淋巴管内皮细胞（精选8篇）
淋巴管内皮细胞 篇1
淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1(lymphatic endothelium specific hyaluronan receptor-1,LYVE-1)在一些巨噬细胞上有表达[1],这些LYVE-1+巨噬细胞在淋巴管的发生过程中可能起重要作用[2,3]。KIM等[4]研究鼠胚胎期血管和淋巴管的发育,发现小肠内淋巴管丛和毛细淋巴管的分支形成,需要LYVE-1+巨噬细胞的参与。本文可为研究LYVE-1+巨噬细胞在淋巴管的形成中的作用提供实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料来源
选用C57BL6小鼠。孕鼠的选择及实验操作依据韩国加图立医科大学动物中心的要求。取怀孕后第13～16天(E13～16)的胎鼠和生后第1、4、14和21天(P1～21)及成年小鼠肾,每年龄段取小鼠3、4只。
实验动物用16.5%的乌拉坦(1 m L/100 g)腹腔内注射麻醉。妊娠期小鼠仰卧位固定于手术台上,剖腹取胎鼠,分离肾,过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛(periodate-lysine-paraformaldehyde,PLP)液固定4℃过夜。出生后所有的小鼠,心脏灌注固定,分离肾,切成2、3 mm厚,PLP固定4℃过夜。小鼠肾用震动切片机(Technical Products International,美国)切片,片厚50μm,30%蔗糖4℃过夜,-70℃保存。
1.2 主要试剂
兔抗小鼠多克隆抗体LYVE-1(稀释度1∶1 000)购自Research Diagnostics Inc;大鼠抗小鼠多克隆抗体CD45(稀释度1∶50)购自BD Bioscience;大鼠抗小鼠F4/80(稀释度1∶30)与单克隆抗体Nestin(稀释度1∶2 000)均购自Serotec;单克隆抗体Vimentin稀释度(1∶2 000)购自Dako;过氧化物酶连接的驴抗兔IgG(稀释度1∶100)、Alexa488-连接的驴抗兔抗体、cy3-连接的驴抗大鼠抗体与cy3-连接的驴抗小鼠抗体(稀释度均1∶1 000)均购自Jackson Immuno Research Laboratories;明胶、皂甙和牛血清白蛋白均购自Sigma-Aldrich。
1.3 免疫组织化学检测LYVE-1的表达
新配制的50 mmol/L NH4Cl/PBS洗10 min×3次,0.3%H2O2洗10 min,高浓度白蛋白(0.01 mol/L PBS 100 m L,明胶0.2 g,皂甙0.05 g,牛血清白蛋白1.0 g)洗4 h,以上操作均在4℃环境中进行。在高浓度白蛋白稀释的LYVE-1中孵育,4℃过夜。室温1h,低浓度白蛋白(0.01 mol/L PBS 100 m L,明胶0.2g,皂甙0.05 g,牛血清白蛋白0.1 g)洗1 h,在过氧化物酶结合的驴抗兔IgG中孵育2 h,低浓度白蛋白洗30 min。0.1%DAB 5 min后每孔滴加3%过氧化氢溶液45μL,显色10 min。梯度乙醇脱水各5 min,丙酮15 min×2次,丙酮∶环氧树脂=3∶1混合液内1 h,丙酮∶环氧树脂=1∶1混合液内1 h,丙酮∶环氧树脂=1∶3混合液内1 h,纯环氧树脂中过夜,封片,烤干。镜下观察,拍照(图1和3)。
1.4 电镜标本制备
LYVE-1免疫组织化学DAB显色后,1%戊二醛4℃1 h,1%四氧化锇4℃1 h,50%乙醇5 min,70%乙醇4℃过夜。1%醋酸铀室温1 h。乙醇梯度脱水,丙酮15 min×2次,丙酮∶环氧树脂=3∶1混合液内1 h,丙酮∶环氧树脂=1∶1混合液内1 h,丙酮∶环氧树脂=1∶3混合液内1 h,纯环氧树脂中过夜,封片,烤干。选取所需结果,制作半薄切片,电镜观察,拍照(图4A、C、E和F)。将过滤的1%硼砂甲苯胺蓝染液滴在切片上,在60℃～80℃的温台上加热约2 min,用水冲去多余的染液,自然晾干,用中性树胶封片,镜下观察,拍照(图4B和D)。
1.5 免疫荧光染色
50 mmol/L NH4Cl/PBS洗10 min×3次,PBS洗10 min×3次。高浓度白蛋白洗4 h。LYVE-1分别与F4/80、CD45、nestin或vimentin混合,用高浓度白蛋白稀释,4℃孵育过夜。室温1 h,低浓度白蛋白洗1h。Alexa488-结合的驴抗兔抗体与cy3-结合的驴抗大鼠或cy3-结合的驴抗小鼠抗体混合,避光孵育2h。低浓度白蛋白洗30 min,0.1 mmol/L PB洗5min×3次,均避光操作。封片,荧光显微镜观察,拍照(图5)。
2 结果
2.1 LYVE-1+细胞的分布
在胚胎期,第13天在肾髓质中(图1A)可检测到LYVE-1+细胞。LYVE-1+细胞主要位于髓质,皮质也可见到(图1B和C)。出生后第1天阳性细胞数量显著增加,出生后第4天到达顶峰(图2)。此后,这些LYVE-1+细胞的数量从肾乳头开始逐渐减少(图1E),到出生后第21天逐渐消失(图1F和2)与成年肾的表达相同(图1G)。
A:在髓质可见到LYVE-1+单个细胞(箭头所示)。B:在胚胎期第14天可看到发育良好的LYVE-1+淋巴管丛。B’中箭头所示发育中淋巴管有出芽。C～G:LYVE-1+淋巴管在皮质弓形血管和小叶间血管周围逐渐形成,在髓质LYVE-1+单个细胞数量逐渐增多直到出生后第4天(C,D),然后逐渐减少直到出生后第21天(F)完全消失。D’说明在出生后第4天肾乳头有LYVE-1+单个细胞。
镜下观察,胚胎期肾不同发育阶段LYVE-1+的单个细胞有粗而不规则的突起,出生后这些突起逐渐变细变长(图3)。
2.2 LYVE-1在细胞的表达
电镜显示,出生后第4天LYVE-1+单个细胞出现在肾皮质(图4A～C)和髓质(图4D～F)。这些细胞的细胞核不规则,胞质有大小不一的囊泡和空泡,LYVE-1表达在这些细胞的细胞膜和细胞内小囊泡上。而在一些典型的间质细胞上,未检测到LYVE-1的免疫活性。
2.3 免疫荧光染色
为了确认这些LYVE-1+单个细胞是否为巨噬细胞,进一步研究分别应用巨噬细胞的标记物F4/80(小鼠非成熟巨噬细胞标记)、CD45(白细胞共同抗原)、Nestin(干细胞标记)或Vimentin与LYVE-1进行双标记免疫荧光检测。结果发现,在发育中小鼠肾,大多数LYVE-1+单个细胞与F4/80(图5A)共同表达,但不与CD45(图5B)、Nestin(图5C)或Vimentin(图5D)共同表达。证实LYVE-1+单个细胞是巨噬细胞。
3 讨论
MARUYAMA等[2]报道单核细胞暴露于TNF-α及其他促炎症反应因子时,能转化为分泌VEGF-C的巨噬细胞,这样的巨噬细胞能诱导淋巴管内皮细胞增生。在小鼠角膜移植模型中,巨噬细胞通过细胞聚集,形成管形结构然后形成淋巴管而转化为淋巴管内皮细胞。实验证明,在小鼠角膜移植中CD11b+的巨噬细胞可以形成管形结构并表达淋巴管一些特异性标志,如LYVE-1和podoplanin。在炎症角膜中,系统性的去除巨噬细胞可几乎完全抑制淋巴管的形成。SCHLEDZEWSKI等[3]报道在恶性肿瘤和愈合的伤口中,LYVE-1+/CD11b+巨噬细胞也同时表达F4/80。本研究结果说明,从胚胎期第13天到出生后第14天,LYVE-1在很多间质细胞中表达。LYVE-1+细胞有粗而不规则的突起,而且这些细胞比F4/80+细胞数量要少。但是,LYVE-1+细胞与F4/80+细胞有大量的重叠,因为大多数LYVE-1+单个细胞也表达F4/80。在发育的小鼠肾中,LYVE-1+单个细胞与CD45、Nestin或Vimentin双标记荧光染色显示,这些细胞均未发现共表达。报道显示,有很多树突细胞亚群可通过其表面标记物予以确认,如非成熟树突细胞亚型表达F4/80[5,6]。本研究证明,在发育的小鼠肾中LYVE-1+单个细胞为F4/80+非成熟巨噬细胞/树突细胞。
值得注意的是,F4/80+/LYVE-1+非成熟巨噬细胞/树突细胞主要位于外髓内带的外侧。然而,发育中的LYVE-1+淋巴管主要位于皮质。组织中巨噬细胞是VEGF-C的一个重要来源,VEGF-C在炎症和肿瘤组织淋巴管的发生中起到重要作用。巨噬细胞在VEGF-A介导的淋巴管形成中起到重要作用。笔者推测,发育中的小鼠肾中F4/80+/LYVE-1+非成熟巨噬细胞/树突细胞可能通过旁分泌VEGF-C,在淋巴管发生中发挥重要作用。这种假定与以前的发现相吻合,例如在移植的肾和角膜中[2,7,8]、肿瘤组织中和皮质纤维化的残余肾模型中,淋巴管的发生与巨噬细胞的亚型密切相关。尽管一些F4/80+/LYVE-1+非成熟巨噬细胞/树突细胞可在发育中的淋巴管周围观察到,但是尚未观察到这些细胞形成管样结构。也很难排除这些细胞能够聚集循环系统中的祖细胞,并且转化为淋巴内皮细胞[9]。这种F4/80+/LYVE-1+非成熟巨噬细胞/树突细胞在发育的淋巴管中起的具体作用有待于进一步研究。
摘要：目的 探讨淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1(LYVE-1)阳性细胞在发育中小鼠肾内的分布及形态特点。方法 胚胎期第13～16天(E13～16)的胎鼠和出生后第1、4、14和21天(P1～21)及成年的小鼠肾,震动切片后进行LYVE-1免疫组织化学和免疫荧光染色。结果 LYVE-1+细胞在小鼠胚胎期第13天的肾髓质开始表达,这种细胞的数量逐渐增多直到出生后第4天,然后逐渐减少,直到出生后第21天完全消失。这些细胞有粗而不规则的突起,出生后这些突起逐渐变细变长。免疫荧光证实其为巨噬细胞。结论 LYVE-1+细胞为巨噬细胞,并在淋巴管的发生中起一定的作用。
关键词：肾,淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1,巨噬细胞,小鼠
参考文献
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用母亲淋巴细胞可治子女淋巴瘤 篇2
儿童EB病毒(一种疱疹病毒)相关淋巴瘤恶性度很高，迄今还没有很好的治疗方法，患者常年发烧、肝脾淋巴结肿大，抗病毒治疗或者化疗均不能达到满意效果。在科技部国际科技合作重大项目资助下，朱平课题组开展相关研究。他们在临床治疗中注意到，有一种儿童淋巴瘤类似的疾病，称为“移植后EB病毒相关性淋巴增殖病”，采集供者的淋巴细胞输注给患者，可以取得较好的疗效。但由于异体排斥反应，很可能发生移植物抗宿主病。针对上述问题，朱平设想，妊娠时期母亲和胎儿间会发生双向血流交换，很可能在母亲和孩子体内存活着对方的细胞(微嵌合状态)，他们的淋巴细胞也很可能相互识别，不容易发生排斥反应。如果母亲淋巴细胞具有免疫活性，能够清除EB病毒感染细胞和肿瘤细胞，就有可能用淋巴细胞输注的方式治疗这类疾病。
研究人员建立了更为敏感的检测母亲和孩子体内存活着对方的细胞的微嵌合状态的检测技术，发现许多母亲体内存在孩子的微嵌合体，最年长的孩子已经达30岁，证实相当多的母亲体内长期存活着子女的细胞。他们在确定5名儿童EB病毒相关淋巴瘤患者母亲体内都存在孩子微嵌合体，采集母亲淋巴细胞，分别对这5名患者进行大剂量输注，患者均在输注后一周左右临床症状明显改善，淋巴结肿大迅速消退，EB病毒消失，并且没有一例发生明显移植物抗宿主病。
淋巴管内皮细胞 篇3
1 材料与方法
1.1 材料
HepG-2细胞株由大连医科大学附属第一医院中心实验室提供。HLEC购自上海丽臣商贸有限公司。基质胶购自GIBICO公司。台盼蓝购自迈晨科技有限公司。胎牛血清(FBS),低糖IMDM培养基,高糖DMEM,胰蛋白酶:购自GIBICO公司。
1.2 细胞培养
将HepG-2细胞常规复苏后接种于含10%新生牛血清的低糖IMDM培养液于37℃,CO2体积分数为5%的培养箱中培养。取对数生长期细胞用0.25%的胰蛋白酶消化,行细胞计数。HLEC培养与HepG-2细胞培养方法基本相同。实验均在细胞对数生长期内进行。
1.3 建立HLEC与HepG-2细胞共培养系统
根据实验不同选择不同孔径的insert(上室)和不同规格的培养板(下室)建立起transwell共培养系统。培养板预先用自制的鼠尾胶包被。首先取对数生长期的HepG-2细胞,消化制成细胞悬液,接种于下室内,于5%CO2、37℃、饱和湿度的孵箱中培养。12h后,取处于对数生长期的HLEC,消化制成细胞悬液,接种于上室,然后放于孵箱中共培养。
1.4 细胞增殖实验
取transwell(0.4µm孔径,6孔培养板)小室,6孔培养板预先用自制的鼠尾胶包被。将HLEC消化制成细胞悬液,调整细胞数为1×104/mL,接种1mL于下室内,于5%CO2、37℃孵箱中培养。12h后,HepG-2细胞重悬,调整细胞数为1×104/mL接种于上室,同时设立空白对照组(未加HepG-2细胞),然后放于孵箱中共培养。绘制细胞生长曲线:实验中各组分别设6个时间平行孔,每个时间点又分别设3个复孔。每隔24h、连续6d对HLEC进行台盼蓝染色。每个样本随机选取5个视野(×200)计数,并记录每个时间点的平均细胞数。以培养时间为横坐标、平均细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。本试验重复3次。
1.5 细胞迁移实验
取transwell(8µm孔径,24孔培养板)小室,其中小室内预先铺设基质胶10µL。首先将HepG-2细胞消化制成细胞悬液,调整细胞数为1×104/mL分别接种1mL于下室内,于5%CO2、37℃孵箱中培养。12h后,将HLEC消化制成细胞悬液,调整细胞数为1×105/mL,0.1mL接种于上室,并设立空白对照组(下室未加HepG-2细胞),孵箱中培养24h后取出insert上室,用棉签轻轻擦去内表面的基质胶和HLEC。将insert上室置入95%乙醇中固定10分钟,行HE染色。倒置相差显微镜下照相,计数迁移到insert外表面的细胞数量。每个样本随机计数5个视野(×200)的细胞数,取平均值进行比较,实验重复3次。
1.6 基质胶实验
选择孔径为0.4µm的insert(上室)和6孔培养板(下室)建立起transwell迁移系统,6孔培养板预先铺设基质胶800mL/孔,基质胶(10g/L)与无血清的EBM-2(含10µg/LVEGF-C)按4:1加入。首先将HLEC消化制成细胞悬液,调整细胞数为1×104/mL,分别接种1mL于下室内,于5%CO2、37℃、饱和湿度的孵箱中培养。12h后,将HepG-2细胞消化制成细胞悬液,调整细胞数为1×105/mL,0.1mL接种于上室,同时设立空白对照组(上室未加HepG-2细胞),然后放于孵箱中共培养。24h后,倒置相差显微镜亮视野观察淋巴管内皮细胞聚集和管状结构形成情况。镜下(×200)随机选取5个视野,计数HLEC聚集数量和管状结构形成情况,实验重复3次。
1.7 统计方法
采用SPSS 11.5统计软件处理实验数据,进行统计学分析,结果以均数±标准差表示。与对照组比较采用t检验,两实验组均数比较采用方差检验,以P<0.05作为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 成功构建HLEC与HepG-2细胞transwell共培养体系,其中HLEC于上室,HepG-2细胞于下室。
2.2 HepG-2细胞对HLEC增殖的影响
通过绘制细胞生长曲线,观察HepG-2细胞对HLEC增殖的影响。结果表明,与HepG-2细胞共培养体系中HLEC增殖速度明显高于HLEC单独培养组(P<0.05,图1A,图1B)。
1.单独培养的HLEC;2.与HepG-2细胞共培养系统中的HLEC
2.3 HepG-2细胞对HLEC迁移的影响
通过细胞迁移实验,观察HepG-2细胞对HLEC迁移的影响。结果表明,与HepG-2细胞共培养体系中HLEC迁移率(2.03±0.21)显著高于单独培养的HLEC迁移率(1.00±0.06,P<0.05,图2A,图2B)。
2.4 HepG-2细胞对HLEC管状结构形成的影响
通过基质胶实验,观察HepG-2细胞对HLEC管状结构形成的影响。使用基质胶作为淋巴管样结构形成的支持物,结果表明,与HepG-2细胞共培养体系中HLEC成管率(1.67±0.12)显著高于单独培养的HLEC成管率(1.00±0.08,P<0.05,图3A,图3B)。
3 讨论
作为肿瘤早期转移的主要方式,淋巴道转移机制的解析,对于肿瘤转移早期治疗有深远意义[5]。新近,肿瘤淋巴道转移机制研究取得进展,研究表明,肿瘤淋巴管生成与肿瘤淋巴道转移关系密切。
1.单独培养的HLEC;2.与HepG-2细胞共培养系统中的HLEC
1.单独培养的HLEC;2.与HepG-2细胞共培养系统中的HLEC
恶性肿瘤组织周围存在着淋巴管新生和淋巴管扩张的现象,恶性肿瘤具有使其周围淋巴管数目增加的特性,从而提高转移性能[6,7]。有关肿瘤淋巴管新生与肿瘤淋巴道转移的关系,已在诸多肿瘤研究中基本达成共识。有关肝癌淋巴管新生的研究未见报道,肝癌是以血管转移为主的恶性肿瘤,研究表明,淋巴道转移仅占肝癌转移总数的12.6%。我们关注了肝癌细胞与淋巴管内皮细胞互动过程中,对淋巴管内皮细胞生物学行为的影响,人淋巴内皮细胞体外培养为从细胞水平研究淋巴管生成提供了一个很好的研究平台,我们采用transwell小室建立HLEC与HepG-2细胞非接触共培养体系:下层培养液中HepG-2细胞的成分可以影响到上室内的HLEC细胞,从而分析下层HepG-2细胞分泌或代谢产物对上室内HLEC增殖、迁移、管状形成等的影响[8]。通过共培养体系,可以在相对接近体内环境下观察细胞与细胞之间的相互影响。
我们的研究表明HepG-2细胞能够促进HLEC细胞的增殖、迁移及管状形成,提示肝癌细胞能够诱导肿瘤淋巴管形成,肝癌淋巴管形成,可能参与了肝癌淋巴道转移。
参考文献
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淋巴管内皮细胞 篇4
【摘要】血管内皮细胞生长因子(VEGF)是机体内促进血管生长最主要的生长因子,VEGF特异性地作用于内皮细胞,促进其增殖和血管生成。因此,以VEGF为基础的治疗性血管生成的研究备受关注。
【关键词】血管内皮细胞；生长因子；干细胞移植
【中图分类号】R318.06【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)08-0032-02
1骨髓间充质干细胞
1.1BMSC的生物学特性间充质干细胞是中胚层发育的早期细胞,为多能干细胞,主要存在于全身结缔组织器官间质中,其中以骨髓组织中含量最为丰富,称为骨髓间充质干细胞。其具有自我更新和多向分化的潜能,在不同的微环境中能够分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、纤维细胞、内皮细胞等,特别是能够横向分化为神经细胞。其具有取材方便、扩增迅速、可自体移植等特点。BMSC没有特异性的表面标志，在其表面存在一些与造血干细胞不同的表面抗原，目前一致认为BMSC对于CD29，CD44，CD90，CD105，CD71，SH-2,SH-3等呈阳性反应，同时对于造血干细胞的表面标志CD11b、CD45、CD34等呈阴性反应[1,2]。形态上多呈扁平梭形或星形细胞，因此BMSC可通过细胞的表面标志和细胞形态进行初步鉴定。目前常用的BMSC分离的方法主要有三种：贴壁筛选法、密度梯度离心法和流式细胞仪分离法。
1.2BMSC作为种子细胞治疗疾病的优越性BMSC具有很多其他干细胞没有的特性,使其成为很多治疗疾病的种子细胞:①可来源于自体,取材方便,分离获取容易,没有伦理学争议。②在体外培养能快速扩增,且能永久分化,可诱导分化为各种细胞。免疫原性弱,安全性好。④能在组织中成活、迁移和分化。⑤可分泌多种细胞因子、集落刺激因子、干细胞生长因子、多种黏附分子等 ,在组织发育及分化过程中发挥重要作用。因其有以上优越性,表明BMSC是疾病治疗的理想种子细胞之一。
1.3BMSC作为外源性基因细胞载体的优越性①转染后骨髓间充质干细胞仍可以保持其干细胞的多向分化潜能。②外源性基因的产物可随骨髓间充质干细胞迁移至缺血损伤区,充分发挥其作用,改善组织修复的微环境。③骨髓间充质干细胞可转染外源性营养因子促进自身和神经干细胞存活、增殖、分化,同时亦可转染凋亡基因如 bcl-2等抑制脑细胞凋亡,减轻神经组织的进一步缺血损伤。因此,通过导入目的基因,将细胞治疗与基因治疗相结合,对脑梗死的治疗将具有更广泛的前景。
2血管内皮细胞生长因子
2.1VEGF的生物学特性VEGF特异性促使血管内皮增殖的有丝分裂原，是机体内促使血管生成的最主要生长因子，其功能是刺激血管内皮细胞生长，启动血管形成和增加血管通透性，并能与内皮细胞表面的特异性受体结合，强烈的促进血管内皮细胞增殖，诱导血管生成，在胚胎发育、创伤修复、侧枝循环建立等病理生理过程中发挥重要作用。VEGF165在组织和细胞中的含量最丰富，而且它是一种分泌性生长因子，广泛地在多种组织细胞中表达，不仅具有促进血管生成活性，而且其表达产物是可溶性的。从细胞中分泌出来，扩散性强，易到达靶细胞，能很好的发挥生物学活性。
2.2VEGF基因转染BMSC移植治疗疾病的优势对于移植的BMSC进行VEGF基因修饰后，就会从几个方面加强疾病的治疗作用。㈠大量的血管新生可以改善梗死边缘区休眠细胞的血供，改善和恢复其功能；㈡血管内皮细胞生长因子在促进血管新生的同时，还可以直接刺激血管扩张，血供的改善可以提高移植细胞的成活率并为其以后的长期增殖分化提供一个良好的生存环境；㈢移植细胞存活数量可能增多，因为通过对移植细胞的基因修饰可提高其移植后的存活率。因此，将细胞治疗和基因治疗结合起来将是一种新的较好的方法。
3VEGF基因转染入BMSC的方法
3.1重组载体导入真核细胞的方法将重组载体导入真核细胞的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀法，电穿孔法，DEAE-葡聚糖法，脂质体介导法，原生质融合法；病毒载体转染法，细胞核直接注射法。其中阳离子脂质体介导基因转染是近年来外源性基因导入宿主细胞的常用方法之一。
脂质体是由生物可降解成分组成，以其靶细胞范围宽、转化效率高、应用简便、毒性小、对包裹的基因没有限制，又没有病毒做载体引发生物变异和癌变的可能性等优点正受到越来越多的重视。因此在实验室研究和临床基因治疗中得到了广泛的应用。
脂质体转染基因的作用方式主要是通过脂质体与细胞膜相结合，由于其与细胞膜有相似的结构产生了脂质体与细胞膜融合，或者通过内吞的形式使得外源基因进入胞内，但是阳离子脂质体介导的外源基因主要是通过内吞的形式进入胞内，在胞内释放外源基因或者进一步与核摸结合使得外源基因直接进入细胞核，减少了外源基因被溶酶体降解，同时由于阳离子脂质体带有正电荷而核酸分子及细胞膜的电荷都是负电荷，所以阳离子脂质体与核酸和细胞膜的结合力都大大增加，从而增强了脂质体介导的转染效率。
3.2影响脂质体介导VEGF基因转染入BMSC的因素①阳离子脂质体的组成；②脂质体与DNA的比率；③脂质体的总量；④细胞密度以及脂质体/DNA复合物与细胞作用的时间；⑤转染时所用的培养液是否含有血清等。由于脂质体具有细胞毒性作用是影响基因转染效率的重要因素,因此适时终止其胞毒作用是很关键的。
4BMSC修复组织损伤的机制
大量研究表明BMSC能有效修复组织损伤, 使其功能和结构缺损得到恢复, BMSC的组织修复机制有以下几方面:①BMSC能直接分化为相应的组织细胞；②分泌营养因子促进修复；③促进内源性干细胞迁移与分化；④促进新生血管形成；⑤BMSC对损伤部位靶点的归巢；⑥抑制炎症因子的表达。
5影响BMSC移植治疗效果的因素
5.1移植BMSC的时机移植时机的选择需要考虑两个方面的影响:一是在缺血的早期,毒性物质、促炎递质和氧自由基的释放等微环境的改变对移植细胞的影响。同时,组织损伤亦释放趋化因子等使干细胞迁移至损伤部位参与修复,即缺血后组织的自身修复过程有利于细胞的存活、分化。二是在缺血的慢性期,纤维组织的形成阻碍了移植细胞的迁移、生长、整合。
5.2移植BMSC的途径脑局部立体定向注射细胞移植是一种创伤性手术,有可能会损伤正常脑组织,不易为患者接受,而经静脉或动脉注射较脑局部注射优越,因移植细胞分布更广,每次可移植的细胞数更多,操作更为方便,不需特殊装置,将来临床应用中患者更容易接受。
5.3移植BMSC的浓度BMSC的浓度影响着移植治疗的效果,研究表明,MAPCs浓度为3～6×106时,神经功能缺失症状均有恢复,而MAPCs浓度为1×106时,神经功能恢复不明显。MAPCs浓度太低,达不到治疗效果,浓度太高又易致静脉栓塞。
6VEGF基因转染BMSC的治疗应用
6.1缺血性心肌病周文武等心肌缺血动物模型中，移植后4周用Buxco系统于Wistar大鼠心尖置测压管进行有创动态心功能测定。结果表明：冠状动脉结扎后各组的大鼠收缩功能及舒张功能均受损，导致了心功能不全；在治疗后，联合组、细胞组及基因组动物均显示有不同程度的心功能改善，以联合组最明显，且心肌梗死面积明显小于对照组、细胞组、基因组，同时，细胞组、基因组动物又明显小于对照组。这说明联合治疗在抑制心室扩张、限制心室重构及促进心肌细胞修复，缓解心功能进行性下降等方面要优于单纯的细胞治疗或基因治疗；即认为血管内皮细胞生长因子基因转染BMSC移植于心肌缺血区，其疗效可能优于细胞治疗与基因治疗的单独应用。因此采用基因转染的方法将VEGF导入 MSC中就有可能使BMSC在发挥心肌修复作用的同时表达分泌 VEGF,从而促进血管的生成,有利于血管化心肌组织的新生,提高组织工程心肌组织修复缺血心肌的效果。
6.2骨缺损对骨发生，骨修复的研究证实，血管入侵是骨形成的关键环节，血管内皮细胞生长因子是其中的关键生长因子，不仅可促使血管内皮细胞的募集，迁移，增殖，协调着血管生成，并且介导成骨细胞，软骨细胞，破骨细胞等的分化及功能。骨内血管生成是骨形成早期的关键环节，骨生发中心即位于血管化的环境中，无论膜内成骨，软骨内成骨都与血管生成密切相关。禹志宏等在腺病毒介导人血管内皮生长因子165基因转染促进人骨髓间充质干细胞的成骨特点的研究中证实人血管内皮生长因子165基因重组腺病毒基因转染对人骨髓间充质干细胞成骨能力具有促进作用，验证了转染人血管内皮生长因子165的人骨髓间充质干细胞移植治疗骨疾病的可行性。 Zelzar等表明血管内皮细胞生长通过增加格根包尔氏细胞在骨膜内和软骨内的活性来促使骨的形成。J.Wang 等表明Ad-VEGF165组诱导骨形成的时间比阳性对照组早2周，这说明Ad-VEGF165能缩短骨形成的时间。在临床上，我们可以发现它能缩短治疗周期和降低细胞污染的危险性。
7小结与展望
血管内皮细胞生长因子(VEGF)是机体内促进血管生长最主要的生长因子,VEGF特异性地作用于内皮细胞,促进其增殖和血管生成。因此,以VEGF为基础的治疗性血管生成的研究备受关注。VEGF在很多正常及病理的人或动物组织中的表达水平较低无法形成有效浓度，并且VEGF蛋白的生物半衰期非常短，仅为6分钟，即使直接将VEGF应用于损伤处也会被周围组织中的酶类很快降解，不能持续发挥作用，为了解决这个问题，许多学者采取了基因治疗的手段通过许多实验也都证实了通过转基因技术可以使VEGF蛋白在机体局部持续、高效表达，为治疗各种缺血性疾病、骨折、骨缺损、骨坏死等提供了一种有效的途径。骨髓间充质干细胞（BMSC）由于具有多向分化潜能，取材方便安全、来源丰富、损伤小，易于体外培养扩增，在体外可长时间保持未分化状态，体外基因转染率高，并能稳定高效表达多种治疗性外源基因，而且自体获取的BMSC回植后不会发生免疫排斥反应等优点，BMSC已经成为重要的组织工程种子细胞，因此随着组织细胞工程学和基因工程学的兴起，若与其多向分化潜能相结合，通过导入目的基因，将细胞治疗和基因治疗结合在一起，这在临床应用中将会有广阔的前景。如将二者结合起来治疗神经系统方面的疾病，这将为神经临床科医生开拓新的思路和方法。
虽然对BMSC的研究已经取得了惊人的成果，但是也还有许多问题没有解决。目前BMSC的鉴定、分离纯化等还未形成成熟的技术体系,BMSC在体外诱导和体内移植的生物学机制还未阐明，以及通过病毒载体如腺病毒将VEGF转染到BMSC中，虽然效率高，但存在着免疫反应的危险，何适时调控VEGF表达等问题还需要深入研究。
淋巴管内皮细胞 篇5
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择佛山市顺德区第一人民医院2008年9月至2010年7月NSCLCⅠ期患者40例作为实验组,年龄43~76岁,平均58.6岁,男31例,女9例;高分化癌5例,中分化癌18例,低分化癌17例,其中有淋巴结转移16例。另外选择同期体检的健康人群40例作为对照组,年龄42~75岁,平均57.8岁,男30例,女10例。
1.2 方法
采集两组清晨肘间静脉血4mL,离心分离上层血清,置于-20℃冰箱保存。VEGF试剂盒购自保深圳晶美生物工程有限公司,采用酶联免疫吸附法,根据操作说明进行测定。
1.3 数据处理
相关数据采用SPSS11.5软件。计数资料χ2检验,计量资料t检验。P<0.05为统计学差异具有显著性。
2 结果
(1)组间比较,实验组VEGF-C(16.32±3.16)µg/L,对照组VEGF-C(10.36±2.75)µg/L,实验组显著高于对照组(P<0.05)。(2)实验组组内比较,高分化癌患者VEGF-C(18.74±4.28)µg/L,中分化癌患者VEGF-C(16.89±3.14)µg/L,低分化癌患者VEGF-C(15.13±2.87)µg/L,不同分化类型的患者比较有显著统计学差异(P<0.05);淋巴结转移患者VEGF-C(17.68±4.11)µg/L,非淋巴结转移患者VEGF-C(15.49±3.72)µg/L,比较有显著统计学差异(P<0.05)。
3 讨论
对于肿瘤患者来说,预后的判断,与肿瘤细胞是否转移有密切关系。而肿瘤细胞主要通过血管和淋巴细胞向远端全身转移。VEGF-C是特异的血管内皮细胞刺激因子,可刺激血管内皮细胞的增殖,还与血管内皮细胞的相应受体结合,促进促进淋巴管和血管的新生,淋巴管和血管内物质的渗出,可为肿瘤细胞的转移和血管内皮细胞的迁移提供基质[4]。而且VEGF-C诱导的淋巴内皮细胞大量增生,处于高渗漏状态,结构并不完善,有利于肿瘤细胞转移进入淋巴管,在病情进展中扮演重要角色。
肿瘤患者的治疗,主要是通过手术切除肿瘤大部分组织结构,然后通过化学疗法或放射疗法等手段,进一步杀灭肿瘤微组织细胞。而预后的判断,短期生存率主要与病情分期和治疗效果有关,因此,采用VEGF-C作为监测指标之一,可以为病情监测和治疗提供参考。而肿瘤患者体内的VEGF-C水平明显高于健康人士,可通过相关技术监测出来,从而为VEGF-C作为监测指标提供了技术支持。目前临床上很多采用阳性率和阴性率作为判断的指标,快速简单,但是缺乏一定的精确性。将VEGF-C具体值监测出来,可以更为准确的判断病情,但目前关于何种水平的VEGF-C对应相对病情进展的文献较少,因此其监测价值受到影响,但随着相关数据的的积累,其监测价值有望得到进一步提高。
肿瘤患者的长期短期生存率主要与病情进展程度有关,肿瘤的发生和进展,与一系列的基因突变有关。而目前的治疗,主要是基于对肿瘤细胞的杀灭。目前关于基因治疗的研究中,一种是对相关基因进行修复和抑制;另一种是对基因产物进行抑制,使相关刺激因子不能发挥其活性,从而控制病情进展,然后通过传统的治疗手段杀灭肿瘤细胞[5]。VEGF-C在肿瘤的转移中扮演重要角色,而肿瘤患者的预后,与肿瘤细胞是否发生转移有重要关系。因此,对VEGF-C进行检测,可以为追踪和阐明VEGF-C的表达过程提供参考,为未来的药物开发方向—在基因和分子水平上进行的靶向治疗提供参考。
从临床统计来看,NSCLC患者的VEGF-C水平显著高于健康人士,而且随着病情的进展,其表达水平显著升高,提示VEGF-C在肿瘤的进展中扮演重要角色。就目前来说,对NSCLC患者进行VEGF-C的监测,可以为病情进展提供参考,从而及早采取治疗,改善预后,值得临床进一步研究。
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淋巴管内皮细胞 篇6
1 材料与方法
1.1 孕早期绒毛收集
随机选择2008年12月至2009年6月在上海交通大学附属第六人民医院计划生育门诊手术室行人工流产的孕6～8周健康妇女, 年龄20～35 岁, 平素月经规则, 经B超检查证实为宫内早孕并探及原始心管搏动, 术前3月内未服用过甾体激素。孕妇无高血压、心脏病、肝炎、结核等妊娠合并症和并发症史; 患者均知情同意后签署经上海交通大学附属第六人民医院伦理道德委员会批准的同意书。将吸宫术所获得的无菌绒毛组织用于培养细胞滋养细胞。
1.2 血清标本收集及分组
选择住院正常足月妊娠剖宫产孕妇10例 (正常对照组) , 子痫前期患者20例 (子痫前期组) , 并收集两组孕妇外周血各 10 ml, 制备血清。另收集剖宫产孕妇 50例脐静脉血各50 ml, 制备血清用于培养细胞。此剖宫产孕妇和正常对照组孕妇剖宫产原因为骨盆或胎位异常、产程停滞、社会因素等。子痫前期诊断标准参考《妇产科学》第6版。两组病例的年龄、孕周、孕产次比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 所有病例均无肝肾疾病、糖尿病、原发性高血压及其他心血管疾病史。两组患者的临床资料见表1。
①与正常对照组比较: P<0.05
1.3 细胞滋养细胞、人脐静脉内皮细胞的原代培养及鉴定
按文献[3]报道的方法, 采用组织块贴壁法培养人孕早期细胞滋养细胞, 细胞在含20%人脐血清、1 ng/ml表皮生长因子 (EGF) 、青霉素和链霉素 (浓度分别为100 U/ml和100 g/ml) 的达尔伯克 (氏) 改良伊格尔 (氏) 培养基 (DMEM) 高糖培养基, 37℃、5% CO2温箱内培养。人脐静脉内皮细胞培养:无菌条件下取正常足月妊娠剖宫产胎儿娩出后脐带10 cm左右, 胰酶消化法行内皮细胞培养, 培养液为含20%人脐血清、青霉素和链霉素 (浓度分别为100 U/ml和100 g/ml) 的 RPMI-1640培养基。DAB显色加免疫组化法鉴定细胞滋养细胞和人脐静脉内皮细胞。
1.4 滋养细胞与脐静脉内皮细胞共培养模型的建立
取传至 3～4代呈对数生长期的内皮细胞 (1×106) 6孔培养板中培养24小时后行饥饿培养24小时 (更换含 1%正常脐静脉血清的培养基 ) , 进行后续实验, 将铺有鼠尾胶原的Transwell小室 (美国 BD公司 ) 放入6孔培养板, 取培养48小时的3～4代滋养细胞悬液于上室 (1×105个) , 或下室为滋养细胞上室加内皮细胞。正常对照组的模型建立:上、下室加入含10%正常对照组孕妇外周血清 ( 10%, 浓度梯度实验得出最佳有效浓度) 的培养基37℃培养24小时;子痫前期组的模型建立:上、下室加入含10%子痫前期组患者外周血清的培养基37℃培养24小时。各组实验均进行时间配对。
1.5 Transwell技术检测细胞滋养细胞的侵袭能力
取分别用正常对照组和子痫前期组孕妇外周血清共培养体系24小时后的Transwell小室, 用棉签拭去上室内未侵袭至底部的细胞, 0.1%结晶紫染色, 室温15分钟, 染色后清水漂洗, 高倍显微镜 (×200) 下每孔随机选择5个视野计数细胞。以侵袭细胞的相对数目来表示细胞滋养细胞的侵袭能力。
1.6 流式细胞仪检测人脐静脉内皮细胞 ( HUVEC) 凋亡
分别收集两组孕妇外周血清处理共培养体系24小时后HUVEC, 参照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 (购于南京凯基生物科技发展有限公司) 说明书进行HUVEC凋亡的检测。
1.7 逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 检测正常孕妇外周血清和子痫前期孕妇外周血清共培养所得细胞滋养细胞MMP-2、MMP-9mRNA及人脐静脉内皮细胞FasmRNA的表达
从PubMed检索MMP-2、MMP-9、Fas基因全序列, 以GAPDH为内参照, 引物序列由上海生物工程公司合成。内参GAPDH引物:上游5′-CAACGAATTTGGCTACAGCA-3′, 下游5′-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3′;所用MMP-2引物:上游5′-CACCTACACCAAGAACTTCC-3′, 下游5′-AACACAGCCTTCTCCTCCTG-3′;MMP-9引物:上游5′-CCCTTCTACGGCCACTACTGTG-3′, 下游5′- GCACTGCAGGATGTCATAG-3′;Fas引物:上游5′-TCTGCCATAAGCCCTGTC-3′, 下游5′- TTGGTGTTGCTGGTGAGT-3′。分别收集经两组孕妇外周血清处理24小时后的细胞, Trizol法提取细胞总 RNA, 紫外分光光度计测定其纯度及浓度, 模板 RNA500 ng, 参照TaKaRa RNA PCR Kit (大连宝生物公司) 试剂盒说明进行逆转录。PCR扩增条件:GAPDH、MMP-2、Fas: 94℃预变性 2分钟, 94℃×30秒, 56℃×30秒, 72℃×1分钟, 30个循环 , 72℃延伸5分钟;MMP-9: 94℃预变性 2分钟, 94℃×30秒, 53℃×30秒, 72℃×1分钟, 32个循环 , 72℃延伸 5分钟。 取10 μl PCR产物, 1.5%琼脂糖凝胶电泳, 用 UVIpro凝胶图像分析系统观察并摄像, 用UVIBand软件扫描分析, 以目的基因条带与GAPDH条带的灰度比值为目的基因 mRNA相对表达强度。
1.8 统计学处理
所有实验均用不同批次的标本重复3次。所有数据均采用SPSS 13.0进行处理, 结果用undefined表示, 两组间数据采用两样本均数的t检验, 以P<0.05为差异有高度统计学意义。
2 结 果
2.1 两组滋养细胞浸润结果
正常对照组细胞滋养细胞穿透 Transwell基底膜的数量为105.7±7.3, 子痫前期组为 57.5±4.4, 两组比较差异有统计学意义 (P<0.01) 。子痫前期组血清明显抑制细胞滋养细胞的侵袭能力。
2.2 流式细胞仪检测
HUVEC凋亡的结果 子痫前期血清共培养体系的人脐静脉内皮细胞凋亡率明显低于正常对照组 (P<0.05) , 见表2。
①与正常对照组比较:P<0.05 ②与同组MMP-9比较:P<0.05
2.3 RT-PCR检测细胞滋养细胞MMP-2、MMP-9和内皮细胞FasmRNA的表达结果
由表2可见:子痫前期组MMP-2、MMP-9和FasmRNA的表达明显低于正常对照组 ( P<0.05) 。结果还显示, 在孕早期6～8周细胞滋养细胞中MMP-2 mRNA的表达强度高于MMP-9 (P<0.05) 。琼脂糖凝胶电泳扩增结果见图1。
3 讨 论
1967年Robertson首次提出子宫螺旋动脉重铸 (remodel) 概念, 认为绒毛滋养细胞于妊娠的第10周开始沿着螺旋小动脉侵入蜕膜、肌层及血管, 逐步取代螺旋动脉血管内皮细胞, 深入血管壁, 降解血管平滑肌及弹力纤维从而使血管腔扩大, 血流阻力下降, 血流量增加。子宫螺旋动脉重铸障碍, 是导致病理妊娠如子痫前期的重要原因。因此正常妊娠的建立、维持有赖于胎盘滋养细胞正常侵入和子宫螺旋动脉成功重铸。滋养层细胞浸润能力的降低与子痫前期的发生密切相关。滋养细胞具有浸润性是由于自身能分泌 MMPs, MMPs是一类锌离子依赖性蛋白水解酶, 可降解细胞外基质, 在滋养细胞对母体子宫内膜侵袭过程中发挥着主要作用, 其中MMP-2与 MMP-9在细胞浸润过程中起了关键作用[4]。Staun Ram等[5]研究发现在妊娠 6～8周阶段 , MMP-2是滋养细胞浸润的关键水解酶 , 而妊娠 9～12周 , MMP-2与MMP-9共同参与了对滋养细胞浸润的调节。本研究采用的细胞均来自妊娠 6～8周, 结果显示, MMP-2 mRNA的表达强度高于MMP-9 (P<0.05) , 提示MMP-2调节滋养细胞的侵袭力可能比 MMP-9起了更关键的作用。
Fas属于肿瘤坏死因子 (TNF) 受体和神经生长因子 (NGF) 受体超家族。Fas广泛存在于多种组织细胞中, 如不成熟的胸腺细胞和活化的淋巴细胞 (包括活化的T、B细胞) 等。FasL是Fas 的配体, 分布较为局限, 仅表达于活化的T细胞、自然杀伤细胞 (NK) 、胎盘滋养细胞等处。FasL与Fas 分子交联, 结合Fas相关的死亡结构域 (fas-assosiated death domain, FADD) , FADD 与caspase-8相互作用, 形成死亡诱导信号复合体 (death-inducing signaling complex, DISC) , 活化的caspase-8 进一步活化效应caspases, 如caspase-3 等, 细胞发生凋亡, Fas/FasL 还可以通过线粒体途径引起细胞凋亡。Fas/FasL凋亡系统涉及正常血管形成和许多血管病变的发生, 包括:高血压、动脉硬化等[6]。而Fas/FasL与子宫螺旋动脉重铸的研究却少有报道。已有研究表明子宫螺旋动脉的内皮、平滑肌细胞表达Fas, 妊娠早期的滋养细胞能分泌FasL, 引起母体免疫细胞的凋亡, 在母胎界面的免疫耐受中发挥作用[7]。Ashton等[8]研究发现滋养细胞能通过Fas/FasL凋亡途径诱导子宫螺旋动脉内皮细胞凋亡, 使滋养细胞正常侵入子宫螺旋动脉取代内皮细胞保证子宫螺旋动脉成功重铸。除了线粒体内途径, 膜结合型Fas (mFas) 还主要通过自分泌/旁分泌或外部途径引起细胞凋亡。滋养细胞可能通过相邻的内皮、平滑肌细胞触发FasL的表达, 可见子宫螺旋动脉内皮、平滑肌细胞的凋亡很可能通过一种旁分泌形式实现的。Fas/FasL不是唯一涉及子宫螺旋动脉重铸中滋养细胞-内皮细胞作用的机制。最近证明, 组织相容性白细胞抗原-G1 (histocompatibility leukocyte antigen, HLA-G1) 复合物能直接与活化的内皮细胞表达的CD160受体结合, 通过一种凋亡途径抑制血管形成。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (tumor necrosis factor (TNF) -a-related, apoptosisinducing ligand, TRAIL) 是新发现的肿瘤坏死因子超家族成员, 与FasL和TNF一样可诱导细胞凋亡。Keogh等[9]研究发现妊娠前3个月的滋养细胞也表达TRAIL, 滋养细胞通过TRAIL依赖的机制引起子宫螺旋动脉内皮、平滑肌细胞凋亡。Roberta等[10]研究表明血管内皮钙黏蛋白 (vascular-endothelial cadherin) 通过细胞间接触机制而非凋亡程序促进滋养细胞侵入子宫螺旋动脉替代内皮细胞。Fas敲击小鼠表现正常的生育, 很可能是子宫自然杀伤细胞 (uterine natural killer cells, uNK) 而非滋养细胞调节子宫螺旋动脉的重铸[11]。
本研究通过建立滋养细胞与脐静脉内皮细胞共培养模型, 用子痫前期血清进行培养, 并用正常血清作对照, 结果表明, 子痫前期血清培养组滋养细胞侵蚀能力、MMP-2 mRNA、 MMP-9 mRNA、脐静脉内皮细胞Fas mRNA表达明显低于正常对照组, 脐静脉内皮细胞凋亡率明显下降, 提示子痫前期血清可降调滋养细胞MMP-2 mRNA、 MMP-9 mRNA表达, 进而影响脐静脉内皮细胞发生程序性死亡, 滋养细胞取代子宫螺旋动脉内皮细胞过程受阻, 子宫螺旋动脉重铸障碍, 胎盘缺血、缺氧, 将导致病理妊娠如子痫前期与FGR的发生。本研究为进一步探讨因滋养层细胞侵袭能力降低, 内皮细胞凋亡异常导致子宫螺旋动脉重铸障碍而引起的子痫前期等疾病的防治提供更有效的理论依据。当然, 除了凋亡还有其他的机制也在子宫螺旋动脉重铸过程中发挥了作用, 对子痫前期子宫螺旋动脉重铸障碍的分子机制及具体的调控路径的阐明仍需进一步的研究
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内皮祖细胞与肿瘤 篇7
1 EPC的来源及特点
在胚胎第15天左右, 卵黄囊内出现许多由间充质细胞密集而成的细胞团, 即血岛。血岛中央为造血干细胞, 周围扁平状的细胞即为早期EPC, 它参与胚胎时期的血管发生。在胎儿出生后, EPC主要存在与骨髓中, 在某些生理、病理状态下可释放入外周血发挥作用。Asahara等于1997年首先使用免疫磁珠方法从人的外周血单个核细胞中培养分离出血管内皮标记物CD34 (+) EPC。在粒细胞-集落刺激因子 (G-CSF) 作用下, CD34 (+) EPC细上粘附分子表达发生变化, 与骨髓中干细胞动员入外周血有关。
2 EPC的分类
EPCs目前已从骨髓、外周血、脐带血中成功分离培养出来, 并作为不同的群体。在EPCs分化为内皮细胞的过程中, 不同群体EPCs在形态结构及表型特征上也有所差别。
目前根据EPC在体外存活时间长短分为2种类型:第1种为早期EPCs, 来自外周血单个核细胞, 在培养3~8周时达到生长高峰, 第4周时逐渐死亡消失。第2种为晚期EPCs, 主要来源于骨髓单个核细胞, 也存在于外周血中, 但较少, 晚期EPCs于培养第2~4周时形成的细胞集落出现在早期EPCs (呈梭形) 中间, 呈鹅卵石形, 在第12周逐渐死亡消失。
3 EPC的标记
成熟内皮细胞不表答造血祖细胞糖蛋白抗原AC133, 而大多数CD34 (+) VEGFR-2 (+) 细胞表达AC133, 这意味着CD34 (+) 细胞中同时表达VEGFR-2和AC133的一部分可确定为一个特异的群体, EPC即被认为是表达有胚胎时期内皮祖细胞和造血干细胞共同抗原 (CD34/VEGFR-2, CD133/VEGFR-2, CD34) 的一类细胞。CD34 (+) VEGFR-2 (+) 细胞还表达内皮特异性的标记如VE-钙粘连素、E-选择素, 所有的CD34 (+) VEGFR-2 (+) 细胞在基质细胞源性生长因1 (SDF-1) 或VEGF作用下都表达趋化因子受体CXCR4, 并在这些因子作用下进行迁移。Harraz等认为CD14 (+) 也为EPC表面所有, 但可能并不特异。
4 EPC在肿瘤中的作用
肿瘤的生长和转移与血管的形成密切相关。血管形成包括2种方式, 一种为血管发生 (vasculogenesis) 是指基于胚胎时期的由EP Cs分化为成熟内皮细胞的过程;而另一种为血管生成 (angiogenesis) 即指在已有血管的基础上以出芽方式形成血管的过程。大量研究结果表明EPCs在肿瘤的生长及转移过程中起到重要作用, 它可促进上述两种过程, 使肿瘤组织的血管系统迅速扩展, 从而为肿瘤细胞提供丰富的血供, 并促进肿瘤的侵袭及转移。
研究表明, 乳腺癌患者外周血EPCs的数量增加, 肿瘤切除术后, CD34 (+) FLK-1 (+) 细胞数量迅速下降, 表明EPCs的水平高低与肿瘤自身释放的血管生成因子密切相关。对小鼠肿瘤模型的研究也表明肿瘤的早期生长需要EPCs的参与, 且在肿瘤血管形成后, EPCs也可作为一种维持血管长期完整性的监管者而被肿瘤组织所需要。Naik等研究观察到在乳腺癌患者中, 外周血中循环EPCs量的高低与癌症的进展阶段相关, Ⅲ期、Ⅳ期乳腺癌患者外周血中循环EPCs的水平明显高于Ⅰ期、Ⅱ期患者, 在化疗后, Ⅲ期、Ⅳ期患者的循环EPCs水平显著下降, 而Ⅰ期、Ⅱ期EPCs变化不明显。表明EPCs在肿瘤的发展中确实起到重要的作用。乳腺癌患者血浆中可溶性VEGF浓度是对照组中健康人的3倍。这一显著的差异说明, VEGF在肿瘤血管生成中可能起到重要的作用。
5 EPC相关基因与肿瘤
尽管对于EPC在肿瘤血管形成中的作用已进行了较多的研究, 但对于血管形成的具体调控网络的认识还不够完善。针对这一方面, Furuhata等利用寡核苷酸芯片解析和RT-PCR对脐带血单个核细胞来源的CD34 (+) EPCs中169个上调基因和107个下调基因做了研究, 其中有3个重要的基因可能与EPCs的功能最密切相关, 他们是Syk, galectin3, ATF3。
Syk基因编码一种酪氨酸蛋白激酶, 该基因表达于正常的乳腺组织及乳腺上皮细胞系中, 在某些高度恶性乳腺癌细胞系不表达, 说明在人类乳腺癌中Syk起着肿瘤抑制基因的作用, 作为上皮细胞生长的抑制基因。Syk在胸腺T细胞活化、B细胞发展中起重要作用, 并可通过受体来发送免疫信号, 并且研究表明Syk基因在EPCs中表达, 而在大多数成熟内皮细胞中是不表达的。Syk缺乏的小鼠呈现一种致死性的表型, 表现为扩散性出血、严重瘀斑、乳糜性腹水等, 这种现象的发生可能与不正常的血管发育有关。
另一个在EPCs中表达上调的基因为galectin-3, 编码一种β-半乳糖苷特异性的植物凝集素, 它有多种生物学功能, 包括细胞的增殖分化、肿瘤细胞粘附、血管形成、肿瘤的转移。在人类的多种肿瘤中均有galectin-3过表达。
ATF3为激活转录因子3 (activating transcription factory 3) 。它在EPCs中的表达上调。ATF3在细胞增殖、致瘤转化和转录活性等方面起作用。它与c-Jun和c-Fos同属于b-Zip转录因子家族成员。ATF3基因的过表达也会导致人类肿瘤发生。
Gao等的研究表明, 肿瘤细胞可诱导EPCs中转录因子表达, 从而促进了癌症转移灶的形成。肿瘤组织中EPCs的Id1 m RNA表达比正常上调了2.5倍, 并且Id1只在BM-EPCs中表达, 其他BM细胞中并未发现Id1表达。在小鼠肺癌模型中, 阻碍EPCs的动员可严重地抑制血管的生成, 并显著的削弱致命转移灶的形成。这表明EPCs借助Id1在血管生成中起着重要调控者的作用。
目前, 对EPC已做了较多的研究, 关于EPC的来源、分化为内皮细胞的过程、细胞的表面标记、在心血管疾病及肿瘤中的作用有了初步的认识, 也提出了在疾病治疗学中EPCs可能发挥到的作用。但仍旧存在一些学术上的空白点及不确定点有待进一步的研究, 比如, 目前还未发现只有在EPCs上表达的标记物质, 所以对于EPC表型的描述及分离培养的依据都有错误的可能性。在肿瘤的治疗方面, 抑制EPCs的动员可抑制肿瘤的生长及转移, 但在抑制肿瘤组织的同时是否会对正常组织产生影响。对EPCs功能表达的分子及基因机制也缺乏系统的认识。但是, 可以肯定的是, EPCs在治疗学上的前景仍是显著的, 这有待于进一步较深入的研究。
摘要：内皮祖细胞 (endothelial progenitor cells) 是血管内皮细胞的前体细胞, 它具有在外周血管系统中分化为成熟内皮细胞的能力, 参与胚胎时期的血管发生, 出生后的血管损伤修复, 并在肿瘤形成及转移的血管发生中起重要作用。因此, 在肿瘤中针对EPC为靶点的治疗备受关注。
淋巴管内皮细胞 篇8
他在中国的治疗过程让笔者震惊——只接受了四个月化疗便停止而转投中医，然而半年后，他急淋复发，反复治疗，不见好转。
抱着最后的希望，他来到美国，接受了一年的治疗，但由于先前中止化疗，错过了最佳治疗期，最终不治而亡。
他中止正规治疗而转投中医的原因，笔者不得而知。但通过网络，笔者看到一些中医院对治疗白血病的描述——立竿见影，神奇有效，却又充满了与现代医学相悖的观点，很多“概念”无法用科学解释。
在中医治疗白血病的原理中，甚至有这样的表述，“中药可以诱导白血病细胞向正常细胞转化，也就是说使白血病改邪归正，从而使白血病的治疗取得满意效果，并达到治愈白血病的目的”。
然而到目前为止，现代医学还未找到任何方法，使癌变的细胞逆转成正常细胞。无论是中医西医，谁要真能找到这个方法，他一定会得诺贝尔奖。
中医治癌只是替代疗法
主流医学对癌症治疗的方法是手术、化疗和放疗，这三种方法已经被科学证实对治疗癌症有效。
然而在主流医学以外，还有一种替代疗法。代替疗法没有循证证据证明可预防或治愈疾病，但提倡者却声称有神奇疗效并试图用其代替主流医学治疗方法。
就目前的证据看来，中医治疗癌症只能是替代疗法，不同的中医师开着各种不同的中药，中药方剂没有经过严格的临床试验，都声称能治愈癌症，却没有科学文献数据支持。
让人啼笑皆非的是，有的中医声称治白血病使用的是“祖传秘方”，更有人拿出《黄帝内经》等中医巨著来证明其权威性。
白血病由德国病理学家Rudolf Virchow于1847年命名，他观察到白血病患者的血液中白细胞呈爆发性增长，抽到体外的血液中的红细胞上覆盖着厚厚的白细胞。
我们无法考证中医是在什么时候才全面认识白血病的，但可以肯定的是，《黄帝内经》的作者对白血病的认识远不如现在的一个临床血液肿瘤科的护士。
急淋治疗的原则
在1947年，美国医生Sidney Farber用氨基蝶呤来治疗儿童急淋，拉开了用人工合成化学药品治疗癌症的序幕。随后，长春新碱等化疗药物相继出现，化疗药物“组合拳”使急淋治愈率不断提升。
儿童急淋治愈率的提升尤为显著，最新数据显示，十岁以下治愈率已超过90%，三十岁以下患者的治愈率也超过60%。这种曾被认为诊断后只能生存6个月的恶性癌症已经不再像过去那么可怕。
由于不是实体肿瘤，白血病的治疗只能依靠化疗。国际上，急淋的治疗原则是标准化的，简单来说是三步曲：以缓解为目的诱导化疗，以维持缓解为目的巩固化疗，使用低剂量以延长缓解期为目的维持化疗。
为什么癌症缓解后还要治疗？目的是防止复发。现在的化疗药一般一个月就能让癌症缓解，巩固治疗一般为半年，维持治疗一般为24个月，如果癌症在三年内不复发，再次复发的可能性则大幅降低。前文提到的年轻急淋患者连巩固治疗都没有完成，复发也就不在意料之外了。
美国癌症协会指出，如果放弃已经被证明有效的方法，而选择尚未被证明有效的替代疗法治疗癌症，将延误治疗，危及患者生命。