血管内皮细胞损伤

血管内皮细胞损伤（精选8篇）

血管内皮细胞损伤 篇1

摘要：目的:观察杞菊地黄丸对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导损伤的血管内皮细胞超微结构的影响。方法:采用AngⅡ诱导人脐静脉内皮细胞损伤为实验模型。分别设立正常对照组、AngⅡ损伤组、AngⅡ损伤+空白血清组、AngⅡ损伤+杞菊地黄丸血清组。采用电子显微镜观察细胞形态结构。结果:电子显微镜观察结果显示,AngⅡ损伤+杞菊地黄丸血清组血管内皮细胞超微结构损伤程度明显低于AngⅡ损伤组和AngⅡ损伤+空白血清组。结论:益肾中药杞菊地黄丸对高血压病血管内皮细胞损伤具有一定的保护作用。

关键词：杞菊地黄丸,血管内皮细胞损伤,AngⅡ,高血压病

原发性高血压是以体循环动脉压增高为主要表现的一类疾病,其发病机制目前尚未完全明确。近年来研究表明,血管内皮细胞受损、内皮功能失调在高血压病的发生发展中起重要作用,高血压病患者的内皮功能均存在不同程度的异常[1]。多种因素可导致内皮细胞损伤,其中肾素-血管紧张素系统(RAAS),尤其是局部RAAS所产生的AngⅡ起着重要的病理生理作用[2]。

中医学认为高血压病的基本病机为本虚标实,其中肾虚是根本。采用益肾法治疗高血压病,可以明显改善患者的临床症状,取得较好的疗效。有实验和临床研究证实[3,4,5],益肾法能够保护血管内皮细胞,防治和减轻高血压病血管内皮细胞损伤的效果显著。课题组前期在益肾法对自发性高血压大鼠(SHR)肾保护作用的研究中发现:益肾中药复方可通过改善SHR的肾血流量,改善肾血管重塑,并降低血压,尤其以滋补肾阴的杞菊地黄丸的降压作用更为明显[6]。为了进一步明确杞菊地黄丸的降压机制,本研究拟通过采用AngⅡ诱导人脐静脉内皮细胞损伤,建立细胞损伤模型,应用电子显微镜观察杞菊地黄丸对内皮细胞超微结构的影响,从细胞、分子水平探讨杞菊地黄丸对血管内皮细胞的保护作用,为临床提供实验依据。

1 材料

1.1 实验动物

24只清洁级Wistar大鼠,体重(250±20)g,雌性(购自中国医学科学院实验动物研究所,许可证编号:SCXK(京)2005-0013),饲养在清洁级动物房,正常光照条件,食、水可自由摄取,室温控制在(18～22)℃之间。

1.2 实验细胞

人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(购自南京凯基生物科技发展有限公司),由本实验室复苏、传代保存。

1.3 药品与试剂

完全RPMI-1640培养液(含10%小牛血清,抗青链霉素)、不完全RPMI-1640培养液、青链霉素混合液、0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)消化液(南京凯基生物科技发展有限公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);杞菊地黄丸(浓缩丸)(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂,生产批号:9071151);兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.4 实验仪器

恒温CO2培养箱(英国RS Biotech公司);相差倒置显微镜(北京欣惠泽奥科技有限公司);超净工作台(天津泰斯特仪器有限公司);离心机(上海安亭科学仪器厂);电子显微镜(北京恩环泰科技发展有限公司)。

2 方法

2.1 含药血清制备

2.1.1 实验分组

将大鼠24只随机分成两组:空白组、杞菊地黄丸组。

2.1.2 给药方法及剂量

将配制好的杞菊地黄丸药液(0.15g/ml)按每只每日2ml/100g体重(相当于60kg体重成年人每日临床剂量的20倍)分上、下午2次给大鼠灌胃,空白组给予同体积的生理盐水,连续给药4天。

2.1.3 含药血清制备与保存

末次给药2小时后无菌条件下取血,血液静置4h,待血清析出后,3 000rpm/min离心20min分离血清。将同种条件的血清混匀,56℃30min灭活,0.22μm微孔滤膜除菌后分装,-20℃冻存。

2.2 细胞培养与鉴定

2.2.1 细胞培养

将人脐静脉内皮细胞接种至25cm2培养瓶中,加入含10%胎牛血清的完全RPMI-1640培养液(6～8)ml,置CO2培养箱中于37℃、5%CO2、完全饱和湿度条件下培养,每48h换液1次,至细胞长满瓶底后即可传代。当细胞传至第3代时进行实验。

2.2.2 细胞鉴定

采用兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒。

2.3 实验分组与处理因素

2.3.1 分组将培养好的细胞分成4组:

正常对照组、AngⅡ损伤组、AngⅡ损伤+空白血清组、AngⅡ损伤+杞菊地黄丸血清组。

2.3.2 加药正常对照组:

加不完全RPMI-1640培养液(含20%小牛血清及青链霉素);AngⅡ损伤组:加不完全RPMI-1640培养液(含20%小牛血清及青链霉素)、AngⅡ(终浓度为10-6mol/L);各血清组:预先加不完全RPMI-1640培养液(不含小牛血清,含青链霉素)、AngⅡ(终浓度为10-6mol/L),30min后再加入各含药血清(终浓度为20%)。

2.4 检测指标

电子显微镜观察细胞超微结构将细胞以(1×105)/ml浓度接种于25cm2培养瓶中。待细胞长至60-70%融合状态时吸弃培养液并加药。加药24h后,吸弃培养液,并用0.1mol/L PBS(pH7.2～7.4)洗细胞2次。培养瓶中留少量PBS液,用细胞刮刮取细胞,收集至1.5ml离心管中。800rpm/min离心5min,去上清,加入用0.1mol/L PBS(pH7.2～7.4)稀释的2.5%戊二醛固定液100μl,4℃固定。按常规方法,制作超薄切片,电子显微镜下观察、摄片。

3 结果

透射电镜观察结果正常对照组细胞胞浆内可见内质网呈扁平囊状、线粒体呈棒状,胞核明显(见图1)。AngⅡ损伤组细胞胞浆内可见内质网扩张,线粒体肿胀呈圆形或椭圆形,线粒体嵴模糊甚至消失,细胞明显受损(见图2)。AngⅡ损伤+空白血清组细胞胞浆内可见内质网扩张,线粒体肿胀,损伤特征同AngⅡ损伤组(见图3)。AngⅡ损伤+杞菊地黄丸血清组细胞胞浆内可见内质网呈扁平囊状,线粒体呈棒状,结构基本正常(见图4)。

4 讨论

AngⅡ是引起高血压、动脉硬化等心血管疾病内皮细胞损伤的重要因素之一,其损伤机制目前公认的有以下几方面:AngⅡ可促进内皮细胞表达单核细胞化学吸引蛋白1型(MCP-1)、Ⅰ型细胞间粘附分子(ICAM-1)、白细胞介素6(IL-6)等因子,加重内皮细胞的炎症反应[7];激活内皮细胞膜表面的NADH/NADPH氧化酶,产生大量活性氧(ROS),导致内皮细胞发生氧化应激[8],改变内皮细胞的氧化/还原状态[9];通过其受体激活蛋白激酶C等途径,诱导内皮细胞凋亡[10]等。

益肾法是临床治疗高血压、冠心病等心血管疾病的常用治法,大量实验和临床研究均证实[3,4,5]益肾法能够保护血管内皮细胞,防治和减轻内皮细胞损伤。课题组前期研究发现益肾中药杞菊地黄丸降低SHR收缩压的作用明显,为进一步从细胞水平评价杞菊地黄丸对血管内皮细胞的保护作用,初步探讨其可能作用机制,本研究以AngⅡ诱导人脐静脉内皮细胞损伤为实验模型,采用杞菊地黄丸干预内皮细胞,对内皮细胞超微结构进行了观察。

电子显微镜观察结果显示:AngⅡ作用于血管内皮细胞后,与正常对照组细胞相比,细胞超微结构发生明显改变,具体表现为线粒体肿胀、内质网扩张。线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所,是对各种损伤最为敏感的细胞器之一,在细胞损伤时最常见的改变为线粒体肿大。其肿胀可由多种损伤因子引起,其中最常见的为缺氧。内质网是参与细胞钙稳态、蛋白质合成和凋亡调节的重要细胞器,在由各种原因引起的细胞变性和坏死过程中,粗面内质网的池一般出现扩张。本实验中线粒体和内质网出现肿胀、扩张,提示内皮细胞受到损伤。杞菊地黄丸血清干预后,线粒体肿胀、内质网扩张程度明显减轻,提示杞菊地黄丸对受损细胞有一定的保护作用。我们推测其机制可能是益肾中药杞菊地黄丸通过发挥一定的抗氧化作用,减轻了由AngⅡ引起的内皮细胞氧化损伤,从而对细胞超微结构发挥了一定的保护作用。

总之,本实验的初步研究结果表明:滋补肾阴的杞菊地黄丸对内皮细胞的线粒体、内质网等超微结构具有一定的保护作用,至于其具体作用机制,今后还需要进一步深入研究。

参考文献

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[4] 周涛.补肾活血中药对实验性血瘀证大鼠内皮细胞功能的影响[J].中华中医药学刊,2007;25(9) :291～293

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血管内皮细胞损伤 篇2

【关键词】肺肿瘤；肺上皮样血管内皮细胞瘤;病理学；免疫组织化学

【中国分类号】R734.2【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）11-0019-02

【Abstract】Objective: To study the clinical and pathological characteristics, diagnosis and differential diagnosis of pulmonary epithelioid hemangioendothelioma(PEH). Methods: Analyze the clinical manifestations, pathological morphology and immunohistochemical features of PEH after diagnosing three cases and reviewing some literatures. Results: Three cases were middle-aged female. The gross presentation was solitary or multiple nodules in lung. Histologically, the tumors were characterized by oval to round nodulous proliferation, mucocartilagnoid background, centrol hypercellular and sclerotic area, peripheral hypocellular area, invasion to adjacent bronchiole and alveolar. Oval to round epithelioid cells with intracytoplasmic vacuoles, signet-ringoid sometimes, suggested the formation of single-cell vascular, the characteristic of epithelioid hemangioendothelioma. The tumor cells were strongly positive for factorVⅢ, CD31, CD34 and vimentin, negative for TTF-1, CK(pan) and EMA. Conclusion: PEH is a rare low/medium-grade m alignant tumor. Surgery is the main therapy, supplemented by radiotherapy and chemotherapy.

【Key words】lung tumor ；pulmonary epithelioid haemangioendothelioma；pathology；immunohistochemistry

肺上皮样血管内皮细胞瘤（pulmonary epithelioid haemangioendothelioma ，PEH）是一种罕见类型的肺脏肿瘤、发病率低 。临床上常常误诊、漏诊，病理诊断有一定困难。PEH病例国内外报道不多［1］。本文总结我院近年来诊治的3例PEH，并复习相关文献。报告如下。

1 福建省立医院病理科

1 临床资料 :例1：女性,50岁，无明显诱因持续胸闷、咳嗽2个多月，无咳痰、咳血；CT提示左肺上、下叶及壁层胸膜有多发性结节，部分胸膜皱缩。送检肺组织大小约7.5cmx3.0cmx2.2cm,切面肺实质中见散在多发性结节，灰白色或褐色，结节直径大小约0.3－2.0cm，界限清楚，切面质地中等，部分区域钙化质硬。镜下肺内散在富有黏液样基质的病灶，大小不一，小者仅有几个或十几个细胞组成围绕在小血管周、支气管树周或泡间隔中。病灶周边细胞丰富，中央细胞稀少。病灶部分瘤细胞有轻度异型性，未见核分裂像及坏死，部分瘤细胞胞浆有空泡形成。免疫组织化学染色CD34、CD31及FⅧ阳性，TTF－1、CK(pan),EMA阴性。诊断肺上皮样血管内皮瘤。例2，女性，46岁，因体检发现右肺占位性病变1周入院，X线及CT检查见右下肺叶孤立性结节性肿物，临床诊断为右下肺肿物性质待查。术中送检肺组织大小约3.0cmx2.0cmx1.2cm行冰冻诊断，肺组织切面见孤立性结节，灰褐色，结节直径大小约0.8cm，界限清楚，质中。术中冰冻切片诊断为肺恶性肿瘤，考虑腺癌。常规切片镜下见一个圆形的结节，间质纤维化，中央部分区域坏死。肿瘤细胞卵圆形，呈上皮样，胞浆丰富嗜双色性，瘤细胞内见空泡，呈印戒样。核分裂象少见。 免疫组织化学染色CD34、CD31及FⅧ、vimentin阳性，TTF－1、CK(pan),EMA阴性。诊断肺上皮样血管内皮瘤。例3，女性，56岁，反复咳嗽、咳血1年余，加剧3天入院。X线及CT检查示两肺分布大小不等的类圆形小结节，性质待定。肝脏分布大小不等的类圆形低密度灶，增强扫描呈"牛眼状"强化，提示为肝、肺转移癌。临床诊断为肝、肺结节原因待查，考虑为转移癌。在CT引导下行肺脏结节穿刺活检。送检穿刺组织5条，总体积大小约1.0cmx0.8cmx0.5cm。镜下见瘤细胞间的间质由丰富的基质组成，为粘液软骨样背景。肿瘤细胞异型性小，呈圆形，具有上皮样形态，胞浆丰富嗜酸性，瘤细胞内见空泡，呈印戒样，这提示单细胞血管形成趋势。部分瘤细胞核内见胞浆包涵体。核分裂象少见。免疫组织化学染色CD34、CD31及FⅧ、vimentin阳性，TTF－1、CK(pan),EMA阴性。诊断肺上皮样血管内皮瘤。

2 讨论

肺上皮样血管内皮细胞瘤（PEH）是十分罕见的疾病［1、2］，是一种低到中级别恶性的血管肿瘤，是由包埋于粘液透明性基质中的短索状和巢状的上皮样内皮细胞组成。1975年，Dail等［3］首先报道了肺上皮样血管内皮瘤（PEH）,但由于对肿瘤的组织起源不清楚，肿瘤细胞又有在肺泡内生长的特性，当时认为是肺泡细胞癌的亚型，并称之为血管内支气管肺泡瘤。近年来随着电镜及免疫组织化学方法的应用，明确了其血管源性肿瘤的本质［4］。证实此瘤起源于血管内皮细胞，和肺外上皮样血管内皮瘤一样具有相似的上皮样和内皮分化。以往认为该瘤是中间型并有恶性倾向的肿瘤，在2002年WHO软组织肿瘤分类中将其定为恶性［5］。

2.1 诊断

2.1.1 临床特点： PEH的患者大多数是白种人，80%为女性。年龄范围12-61岁。由于PEH临床症状缺乏特异性，故极易被漏诊、误诊。PEH临床表现通常是无痛的，一半患者是无症状的。有症状的患者表现为胸膜炎性胸痛、咳嗽、气短、咯血及杵状指。有的患者可表现为肺泡出血或血栓栓塞性疾病。影像学检查：胸部X光拍片、CT扫描特征性地显示肺部结节，结节大小约0.8-2.5cm，结节为孤立性或多发性，偶见钙化。

2.1.2 病理学特点：PEH最常见的大体表现是肺脏孤立性或多发性结节，结节大小不等，直径0.3－2.5m、界限清楚，灰白色或褐色，偶尔伴有黄色斑点。质地中等，切面均匀一致，部分区域钙化质硬。显微镜下组织学检查：低倍显示圆到卵圆形的大小不等结节，典型的有中心硬化、细胞减少区和外周的富于细胞区。有些结节中央为无定型嗜酸性物质或凝固性坏死，坏死中心有时可能钙化和骨化。肿瘤典型地播散至邻近的细支气管和肺泡腔，呈微息肉样并可见通过肺泡壁的肺泡孔。广泛的淋巴道播散可类似转移癌。细胞间的间质由丰富的基质组成，早期可见粘液软骨样肿瘤背景，部分区域粘液样和淀粉样变性。肿瘤细胞异型性小，通常呈圆形或卵圆形，具有上皮样或组织细胞样形态，胞浆丰富嗜酸性或嗜双色性，细胞内空泡常见，有时呈印戒样，这提示形成单细胞血管的趋势，这种单细胞原始管腔是血管内皮细胞瘤的特征（称细胞内原始血管腔）［5］。核内的胞浆包涵体常见。核分裂象少见。特殊染色：PEH瘤细胞AB/PAS染色陰性。免疫组化染色结果：PEH瘤细胞CD34、CD31及FⅧ、vimentin阳性，TTF－1、CK(pan),EMA阴性，25%-30%的病例灶性表达CK或EMA。电镜检查显示围绕肿瘤细胞的外板或基底膜，偶见紧密连接。细胞浆内腔隙是特征性的表现。最近发现PEH中存在一种非随机性染色体异常t(1;3)(p36.3;q25)［6］。

2.2 治疗：宜将肿瘤完整切除，并保证切缘干净，必要时辅以放疗和化疗。

2.3 鉴别诊断：肺上皮样血管内皮细胞瘤常常被误诊，X线或CT显示的结节不能定性，故只有病理学检查才可以确诊。PEH大体与组织学形态与肺脏腺癌类似（尤其在冷冻切片时），病理学检查时主要与以下疾病鉴别：1.腺癌：PEH瘤细胞呈巢状及索条状排列，而且细胞质内含有空泡，易被误诊为腺癌。但是腺癌癌细胞异型性明显，核分裂像易见，免疫组化表达上皮性标记，内皮性标记物均为阴性。可以与PEH鉴别。2.肺的转移癌：PEH瘤细可类似黏液腺癌。但若为黏液腺癌，特殊染色显示胞质内含有黏液，免疫组化血管内皮标记阴性可资鉴别。3.上皮样血管肉瘤：是血管肉瘤的亚型，肿瘤内含有不规则的血窦样腔隙，内衬的上皮样内皮细胞异型明显，并可见较多的核分裂像。多数病例可见坏死。而PEH瘤细胞异型性不明显，核分裂象和出血、坏死较少或不明显，是低度恶性肿瘤。4.上皮样肉瘤：多发生于远端肢体，由呈地图状的多结节组成，结节的中心为坏死物质，其周围瘤细胞常与邻近的梭形细胞及胶原组织在形态上有移行。而PEH瘤细胞形成原始血管，内见红细胞。间质黏液样，可有钙化、骨化、凝固性坏死，免疫组化表达内皮性标记物，可与上皮样肉瘤鉴别。

此外，PEH罕见，临床症状缺乏特异性，故极易被漏诊、误诊。PEH死亡率约为65%，一旦确诊，应及时采取有效的治疗措施，尽可能延长患者的生命。

参考文献

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血管内皮细胞损伤 篇3

关键词：狼疮性肾炎,血管病变,内皮细胞,损伤,标记物,变化

近年来,狼疮性肾炎伴血管病变发病率逐年攀升,已经发展成威胁公众健康的主要疾病之一[1]。血管内皮细胞是狼疮性肾炎伴血管病变的最早接触部位,也是被机体免疫系统所识别的供体细胞[2]。霉酚酸酯是一种具有高选择性和非竞争性的次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶的可逆性抑制剂,不仅可以有效抑制内皮细胞的增生和迁移,还可以抑制血管的形成,降低内皮细胞表面部分黏附因子的表达[3]。为了探讨霉酚酸酯治疗狼疮性肾炎伴血管病变患者血管内皮细胞损伤标记物的变化情况和临床疗效,本研究选取我院76例狼疮性肾炎伴血管病变患者采用不同的药物治疗方式,分别比较两组患者治疗后的各项临床指标,现总结报道如下:

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2006年1月～2010年6月我院狼疮性肾炎伴血管病变患者76例,年龄24～52岁,平均(36.1±15.7)岁,其中,男19例,女57例。将所有患者随机分为两组,将采用环磷酰胺治疗的患者作为对照组38例,采用霉酚酸酯治疗的患者作为观察组38例,两组患者间一般情况(性别,年龄,婚姻,职业,文化程度等)比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

入选标准:所有患者均符合(1)美国风湿病协会(ARA)1997年系统性红斑狼疮的诊断标准。(2)尿蛋白≥2 g/d伴或不伴活动性尿沉渣尿红蛋白≥10万/mL,血肌酐(SCr)≤3 mg/d或内生肌酐清除率(Ccr)≥30 mL/min。(3)肾活检肾小球病理类型为Ⅳ型,同时伴有间质血管NNV病变,不合并模性病变和肾组织慢性化指数(CI)<4,肾小球的硬化比例<50%。(4)3个月内未使用过任何细胞毒药物治疗。

1.2 方法

1.2.1 给药方案

对照组采用环磷酰胺0.75～1.00 g/m2,每月静脉滴注1次治疗3个月;观察组采用霉酚酸酯1.5～2.0 g/d,分两次口服治疗3个月。疗程结束后,分析比较两组患者的各项临床指标,主要包括可溶性血栓调节蛋白(soluble thrombomodulin,sTM)、可溶性血管内皮细胞蛋白C受体(soluble endothelial cell protein C receptor,sEPCR)、血管病血友病因子(von willebrand factor,vWF)。治疗期间经医护人员果断、快速、有效地处理,所有患者无一例死亡。

1.2.2 肾活检

所有患者均采用经皮肾活检术,肾组织切片行HE、PAS、PASM、Masson染色,使用直接免疫荧光法检测免疫球蛋白和补体在肾组织中的沉积状况。

1.2.3 sTM检测

所有患者均采用双抗夹心ELISA法检测sTM,试剂为上海太阳生物技术有限公司提供的法国Diuagnostica Stago公司原装进口试剂。严格按照试剂盒说明书进行操作,同时采用相应的标准品进行检测,使用美国宝特公司生产的ELx-800型酶标仪读取光密度,经标准曲线得出相应浓度。

1.2.4 sEPCR的检测

所有患者均采用双抗夹心ELISA法检测sEPCR,试剂为北京莱博生物实验材料研究所提供的美国ENDOGEN公司原装进口试剂。严格按照试剂盒说明书进行操作,同时采用相应的标准品进行检测,使用美国宝特公司生产的ELx-800型酶标仪读数,采用多元回归自动计算结果。

1.2.5 vWF的检测

所有患者均采用免疫比浊法检测vWF,使用法国Diuagnostica Stago公司生产的STA Compact全自动血凝分析仪及其原装进口试剂进行检测,直接读数。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差表示,两组间比较采用t检验;计数资料用率表示,组间比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者治疗后血管内皮细胞损伤标记物变化比较

两组患者治疗后血管内皮细胞损伤标记物变化比较结果显示,观察组采用霉酚酸酯治疗后血管内皮细胞损伤标记物sTM、sEPCR、vWF明显低于采用环磷酰胺治疗的对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 两组患者治疗后并发症和患者满意度比较

两组患者治疗后并发症和患者满意度比较结果显示,观察组并发症明显少于对照组,观察组患者满意度明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2

3 讨论

有研究表明,sTM、sEPCR、vWF均由机体血管内皮细胞分泌而来,前两种蛋白是机体蛋白C系统的主要组成部分[4]。sTM与凝血酶结合后可以形成T-TM复合物,进而激活机体的蛋白C系统;可溶性血管内皮细胞蛋白C受体能够加强T-TM复合物,使之活化蛋白C,二者还可以通过与活化的蛋白C结合而起到抑制活化蛋白C活性的作用。vWF不仅可以促进血液中的血小板在血管内皮细胞下黏附,还可以保护FⅦ的活性,有效防止其降解。这三种物质在机体凝血和抗凝过程中均起到了关键作用,是公认的血管内皮细胞损伤标记物。

传统采用环磷酰胺治疗狼疮性肾炎伴血管病变,患者病情缓解有限,疗程结束后,很多患者会出现不同程度的呕吐、恶心、带状疱疹、肺炎等并发症,同时伴有白细胞大幅下降和肝酶升高的问题。霉酚酸酯是一种新型的免疫抑制剂,主要成分为2-乙基酯类衍生物[5]。霉酚酸酯进入人体后,将迅速水解成为具有免疫抑制作用的活性代谢产物MPA,通过可逆性的抑制鸟嘌呤核苷酸经典合成途径中的限速酶,可以有效抑制细胞DNA和RNA的合成,但对替代途径并不影响。MPA具有特异性,不仅可以可逆性的抑制T、B淋巴细胞增殖,抑制淋巴细胞产生抗体,对其他中性细胞无影响,还可以抑制细胞表面的黏附分子合成。将霉酚酸酯使用于狼疮性肾炎伴血管病变患者,其疗效明显好于其他传统的免疫抑制剂[6]。霉酚酸酯可以大幅缓减患者的临床症状,尤其是患者血管内皮细胞损伤标记物黏附因子将明显减少[7],从而通过抑制这类黏附因子和炎症介质,起到抑制内皮细胞血管形成的作用。霉酚酸酯还具有强大的抗炎作用,可以通过抑制细胞核因子的活性,而抑制患者体内炎症因子的过度释放,使得机体炎症症状得到大幅缓解[8]。

本次研究表明,狼疮性肾炎伴血管病变患者的血管内皮细胞损伤标记物sTM、sEPCR、vWF升高,导致机体出现不同程度的临床症状,通过使用霉酚酸酯治疗3个月后,其体内的sTM、sEPCR、vWF水平降低,证明霉酚酸酯确实起到了独有的功效。

综上所述,采用霉酚酸酯治疗狼疮性肾炎伴血管病变的患者血管内皮细胞损伤标记物的变化显著,sTM、sEPCR、vWF均得到了明显改善,且对患者副作用较小,是一种安全有效的治疗方法,值得临床推广使用。

参考文献

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血管内皮细胞损伤 篇4

关键词：急性肺损伤,内皮祖细胞,乌司他丁注射液,成血管能力

急性肺损伤时内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)参与到肺泡-毛细血管的修复,2008年内皮祖细胞移植至油酸诱导的急性肺损伤兔模型[1]的研究已证实,在急性肺损时内皮祖细胞可归巢到肺毛细血管,起到修复肺损伤的作用,在最近的研究中也有类似的研究。2013年在Chest[2]发表的一项研究中发现单独使用内皮祖细胞或单独使用辛伐他丁均能减轻急性肺损伤,如联合治疗效果更好,研究没有更深入讨论机制研究,实验提示内皮祖细胞可进行急性肺损伤修复,并且利用药物提高内皮祖细胞功能是研究的一个重要手段及研究热点。乌司他丁注射液(ulinastatin injection,UTI)具备了治疗急性肺损伤的潜力。乌司他丁是从健康尿液中提取的蛋白酶抑制剂,可有效地减轻炎症渗出及炎症因子的释放[3],也有研究证明它有利于内皮细胞修复及维持动脉内膜完整,现主要的研究偏向于乌司他丁减轻炎症因子或中性粒细胞从而减低内皮细胞的损伤,但暂未见乌司他丁和内皮祖细胞的研究。为此,本研究主要针对乌司他丁是否提高内皮祖细胞成血管能力展开。

1 材料与方法

1.1实验动物

成年新西兰大耳白兔(2.5kg~3.0kg)共40只,购自广东省动物中心,根据国家实验动物健康使用规范指南饲养,所有操作符合广东省人民医院伦理委员会的要求。

1.2材料与试剂

M199培养液、胎牛血清购自Hy-clone公司;人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司;体外血管形成试剂盒、DIL-labeled acetylat-ed LDL(Dil-acLDL)、FITC标记荆豆凝集素 Ⅰ(FIT-CUEA-1)、oleicacid(75 mg/kg)均购自Sigma公司。VWF抗体(博奥森);ChemMate TM DAKO Envision TM Detection Kit(DAKO),乌司他丁注射液(天普洛安)。PKB阻断剂(LY-294002);eNOS阻断剂(L-NAME)。

1.3 方法

1.3.1分组

肺毛细血管密度分3组:正常对照组、急性肺损伤组、乌司他丁治疗组。正常对照组:正常新西兰大耳兔,体重(2.0±0.5)kg,均为雄性,共10只,进行免疫组化观察肺毛细血管密度;病理评价肺泡炎症。急性肺损伤兔组:正常新西兰大耳兔,体重(2.0±0.5)kg,均为雄性,共10只。造模成功24h进行分别进行免疫组化观察肺毛细血管密度;病理评价肺泡炎。乌司他丁治疗组:正常新西兰大耳兔,体重(2.0±0.5)kg,均为雄性,共10只,造模成功后使用40 000U/(kg·d)乌司他丁治疗48h后处死实验动物,分别进行免疫组化观察肺毛细血管密度;病理评价肺泡炎症。

体外内皮祖细胞成血管能力检测分为3组:正常对照组、急性肺损伤组、乌司他丁治疗组。正常对照组:正常新西兰大耳兔,体重(2.0±0.5)kg,均为雄性,共6只,抽取10mL外周血分离诱导内皮祖细胞7d后,行内皮祖细胞鉴定。48h后,检测成血管能力测定。急性肺损伤组:正常新西兰大耳兔,体重(2.0±0.5)kg,均为雄性,共6只,造模成功24h后,抽取10 mL外周血,分离诱导内皮祖细胞。48h后,检测成血管能力测定。乌司他丁治疗组:正常新西兰大耳兔,体重(2.0±0.5)kg,均为雄性,共6只,造模成功24h后,抽取10mL外周血,分离诱导内皮祖细胞。内皮祖细胞加入1 000U/mL乌司他丁培养48h后,检测成血管能力测定。

1.3.2 EPCs的分离培养

肝素抗凝取骨髓10 mL,采用密度梯度离心法获取单个核细胞,接种在24孔板上。应用M199培养基(含20%胎牛血清,青霉素100U/mL,链霉素100 U/mL)培养,用PBS洗去非贴壁细胞。换培养液后培养至7d,PBS液去除非贴壁细胞,对贴壁细胞进行细胞鉴定。

1.3.3 EPCs的鉴定

按2×106~3×106接种在纤连蛋白包被24孔板,细胞爬片培养第4天取出,将细胞与2.4ng/mL的DIL-acLDL在37 ℃温度下孵育1h,以检测EPCs摄取DIL-acLDL。采用2%多聚甲醛固定细胞10min。应用PBS清洗2min,10ng/mL的FITC-UEA-1加于上述标本,37 ℃ 温度下孵育1h。采用激光共聚焦显微镜鉴定DIL-acLDL和FITC-UEA-1双染色阳性细胞被认为是正在分化的内皮祖细胞。

1.3.4病理切片评估肺泡炎症

部分左肺组织经10%甲醛固定,石蜡包埋切片,HE染色后用普通光学显微镜观察形态学变化。根据肺泡炎症的特点炎症细胞渗出,肺泡间隔增大,根据受损面积肺泡炎症分级:0级,无肺泡炎;Ⅰ 级,轻度肺泡炎,少于20%的肺病灶区;Ⅱ级,中度肺泡炎,病变区20%~50%;Ⅲ级,弥漫病变面积大于50%。

1.3.5 EPCs血管生成能力检测

采用体外血管生成试剂盒检测体外EPCs的血管生成能力。200倍倒置显微镜下观察小血管生成情况。细胞拉长变形,长度为宽度的4倍以上即可被认为形成小管。选择200倍光镜下5个视野,计数小管数。

1.3.6免疫组化评估肺毛细血管密度

血管性血友病因子(von willebrand factor VWF)是内皮细胞的标志物,经常被用于病理切片上确定毛细血管数目,按免疫组化试剂盒步骤,应用免疫组化图像自动分析模块,计算阳性目标总面积/统计场总面积,即每平方毫米的毛细血管密度。

1.3.7统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件分析,体外成血管能力检测、肺毛细血管密度方差分析,肺泡炎症评估采用秩和检验。

2 结果

2.1肺部HE染色

急性肺损伤见肺部严重渗出,经乌司他丁治疗后渗出较急性肺损伤组减少。根据受损面积肺泡炎症分级,急性肺损伤组与乌司他丁治疗组比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

只

2.2肺毛细血管密度

棕色染色为血管性血友病因子抗体阳性,肺毛细血管密度比较乌司他丁治疗组较急性肺损伤组明显增加(P <0.05)。详见表2。

2.3内皮祖细胞鉴定

共聚焦显微镜观察EPCs摄取荧光双染阳性:DiL-acLDL染色细胞呈红色;FITC-UEA-I染色细胞呈绿色;双染色细胞同时呈红、绿色。通过共聚焦显微镜鉴定,FITC-UEA-I和DiL-acLDL双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPCs。

2.4体外EPCs血管生成能力检测

急性肺损伤组较正常对照组体外成血管数目下降,但两组比较差异无统计学意义(P>0.05);乌司他丁治疗组较急性肺损伤组体外成血管数目增加,差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

3 讨论

现有的研究主要考虑乌司他丁的内皮保护作用为炎症因子下降及炎症细胞减少导致内皮功能保护[4,5,6]。但在我们的实验中已发现乌司他丁能增加内皮祖细胞的归巢数目,在体内经免疫组化观察到肺毛细血管密度增加,在体外进行细胞培养同样发现经乌司他丁组治疗后内皮祖细胞的成血管能力提高。为此,认为乌司他丁的内皮保护作用,作用于内皮祖细胞,导致内皮功能改善,修复肺泡毛细血管屏障,减少肺部渗出。

内皮祖细胞在内皮保护起到主要的作用,内皮祖细胞组织归巢至受损的肺毛细血管起到修复的作用。有研究表明在急性肺损伤动物模型中大约有50%的肺毛细血管丢失,所以利用内皮祖细胞拯救肺毛血管是现在新的研究方向。参与肺血管[7]的修复有以下研究:Suratt等[8]的研究认为内皮祖细胞参与内皮修复提供了强有力的证据,证明内皮祖细胞参与肺血管的修复,在接受男性造血干细胞移植的女性病人肺组织中(活检或尸检)观察到含有Y染色体的内皮细胞,证明外源性内皮祖细胞在受者肺组织中定植并分化为成熟的内皮细胞。内皮祖细胞可减轻氧化应激反应,在研究中发现,油酸诱导的急性肺损伤兔的肺中线粒体中的血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、锰超氧化物歧化酶(Mn super oxide dismutase)蛋白水平升高,这两种酶对抵抗肿瘤坏死因子(TNF-α)介导的内皮损伤及凋亡起到重要作用[1]。内皮祖细胞除了直接的内皮修复作用还有免疫调节功能保护减少细胞内黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1),P-选择素(P-selectin)蛋白使炎症细胞渗出减少[9]。

从本实验可以发现内皮祖细胞能归巢至受损的肺血管及参与肺血管内皮修复和血管新生。并且发现乌司他丁有直接引起内皮祖细胞成血管功能提高的作用。

参考文献

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[8]Suratt BT,Cool CD,Seris AE,et al.Human pulmonary chimerism after hematopoietic stem cell transplantation[J].Am J Respir Crit Care Med,2003,168(3):318-355.

血管内皮细胞损伤 篇5

溶栓颗粒 (枳实、柴胡、地龙、水蛭等组方) 是在临床治疗缺血性中风病的有效方剂基础上研制的制剂。前期研究发现溶栓颗粒对大鼠缺血再灌注损伤有一定保护作用, 能减少缺血再灌注脑组织TNF-α等炎性介质产生及ICAM-1表达。为了研究溶栓颗粒对血管内皮细胞血管内皮生长因子 (VEGF) 的影响, 进行了如下研究。

1材料与方法

1.1 材料

Wistar大鼠20只 (许可证号:SCXK (鲁) 20030010) , 雄性, 体重250～280g, 购自青岛市药检所实验动物中心。大鼠脑微血管内皮细胞 (BMECs) :购自北方伟业科技有限公司。DMEM和10%胎牛血清:美国Gibco公司;多聚赖氨酸 (AR0003) 、复合消化液 (AR0022) 、VEGF (BA0407) 免疫组化试剂盒、SABC免疫组化试剂盒 (SA1022) :均购自武汉博士德科技有限公司;TNF-α (105-01) :购自上海天呈生物信息科技有限公司。溶栓颗粒:柴胡、枳实、川芎、泽兰、丹参、地龙、水蛭等组方, 每包10克, 由青岛市海慈医疗集团制剂实验室提供, 临用时配制成0.25g/ml、0.125g/ml、0.0625g/ml浓度;阿托伐他汀钙片 (立普妥) :辉瑞制药有限公司生产, 批号:85837010, 临用前配成0.083mg/ml。

1.2 动物分组及含药血清制备

Wistar大鼠20只, 雄性, 体重250～280g, 随机分为5组, 每组4只。分别为空白血清组、大剂量血清组、中剂量血清组、小剂量血清组、阿托伐他汀血清组, 以上各组分别灌胃蒸馏水、大剂量中药、中剂量中药、小剂量中药、阿托伐他汀2ml, 2次/日, 连续2天, 第3天给药1次。最后1次给药后1小时开始, 大鼠不麻醉固定, 腹主动脉取血, 分离血清, 过滤除菌后置-20℃保存。用于细胞时, 预先56℃、30分钟灭活。

1.3 细胞培养及分组处理

BMECs用含有10%胎牛血清的DMEM培养液, 置孵箱 (37℃, 5%CO2) 培养。镜下细胞计数, 待细胞达对数增长期, 实验共分7组, 接种于24孔培养板, 为空白组、模型组、空白血清组、大剂量组、中剂量组、小剂量组、阿托伐他汀组。分组后置37℃, 5%CO2培养箱孵育, 除空白组外各组加入TNF-α (40ng/ml) 孵育6小时, 用含药血清处理24小时后检测。

1.4 培养细胞形态观察

采用HE染色, 光镜下观察。

1.5 培养细胞VEGF检测

按照免疫组化试剂盒说明进行。

1.6 统计学处理

应用PEMS 3.1统计软件进行分析。阳性细胞率用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 各组细胞形态学观察

每组各观察10个放大10×20倍光镜下视野记录的有丝分裂细胞数。模型组、空白血清组BMECs细胞分裂相细胞数量较空白组明显增加 (P<0.05) , 皱缩、变形, 细胞形态发生明显变化, 血管内皮细胞部分呈明显的长梭形、星形, 似成纤维细胞样改变, 细胞间隙增大。大、中剂量组及阿托伐他汀组分裂相细胞较少, 少于模型组 (P<0.05) , 与空白组相当 (P>0.05) ;与空白血清组比较, 大、中、小剂量组及阿托伐他汀组分裂相细胞有减少趋势, 但缺乏统计学意义 (P>0.05) 。大、中、小剂量组与阿托伐他汀组细胞密度大于模型组及空白血清组, 皱缩变形细胞较少。结果见表1。

与空白组比较*P<0.05;与模型组比较△P<0.05

2.2 各组细胞的VEGF蛋白表达

各组10×40倍光镜下计数10个视野, 计算阳性细胞数量。空白组BMECs胞浆内没有或有少量棕黄色颗粒, 染色很浅。模型组、空白血清组BMECs有较多细胞胞浆内见棕黄色颗粒, 染色较深。大、中剂量组、阿托伐他汀组胞浆含黄色颗粒细胞较少, 染色较浅。阳性细胞数量比较见表2。

与空白组比较*P<0.05;与模型组比较△P<0.05;与空白血清组比较#P<0.05

3讨论

VEGF是血管内皮细胞特异性的促有丝分裂原, 属分泌性糖蛋白, 具有促进内皮细胞增殖、加速新血管形成, 增强血管通透性等作用[1,2]。有学者认为, VEGF在动脉粥样硬化的发生过程中是不可缺的, 并随粥样斑块病变进展逐渐增强[3]。近年来研究表明, 内皮细胞不仅是机械性防御结构, 而且是体内最大的“内分泌器官”, 内皮细胞还具有产生细胞因子的作用, 可通过旁分泌或自分泌形式在其生成的微环境中直接发挥作用, 或进入循环系统, 引起全身效应[4];各细胞因子相互制约、相互调节, 参与机体免疫和炎症反应, 影响补体、血小板活化因子的生成, 调节细胞黏附分子的表达。内皮损伤、炎症反应及平滑肌细胞增殖迁移是动脉粥样硬化发生发展的关键环节, 其中贯穿始终的炎症反应最终导致了血管事件的发生。

前期研究发现, 溶栓颗粒脑保护作用可能存在以下机制:①抑制由IL-1β介导的急性炎症反应;②抑制白细胞黏附链条式过程中的IL-1β和ICAM-1产生环节, 从而减少白细胞黏附造成的脑组织损伤[5];③降低MDA的过量释放、提高SOD活性、增强抗脂质过氧化能力;④降低TNF-α的过量释放、减少脑含水量[6];⑤抑制MMP-9的表达, 从而减少由MMP-9所造成的血管通透性增加和脑水肿及对脑组织的直接损伤[7]。

炎症因子可一定程度地促进VEGF在内皮细胞中的表达。本研究用40ng/mlTNF-α损伤BMECs 6小时, 用含3种剂量溶栓颗粒和阿托伐他汀的大鼠血清干预24小时, 实验结果显示:血管内皮细胞部分呈明显的长梭形、星形, 似成纤维细胞样改变, 细胞间隙增大。大、中、小剂量溶栓颗粒与阿托伐他汀组细胞密度大于模型组及空白血清组, 皱缩变形细胞较少。空白组少量表达VEGF蛋白, 经过TNF-α损伤, 除阿托伐他汀组外各组都有VEGF蛋白表达增多。大中剂量组、阿托伐他汀组抑制VEGF表达, 小剂量组有减少趋势, 但缺乏统计学意义。大剂量组与阿托伐他汀组减少VEGF蛋白的程度相当。

在TNF-α损伤状态下, 血管内皮细胞生长因子表达增加, 血管内皮细胞的分裂增殖增加, 加快动脉粥样硬化斑块形成, 增加动脉粥样硬化斑块的不稳定性。这可能是炎性介质诱发动脉粥样硬化形成以及破裂的原因之一。本研究发现, 溶栓颗粒对大鼠脑皮质微血管内皮细胞有保护作用, 能够减少TNF-α对内皮细胞的损害。而且含溶栓颗粒大鼠血清干预的BMECs分裂相细胞数量有所减少, 说明溶栓颗粒还有减少受损BMECs分裂增殖的作用。溶栓颗粒的这一作用可能由于减少VEGF的表达而实现。其中, 大剂量和中剂量溶栓颗粒效果较明显, 而小剂量溶栓颗粒组并未显示出明显的降低VEGF表达作用。小剂量组以及空白血清组相对于不加入大鼠血清的模型组有减少趋势, 抑制VEGF表达的作用相当, 考虑或许单纯增加血清含量也能减少受损BMECs的VEGF表达, 其具体机理有待于进一步研究。

参考文献

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血管内皮细胞损伤 篇6

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物

SPF级健康新生SD大鼠80只,鼠龄24 h,不限雌雄,重量5~8 g,购自广东医学院动物实验中心,分批实验。

1.1.2主要试剂

胎牛血清(FBS)、DMEM培养液、0.25%胰蛋白酶购自Gibco公司,PDTC、NF-κB免疫荧光试剂盒、SDS购自Sigma公司,FITC Annexin V Apoptosis Detection kit凋亡试剂盒购自BD公司,兔抗鼠Ⅷ因子多克隆抗体、FITC标记山羊抗兔Ig G为Abcam公司产品,兔抗鼠磷酸化NF-κBp65单克隆抗体、兔抗鼠LC3B单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔Ig G为Cell Signaling公司产品,PVDF膜(PVDF 0.22μm)为Millpore Biotechnology公司产品。

1.1.3主要仪器

Thermo细胞培养箱,Leica倒置显微镜,Leica激光扫描共聚焦显微镜,BD流式细胞仪,Kodak X光自动洗片机,Serial垂直转移电泳槽。

1.2 方法

1.2.1脑微血管内皮细胞的原代培养、纯化及鉴定

参照文献[4]的方法并加以改良进行体外原代培养及纯化SD大鼠大脑皮层BMEC:取24 h内新生SD大鼠75%的酒精浸泡消毒,在无菌冷冻条件下取大脑皮质,剥离脑膜及血管血块,将脑皮质置于DMEM培养液中剪碎成1 mm3的小块,移入15 ml离心管,加入DMEM至2 ml,加0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA)2 ml,37℃消化10~20 min,持续震摇。加入终浓度为10%的胎牛血清终止消化,1 000 r/min离心5 min,弃上清。加含胎牛血清的DMEM洗涤2次,吸管轻轻吹打,弃去经200目不锈钢网过筛的滤液,用DMEM液反复冲洗下滤网上的组织。经100目不锈钢网过筛并收集滤液,1 000 r/min离心5 min,弃上清液。加入0.1%Ⅱ型胶原酶1~2 ml(用量据组织多少而定),37℃水浴震荡消化15~25 min,加入含血清培养基终止消化后,吹打使混匀,1 000 r/min离心5 min,弃上清液。加完全培养基后轻轻吹打使其混匀,接种于已铺有明胶的培养皿上,静置于37℃、5%二氧化碳的培养箱内培养24 h后换培养液。之后每隔2~3 d更换培养液,约7~10 d见细胞融合铺满时即可进行纯化传代。纯化传代:选取培养至近融合状态的细胞,吸弃原培养基,予37℃预热的DMEM液清洗2遍,加入1∶1的0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA消化液,置培养箱中37℃消化1~2 min。在相差显微镜下观察,见大部分细胞收缩变圆、间隙增大时,即刻加入1~2 ml完全培养基终止消化,用移液器轻轻吹打使细胞脱壁,收集细胞悬液,1 000 r/min离心5 min,弃上清。加完全培养基,混匀后按照1∶2接种于2个细胞培养皿内,孵育4 h取出,吸去未贴壁的细胞并更换完全培养基,置培养箱内继续培养至细胞重新生长至融合状态时,重复上述操作处理2~3次,便可得到纯度较高的大鼠BMEC。鉴定:将已纯化好的细胞消化传代接种于放有细胞培养专用盖玻片的12孔培养板中,至细胞生长至80%~90%汇合状态时,吸除培养液,用PBS洗涤1次,加入固定液固定5~15 min,吸除固定液,用洗涤液洗3次,每次3~5 min,滴加免疫染色封闭液至充分盖住样品,室温封闭1 h,吸去免疫染色封闭液,滴加1 ml兔抗大鼠第Ⅷ因子相关抗原抗体(抗体用一抗稀释液稀释,1∶100),用一抗稀释液代替一抗作为阴性对照,37℃孵育1 h或4℃孵育过夜。吸出一抗,洗涤液洗3次,每次5~10 min,加入FITC标记的羊抗兔Ig G 1 ml(二抗稀释液稀释,1∶100),室温孵育1 h。吸出二抗,洗涤液洗涤2次,每次5~10 min;加入细胞核染色液(PI)使充分盖住样品,室温染色5 min左右,吸除细胞核染色液,用洗涤液洗涤3次,每次3~5 min;加适量抗荧光淬灭封片液并用盖玻片封片,应用激光扫描共聚焦显微镜进行观察。胞浆中第Ⅷ因子相关抗原的染色为绿色荧光,细胞核的PI染色为红色荧光。高倍镜下各取5个视野内细胞计数,脑微血管内皮细胞纯度=阳性细胞数/全部细胞数,求其平均值,检测脑微血管内皮细胞纯度。

1.2.2体外培养脑皮层微血管内皮细胞损伤模型的建立

参考文献[5,6]损伤模型的方法加以改良。将经2次传代纯化满意的BMEC传代种植于6孔细胞培养板中培养,待细胞融合长满。将预先设计好的标准模板(其上划有纵、横平行线,间距均为4 mm)置于培养板底部,吸除培养液,PBS液轻柔洗涤2遍,无菌环境直视下使用20μl微量移液器,tip头严格按模板线条用力均匀地制成纵、横划痕损伤,划痕宽度约1 mm。确保实验所用的BMEC损伤范围和程度一致。

1.2.3 PDTC干预划痕损伤后BMEC的实验分组处理

BMEC经传代纯化满意后,传代种植于6孔细胞培养板中,待细胞长满融合后,随机平均分成对照组、单纯损伤组、损伤+抑制组进行实验,重复3次。分组处理前先吸除培养板中的原培养液并用PBS液轻柔冲洗2遍。对照组加入含10μl PBS液、10%FBS的DMEM培养液3 ml;单纯损伤组按1.2.2方法建立划痕损伤模型,然后加入与对照组相同的培养液;损伤+抑制组同单纯损伤组建立损伤模型,然后加入含PDTC 10μl、10%FBS的DMEM培养液3 ml(PDTC的终浓度为20μmol/L)。各组分别于处理后1、6、12、24及48 h 5个时间点进行实验。

1.2.4免疫荧光细胞化学方法检测磷酸化NF-κBP65蛋白的表达

弃去培养液,用冷PBS洗2遍,固定液固定30 min,洗涤2遍,滴加免疫染色封闭液,室温封闭1 h,吸去封闭液后滴加一抗(1∶100稀释的兔抗鼠磷酸化的NF-κB p65单克隆抗体)湿化盒中4℃孵育过夜。洗涤2遍,加二抗(1∶100稀释的FITC标记山羊抗兔Ig G),37℃避光孵育1 h,洗涤2遍,激光共聚焦显微镜下观察。阴性对照组用0.01 mol/L PBS代替一抗。以细胞核及胞浆内出现绿色荧光为阳性细胞,细胞内无绿色荧光为阴性细胞。利用Leica Confocal图像分析软件对荧光结果进行图像分析,得出各组阳性细胞不同荧光强度值,从而得出各组中不同时间点磷酸化NF-κB P65蛋白表达的程度。

1.2.5 Annexin V/PI apoptosis kit检测凋亡及坏死

收集细胞培养液到一离心管中,用0.25%不含EDTA胰酶消化细胞至细胞可以被移液管或枪头轻轻吹打下来时,终止消化。将细胞吹打下来,细胞悬液移至上述收集细胞培养液的离心管内混匀,1 000 r/min离心5 min,弃上清液后冷PBS液洗涤细胞2次。用500μl Binding Buffer悬浮细胞,滴加5μl Annexin V-FITC并轻轻混匀,于2~8℃避光条件下孵育15min。滴加5μl PI后轻轻混匀,于2~8℃避光条件下孵育5 min。1 h内用流式细胞仪检测,激发波长为488 nm,每个样本均获取10 000个细胞进行分析。

1.2.6 Western blot检测自噬标志性蛋白LC3Ⅱ表达情况

于各个时间点提取各组细胞蛋白,用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度,分装,保存于-80℃冰箱中。等量蛋白样品经SDS-PAGE电泳分离,电转移至PVDF膜上。再用封闭液室温下摇动封闭1 h,一抗(抗LC3 1∶1 000)4℃过夜,二抗(辣根过氧化物酶标记羊抗兔1∶5 000)室温1 h。以上步骤操作后均用TBST缓冲液洗膜(15 min×3次),ECL显色,X光片曝光,X光自动洗片机洗片显影。胶片扫描、拍照,采用Image J软件采集结果图像,取检测蛋白与内参灰度值的比值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计软件进行数据处理,计量资料用均数±标准差(±s)表示,不同处理组、不同时间点的组内比较用单因素方差分析,多重比较用LSD检验法或SNK检验法,P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外培养SD大鼠BMEC形态及鉴定

倒置显微镜下见分离的脑微血管段长短不等、形态各异,呈单支或多支状(见附图A)。经胶原酶消化后,微血管管壁不清,但壁上BMEC清晰可见。培养24 h后,见微血管片段大部分已贴壁,BMEC从贴壁的微血管段周围爬出,细胞多呈短梭形或多角形,排列不规则,核淡,胞膜明显。培养2~3 d,细胞分裂增殖形成散在细胞群落,呈旋涡状生长。7~9 d细胞呈长梭形、多角形,融合成片,排列紧密,互不重叠,形成致密的单层细胞,呈典型的“铺路石”征象。初种的传代细胞呈明亮的圆球形,悬浮于培养液中,4h后大部分贴壁,细胞呈扁平状,24 h后胞体变大。随培养时间延长,BMEC多呈三角形、长梭形,约7~9 d,BMEC增殖成单层片状(见附图B)。免疫细胞荧光染色后,镜下所有的细胞核呈红色荧光,含第Ⅷ因子相关抗原的细胞浆呈绿色荧光,标记为阳性细胞(见附图C)。以随机5个不同视野中阳性细胞数占总细胞数的比例为细胞的纯度,本实验所培养的BMEC纯度约90%。将细胞培养至80%~90%汇合状态时,便可进行划痕(见附图D)和药物干预实验。

A:脑微血管段(×40);B:培养中的微血管内皮细胞(×200);C:免疫细胞荧光染色(×200);D:划痕损伤(×40)

2.2 免疫荧光细胞化学方法检测磷酸化NF-κB p65 蛋白表达

损伤后1 h各组磷酸化NF-κB p65 蛋白表达量两两比较差异无统计学意义(P >0.05)。随损伤时间延长NF-κB表达量逐渐增加,以24 h时改变最显著,单纯损伤组从6 h始差异有统计学意义(P <0.01),48 h与24 h比较变化不明显。损伤+ 抑制组于加入NF-κB抑制剂PDTC后,24 h始增加,6 h始NF-κB蛋白的表达较单纯损伤组有所减少,与单纯损伤组比较差异有统计学意义(P <0.05)。见表1。

2.3 凋亡及坏死情况

1 h单纯损伤组与损伤+ 抑制组凋亡程度差异无统计学意义(P >0.05),但与对照组比较差异有统计学意义(P <0.05)。随着损伤时间延长,损伤组细胞凋亡程度相应增大。自6 h始单纯损伤组与损伤+抑制组比较,两者差异有统计学意义(P <0.05)。单纯损伤组的凋亡程度总体大于损伤+ 抑制组,凋亡的峰值出现在24 h(见表2)。对照组在细胞正常代谢状态下坏死不明显,与抑制组之间差异无统计学意义(P >0.05)。损伤后细胞坏死明显,单纯损伤组及损伤+ 抑制组细胞坏死程度自1 h始即与对照组比较差异有统计学意义(P <0.01),而单纯损伤组与损伤+ 抑制组之间差异无统计学意义(P >0.05)。随损伤时间延长,损伤+ 抑制组坏死程度总体低于单纯损伤组,自6 h始两组间坏死程度差异有统计学意义(P <0.05)。24 h坏死达高峰(见表3)。

(n=3,±s)

注:1)与对照组比较,P <0.05;2)与单纯损伤组比较,P <0.05

(n=3,±s)

注:1)与单纯损伤组比较,P <0.05;2)与对照组比较,P <0.05

2.4 自噬情况

在1 h,单纯损伤组、损伤+ 抑制组之间比较差异无统计学意义(P >0.05),但与对照组比较差异有显著统计学意义(P <0.01)。损伤后6 h始单纯损伤组与损伤+ 抑制组比较差异均有统计学意义(P <0.01),24 h达高峰。见表4。

(n=3,±s)

注:1)与单纯损伤组比较,P <0.05;2)与对照组比较,P <0.05

(n=3,±s)

注:1)与单纯损伤组比较,P <0.05;2)与对照组比较,P <0.05

3 讨论

既往忽视了BMEC在中枢神经系统中的重要作用,随着“血管神经单元(neurovascular unit)”概念的提出并对脑血管疾病的深入研究,逐渐认识到神经元、胶质细胞与BMEC的伙伴关系,BMEC可以胶质细胞为桥梁与神经元进行信息交流,发挥着重要作用。对创伤性脑损伤后早期BMEC的超微结构观察可见线粒体等超微结构发生一系列病理改变,甚至部分血管可见内皮断裂,内皮细胞消失[7,8]。应用中药通络救脑注射液作用于BMEC后收集到的条件培养液中神经元的生存活性明显提高[10]。所以BMEC在脑损伤后的生存和死亡将直接影响到神经细胞的生存。

NF-κB以非活化形式广泛存在于静止期细胞的胞质中,多以蛋白二聚体与其特异性抑制蛋白IκB(inhibitor κB,IκB)形成三聚体。当细胞受到刺激,IκB发生磷酸化而失活,暴露出活性的p50-p65;或因p105 的C- 端磷酸化降解从而形成活性的p50-p65 复合体。p50-p65 转移到细胞核并与目标基因增强子的GGGRNNYY-CL序列结合,从而启动或调节早期反应基因的转录,参与炎症反应、细胞增殖和细胞凋亡等[10,11,12,13,14]。而抗氧化剂PDTC可特异性阻断NF-κB的传导通路[15]。细胞的继发性死亡形式有3 种:包括自噬、凋亡和坏死。脑损伤后NF-κB信号转导通路对BMEC继发性死亡的影响逐渐成为研究热点。

血管内皮细胞损伤 篇7

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物及饲料

辽宁中医药大学实验动物中心引进的封闭群健康新西兰大耳白兔, 微生物控制级别为E级, 体重2.0 kg～2.5 kg,40只, 雌雄不限, 在普通环境中饲养。其中10只为正常对照组, 喂普通饲料, 不施行手术; 30只喂特制的模型饲料, 并施行手术。模型饲料 (基础饲料79%、15%蛋黄粉、猪油5%、胆固醇1%)均由辽宁中医药大学动物实验中心加工。

1.1.2 主要试剂

血小板源生长因子B蛋白(PDGF-B)抗体, SA1020 免疫组化染色试剂盒,由武汉博士德生物公司提供。

1.1.3 主要仪器

SN-695型智能放免γ测量仪,上海原子核研究所日环仪器一厂生产。SANYO MDF-382E超低温冰箱,日本三洋公司生产。恒温水浴箱、Smart View2001生物电泳图像分析软件等。

1.1.4 中药和西药

桃核承气改良方(大黄30 g,芒硝15 g,甘草15 g,肉桂15 g,桃仁15 g,水蛭25 g,金银花20 g),由辽宁中医药大学附属医院中药局提供,药物用水浸泡30 min,先武火再文火煎1 h,倒出药汁,共煎3次,将药汁合并,纱布过滤后100 ℃ 水浴浓缩至100 mL,4 ℃冰箱保存。舒降之(批号:国药准字J20060032,杭州默沙东制药有限公司)每片40 mg,阿司匹林(批号:BTA6015,拜尔药业集团有限公司)100 mg,研磨后,双蒸水溶解,13.5 mL相当含舒降之1.5 mg、阿司匹林3.7 mg,4 ℃冰箱保存。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组

将健康新西兰大耳白兔40只分为模型组、中药组、西药组、空白组,每组10只。

1.2.2 动物造模

30只兔高脂饲料喂养4周造成动脉粥样硬化模型[1] ,然后用25%乌拉坦每0.4 mL/100 g腹腔注射麻醉,于右侧腹股沟区备皮、消毒、铺巾, 利多卡因少量局部麻醉,切皮拨肉分离股动脉,两动脉夹分别夹住股动脉近心远心两端暴露2 cm左右,剪开动脉周长1/3口,用6F 穿刺针刺破动脉壁,经导丝导入直径(1.5～2.0)mm球囊导管(依血管直径大小而定),至肾动脉下方,盐水充盈球囊,缓慢回拉导管至切口处抽空球囊内液体降至零,重复上述过程3次,间隔5 min 重复1次,达到剥落腹主动脉内皮的目的。撤出导管,结扎股动脉,缝合皮肤,术后3 d连续肌肉注射青霉素每只8×105 U/d,预防感染。

1.2.3 术后喂饲

从内膜剥脱术后第2 天开始每日每只兔喂普通饲料50 g,中药组予桃核承气改良方13.5 mL/kg灌胃4周,西药组予舒降之、阿司匹林混合液13.5 mL/kg灌胃4周,模型组、空白组予生理盐水13.5 mL/kg灌胃4周(给药量按人和动物间体表面积折算的等效剂量比率表计算)。

1.3 病理标本采集与观察

腹主动脉内膜剥脱术后4周处死家兔,切开腹壁暴露腹腔,将肠管翻至一侧,见到腹主动脉与下腔静脉并行于脊柱旁,分离腹主动脉,截取长2 cm腹主动脉用生理盐水冲洗后放于10%的中性甲醛溶液中(-20 ℃)。

1.4 术后指标测定

1.4.1 中药对动脉壁PDGF-B含量影响[2]

取腹主总动脉,制成石蜡切片,3%H2O2灭活内源性酶10 min,加复合酶消化液置8 min,滴加正常山羊血清封闭液置20 min,加PDGF-B链单克隆抗体,4 ℃过夜,次日加生物素化山羊抗鼠/兔IgG,37 ℃反应40 min,滴加试剂SABC,37 ℃反应30 min,显色,脱水,中性树胶封固。新生内膜部位棕黄色颗粒为PDGF-B染色阳性信号。

1.4.2 药物对血管内膜增生的影响

标本脱水、石蜡包埋,切片5 μm HE染色,在SEM2IPS 图像分析系统(日本SONY公司),测量动脉内膜厚度、中膜厚度(μm),计算内膜/中膜厚度比,测定管腔面积、内弹力板围绕面积和外弹力板围绕面积,以内弹力板围绕面积减管腔面积得到新生内膜面积,外弹力板围绕面积减内弹力板围绕面积得到中膜面积(mm2),计算内膜/中膜面积比。每只动物随机选取3张切面分析,取平均值。

1.5 统计学处理

采用SPSS 10.0软件,数据以均数±标准差$(\overline{x}\pm s)$表示,两组间比较用 q 检验,计数资料率用χ2检验,P<0.05为有统计学意义。图像分析和统计学处理图像经Smartview 2001生物电泳图像分析软件(上海复日科技有限公司)进行处理、分析。

2 结 果

2.1 各组血管内膜和中膜厚度及面积比

中药组和西药组内膜厚度与面积、内膜/中膜厚度比、内膜/中膜面积比与模型组比较显著减少(P<0.05或P<0.01),中药组、西药组间无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

与模型组比较,1)P<0.05,2)P<0.01

2.2 PDGF-B免疫组化结果

PDGF-B免疫组化染色图像分析,阳性颗粒主要表达部位在腹主动脉内膜内皮细胞胞浆,动脉中膜及内皮下的平滑肌细胞胞浆有少量表达。空白组内膜很薄,在腔面只见一层内皮细胞核,内弹性膜呈波浪状,与中膜分界明显;模型组内膜增生严重,内弹力板不连续,内膜增厚处向腔内呈丘状或扁平状隆起,大量平滑肌细胞排列紊乱和大量泡沫细胞积聚;中药组、西药组与模型组比较内皮连续、增生减低。说明桃核承气改良方能使兔腹主动脉内膜损伤后内膜增生减低。

2.3 兔腹主动脉内膜剥脱术后28d各组动脉壁PDGF-B含量

模型组血管壁PDGF-B 含量明显增加,中药组和西药组均使血管壁PDGF-B含量下降,中药组和西药组无统计学意义。详见表2。

pg/mL

与空白组比较,1)P<0.05;与模型组比较,2)P<0.05

3 讨 论

PTCA机械性扩张血管,拓开管壁,是外源性创伤,伤及络脉,造成血行不畅,导致瘀血形成,属血瘀证范畴。《圣济总录·伤折总论》曰:脉者,血之府,血行脉中……若因伤折,内动经络,血行之道,不得宣统,瘀积不散,则为肿为痛。《温热经纬·方论》亦云:“络伤则血不能循行……其伤处即瘀阻,阻久而蓄积,无阳气以化之,乃为死血矣”。陈无择《三因方》所述“金刃所伤”。我国第一代的著名中西医结合心血管病专家廖家祯教授认为PTCA术后再狭窄(RS)从其病理过程与创伤修复相似,辨治当类同于中医修复创伤的治法。其发病理论涉及瘀、痰、虚等多个方面,病机为脏气亏虚为本,痰瘀阻滞为标。因PTCA系为外源性创伤,导致血脉受损,瘀血内停,毒邪壅于局部,与外伤的创伤过程类似,并根据病变局部的感染因素和炎症反应,PTCA术后RS的中医发病机制不单纯是痰瘀和虚,局部特点应为瘀毒互结,兼以正气亏虚。中药治疗理论则主要是活血化瘀、豁痰去浊,兼以扶正等方面,同时针对病变局部瘀毒互结的病机特点治以通下瘀毒,故治疗以“活血化瘀,通下瘀毒兼扶正气”达到防止经皮冠状动脉介入(PCI)术后RS的目的。伤寒方桃核承气汤为基础的改良方是由大黄、芒硝、甘草 肉桂、桃仁、水蛭、金银花组成。大黄破瘀泻热,芒硝泻热软坚,助大黄逐瘀泻热并为君药;桃仁为活血祛瘀之药,与大黄配伍,瘀热并治,水蛭为破血逐瘀之药,金银花芳香疏散,清热解毒共为臣药;肉桂辛散温通,通行气血经脉为佐药,炙甘草入心经,护胃安中,缓诸药峻烈之性,以为使药。该方具有活血化瘀,通下瘀毒兼扶正气之功效,使蓄血去,瘀毒清,诸证平。

现代药理研究证明,桃核承气汤配伍促进了大黄酸的吸收利用, 家兔灌服桃核承气汤后,达峰浓度较灌服单味大黄显著提高,达峰时间也有所提前,有利于桃核承气汤迅速产生抗血栓的作用,灌胃给药后可抑制动物血栓形成和血小板聚集[3]。桃仁的乙酸乙酯提取物在抗血栓作用方面表现较显著[4]。水蛭素是水蛭唾液的提取物之一,是凝血酶的特异性抑制剂。有研究应用120I标记血小板观察了水蛭素对模拟血管成形术后血小板沉积量的影响,结果表明水蛭素组损伤段血小板沉积量与对照组损伤段相比减少了43%[5]。张涛等[6]利用家兔实验性动脉粥样硬化狭窄模型并进行PTCA 术后,饲入水蛭粉,血管造影发现水蛭组动脉内膜血管平滑肌细胞(VSMC)分化较好,细胞内粗面内质网较少,肌丝较多,而对照组VSMC合成型多见含有较多的粗面内质网。提示水蛭有抑制PTCA 术后VSMC增生,减轻内膜增生,降低再狭窄率的作用。肉桂和肉桂醛对氧自由基诱导的自发性高血压大鼠离体主动脉收缩有抑制作用[7],金银花有抑菌、抗炎、抗病毒的作用,能显著降低多种模型小鼠血清胆固醇(TC)及动脉粥样硬化指数,提高高密度脂蛋白、胆固醇含量,保护胰腺B 细胞及弱降糖作用[8]。

PCI治疗冠状动脉狭窄,最佳的心肌再灌注对接受PTCA对急性心肌梗死(AMI)病人生存是重要的[9],术后再狭窄发生率高达10%～20%。Danenberg证实在新生内膜内,巨噬细胞显著增多并且表达多种生长因子,细胞因子和酶参与新生膜的形成[10]。当球囊损伤血管壁的早期,由于内皮细胞受损,基底膜暴露,胶原纤维粘连等和促凝血物质释放入血液,同时多种细胞因子、生长因子和趋化因子分泌增加,从而促进了炎细胞侵入和有害物质的透入,诱发局部病毒感染,进而启动和引起一系列血管损伤和修复反应,引起大量的血小板聚集、黏附、释放。其中大量的PDGF 促使单核巨噬细胞、平滑肌细胞向内膜下迁移、增生,同时产生多种细胞因子和生长因子,再通过自分泌和旁分泌的作用,形成复杂的作用网络,导致局部细胞脂质代谢异常,泡沫细胞形成和细胞基质过量产生,形成动脉粥样硬化特征性斑块,导致再狭窄的发生。PDGF或其受体的特异性阻滞剂能够抑制内膜的增生。任宏生等[10] 实验研究表明西药氯吡格雷可以减轻兔髂腹动脉球囊损伤后血管内膜增生,抑制PDGF表达。本实验表明, 模型组球囊损伤内膜后, 损伤动脉可见有明显的新生内膜形成, 中药组内膜厚度与面积、内膜/中膜厚度比、内膜/中膜面积比较模型组显著减少,桃核承气改良方的通下瘀毒、扶助正气之功效使炎细胞和有害物质不易透入,抑制血小板聚集、黏附及血管平滑肌细胞增殖,使PDGF分泌减少,内膜增生减低,明显抑制管腔狭窄,为中医药防治PCI术后的再狭窄提供了有利有理的实验依据。

参考文献

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[3]谢华,马越鸣,王天明,等.桃核承气汤及单味大黄中大黄酸在家兔体内的药代动力学[J].中药药理与临床,2005,21(2):1-5.

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血管内皮损伤的机制探讨 篇8

1 内皮功能障碍

内皮功能障碍是动脉粥样硬化的起始环节和关键环节[2], 血管内皮功能障碍主要与以下因素相关。

1.1 内皮素内皮素

内皮素内皮素 (endothelin, ET) 是迄今为止发现的作用最强的缩血管物质, 对维持基础血管张力与心血管系统稳态起重要作用。其引起的血管收缩、心肌缺血和细胞增殖是与血管损伤有关疾病的共同致病因素。研究发现[3,4,5], 血浆ET水平与AS家兔冠状动脉内皮损伤程度具有较好的相关性。

1.2 一氧化氮

一氧化氮 (nitric oxide, NO) 广泛分布于生物体内各组织中, 是一种新型生物信使分子。NO在维持血管张力的恒定和调节血压的稳定性中起着重要作用, 血管内皮细胞有产生NO的体系, 内皮依赖的血管功能受损主要因为内皮NO的活性受损。潘德茂等[6]研究发现, 不稳定性心绞痛组患者的NO水平较稳定性心绞痛患者有所升高, 可以认为UAP患者的内皮功能损伤较为明显。

1.3 内皮一氧化氮合酶 (NOS)

内皮一氧化氮合酶 (NOS) 于血管内产生一氧化氮及协助调节血管功能, NO含量的增加主要是由NOS活性增加所致[7]。近年来研究发现[8], NOS合成NO的减少及相关代谢调节在AS的发展和形成中起着重要作用。Kawashima等[9]研究表明, AS与内皮依赖性的血管扩张障碍有关, 由于内皮NOS产生的NO生物活性的减少。

1.4 血管内皮细胞膜超微结构变化

研究表明[10], 在AS较早期血管内皮细胞超微结构就已有了改变。VEC的形态及表面结构变化很可能是AS发生发展中的关键环节, VEC表面粗糙程度的增加可能使白细胞更易于牢固地黏附于内皮细胞上, 有利于血小板的聚集, 加大与血液间的摩擦力引起脂质的沉积, 从而加速了AS的发生发展[11,12]。

1.5 内皮祖细胞

内皮祖细胞 (Endothelial Progenitor Cells, EPCs) 是一群能增殖分化为成熟血管内皮细胞但尚未表达成熟血管内皮细胞表型, 并参与出生后新生血管形成及内皮损伤修复的干/祖细胞。最近研究发现内皮损伤后的修复过程除了相邻成熟内皮细胞延展修复, 还有一部分是通过外周血中的EPC分化为成熟内皮细胞来完成, 老化的AS机体可能加速骨髓内皮祖细胞的消耗[13,14,15]。

2 各种危险因子

2.1 脂质代谢异常

研究发现AS白兔实验4周时已有高脂血症形成, 高脂血症能促进超氧阴离子 (02-) 产生, 使低密度脂蛋白氧化修饰, 是AS的危险因子之一[3]。氧化型低密度脂蛋白 (ox-LDL) 对动脉内膜造成功能性损伤, 使内皮细胞和白细胞表面特性发生变化, 黏附因子表达增加。单核细胞黏附在内皮细胞上的数量增多, 并从内皮细胞之间移入内膜下成为巨噬细胞, 通过清道夫受体吞噬ox-LDL转变为泡沫细胞, 形成最早的粥样硬化病变脂质条纹。其主要机制包括以下几个方面。

2.1.1 氧化型低密度脂蛋白

氧化型低密度脂蛋白 (oxLDL) 所导致的内皮细胞 (EC) 形态结构的损伤和功能失调是引发AS的病理生理学基础, ox-LDL具有高度细胞毒性, 损伤EC, EC损伤后, 其脆性增加, 黏附性变大, 使更多的低密度脂蛋白进入内膜下沉积, 并氧化成氧化型低密度脂蛋白, 形成恶性循环[16]。

2.1.2 其他因素

凝血酶活化纤溶抑制剂 (TAF1) 可被凝血酶、凝血酶调节蛋白 (TM) 、纤溶酶等多种物质激活发挥抗纤溶作用。在AS的发生过程中血脂与血浆TAFI活性呈正相关, TAFI参与了AS的形成过程, 其活性升高可能是AS的致病因素之一[17]。血管内皮增长因子 (Vegf) 和NO对保持内皮完整性起着重要的作用。早期AS的增高有可能是一种对内皮损伤的保护反应[18]。Ryoo等[19]研究发现精氨酸酶2在胆固醇介导的内皮功能障碍过程中起着重要的作用。

2.2炎症反应

近年来研究认为AS是一种慢性炎症性疾病, 炎症反应的激活可能是导致斑块不稳定的一个重要因素, AS斑块中存在的巨噬细胞即炎症免疫细胞一方面分泌大量细胞因子, 另一方面也受多种炎性细胞因子的调控。从而表明炎症刺激能够诱导炎症因子释放增加, 损伤动脉血管内皮细胞, 促进AS的发生[20]。

在炎性标志物中, 对C-反应蛋白 (CRP) 研究的最广, 它可直接诱导炎症, 是心血管疾病最有力的预示因子与最重要的危险因子, 是预测心血管事件最有效的炎性标志物。CRP剂量依赖性激活血管内皮细胞的炎症因子表达中, NF-κB途径被激活参与致AS作用, NF-κB在炎症反应的基因表达中也可能发挥着重要的作用, 可影响AS斑块的稳定性[21,22]。NF-κB作为调控多种免疫、炎症因子的转录因子, 是TNF信号通路的重要环节。TNF-α作用于血管内皮细胞, 损伤内皮细胞或导致血管功能紊乱, 使血管损伤和血栓形成。AS早期的重要的一步就是循环中的单核细胞黏附到血管内皮上, 炎症介质TNF-α通过激活NF-κB调控黏附分子的表达。

2.3 氧化应激

氧化应激是指机体或细胞内以氧自由基为代表的氧化性物质的产生与消除失衡, 或外源性氧化物质的过量摄入, 导致氧化性物质在细胞内蓄积而易于引发氧化反应状态。病理状态下, 活化内皮细胞产生大量的氧自由基, 同时自由基清除能力降低, 使血液中氧自由基含量增加, 内皮细胞长时间暴露在高浓度的活性氧条件下, 最终导致损伤。氧化应激在冠状动脉内皮细胞缺氧/再给氧损伤过程中起重要作用, 冠心病患者体内氧化应激水平较高, 其血清清除超氧阴离子能力下降[23,24]。

2.4 高血糖

高血糖可促进细胞死亡, 受损的内皮细胞释放缩血管活性物质, 增加了血管通透性, 血浆中的胰岛素、血管紧张素Ⅱ、生长因子等向血管壁的基底膜渗透增多, 从而使基底膜成分增加。同时, 糖基化或氧化后的低密度脂蛋白 (LDL) 与血管胶原糖化终产物结合后, 可阻止LDL弥散出血管内膜而滞留于血管内膜, 激活和分化单核-巨噬细胞, 使之摄取自身后转变为泡沫细胞。故合并糖尿病时通过粥样病变内巨噬细胞浸润增强和平滑肌细胞密度减少可降低病变稳定性, 糖尿病可增强动脉粥样硬化病灶内炎症反应, 且经研究证实胰岛素抵抗越严重, 血糖控制越差, 内皮受损程度越严重[25,26]。

2.5 血管紧张素Ⅱ (AngⅡ)

AngⅡ浓度的升高, 可改变内皮细胞的氧化/还原状态, 促进动脉内皮细胞凋亡, 影响血管内皮细胞衍生的血管活性物质的表达等, 进而增加血管内皮细胞或内膜的通透性, 从而加重血管内皮损伤[27,28]。

2.6高同型半胱氨酸血症

高同型半胱氨酸血症 (Hyperhomocysteinemia, Hhcy) 为心血管疾病的独立危险因素, 高Hhcy血症促进动脉粥样硬化形成的始动因子是动脉内皮损伤, Hhcy诱导的内皮依赖性血管舒张功能障碍主要与内皮细胞分泌NO的功能下降有关[29]。而Hhcy的巯基有利于活性氧物质的产生, 造成血管内皮细胞的化学损害, 从而有利于血液中单核细胞、低密度脂蛋白胆固醇等进入内皮下间隙, 促进脂质斑块的形成[30]。Hhcy亦可通过氧化应激机制损伤血管内皮细胞, 促进动脉粥样硬化的形成[31]。

3 血流动力和血管应力

内皮细胞的损伤是AS进程的开始, 各种危险因子诱导内皮细胞机械损伤, 触发巨噬细胞入侵和脂质的沉积, 连续的损害导致内皮细胞功能的失调, 是AS的前提条件。血流动力和血管应力影响内皮细胞的形态、排列、迁移和凋亡, 引起内皮细胞骨架结构和细胞间连接发生变化, 调节血管活性物质、生长因子、黏附分子等的合成及表达, 是心血管疾病的病理启动因子。Dai等[32]在内皮细胞生物力学的研究中发现, 内皮细胞在不同的血管体中所经历的生物力学模式在调节内皮细胞功能和决定上对AS的区域敏感性起着非常重要的作用。

4 其他

郑文洁等[33]探讨抗内皮细胞抗体 (antiendothelial cell antibody, AECA) 对内皮细胞凋亡的影响及重组α-烯醇化酶对内皮细胞凋亡的阻断作用时发现, AECA在体外可诱导内皮细胞凋亡, 引起内皮细胞损伤。王桂霞等[34]关于细胞毒性物质的研究表明, 烟草中含多环芳烃, 尤其是7, l2-二甲基苯蒽、苯并芘可与高密度脂蛋白及低密度脂蛋白结合, 到达心脏、主动脉、肺等组织, 促进这些细胞毒性物质进入内皮细胞, 损伤内皮细胞, 加速动脉粥样硬化, 吸烟20 min即可损伤冠状动脉内皮细胞。一些外源性毒素和内源性毒素如甲乙二醛、丙烯醛、内毒素等, 均可造成血管内皮损伤。钙磷代谢异常亦可导致内皮细胞的损伤[35]。