检测体系;在37°培养箱内孵育1~4h, 肉眼观察到有橙黄色颜色出现即可, 在490nm处测定吸光度。

2.4 统计学处理

计量资料以 (±s) 表示, 采用计算机SPSS17.0软件, 根据统计学处理的要求进行方差分析检验。多样之间差异显著性选用单因素方差分析, 用Levene检验进行方差一致性检验, 方差相等时选用LDS和Duncan检验完成组间比较, P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 HUASMCs免疫组化鉴定

细胞经α-肌动蛋白单克隆抗体免疫组织化学鉴定, 显微镜下观察可见, 细胞的胞浆显示为棕黄色, 结果见图1, 为预期的阳性结果。细胞经α-actin免疫组织化学鉴定, 细胞的胞浆显示为棕黄色, 为阳性结果, 说明培养细胞是平滑肌细胞。

3.2 拉西地平、坎地沙坦酯、福辛普利钠对HUASMCs影响 (MTS) 的研究结果

3.2.1 拉西地平对HUASMCs影响 (MTS) 的研究结果

两种计量的拉西地平对HUAMCs的增殖均有抑制作用 (P<0.01) , 且随着剂量的增加抑制作用增强 (P<0.01) , 呈剂量依赖性, 结果图2。

3.2.2 坎地沙坦酯对HUASMCs影响 (MTS) 的研究结果

两种计量的坎地沙坦酯对HUAMCs增殖的影响无统计学意义。

3.2.3 福辛普利钠对HUASMCs影响 (MTS) 的研究结果

两种计量的福辛普利钠对HUAMCs增殖均有抑制作用 (P<0.05) , 且随着剂量的增加抑制作用增强 (P<0.05) , 呈剂量依赖性, 结果见图3。

4 讨论

高血压是最常见的慢性疾病, 也是心脑血管疾病最常见的危险因素之一, 目前高血压已经影响全球四分之一的人口[3]。在我国, 过去的40年中高血压已是增长最快的疾病之一。据估计到目前为止, 我国拥有约2亿的高血压患者, 每10个成年人中就有2个是高血压患者[4]。如此庞大的高血压患者的临床用药的有效性和安全性问题, 逐渐成为当代医生热议的话题。根据中国高血压防治指南报道, 颈动脉内膜中层厚度可独立于血压水平预测心血管事件[5]。如果某种抗高血压药物在降压的同时能对血管有适当的保护功能, 则能对高血压的治疗起到一定的积极作用。钙通道阻滞剂 (CCB) 、血管紧张素转化酶抑制剂 (ACEI) 、血管紧张素II受体拮抗剂 (ARB) 、利尿剂和β受体阻滞剂这五大类药物均为指南推荐用药[6]。本文以拉西地平、坎地沙坦酯、福辛普利钠钠为代表, 研究这三种抗高血压药对血管平滑肌细胞异常增殖的影响, 实验结果显示拉西地平、福辛普利钠都能抑制血管平滑肌细胞的异常增殖, 且呈剂量依赖性;而坎地沙坦酯则对血管平滑肌细胞的异常增殖没有影响, 这也提示临床在选择长期应用的抗高血压药时应考虑这种药对血管是否有保护功能。

参考文献

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[4]张延杰, 徐俊波.高血压防治的趋势与思考[J].中华高血压杂志, 2010, 18 (11) :1001-1004.

[5]刘力生.中国高血压防治指南2010[J].中华高血压杂志, 2011, 19 (8) :701.