心脏微血管内皮细胞（精选8篇）
心脏微血管内皮细胞 篇1
目前对心脏微血管内皮细胞(CMEC)原代培养实验模型的建立大多取材于大鼠和人,对乳鼠CMEC的体外模型建立研究较少。本文探讨乳鼠CMEC的原代培养方法,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物
3d内的Wistar新生大鼠,雌雄不拘。由天津市山川红实验动物科技有限公司提供(合格证号:0004036)。
1.2主要试剂和仪器
胰蛋白酶(sigma),Ⅱ型胶原(gibco),DMEM-F12(hyclone),胎牛血清(bioind),肝素钠,内皮细胞生长因子(ECGF,sigma),第Ⅷ因子相关抗原抗体(北京博奥森)及免疫组化SABC染色试剂盒(北京索莱宝)。恒温二氧化碳培养箱(Thermo),倒置相差光学显微镜(Leica),新颖立式小容量恒温摇床(上海世平实验设备有限公司),高速冷冻离心机。
1.3 实验方法
1.3.1 CMEC的原代培养
取1d~3d龄Wistar大鼠,于含75%酒精的无菌小烧杯中浸泡5s~6s后迅速取出置于无菌培养皿中,无菌开胸,暴露心脏,于心脏收缩期剪下心脏,放于预冷的盛有PBS缓冲液和少量1%双抗的培养皿中,清洗三次,去除残留血液,第二次清洗时去掉结缔组织、心房组织及部分血管。三遍清洗后,将其转移至锥形瓶瓶口中,将心室肌剪为1mm3碎块,加入0.1%胶原酶和0.06%胰蛋白酶的混合酶5mL,新颖立式小容量恒温摇床37℃,转速110次/分,震荡5min,吸取第一次消化后的上清液,弃去,因其含有残留血细胞和部分坏死心肌细胞碎片等,于第二次消化时收集上清液,200目细胞筛过滤至预冷的盛有5mL完全培养基的50mL离心管里,反复消化4次~5次,至组织消化成半透明状时终止继续消化,1 000r/min,10min离心后倒掉上清,加入适量完全培养基小心轻柔重悬细胞沉淀,将混匀的细胞悬液转入75cm2培养瓶中,放入恒温二氧化碳培养箱内,差速培养1h30min后取出,去除未贴壁细胞,重新加入完全培养基(90%DMEM/F12培养基,10%胎牛血清以及1%双抗,1%ECGF,1%肝素)培养,隔日换液,直到长至单层细胞铺满80%以上的瓶底即可传代。根据实验目的,调整细胞密度至合适浓度,轻柔吹打均匀后种板或加入培养瓶培养,首次2d换液1次,以后隔天换液。本次实验取1mL加入12孔板内,板内含有预先用多聚赖氨酸包被的圆形盖玻片,用于免疫组化纯度鉴定。
1.3.2 CMEC的传代培养
传代时,弃去旧培养液,PBS清洗3次后,以适量的0.25%胰酶-EDTA消化液消化约2min(镜下观察细胞状态以控制消化时间),并轻轻吹打制成细胞悬液,离心800rm/min,8min,再以完全培养基重悬细胞,转种于培养瓶中,此为第一代细胞,等细胞生长至铺满大部分培养瓶底部,约80%融合时即可进行下一次传代。
1.3.3 CMEC生长曲线绘制
以适量细胞密度接种于24孔培养板中培养,共21孔,每24h取3孔细胞进行细胞计数,求其平均值作为指标数值,连续7d绘制生长曲线。
1.4 CMEC的形态学观察
原代培养3d后,无菌条件下取出经多聚赖氨酸包被的细胞玻片,4%多聚甲醛固定30min,PBS清洗2次,0.5%TritonX-100通透20min。室温5%BSA封闭30min,用SABC法检测Ⅷ因子相关抗原的表达。兔抗鼠Ⅷ因子相关抗原抗体浓度为1∶100,4℃孵育过夜,37℃下二抗孵育20min,DAB显色。
2 结果
2.1 CMEC生长曲线
通过细胞计数法所绘制的细胞生长曲线大致成倒S形,说明生长过程分三个时期,潜伏期、指数生长期、平台期。
2.2 倒置显微镜下观察细胞形态
原代培养乳鼠CMEC最初分离时为贴壁圆形,细胞形态不明显;2d~3d时呈短梭形、多边形,之后迅速增长至融合状态,呈铺路石样。
2.3 CMEC鉴定
通过免疫细胞化学SABC法检测Ⅷ因子相关抗原,胞浆中有棕黄褐色着色,即呈阳性反应。
3 讨论
不同管径、组织的血管内皮细胞在结构、功能、表面分子等方面具有不同的功能特性,因此,研究某一器官或组织的微血管病变,应采用该器官组织的微血管内皮细胞[1,2]。在缺血性心血管疾病中,微血管内皮细胞是重要的靶细胞,而市面出售的微血管内皮细胞株价格较贵且传代次数有限,因此,建立CMEC离体培养模型,对于细胞损伤的分子机制及药物保护等的研究有重要意义。由于在微血管内皮细胞的分离过程中不可避免地会伴随有非血管内皮细胞的污染,因此,微血管内皮细胞的纯化是决定微血管内皮细胞培养成功与否的关键。本实验采用胰酶和胶原酶等体积混合消化,两种酶共同作用,能促使纤维母细胞等非内皮细胞的破坏,提高内皮细胞的纯度[3]。CMEC与大血管内皮细胞不同,需要在培养基中添加生长因子,这种生长因子提供了CMEC生长所需的成分,同时可抑制其他细胞的生长,促进CMEC优势生长,为体外培养该细胞的生长增殖创造特定的微环境。CD31是很好的内皮细胞标记物,但在培养过程中只有HUVEC和肺内皮细胞能将其保留下来,其他类型的细胞常丢失[4],故本实验选用另一经典特征第Ⅷ因子相关抗原作为鉴定指标。在整个取材、分离、剪碎的过程中,要注意始终保持低温操作,以保证细胞活性。尽量缩短取下心脏至剪成碎块时间。消化过程尽量控制在半小时至一小时内。整个操作流程必须严格遵循无菌原则。
本实验提供了体外培养乳鼠CMEC的简便方法,为进一步探讨心脏微环境的生理及病理生理改变的研究提供了实验基础。
摘要：目的 建立乳鼠心脏微血管内皮细胞(CMEC)体外培养研究模型。方法 采用混合酶(0.06%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶均量混合)消化法和差速贴壁法纯化细胞,倒置显微镜对所培养的细胞进行形态学观察,以Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色法进行细胞鉴定。结果 通过形态学特征及微血管内皮细胞相关特异性抗原检测证实,得到高纯度乳鼠心脏微血管内皮细胞。结论 利用混合酶消化法成功分离并培养乳鼠的CMEC,该方法简单易行,可用于进一步的科学研究。
关键词：心脏微血管内皮细胞,原代培养,乳鼠
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心脏微血管内皮细胞 篇2
【摘要】近几年来手足口病在全球的发病率非常高，重症手足口病并发神经源性肺水肿（neurogenicpulmonaryedema，NPE）起病急，病情发展快，病死率较高。NPE与肺微血管内皮细胞凋亡有关。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中与细胞凋亡关系密切的两种基因，前者为抗凋亡基因，后者为促凋亡基因。Bcl-2、Bax的表达可能与NPE的发病有关。
【关键词】手足口病；神经源性肺水肿；肺微血管内皮细胞；Bcl-2；Bax
【中图分类号】R541.63【文献标识码】B【文章编号】1005-0019（2015）01-0024-01
【中图分类号】R762.21【文献标识码】B【文章编号】1005-0019（2015）01-0024-01
神经源性肺水肿是指在无原发性心、肺和肾等疾病的情况下，由颅脑损伤或中枢神经系统其他疾病引起的突发性颅内压增高而导致的急性肺水肿，又称中枢性肺水肿[1]。临床表现为起病急，早期出现呼吸衰竭，可伴有大量粉红色泡沫痰，心率增快，血压升高及双肺可闻及弥漫性湿性啰音。病程进展迅速，治疗困难，病死率高。1957年手足口病被首次报道，2008年手足口病再次在我国流行，其中部分重症患儿并发严重的神经源性肺水肿（neurogenicpulmonaryedema，NPE），病情进展凶险，治疗效果差，死亡率高达90%以上[2]。2011年日本学者Suzuki研究证实蛛网膜下腔出血时肺血管内皮细胞凋亡有利于NPE的形成[3]，提示肺微血管内皮细胞凋亡在NPE的形成中扮演着重要角色。因此，目前对肺微血管内皮细胞凋亡的调控成为神经源性肺水肿研究的热门领域。研究认为Bcl-2通过抑制线粒体膜上Bax介导的线粒体途径及细胞内质网内钙离子释放，直接或间接地影响细胞凋亡[4]。本文分别从Bcl-2和Bax分布与功能、肺微血管内皮细胞凋亡与NPE关系以及Bcl-2和Bax参与NPE发病的可能机制进行论述。
1Bcl-2、Bax分布与功能
在细胞凋亡的相关调控基因的研究方面，目前Bcl-2基因是研究的最广泛、最深入的凋亡调控基因之一。Bcl-2基因最早是在非霍奇金滤泡状B细胞淋巴瘤中分离出来的。Bcl-2基因是癌基因家族成员中的一员，通过有效抑制许多不同类型的凋亡刺激诱导的不同类型细胞的凋亡，延长细胞活力而发挥其生物学作用，对细胞周期的进程不发生影响。这说明它在细胞凋亡调控机制中起着十分重要的作用。Bcl-2家族可以分为两大类，一类是抗凋亡的，主要有Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-W等，另一类是促细胞凋亡的，主要包括Bax、Bak、Bcl-XS等。它们广泛存在于造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、神经细胞及多种肿瘤细胞，主要分布在线粒体外膜、细胞膜内表面、内质网膜及核膜等处。Bcl-2是最早被确认为能够通过抑制细胞凋亡而起到癌基因作用的细胞内蛋白，它能够抑制多种凋亡刺激诱导信号所致的凋亡[5-6]。研究发现：Bcl-2蛋白负性调节Beclin-1依赖的自吞噬和自吞噬细胞死亡，Bcl-2作为癌基因不仅能够抑制凋亡还能抑制自吞噬作用[7]。因此Bcl-2在调节细胞凋亡过程中发挥着重要的作用。Bax是最早发现的促凋亡因子[8]，正常情况下Bax位于胞质，在凋亡信号诱导下，胞质内的Bax其构象发生改变，由胞质移位到线粒体膜中，并在此形成Bax-Bax二聚体，然后激动线粒体外膜的透化作用，开启线粒体通透性转换孔引起线粒体跨膜电位下降，释放凋亡前因子，释放的凋亡前因子与凋亡蛋白活化因子、dATP及caspase-9前提结合形成凋亡小体而导致凋亡[9-11]。
2肺微血管内皮细胞凋亡与NPE关系
神经源性肺水肿发病的确切机制尚不清楚，儿茶酚胺被認为是主要致病因素，使周围血管强烈收缩，体循环压力迅速升高，大量血液由压力较高的体循环进入压力较低的肺循环，引起肺静脉高压，肺毛细血管压随之升高，跨肺毛细血管Starling力不平衡，液体由血管渗入至肺间质和肺泡内，最终形成急性肺水肿[12]。过度释放的儿茶酚胺不仅能导致肺水肿，而且可激活炎症因子和肺微血管内皮细胞（Pulmonarymicrovascularendothelialcells，PMVECs）凋亡。炎症反应可诱发肺水肿，然而炎症反应并不被认为参与NPE的发展，可能与维持和加重毛细血管通透性有关，另一方面，PMVECs凋亡参与NPE的发病机制[13]。PMVECs在生理和病理情况下均起着重要作用，与急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征等的发生有关[14]。既往研究表明，在肺损伤时，炎症因子攻击的是PMVECs形成的体液免疫和溶质流动的动态平衡，该屏障受损后可诱发肺水肿的发生。在肺组织损伤中，PMVECs也是活性氧物质攻击的重要对象，细胞间的连接被破坏，大量蛋白质进去肺间质，是肺水肿发生的主要原因之一[15-16]。SuzukiH明确提出PMVECs凋亡有利于蛛网膜下腔出血NPE的形成。上述研究发现PMVECs凋亡在NPE的形成中扮演着重要角色。
3Bcl-2、Bax参与NPE发病的可能机制
凋亡是指一个受多种信号调控的细胞程序性死亡过程。目前所知，凋亡主要分为两种途径，一为线粒体依赖的凋亡，另一种为死亡受体（如Fas/Fasl）依赖的凋亡。Bcl-2家族蛋白在线粒体依赖的凋亡途径中扮演了重要角色，该家族蛋白能够控制线粒体外膜通透话开合进而调节凋亡。Bcl-2是Bcl-2蛋白家族中重要的抗凋亡蛋白，而Bax是该家族中重要的促凋亡蛋白。Bcl-2与Bax在细胞中处于一个动态平衡，并互相拮抗。所以说Bcl-2/Bax比值改变是细胞凋亡的重要机制[17-18]，Bcl-2/Bax比值>1，细胞凋亡的发生率较低；Bcl-2/Bax比值<1，细胞凋亡率明显升高[19]。我们知道：凋亡的内皮细胞能够增加ICAM-1、VCAM-1、活性氧产物的生成，增强机体的促凝活性，降低前列环素的产生，活化补体，并增强与血小板的结合，对血流动力学和炎症反应发挥有害的作用[20]。微粒是内皮细胞损伤和凋亡的产物[21]，可通过各种方式介导细胞间的相互联系，导致血管炎症和组织重构、内皮细胞功能障碍、白细胞黏附和应激反应[22]。上述机理可能在NPE的发生中起重要作用。
4展望
Bcl-2和Bax作为调控细胞凋亡的因子，与肺微血管内皮细胞的凋亡密切相关，肺微血管内皮细胞的凋亡在神经源性肺水肿的发病机制中具有重要作用。目前，有关Bcl-2、Bax介导的肺微血管内皮细胞凋亡与NPE关系的研究尚处于初步探索阶段，仍有一些问题函待解决，如肺微血管内皮细胞凋亡在NPE的形成中扮演着重要角色，但其具体机制尚不明确。深入研究Bcl-2、Bax介导的肺微血管内皮细胞凋亡在NPE的发病机制中的作用，将有助于更好地理解Bcl-2、Bax介导的肺微血管内皮细胞凋亡与NPE的关系，以期为防治NPE提供理论依据和作用靶点。
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微血管内皮细胞的功能概述 篇3
1 微血管内皮细胞的屏障与分泌功能
微血管内皮细胞衬于血管内壁，在动物体内居于“战略性”的解剖学位置，构成了微血管通透性的主要物理屏障，从而保证微血管内、外正常的物质交换，其间的各种连接方式的动态变化构成了微血管通透性调控的基础。研究表明，不同部位的内皮细胞在形态、特性上表现出显著的异质性[1]。动脉内皮细胞不同于静脉内皮细胞，微血管内皮细胞不同于大血管内皮细胞，甚至不同组织和器官中的微血管内皮细胞之间在形态、表型、功能上都不尽相同，表现出组织器官的特异性。
微血管内皮细胞是一种多功能的分泌细胞，能够分泌或表达数十种局部激素和细胞因子，这些激素或者细胞因子在调控细胞微环境方面有重要的作用。例如，白介素-1 (IL-1) 和白介素-6 (IL-6) 能够影响T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖和活性，诱导急性期蛋白释放，参与特异性免疫应答;白介素-8 (IL-8) 、MCP-1、前列腺素等具有化学趋化作用，导致中性粒细胞的聚集等。因此，微血管内皮细胞在调节正常的血液循环、维持细胞微环境的稳定方面具有十分重要的意义。值得注意的是，微血管内皮细胞分泌的活性物质按其功能可分为彼此对立的两大类[2]，即缩血管类和舒血管类、凝血类和抗凝血类、致炎类和抗炎类、纤溶类和抗纤溶类及促进血管壁细胞生长类和抑制血管壁细胞生长类等，这些特性与中医学中的“双向调节”、“阴阳平衡”观点极其相似。
2 微血管内皮细胞的摄取、灭活功能
微血管内皮细胞是一个功能强大的代谢器官，能摄取、灭活多种活性物质，从而维持其在机体内一定的浓度比，进而精确地调节细胞内环境的稳定，维持生命活动的正常进行，微血管内皮细胞灭活的活性物质主要包括胺类、脂类和肽类[3]。
3 微血管内皮细胞的维持凝血与抗凝血的功能
微血管内皮细胞能够合成并分泌多种促凝血因子，如组织因子 (TF) 、冯威勒布兰特因子 (vWF) 、血小板激活因子 (PAF) 、纤溶酶原激活物抑制剂 (PAI) 等，同时还能够分泌并合成抗凝血因子，如凝血酶调节蛋白 (TM) 、抗凝血酶Ⅲ (AT-Ⅲ) 、纤溶酶原激活物 (PA) 等[4]，通过这些功能相互对立的调节因子共同调节着凝血与抗凝血机制的动态平衡和维持正常的血液流动状态。当其中的某个因子合成、分泌功能出现问题时会使其抗凝与促凝血功能的动态平衡出现失常，进而引起血栓的形成或者出血。因此，微血管内皮细胞的这种功能与出血或血栓形成相关疾病的病理过程有着密切的联系。
4 微血管内皮细胞的舒张、收缩功能
微血管内皮细胞的舒张收缩功能主要是通过以下几种细胞因子来实现的。
4.1 一氧化氮
微血管内皮细胞可以合成并分泌一氧化氮 (NO) ，是其产生的内皮衍生性舒张因子[5]，也是一种具有细胞内和细胞间信使作用的气体分子。已知的内皮细胞衍生舒张因子 (EDRF) 的本质就是一氧化氮。研究表明，微血管内皮细胞在乙酰胆碱 (ACh) 的作用下激活NO合酶，以L-精氨酸 (L-Arg) 为底物生成NO。NO是嗜脂性物质，极易通过细胞膜进入靶细胞，使其内的环磷酸鸟苷 (cGMP) 水平升高而介导血管舒张。由于NO的半衰期很短，所以只能在局部起作用，同时许多内皮依赖性的舒张血管物质的作用都是通过NO的合成分泌而发挥作用的。有研究表明，NO具有抗血小板聚集和粒细胞黏附作用，在体内可与前列环素 (PGI2) 协同抑制血栓的形成[6]。
4.2 内皮素
微血管内皮细胞可以合成分泌内皮素 (ET) 。内皮素是由21个氨基酸残基组成的缩血管活性多肽 (主要有4种:ET-1、ET-2、ET-3及血管活性肠肽) ，具有强烈的缩血管功能，尤以ET-1功能最强。
4.3 前列环素
研究表明，微血管内皮细胞是前列环素合成的主要场所。前列环素是强烈的血管平滑肌舒张剂，具有扩张血管并抑制血小板聚集的作用，还可以减少内皮素的合成、分泌，从而减弱其在血管中的缩血管效应，作用原理是与细胞膜上的受体结合，激活腺苷酸环化酶导致细胞内的环磷酸鸟苷含量升高，进而发挥松弛平滑肌和抑制血小板聚集的作用。生理状态下，微血管内皮细胞分泌的舒张因子占主导优势，抑制血管收缩和血小板激活，起保护性作用。在病理状态下，微血管内皮细胞的保护性机制减弱或消失，内皮素与NO分泌失衡，收缩因子占优势，或者是血管平滑肌细胞对这些因子的反应性发生改变。进一步研究表明，在细胞水平内皮素和NO的关系为内皮素可诱生NO, NO合成可增加抑制内皮素-1的分泌，这也说明NO具有抑制内皮素-1分泌的作用[7]。
5 微血管内皮细胞的促进抑制细胞生长因子的功能
微血管内皮细胞可分泌细胞因子来影响微血管内皮细胞生长。例如，微血管内皮细胞分泌的血小板生长因子 (PDGF) 、转化生长因子 (TGF) 可以促进平滑肌细胞的生长，分泌的成纤维细胞生长因子 (FDF) 是结缔组织细胞的促生长因子，而其分泌的内皮素、血管紧张素Ⅱ、神经肽 (NPY) 除了具有强烈的微血管收缩功能外，还具有促进平滑肌生长和增殖的功能。
微血管内皮细胞除了分泌可促进微血管平滑肌生长的细胞因子之外，还可分泌抑制微血管平滑肌生长的细胞因子，如肝素类蛋白聚糖、前列环素等可强烈地舒张微血管平滑肌细胞进而扩张微血管，同时还可以抑制微血管平滑肌的生长和增殖[8]。
6 微血管内皮细胞的免疫学功能
微血管内皮细胞具有重要的免疫学功能，主要表现在以下几个方面。
(1) 微血管内皮细胞具有抗原呈递作用。与大血管内皮细胞不同，微血管内皮细胞在一定条件下能够明显地表达MHCⅡ类分子，以MHCⅡ类分子限制性方式将抗原肽呈递给淋巴细胞，并可通过B7:CD28、CD40:CD40L、CD58 (LFA3) :CD2 (LFA2) 等途径向淋巴细胞提供刺激信号，激活CD4+淋巴细胞，释放共同刺激信号致细胞毒性T淋巴细胞 (CTL) 激活，促进免疫应答的进程。Victor L等研究了SVEC4-10内皮细胞系和原代培养的小鼠肺微血管内皮细胞对记忆型CD4+和幼稚型CD4+T淋巴细胞的抗原呈递作用，认为微血管内皮细胞能够对已由其他抗原呈递细胞刺激过的T淋巴细胞发挥抗原呈递作用而诱导免疫反应，但是对于幼稚型的T淋巴细胞没有抗原呈递作用。
(2) 微血管内皮细胞能够对其他免疫细胞产生调控作用。例如，微血管内皮细胞能够通过促进单核细胞向树突状细胞的分化，影响其他抗原呈递细胞的功能而间接地协助初次免疫应答的发生。另外，活化的微血管内皮细胞刺激CD4+T淋巴细胞上的白介素-2、白介素-4、白介素-12、IFN-γ等细胞因子受体的表达，改变局部T淋巴细胞对细胞因子的反应性，并通过LFA-3与T淋巴细胞CD2结合传递信号，促进CD4+T淋巴细胞分泌白介素-2、白介素-4、IFN-γ。微血管内皮细胞也可通过LFA-3稳定活化的CD4+T淋巴细胞内CD40L的m RNA，从而增加T淋巴细胞表达CD40L, T淋巴细胞表面的CD40L能够与B淋巴细胞上CD40结合，刺激B淋巴细胞表达CD23、MHCⅡ类分子、B7等，诱导B淋巴细胞增生、分化，形成抗体分泌细胞，并以此方式促进体液免疫[9]。
(3) 微血管内皮细胞表达黏附分子和分泌炎性细胞因子促进炎症反应的发生，有助于白细胞的移行，使之穿过内皮细胞及其基膜进入组织炎症部位。激活的血管内皮细胞还能够分泌白介素-8，导致中性粒细胞的聚集增加，在机体的抗感染免疫中发挥重要作用。微血管内皮细胞在静息或激活状态下可分泌白介素-1、白介素-6、白介素-8、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 等多种细胞因子，在机体免疫应答中起重要作用[10]。
(4) 微血管内皮细胞还与淋巴细胞的再循环有关。内皮细胞上的一些分子在淋巴细胞的定向移动中起作用，如血管黏附蛋白-1 (VAP-1) 可能是CD44的配体，与淋巴细胞归巢有关[11]。
综上所述，微血管内皮细胞除了具有分泌、摄取、灭活等功能外，还在对特异性抗原的处理与呈递、诱导淋巴细胞的定向迁移及对其他免疫细胞功能的调节中具有重要的作用，特异性的抗原如果直接损伤到微血管内皮细胞，或者微血管内皮细胞诱导抗原特异性的淋巴细胞产生外周免疫耐受，则导致免疫功能下降。另外，微血管内皮细胞是大多病原在体内经循环系统扩散造成全身感染的必经组织。研究表明，微血管内皮细胞是多种细菌毒素和病毒 (如疱疹病毒、艾滋病病毒等) 攻击的主要作用靶细胞，因此深入研究微血管内皮细胞的各项功能具有重要意义。
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血管内皮祖细胞功能的影响因素 篇4
1 EPCs的生物学特性
1.1 来源及表型
通常认为EPCs来源于骨髓, 脐带血以及外周血中的EPC也来自骨髓, 在大多数相关的体外实验中, EPC由外周血或骨髓来源的单核细胞提取而来。人们通过其细胞膜上所表达抗原标记 (VEGFR2, AC133, CD34) 来识别。EPCs在培养过程中分出现两种表型:早期长出的EPCs和晚期长出的EPCs。前者呈纺锤形, 在接种培养后3 d～7 d长出, 2周～3周出现生长高峰, 第4周开始凋亡, 体外实验中形成血管不良, 通过分泌各种血管生成因子如血管内皮生长因子 (VEGF) 、白介素 (IL) -8、基质金属蛋白酶-9 (MMP-9) 促进血管生成;后者表现为鹅卵石样细胞, 接种后2周～3周才长出, 4周～8周生长高峰, 12周仍能存活, 体外实验可形成血管。两者都具备摄取乙酰低密度脂蛋白和凝集素的特征[2,3,4]。
1.2 EPCs与血管修复
血管损伤、组织缺血缺氧后释放诸如VEGF、基质细胞衍生因子-1 (SDF-1) 、单核细胞趋化因子-1 (MCP-1) 等因子进入外周血液循环, 这些因子作用于造血组织 (骨髓) , 削弱EPC与基质细胞之间的黏附作用, 从而使EPCs动员入外周血。接着, 由缺血组织产生的这类因子能与各自受体相互作用, 破坏细胞间的相互连接, 增加血管通透性, EPCs在内皮上贴壁。之后, 随着EPCs分泌金属蛋白酶 (MMPs) 和金属胰肽酶E (MMEs) 降解内皮基底膜, EPCs向外出芽样形成毛细血管样的结构, 并且EPCs通过分泌相关信号因子[IL-8、粒细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 、肝细胞生长因子 (HGF) 、SDF-1、干细胞生长因子 (SCF) ]形成了一个有利于血管新生的微环境, 招募更多的EPCs, 并且使得临近内皮迁移并覆盖上述毛细血管样结构的管壁。最后, 随着EPCs分化成为成熟的内皮细胞, 之前出芽样长出的毛细血管样小管形成了具备完整功能的血管。从上述新血管形成的过程可以看出, 组织的缺血、缺氧可以促进EPCs的骨髓动员, 从而促进受损血管的修复[5]。
2 EPCs功能的影响因素
2.1 生理因素对EPCs的影响
2.1.1 年龄
随着年龄的增长, EPC数量减少, 功能衰退, 凋亡增加, 这可能与胰岛素样生长因子 (IGF-1) 随着年龄增长而减少有关[6], 也有人发现是因为年龄的增加降低了组织中缺氧诱导因子1α (HIF-1α) 的稳定性, 使得组织对缺氧的反应性下降, 以及表达的SDF-1、VEGF减少而间接导致EPCs的活性减退[7]。
2.1.2 性别
雌激素能增加骨髓中EPCs的动员, 这与雌激素受体 (Ers) 介导的MMPs表达增多有关, 加之在女性排卵期, 诸多动员祖细胞的细胞因子[受体酪氨酸激酶 (cKIT) 、GSF、IL-1、IL-6]也显著增多[8], 雌激素能增强体外培养的EPCs的增殖及集落形成[9], 并能延缓其衰老, 这与其提高端粒酶活性有关[10];而雄激素无论体内还是体外实验中均显示与EPCs无直接相关性, 甚至在男性中雌激素水平与EPCs的数目也有相关性[11]。
2.2 病理状态下EPCs数目及功能的改变
2.2.1 高血压病
无论是动物实验还是调查原发性高血压病的患者, EPCs的存活率明显下降, 这可能与端粒酶的失活相关[12]。
2.2.2 高胆固醇血症
与正常对照组相比外周血中EPCs数目明显下降 (P<0.05) , 并与总胆固醇 (r=-0.659, P<0.001) 及低密度脂蛋白数值 (r=-0.611, P<0.001) 呈负相关, EPCs增殖、迁移、血管形成能力及存活率均下降[13]。
2.2.3 糖尿病
2型糖尿病患者体内的EPCs数目、增殖和黏附能力都低于正常人, 且血管并发症组EPCs的数目和功能又比无血管并发症组差, 此种差异与糖化血红蛋白 (HbA1c) 水平呈负相关, 可能与CXCR4 (SDF-1的特异性受体) 表达下调有关[14]。
2.2.4 高半胱氨酸血症
Chen等[15]证实高半胱氨酸血症不仅直接损伤内皮细胞, 同时影响EPC的数目及功能, 并通过体外实验发现这种变化与浓度和时间呈正相关, 在200 μmol/L (相当于严重的高半胱氨酸血症) 浓度下作用24 h外周血中EPC数目减半。
2.3 生活方式对EPCs的影响
虽然年纪的增长是血管老化的一个不可逆因素, 但通过有规律的运动完全有可能拥有一个较为年轻的血管, 甚至就算已经是患有心血管疾病的病人, 通过积极的适宜的运动也可显著纠正内皮损伤。高热量饮食之后的血脂、血糖一过性升高能损伤血管内皮细胞, 这一变化甚至在健康人之中也存在。健康的生活方式, 比如体育锻炼、健康饮食 (低糖、低脂、高蛋白饮食, 红酒, 蔬菜, 红茶, 绿茶) 、戒烟、控制体重、自我减压等都能促进EPCs的迁移、增殖等功能活动, 从而维持血管内皮系统的稳定, 坚持健康生活可以从预防的角度保持血管年轻[16]。
2.4 药物对EPCs的影响
2.4.1 他汀类药物
能增加外周循环中EPCs的数量、迁移、增殖以及骨髓动员, 并在体外实验中能促进血管的新生及再生, PI3K/Akt信号旁路在他汀类药物介导的新血管形成及EPCs功能的增强过程中起关键作用[17], 但长期应用他汀类药物又能减少外周血中EPCs的数目[18]。
2.4.2 血管紧张素Ⅱ受体阻断剂
除了降压作用外, 替米沙坦通过其增加EPC的数目及功能来保护心血管[19], 并且体外实验证实替米沙坦呈浓度依赖地增加EPC的数量, PI3K/Akt信号旁路亦是其关键途径[20]。
2.4.3 促红细胞生成素
通抗细胞老化、促进血管新生及发生, 增加EPC的骨髓动员等途径发挥抗组织缺血缺氧, Yip等[21]将其应用于急性缺血性中风患者 (5 000 U皮下) 后发现, 促红细胞生成素能显著增加其外周血中EPCs浓度, 并能改善患者90 d后的预后 (减低了严重的神经系统事件, 包括再发中风、NIHSS≥8分、死亡的发生率) 。
2.4.4 生长激素
Thoma等[6]发现人体或动物应用生长激素 (GH) 后随着IGF-1的显著增多, EPC的数目、集落形成、迁移能力、NO合酶表达显著提高。
2.4.5 阿司匹林
低浓度阿司匹林能促进EPC的功能, 阿司匹林在0.1 μmol/L～100 μmol/L浓度时能促进EPC的迁移、贴壁。在50 μmol/L～100 μmol/L能明显防止其衰老, 但不能影响其增殖、凋亡及eNOS的表达, 而高浓度 (1 mmol/L) 时阿司匹林却有碍EPC的迁移、贴壁、增殖, 减少eNOS的表达, 甚至能诱导该细胞凋亡[22]。
2.4.6 中药及中药提取物
人参皂苷Rg-1能促进EPCs的贴壁、增殖、迁移以及体外血管的生成, 与浓度和作用时间相关, 还能增加VEGF的数量[23]。丹参提取物丹参酮ⅡA体外实验是可明显促进EPCs的增殖、黏附、迁移能力, 呈浓度依赖, 但高浓度时对其数目及功能反而呈现抑制作用[24]。黄芪和三七在EPCs向成熟内皮细胞分化的过程中有促进作用[25]。柴胡疏肝散 (陈皮6 g, 柴胡6 g, 川芎6 g, 香附6 g, 枳壳6 g, 芍药9 g, 炙甘草3 g) 合大黄虫丸能促进下肢缺血动物EPC的动员, 改善缺血肢体供血, 并且增加了血管新生[26]。通心络胶囊 (人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍和冰片等) 使外周血EPCs 的数量增加、增殖迁移黏附等功能有明显改善, 在500 μg/mL时最为显著[27]。
3 展 望
小鼠血管内皮细胞的原代培养 篇5
1 材料
1.1 实验动物
C57BL 小鼠(山西医科大学动物中心)。
1.2 主要试剂
DMEM高糖培养基(GIBCO公司),新生牛血清(杭州四季青公司),兔抗鼠抗Ⅷ相关抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司),羊抗兔IgG工作液(北京中杉金桥生物技术有限公司)。
1.3 主要仪器
CO2 水套培养箱(美国Reveco公司),倒置相差显微镜(重庆光学仪器厂XS2-D2),倒置荧光显微镜(日本OLYMPUS,BX51)。
2 方法
2.1 取材
将小鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠( 50mg/kg)麻醉, 75%酒精浸泡全身消毒5min。在超净工作台内无菌状态下剪开胸腔,取出腹主动脉至髂总动脉分叉处。用眼科剪、镊将血管剪碎,PBS液反复冲洗后置于DMEM培养液中备用。
2.2 原代培养
吸取组织块接种到培养瓶内,将培养瓶倒置于37℃、5% CO2的培养箱中,使组织贴壁20min后,沿培养瓶侧壁轻轻加入少许DMEM 培养液,以刚没过植块为宜,放入培养箱中继续培养24h,在倒置显微镜下观察植块贴壁和血细胞迁出情况。组织块植入后最先游出的是成纤维细胞,其次是平滑肌细胞,将织块周围迁出大量血细胞的组织块可吸出接种到另一新培养瓶内再次重复贴壁20min的步骤,组织块植入后48h无论血管内皮细胞迁出与否,将组织块去掉,并更换培养液,防止成纤维细胞等其他细胞迁出,以使培养瓶中贴壁生长的主要为血管内皮细胞。
2.3 细胞传代的方法
吸去或倒掉瓶内旧培养液。PBS液清洗两次。向瓶内加入适量的消化液,在倒置显微镜下观察,当胞质回缩、细胞间隙增大时,加含血清的培养液迅速终止消化。弃去瓶内液体,加入含10%新生牛血清的DMEM培养液反复吹打瓶壁细胞,吹打过程要顺序进行,从培养瓶底部一边开始到另一边结束,以确保所有底部都被吹到。计数,分别接种到新的培养瓶内。细胞原代及传代培养中,一般3～7 d换液1次,主要根据细胞生长情况及培养液的颜色变化确定。当细胞增殖旺盛,培养液由桃红色变成黄色时,需换液1次,吸弃旧培养液,加PBS液2 mL清洗后吸弃,再加入新鲜培养液2～3 mL,也可进行半量或2/3量换液。
2.4 细胞计数方法
使用计数板,上面盖上盖玻片,滴一滴细胞液,在显微镜下观察,在左上、左下、右上、右下各有四个小格,每个小格内有16个小格,分别计数,四个小格相加,除以4,后面加上(×104),再乘以稀释的倍数,就是估计的细胞数。
2.5 细胞鉴定(免疫组织化学染色)
将第3代对数生长期的细胞悬液接种到预先放置有盖玻片的六孔板中。待细胞基本长成单层后,取出盖玻片,PBS洗5min×3次。4%多聚甲醛室温下固定15min,PBS再次洗5min×3次。将已固定好的细胞玻片放入盖片染色缸。PBS振洗5min,取出吹干。滴加兔抗鼠Ⅷ因子抗体,置入湿盒内。37℃保温30min或4℃冰箱过夜。PBS洗5min×3次。滴加辣根过氧化物酶聚合物标记羊抗兔IgG工作液,37℃孵育30min。PBS洗5min×3次。蒸馏水冲洗1次,50%缓冲甘油封片,镜检。
3 结果
3.1 倒置显微镜观察
细胞培养48h后,可见大部分贴壁细胞连接形成网状,细胞密度较低。3～5d后,内皮细胞岛出现。继续进行培养,细胞岛增大,可分为密度较大的中央区和密度较小的边缘区。约7～9d后细胞融合成片。VEC呈单层镶嵌状排列,呈现“鹅卵石样”或“铺路石样”,出现接触抑制现象。
3.2 生长曲线的绘制
3.3 免疫组化结果
4 讨论
小鼠血管内皮细胞的体外培养的条件较为苛刻,在培养过程中可能存在以下问题:
(1)内皮细胞的纯化。
血管内层为内皮细胞,中层为平滑肌细胞,外层为成纤维细胞。成纤维细胞、平滑肌细胞与内皮细胞体外共同培养时具有生长优势,如果不在培养早期去除这些污染细胞,血管内皮细胞将不能增殖、传代。Zhao等[3]采用荧光激活细胞分类器(fluorescence-activated cell sorter,FACS)分离人脑血管细胞,效果良好。Favaro等采用免疫磁珠(immunomagnetic beads)进行人脑微血管内皮细胞的分离,效果良好。上述两种方法对实验器材要求较高且费用昂贵。Cheng等研究发现培养时内皮细胞和血细胞首先从组织块中游离出来,成纤维细胞和平滑肌细胞则会在培养72h后游离。原代培养60h后去除漂浮的细胞及组织植块,可保证剩余细胞大部分为内皮细胞和血细胞。传代培养1～2次后血细胞可以清除。
(2)培养液的选择。
一般原代培养需要较高浓度的血清,而传代培养时血清浓度可以降低。研究显示,20%的胎牛血清对小鼠内皮细胞的原代培养有利,传代后的内皮细胞可以在含10%胎牛血清的RMPI1640培养液中生长。
(3)内皮细胞的鉴定。
血管内皮细胞的鉴定常用的方法:免疫组织化学技术检测免疫标志物;倒置显微镜观察的细胞形态特征和生长方式;RT-PCR(reverse trascriptasepolymerase chain reaction)、流式细胞仪、蛋白组学检测内皮细胞表达的特异性蛋白质。
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心脏微血管内皮细胞 篇6
资料与方法
患者,男,52岁,体检发现左肺占位1个月余入院。既往有右侧颈肩部疼痛病史半年,近期加重,伴颈部活动受限。无咳嗽、咳痰、咯血等肺部症状肺部及颈部CT发现:C6椎体右侧及右侧附件区异常密度影;左肺上叶尖后段不规则形结节影。PET/CT示:左肺上叶周围型肺癌,C5、6水平右侧椎旁异常代谢影。临床诊断:①左肺上叶占位,肺癌?②C6椎体占位,转移瘤?患者于2015年1月行胸腔镜下左肺上叶楔形切除术,颈椎病灶未进一步治疗。电话随访至今患者健在,病情基本稳定。
方法与试剂:标本采用1 0%福尔马林液固定,石蜡包埋,常规HE切片染色,光镜下观察。免疫组化采用SP法染色,即用型单克隆抗体CD34、Ⅷ因子、FLI-1、CK、Vimentin等试剂。
病理特点:大体观察:送检肺叶组织大小约9 cm×4.5 cm×3cm,切面灰红,切开见一肿物大小约2.5 cm×2cm×1.8 cm,切面灰白,散在坏死区域,质中偏硬,无包膜,界尚清。镜下观察:肿瘤为界限清楚的嗜酸性结节,中心可见均匀的类似淀粉样变组织,结节显示外周细胞增多,瘤细胞呈上皮样,可呈实性巢状,瘤细胞出现脂肪样空泡。细胞异型性不明显,核分裂象罕见,肿瘤侵犯细支气管,肿瘤呈乳头状充满肺泡腔,见图1～3。
免疫组化结果:Ki67:10%,CD34(+++),F8(-),Vimentin(+++),FLI-1 (+++),CKh(-),CKL(++),EGFR(-),CD68(++),TTF-1(+),CK20(-),SP-B(-)Villin(-),CK7(+),TOPOII(+),见图4和图5。
病理结果:左肺上叶肺上皮样血管内皮细胞瘤。
讨论
PEH首先由Dail等于1983年报道[2],当时由于对其组织来源不甚清楚,将本病称为“血管内支气管肺泡肿瘤(IVBT)”。随着免疫组化技术的发展,证实了其组织来源于血管内皮细胞,随后1986年由Weiss等首次提出了PEH的命名[3]。PEH的免疫组化结果显示,某些或者全部的血管内皮标志物CD31、CD34、Ⅷ因子、FLI-1因子在细胞质内呈弥漫性着色阳性,证明了IVBT实际上是一种起源于血管内皮细胞的肿瘤。PEH是一种罕见的交界性或低度恶性的血管源性肿瘤,肺和肝脏是原发性上皮样血管内皮细胞瘤常见的好发部位,可通过血行转移至其他部位,如骨骼、软组织。2003年世界卫生组织(WHO)将其定义为“一种低到中级别的血管肿瘤,是由包埋于黏液透明性基质中的短索状和巢状的上皮样内皮细胞组织”[4]。
临床特点:PEH是一种罕见的起源于肺血管内皮细胞的肿瘤,根据目前的文献,世界范围内只有108例被公开报道。关于PEH最大宗的文献包含93个病例,平均年龄(40.1±17.3)岁,女性更多见,发病率73%。几乎半数的患者无明显临床症状,常在体检中发现。常见的临床症状包括呼吸困难、咳嗽(18.3%),胸痛(16%),咳血、体重减轻(6.5%)。骨转移常见于中轴骨,可引起受累部位疼痛、病理性骨折、脊柱压缩性骨折,甚至引起感觉异常、肌无力、截瘫[5,6,7]。肺部影像学常表现为双肺部多发小结节,病灶沿血管及支气管分布,以双下肺为重。结节大小约0.1～3.0 cm,可有钙化,少数累及胸膜并出现胸腔积液。
病理特点:PEH大体表现是大小0.3～1.0 cm的多发散在的结节,在接近胸膜下的区域分布有增多趋势。在组织切开活检时常发现相对于X线检查更多的病灶,结节的颜色从浅灰白色至浅灰褐色,偶可见黄色斑点,切片时具有软骨样的质地,切面均匀一致,结节中心有时因钙化而变得质地坚硬。低倍镜显示为圆形或卵圆形的结节,由淡粉色的无细胞核心和周围的富细胞区构成。偶尔结节的中心可能有坏死、钙化、骨化,结节外周的细胞构成一般变化不大,很多时候肿瘤的大部分是由呈软骨样透明变性,或呈黏液瘤样外观的肿瘤间质构成。瘤细胞呈上皮样,细胞境界清楚,可呈实性巢状、条索样。胞质丰富,可呈玻璃样或颗粒状,可见胞质内空泡,可见红细胞。细胞核仁不明显,核分裂少见,局部可见较多核分裂,呈轻到中度异型性。结节周边的瘤细胞可呈舌状、息肉状伸人周围的肺泡腔内或小气道,甚至胸膜。
尽管PEH的病因尚不明确,但免疫组化和电镜技术已经揭示了肿瘤的内皮细胞来源，淋巴转移途径罕见符合内皮细胞肿瘤的特点。肿瘤细胞强表达vimentin,表达CD31、CD34、Ⅷ因子抗原等血管内皮标记物中的1项或多项,20%～30%病例局灶性表达CK[8],不表达EMA、TTF-1、SMA、S-100等,Ki67一般为低表达。FLI-1基因是ETS转录因子家族中的一员,其编码蛋白是一种敏感、可靠的内皮分化标志物,对于PEH的诊断也是非常有意义的[9]。此外有文献报道血管内皮生长因子(VEGF)及血管内皮生长因子受体(VEGF Receptor)在肿瘤细胞中的表达呈阳性,提示VEGF可作为肿瘤治疗的分子靶点[10,12]。
鉴别诊断:①硬化性血管瘤:单发最常见,组织结构多样,由间质细胞和表面细胞这2种细胞构成,均表达TTF-1,而不表达CD31、CD34、Ⅷ因子等。②转移瘤:一般有原发性肿瘤病史,肺部病变有着相似于原发病灶的组织学形态,对血管源性标记物进行检测,可以鉴别。③间皮瘤:瘤细胞一般分布弥漫,分界清楚,不表达CD31、CD34、Ⅷ因子等。④上皮样血管瘤:由增生的毛细血管构成分叶状结构,界限模糊不清,血管分化较成熟,增生的血管内皮细胞无异型性。⑤上皮样肉瘤:上皮样肉瘤细胞空泡非原始血管腔,表达EMA、34βE12,胞质表达CD31,不表达Ⅷ因子,从而与PEH进行鉴别。⑥乳头状内皮细胞增生:乳头核心为纤维脉管束,增生的内皮细胞扁平。
治疗及预后:由于本病罕见,目前尚未确定统一的治疗方法。对于无症状的患者,谨慎的观察也不失为一种方法。一般情况下,对于那些局灶单结节或多结节的患者首选外科手术切除。扩大切除术与楔形切除手术相比,并不能提高患者的长期存活率[13],化疗也仅显示了微弱的效果[14]。由于肿瘤细胞的放射生物学特性(生长缓慢),放射治疗被视为无效的。但也有研究表明外科手术联合放疗对于骨转移患者的病情控制是有效果的。合适的放射治疗剂量可以保持患者对放疗有较好耐受性的同时,达到缓解局部疼痛、改善生活质量的目的。一些研究显示免疫治疗,如干扰素α对于一些肺部弥漫性病变的控制有效[15]。
心脏微血管内皮细胞 篇7
血管内皮生长因子 (VEGF-A或VEGF) , 过去称为vasculotropin或血管渗透性因子 (vascular perme-abilityfactor, VPF) , 属多潜能细胞因子家族中的一员, 还包括VEGF-B、-C、-D、-E和胎盘生长因子。VEGF是由2条相同的多肽链通过二硫键相连而构成的二聚体糖蛋白, 由2个相同的分子质量为23×103的亚基通过二硫键结合成二聚体, 基因定位于染色体的6p21.3, 全长28kb, 编码VEGF的基因长14kb, 由8个外显子和7个内含子构成。目前已知6种VEGF的单体:121、145、165、189、206、183[1]。VEGF的生物学作用主要包括: (1) 促进内皮细胞增殖:许多研究表明, 在肾小球中最重要的血管促成因子是VEGF[2], VEGF是内皮细胞增生和存活的因子, 它通过内皮细胞上的特殊受体在血管生成过程中扮演重要的角色; (2) 增加血管通透性:VEGF是目前所发现的最强的血管通透剂, 它在1mmol/L浓度下即有活性, 其活性是组胺的5000倍; (3) 血管生成及维持功能:不论是在生理还是病理情况下, VEGF对血管生成都起非常重要的作用。VEGF对整个血管系统的内皮细胞均有促有丝分裂作用, 是目前所知最有选择性的血管内皮细胞促有丝分裂剂, 此外, VEGF可刺激内皮细胞生成一氧化氮, 起到血管维持的功能; (4) 细胞质的聚钙作用:VEGF选择性直接作用于血管内皮细胞膜上的两种特异性受体FMS样的酪氨酸激酶1 (Flt1) 受体和含激酶插入区 (KDR) 受体后, 最先观察到的生物学效应即胞质钙离子的增加, VEGF在几秒内可使钙离子浓度升高4倍以上。
2 VEGF在正常肾脏的表达及作用
外周血及组织中的VEGF含量与病变的程度相关, 对肾脏病的发生、发展、预后均起重要作用。生理状态下, 无论成人或成年小鼠和大鼠的肾组织, 均能检测到VEGF在足突和集合管上皮细胞的持续表达, 从而调节肾小球滤过膜的通透性。VEGF由肾小球脏层上皮细胞及远端集合管上皮细胞合成与分泌, 特别是近髓及髓放线处的肾小球足突细胞及小管上皮细胞。而其受体分布在肾小球内皮细胞和间质血管内皮细胞, 足突细胞分泌VEGF量与内皮细胞VEGF受体的表达量一致。
VEGF在肾脏发育尤其肾小球形成中起重要作用。在人肾发育过程中, 肾小球、肾小管结构形成的同时, 肾的血管化也开始发生, 起诱导分化作用的间质产生血管发生因子, 分化的肾小球上皮细胞产生VEGF, 集合管上皮细胞产生VEGF, 皮髓质肾小管周毛细血管内皮细胞存在VEGF受体, 促使肾小管周毛细血管发生。肾小球足突细胞参与合成肾小球基底膜 (GBM) [3], 推测足突细胞产生VEGF, 以旁分泌形式结合于表达VEGF受体的小球内皮, 参与局部调节, 两种细胞互相作用使GBM保持完整性和正常功能。集合管上皮分泌的VEGF与肾小管周毛细血管的受体结合, 可能影响它们的通透性, 从而影响肾髓质的渗透压梯度。
3 影响肾VEGF表达的因素
缺氧是VEGF的最强刺激因子, 有研究显示急性血管闭塞 (急性缺氧) 能刺激肾脏VEGF表达。VEGF生成也受糖类、几种细胞因子和生长因子包括转化生长因子β (TGF-β) 、成纤维细胞生长因子 (FGF) 、血小板源生生长因子 (PDGF) 血管紧张素Ⅱ (AT-Ⅱ) 、胰岛素样生长因子1 (IGF-1) 及活性氧簇等影响。此外, VEGF的生成还受组织、细胞类型及培养条件的影响。NO与VEGF间存在着密切关系, 抑制NO的合成能明显的加速肾瘢痕化, 这与血管生成反应受损, 肾小球和肾小管周毛细血管减少、内皮组织及动脉平滑肌细胞增殖有关[4]。此时肾小管细胞 (髓袢升枝粗段) VEGF表达明显降低, 而血管平滑肌细胞VEGF表达增加;近来Ostendorf等[5]在Thy1肾小球肾炎的鼠模型中, 用选择性诱生的一氧化氮合酶 (inducible NO synthase, i NOS) 的抑制剂L-N6- (1-iminoethyl) -lysin (L-NIL) 后, 明显降低了VEGF的表达, 减少了内皮细胞的增殖。这些都提示了NO通过对VEGF的调整在维持肾微血管中起了重要作用。
4 VEGF在不同类型肾疾病中的表达
4.1 VEGF与肾小球肾炎
在肾小球肾炎时, 肾小球可高表达VEGF以维持肾小球结构。肾小球足突细胞分泌VEGF, 肾小球内皮细胞表面存在VEGF受体, VEGF能够减少肾小球基底膜阴离子数目, 诱导肾小球内皮细胞的小窗形成, 故VEGF可能通过同时影响肾小球基底膜的电荷屏障及机械屏障而调节肾小球通透性, VEGF分泌的异常增加可以导致肾小球滤过膜对血浆蛋白的通透性增加, 从而导致蛋白尿的形成。在微小病变患者肾组织中VEGF m RNA表达明显高于正常对照人群, 并与蛋白尿水平呈正相关[6]。有不同的研究证实, 体外培养的人系膜细胞上有VEGF受体。因此VEGF可能作为小球内旁分泌信号从其主要产生部位小球上皮细胞作用于靶细胞, 即内皮、系膜细胞, 而且VEGF可能通过对系膜细胞作用调节基质合成、降解。在血栓形成的微血管病变, 肾脏切除和系膜增生性肾小球肾炎等几种肾脏疾病的实验模型中, VEGF能调控内皮细胞增殖[7]。
近年研究表明, VEGF与相应受体结合可能参与了急慢性肾衰竭、原发性肾小球疾病及代谢疾病、血管性疾病、系统性疾病等所致的肾脏病变的发病过程。在鼠模型中注入VEGF能增加肾小管周围血管的密度, 从而减少了肾纤维化, 改善肾功能[8]。在新生的鼠中, VEGF在肾血管的形成中起到重要的作用。Miyamoto等在有轻度肾小球损害的鼠模型中, 用VEGF/VPF121或VEGF/VPF161治疗后保护了肾小球内皮细胞, 促进了肾小球的修复。在进行性坏死和新月体形成的抗基底膜肾小球肾炎的鼠模型中, 用VEGF治疗后, 控制了肾小球的炎症, 也促进了肾小球的修复[9]。不同肾脏疾病中VEGF的表达有所不同, 在进一步探讨VEGF的功能的基础上, 采用干预VEGF及其受体的方法, 可能对治疗多种肾脏疾病具有非常重要的意义。有文献报道[10], 在鼠模型中, 抑制VEGF的表达后, 阻止了毛细血管的修复, 导致了进行性的肾损害。在肾切除的鼠模型中, 用VEGF治疗后保护了肾小球毛细血管袢的数目, 减少了小管间质纤维化的严重性, 从而稳定了肾功能。
4.2 VEGF与糖尿病肾病
VEGF在糖尿病肾病 (DN) 、神经病变、视网膜病变和微循环疾病的发病机制中扮演了重要角色[11]。推测DN时, 肾小球足突上皮细胞晚期糖基化终末产物 (AGEs) 受体上调, 足突细胞VEGF的表达和分泌增加, 增加的VEGF可能主要经旁分泌形式与肾小球内皮细胞上的VEGF受体结合而发挥其促血管通透性增强的作用, 从而调节肾小球滤过膜的通透性 (可能是通过同时影响肾小球基膜的电荷屏障及机械屏障调节肾小球通透性) , 导致蛋白尿的形成。另一方面, VEGF导致肾小球内的单核巨噬细胞迁移/活性增加, 系膜活化TGF-β产生增加, 细胞外基质堆积, 促进肾小球硬化。
有研究表明, VEGF与糖尿病患者或动物的内皮功能紊乱的发生密切相关。Bailey等[12]用非放射性同位素杂交的方法发现与糖尿病肾病发生相关的是24h尿蛋白及每个肾小球表达EGF m RNA的细胞数, 而VEGF m RNA几乎是由肾小球上皮细胞表达, 糖尿病肾病轻微病变与表达VEGFm RNA的细胞数异常明显相关, 故分析VEGF表达的量可以早期诊断糖尿病肾病。糖尿病患者尿VEGF的排泄随蛋白尿程度加重而显著增加, 并与血清肌酐、肌酐清除率、蛋白尿相关。高血糖、氧化应激、终末期糖基化产物 (AGE) 和缺氧均可增加VEGF的表达。关于VEGF在糖尿病视网膜增生病变和黄斑水肿中的作用已被广泛接受, 糖尿病肾病的进展也与此相联系。Cha等[13]观察到VEGF m RNA在早期糖尿病肾病中表达增加, 而这与尿VEGF排泄增加相关联。在糖尿病患者肾脏中产生过剩的VEGF可能参与了早期的糖尿病肾病的发病机制。
4.3 VEGF与肾脏肿瘤
肾癌是一种较易发生转移的肿瘤, 临床上诊断时往往有30%的患者已发生了转移, 其转移方式主要是淋巴和血行转移。肿瘤的浸润转移是一个极其复杂的动态过程, 其中涉及许多肿瘤相关因子的参与和调控。VEGF是近年来发现的与实体瘤生长和转移关系最为密切的血管形成调节因子, 以旁分泌的形式刺激肾癌血管形成, 间接促进肿瘤的发展。另外, 晚期肾癌的VEGF表达水平明显高于早期肾癌, 提示VEGF可以作为肾癌疾病活跃的一个指标, 可能对于肾癌的预后有一定的意义。
VEGF在VHL肾细胞癌及散发型肾细胞癌中含量上升, 它除了有促进内皮细胞的有丝分裂活性外还能诱导血管的通透性增加, 从而导致血管外蛋白及纤维的沉积而支持并营养肿瘤细胞, 促进肿瘤的形成, VEGF在肾细胞癌 (RCC) 中的表达明显增高, 对RCC血管生成具有重要的促进作用, 且p53与VEGF的表达无统计学上的相关性。Kurodak等[14]报道, 肾素瘤的血管及小管成分是通过VEGF自分泌作用促使瘤的增生。
4.4 VEGF与肾脏微血管变化
在慢性肾脏疾病中, 在局灶节段性肾小球硬化中, 肾小球VEGF表达是减少的, 慢性间质性瘢痕形成如慢性排斥反应中, 肾小管的VEGF表达也是减少的, 在人类慢性间质性肾炎中, 在肥大的肾小管处VEGF表达基本不变, 而在萎缩的小管处VEGF表达是减少的。在老年化相关的肾脏疾病中, 足突细胞及髓质外层的肾小管VEGF表达明显减少, 而且肾小管VEGF表达下降与肾小管周围毛细血管减少程度密切相关。在急性肾小球肾炎、急性移植排斥反应中VEGF有急速的增高现象。用Con A刺激Ig A肾病患者外周血单核细胞, 可引起血浆VEGF水平升高。在体外实验中, IL-12和IL-15可增加外周血单核细胞VEGF的分泌, 而IL-4、IL-10或IL-13能抑制VEGF的释放, 并呈剂量依赖性。Matsumoto等研究发现人系膜细胞中一氧化氮合酶 (i NOS) 活性增加可通过介导血清变体糖基化Ig A生成而抑制VEGF基因表达, 减少VEGF的合成和释放。NO的供体硝普钠, 对VEGF的合成有双向调变的作用:低浓度 (0.0001nmol/L) 可促进VEGF的生成, 而较高浓度 (1000nmol/L) 则可抑制VEGF表达。因此, VEGF合成减少可能引起或加重Ig A肾病肾小球硬化, 并损伤血管的修复机制[15]。
5 展望
近年研究表明, VEGF与相应受体结合可能参与了急慢性肾衰竭、原发性肾小球疾病及代谢疾病、肿瘤、血管性疾病、系统性疾病等所致的肾脏病变的发病过程, 不同肾疾病中VEGF的表达有所不同。VEGF与肾疾病的相关研究起步不久, 许多问题有待深入探索。通过应用重组的内皮因子或抗内皮因子抗体甚至基因工程方法加强或减弱局部组织血管生成素和VEGF的表达将有可能成为今后治疗肾脏疾病的一种选择。值得一提的是, 通过测定血清、尿中的血管内皮因子的水平可能成为一种有效的疾病监测的方法。进一步明确不同肾疾病条件下, VEGF的表达及作用是一个非常有意义的课题, 通过干预VEGF, 减轻肾脏损伤, 改善肾功能的作用, 并为肾疾病的诊断治疗开辟新的途径。
摘要：血管内皮生长因子 (VEGF) 是一种促进血管内皮生长及渗透的因子, 具有增加血管通透性、促进内皮细胞增殖及血管维持功能。VEGF与相应受体结合可能参与了急慢性肾衰竭、原发性肾小球疾病及代谢疾病、肿瘤、血管性疾病、系统性疾病等所致的肾脏病变的发病过程, 不同肾疾病中VEGF的表达有所不同, 通过测定血清、尿中的血管内皮生长因子的水平可能成为一种有效的疾病监测的方法。检测VEGF的表达, 对探讨肾脏疾病的发病机制、观察病情进展、指导临床治疗及判断预后有重要意义。
心脏微血管内皮细胞 篇8
肺微血管内皮细胞以紧密连接方式像地毯一样覆盖在肺血管腔表面,直接与血液接触。在20世纪70年代前,血管内皮一直被看作为血液和气体交换,水、小分子物质和细胞沟通的屏障。近20年来,内皮细胞研究取得了突飞猛进的进展,目前,内皮细胞已被认为是一个“代谢和内分泌器官”。内皮细胞参与调节血管张力,调节抗凝、凝血和纤溶,表达黏附分子,参与血管活性物质代谢等[1]。由于它广泛涉及多种疾病的发病机制,应用体外培养的微血管内皮细胞,可以构建多种实验模型来研究生理和病理情况下微血管内皮细胞的基因、表型和功能,探讨各种组织细胞相互作用及其调控机制。不同器官和组织起源的微血管内皮细胞在形态、基因、表型和功能方面有所差别[2]。近年来,有不少国内外文献报道肺微血管内皮细胞(pulmonarymicrovascularendothelialcells,PMVECs)的分离和培养方法[3,4,5],主要有组织块培养法和酶消化法,但经实际重复实验发现,仍存在不少问题,如污染问题、贴壁问题等,都影响了细胞培养的成功率。本研究对组织块法培养大鼠PMVEC的方法进行了某些方面的改进和可能详尽的介绍,使体外培养大鼠PMVEC的方法在简单易行的基础上,达到了重复性高、成功率高。
1材料与方法
1.1材料
雄性健康SD大鼠(二级清洁,由第四军医大学动物中心提供),体重180-220g。DMEM培养液胰酶等购自Gibco公司,胎牛血清购自Hyclone公司,两性霉素B购自Sigma公司,Ⅷ因子相关抗体购自Santa公司,25cm 2培养瓶和96孔板购自Costar公司。5%CO2培养箱(日本),倒置显微镜(Olympus),超净工作台,低温离心机,器械(R.D)。
1.2培养方法
1.2.1取材
在无菌缓冲间内,给大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠50mg/kg体重,肝素钠800U/kg体重。麻醉后,用75%酒精进行胸腹部的擦拭消毒。打开腹腔,腹主静脉放血。换器械后打开胸腔,剪去左心耳,放出肺循环中的血液。取出心肺,放入DMEM培养液(含100U/mL青霉素,100U/mL链霉素,两性霉素中备用。
1.2.2植块
在超净台无菌条件下,修剪心肺。除去心脏后,将肺组织移入新的DMEM培养液中进行清洗,然后移入干燥培养皿中,加DMEM培养液(含100U/mL青霉素,100U/mL链霉素,2.5μg/mL两性霉素B),以刚没过肺脏为宜。以下操作均在冰袋上进行。用细弯镊轻柔地撕去肺表面的胸膜后,剪下2—3mm宽的肺外边缘。将剪下的边缘组织移入干燥的培养皿中,将其剪成约1mm×1mm×1.5mm大小的组织块。然后用弯头滴管吸取组织块接种到25cm 2塑料培养瓶内,约2块/cm 2,种植壁用少量DMEM培养液(含20%胎牛血清,100U/mL青霉素,100U/mL链霉素,2.5μg/mL两性霉素B)预湿,以利于组织贴壁。将植块后的培养瓶倒置,加入5mLDMEM(含20%胎牛血清,100U/mL青霉素,100U/mL链霉素,2.5μg/mL两性霉素B)培养液,放入37℃,5%CO孵箱中。
1.2.3原代培养
组织块贴壁4h后,轻轻翻正培养瓶,继续培养,并不时在倒置显微镜下观察细胞迁出情况植块后最先游出的是血细胞,翻瓶后约24h,可见到明显的内皮细胞游出,数量不多,约36h后,更换培养液。约48h后,可见数量较多的内皮细胞爬出,60h后,轻轻吸掉组织块,更换培养液,继续培养。
1.2.4传代培养
原代培养8—9d后,细胞长满瓶壁的95%以上,进行传代。弃原培养液,加1—2mL不含血清的DMEM清洗后,加500μL含0.02%EDTA的0.25%胰酶消化液。消化约30s,待细胞收缩变圆,立即加入2mLDMEM培养液(含20%胎牛血清,100U/mL青霉素,100U/mL链霉素)中止消化,并用弯头吸管将细胞轻轻吹打下来,移入离心管中,1 000r/min,离心5min,弃上清,加适量DMEM培养液(含20%胎牛血清,100U/mL青霉素,100U/mL链霉素),将细胞吹散制成悬液,再根据需要按(1-2)×104/cm 2的接种密度传代。传代后视情况3d换一次培养液,约5—6d后细胞长满瓶壁80%右,再次传代。原代细胞传至4代以后生长速度慢,细胞形态发生变化,因此取2—4代用于实验研究。
1.3 MTT法测定细胞生长曲线
取第2代细胞接种于96孔板,接种密度1×104/cm 2。接种后每24hMTT法测细胞活性,连续测7d。加MTT(5g/L,溶于PBS)前,弃去孔内含FBS的DMEM培养基,加入200μL无血清的DMEM培养基,再加入20μLMTT,37℃,5%CO2孵箱中培养。4h后,弃孔内液体,加入150μLDM-SO,振荡10min后,放入ELISA测量仪中,490nm比色。以时间为横轴,吸光值为纵轴,绘生长曲线。
1.4形态学观察
倒置显微镜下观察原代细胞的形态特点,生长点。第2代细胞用于做透射电镜,观察细胞形态征。
1.5免疫荧光化学方法检测PMVECs第Ⅷ因子相关抗原
一抗为抗兔第Ⅷ因子抗体,二抗为FITC标记的羊抗兔抗体,均为Santa公司产品。方法:将原代细胞消化后接种于放置有盖玻片的培养皿中,待细胞汇成单层后,取出培养皿中盖玻片,PBS漂洗,5min×3次;40g/L多聚甲醛固定,4℃,20min取出,PBS漂洗,5min×3次;甩干后,中性树胶将其粘于载玻片上,隔夜放置;羊血清封闭,30min后弃去;一抗(1∶20稀释)滴加,4℃过夜,PBS漂洗,5min×3次;二抗(1∶100稀释)滴加,避光,37℃,30min,PBS漂洗,5min×3次;缓冲甘油(甘油与PBS按1∶1稀释)封片,荧光显微镜观察。
2结果
2.1生长曲线
如图1所示,接种后48h内,细胞增长不明显,处于停滞期;48—144h内,细胞增殖旺盛,处于对生长期,适于实验研究;144h以后,细胞生长基本停止,活力有所降低,进入平台期。
2.2 细胞形态学特点
植块后24 h,可见少量PMVECs爬出(图2),60 h后,大量细胞爬出(图3)。原代培养后8 d,细胞融合成单层,低倍镜下,PMVECs的形态为多边形、短梭形,呈典型的 “鹅卵石”、“铺路石”样排列(图4)。高倍光镜下可见PMVECs呈扁平状,长椭圆形,核仁显著(图5)。透射电镜下(图6)可见PMVECs胞内特有的Weibel-Pallade小体及细胞连接,正在生长的内皮细胞粗面内质网较丰富,吞饮小泡不明显。
2.3 PMVECs第Ⅷ因子相关抗原检测
将固封后的盖玻片在荧光显微镜下观察。结果如图7所示,呈现典型的胞浆黄绿色着色(图7)。
3 讨论
目前用于血管内皮细胞的培养方法主要有酶消化法、组织块法等。其中,酶消化法主要用于大血管内皮细胞的培养,且较其他方法昂贵、操作复杂、技术要求较高,同时还存在对细胞的化学污染和机械损伤[2,3]。与此相比,组织块法则简单、快捷、经济。在大鼠PMVEC的培养过程中,多种因素均可影响细胞培养的成功率。为此,我们从多个细节上对RPMVEC的体外培养方法进行了改进,使体外培养RPMVEC更加可靠、有效。①动物的选择及处理:有研究表明,幼年鼠的肺组织细胞增殖能力旺盛,生长状态较成年鼠的细胞好。然而,经实验发现,幼年鼠肺脏小,胸膜薄,很难除去,而去胸膜是为了让细胞更充分地爬出组织块。因而,我们采用体重180-220 g的刚成年大鼠,胸膜发育完全,柔韧性好,易于剥去。同时,在取心肺前,给动物注射肝素钠是为了延长凝血时间,好让肺循环里的血液充分流出。未采用肺循环灌流冲洗,是为了减少对血管的损伤,且经对照实验发现,灌流并不能减少血细胞的污染。②培养基的改进:培养基常规添加的青链霉素只能抑制细菌的生长,然而,在实验中发现,组织块法经常会发生霉菌污染,基本都是肺组织本身的污染,而非操作的人为污染。因而,添加抗真菌药两性霉素B,可以降低微生物污染的机会,提高了成功率。③植块方法的改进:植块能否牢固贴壁并成活是植块培养成功与否的关键。为了使植块更好贴壁,不能将已剪碎的组织块过度冲洗,只能在干燥的培养皿中滴加2-3滴含血清的培养基,并尽可能在短时间内将组织块平铺到培养瓶内。为了保持组织活性,所有操作均在4℃冰袋上进行。培养瓶不需特殊处理,只需用含血清培养基预湿瓶壁。采用塑料培养瓶,依靠静电力贴壁。翻身时动作轻柔。经过上述改进,组织块贴壁率达90%以上,污染几率大大降低,细胞生长状态好、数量多。
到目前为止,由于还没有公认的微血管内皮细胞的特异蛋白或标志。因此,微血管内皮细胞的鉴定大多是根据器官和组织的起源,从形态、表型、生化和功能等方面进行综合评价。本研究应用透射电镜观察内皮细胞内的特殊结构Weibel-palade小体,同时结合免疫荧光法检测第Ⅷ因子相关抗原呈阳性表达,均证明培养的细胞为PMVEC[6,7]。
综上所述,本研究应用组织贴块法,并加以改进,建立了大鼠PMVEC的原代培养技术,成功地培养出大鼠PMVEC。此法成功率高、细胞产量高、寿命长、增殖旺盛,且能够持续传代培养。同时,细胞纯度高,鲜见成纤维细胞污染现象,因为成纤维细胞对血清没有内皮细胞敏感,因而在高浓度血清的培养条件下,成纤维细胞的爬出明显落后于内皮细胞。而最早爬出的血细胞,传代后即可除去,获得高纯度的PMVEC。整个培养过程简单有效、为深入研究PMVEC在疾病过程中的病理生理作用奠定了方法学基础。
摘要：实验应用SD雄性大鼠的外周肺组织,进行大鼠肺微血管内皮细胞(RPMVEC)的原代培养和传代培养,并从实验动物、培养基、操作条件、剪块方法、植块方法等细节方面对组织块法培养RPMVEC的方法进行探讨改进。同时,对培养细胞进行Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学鉴定,通过光镜和透射电镜观察细胞形态和超微结构,通过MTT观察细胞生长情况。体外培养的原代RPMVEC在光镜下呈多角形或梭形,胞核清晰,呈卵圆形。细胞单层呈典型的铺路石样排列。细胞生长状态良好、抗Ⅷ因子相关抗原染色阳性。透射电镜可见Weibel-Palade小体。改进后的组织块培养法获取RPMVEC的成功率高,污染几率低,细胞活力好,纯度高,数量大,同时保有了PMVEC的结构和功能,可用于进一步的实验研究。
关键词：大鼠肺微血管内皮细胞,培养方法,组织
参考文献
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