心脏实验（精选6篇）
心脏实验 篇1
随着核磁技术的快速发展, 心脏核磁能准确的显示心脏的解剖、形态、室壁运动, 还能提供心肌灌注、活性等信息, 所以近来核磁应用在冠心病愈来愈多。但核磁研究放射性心脏损伤报道较少。放射性损伤是胸部肿瘤放射治疗后引起的不良反应之一[1]。本实验是用核磁研究犬放射性心脏损伤, 旨在探讨MRI在放射性心脏损伤中的应用价值[1]。
1 材料与方法
1.1 实验动物与照射方法
取成年雄性健康比格犬8只, 体重为 (12.0±0.67) kg, 年龄为1岁, 动物由安徽省埠阳市维光动物实验室提供, 中国辐射防护院动物中心对实验犬进行标准化饲养。照射剂量为单次20 Gy。
1.2 核磁扫描方法
在照射前、照射后3个月、6个月对实验犬进行扫描。用3%戊巴比妥钠麻醉实验犬 (1 ml/kg) , 备皮, 仰卧固定在真空垫上定位扫描。用德国Siemens Sonata 1.5T磁共振扫描仪先扫心脏形态和功能, 再扫灌注和活性。先扫二腔、三腔、四腔、短轴, 扫描参数:TR 418 ms, TE 1.1 ms, 翻转角15°, 层厚6 mm, 视野350 mm×350 mm。左室电影扫描:TR 43.5 ms, TE 1.5 ms, 翻转角15°, 层厚6 mm, 视野297mm×340 mm。心肌灌注扫描:扫描开始后5~10 s用高压注射器经肘静脉注射对比剂, 对比剂为钆喷替酸葡甲胺 (GdDTPA) , 注射速度5 ml/s, 总量按0.1~0.2 mmol/kg。左室延迟扫描:经肘静脉注射对比剂8 ml, 注射速度1 ml/s, 注射对比剂10 min后进行活性扫描。
1.3 核磁心脏图像分析
心脏电影扫描完将图像传至工作站, 观察是否出现局部室壁运动减弱或反向运动。灌注图像观察心肌是否出现不规则低信号区, 并记录时间信号强度曲线。心肌活性观察是否有心肌的延迟增强显影, 并记录延迟增强最佳时间。由3位不了解临床资料的放射科医师行双盲独立观察分析, 以意见一致为判断标准。
1.4 病理检查
用戊巴比妥钠麻醉后, 10%Kcl 5 ml心腔内注射处死实验犬, 肉眼观察心包、心肌等的变化, 把样本浸入3.7%的福尔马林溶液中, 用石蜡包埋切片, 用HE染色, 用光学显微镜观察。
2 结果
2.1 心脏电影、首过灌注、心肌活性
心脏电影:放疗前心脏运动未见减弱, 放疗后3个月, 有1只犬心运动功能减弱, 放疗后6个月有3只犬心运动功能减弱。首过灌注:实验犬心脏放疗前未见灌注缺损区, 放疗3个月后12.5%出现边界不规则的低信号灌注缺损区, 放疗6个月后87.5%出现边界不规则的低信号灌注缺损区。心肌活性:实验犬心脏放疗前未见延迟强化, 放疗3个月后12.5%出现延迟强化, 放疗6个月后62.5%出现延迟强化。
2.2 病理改变
处死实验犬充分暴露心脏后肉眼观察, 8只犬心均可见照射区外表苍白, 横断切开心肌, 照射野区心肌呈灰白色瘢痕状, 质地变硬, 病理观察照射区心肌出现退变、局灶性心肌坏死, 血管肿胀, 周围向外渗透。HE染色照射区心肌退变、局灶性坏死, 血管肿胀, 血管内壁不规则, 周围向外渗透, 周围可见纤维形成。
3 讨论
肿瘤的发病率居高不下, 放射治疗是肿瘤治疗常用的三大手段之一。食管癌、肺癌、乳腺癌等胸部肿瘤的治疗常用放射治疗。胸部放射治疗常引起放射性心脏损伤 (RIHD) , RIHD是一种远期副反应, 主要症状表现在心包及心肌纤维化、加速冠状动脉粥样硬化形成、心脏传导阻滞及心瓣膜损伤。以前心脏一直被认为是可以抗拒放射线的损害, 直到20世纪90年代, 流行病学发现放射治疗早期的胸部肿瘤疾病引起的心脏毒副作用超过了其带来的益处, 放射性心脏损伤才逐渐得到重视。随着医疗技术的发展和进步, 更多的肿瘤患者生存时间增加, RIHD越来越受到人们的重视。
MR心肌延迟增强扫描:心肌延迟增强扫描对心肌细胞存活能力的分析是以Gd-DTPA的分布特性作为基础的, 正常状态下Gd-DTPA造影剂可迅速漏出血管床分布于细胞外间隙, 心肌损伤时心肌细胞膜破坏, 对比剂进入细胞内, 排出延迟滞留在心肌细胞内, 造影剂可缩短T1, 呈高信号, 表现为延迟强化[2];另外, 部分心肌发生程度不同的纤维化, 细胞外间隙增大, 对比剂的分布容积大, 亦导致对比剂排出延迟。放射性心肌损伤心肌纤维化的形成主要是因为冠状动脉、微循环内皮细胞的损伤, 虽然未受损的心肌细胞可以代偿性增殖, 但由于重建时间短无法重建破坏的毛细血管网。内皮细胞的增殖、小动脉的变性、血管内膜胶原沉积可导致管壁增厚、官腔狭窄, 使心肌供血减少, 心肌缺血、纤维化。本实验放疗6个月较放疗3个月延迟强化增多。
心脏电影空间和时间分辨率均较高, 可以直接测量心腔容积及室壁厚度, 还可以动态观察心室壁运动情况。室壁运动减弱与心肌低灌注及延迟强化基本一致, 观察局部心肌的收缩运动有助于进一步发现病变, 本实验放疗后3个月可观察到1只实验犬心脏前壁运动减弱, 放疗后6个月可观察到2只实验犬心脏前壁运动减弱。
总之, 综合上述实验结果, 综合分析心脏电影、首过灌注、心肌活性, 不仅可以早期区别损伤心肌与正常心肌, 还可以评判损伤心肌的活力。
摘要：目的 探讨心肌灌注、心肌活性及心脏电影MRI在实验犬心脏放射性心脏损伤诊断中的应用价值。方法 实验犬放射性心脏损伤8例, 放疗前、放疗后3个月、6个月进行心脏MRI检查。进行心脏电影、心肌灌注、心肌活性扫描, 传至工作站分析其特点。结果 实验犬放射性心脏损伤心肌首过灌注心肌内可见低灌注区, 敏感性为87.5%, 心肌活性心肌内存在延迟强化灶, 敏感性为62.5%, 心脏电影扫描部分心肌运动减弱, 敏感性为25%。结论 通过综合分析首过灌注减低、延迟强化、心脏电影可以早期更有效地区别损伤心肌与正常心肌, 并可判断损伤心肌的活性。
关键词：实验犬,放射性心脏损伤,灌注,磁共振成像
参考文献
[1]庞丽芳, 张欢.MRI及MSCT心肌灌注成像的研究进展.放射学实践, 2011, 26 (1) :97-100.
[2]李坤成.中华影像医学心血管系统卷.北京:人民卫生出版社, 2007:105-118.
心脏实验 篇2
验
报
告
学生姓名： 学 号：
指导教师：
实验地点：
实验时间：
一、实验室名称：介入手术室
二、实验项目名称：羊的心脏造影及肾动脉栓塞术
三、实验学时：4学时
四、实验原理：
心脏造影：经股动脉穿刺将含有机化合物在X线照射下透明的造影剂快速注入血流，使心脏和大血管腔在X线照射下显影，同时快速摄片，将心脏和大血管腔的显影过程拍摄下来，从显影的结果可以看到含有造影剂的血液流动顺序，以及心脏大血管充盈情况，从而了解心脏和大血管的生理和解剖的变化。
肾动脉栓塞术：经股动脉逆行插管至肾动脉，用76%泛影葡胺行伤肾选择性肾动脉造影，显示伤肾动脉分支及出血部位，应用非永久性栓塞材料再选择性进行栓塞。
五、实验目的：1，掌握介入羊心脏造影和肾动脉栓塞术原理及步骤； 2，总结羊肾动脉栓塞和心脏造影介入技术经验； 3，全面了解心脏造影术和肾动脉栓塞术的作用；
4，熟悉介入器材及操作
六、实验内容：
羊的心脏造影和肾动脉栓塞术
七、实验器材：羊，麻醉剂，穿刺针，导丝，导管鞘，导管，栓塞剂，肝素，造影剂，DSA机及高压注射器
八、实验步骤：
1、准备实验器材；
2、给羊进行麻醉；
3、进行实验；
心脏造影：①用Seldinger穿刺插管技术，经Seldinger套管针穿刺股动脉②经此针放入导丝，③再经扩张管扩张穿刺孔后（也可不用扩张导管）将动脉导管沿导丝插入，造
影
前
摄
影
片
如
下
如
：
④在透视下，把导管移至主动脉的冠脉入口处，推入造影剂，摄片如下图：
⑤再将导管移至左心室，再推入造影剂进行摄片，所得影片如下图：
肾栓塞术：①用Seldinger穿刺插管技术，经Seldinger套管针穿刺股动脉②经此针放入导丝，在透视下，将导丝移至肾动脉③再经扩张管扩张穿刺孔后（也可不用扩张导管）将动脉导管沿导丝插入，移置肾动脉，摄影如下图：
④推注造影
剂，进
行
摄
影
摄
影，如
下
图
：
⑤等待一段时间，再摄影如下图：
⑥找到欲栓塞肾动脉，再进行摄影如下图：
⑦再将导管移动至欲栓塞的肾动脉内，再推注栓塞剂进行栓塞。摄影如下二图：
图一
图二
九、总结及心得体会：
通过这次动物实验对介入放射及治疗，有了直观、全新的认识和理解。熟悉介入的器材，了解介入治疗微创的优势，掌握了介入肾动脉栓塞术及心血管造影。知道了学介入就得有不怕牺牲的大无畏精神。总之，收获颇多！
十、对本实验的过程及方法、手段的改进建议：
指导老师签字：5
心脏实验 篇3
“药物对离体心脏的影响”实验是医学机能学实验室开设的经典实验项目。该实验采用蟾蜍离体心脏灌流模型, 研究作用于心脏的相关药物, 实验要求学生自己动手制作离体蟾蜍心脏灌流标本, 有一定的技术难度, 学生对此很感兴趣。以往该实验所用的药品为洋地黄毒苷 (强心苷类, 是临床用于治疗充血性心力衰竭的经典药品) 、异丙肾上腺素 (β受体激动剂) 、普萘洛尔 (β受体阻断剂) 。通过设计不同的加药顺序[3], 以普萘洛尔为工具药, 分析洋地黄毒苷和异丙肾上腺素对心脏的兴奋作用及作用机制的不同。因此通过该实验既培养了学生的动手能力, 又锻炼了学生分析问题能力。
目前洋地黄毒苷临床已很少应用, 所以市面上很难买到。为保留该实验项目, 我们对实验进行了改进。用维拉帕米 (钙通道阻滞剂, 临床主要用于治疗心律失常) [4]作为取代药, 以异丙肾上腺素为工具药来区分普萘洛尔和维拉帕米对心脏的抑制作用及其作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
蟾蜍。
1.2 药品
0.001%异丙肾上腺素注射液 (上海禾丰制药有限公司) ;0.002%普萘洛尔片剂 (研碎, 生理盐水溶解后过滤;山西云鹏制药有限公司) ;0.003%维拉帕米 (上海禾丰制药有限公司) ;林格溶液 (自制) 。
1.3 主要仪器
八木离体蛙心灌流套管 (自制) , BL-420F生物信号采集与分析系统 (成都泰盟科技有限公司) 。
注:与给药前比:#P<0.01;与普萘洛尔组比:*P>0.05, **P<0.01
注:与给药前比:#P<0.01;与普萘洛尔组比:*P>0.05, **P<0.01
注:与给药前比:#P<0.01;与普萘洛尔组比:*P>0.05, **P<0.01
2 实验方法及结果
2.1 八木离体心脏标本的制备
按文献方法制备[5]2只离体蟾蜍心脏灌流标本。
2.2 正式实验
将八木离体蟾蜍心脏灌流标本与张力换能器连接, 启动BL-420F生物信号采集与分析系统, 选择张力实验。描记正常收缩曲线, 观察并记录心脏收缩振幅、心率、每分钟搏出量。然后按下列步骤给药:
一号心脏: (1) 用1 ml注射器, 向灌流器的漏斗端滴入异丙肾上腺素液2滴, 观察, 待作用明显时开始记录上述各项指标。 (2) 用林格溶液冲洗3次, 使心脏活动基本恢复至给药前状态。 (3) 加入维拉帕米溶液2~3滴, 待作用明显后, 记录上述各项指标。 (4) 不冲洗, 加入异丙肾上腺素液2滴, 观察并记录上述各项指标。
实验结果见表1~3。结果表明, 维拉帕米可明显抑制离体蟾蜍心脏的各项功能 (P<0.01) 。在此基础上给予异丙肾上腺素, 可明显兴奋心脏。
二号心脏: (1) 用1 ml注射器, 向灌流器的漏斗端滴入异丙肾上腺素液2滴, 观察, 待作用明显时开始记录上述各项指标。 (2) 用林格溶液冲洗3次, 使心脏活动基本恢复至给药前状态。 (3) 加入普萘洛尔溶液1~2滴, 待作用明显后, 记录上述各项指标。 (4) 不冲洗, 加入异丙肾上腺素液2滴, 观察并记录上述各项指标。
实验结果见表1~3。结果表明, 普萘洛尔可明显抑制离体蟾蜍心脏的各项功能 (P<0.01) 。在此基础上给予异丙肾上腺素, 后者的兴奋心脏作用被明显阻断。
3 讨论
异丙肾上腺素的作用机制是激动心肌细胞β1受体, 临床用于心脏骤停等。普萘洛尔的作用机制是阻断心肌细胞β1受体, 临床主要用于窦性心动过速等。维拉帕米是临床常用的抗心律失常药, 其作用机制是抑制心肌细胞钙离子内流。设计本实验的目的在于以异丙肾上腺素为工具药, 区分出普萘洛尔和维拉帕米对心脏抑制的不同机制。同时使学生学习利用离体心脏灌流标本分析药物作用机制的基本方法。
结果显示, 本实验中所加入的普萘洛尔和维拉帕米浓度要适中, 即两药对心脏的抑制程度要相似 (抑制率P>0.05) , 这样才有可比性。当在心脏被抑制的情况下再次加入异丙肾上腺素后, 普萘洛尔组再次兴奋的程度远低于维拉帕米组 (增加率P<0.01) 。说明异丙肾上腺素与普萘洛尔两药间相互作用更有特异性。因为前者为β受体激动剂, 后者为β受体阻断剂。而异丙肾上腺素和维拉帕米因作用机制的不同, 相互作用缺乏特异性。由此说明普萘洛尔和维拉帕米的作用机制是不同的。
本实验保留了运用工具药分析两种作用于心脏药物的实验方法, 通过选用适宜的药物浓度使维拉帕米和普萘洛尔对离体心脏的抑制作用程度相近。在此基础上分别观察两药对异丙肾上腺素作用的影响, 并得出两药机制不同的结论。该实验成功率高, 可重复性强, 适合在学生实验中进行。
参考文献
[1]王迎伟, 朱学江, 郭军, 等.基础医学实验教学新体系的构建与实践[J].中国高等医学教育, 2013 (10) :54-55.
[2]丁伯平, 黄帧桧, 汪五三.PBL和Seminar教学法在机能综合开放性实验教学中的应用[J].卫生职业教育, 2014, 32 (22) :39-41.
[3]郝刚, 李效义.医学机能学实验教程[M].北京:北京大学医学出版社, 2007.
[4]林志彬, 金有豫.医用药理学基础[M].6版.北京:世界图书出版公司, 2008.
心脏实验 篇4
1 资料与方法
1.1 一般资料
1.1.1 试剂与药物:
N-甲基-N-亚硝基脲 (MNU, sigma-aldrich (上海) 贸易有限公司生产) ;褪黑素 (MLT, 美国Sigma公司生产) ;阿霉素 (ADM, 浙江海正药业生产) 。RPM I-1640培养液[Gibco/BRL公司 (USA) 生产], 胎牛血清系 (美国Sigma公司生产) , 碘化丙啶系 (美国Sigma公司生产) , 全自动酶标仪 (Multis Ascent公司生产) , LPO、SOD及GSH-Px测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。
1.1.2 动物和饲养:
健康清洁级SD雌性大鼠140只。购于河北医科大学动物中心。大鼠在光照—黑暗 (LD) 条件下饲养, LD即采用12h光照 (光照期6∶00-18∶00) 与12h黑暗 (18∶00-6∶00) 交替。自由饮水进食。动物房屋室温 (25±2) ℃, 湿度45%~50%, 同步化3周后进入试验。
1.2 方法
1.2.1 大鼠乳腺癌模型制备:
(1) 清洁级SD雌性大鼠共140只, 其中130只接受注射MNU诱发乳腺癌模型, 10只仅接受溶酶植物油腹腔内注射作为对照。 (2) 按照Dagar方法, 大鼠分别称重并编号, MUN按50mg/kg剂量进行腹腔注射, 2周后重新称重, 再按同样的剂量强度重复注射1次。每周1次检查大鼠乳垫周围, 观察肿瘤生长情况, 及时评价成功情况。
1.2.2 动物分组:
分为空白组 (Blank组) ;溶酶组 (Diss组) ;褪黑素组 (MLT组, 10mg/kg/次, 每天1次, 共15次) ;阿霉素组 (ADM组, 2.5mg/ml, 隔天1次, 共7次) ;褪黑素联合阿霉素组 (M+A组, 入组第1天开始MLT10mg/kg/次, 每天1次, 共15次;第3天ADM2.5mg/ml, 隔天1次, 共7次。注:MLT在ADM前腹腔注射) 。第18天各组处死部分大鼠取材检测, 剩余继续观察生存状况。
1.2.3 氧化损伤指标检测:
各组大鼠以戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉, 之后打开胸腔, 迅速取出心脏, 用生理盐水冲洗3次, 滤纸吸干表面水分, 称重, 用0.2mol/L磷酸缓冲液 (PH8.6) 在冰水浴中置备10%匀浆液, 测定心肌组织中LPO含量及SOD和GSH-Px活性。
1.2.4 光镜心肌组织样本制备:
麻醉处理同前, 打开大鼠胸腔, 暴露并摘取心脏。在室间隔处切开心脏, 在左心室处取心肌组织, 顺肌纤维走形将心肌组织切成1mm3组织块8~10块, 固定于10%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中, 以备病理切片, HE染色。低倍和高倍光镜下观察并照相。
1.2.5 电镜样品制备:
心肌组织电镜样品处理步骤:取材—前固定—清洗—后固定—清洗—脱水—浸透—包埋—聚合—超薄切片—观察并照相。
1.3 统计学方法
应用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析。计量资料以±s表示, 采用t检验;计数资料以率 (%) 表示, 采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 成瘤入组
140只SD雌性大鼠, 10只MNU溶媒组中无故死亡1例, 其它状态良好, 无1例成瘤.130只接受注射大鼠, 注射中死亡4只, 成瘤后未入组前死亡3只, 未成瘤7只, 共成瘤随机入组116只, 成瘤率91.5%。每组随机取8只解剖取瘤及心脏后处死, 余观察6个月死亡率。
2.2 氧化指标检测
心肌组织中脂质过氧化物 (LPO) , 超氧化物歧化酶 (SOD) 谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 。Blank组、Diss组和MLT组相比各项指标差别不明显, LPO在ADM组与M+A组相比, 心肌LPO含量明显升高, 差异有统计学意义 (P<0.05) , ADM组SOD及GSH-Px较见M+A组显著升高, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。
注:与ADM组比较, *P<0.05, #P<0.05, △P<0.05
2.3 各组心脏的形态学变化
2.3.1 心脏大体表现:
MLT组、Blank组与Diss组心脏外形、大小、重量接近正常;ADM组大鼠心脏充血肿胀明显, 体积增大, 心包膜上可见出血点。M+A组心脏外形接近正常, 轻度充血, 包膜未见出血点。
2.3.2 光镜和电镜下心脏情况:
Blank组、Diss组、MLT组无论在心肌HE染色切片低倍镜光镜下还是电子显微镜下都未见明显异常。
ADM组低倍镜下可见大量心肌肌束断裂, 肌束间充满大量粘液 (见图1) 。高倍镜下可见心肌排列紊乱, 呈现出严重粘液变性表现 (见图2) 。电镜下可见核一侧基质明显水肿, 线粒体大部分嵴和少部分膜融合, 模糊不清或缺失, 部分染色体甚至有空化现象, 糖原颗粒显著减少, 部分基节排列紊乱或缺失 (见图3) 。
M+T组低倍镜下可见心肌肌束基本正常, 少数区域可见肌束断裂, 程度不重 (见图4) ;高倍镜下可见轻度颗粒样变性样改变 (见图5) 。电镜下可见线粒体少部分嵴融合模糊不清, 糖原颗粒减少, 未见线粒体空化现象。 (见图6) 。
2.4 1月生存状况
1月生存状况Blank组4/16, Diss组6/16, 2者比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。MLT组全部存活 (14/14) 明显高于前2者, 差异有统计学意义 (P<0.05) , ADM组和M+A组分别为5/16和11/14, 后者高于前者, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 而MLT组和M+A组比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表2。
Blank and Diss:χ2=1.45, P=0.35.Blank and MLT:χ2=17.5, P=0.000Blank and ADM:χ2=0.00, P=1.00.Blank and M+A:χ2=8.57, P=0.005MLT and M+A:χ2=3.36, P=0.11.ADM and M+A:χ2=6.71, P=0.012
3 讨论
阿霉素为蒽环类抗生素的代表药物之一。迄今为止, 仍是乳腺癌、恶性淋巴瘤、胃癌等常见恶性肿瘤化疗组方的主要成员之一, 在其治疗中发挥着不可替代的作用。心脏毒性是阿霉素的主要剂量限制性毒性, 不仅使得许多合并心脏疾患的患者无法应用, 也因为其特殊毒性存在无法提高剂量强度, 并且因此而严重影响患者的生存质量[1]。因此寻求低毒高效的心脏防护药物是临床迫切需要解决的问题。
褪黑素是由松果体分泌并人体内自然存在的内分泌物质, 它广泛分布在各种器官当中, 并且在人体内发挥着重要而复杂的生物学功能。我们在既往研究中发现了外源性褪黑素对乳腺癌细胞增殖的抑制作用以及对阿霉素增敏及耐药逆转作用[2、3]。然而, 褪黑素作为目前公认的功能最强大的抗氧化剂, 其多种器官保护作用已得到公认。这就意味着褪黑素在促进阿霉素的抗肿瘤作用的同时有可能还起到对心肌的保护作用。
当前针对蒽环类药物致心肌损害的机理有如下假说: (1) 氧化应激产生自由基对心肌造成损害; (2) 钙超载及能量代谢障碍引发心肌细胞脂质过氧化反应; (3) 心肌细胞酪氨酸硝基化; (4) 心肌细胞直接凋亡[4]。自由基损害和心肌细胞脂质过氧化反应在蒽环类药物致心肌损害中起重要作用, 清除自由基也是预防心肌损害的一项重要措施[5]。
超氧化物歧化酶 (SOD) 是生物体内清除自由基的首要物质, 它可以催化超氧自由基转化为过氧化氢和分子氧, 在抵御氧自由基导致的细胞损伤中起关键作用。谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶, 为生物体中清除过氧化氢和其他有机过氧化物的脱毒酶。它能通过抗氧化作用保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物的干扰及损害。过氧化脂 (LPO) 是体内细胞膜性结构中的多介不饱和脂肪酸受到氧自由基的作用生成的脂质过氧化, 膜脂质的过氧化, 使膜结构和细胞功能受损而引起多种疾病。以上指标被视为药物干预阿霉素心脏毒性药效学研究的重要指标[6、7]。心肌损伤程度与以上指标有着密切的联系, 在本研究中我们看到其与SOD和GSH-Px与阿霉素造成的心机损伤呈负相关, LPO则呈正相关。同时可以看到褪黑素的干预在一定程度上降低了阿霉素对心肌造成的氧化损伤。这与既往研究中观察到的褪黑素因其抗氧化机制而发挥的器官保护作用是一致的[8、9]。
我们分别在光学显微镜阿霉素应用后心肌组织的结构紊乱和黏液变性表现, 而在电子显微镜下则看到典型的线粒体损伤甚至空化的表现, 这在既往研究中也曾经看到[10]。在应用褪黑素后再应用阿霉素可以看到这种损伤明显减轻, 从形态学上更进一步证实了褪黑素对阿霉素造成的心肌线粒体的氧化损伤所起到的保护作用。
心脏实验 篇5
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 动物
纯种德国牧羊犬14只,雄性,体质35～40 kg。
1.1.2 主要试剂
质粒pSecTag 2B、感受态细胞E.Coli JM109、中国仓鼠卵巢细胞系由亚能生物技术(深圳)有限公司提供;限制性内切酶Hind III、Kpn I、BamHI和Xho I购自宝生物工程有限公司;VentDNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自New England Biolabs公司;羊抗人t PA多克隆抗体、兔抗羊多克隆抗体、牛血清白蛋白、t PA ELISA检测试剂盒由晶美生物工程有限公司提供;全氟丙烷气体(Halocarbon-218)由广东佛山捷锐公司提供。
1.1.3 主要仪器
超声波发生器系宁波新芝生物科技有限公司产品;治疗性超声仪(US-700)系德国产品。
1.2 方法
1.2.1 基因质粒的构建和表达
根据3个EST序列及t PA基因序列设计3对引物将t PA的3段序列从3个EST克隆质粒中扩增出来,并且在3对引物末端分别引入酶切位点。分别用含有氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基扩增培养3个EST克隆菌株,提取3个EST克隆质粒作为PCR扩增模板并扩增3条t PA片断,回收扩增产物并测序鉴定。质粒pSec Tag 2B和3条t PA片断t PA-1、t PA-2、t PA-3分别经Hind III和Xho I、Hind III和Kpn I、Kpn I和BamHI、BamHI和Xho I双酶切消化,经QIAGEN PCR Product Purification Kit纯化,T4 DNA连接酶14℃连接过夜,将连接产物转化E.Coli JM109感受态细胞,经含氨苄青霉素LB平板挑出抗性菌落,PCR检测重组质粒,提取重组质粒测序鉴定(如图1)。重组质粒经磷酸钙共沉淀法转染至CHO细胞,用间接免疫荧光法检测t PA表达。
1.2.2 一步法制备载基因白蛋白纳米粒
100 mg牛血清白蛋白加入5 m L双蒸水溶解,用0.1 NHCl调整pH值至5.5。将已构建的1 mg t PA质粒加入上述白蛋白溶液中,孵育30 min后在超声场的存在下缓慢滴入乙醇(乙醇∶水=2∶1),直至溶液出现乳白色并逐滴滴入0.5%的戊二醛溶液30μL,适当搅拌,室温下静置2 h。减压使残余的乙醇挥发,所得溶液17 000 r/min离心30 min以除去游离的白蛋白和多余的交联剂。沉淀用双蒸水重悬并用超声波(条件:180 W,固定频率20 kHz,30 s)分散成乳胶状,4℃下储存备用。取部分制备扫描电镜标本观察纳米粒形态、做包封率检测和凝胶阻滞实验,并用Zetasizer 3000仪测定粒径大小和表面Zeta电位。
1.2.3 氧-氟丙烷蔗糖白蛋白超声微泡的制备方法
无菌制备含10%蔗糖的5%(g/m)牛血清白蛋白液体10 m L;并置于有盖50 m L塑料离心管中,依次用氧气和氟碳气体饱和液体(流量:6 m L/min),约10 min,超声波发生器处理1 min(条件:180 W,固定频率20 kHz);将制备的微泡4℃下密闭保存备用。取部分显微镜观察微泡形态、测量大小并计数;Zetasizer 3000仪测定粒径大小和表面Zeta电位。
1.2.4 载基因白蛋白纳米微泡靶向超声造影剂制备
将一次制备的白蛋白纳米粒(含1 mg质粒)加至5m L白蛋白微泡中,加入50%戊二醛10μL溶液4℃下孵育2 h进行交联(戊二醛溶液终浓度为0.1%)。用生理盐水洗涤、离心、分层,离心速度200 r/min,1min,取上浮泡沫悬液即得载基因的白蛋白纳米微泡靶向超声造影剂(载体)。调整微泡浓度使10 m L靶向造影剂中含微泡0.8×109～1.8×109/m L,基因质粒含量为2 mg。4℃下保存备用。
1.2.5 载t PA基因白蛋白纳米微泡靶向超声治疗方法
实验组(n=7)于三尖瓣膜置换术后胸壁表面二维超声观察心脏显影。经静脉注入载t PA基因白蛋白纳米微泡剂10 m L,并观察到心脏显影明显增强后经胸前壁正对心脏前壁右室流出道局部超声照射30 min,并观察到将微泡击碎(二维超声观察),超声频率1 MHz,强度1.5 W/cm2。对照组(n=7)于常规体外循环下行三尖瓣机械瓣膜置换术后静脉输入10m L生理盐水并超声照射(条件同前)。术后给予抗生素预防伤口感染,常规饮食,各组均无抗凝治疗。动物于术前和观察结束后(4周)分别取血液检测D-二聚体含量并用ELISA法检测血t PA含量。
1.2.6 病理和免疫组织化学观察
观察期4周结束或动物死亡后,取其心脏,沿血流方向打开心腔观察血栓形成情况;取心房和心室肌壁尤其是左室前壁右室流出道局部靶向治疗处心肌组织,10%多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,做HE染色和免疫组织化学间接法染色,观察病理改变、检测t PA抗原表达和转基因效果。免疫组织化学一抗为羊抗人t PA多克隆抗体;二抗为兔抗羊多克隆抗体,操作方法按试剂说明书进行,阳性反应细胞为细胞浆内黄褐色颗粒状沉淀。另取肝脏、肾脏和肺脏用上述方法检测,观察基因药物的组织分布和毒性。
1.3 统计学方法
用SPSS 13.0软件进行统计学分析,数据进行正态性检验后以均数±标准差表示,采用两组独立样本t检验,P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 p SecTag2B-tPA重组质粒的构建与表达
转染CHO细胞后免疫荧光反应结果如图2所示,加入荧光素标记t PA抗体后被转染的CHO细胞胞浆呈强阳性反应;未加荧光素标记t PA抗体被转染的CHO细胞胞浆呈阴性反应;一抗用荧光素标记β-catenin抗体取代后反应为阴性。
2.2 载tPA基因白蛋白纳米粒粒径、形态和包封率的测定
扫描电镜结果显示,白蛋白纳米粒球形、大小较均匀且分散良好。Zetasizer 3000仪粒度分析显示,白蛋白粒径大小呈正态分布,平均粒径为132.0 nm,最大粒径为152.4 nm,最小粒径为49.1 nm。多分散指数平均0.33(图3)。表面Zeta平均(31.32±41.42)m V。样品的包封率用紫外分光光度计进行检测,测量加入的总的质粒DNA含量。将包裹基因后的纳米溶液离心并测量上清液中游离质粒DNA,包封率(%)=(W总-W游)/W总×100%(W总:总的加入量;W游:上清液中质粒DNA测得量)。测定结果显示包封率平均为73.58%,符合实验要求。
2.3 凝胶阻滞分析和DNaseⅠ保护实验
0.9%琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示,第1加样孔为分子量标记(Marker)。第2加样孔为质粒DNA,未经纳米粒包裹,可见明显条带。第3加样孔为经白蛋白纳米包裹后的质粒DNA,完全阻滞于加样孔中未能移动(DNA:白蛋白为1/100)。第4加样孔为质粒DNA经白蛋白纳米粒包裹并用DNaseⅠ消化后降解,电泳亦未见条带显现,表明纳米粒对质粒DNA具有保护作用。
2.4 超声微泡形态的物理特征
普通光学显微镜显示制备的糖蛋白超声微泡圆球形囊泡状,大小较一致,分散良好,直径最小0.9μm,最大9.8μm,95%以上微泡直径2～5μm,可满足微血管超声造影需求。含10%蔗糖的白蛋白微泡经4℃保存30 d形态学上未发生改变,且对热稳定性良好(40℃,30 min)。与白蛋白纳米粒交联后上述性状亦未发生明显变化(图5)。
2.5 超声显像和靶向治疗
实验组经静脉注入载t PA基因白蛋白纳米微泡剂10 m L,超声显像心脏靶组织,观察到与注射前相比相关脏器显影明显增强。经超声波治疗30 min后组织显像回复至注射前水平。对照组未见治疗前后超声影像变化(图6)。
2.6 术后各组动物状况
术后各组动物均观察28 d(4周)。对照组7只,其中1只于术后19 d死亡。观察期死亡动物的主要症状为食欲差、体重明显减轻、咳痰和呼吸困难等,心功能衰竭是主要死亡原因。实验组7只,存活时间均达到观察期4周,动物的一般情况良好,术后1周左右出现轻度食欲差和体重减轻,经治疗和调理后恢复正常。
2.7 心脏和其他脏器的病理学改变
大体:各组死亡和观察结束后处死的动物心脏心包膜局部均可见轻度黏连。沿血流方向切开心脏,见三尖瓣机械瓣膜缝合良好,无瓣周漏现象。对照组包括观察第19天死亡1只在内共7只动物机械瓣膜心房和心室表面有不同程度的血栓形成,血栓形成率为100%,死亡动物心脏血栓形成最为明显,从瓣环与瓣叶交界处开始沿瓣膜房室两面向瓣中央发展,阻碍瓣膜活动,并向上发展填充右房;向下发展,沿右室至肺动脉。实验组经靶向转染t PA质粒,7只动物心脏瓣膜表面及心腔内均未见血栓形成(图7、8),4周血栓抑制率100%,各组心肌肉眼上无明显改变。镜下:对照组心腔和瓣膜表面血栓均为混合性血栓,偶伴有轻度感染可见有炎症浸润和局部血栓溶解。死亡动物见轻度肺水肿和间质性肺炎性改变;肝、肾等有不同程度淤血,肝细胞周围型脂肪变性,肾近曲小管上皮细胞轻度水变性。实验组心脏和相应脏器未见明显异常。两组经超声处理的心肌组织心肌细胞体积轻度增大,细胞浆深染,细胞核增大。部分细胞胞浆可见空泡;其余未见明显异常。
2.8 心肌tPA抗原表达
超声靶向转染后4周可见局部心肌细胞表达t PA抗原阳性,这些心肌细胞呈散在分布,体积轻度增大,胞浆横纹减少,呈棕褐色细颗粒状,部分间质细胞和小血管壁可见弱的阳性反应(图9)。
2.9 血D-二聚体和tPA含量
靶向转基因前和术后4周血D-二聚体和t PA含量检测结果如附表所示,实验组于转基因后4周血液2项反应纤溶活性的指标均较转基因前、对照组术前和术后显著增高;实验组术前与对照组术前和术后相比差异均无统计学意义。
注:覮与对照组术前、术后及实验组术前比较,P<0.01
3 讨论
t PA是纤溶系统主要激活因子,是机体重要的抗凝成分。它由血管内皮细胞合成,在各种刺激尤其是纤维蛋白的作用下释放入血,作用于血浆素原使其转换为血浆素促进纤维蛋白降解[2]。人重组t PA作为生物制剂已应用于冠心病急性心肌梗死、脑栓死、肺梗死等的溶栓治疗[6]并取得了显著疗效,但由于价格昂贵未能广泛应用。这些研究成果使笔者设想构建真核t PA基因表达质粒并选择适当的载体将其转导机体细胞获得有效和持续t PA的产生,以达到长期抗凝和防止血栓形成的目标。笔者实验体系里,以3个EST克隆质粒为模板分别扩增3条t PA片断并将之克隆于质粒pSecTag 2B中构建成pSecTag 2B-t PA重组质粒,扩增后体外转染CHO细胞获得了t PA的高效表达。
白蛋白是近年来研究较多的一种纳米材料,它的生物相容性好,生物可降解,无免疫源性和细胞毒性,基因转移效率较高。它有精确的纳米结构、表面与内部可携带分子的特性,使之成为一种很好的DNA导入细胞的载体[7]。白蛋白纳米粒携载基因的方式包括表面静电吸附和物理包裹两种方式,具体在结合过程中采取哪种方式取决于载基因纳米粒的制备方法[8]。一步法是在白蛋白形成纳米粒前先与基因质粒混合,这种方法将基因物理包裹于白蛋白纳米粒中。其主要优点是携带被转基因量较高;药物缓释和转基因时间较长;具有较好的酶保护和防止体内DNA酶降解作用;容易设计成靶向载体,应用于体内研究或制备成纳米药物应用更具优越性。二步法:先制备白蛋白纳米粒并调整介质酸碱度使之表面含有较多正电荷,借助静电吸附原理将富含负电荷的质粒DNA吸附于表面携带。主要特点是制备过程温和简易,不易破坏DNA;纳米粒径均一,容易调整粒径大小,但载药量相对小,不释控,无酶保护作用,设计靶向载体较为复杂。笔者实验采取一步法制备载t PA基因质粒白蛋白纳米粒,扫描电镜和粒度分析结果显示,粒径132.0 nm左右,大小较均匀,分散性好;包封率73.58%;凝胶电泳分析显示具有较好的DNA酶保护作用,符合实验要求。
基因导入体内的方式多为将目的基因直接注射于靶组织,如心血管疾病多采用心肌内直接注射或心导管注入质粒DNA或腺病毒载体。笔者实验室曾构建了高表达t PA基因质粒并用外科涤纶缝线作为载体制备了基因缝线,直接缝合于心肌组织[9];用壳聚糖做原料制备了纳米t PA基因载体并直接注射于心肌均获得t PA的有效表达[10]。但这种方法存在有创性,限制其临床应用。自超声造影剂应用以来,在利用微泡增强超声显像的同时,还发现微泡具有靶向运载作用,可以靶向传输基因或药物,达到治疗疾病的目的,并可能建立一种安全、有效、无创的超声介导靶向传输系统[11]。超声靶向治疗的基本原理:声场内的超声波破坏微泡造影剂后,其产生的空化或机械效应可使靶细胞膜轻度可逆性损害和通透性增加,并致直径≤7 mm的微血管破裂,内皮细胞间隙增宽。靶基因可通过破裂的微血管和内皮细胞间隙到达组织细胞内。同时,利用超声波在特定时间和空间内击碎靶组织内的微泡,从而使细胞对基因或药物的摄入增强,达到在靶器官定向治疗的目的并降低了携带基因或药物的全身不良反应和毒性[12]。
目前,以白蛋白作为液膜的微泡研究较多,它具有无毒性、易于制备等优点,缺点是稳定性较差。有学者在制备超声微泡过程中在白蛋白液体中加入一定量(40%)蔗糖,结果发现微泡的热稳定性增强且存放时间明显延长,从未含蔗糖的16 d延长至含40%蔗糖的半年以上[12]。笔者实验体系中,发现40%的蔗糖白蛋白液体黏滞性强,制备时超声较困难且所需能量较大,容易导致微泡液温度增高;另外,高含量蔗糖的输入机体难以接受。为此,实验选择10%的蔗糖构成糖蛋白,不但避免上述情况发生且微泡的稳定性良好。惰性气体氟碳是目前最常用的制备超声微泡时使用的气体。有学者发现含全氟碳的微泡如果同时加入少量氧气会进一步增加微泡在血液中的稳定性,取得更强的心肌显影效果。根据超声微泡这些特性和靶向原理,实验使用蛋白交联剂戊二醛将构建的白蛋白纳米t PA基因质粒连接到制备的蔗糖白蛋白超声微泡表面,在超声场的存在下,将t PA基因质粒靶向导入心肌组织,获得了t PA基因的有效表达并有效预防了狗三尖瓣机械瓣膜置换术血栓的形成。在获得心肌靶组织表达t PA增强的同时,检测到血t PA含量增加以及D-二聚体含量增高,反应了t PA抗凝活性明显增强。
笔者的初步研究结果发现,采用超声触发破坏微泡造影剂的方式,可使载有基因质粒的白蛋白纳米粒靶向定位释放和靶基因的表达增强,这种方法是一种简易有效的靶向纳米基因转移新技术。虽然该方法使目的基因在体内实现高效、稳定、可调控的表达还有待进一步深入研究,但随着分子生物学和超声医学技术的不断发展,将为人类疾病防治的研究提供一种新的途径。
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心脏实验 篇6
1 资料与方法
3例心脏穿孔的患者均为行心脏介入治疗后发生。患者1:女性, 68岁。诊断为不稳定性心绞痛, 行冠状动脉介入治疗, 手术后半小时突发心率加快, 血压下降, 意识不请, 放射线下透视发现心影增大, 有心包积夜影象, 快速心包穿刺, 抽出不凝血100m L后, 血压回升, 心率减慢, 意识恢复。应用等量鱼精蛋白中和, 重复冠状动脉造影见左前降支冠脉有造影剂外渗, 植入带膜支架后观察2h后血流动力学仍不稳定, 仍有出血迹象, 然后转外科手术治疗。患者2:女性, 54岁。诊断为先天性心脏病, 房间膈缺损。行缺损封堵术。术中顺利, 术后应用心脏超声评价时发现心脏周围有少量液性暗区, 可疑有心脏穿孔心包积液。但是反复询问病人仅述胸部轻微不适血压正常。但是发现病人心率偏快, 和术前比增加每分20次, 继续密切观察病情, 发现病人心前区不适的症状加重, 心率逐渐加快, 血压逐渐下降, 心脏超声液体量有增加的趋势。迅速行心包穿刺, 抽出暗红色血液120m L, 应用等量鱼精蛋白中和肝素, 留置引流管观察病情直到稳定。患者3:男性, 57岁。诊断为扩张性心肌病, 心力衰竭, 完全性左束支传导租滞。行心脏三腔起搏器植入术, 在行冠状窦静脉插管造影时发现冠状窦有夹层撕裂, 造影发现有造影剂外渗, 并滞留于心包腔内。病人无任何不适的感觉, 心脏超声检查无液性暗区, 反复观察2h病情无变化, 再次造影无造影剂外渗, 成功的植入三腔起搏器后出院。
2 护理体会
2.1 术前护理
心脏介入手术心脏穿孔的发生率很低<0.5%, 然而一旦发生可危及生命, 所以在手术前要做好充分的准备, 术前要准确记录好生命体征, 包括心率、血压、脉搏情况、呼吸状态、意识状态。建立确切的静脉输液通路, 准备好鱼精蛋白并能熟练的计算计量和掌握应用方法, 准备好检测凝血功能的备品和仪器, 备好心包穿刺应用的物品。
2.2 术中护理
术中主要是密切观察病情, 及早发现异常征象以便及时处理。心脏穿孔根据穿孔部位不同, 出血量的多少和速度。临床表现变化较大, 轻者可以无症状, 严重的可以发生心包填塞需要紧急处理, 重者危及生命。所以术中密切观察病情变化极其重要。本组第3例患者无任何症状, 只进行病情的观察直至病情稳定。第2例患者首先表现心前区不适, 心率加快, 此时给予密切的注意和观察, 一经证实有心脏穿孔立即中和应用鱼精蛋白中和肝素极为重要。一旦发现血压下降, 出现心包填塞的征象应立即行心包穿刺并植入引流管, 解除心脏压迫非常重要[2]。本组第2例患者, 早期症状不明显, 但是因为有了充分的准备和及时的发现和处理, 使病人迅速转危为安。严重的动脉系统或者是左心的穿孔出血量较大而速度快, 多会迅速发生血压下降和意识障碍, 在导管室需要快速心包穿刺或开胸解除压迫, 多数需要介入方法或者外科手术方法修补方能有效。本组第1例患者经过手术修补才终止了出血和心包压塞。
2.3 术后护理
心脏穿孔的病人经过处理后, 病人常常遗留一些心前区不适的症状以及局部心包穿刺后或手术后遗留下的局部损伤和不适的感觉。另外心脏穿孔时的一些异常感觉以及危险的情况会给病人带来思想上的负担, 精神上的恐惧和压力。所以术后要密切配合医生向患者和家属解释说明并发症出现的原因和后果, 帮助患者正确认识疾病的发生以及治疗过程中带来的不良反应, 有些并发症和不良反应是在治疗过程中不可完全避免的, 要正确处理和对待并发症的出现, 迅速战胜疾病, 恢复健康。
参考文献
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