动脉血管内皮损伤

动脉血管内皮损伤（通用7篇）

动脉血管内皮损伤 篇1

肺动脉高压(hypoxic pu1monary hypertension, HPH)是一种常见病症,是慢性肺源性心脏病(COPD)的关键发病环节。在我国,80%的肺动脉高压患者源于慢性阻塞性肺疾病。而后者是严重危害人们健康的常见病,其发病机制极为复杂。在肺动脉高压形成中,由缺氧损伤内皮细胞从而导致肺血管张力收缩反应加强在此过程中起重要作用[1]。目前临床缺乏对内皮细胞损伤有保护作用的药物,本研究通过形态学、生化等方法,观察银杏酮酯(GBE50)对常压缺氧所致肺动脉高压模型大鼠内皮损伤的保护效应,并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级SD大鼠30只,体重200 g～220 g,由上海中医药大学实验动物中心提供。

1.2 试剂与仪器

超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)试剂盒(南京建成生物有限公司。批号:20070235);缺氧装置系统;GBE50由上海杏灵科技药业股份有限公司提供(批号050901),RSS-5100型测氧仪(上海雷磁新泾仪器有限公司生产)。

1.3 慢性常压缺氧肺动脉高压模型的建立

参照慢性间歇性低氧动物模型的方法,用RSS-5100型测氧仪监测和调节舱内氧浓度,使其维持在(10±0.5)%。舱内二氧化碳和水蒸气分别用钠石灰和氯化钙吸收,进行间断低氧每天8 h,连续21 d。

1.4 分组及给药

SD大鼠30只,随机分为正常对照组(N)、模型组(M)和GBE50组,每组10只。GBE50组自第1天起每天1次 EGB50 80 mg/kg,连续3周。

1.5 肺血管形态学分析

大鼠右上肺组织以10% 甲醛固定,苏木精-伊红(HE)和弹性纤维染色。每只大鼠选3张肺组织切片,每张切片随机选取横断面积较圆、直径100 μm～150 μm肺细小动脉5支,用病理图像分析软件(PIPS-2020型)测定肺动脉管壁面积/管总面积(WA)作为肺小血管重塑指标。

1.6 右室肥厚指数的测定

取出心脏置10%甲醛,固定48 h,用镊子同时夹住右心耳和左心耳,手术刀在镊子下平面切除,眼科剪剪开右心室(呈圆弧形状),同时剩余部分为左心室和室间隔,分别用滤纸吸干右室(RV)和左室+室间隔(LV+S)并称取的各自重量,以RV/(LV+S)的值反映右心室肥厚指数(RVHI)程度。

1.7 血浆NO、MDA、SOD、内皮素-1(ET-1)含量的测定

各组大鼠于造模21 d后,腹主动脉取血,检测各组血浆中NO、MDA、SOD、ET-1含量。血浆SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法;MDA含采用硫代巴比妥法;采用硝酸还原酶法测定血浆中NO2-/NO3-含量,其间接反映NO水平;ET-1按放免试剂盒(上海中医药大学核医学实验室)说明严格操作。

1.8 统计学处理

利用SPSS11.5软件,数据用均数±标准误(SE)表示,计量资料采用方差分析,两两比较用SNK检验。

2 结 果

2.1 GBE50对慢性HPH大鼠右心室重量的影响

与N组相比,M组RV/LV+S明显升高(P<0.01);与M组相比,GEB50组RV/LV+S比值显著下降(P<0.01)。详见表1。

与N组比较,1)P<0.01;与M组比较,2)P<0.01

2.2 GEB50对慢性HPH大鼠肺血管WA的影响

与N组相比,模型组WA明显升高(P<0.01),与M组相比,GEB50组WA比值显著下降(P<0.01) 。 详见表2。

与N组比较,1)P<0.01;与M组比较,2)P<0.01

2.3 各组对慢性HPH大鼠血浆MDA、SOD、ET-1、NO影响

M组NO、MDA、SOD、ET-1水平显著高于N组(P<0.01),GEB50组与M相比,SOD、NO水平显著增加(P<0.01);ET、MDA都有下降趋势(P>0.05)。详见表3。

与N组比较,1)P<0.01;与M组比较,2)P<0.01

3 讨 论

银杏叶提取物GEB50为我国自主开发的具有知识产权,并在美国等取得专利的第四代提取物,其总黄酮达44%,内酯达6%。银杏叶提取物含有丰富的黄酮类活性物质和萜内酯等药效成分,具有扩张血管、拮抗血小板活化因子(PAF),抗应激反应[2],保护心肌损伤[3],促进血液循环和代谢,消除自由基[4],保护机体组织和耐缺氧[5]等作用,并在呼吸系统疾病治疗中有明显疗效[6]。但未见有用于抗肺动脉高压血管内皮损伤的临床与实验方面的报道。

本研究显示,M组RV/LV+S、WA比值明显高于N组,而GEB50显著低于M组,表明本实验中慢性缺氧性肺动脉高压的模型成立,而且也表明GEB50可防治慢性肺动脉高压,降低外周阻力。 HPH造成肺血管内皮损伤,是 COPD 病理发展过程中不容忽视的环节,而HPH机制复杂,涉及很多因素。在持续低氧的过程中,由于血管收缩因子和舒张因子的失平衡导致了低氧性肺血管收缩,这是HPH形成的一个重要原因。Giveriz等[7,8]研究表明,ET-1参与了低氧性肺动脉高压的形成。NO是内皮舒张因子的主要成分,具有舒张肺动脉和抑制血管平滑肌细胞增殖[9,10]。在HPH形成过程中,ET-1占主动,iNOS诱导是被动因素。缺氧一方面使ET-1合成增加,eCNOS表达下降,这不仅使NO合成下降,舒血管能力减弱,而且对ET-1分泌的抑制减弱,促进ET-1合成,引起肺血管收缩和结构的重建,对HPH的形成有重要作用[11]。本研究发现, M 组血中NO、ET-1显著增加,而GEB50组可明显减轻缺氧大鼠肺动脉内皮细胞损伤 ,是通过显著增加血浆中NO2-/NO3-含量,降低ET-1的含量而实现的。

氧自由基(OFR)中肺血管内皮损伤中的作用已受到广泛重视。超氧化物阴离子(O2- )增多,不但可导致急性肺血管收缩[12],也与肺动脉高压的血管增殖有关。SOD作为一种抗氧化酶 ,避免O2-形成的重要细胞防御机制,是反映机体消除氧自由基的能力。本研究观察到, 在慢性缺氧过程中,血中OFR显著增加,表明在缺氧过程中,产生大量的氧自由基, GEB50能显著增加血浆中总SOD活性,提示GEB50可能通过其黄酮甙类化合物分子中含有的还原性羟基功能基团,可直接扑捉和清除体内自由基[13],从而表现出抗氧化、抗自由基和减少对血管内皮损害的作用。MDA常反应体内脂质过氧化的程度,间接反映出细胞损伤的程度。本研究也观察到,在慢性缺氧过程中,缺氧组MDA并发生显著改变,本实验中脂质过氧化参与HPH的形成,尽管用药组没能使MDA的改变有统计学意义,但呈现下降的趋势,表明GBE50在抗脂质过氧化的过程中起着一定的作用。

以上结果提示,GEB50可能通过增加血浆中NO和SOD含量,降低ET含量,并间接减少肺血管内皮损伤,改善肺动脉高压状态,从而影响到慢性阻塞性肺病发生发展的病程过程。本研究为GEB50临床应用防治 COPD 提供了实验依据,对其作用机制还有待进一步深入的研究。

动脉血管内皮损伤 篇2

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物及饲料

辽宁中医药大学实验动物中心引进的封闭群健康新西兰大耳白兔, 微生物控制级别为E级, 体重2.0 kg～2.5 kg,40只, 雌雄不限, 在普通环境中饲养。其中10只为正常对照组, 喂普通饲料, 不施行手术; 30只喂特制的模型饲料, 并施行手术。模型饲料 (基础饲料79%、15%蛋黄粉、猪油5%、胆固醇1%)均由辽宁中医药大学动物实验中心加工。

1.1.2 主要试剂

血小板源生长因子B蛋白(PDGF-B)抗体, SA1020 免疫组化染色试剂盒,由武汉博士德生物公司提供。

1.1.3 主要仪器

SN-695型智能放免γ测量仪,上海原子核研究所日环仪器一厂生产。SANYO MDF-382E超低温冰箱,日本三洋公司生产。恒温水浴箱、Smart View2001生物电泳图像分析软件等。

1.1.4 中药和西药

桃核承气改良方(大黄30 g,芒硝15 g,甘草15 g,肉桂15 g,桃仁15 g,水蛭25 g,金银花20 g),由辽宁中医药大学附属医院中药局提供,药物用水浸泡30 min,先武火再文火煎1 h,倒出药汁,共煎3次,将药汁合并,纱布过滤后100 ℃ 水浴浓缩至100 mL,4 ℃冰箱保存。舒降之(批号:国药准字J20060032,杭州默沙东制药有限公司)每片40 mg,阿司匹林(批号:BTA6015,拜尔药业集团有限公司)100 mg,研磨后,双蒸水溶解,13.5 mL相当含舒降之1.5 mg、阿司匹林3.7 mg,4 ℃冰箱保存。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组

将健康新西兰大耳白兔40只分为模型组、中药组、西药组、空白组,每组10只。

1.2.2 动物造模

30只兔高脂饲料喂养4周造成动脉粥样硬化模型[1] ,然后用25%乌拉坦每0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉,于右侧腹股沟区备皮、消毒、铺巾, 利多卡因少量局部麻醉,切皮拨肉分离股动脉,两动脉夹分别夹住股动脉近心远心两端暴露2 cm左右,剪开动脉周长1/3口,用6F 穿刺针刺破动脉壁,经导丝导入直径(1.5～2.0)mm球囊导管(依血管直径大小而定),至肾动脉下方,盐水充盈球囊,缓慢回拉导管至切口处抽空球囊内液体降至零,重复上述过程3次,间隔5 min 重复1次,达到剥落腹主动脉内皮的目的。撤出导管,结扎股动脉,缝合皮肤,术后3 d连续肌肉注射青霉素每只8×105 U/d,预防感染。

1.2.3 术后喂饲

从内膜剥脱术后第2 天开始每日每只兔喂普通饲料50 g,中药组予桃核承气改良方13.5 mL/kg灌胃4周,西药组予舒降之、阿司匹林混合液13.5 mL/kg灌胃4周,模型组、空白组予生理盐水13.5 mL/kg灌胃4周(给药量按人和动物间体表面积折算的等效剂量比率表计算)。

1.3 病理标本采集与观察

腹主动脉内膜剥脱术后4周处死家兔,切开腹壁暴露腹腔,将肠管翻至一侧,见到腹主动脉与下腔静脉并行于脊柱旁,分离腹主动脉,截取长2 cm腹主动脉用生理盐水冲洗后放于10%的中性甲醛溶液中(-20 ℃)。

1.4 术后指标测定

1.4.1 中药对动脉壁PDGF-B含量影响[2]

取腹主总动脉,制成石蜡切片,3%H2O2灭活内源性酶10 min,加复合酶消化液置8 min,滴加正常山羊血清封闭液置20 min,加PDGF-B链单克隆抗体,4 ℃过夜,次日加生物素化山羊抗鼠/兔IgG,37 ℃反应40 min,滴加试剂SABC,37 ℃反应30 min,显色,脱水,中性树胶封固。新生内膜部位棕黄色颗粒为PDGF-B染色阳性信号。

1.4.2 药物对血管内膜增生的影响

标本脱水、石蜡包埋,切片5 μm HE染色,在SEM2IPS 图像分析系统(日本SONY公司),测量动脉内膜厚度、中膜厚度(μm),计算内膜/中膜厚度比,测定管腔面积、内弹力板围绕面积和外弹力板围绕面积,以内弹力板围绕面积减管腔面积得到新生内膜面积,外弹力板围绕面积减内弹力板围绕面积得到中膜面积(mm2),计算内膜/中膜面积比。每只动物随机选取3张切面分析,取平均值。

1.5 统计学处理

采用SPSS 10.0软件,数据以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示,两组间比较用 q 检验,计数资料率用χ2检验,P<0.05为有统计学意义。图像分析和统计学处理图像经Smartview 2001生物电泳图像分析软件(上海复日科技有限公司)进行处理、分析。

2 结 果

2.1 各组血管内膜和中膜厚度及面积比

中药组和西药组内膜厚度与面积、内膜/中膜厚度比、内膜/中膜面积比与模型组比较显著减少(P<0.05或P<0.01),中药组、西药组间无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

与模型组比较,1)P<0.05,2)P<0.01

2.2 PDGF-B免疫组化结果

PDGF-B免疫组化染色图像分析,阳性颗粒主要表达部位在腹主动脉内膜内皮细胞胞浆,动脉中膜及内皮下的平滑肌细胞胞浆有少量表达。空白组内膜很薄,在腔面只见一层内皮细胞核,内弹性膜呈波浪状,与中膜分界明显;模型组内膜增生严重,内弹力板不连续,内膜增厚处向腔内呈丘状或扁平状隆起,大量平滑肌细胞排列紊乱和大量泡沫细胞积聚;中药组、西药组与模型组比较内皮连续、增生减低。说明桃核承气改良方能使兔腹主动脉内膜损伤后内膜增生减低。

2.3 兔腹主动脉内膜剥脱术后28d各组动脉壁PDGF-B含量

模型组血管壁PDGF-B 含量明显增加,中药组和西药组均使血管壁PDGF-B含量下降,中药组和西药组无统计学意义。详见表2。

pg/mL

与空白组比较,1)P<0.05;与模型组比较,2)P<0.05

3 讨 论

PTCA机械性扩张血管,拓开管壁,是外源性创伤,伤及络脉,造成血行不畅,导致瘀血形成,属血瘀证范畴。《圣济总录·伤折总论》曰:脉者,血之府,血行脉中……若因伤折,内动经络,血行之道,不得宣统,瘀积不散,则为肿为痛。《温热经纬·方论》亦云:“络伤则血不能循行……其伤处即瘀阻,阻久而蓄积,无阳气以化之,乃为死血矣”。陈无择《三因方》所述“金刃所伤”。我国第一代的著名中西医结合心血管病专家廖家祯教授认为PTCA术后再狭窄(RS)从其病理过程与创伤修复相似,辨治当类同于中医修复创伤的治法。其发病理论涉及瘀、痰、虚等多个方面,病机为脏气亏虚为本,痰瘀阻滞为标。因PTCA系为外源性创伤,导致血脉受损,瘀血内停,毒邪壅于局部,与外伤的创伤过程类似,并根据病变局部的感染因素和炎症反应,PTCA术后RS的中医发病机制不单纯是痰瘀和虚,局部特点应为瘀毒互结,兼以正气亏虚。中药治疗理论则主要是活血化瘀、豁痰去浊,兼以扶正等方面,同时针对病变局部瘀毒互结的病机特点治以通下瘀毒,故治疗以“活血化瘀,通下瘀毒兼扶正气”达到防止经皮冠状动脉介入(PCI)术后RS的目的。伤寒方桃核承气汤为基础的改良方是由大黄、芒硝、甘草 肉桂、桃仁、水蛭、金银花组成。大黄破瘀泻热,芒硝泻热软坚,助大黄逐瘀泻热并为君药;桃仁为活血祛瘀之药,与大黄配伍,瘀热并治,水蛭为破血逐瘀之药,金银花芳香疏散,清热解毒共为臣药;肉桂辛散温通,通行气血经脉为佐药,炙甘草入心经,护胃安中,缓诸药峻烈之性,以为使药。该方具有活血化瘀,通下瘀毒兼扶正气之功效,使蓄血去,瘀毒清,诸证平。

现代药理研究证明,桃核承气汤配伍促进了大黄酸的吸收利用, 家兔灌服桃核承气汤后,达峰浓度较灌服单味大黄显著提高,达峰时间也有所提前,有利于桃核承气汤迅速产生抗血栓的作用,灌胃给药后可抑制动物血栓形成和血小板聚集[3]。桃仁的乙酸乙酯提取物在抗血栓作用方面表现较显著[4]。水蛭素是水蛭唾液的提取物之一,是凝血酶的特异性抑制剂。有研究应用120I标记血小板观察了水蛭素对模拟血管成形术后血小板沉积量的影响,结果表明水蛭素组损伤段血小板沉积量与对照组损伤段相比减少了43%[5]。张涛等[6]利用家兔实验性动脉粥样硬化狭窄模型并进行PTCA 术后,饲入水蛭粉,血管造影发现水蛭组动脉内膜血管平滑肌细胞(VSMC)分化较好,细胞内粗面内质网较少,肌丝较多,而对照组VSMC合成型多见含有较多的粗面内质网。提示水蛭有抑制PTCA 术后VSMC增生,减轻内膜增生,降低再狭窄率的作用。肉桂和肉桂醛对氧自由基诱导的自发性高血压大鼠离体主动脉收缩有抑制作用[7],金银花有抑菌、抗炎、抗病毒的作用,能显著降低多种模型小鼠血清胆固醇(TC)及动脉粥样硬化指数,提高高密度脂蛋白、胆固醇含量,保护胰腺B 细胞及弱降糖作用[8]。

PCI治疗冠状动脉狭窄,最佳的心肌再灌注对接受PTCA对急性心肌梗死(AMI)病人生存是重要的[9],术后再狭窄发生率高达10%～20%。Danenberg证实在新生内膜内,巨噬细胞显著增多并且表达多种生长因子,细胞因子和酶参与新生膜的形成[10]。当球囊损伤血管壁的早期,由于内皮细胞受损,基底膜暴露,胶原纤维粘连等和促凝血物质释放入血液,同时多种细胞因子、生长因子和趋化因子分泌增加,从而促进了炎细胞侵入和有害物质的透入,诱发局部病毒感染,进而启动和引起一系列血管损伤和修复反应,引起大量的血小板聚集、黏附、释放。其中大量的PDGF 促使单核巨噬细胞、平滑肌细胞向内膜下迁移、增生,同时产生多种细胞因子和生长因子,再通过自分泌和旁分泌的作用,形成复杂的作用网络,导致局部细胞脂质代谢异常,泡沫细胞形成和细胞基质过量产生,形成动脉粥样硬化特征性斑块,导致再狭窄的发生。PDGF或其受体的特异性阻滞剂能够抑制内膜的增生。任宏生等[10] 实验研究表明西药氯吡格雷可以减轻兔髂腹动脉球囊损伤后血管内膜增生,抑制PDGF表达。本实验表明, 模型组球囊损伤内膜后, 损伤动脉可见有明显的新生内膜形成, 中药组内膜厚度与面积、内膜/中膜厚度比、内膜/中膜面积比较模型组显著减少,桃核承气改良方的通下瘀毒、扶助正气之功效使炎细胞和有害物质不易透入,抑制血小板聚集、黏附及血管平滑肌细胞增殖,使PDGF分泌减少,内膜增生减低,明显抑制管腔狭窄,为中医药防治PCI术后的再狭窄提供了有利有理的实验依据。

参考文献

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血管内皮功能与动脉粥样硬化 篇3

关键词：血管,内皮功能损伤,动脉粥样硬化

近年来研究发现,血管内皮功能损伤参与动脉粥样硬化、高血压及心力衰竭等多种心血管疾病的发生发展。其中,内皮损伤与动脉粥样硬化的发病机制密切相关,对内皮功能紊乱进行干预治疗,已成为防治动脉粥样硬化的重要环节。

1 内皮的正常功能

内皮细胞是指覆盖血管内皮表面的单层扁平细胞,为血液流动提供光滑的内表面,以维持全身血液循环的正常进行。其主要生理功能如下:(1)分泌血管活性物质,调节血管的收缩及舒张功能:例如一氧化氮(NO)、前列环素(PGI2)、内皮素(ET)、血栓素A2(TXA2)及内皮衍生超极化因子(EDHF);(2)维持凝血及纤溶系统之间的动态平衡,例如分泌尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)和组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)以及t-PA和u-PA的抑制剂(PAI);(3)维持血管的增殖平衡,例如ET促血管平滑肌细胞增殖,PGI2和NO抑制增殖;(4)分泌多种黏附分子表达,促进血细胞与内皮细胞的黏附,调节炎症反应;(5)合成和分泌一些生长因子及细胞因子,调节正常的生理功能;(6)具有选择性血管通透屏障作用,维持血管基底膜静息时胶原及糖蛋白的稳定。因此,内皮细胞功能的完整性对于心血管系统正常稳态的维持有着重要的意义。

2 内皮功能的检测

2.1 内皮依赖性舒张功能的评价

(1)肱动脉血流介导的血管扩张功能(FMD):现成为评价内皮功能最常用的无创方法,冠状动脉与其高度相关,可间接反应冠状动脉的内皮功能。操作方法为用袖带阻断肱动脉血流5min后再释放袖带,引起动脉内反应性血流增加,促进NO的释放,导致血管扩张;(2)动脉造影冠脉注入乙酰胆碱(ACH)检测:结果可靠,属有创检查,价格高,临床应用受到限制。ACH是一种内皮依赖性血管扩张剂,当内皮功能正常时,可刺激NO分泌,使局部血管呈舒张状态;当内皮功能障碍时,ACH不能促使NO分泌增加,反面直接作用于血管平滑肌引起血管收藏缩;(3)血管内超声及冠状动脉内多普勒检测:最为可靠,属有创检查,价格高,临床难以大规模推广。利用血管内超声及冠状动脉内多普勒检测血管内活性药物ACH及硝酸甘油前后血流的改变,评价冠状动脉内皮舒张功能的改变。

2.2 动脉弹性检测

动脉弹性又称顺应性,主要反映动脉舒张功能的状态,它取决于动脉腔径大小和血管僵硬度。其下降是动脉粥样硬化的特征性改变,而内皮功能受损导致动脉壁结构和舒缩功能的变化是引起动脉弹性下降的主要原因。因此,动脉弹性可反映内皮功能的重要指标。(1)脉搏波传导速度(PWV):目前经典的检测大动脉弹性的方法。重复性好,但影响因素多,例如年龄、身高、体表面积、血糖及血脂等;(2)脉搏波形分析(PWA):通过桡动脉测定仪测量大动脉弹性指数(容量顺应性,C1)和小动脉弹性指数(振荡顺应性,C2)。动脉粥样硬化者其C1及C2均下降;(3)袖带血压振荡信号分析:通过在测量血压时记录袖带压力振荡信号,并经过转换器产生持续数字信号,电脑根据振荡性压力改变识别出特征性信号。可检测肱动脉顺应性和整个动脉系统总顺应性;(4)超声技术:经食管或体表可观察表浅动脉

2.3 内皮损伤循环标志物检测:(1)NO和ET:动脉粥样硬化患者,NO

水平降低,ET水平升高,提示其内皮受损;(2)t-PA和PAI-1:动脉粥样硬化患者血浆中PAI-1增高,t-PA水平下降,存在血液纤溶活性异常;(3)v WF和P选择素:动脉粥样硬化患者血浆中v WF和P选择素水平增高,曾正相关,为内皮损伤的重要循环标志物。

3 内皮功能损伤的防治

3.1 非药物干预

改变不良的饮食和生活习惯有益于对内皮功能的恢复。例如:忌烟酒、低脂饮食、适度运动、生活规律,均有益于改善内皮功能。

3.2 药物治疗

(1)他汀类药物:对内皮功能有明显改善作用,其机制如下:a)降低血液中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),减少脂质氧化代谢产物对内皮的损害;b)降低内皮细胞超氧化阴离子的产生,上调e NOs的表达,增加NO的生物合成;c)使ET分泌减少,降低氧化低密度脂蛋白刺激细胞膜ET受体合成增加的作用,减弱ET的缩血管效应;(2)血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI):明显改善内皮功能,强于钙通道阻滞剂(CCB)、肾上腺素能β受体阻滞剂和利尿剂;(3)血管紧张素受体阻滞剂(ARB):与ACEI相似,通过抑制angⅡ产生,以产生保护内皮功能;(4)钙通道阻滞剂(CCB):其中二氢吡啶类改善内皮功能的作用更强。CCB改善内皮功能与其抗氧化作用,保护内皮细胞免受氧自由基损害,并使NO破坏减少有关;同时,其可使血小板释放NO增加也起一定作用;(5)肾上腺素能β受体阻滞剂:少数第三代肾上腺素能β受体阻滞剂,如奈必洛尔和卡维地洛能改善内皮功能,增加前臂血流量,可能增加e NOs活性和促进内皮源性NO的释放;(6)利尿剂:双氢克尿噻对内皮功能无改善作用,速尿尚无定论,安体舒通可能有改善内皮功能的作用;(7)抗氧化药物:维生素C维生素E等均有较好的抗氧化作用,对内皮功能有保护作用。其机制可能是清除血管内多种有害的氧化物,抑制脂质过氧化,通过保护谷胱甘肽酶活性来提高NO活性等;(8)阿司匹林:减少血小板膜TXA2生成,使PGI2/TXA2比值升高。PGI2为花生四烯酸的代谢产生,通过激活血管平滑肌细胞内腺苷酸环化酶使c AMP升高面舒张血管,并可抑制血小板聚集和抗血栓形成;而TXA2是强烈的舒张血管因子,并促进血小板聚集。故阿司匹林有一定改善内皮功能的作用;(9)ET受体拮抗剂:可以显著抑制缺血再灌注引起的血管对ACH反应下降,可保护内皮功能。

总之,内皮功能损伤是动脉粥样硬化最重要的发病环节之一,通过深入探讨内皮功能损伤的发生机制,早期检测内皮功能损伤情况,采用药物治疗和非药物干预相结合的策略综合防治内皮功能损伤,将更有利于指导动脉粥样硬化的防治工作。

参考文献

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动脉血管内皮损伤 篇4

关键词：中医药,动脉粥样硬化,内皮功能

动脉粥样硬化 (AS) 是引起心脑血管疾病的首要原因。干预血管内皮功能紊乱成为治疗动脉粥样硬化的新靶点之一。中医药防治动脉粥样硬化是我国的特色与优势, 现就近年来中医药保护动脉粥样硬化血管内皮功能这一领域的研究进行综述。

1 血管内皮功能与动脉粥样硬化

近20多年的研究表明, 血管内皮不是单纯的血管屏障, 而是一个多功能的内分泌器官, 能合成分泌多种生物活性物质, 参与机体复杂功能的调节过程。血管内皮细胞可以产生和分泌几十种生物活性物质。大致可分为:血管收缩因子, 如内皮素 (ET) 、血管紧张素I (AGI) 、血栓素;血管舒张因子, 如一氧化氮 (NO) 、前列腺素 (PGE) 等黏附因子, 如血管细胞黏附因子-1 (VCAM-1) 、细胞间黏附因子 (ICAM) ;生长因子, 如血管内皮生长因子、转化生长因子 (TGF) 、血小板源生长因子 (PDGF) 等;凝血纤溶物质, 如纤溶酶原激活物 (PA) 、VonWillebrand因子 (vWF) 、血小板激活因子 (PAE) 。正常血管内皮细胞能调节血管紧张度及血管结构, 并能分泌抗血小板物质、抗凝和纤溶蛋白、防止细胞 (如中性粒细胞、单核细胞) 向血管壁黏附聚集[1]。内皮功能障碍与动脉粥样硬化的发病机制密切相关, 内皮受损可促进白细胞黏附迁移、脂质沉积、平滑肌细胞增殖、粥样斑块脆性增加与破裂。导致血栓形成, 是诱发多种心血管疾病的共同病理生理基础, 导致AS形成的始动环节。因此, 对内皮功能紊乱进行干预治疗, 已成为防治动脉粥样硬化的重要环节。

2 单味中药

2.1 活血化瘀类中药

彭小春等[2]研究川芎嗪对氧化型低密度脂蛋白 (ox-LDL) 致人内皮细胞ECV304损伤的保护作用及其影响机制, 川芎嗪能显著提高血管内皮细胞抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性, 对ox-LDL诱导的血管内皮细胞诱导的损伤有明显的抑制作用。王立杰等[3]研究发现银杏叶提取物能明显升高AS家兔血NO的及6-酮-前列腺素F1α (6-keto-PGF1α) 水平, 这两种由血管内皮释放的舒张血管物质, 能维持血管舒张性, 抑制血小板黏附, 减轻AS家兔血管损伤, 抑制AS的形成和发展。张艳军等[4]观察丹参水溶性成分丹酚酸B和脂溶性成分丹参酮ⅡA对家兔动脉粥样硬化模型内皮细胞功能的影响, 结果证实, 丹酚酸B能降低AS家兔血浆血栓素B2 (TXB2) 、ET浓度, 增加6-keto-PGF1α浓度, 从而起到保护内皮细胞的效应, 而脂溶性成分丹参酮ⅡA对内皮细胞功能没有明显影响。杨艳秋等[5]采用中药当归提取的主要活性成分阿魏酸钠治疗42例老年冠心病心绞痛患者, 发现阿魏酸钠可通过降低血浆ET水平, 升高NO水平, 改善患者的血管内皮功能。林梅瑟等[6]观察姜黄素对动脉粥样硬化家兔血脂和血管内皮功能的影响, 经治疗后治疗组较对照组血浆TG、TC、LDL-C、HDL-C水平明显改善, PAI-1及PAI-1/t-PA比值下降。提示姜黄素可能通过降低vWF、PAI-1及PAI-1/t-PA水平, 改善血液高凝状态, 保护血管内皮功能。。

2.2 清热类中药

丁辉等[7]将56只大鼠, 随机分为对照组 (C) , 高脂饮食假手术组 (HD) , 肾动脉狭窄组 (RAS) , 肾动脉狭窄高脂饮食组 (HD+RAS) , 实验结果表明, HD组, RAS组, HD+RAS均表现为不同程度的动脉粥样硬化性损伤, 小檗碱对动脉粥样硬化性损伤具有良好的保护作用。谭华炳等[8]研究发现清热解毒中药绞股蓝能降低动脉粥样硬化兔模型血浆ET-1、TG、TC及LDL-C水平, 纠正血管的舒缩功能, 调节脂蛋白代谢。秦俭等[9]实验结果证实虎杖能改善血管内皮依赖性舒张功能, 降低胸主动脉AS斑块面积。刘月丽等[10]研究山苦茶提取物对动脉粥样硬化大鼠血管内皮功能的影响, 结果发现山苦茶提取物B、D通过降低AS大鼠血清丙二醛 (MDA) 水平, 提高NOS、SOD活性, 增加AS大鼠内皮依赖性血管舒张能力。

2.3 补益类中药

李凤娥等[11]采用维生素D3与高脂饲料相结合复制大鼠高脂血症与动脉粥样硬化模型, 人参二醇组皂苷能够降低大鼠血清TC、LDL-C, 人参二醇组皂苷通过降血脂, 保护内皮细胞, 稳定细胞膜作用发挥抗动脉粥样硬化作用。马灵筠等[12]观察枸杞多糖对新西兰兔动脉粥样硬化内皮细胞功能、炎症反应的影响。结果表明, 枸杞多糖组与模型组比较, TG、CRP、NO、ET-1、MDA等指标明显下降, SOD活性明显升高, 主动脉内膜粥样斑块面积明显减少, 具有抗AS作用。曾国安等[13]研究报道, 黄芪多糖可明显降低动脉粥样硬化兔模型血清中TG、MDA、NO、C反应蛋白 (CRP) 、ET-1的含量, 减轻内皮缩血管肽对血管的损伤作用, 提示黄芪多糖具有较好的保护血管内皮细胞的功能。

2.4 其他类中药

殷惠军等[14]通过小牛血清白蛋白损伤血管内皮后, 以高脂饮食喂养建立AS兔模型, 蒺藜总皂苷小剂量、大剂量治疗组血清NO水平与模型组比显著升高, ET水平明显下降, 提示蒺藜总皂苷可通过调节脂质代谢, 减少NO的降解和合成抑制, 抑制ET合成、释放, 提高血清及动脉壁组织NOS的表达, 达到保护血管内皮, 抗AS的作用。杜万红等[15]发现十两茶提取物显著降低高脂诱导的动脉粥样硬化家兔血MDA和非对称二甲基精氨酸 (ADMA) 含量和增加NO水平, 且呈剂量依赖性, 提示十两茶提取物抗动脉粥样硬化的作用, 与抑制脂质过氧化、调节ADMA/NO系统, 改善血管内皮功能有关。张艳慧等[16]研究表明, 蜈蚣通过增加动脉粥样硬化家兔内皮细胞合成NO的能力, 抑制ET的释放, 改善血管内皮细胞功能, 从而起到抗动脉粥样硬化的作用。牛丽颖等[17]通过实验, 发现淡豆豉对早期动脉粥样硬化大鼠血管内皮损伤有明显的保护作用, 其机制可能与调节血管内皮细胞凋亡与增殖的平衡有关。

3 中药复方

3.1 化痰祛瘀类

张来军等[18]研究发现, 通心络胶囊可显著提高冠心病患者血清NO水平和肱动脉FMD, 总有效率达91.8%, 明显高于对照组68.29%。提示其通过抗凝、降低缩血管因子水平, 提高舒血管因子水平, 减少部分细胞黏附分子等途径改善血管内皮功能。曹加潍等[19]报道, 通心络胶囊改善血管内皮功能, 抗AS形成的机制可能与下调CD40及CD40L mRNA的表达有关。刘宁等[20]观察化痰祛瘀汤 (黄芪、党参、丹参、赤芍、茯苓、半夏、菖蒲、川芎、绞股蓝组成) 对动脉粥样硬化家兔血管内皮功能的影响。结果表明, 治疗组主动脉粥样硬化病变及血管内皮功能损伤明显轻于高脂模型组, 血清NO、hs-CRP水平较高脂模型组显著升高, 提示该方可抑制炎症反应, 保护血管内皮功能。裴强等[21]研究发现, 桂枝茯苓胶囊 (桂枝、茯苓、牡丹皮、白芍、桃仁) 可明显升高对动脉粥样硬化模型大鼠血清NO水平;降低血清ET-l及hs-CRP水平, 下调主动脉ICAM-1的表达, 桂枝茯苓胶囊有一定抗AS作用。

3.2 益气活血类

李亚芹等[22]研究表明, 参芍胶囊 (人参、茎叶、皂苷、白芍) 对动脉粥样硬化造成的心肌损害有保护作用, 通过升高动脉粥样硬化大鼠心肌组织中NO、NOS及降低心肌组织中ET及PAI-1水平, 改善血管内皮细胞功能。王楠等[23]证实经益心舒服囊 (人参、麦冬、五味子、黄芪、丹参、川芎、山楂) 及他汀干预后, 实验性动脉硬化兔模型的动脉硬化程度减轻, 血管舒张功能明显改善, 益心舒服囊联合他汀可改善血管内皮功能, 抑制动脉粥样硬化的形成与发展。贾爱明等[24]实验结果表明芪参降脂饮 (黄芪、丹参、当归等) 可明显降低TXB2、TXB2/6-ketoPGF1α/ET, 升高6-keto-PGF1α, 改善血管内皮功能, 防止血栓形成, 进而起到防治AS的作用。王学玲[25]观察80例冠心病患者经芎芍胶囊干预前后肱动脉舒张功能及血清NO、ET、6-kteo-PGF1α、TXB2浓度的变化, 并与对照组比较, 证实了芎芍胶囊可以调控NO/ET的平衡, 改善冠心病患者血管内皮依赖性的舒张功能。

3.3 活血化瘀类

管高峰等[26]观察丹红注射液对动脉粥样硬化家兔模型脂代谢及血管内皮功能的影响, 丹红注射液对实验性AS具有抑制作用, 其作用机制为调节血管内皮细胞生成和释放NO、ET, 保护血管内皮细胞功能, 进而起到抗AS作用。贾运乔[27]研究大黄蛰虫丸动脉粥样硬化的作用, 发现高脂血模型大鼠经大黄蛰虫丸 (熟大黄、黄芩、生地黄、蛰虫、水蛭、蛴螬、虻虫、桃仁、杏仁、芍药、牛膝、甘草) 治疗后, 血清TG、TC、LDL、MDA含量明显降低, SOD活性增高, 与模型组比较血清NO明显升高、ET明显降低;HDL-C升高提示该药能降血脂、抗过氧化、保护血管内皮细胞, 发挥抗动脉粥样硬化的作用。王贵娟等[28]采用高脂血症大鼠模型观察鳖甲煎丸抗动脉粥样硬化的作用, 结果与模型组比较, 鳖甲煎丸组大鼠血清TG、TC、LDL、MDA含量明显降低, SOD活性及HDL-C升高, 证实了鳖甲煎丸 (大黄、桃仁、人参等) 能升高血清NO含量, 降低ET, 调节NO/ET的平衡, 保护血管内皮细胞。

3.4 其他类中药复方

赵书刚等[29]采用连朴饮 (丹参、川黄连、厚朴、山栀、石菖蒲、法半夏、淡豆豉) 治疗湿热夹瘀型动脉粥样硬化患者, 结果发现连朴饮治疗组患者治疗后, 脉粥样硬化指数 (AIP) 明显改善, 血清ET明显下降、NO明显上升。提示该方能维持舒张和收缩血管的NO、ET的平衡, 保护血管内皮功能, 防止血管发生粥样硬化。郭来等[30]采取高脂饲料加静脉注射小牛血清方法 (免疫损伤) 制作兔动脉粥样硬化模型, 发现模型组血管内皮细胞及平滑肌细胞ET-1mRNA的表达上调, 复方莶草合剂能从基因转录和翻译水平对ET-1 mRNA进行调节, 减少ET的生成。焦宏等[31]研究桂枝汤对动脉粥样硬化大鼠模型血脂和血管内皮活性因子的影响, 发现桂枝汤可降低血脂和血管内皮活性因子。吴智春等[32]观察清热解毒经方金匮泻心汤的抗动脉粥样硬化作用的动物实验, 该方具有调脂、抗氧化、影响NO代谢、保护动脉内皮细胞等作用。赵添成[33]研究搜风祛痰中药活心汤对AngⅡ诱导人脐静脉内皮细胞NF-κBmRNA及iNOSmRNA表达的影响, 结果发现活心汤可抑制AngⅡ导致的内皮细胞损伤, 减少NF-κBmRNA及iNOSmRNA的表达, 保护血管内皮功能。

4 结语

动脉血管内皮损伤 篇5

1 血管内皮生长因子的功能

VEGF是通过膜受体介导而实现生物学功能的。VEGF具有自身特异性受体 (VEGFR) , 在血管内皮细胞, VEGF与特异性VEGFR结合而发挥功能, 其功能主要是促进内皮细胞增殖、分化, 增加微血管的通透性及诱导血管发生。VEGF有六个等型:VEGF-A、-B、-C、-D及-E;每个等型的VEGF特异性地与3个具有相关特异性受体VEGFR-1、-2及-3特定组合相结合而发挥相应的作用。

2 VEGF在肺内的表达

VEGF主要在胚胎肺、肾和视网膜中表达。有研究者在人类胚胎的肺 (体外培养45d) 中检测到了血管内皮生长因子蛋白和mRNA, 这可能有利于人类肺毛细血管的发育。Boussat等在正常成人肺的原始和已转化的肺泡上皮细胞 (AEC) 中, 利用免疫组化方法和蛋白印迹技术检测到了VEGF基因的表达。

3 VEGF在急性肺损伤中的双重作用

A L I和A R D S共有的病理特点是高渗透性肺水肿 (H P P E) 的形成。正常的肺组织是由肺泡上皮细胞和微血管内皮发挥着屏障作用, 由于直接肺损伤 (气道损伤) 或间接肺损伤 (毛细血管损伤) , 保护性屏障被阻断, 含有丰富蛋白的体液大量滤出, 形成高渗透性肺水肿 (HPPE) 。ALI的病理过程是由毛细血管内皮细胞 (间接性损伤) 和肺泡上皮细胞损伤以及随后的修复反应组成的。VEGF在ALI发生时自身及其特异性VEGFR都发生着显著的变化, 分别在早期促进增加肺的通透性和恢复期刺激肺泡细胞存活上发挥重要作用, 分述如下。

3.1 VEGF参与ALI早期高通透性肺水肿形成

VEGF的分泌与表达受多种因素的影响, 国内外学者研究发现TNF-α、IL-1β和IL-6可以诱导VEGF合成, 急性HPPE时检查血清中IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8细胞因子浓度水平明显升高, 推测这些细胞因子促进急性肺损伤中VEGF的过表达, 进而促肺水肿形成。各种原因引起的ALI如气管内注射盐酸、高潮气量机械通气及各种原因致缺氧时均可见血浆VEGF水平显著升高, 肺泡毛细血管通透性增加, 形成肺水肿。

3.2 VEGF促进ALI恢复期肺细胞存活ALI时, 肺水肿的一个基本条件

是毛细血管内皮细胞屏障完整性丢失, 但渗透性肺水肿的决定性因素是肺泡上皮细胞完整性被破坏。VEGF的作用方式有旁分泌 (作用于血管床外) 和自分泌 (作用于上皮细胞) 两种形式。在损伤的血管内皮细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞上VEGF发挥着保护性细胞因子的作用。已经明确VEGF是肺泡内皮细胞生存因子, 研究证实ARDS患者肺实质中VEGF减少引起肺血管内皮细胞死亡。

3.3 VEGF双重作用的相互转化

近年来, 多项研究表明, VEGF在ALI及ARDS发病机制中发挥着双重作用, 早期, 由于肺损伤引起多种细胞因子的增加, 从而引起VEGF的过表达, VEGF水平升高, 促进肺通透性增加, 加速了炎症反应的发生。引起高渗性肺水肿。肺内上皮细胞进一步坏死。VEGF自身受体减少, 作用发挥受到限制, 进入到了ALI恢复期, 炎症反应逐渐被控制, 可能与VEGF减少有关, 目的在于降低内皮细胞的通透性, 减轻炎症反应。

关键词：急性肺损伤,血管内皮生长因子

参考文献

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动脉血管内皮损伤 篇6

关键词：杞菊地黄丸,血管内皮细胞损伤,AngⅡ,高血压病

原发性高血压是以体循环动脉压增高为主要表现的一类疾病,其发病机制目前尚未完全明确。近年来研究表明,血管内皮细胞受损、内皮功能失调在高血压病的发生发展中起重要作用,高血压病患者的内皮功能均存在不同程度的异常[1]。多种因素可导致内皮细胞损伤,其中肾素-血管紧张素系统(RAAS),尤其是局部RAAS所产生的AngⅡ起着重要的病理生理作用[2]。

中医学认为高血压病的基本病机为本虚标实,其中肾虚是根本。采用益肾法治疗高血压病,可以明显改善患者的临床症状,取得较好的疗效。有实验和临床研究证实[3,4,5],益肾法能够保护血管内皮细胞,防治和减轻高血压病血管内皮细胞损伤的效果显著。课题组前期在益肾法对自发性高血压大鼠(SHR)肾保护作用的研究中发现:益肾中药复方可通过改善SHR的肾血流量,改善肾血管重塑,并降低血压,尤其以滋补肾阴的杞菊地黄丸的降压作用更为明显[6]。为了进一步明确杞菊地黄丸的降压机制,本研究拟通过采用AngⅡ诱导人脐静脉内皮细胞损伤,建立细胞损伤模型,应用电子显微镜观察杞菊地黄丸对内皮细胞超微结构的影响,从细胞、分子水平探讨杞菊地黄丸对血管内皮细胞的保护作用,为临床提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

24只清洁级Wistar大鼠,体重(250±20)g,雌性(购自中国医学科学院实验动物研究所,许可证编号:SCXK(京)2005-0013),饲养在清洁级动物房,正常光照条件,食、水可自由摄取,室温控制在(18～22)℃之间。

1.2 实验细胞

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(购自南京凯基生物科技发展有限公司),由本实验室复苏、传代保存。

1.3 药品与试剂

完全RPMI-1640培养液(含10%小牛血清,抗青链霉素)、不完全RPMI-1640培养液、青链霉素混合液、0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化液(南京凯基生物科技发展有限公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);杞菊地黄丸(浓缩丸)(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂,生产批号:9071151);兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.4 实验仪器

恒温CO2培养箱(英国RS Biotech公司);相差倒置显微镜(北京欣惠泽奥科技有限公司);超净工作台(天津泰斯特仪器有限公司);离心机(上海安亭科学仪器厂);电子显微镜(北京恩环泰科技发展有限公司)。

2 方法

2.1 含药血清制备

2.1.1 实验分组

将大鼠24只随机分成两组:空白组、杞菊地黄丸组。

2.1.2 给药方法及剂量

将配制好的杞菊地黄丸药液(0.15g/ml)按每只每日2ml/100g体重(相当于60kg体重成年人每日临床剂量的20倍)分上、下午2次给大鼠灌胃,空白组给予同体积的生理盐水,连续给药4天。

2.1.3 含药血清制备与保存

末次给药2小时后无菌条件下取血,血液静置4h,待血清析出后,3 000rpm/min离心20min分离血清。将同种条件的血清混匀,56℃30min灭活,0.22μm微孔滤膜除菌后分装,-20℃冻存。

2.2 细胞培养与鉴定

2.2.1 细胞培养

将人脐静脉内皮细胞接种至25cm2培养瓶中,加入含10%胎牛血清的完全RPMI-1640培养液(6～8)ml,置CO2培养箱中于37℃、5%CO2、完全饱和湿度条件下培养,每48h换液1次,至细胞长满瓶底后即可传代。当细胞传至第3代时进行实验。

2.2.2 细胞鉴定

采用兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒。

2.3 实验分组与处理因素

2.3.1 分组将培养好的细胞分成4组:

正常对照组、AngⅡ损伤组、AngⅡ损伤+空白血清组、AngⅡ损伤+杞菊地黄丸血清组。

2.3.2 加药正常对照组:

加不完全RPMI-1640培养液(含20%小牛血清及青链霉素);AngⅡ损伤组:加不完全RPMI-1640培养液(含20%小牛血清及青链霉素)、AngⅡ(终浓度为10-6mol/L);各血清组:预先加不完全RPMI-1640培养液(不含小牛血清,含青链霉素)、AngⅡ(终浓度为10-6mol/L),30min后再加入各含药血清(终浓度为20%)。

2.4 检测指标

电子显微镜观察细胞超微结构将细胞以(1×105)/ml浓度接种于25cm2培养瓶中。待细胞长至60-70%融合状态时吸弃培养液并加药。加药24h后,吸弃培养液,并用0.1mol/L PBS(pH7.2～7.4)洗细胞2次。培养瓶中留少量PBS液,用细胞刮刮取细胞,收集至1.5ml离心管中。800rpm/min离心5min,去上清,加入用0.1mol/L PBS(pH7.2～7.4)稀释的2.5%戊二醛固定液100μl,4℃固定。按常规方法,制作超薄切片,电子显微镜下观察、摄片。

3 结果

透射电镜观察结果正常对照组细胞胞浆内可见内质网呈扁平囊状、线粒体呈棒状,胞核明显(见图1)。AngⅡ损伤组细胞胞浆内可见内质网扩张,线粒体肿胀呈圆形或椭圆形,线粒体嵴模糊甚至消失,细胞明显受损(见图2)。AngⅡ损伤+空白血清组细胞胞浆内可见内质网扩张,线粒体肿胀,损伤特征同AngⅡ损伤组(见图3)。AngⅡ损伤+杞菊地黄丸血清组细胞胞浆内可见内质网呈扁平囊状,线粒体呈棒状,结构基本正常(见图4)。

4 讨论

AngⅡ是引起高血压、动脉硬化等心血管疾病内皮细胞损伤的重要因素之一,其损伤机制目前公认的有以下几方面:AngⅡ可促进内皮细胞表达单核细胞化学吸引蛋白1型(MCP-1)、Ⅰ型细胞间粘附分子(ICAM-1)、白细胞介素6(IL-6)等因子,加重内皮细胞的炎症反应[7];激活内皮细胞膜表面的NADH/NADPH氧化酶,产生大量活性氧(ROS),导致内皮细胞发生氧化应激[8],改变内皮细胞的氧化/还原状态[9];通过其受体激活蛋白激酶C等途径,诱导内皮细胞凋亡[10]等。

益肾法是临床治疗高血压、冠心病等心血管疾病的常用治法,大量实验和临床研究均证实[3,4,5]益肾法能够保护血管内皮细胞,防治和减轻内皮细胞损伤。课题组前期研究发现益肾中药杞菊地黄丸降低SHR收缩压的作用明显,为进一步从细胞水平评价杞菊地黄丸对血管内皮细胞的保护作用,初步探讨其可能作用机制,本研究以AngⅡ诱导人脐静脉内皮细胞损伤为实验模型,采用杞菊地黄丸干预内皮细胞,对内皮细胞超微结构进行了观察。

电子显微镜观察结果显示:AngⅡ作用于血管内皮细胞后,与正常对照组细胞相比,细胞超微结构发生明显改变,具体表现为线粒体肿胀、内质网扩张。线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所,是对各种损伤最为敏感的细胞器之一,在细胞损伤时最常见的改变为线粒体肿大。其肿胀可由多种损伤因子引起,其中最常见的为缺氧。内质网是参与细胞钙稳态、蛋白质合成和凋亡调节的重要细胞器,在由各种原因引起的细胞变性和坏死过程中,粗面内质网的池一般出现扩张。本实验中线粒体和内质网出现肿胀、扩张,提示内皮细胞受到损伤。杞菊地黄丸血清干预后,线粒体肿胀、内质网扩张程度明显减轻,提示杞菊地黄丸对受损细胞有一定的保护作用。我们推测其机制可能是益肾中药杞菊地黄丸通过发挥一定的抗氧化作用,减轻了由AngⅡ引起的内皮细胞氧化损伤,从而对细胞超微结构发挥了一定的保护作用。

总之,本实验的初步研究结果表明:滋补肾阴的杞菊地黄丸对内皮细胞的线粒体、内质网等超微结构具有一定的保护作用,至于其具体作用机制,今后还需要进一步深入研究。

参考文献

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动脉血管内皮损伤 篇7

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与药物

8周龄雄性载脂蛋白E基因敲除 (apoE-KO) 小鼠24只, 同种属C57BL/6J小鼠8只, SPF级, 均购自北京大学医学部实验动物中心, 动物许可证SCXK (京) 2006-0008。TPNS粉末购自山东省药品检验所。辛伐他汀片 (舒降之, 杭州默沙东制药生产, 批号H10970385) 。

1.1.2 仪器与试剂

紫外分光光度仪 (Beckman counter DU800, America) ;酶标仪 (DV800, Bechman, America) ;全自动生化分析仪 (Hitachi 917Roche Diagnostics, Germany) ;Tgradient96型PCR热循环仪 (Whatman Biometra, Germany) ;LightCycler型荧光实时定量PCR系统 (Roche Diagnostics, Germany) 。主要试剂:氧化修饰的低密度脂蛋白ELISA测定试剂盒 (E0527m) ;Trizol、Oligo dT和dNTP购自Invitrogen公司;M-MLV购自Promega公司;荧光实时定量PCR试剂盒购自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及给药

apoE-KO小鼠给予高脂饮食喂养 (15%脂肪, 0.25%胆固醇, 84.75%的基础饲料) 。12周后, 随机分为模型组、三七总皂苷组、辛伐他汀组, 每组8只。三七总皂苷组给予TPNS 60mg/kg灌胃, 1次/日;辛伐他汀组给予辛伐他汀3.3mg/kg灌胃, 1次/日;模型组给予生理盐水0.2mL灌胃, 1次/日;灌胃时间为8周。C57BL/6J小鼠给予正常饲料, 作为正常对照组, 给予生理盐水0.2mL灌胃8周。

1.2.2 透射电镜观察

剪取长约1mm主动脉弓, 3%戊二醛前固定, 0.2mol/L磷酸缓冲液冲洗3次, 1%四氧化锇固定2h, 0.2mol/L磷酸缓冲液再冲洗3次, 梯度乙醇脱水, 环氧树脂包埋, 制成超薄组织切片, 醋酸双氧铀和柠檬酸铅溶液染色, 置于铜网上, 在H-7000FA透射电子显微镜下60-80kV加速电压, 6 000~20 000放大倍率, 观察动脉壁内皮细胞的超微结构变化, 选取典型视野拍照。

1.2.3 血清oxLDL检测

小鼠麻醉后摘眼球取血1mL, 4℃3 000r/min离心15min, 分离血清。采用ELISA法测定血清oxLDL浓度。

1.2.4 总RNA提取及cDNA合成

取约1cm冻存的胸主动脉, 用紫外分光光度仪测OD260/OD280, 所有标本该值均在1.7~2.0。用Oligo dT、dNTP和M-MLV在PCR热循环仪上将RNA逆转录为cDNA, 反应条件为42℃60 min, 95℃5min。

1.2.5 荧光实时定量RT-PCR检测CD40、VCAM-1的mRNA含量

小鼠CD40、VCAM-1与内参基因β-actin引物由上海博亚公司 (Bio Asia) 合成, 引物序列为:CD40 (157bp) 上游GC-TATGGGGCTGCTTGTTGA;下游ATGGGTGGCATT-GGGTCTTC。VCAM-1 (157bp) 上游5’-TGCCGGCATA-TACGAGTGTGA-3’;下游5’-CCCGATGGCAGGTATTAC-CAAG-3’。β-actin (171bp) 上游5’-CATCCGTAAAGACCTC-TATGCCAAC-3’;下游5’-ATGGAGCCACCGA-TCCACA-3’。反应体系:cDNA 1μL, 上下游引物各1μL, SYBR GreenI10μL, 加无菌双蒸水至20μL。反应条件:95℃预变性10s, 57℃ (CD40) 、55℃ (VCAM-1) 、54℃ (β-actin) 退火5s, 72℃延伸10s, 共45个循环, 最后40℃30s结束反应。采用Livak等[3]报道的2-ΔΔCT方法对CD40、VCAM-1的mRNA表达进行相对定量分析, VCAM-1的扩增倍数用比正常野生型C57BL/6J小鼠基因扩增的增高倍数表示。

1.3 统计学处理

计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 组间差异采用独立样本t检验。使用SPSS11.5软件。

2 结果

2.1 血清oxLDL含量变化

模型组oxLDL与正常组相比明显增高 (16.06ng/mL±4.16ng/mL vs 1.43ng/mL±0.84ng/mL, P<0.001) 。与模型组相比, TPNS及辛伐他汀治疗后均明显降低apoE-KO小鼠血清oxLDL含量 (16.06ng/mL±4.16ng/mL vs 4.45ng/mL±1.25ng/mL, 3.92ng/mL±1.99ng/mL, P<0.001) 。

2.2 主动脉内皮细胞超微结构改变

正常VEC为单层扁平细胞, 连续性好, 胞膜平整, 胞浆均匀, 紧贴内弹性膜, 线粒体形态结构正常。内弹性膜连续, 厚度均匀。模型组VEC可见细胞核固缩, 有明显的内皮细胞脱落现象, 并可见内皮细胞凋亡。胞核固缩, 核内异染色质明显增多, 边集于核膜下, 线粒体空泡化, 脊肿胀、溶解。三七总皂苷组、辛伐他汀组与模型组相比, VEC形态有不同程度的改善, 胞浆内可见微丝及吞饮小泡, 胞核内染色质相对均匀, 线粒体数目略增多, 形态结构基本正常, 内皮连续无中断。内弹性膜连续, 厚度均匀。

2.3 VCAM-1mRNA表达结果

模型组VCAM-1的mRNA表达较正常增高了7.65倍, TPNS干预组VCAM-1的mRNA表达下降至正常的4.38倍, 辛伐他汀组下降至正常的3.11倍, 差异有统计学意义 (P<0.001) 。

2.4 CD40mRNA表达结果

模型组CD40的mRNA表达较正常增高了54.15倍, TPNS干预组CD40的mRNA表达下降至正常的15.52倍, 辛伐他汀组下降至正常的16.19倍, 其差异有统计学意义 (P<0.001) 。

3 讨论

血管内皮细胞层不仅是血液与组织间的屏障, 而且是十分活跃的代谢及内分泌器官, VEC结构和功能的改变在心血管疾病的发生发展中起十分重要的作用。近年来, Ross提出的“损伤反应”学说认为, VEC的损伤和功能失调是AS发生的始动环节。oxLDL导致的内皮功能障碍在AS的病理过程中起关键作用。oxLDL具有细胞毒性, 可引起内皮细胞结构及形态损伤, 而且能够降低内皮细胞的抗纤溶活性和舒血管功能[4]。oxLDL还能够诱导内皮细胞表达多种黏附分子, 增强单核细胞和T淋巴细胞的黏附及向内膜下移行, 促进泡沫细胞的形成及AS斑块的发生发展。同时, oxLDL可刺激多种炎症因子如肿瘤坏死因子-α、白介素-1、白介素-8等的表达, 加速AS炎症反应[5,6]。

本研究用电镜观察小鼠主动脉内皮超微结构, 正常小鼠主动脉内皮光滑完整, 而动脉粥样硬化小鼠的主动脉内皮细胞有不同程度的损伤。模型组小鼠血清oxLDL水平明显高于正常组, 三七总皂苷组小鼠血清oxLDL水平有显著降低, 提示三七总皂苷可通过降低apoE-KO小鼠血清oxLDL水平保护血管内皮。

CD40属于肿瘤坏死因子受体超家族成员。AS斑块及培养的人VECs、VSMCs、M均可表达CD40及其配体CD40L, 并且oxLDL可促进CD40、CD40L的表达[7]。CD40与其配体结合后可诱导VECs, VSMCs表达黏附分子如VCAM-1、细胞间黏附分子-1、E-选择素等, 诱使免疫成分细胞黏附到血管壁[8]。并且还可以促进VECs, T细胞表达和释放化学因子如白介素-6、巨噬细胞炎性蛋白-1和单核细胞趋化因子-1等, 吸引和支配T细胞、M到AS斑块内, 维持慢性炎性反应, 促进AS斑块的发展[9]。本研究中, 模型组小鼠主动脉CD40基因有明显的表达, 这与以往的研究相符。三七总皂苷组小鼠主动脉CD40的基因表达水平显著降低, 这可能与三七总皂苷降低oxLDL的水平有关。

VCAM-1是一种重要的细胞黏附分子, 属免疫球蛋白超家族成员, 又称诱导性细胞黏附分子。VCAM-1通过与配体相互作用参与T细胞-T细胞、T细胞-基质杀伤细胞-靶细胞之间的相互作用, 与炎症免疫反应密切相关[10,11]。VCAM-1可在多种促炎因子刺激的VECs, VSMCs中表达[12], 用基因敲除或抗体阻断VCAM-1的表达可降低单核细胞向内皮细胞的黏附, 延缓AS进程[13,14]。本研究结果显示, 模型组小鼠主动脉VCAM-1的表达明显高于正常组, 三七总皂苷组小鼠主动脉VCAM-1的表达较模型组显著降低, 提示长期口服三七总皂苷可降低apoE-KO小鼠的主动脉VCAM-1的表达, 抑制AS中免疫相关细胞的黏附, 从而延缓AS的进展。

摘要：目的 探讨三七总皂苷对动脉粥样硬化主动脉内皮的保护作用。方法 载脂蛋白E基因敲除 (apoE-KO) 小鼠随机分为模型组、三七总皂苷组和辛伐他汀组, 同种属C57BL/6J小鼠作为正常对照组。应用ELISA法测定小鼠血清氧化型低密度脂蛋白 (oxLDL) 含量, 透射电镜观察小鼠主动脉内皮细胞的超微结构。实时定量RT-PCR检测小鼠主动脉细胞分化抗原40 (CD40) 、血管细胞黏附分子-1 (VCAM-1) mRNA表达水平。结果 apoE-KO小鼠的主动脉内皮和正常相比明显肿胀, 连续性中断, 可见细胞凋亡, 胞核固缩, 核内异染色质明显增多, 线粒体空泡化。用药组内皮结构有不同程度的改善。与模型组相比, apoE-KO小鼠血清oxLDL水平显著升高 (16.06ng/mL±4.16ng/mL vs 1.43ng/mL±0.84ng/mL, P<0.001) , 三七总皂苷及辛伐他汀均可显著降低apoE-KO小鼠血清oxLDL水平 (4.45ng/mL±1.25ng/mL, 3.92ng/mL±1.99ng/mL, P<0.001) 。结论 三七总皂苷对动脉粥样硬化小鼠血管内皮具有保护作用, 其机制与降低血清oxLDL水平, 下调主动脉CD40及VCAM-1的基因表达水平有关。