B淋巴细胞增殖性疾病

B淋巴细胞增殖性疾病（共7篇）

B淋巴细胞增殖性疾病 篇1

美罗华 (R) 又称利妥昔单抗, 是一种人鼠嵌合型的抗CD20抗体, 能以极高的亲和力与B淋巴细胞上的CD20结合, 通过抗体依赖的细胞介导及补体介导的细胞毒作用达到使B淋巴细胞被清除的目的。而大剂量甲强龙 (HDMP) 可以通过激素受体以及Caspase途径诱导淋巴细胞凋亡, 新鲜冰冻血浆 (FFP) 可以通过补充具有免疫缺陷淋巴细胞疾病病人体内的补体含量, 从而进一步提高利妥昔单抗的杀伤作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2011年3月—2013年3月我科应用FFP+R+HDMP方案治疗B淋巴细胞增殖性疾病10例, 其中男7例, 女3例, 年龄36岁~73岁。全部病例均有病理组织学诊断, 免疫组化CD 2 0 (+) 或 (++) 。10例均为经外周静脉穿刺置入中心静脉置管 (PICC) 给药。

1.2 方法

1.2.1 药液的保管与配制

美罗华应在2℃~8℃的冰箱中避光保存, 药液现配现用, 配制好的药液室温下可保持12h, 如有特殊情况不能立即使用应置于2℃~8℃冰箱内24h有效。由于美罗华不含防腐剂和抗菌药物, 在配制时应严格无菌操作。抽取美罗华时, 注射器中绝不能有空气, 抽取和往生理盐水中加美罗华时针头深入液面以下, 防止起泡沫, 轻轻倒转输液袋将药液混匀, 严禁剧烈晃动和加热, 以免蛋白质分解降低疗效[1]。在使用前, 肉眼观察溶液澄清无颗粒方可输入。美罗华静脉输注的配制浓度为1mg/mL, 并使用精密输液器。

1.2.2 治疗方案

FFP+R+HDMP方案治疗:新鲜冰冻血浆400 mL+美罗华357 mg/m2, 大剂量激素 (甲强龙1g/m2) , 2 1d为1个疗程, 共用2个~6个疗程。

1.2.3 评价标准

疗效评价标准按世界卫生组织 (WHO) 原则分为完全缓解 (CR) 、部分缓解 (PR) 、无变化或稳定 (SD) 、进展 (PD) 。有效 (RR) =PR+CR[1]。

2 结果

10例中2例完成6个疗程的治疗, 2例完成5个疗程治疗, 3例完成4个疗程治疗, 3例完成2个疗程治疗。治疗完成后评价疗效:CR 7例, PR 1例, SD 2例, 总有效率为80%。

3 护理

3.1 预防过敏及发热反应

我科常规在输血浆前后用生理盐水100mL加地塞米松3mg冲管;在使用美罗华前30min肌肉注射异丙嗪25mg和静脉推注地塞米松5mg。输注时使用精密输液器及输液泵, 严格控制滴速, 首次滴入速度为50mg/h, 后每半小时成倍增加至最大滴速400 mg/h。输液过程中需使用心电监护持续监测生命体征, 加强巡视。本组有5例病人出现过敏反应, 1例输入美罗华7 min左右出现严重寒战及胸闷, 后体温渐升至4 0℃, 医嘱予以氧气4L/min持续吸入, 降温贴物理降温, 异丙嗪25mg肌肉注射和地塞米松5mg静脉推注, 半小时后症状逐渐缓解, 4例病人输入美罗华后30min左右出现轻微寒战, 予增加盖被, 遵医嘱暂停美罗华输注、地塞米松5mg静脉推注、异丙嗪25mg肌肉注射后半小时缓解。在使用美罗华最初2h内容易出现胸闷、发热、关节痛等, 用药后应密切观察病情变化, 如有异常及时对症处理。

3.2 用药期内注意心血管和呼吸系统症状的监测

美罗华可引起心律失常、体位性低血压、支气管痉挛、呼吸困难等, 所以首次用药要持续心电监护, 1h内每15min观察1次心率、呼吸、血压、血氧饱和度, 无异常改为每小时记录1次至静脉输注结束[2]。

3.3 注意物质代谢和水盐代谢紊乱

长期大量应用糖皮质激素可引起物质代谢和水盐代谢紊乱, 出现类肾上腺皮质功能亢进综合征, 如水肿、低血钾、高血压、血糖升高等, 用药前向病人说明可能会出现的反应, 一般不需治疗, 停药后可自行消退。本组病人有4例血糖升高, 给予饮食、运动治疗后3例血糖恢复正常, 1例长期应用胰岛素控制血糖。

3.4 消化系统反应的护理

糖皮质激素能刺激胃酸、胃蛋白酶的分泌并抑制胃黏液分泌, 降低胃黏膜的抵抗力, 故可诱发或加剧消化性溃疡, 用药期间病人可诉胃部不适, 因此, 要遵医嘱静脉应用奥美拉唑并指导病人进食清淡易消化饮食, 禁食辛辣刺激性食物。

3.5 注意骨骼的损伤

骨质疏松可能与糖皮质激素抑制成骨细胞活性, 增加钙磷排泄, 抑制肠内钙的吸取以及增加骨细胞对甲状旁腺素的敏感性等因素有关, 全疗程中病人坚持服用钙尔奇D并辅助静脉应用唑来膦酸注射液。本组10例病人无一例发生骨骼损伤。

4 小结

新鲜冰冻血浆加美罗华加大剂量激素治疗B淋巴细胞增殖性疾病的主要不良反应是发热反应、变态反应、心血管反应、消化系统及物质代谢紊乱等。治疗过程要严格掌握用药原则, 遵医嘱预防性用药, 采取预见性护理措施, 加强药物不良反应的观察和护理, 以保证治疗的顺利进行。

摘要：对10例B淋巴细胞增殖性疾病病人使用新鲜冰冻血浆联合美罗华及大剂量激素治疗, 通过治疗前预防性用药, 采取预见性护理措施, 加强对药物不良反应的观察与护理等措施, 保证了治疗的顺利进行。

关键词：B淋巴细胞增殖性疾病,美罗华,新鲜冰冻血浆,激素,护理

参考文献

[1]何凤贞, 刘淑英.美罗华治疗B细胞淋巴瘤不良反应的预防及护理[J].天津护理, 2009, 17 (6) :330-331.

[2]陈大春, 黄韵红, 刘杰, 等.美罗华治疗B细胞性非霍奇金淋巴瘤的观察及护理[J].护士进修杂志, 2010, 25 (4) :340-341.

B淋巴细胞增殖性疾病 篇2

1 材料

DMEM、Opti-MEM、胎牛血清和马血清,购自Gibco公司;p MD18-T、XhoⅠ、NotⅠ、Bam HⅠ、HindⅢ、LA Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、SYBRPrime ScriptTMRT-PCR KitⅡ,购自宝生物工程(大连)有限公司;Dual-Luciferase Reporter Assay System,购自Promega公司;TRIzol试剂、Lipofectamine 2000 Reagent,购自Invitrogen公司;Endo-Free Plasmid Mini kitⅡ,购自Omega公司;Plasmid Mini kitⅠ、Gel Extraction KitⅠ,购自北京Trans Gen生物技术有限公司;EDU试剂盒,购自广州锐博公司。

2 方法

2.1 牛骨骼肌卫星细胞的分离、培养、鉴定及分化

分离培养的牛骨骼肌卫星细胞取自双城牛场荷斯坦牛后腿,用PBS冲洗后将其剪成肌糜(约1 mm3),用PBS反复吹打,静置1 min;去掉漂浮组织,1 000 r/min离心10 min;取肌糜沉淀物,添加0.2%胶原酶Ⅺ30 m L,37℃水浴摇床(110 r/min)消化1 h;向消化液中加入40 m L PBS对胶原酶进行稀释,吹匀后移入离心管,1 000 r/min离心10 min;弃上清液,向沉淀中加入PBS反复吹打,1 000 r/min离心10 min,重复3次;弃上清液,向沉淀中加入0.25%胰蛋白酶30 m L,37℃水浴摇床(110 r/min)消化30 min;向消化液中加入40 m L PBS对胰酶进行稀释,吹匀后移入离心管,1 000 r/min离心10 min;弃上清液,向沉淀中加入PBS反复吹打,1 000 r/min离心10 min,重复3次;弃上清液,取沉淀用PBS重悬,取悬液经400目筛网过滤后移至离心管中,1 000 r/min离心10 min;弃上清液,向沉淀中加入PBS反复漂洗,1 000 r/min离心10 min,重复3次;弃上清液,用生长培养液(高糖DMEM培养基+20%胎牛血清+10%马血清+5%青/链霉素+1%两性霉素B)重悬细胞,接种并置于37℃、5%CO2的培养箱中培养1 h,贴壁细胞为pp1。未贴壁细胞悬液加入同等体积PBS吹打混匀,1 000 r/min离心10 min;弃上清液,加生长培养液重悬,将悬液移入新培养瓶中继续培养2 h,贴壁细胞为pp2。从pp2开始连续4 d每隔24 h都向未贴壁的细胞悬液加入同等体积PBS,吹匀,1 000 r/min离心10 min;弃上清液,加生长培养液重悬,分别记为pp3~pp6,pp1~pp5弃掉不用,pp6培养5 d后换液,以后每隔36 h更换细胞培养液并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。待细胞汇合度为90%时进行传代培养。待培养瓶中的细胞生长密度为80%~90%时,弃去培养液,用37℃预热的PBS温和清洗3遍,加入适量0.25%胰酶消化。显微镜下观察绝大多数细胞变圆时,加入含有血清的培养液终止消化,按比例进行传代培养[5]。

2.2 mir-133b过表达载体的构建及转染

根据mir Base数据库中牛的mir-133b前体序列,设计引物扩增含前体及两端侧翼序列共203 bp的片段。引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。引物序列:Sense primer 5'-CCCAAGCTTGGA-CACACCAAGAATCCTCGC-3'(下画线部分为HindⅢ酶切位点和保护碱基);Antisense primer 5'-CGCGGATCCACAGCCCATCCTAAAATCCCTAC-3'(下画线部分为Bam HⅠ酶切位点和保护碱基)。

将PCR产物克隆到p MD18-T载体上,双酶切鉴定测序,将测序正确的重组质粒p MD18-T-mir-133b和pc DNA3.1(+)用Bam HⅠ和HindⅢ双酶切,胶回收后将上述203 bp的片段和pc DNA3.1(+)酶切片段连接、转化。挑取阳性克隆提取质粒,PCR和双酶切鉴定重组质粒,鉴定结果正确的重组质粒命名为pc DNA3.1(+)-mir-133b,构建图谱见图1。

用Omega去内毒素质粒提取试剂盒提取验证正确的重组质粒pc DNA3.1(+)和pc DNA3.1(+)-mir-133b,用Lipofectamine 2000 Reagent转染接种在6孔板里细胞汇合度为70%的牛骨骼肌卫星细胞,48 h以后用TRIzol试剂提取总RNA,用超微量分光光度计进行RNA定性和定量检测,-80℃冰箱保存,备用。

2.3 茎环Q-PCR检测mir-133b的表达

pc DNA3.1(+)和pc DNA3.1(+)-mir-133b转染牛骨骼肌卫星细胞48 h后,用TRIzol试剂提取总RNA,用Bio Te Ke super RT kit试剂盒反转录c D-NA。以反转录c DNA为模板合成第2条链。mir-133b茎环逆转录引物:5'-CTCAACTGGTGTCGTG-GAGTCGGCAATTCAGTTGAGTAGCTGGT-3'。反转录过程:取Total RNA或Poly(A)5μL,50μmol/L Oligo d T或Random Primer 1μL,d NTP Mixture(10 mmol/L each),20μmol/L mir-133b Stem-loop Primer 1μL,加Rnase Free H2O至14μL;65℃5 min,冰上急冷。在上述PCR管中加入5×firststrand Buffer 4μL,200 U/μL M-Mu L V Reverse Transcriptase 1μL,Rnase Inhibitor 1μL,50℃50 min,70℃10 min,冰上冷却,得到c DNA。取反转录好的c DNA为模板进行PCR扩增,mir-133b引物序列为:上游引物5'-TTTGGTCCCCTTCAACCA-3',下游引物5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'。内参β-actin引物序列为:上游引物5'-GAACGGT-GAAGGTGACAGCAGT-3',下游引物5'-TTATTA-GAGAGAAGCGGGGTGG-3'。PCR反应条件:95℃2 min;95℃15 s,60℃40 s,共45个循环;95℃15 s;60℃1 min;95℃15 s,收集荧光强度。数据采用2-ΔΔCt法进行分析,ΔCt=CtRNA-133b-Ctβ-acti,比较miRNA-133b在2株细胞间的表达差异时,按ΔΔCt=ΔCtpc DNA3.1(+)-mir-133b-ΔCtpc DNA3.1(+)计算;反映转染后mirRNA-133b表达变化时,用ΔΔCt=ΔCtmRNA-133b-ΔCtControl计算[6]。

2.4 EDU检测转染mir-133b后对细胞增殖的影响

用Omega去内毒素质粒提取试剂盒提取验证正确的重组质粒pc DNA3.1(+)和pc DNA3.1(+)-mir-133b,用Lipofectamine 2000 Reagent转染接种在12孔板里细胞汇合度为70%的牛骨骼肌卫星细胞,48 h以后EDU试剂盒进行检细胞测增殖。

2.5 mir-133b的靶基因预测及双荧光素酶报告基因试验验证

利用Miranda和Target Scan算法预测mir-133b的靶基因为sp1(转录因子),设计并合成靶基因sp13'-UTR区域含mir-133b作用位点及突变的一段序列,分别在5'加XhoⅠ的酶切位点和保护碱基,3'加NotⅠ的酶切位点和保护碱基,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体序列如下:上游引物5'-CCGCTCGAGATTCTGTGACCAAAATACCTT-3',突变上游引物5'-CCGCTCGAGATTCTGTCTG-GTAAATACCTT-3',下游引物5'-ATAAGAATGCG-GCCGCGTGCAAGAAGCTGATCCC-3'(单下画线部分为酶切位点和保护碱基,双下画线部分为靶位点突变碱基)。

上述PCR产物经过纯化连接到p MD18-T载体,转入DH5α感受态细胞,摇菌扩增,提取质粒进行NotⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定,回收纯化目的基因片段。用NotⅠ和XhoⅠ双酶切psi CHECKTM载体,将回收目的基因连接入上述酶切后的载体,转入大肠杆菌,挑取单克隆,进行PCR扩增,同时提取质粒进行NotⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定。提取酶切鉴定正确的克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序,测序正确的质粒命名为psi CHECKTM-2-211-UTR和psiCHECKTM-2-211-T-UTR,构建过程见图2。

将处于对数生长期的He La细胞接种于96孔细胞培养板,24 h后贴壁细胞达70%汇合率时用Lipofectamine 2000 Reagent转染:1)pc DNA3.1(+)-mir-133b;2)pc DNA3.1(+)-mir-133b和psiCHECKTM-2-211-T-UTR进行共转染;3)pc D-NA3.1(+)-mir-133b和psi CHECKTM-2-211-UTR进行共转染。对照组为1)pc DNA3.1(+)-mir-133b。测定细胞荧光素酶表达量,所有试验均重复3次。

2.6 Q-PCR检测mir-133b过表达后靶基因的表达变化

引物合成通过NCBI等网站找到sp1的3'UTR区域扩增出跨1个或者多个内含子的片段,片段长度在80~150 bp之间。引物序列:Sense primer 5'-TCGTCAGCGTCCGCGTTTT-3',Antisense primer 5'-AGGCACCACTACCATTTCCATT-3'。内参用β-acti引物。取对数生长期细胞转染pc DNA3.1(+)和pc DNA3.1(+)-mir-133b 48 h,提取总RNA进行反转录,然后进行实时定量PCR检测。

2.7 统计分析

采用SPSS14.0软件对所得表达数据进行单因素方差分析,并进行统计分析,数据以±s表示,两样本均数间的比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 重组质粒pc DNA3.1(+)-mir-133b的构建及鉴定结果

在重组质粒pc DNA3.1(+)-mir-133b的构建过程中,pc DNA3.1(+)空载体为5 428 bp,重组质粒pc DNA3.1(+)-mir-133b通过Bam HⅠ和HindⅢ限制性内切酶双酶切被切成2个片段:大片段约为5 428 bp,小片段约为203 bp,外源序列插入成功(见图3)。pc DNA3.1(+)-mir-133b过表达载体测序结果证明目的片段序列与预期大小一致,成功地克隆到pc DNA3.1(+)表达载体中。

3.2 茎环Q-PCR检测mir-133b的表达

待牛骨骼肌卫星细胞在6孔板里汇合度为70%左右时,转染pc DNA3.1(+)-mir-133b过表达载体组和对照组pc DNA3.1,48 h以后收集细胞,Q-PCR结果表明,mir-133b的表达水平显著升高,与对照组相比增加了470倍,差异显著(P<0.05),见图4。

3.3 EDU检测转染mir-133b后对细胞增殖的影响(见228页彩图5)

过表达载体pc DNA3.1(+)-mir-133b和对照组pc DNA3.1(+)转染牛骨骼肌卫星细胞48 h后进行EDU检测增殖变化,经计算,转染pc DNA3.1(+)有21.3%的细胞增殖(见228页彩图5 A,B,C),转染pc DNA3.1(+)-mir-133b有39.3%的细胞增殖(见228页彩图5 D,E,F)。pc DNA3.1(+)-mir-133b与对照组相比增殖率为45.8%。

3.4 mir-133b的双荧光素酶报告基因试验验证

重组质粒psi CHECKTM-2-211-UTR和psiCHECKTM-2-211-T-UTR的鉴定结果表明:psiCHECKTM-2空质粒为6 273 bp,重组质粒psiCHECKTM-2-211-UTR和psi CHECKTM-2-211-T-UTR(突变靶位点)通过XhoⅠ和NotⅠ限制性内切酶双酶切,被切成2个片段,大片段约为6 273 bp,小片段约为211 bp,外源序列插入成功。psi CHECK-TM-2-211-UTR和psi CHECKTM-2-211-T-UTR靶基因载体测序结果证明目的片段序列与预期一致,成功地克隆到psi CHECKTM-2表达载体中(见图6)。

将牛骨骼肌卫星细胞接种在12孔板,汇合度为70%时,分别转染过表达载体pc DNA3.1(+)-mir-133b,pc DNA3.1(+)-mir-133b和psi CHECKTM-2-211-UTR进行共转染,pc DNA3.1(+)-mir-133b和psi CHECKTM-2-211-T-UTR进行共转染。每个试验组分别独立重复3次,检测荧光素酶活性,结果表明,pc DNA3.1(+)-mir-133b和psi CHECKTM-2-211-UTR这组荧光素酶活性明显下降,见图7。

3.5 Q-PCR检测mir-133b过表达后靶基因的表达变化

在牛骨骼肌卫星细胞中过表达mir-133b 48 h以后,用Q-RT-PCR检测sp1(转录因子的表达水平),结果表明,sp1表达量显著显著下降,进一步说明sp1是mir-133b的靶基因,见图8。

4 讨论

研究表明,miRNA对肌肉发育过程起着重要的调节作用。mir-1和mir-133最初于2003年从人和小鼠肌肉组织中克隆鉴定[7,8,9],是肌肉特异性的miRNA[10,11]。J.F.Chen等[12]2006年研究发现mir-1和mir-133在骨骼肌细胞分化成熟过程中呈现一定的时空特异性表达,其中mir-1促进骨骼肌分化,而mir-133则抑制分化而促进成肌细胞增殖,结果显示了两者与骨骼肌的发育存在显著的调节作用。

miRNA mimic是针对成熟miRNA序列特殊设计的,是用化学方法合成制备的双链RNA模拟物,仅需将mimic直接转染到细胞中,模拟内源性成熟miRNA的表达,继而增强其调控靶基因的作用,进行功能获得性(gain-of-function)研究。该方法具有快速、简便的特点,但是不能长期稳定发挥作用,价格较贵。pre-miRNA是最先运用的miRNA过表达技术,化学合成的pre-miRNA制备快捷,可以标记荧光等。但是缺点是制备的RNA稳定性较差,容易降解。而且由于制备的RNA较长,合成时难以避免错误(当合成RNA超过60 bp时,出现一个碱基错误率约30%),转录制备的pre-miRNA稳定性较好,但无侧翼序列的结构,现在很少应用。以质粒载体形式的pre-miRNA也因为发现miRNA两侧的flank对于miRNA表达产生重要作用,现在已经开始被primiRNA取代。人工pri-miRNA效果较pre-miRNA好,但这种人工miRNA采用小鼠固定的mir-155的flank,其产生成熟miRNA的表达效率不及原始天然的miRNA,现已较少使用。pri-miRNA的克隆来自miRNA基因本身的文库,由于保留了每个miRNA独自的原始天然双臂结构,效果更好,成为近些年首选方法。因为成熟的miRNA序列只有22 bp左右,但是转录产物pri-miRNA序列上、下游会有一定数目的碱基参与形成pre-miRNA的茎环结构,所以在构建miRNA表达载体时,应保留pre-miRNA序列两侧各100~400 bp的碱基侧翼序列,通常为200 bp左右。典型的miRNA表达载体应包括启动子、premiRNA、侧翼序列及转录终止信号[13]。本试验构建的真核表达载体以100 bp多为侧翼序列进行克隆mir-133b,pc DNA3.1(+)-mir-133b转染牛骨骼肌卫星细胞24 h后,成熟mir-206的表达与pc D-NA3.1(+)空载体相比差异极显著。

5 结论

研究结果表明,mir-133b在牛骨骼肌卫星细胞中,的确具有促进牛骨骼肌卫星细胞增殖的作用,通过双荧光素酶报告试验验证了在牛骨骼肌卫星细胞中,sp1为mir-133b的直接靶基因,本试验证明了在物种牛中,mir-133b有促进细胞增殖的作用,为进一步研究mir-133b在牛体内的作用提供了依据。sp1为mir-133b的直接靶基因,而sp1下游控制基因还有待进一步研究。

A.转染pc DNA3.1(+),EDU增殖;B.转染pc DNA3.1(+),DAPI染细胞核;C.A、B叠加;D.转染pc DNA3.1(+)-mir-133b,EDU增殖;E.转染pc DNA3.1(+)-mir-133b,DAPI染细胞核。F.D、E叠加。

摘要：为了探讨mir-133b对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响,试验将分离培养的牛骨骼肌卫星细胞接种在6孔板中,待细胞汇合度为70%时,用Lipofectamine 2000转染mir-133b的过表达载体进入牛骨骼肌卫星细胞,48 h后实时定量检测RNA表达水平,并用EDU试剂盒检测细胞增殖状况,实时定量PCR检测mir-133b的靶基因sp1的RNA表达情况。结果表明:在牛骨骼肌卫星细胞中,作EDU增殖过表达mir-133b以后细胞增殖数量显著增多。说明mir-133b对牛骨骼肌卫星细胞增殖具有促进作用。

B淋巴细胞增殖性疾病 篇3

1 材料和方法

1.1 主要实验材料

si RNA表达载体pRNA-U6.1/Neo(GenScript公司),脂质体转染试剂LipofectAmineTM2000(Invitrogen公司),细胞增殖检测试剂盒(日本同仁化学研究),鼠抗CB单克隆抗体(USA Santa Cruz公司),辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体(USA Santa Cruz公司),Transwell小室(Corning公司),人低分化胃腺癌细胞BGC-823购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

1.2 si RNA载体的构建

利用si RNA靶片段分析设计在线软件确定19个碱基634～652位(GCTTGGAACTTCTGGACAA)、242-260位(CGGATGAGCTGGTCAACTA)为si RNA靶序列,合成发卡样DNA单链,退火成双链后与si RNA载体pRNAT-U6.1重组连接,PCR扩增筛选转化重组子,DNA序列测定鉴定插入序列,分别提取重组子即得到2个针对CB基因的si RNA载体。

1.3 细胞分组及转染

实验分为4组:(1)转染pRNAT-U6.1-si CB634,沉默1组;(2)转染p RNAT-U61-si CB242,沉默2组;(3)转染pRNAT-U6.1-Con,无关si RNA对照组;(4)不转染任何质粒,空白对照组。参照Lipofectamine2000说明书转染CB基因si RNA。

1.4 RT-PCR检测BGC-823细胞CB mRNA表达情况

CB基因引物为:上游序列为:5'-GCAGCGCTG GGTGGATCTAGGATCC-3',下游序列为:5'-GGCCC ACCCAGGAAGGTACCAC-3',产物片断长度为232bp;内参β-actin的上游引物为5'-GCGAGCACA-GAGCCTCGCCTTT-3',下游引物为5'-GCACATGC-CGGAGCCGTTGTC-3',产物长度为112 bp。采用荧光定量PCR法,检测各组细胞CB m RNA表达水平,以CB的表达量与内参照β-actin表达量的比值为其相对表达水平。扩增使用ABI 7500 fast PCR仪进行扩增。

1.5 Western-blot检测CB蛋白表达

提取各组细胞总蛋白,用Bradford法测定蛋白质浓度。各组样品分别取总蛋白300μg,经100g/L SDS-PAGE电泳后转PVDF膜。与特异性一抗室温孵育1～2 h或4℃过夜。与二抗室温孵育1 h后,ECL化学发光剂于暗室中曝光和显影。测定蛋白条带的光密度值,以表示蛋白的相对表达水平。

1.6 细胞增殖检测

取转染48 h后各组BGC-823细胞接种于96孔细胞培养板内,每孔1.0×104个细胞,各组细胞均设置5个复孔,接种后的1～5 d内,分别采用CCK-8细胞增殖检测试剂盒测定各组细胞孔内的吸光度值,记录读取这数据,计算出平均值,然后绘制各组细胞的生长曲线。

1.7 细胞基质黏附实验

在96孔培养板中分别加入40μL纤维粘连蛋白和基质胶,置37℃、5%二氧化碳培养箱中孵育1h,PBS液小心冲洗2次,加入0.1%BSA 200μL37℃孵育2 h,PBS液清洗2次。转染48 h后,各组细胞分别用含0.1%BSA无血清DMEM培养液制成细胞悬液,调整细胞密度均至1×105/m L。将上述细胞悬液100μL分别接种于已包被纤维粘连蛋白和基质胶的96孔培养板中。37℃、5%二氧化碳培养1 h后,取出96孔板用PBS液清洗未黏附的细胞2次,每孔分别加入100μL含0.1%BSA的DMEM培养液和20μL的MTT(5 mg/m L),继续培养4 h后,去除孔中培养液加入120μL DMSO,室温孵育10 min。用酶标仪检测波长为492 nm时的OD值以表示细胞的黏附情况。每组设3个复孔,实验重复3次。

1.8 Transwell实验检测细胞侵袭能力

按照Corning公司Transwell小室说明书操作,制备细胞悬液,加于Transwell小室(每孔200μL培养液,1×105细胞)。培养48 h后,擦去基质胶和上室内的细胞,台盼蓝染色,正置显微镜观察,3～5个视野计数取均值。

1.9 统计学处理

所有实验数据均使用SPSS 13.0统计软件进行分析处理,所有数据用均数±标准差(x±s)表示,结果采用单因素方差(One-way ANOVA)分析,以P<0.05为有显著性差异。

2 结果

2.1 针对CB基因siRNA载体的构建结果

si CB634和si CB242发卡样si RNA单链DNA退火产物与pRNAT-U6.1双黏质粒连接后,以通用引物进行PCR扩增鉴定,并进行DNA序列测定,其插入序列与设计序列完全一致,见图1。

2.2 RT-PCR检测各组细胞CB mRNA表达结果

各实验组细胞CB m RNA的相对表达量见图2,其中空白对照组与无关si RNA对照组CB m RNA的相对表达量差异无显著性(P>0.05);与2个对照组比较,沉默1组和沉默2组CB m RNA的相对表达量都显著降低,差异有非常显著性(P<0.01)。说明转染pRNAT-U6.1-si CB634和pRNAT-U61-si CB242的沉默1、2组胃癌BGC-823细胞中CB m RNA表达都受到抑制,其中沉默2组的抑制效果优于沉默1组。

2.3 Western-blot检测CB蛋白表达结果

空白对照组和无关si RNA对照组的细胞中CB蛋白呈现高表达;然而沉默1组和沉默2组细胞中,CB蛋白表达被显著抑制,其中沉默2组的抑制效果优于沉默1组,与RT-PCR结果一致,见图3。说明设计针对CB基因的si RNA片段构建出的si RNA载体能够有效干扰胃癌BGC-823细胞中CB m RNA和蛋白的表达。

2.4 测定细胞生长曲线结果

绘制各组细胞的生长曲线见图4,统计学分析显示,空白对照组与无关si RNA对照组细胞孔内的吸光度值比较,差异无显著性(P>0.05);与2个对照组比较,沉默1组和沉默2组在2 d、3 d、4 d及5d细胞孔内的吸光度值显著减少,差异有显著性(P<0.05)。说明抑制胃癌BGC-823细胞CB基因表达,可以降低胃癌BGC-823的生长速度。

2.5 基质黏附能力实验结果

测定与纤维粘连蛋白和基质胶黏着的四组细胞在波长492 nm的吸光度值,结果见表1,其中空白对照组与无关si RNA对照组吸光度值,差异无显著性(P>0.05);与2个对照组比较,沉默1组和沉默2组吸光度值都显著降低,差异有非常显著性(P<0.01)。由此表明,转染pRNAT-U6.1-si CB634和pRNAT-U61-si CB242的沉默1、2组胃癌BGC-823细胞中抑制CB表达对胃癌BGC-823细胞与基质黏附具有显著的抑制作用。

2.6 细胞体外侵袭实验结果

各实验组穿透Matrigel的平均细胞数见表2。与2个对照组相比,转染pRNAT-U6.1-si CB634和pRNAT-U61-si CB242的沉默1、2组胃癌BGC-823细胞穿透Matrigel的平均细胞数显著减少,提示抑制胃癌BGC-823细胞CB基因表达,可以降低细胞侵袭和转移的能力。

注:覮与2个对照组相比,P<0.01

注:覮与2个对照组比较,P<0.01

3 讨论

肿瘤细胞向邻近部位的侵袭和远处的转移是恶性肿瘤有别于良性肿瘤一个重要的生物学特征之一,也是影响治疗效果及愈后的重要因素。在浸润、转移的过程中,肿瘤细胞与细胞外基质(extracellular matrixc,ECM)的黏附是肿瘤侵袭和转移的重要步骤。肿瘤细胞同ECM黏附后,肿瘤细胞本身和其周围的相关细胞(如成纤维细胞、炎性细胞等)产生大量蛋白酶对其周围的基底膜和基质进行酶解,有助于肿瘤细胞向远处迁移[6,7]。

组织蛋白酶B与肿瘤的发生发展有着密切的关系。CB是溶酶体含有的一种半胱氨酸蛋白水解酶,可以水解多种蛋白质,包括体内的血红蛋白、血清蛋白、明胶和卵黄磷蛋白等[1]。在多种恶性肿瘤中,如肺癌、乳腺癌、神经胶质瘤、食管癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌和恶性黑色素瘤中,CB m RNA和CB蛋白表达显著上调,活性明显升高[8,9]。研究发现,CB能够通过调节肿瘤细胞与ECM的黏附反应、降解ECM和影响肿瘤细胞的增殖来促进肿瘤的发生发展[10]。

本研究采用RNA干扰技术、基质黏附能力实验、细胞体外侵袭实验和CCK-8细胞增殖检测实验观察了抑制CB基因表达对胃癌细胞BGC-823的黏附作用、侵袭性和增殖作用的影响。结果显示抑制了CB的表达以后,胃癌细胞同ECM的黏附能力下降,胃癌细胞穿透基质胶的能力下降,胃癌细胞的增殖能力下降,说明CB的表达增加可以促进胃癌细胞的黏附,有助于其对正常组织的侵犯;同时抑制了CB的表达以后,胃癌细胞的增殖能力下降,说明CB的表达增加可以促进胃癌细胞的增殖。临床研究表明,胃癌组织中CB的表达和活性显著高于癌旁正常组织,并且CB的表达同胃癌浸润深度和淋巴转移程度密切相关[5],这一点与该研究相吻合。

综上所述,抑制胃癌BGC-823细胞CB基因表达,可以降低胃癌细胞的生长速度、降低胃癌细胞与基质黏附能力以及降低胃癌细胞侵袭和转移的能力。本研究为揭示胃癌细胞增殖、侵袭和转移的机制积累了实验依据。

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B淋巴细胞增殖性疾病 篇4

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

SPF级SD大鼠 (雄性, 200~250 g) 由广西医科大学实验动物中心提供;I型胶原酶、木瓜蛋白酶、胰酶、戊巴比妥钠、卵清白蛋白、氢氧化铝凝胶、大鼠TN F-α蛋白、四甲基偶氮唑蓝 (M TT) 、二甲基亚砜 (D M SO) 、PD TC为美国Sigm a公司产品;灭活的百日咳杆菌有北京生物所提供;胎牛血清 (Fetal Bovine Serum, FBS) 、D M EM培养基、PBS、D-H ank's液购自美国G ibcol公司;脂质体购自英伟公司;Taq D N A聚合酶、d N TPs、逆转录酶 (M-M LV) 、随机引物 (R andom Prim er) 、琼脂糖、焦碳酸二已酸均由大连宝生公司提供, PCR引物、内参照β肌动蛋白 (β-actin) 引物及特异性引物由上海生物工程有限公司合成;Tunnel试剂盒为南京凯基生物有限公司产品;N F-κB ELISA试剂盒为上海西塘生物有限公司产品。

1.2 仪器与设备

H era cell 150二氧化碳培养箱为美国Therm o公司产品;A xioert 40倒置显微镜为德国ZEISS公司产品;450型ELISA酶标仪为BIO R A D公司产品;PCR仪为美国M J R esearch Co公司产品;低温高速离心机为美国Beckm an公司产品, 紫外分光光度仪为美国Biochrom公司产品;G BO X H R型全自动图像分析仪为德国产品;402A I型超声雾化器为江苏省鱼跃医疗设备有限公司产品;小动物解剖器械一套由上海医疗器械 (集团) 有限公司手术器械厂提供;BG-SU BM IN I水平电泳仪、BG-V ER M IN I垂直电泳仪为北京BA Y G EN E公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 哮喘大鼠模型的建立

第1、8天将每只大鼠于皮下注射10 m g卵清蛋白 (O V A) 和200 m g氢氧化铝凝胶 (混合于1 m L的PBS中) , 同时腹腔注射5×109个灭活百日咳杆菌。于第15天开始激发:将大鼠置于一密闭容器中, 用超声雾化器给予2%O-V A磷酸盐缓冲液 (O V A.PBS) 50 m L雾化吸入刺激, 每天1次, 每次30 m in。诱喘成功后大鼠表现为前8、9 m in烦躁不安, 进而出现呼吸加快、加深、静伏不动、弓背, 严重者伸颈、缩胸、收缩呈喘息状, 有的大小便失禁等。对照组则以磷酸盐缓冲液 (PBS) 代替致敏原注射和雾化吸入。

1.3.2 哮喘大鼠支气管平滑肌细胞的分离、培养及鉴定

按2.1方法建立哮喘大鼠模型, 取哮喘4周大鼠, 腹腔注射3%戊巴比妥钠 (45 m g/kg) 麻醉, 开胸后迅速取出左肺、右中肺及右下肺叶置于预冷的D-H ank's液中, 沿着支气管的走向分离出主支气管, 在解剖显微镜下, 用显微镊剥离支气管平滑肌周围的肺动脉、肺静脉、神经纤维、结缔组织等, 去除内腔面的上皮组织。以上操作均在冰浴中进行。将获得的单层A SM剪成1 m m×1 m m的小块后, 将组织块转入含有下列成分的D-H ank's液中:胶原酶2m g/m L, 木瓜蛋白酶3 m g/m L, 胰酶2 m g/m L, 37℃5%二氧化碳培养箱中消化40~50 m in, 用吸管轻轻地吹打组织块, 100目不锈钢网过滤除去残余组织块, 800 r/m in离心后, 去上清, 加入含20%FBS、青霉素 (100 u/m L) 、链霉素 (0.1 m g/m L) 的D M EM培养液悬浮所分离的单细胞, 种于25 m L培养瓶中, 37℃5%二氧化碳培养箱中培养。原代培养细胞生长约3周后融合, 用0.25%胰蛋白酶消化传代。以含10%FBS、青霉素 (100 u/m L) 、链霉素 (0.1 m g/m L) 的D M EM培养液传代培养, 每3、4天换液1次, 约5、6d细胞长满后传代, 实验用第4~8代细胞。培养的A SM Cs经免疫组织化学方法鉴定平滑肌细胞特有的α-肌动蛋白。

1.3.3 分组

(1) 空白对照组:取培养的4~6代哮喘大鼠气道平滑肌细胞, 不加任何干预剂; (2) TN F-α组:加入TN F-α (终浓度为20 ng/m L) ; (3) (TN F-α+PD TC) 组:PD TC (终浓度为100μm ol/L) 预处理30 m in后, 加入TN F-α (终浓度为20ng/m l) ; (4) (TN F-α+TLR 4) 抗体组:TLR 4抗体 (终浓度为50μg/L) 预处理30 m in后, 加入TN F-α (终浓度为20 ng/m L) 每组做4个复孔, 每组重复实验2次。各组加入不同试剂培养24h后收集细胞及培养上清液, 进行以下实验。

1.3.4 四甲基偶氮唑蓝 (M T T) 微量比色法测定A SM C s增殖

哮喘大鼠A SM Cs按1×106/m L的密度接种于96孔培养板, 培养及分组如前述, 培养结束时每孔加入20μL M TT (5 m g/m L) , 继续培养4h, 弃培养液。再加入D M SO 150μL, 微量振荡器振荡10 m in, 使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪490nm波长处测定各孔吸光度 (A) 值。

1.3.5 T U N N EL法检测A SM C s凋亡

6孔培养板中加入盖玻片, 哮喘大鼠A SM Cs按1×106/m L的密度接种, 细胞长满盖玻片后按上述步骤加药、培养。培养结束后收集盖玻片, PBS液冲洗, 纯丙酮固定8m in, 制成细胞爬片。制细胞爬片后按TU N N EL试剂盒操作说明步骤进行TU N N EL法检测A SM Cs凋亡。凋亡细胞呈深棕色。凋亡率为每个高倍视野中凋亡细胞所占百分比, 计数5个视野取平均值。

1.3.6 ELISA试剂盒检测N F-κB的蛋白含量

哮喘大鼠A SM Cs4-6代细胞按1×106/m L的密度接种于6孔培养板, 培养及分组如前述, 培养48 h后, 离心, 取细胞上清液用ELISA试剂盒检测N F-κB的蛋白含量, 操作步骤按试剂盒说明进行。

1.3.7 逆转录聚合酶链式反应 (R T-PC R) 检测T LR 4的m R N A水平

各组哮喘大鼠A SM Cs按1×106/m L接种于50 m L细胞培养瓶中, 培养及分组如前述。培养结束后PBS洗涤, 0.25%胰蛋白酶消化收集细胞 (每瓶细胞数约为107) , 然后加入TR I-zo1 1m L抽提R N A (按试剂盒说明书操作) , 于-80℃保存, 用于一步法R T-PCR。

(1) TLR 4 R T-PCR扩增反应。TLR 4引物序列, 上游5'-CG CTTTCA CCTCTG CCTTCA CTA CA G-3', 下游5'-A CA CTA CCA CA A TA A CCTTCG G CTC-3', 此对引物扩增出270 bp的片段。β-actin引物序列:上游5'-G A TTA CTG CTCTG G CTCCTG C-3', 下游5'-G A CT CA TCG TA CTCCTG CTTG C-3', 此对引物扩增出150bp的片段。严格按大连宝生生物公司D R R 024A一步法R T-PCR反应体系说明书逐步操作, TLR 4上、下游引物各1μL, β-actin上、下游引物各1μL, 扩增产物置进行琼脂糖电泳。 (2) 琼脂糖电泳反应成功后, 取5μL PCR产物加1μL D N A上样缓冲液和PCR M arker (分子量标准) , 点样在2%琼脂糖凝胶的样板孔中, 凝胶中含有0.5μg/m L的溴化乙锭 (EB) 显色, 电泳电压0.8 V/cm, 时间30 m in。电泳结束后, 采用G BO X H R型全自动图像分析仪对电泳结果进行分析:分别测定每1个目的基因及看家基因β-actin的吸光度值, 取目的基因与β-actin吸光度值的比值。

1.3.8 W estern-Blot检测各组A SM C s中T IR 4的表达

参照《分子克隆》方法:A SM Cs培养结束后, 按通用蛋白裂解液的使用说明提取细胞总蛋白, 用Bradford法测定总蛋白浓度, 适量分装, 置-80℃冰箱冻存, 待测。聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤如下:取40μg蛋白质样品 (使用前, 煮沸变性10 m in) 上样后, 先以10 V/cm电泳, 待染料前沿进入分离胶后, 将电压提高到18 V/cm, 继续电泳直至溴酚蓝达到分离胶底部 (约需2 h) 。分离胶用于电转膜, 依次安装半干式电转移仪后, 根据凝胶面积按0.2 m A/cm 2接通电流, 在电转移液中电转移35 m in。取下硝酸纤维素膜, 放入塑料袋中, 根据滤膜面积以0.1 m L/cm 2加入膜封闭液, 密闭袋口, 并放入摇床上室温孵育1h。弃去封闭液, 立即将硝酸纤维素膜放入塑料袋中, 按0.1 m L/cm 2的量加入一抗稀释溶液 (兔抗鼠TLR 4抗体:一抗稀释液为1∶1 000, 平放在摇床上室温孵育4 h。剪开塑料袋, 弃去稀释液和抗体, 用TBST漂洗滤膜3次, 每次10 m in。然后, 按滤膜面积加入0.1 m L/cm 2 TBS及1∶100辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G, 置摇床上室温孵育2 h。取出滤膜, 在TBST中室温平缓摇动, 每次孵育10 m in, 共3次。最后把滤膜按滤膜面积加入0.1 m L/cm 2的底物显色液, 于室温轻轻摇动, 待蛋白条带颜色深度适当 (约3~5 m in) , 即用PBS漂洗, 将滤膜用G BO X H R凝胶成像分析系统进行扫描读取各条带的吸光度 (A) 值。

1.3统计学分析

应用统计分析软件包SPSS17.0版本进行统计分析。实验数据用均数±标准差 (x±s) 表示, 用方差分析检测组间的总差异, 各两两组间差异比较用q检验完成, 以P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 原代哮喘大鼠气道平滑肌细胞鉴定

镜下观察经原代培养的哮喘大鼠A SM Cs和正常大鼠A SM Cs均呈梭形, 有较长的突起, 细胞核位于细胞中央, 呈疏密相间、典型的“峰与谷”样生长, 见图1。采用兔抗鼠α-actin单克隆抗体进行免疫组织化学染色, 免疫反应产物呈棕黄色。98%细胞α-actin染色阳性, 证明所培养的为平滑肌细胞, 见图2。

2.2 四甲基偶氮唑蓝 (M TT) 微量比色法测定A S M C s增殖

TN F-α组A SM Cs的增殖反应与对照组相比差异有显著性 (t=3.2, P<0.05) , (TN F-α+PD TC) 组、 (TN F-α+TLR 4) 抗体组A SM Cs增殖反应显著低于TN F-α处理组 (t=7.62, t=6.86, 均P<0.01) , (TN F-α+PD TC) 组与对照组相比差异无显著性 (t=0.74, P>0.05) , (TN F-α+TLR 4) 抗体组A SM Cs增殖反应显著低于对照组 (t=3.94, P<0.01) , 见表1。

2.3 各组A S M C s细胞凋亡分析

TU N N EL法结果显示:TN F-α处理组细胞凋亡率显著低于对照组 (t=6.37, P<0.01) 。 (TN F-α+PD TC) 组、 (TN F-α+TLR 4) 抗体组细胞凋亡率显著高于TN F-α组、对照组 (t=20.75, t=20.01, t=14.72, t=18.03, 均P<0.01) 。见表1和图3。

注:1) 与TN F-α比较, P<0.01;2) 与对照组比较, P<0.05;3) 与对照组比较, P<0.01

2.4 E LIS A测定各组哮喘大鼠A S M C s的N F-κB的蛋白含量

比较各组细胞培养上清液N F-κB蛋白含量可见:TN F-α组N F-κB含量显著高于对照组、 (TN F-α+PD TC) 组及 (TN F-α+TLR 4) 抗体组 (t=24.91, t=37.51, t=24.64, 均P<0.01) ;对照组N F-κB含量显著低于T (N F-α+PD TC) 组 (t=4.09, P<0.01) ;对照组与 (TN F-α+TLR 4) 抗体组之间差异无显著性 (t=1.57, P>0.05) , 见表2。

注:1) 与TN F-α组比较, P<0.01;2) 与对照组比较, P<0.01

2.5 逆转录聚合酶链式反应 (R T-P C R) 检测各组哮喘大鼠A S M C s的TLR 4的m R N A水平

各组电泳图经扫描发现:TN F-α组TLR 4m R-N A表达水平显著高于对照组及 (TN F-α+TLR 4) 抗体组 (t=6.06, t=7.64, P<0.01) ; (TN F-α+TLR 4) 抗体组TLR 4表达水平与对照组之间差异无显著性 (t=1.03, P>0.05) 。见表3、图4。

2.6 W estern blot检测各组哮喘大鼠A S M C s的TLR 4的蛋白表达水平

各组电泳图经扫描发现:TN F-α组TLR 4表达水平显著高于对照组及 (TN F-α+TLR 4) 抗体组 (t=39.22, t=86.62, 均P<0.01) ;对照组TLR 4表达水平显著高于 (TN F-α+TLR 4) 抗体组 (t=8.58, P<0.01) 。见图5。

3 讨论

支气管哮喘的重要病理特征之一是气道重构, 其中气道平滑肌细胞在疾病的发生、发展中起着重要作用。气道平滑肌细胞增殖在气道重构中占有十分重要的地位, 气道平滑肌增生, 不仅使支气管对刺激的收缩反应更强烈, 加重气道高反应性, 而且增殖的A SM C使气道壁增厚, 导致基础气道阻力增加和不可逆性气流阻塞的发生。

TLR s作为介导固有免疫和获得性免疫的天然细胞膜受体, 在受到前炎症因子及各种配体刺激时能被激活并将信号传递到下游通路从而激活炎症反应。激活的TLR不仅诱导炎症反应, 而且促进抗原特异性获得性免疫反应的分化和成熟[1]。N F-κB是一种重要的、多向性的核转录因子, 普遍存在于细胞质中的快速反应转录因子, 位于TLR s下游信号通路的枢纽位置参与免疫反应及细胞增殖与分化等过程。TLR s识别配体后经过细胞内的一系列信号转导过程最后活化N F-κB, 诱导靶基因表达[2,3,4,5]。有关TLR-N F-κB的信号转导过程主要来自对TLR 2和TLR 4的研究[6], 促进细胞因子合成与释放是TLR s/N F-κB最突出的生物学功能。所以, 笔者推测TN F-α可能通过激活TLR 4后将信号转导至下游激活N F-κB这一转录因子, 从而在哮喘A SM Cs的增殖、凋亡中起作用。因此, 本实验用TN F-α刺激哮喘大鼠A SM Cs, 利用TLR 4抗体及N F-κB特异性拮抗剂PD TC为工具药, 探讨TLR 4/N F-κB在哮喘大鼠A SM Cs中的表达及对A SM Cs增殖凋亡的影响。

本实验发现:TN F-α组TLR 4的m R N A及蛋白表达、N F-κB蛋白含量显著高于对照组; (TN F-α+TLR 4) 抗体组TLR 4的m R N A及蛋白表达、N F-κB含量显著低于对照组和TN F-α组, 笔者推测TLR 4可能通过激活N F-κB后产生一系列生物效应, 这与其他学者的研究结果一致。

A SM Cs的增殖在哮喘气道重构中起重要作用[7,8]。作为效应细胞的A SM Cs受到长期慢性的炎性刺激可出现增生肥大, 从而导致气道壁增厚、气道重构。本实验发现:TN F-α组TLR 4的m R N A及蛋白表达、N F-κB含量显著高于对照组, 同时TN F-α组A SM Cs的增殖反应与对照组相比有增加, 而 (TN F-α+TLR 4) 抗体组A SM Cs增殖反应显著低于TN F-α组及对照组, (TN F-α+TLR 4) 抗体组A SM Cs凋亡率显著高于对照组和TN F-α组。由此推测, TLR 4可能参与调控哮喘A SM Cs的增殖反应和细胞凋亡。在实验中还发现:TN F-α+PD TC组与对照组相比增殖反应差异无显著性, (TN F-α+PD TC) 组增殖反应显著低于TN F-α组;这与BR A R等[9]研究的N F-κB人气道平滑肌细胞增殖的结果一致。A SM Cs的细胞凋亡不足是气道重构的另一重要原因。实验结果显示: (TN F-α+PD TC) 组细胞凋亡率显著高于TN F-α处理组及对照组。因此, 笔者推测, 哮喘大鼠A SM Cs的TLR 4可能调控N F-κB活性从而促进细胞的增殖, 抑制细胞凋亡, 从而参与哮喘的气道重构。

综上所述, 本研究结果显示TLR 4/N F-κB可能参与哮喘大鼠气道平滑肌细胞的增殖、凋亡的调节, 从而在哮喘大鼠气道重构中起重要作用。TLR 4可能成为哮喘治疗干预靶点。

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B淋巴细胞增殖性疾病 篇5

1 材料与方法

1.1 材料

PCR扩增仪和电穿孔转染仪为Bio-Rad公司产品;荧光显微镜为Olympus公司产品;流式细胞仪为BD公司产品;二氧化碳 (CO2) 培养箱为Thermo公司产品;液体闪烁计数器为Beckman公司产品;CD3+T细胞MACS免疫磁性分离试剂盒为Miltenyi Biotee公司产品;限制性内切酶Eco RⅠ、SalⅠ及T4连接酶均购自Takara公司;真核表达载体p IRES2-EGFP为成都博瑞克公司提供;人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物公司;RPMI 1640培养基购自Gibco公司;胎牛血清购自Hyclone公司;动物组织总RNA提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒及高保真PCR扩增试剂盒均购自天根生化科技公司;兔抗人FcγRⅡb1、PE标记的鼠抗兔Ig G为Epitomics公司产品;羊抗人μ链完整Ig G抗体为Genway公司产品。

1.2 方法

1.2.1 B细胞的分离及总RNA的提取和逆转录

采用Ficoll分层液密度梯度离心法分离出健康人外周血单个核细胞 (PBMC) , CD3+免疫磁珠阴性选择系统进一步分离纯化人外周血B细胞, 用D-Hanks液重复洗涤2次。取1×106细胞, 按照试剂盒说明书提取总RNA并逆转录为c DNA, 置-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 FcγRⅡb1编码区c DNA的扩增

根据Gen Bank提供的人FcγRⅡb1 m RNA序列 (BC148273) 设计引物, 包含起始密码子和终止密码子, 并加入Eco RⅠ和SalⅠ酶切位点, 由上海Invitrogen生物公司合成, 序列上游:5'-AAAGAATTCAGCTCGCTCC AGGGAGTGAT-3', 下游:5'-TATGTCGACTCCCAAT GCAAGACAATGGAGACT-3'。PCR反应条件:25μL体系, 退火温度50.5℃, 延伸1 min, 30个循环。扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析鉴定, 在接近1000 bp处出现电泳带为阳性。

1.2.3 真核表达载体p IRES2-EGFP-FcγRⅡb1的构建

将PCR全部反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳, 切取大小接近1 000 bp的DNA片段进行胶回收, 将胶回收DNA片段与p IRES2-EGFP载体分别进行Eco RⅠ和SalⅠ双酶切, 回收酶切产物后, 使用T4连接酶将两个酶切片段连接。连接产物转化感受态大肠杆菌XL1-blue, 使用LB-Kana平板筛选重组子。挑选3个重组单菌落于LB-Kana液体培养基中37℃振荡培养14 h, 收集菌体, 使用质粒提取试剂盒提取质粒。用Eco RⅠ和SalⅠ双酶切质粒, 使用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果, 选取酶切鉴定为阳性的重组菌送至上海Invitrogen生物公司测序鉴定。

1.2.4 电穿孔转染

采用Gene PulserⅡElectropo ration System (BIO-RAD) 电穿孔仪, 所有操作均在无菌条件下进行。电穿孔缓冲液为不含血清的RPMI1640培养基, 电转杯体积为100μL, B细胞总数为5×105, 分p IRES2-EGFP-FcγRⅡb1和p IRES2-EGFP两组加入10μg质粒, 混合均匀, 选用电压120 V、电容1 000μF电击细胞, 电穿孔后加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2.5 细胞转染效率及FcγRⅡb1分子表达水平的检测

转染细胞培养48 h后, 于荧光显微镜下观察绿色荧光, 同时采用流式细胞术检测绿色荧光蛋白, 以判断转染效率。将转染及未转染的B细胞加入兔抗人FcγRⅡb1, 4℃孵育30 min, 洗涤后再加入PE标记的鼠抗兔Ig G, 4℃孵育30 min, 经流式细胞术检测细胞表面FcγRⅡb1的表达水平。

1.2.6 转染FcγRⅡb1对B细胞增殖能力的影响

分别将1×105个未转染B细胞、p IRES2-EGFP-cγRⅡb1及p IRES2-EGFP转染的B细胞接种于96孔细胞培养板中, 每孔含10%胎牛血清RPMI 1640培养基200μL, 各孔加入羊抗人μ链完整Ig G抗体, 使其终浓度均为100μg/m L, 每组均设6个复孔。于37℃、5%CO2培养箱中培养72 h, 终止培养前16 h加入10μCi的3H-Td R, 收集细胞, 用液闪烁计数仪检测放射性cpm值, 结果以6个孔的均值表示。

1.3 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行数据分析, 各组间样本检测值以均数±标准差 (±s) 表示, 行t检验比较组间差异, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 真核表达载体p IRES2-EGFP-FcγRⅡb1的鉴定

重组载体经Eco RⅠ和SalⅠ双酶切后, 经1%琼脂糖凝胶电泳后可见大小分别为980 bp和5.3 k B左右的两条片段 (见图1) , 分别对应于FcγRⅡb1、p IRES2-EGFP的大小, 与预期重组结果一致。通过双向测序拼接结果证实为人FcγRⅡb1编码区c DNA序列。

2.2 细胞转染效率的检测结果

转染质粒的B细胞培养48 h后, 于荧光显微镜下观察可见绿色荧光蛋白表达 (见图2) 。经流式细胞术分析, p IRES2-EGFP-FcγRⅡb1转染组有15.5%的T细胞表达绿色荧光蛋白, 而空载体p IRES2-EG FP转染组的转染效率为24.8%。

2.3 转染细胞FcγRⅡb1分子的表达水平及对B细胞增殖能力的影响

经流式细胞术分析显示, p IRES2-EGFP-FcγRⅡb1转染组B细胞FcγRⅡb1的平均荧光强度 (MFI) 显著高于未转染B细胞组, 而空载体p IRES2-EGFP转染组B细胞MFI与未转染B细胞组差异无统计学意义。为了检测转染FcγRⅡb1对B细胞增殖能力的影响, 经3H-Td R掺入法检测放射性cpm值显示, 在抗μ抗体的完整Ig G刺激下, p IRES2-EGFP-FcγRⅡb1转染的B细胞增殖能力显著受到抑制, 其cpm值显著低于未转染B细胞组, 而空载体p IRES2-EGFP转染组B细胞cpm值与未转染B细胞组差异无统计学意义。见附表。

左边泳道:重组质粒p IRES2-EGFP-FcγRⅡb1双酶切后产物;右边泳道:LD2000 plus Marker

A:转染空载体p IRES2-EGFP绿色荧光蛋白的表达;B:转染重组质粒p IRES2-EGFP-FcγRⅡb1绿色荧光蛋白的表达

注:1) 与未转染B细胞组比较, P<0.01;2) 与未转染B细胞组比较, P<0.05

3 讨论

FcγRⅡb是一类广泛分布于淋巴样 (T细胞除外) 和髓样细胞表面的Ig G Fc段低亲和力受体, 主要起着负反馈性调节机体免疫反应的作用。在B细胞, FcγRⅡb1通过Ig G免疫复合物与B细胞表面BCR (B cell antigen receptor) 交联, 抑制由BCR启动的激活信号的转导。因此, FcγRⅡb1在B细胞活化过程中发挥着自身调节作用, 其表达水平及功能的改变对调节B细胞的活化和自身免疫病的进程具有深远的影响。例如C57BL/6小鼠或Mrl-Mp J小鼠中的FcγRⅡb1基因剔除后, 能导致狼疮样自身免疫病的发生[4], FcγRⅡb1与Fas双重缺陷的小鼠能建立良好的SLE动物模型[5]。有意义的是, 通过转入野生型基因, 恢复SLE倾向小鼠B细胞的FcγRⅡb1表达水平后, 能有效恢复这些小鼠的免疫耐受性, 从而阻止自身免疫病的发生[6]。如果利用转基因技术将正常人FcγRⅡb1基因导入自身免疫病患者B细胞内, 使患者B细胞表面FcγRⅡb1分子过表达, 则有可能纠正患者B细胞的过度活化。

本实验首先从健康人外周血B细胞中分离扩增出FcγRⅡb1基因片段, 使用Eco RⅠ和SalⅠ双酶切将FcγRⅡb1基因连接到真核表达载体p IRES2-EGFP上, 通过双酶切及双向测序拼接结果证实为人FcγRⅡb1编码区c DNA序列, 表明已成功构建了FcγRⅡb1基因的p IRES2-EGFP真核表达载体。与病毒载体相比, 质粒载体具有制备简单、快捷、成本低廉, 用于基因治疗较安全, 并能与其他合成载体联合使用等优点[7]。通常的质粒转染方法有磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂质体法、逆转入病毒介导转染方法、电穿孔法等。本研究先尝试采用脂质体转染法将FcγRⅡb1基因重组载体转染人B细胞, 但转染效果不理想。根据悬浮细胞适用电穿孔的特点[8], 最后采用了电穿孔法转染技术将p IRES2-EGFP-FcγRⅡb1导入新鲜分离的人B细胞中, 荧光显微镜下观察可见绿色荧光蛋白表达, 经流式细胞术检测转染效率为23.7%。经流式细胞术进一步检测显示, 该转染的质粒能在细胞内得到有效表达, 使B细胞表面FcγRⅡb1的表达水平显著提高。

为了进一步研究转染FcγRⅡb1重组质粒对细胞的功能作用, 本研究采用抗μ抗体的完整Ig G刺激B细胞。因为抗μ抗体除了与BCR结合外, 其Fc段还与FcγRⅡb1结合, 从而实现BCR与FcγRⅡb1的交联。因此该抗体通过BCR激活B细胞的同时, 也通过FcγRⅡb1传递抑制性信号以抑制B细胞的激活。采用3H-Td R掺入法检测放射性cpm值显示, 在抗μ抗体的完整Ig G刺激下, FcγRⅡb1重组质粒转染的B细胞增殖能力显著受到抑制, 表明本实验构建的FcγRⅡb1基因真核重组载体能在人B细胞中得到有效的表达, 并赋予了FcγRⅡb1分子发挥免疫抑制功能的作用。

总之, 本研究成功构建了人FcγRⅡb1基因真核表达载体, 通过电穿孔法转染人B细胞, 增强了B细胞表面FcγRⅡb1分子的表达水平, 并能显著抑制B细胞增殖的能力, 从而赋予了B细胞FcγRⅡb1分子发挥免疫抑制功能的作用。因此本次FcγRⅡb1基因真核表达载体的成功构建, 为下一步研究FcγRⅡb1干预相关自身免疫性疾病奠定了基础。

摘要：目的 构建人FcγRⅡb1基因的真核表达载体并转染人B细胞, 观察其在B细胞的表达及其对细胞增殖的影响。方法 分离健康人外周血B细胞, 提取总RNA并逆转录为cDNA, 采用PCR技术扩增出含有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的人FcγRⅡb1基因片段, 将双酶切产物通过T4 DNA连接酶定向插入pIRES2-EG FP真核载体相应位点中, 经酶切及双向测序鉴定其序列的正确性。通过电穿孔法将pIRES2-EGFP-FcγRⅡb1重组载体转入人B细胞中, 采用荧光显微镜及流式细胞术检测转染效率及细胞表面FcγRⅡb1分子的表达水平, 采用3H-TdR掺入法检测转染FcγRⅡb1基因对B细胞增殖能力的影响。结果 酶切及测序鉴定pIRE S2-EGFP-FcγRⅡb1重组质粒基因序列完全正确, 重组质粒转染细胞的效率为15.5%, 转染细胞表面FcγRⅡb1分子的表达水平显著增高, 并显著抑制了B细胞增殖能力。结论 成功构建了pIRES2-EGFP-FcγRⅡb1真核表达载体, 并赋予了FcγRⅡb1分子发挥免疫抑制功能的作用。

关键词：FcγRⅡb1,真核载体,转染,B细胞

参考文献

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B淋巴细胞增殖性疾病 篇6

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年1月至2012年12月在本院住院COPD患者30例为急性加重期组, 患者均为疾病急性发作期未使用任何免疫抑制剂、免疫增强剂等, 其中男22例, 女8例, 平均 (73±8) 岁。另选30例COPD患者为缓解期组, 经治疗均达到缓解期标准, 符合中华医学会呼吸学会分会年诊断指南中的标准[2]。随机选取同期30名健康体检者为对照组, 其中男25例, 女5例, 平均 (70±8) 岁, 三组入选对象年龄、性别无明显差异, 资料具有可比性。

1.2 方法

三组患者均在清晨空腹抽取外周静脉血2ml于EDTA抗凝管内, 分别采用CD45+CD3+CD4+CD8+, CD4+CD3+CD19+CD56+四色荧光标记流式细胞分析术法测定CD3+细胞比例, CD3+CD4+细胞比例, CD3+CD8+细胞比例, CD19+细胞比例, CD56+细胞比例及CD3+CD4+/CD3+CD8+比值) , 采用美国Beckman Coulter Epics-XL流式细胞仪, 具体操作按说明书进行。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 17.0软件包处理, 计量资料以±s表示, 两组显著性差异比较采用t检验, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

COPD急性加重期组与对照组比较, COPD急性加重期组, 外周血CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+、自然杀伤以及B淋巴细胞水平均比对照组低, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;COPD缓解期组, CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+、自然杀伤以及B淋巴细胞水平均比对照组低, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;COPD缓解期组外周血CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+、自然杀伤细胞及B淋巴细胞水平均高于急性加重期, 但均无统计学意义 (P>0.05) , 见表1。

注:与对照组比较※P<0.05;与急性加重期组比较△P<0.05

3 讨论

慢性阻塞性肺疾病与机体免疫功能的关系已越来越受到临床关注, 淋巴细胞属于一类具有特异性免疫功能的白细胞, 其包括主要参与细胞免疫的T淋巴细胞 (CD3+) , 还包括主要参与体液免疫的B淋巴细胞 (CD19+) , 同时对于T淋巴细胞而言, 其包括辅助性T淋巴细胞 (CD3+CD4+) 及抑制性/细胞毒性T淋巴细胞 (CD3+CD8+) 。机体为了保证正常的免疫功能状态, 还要依靠T淋巴细胞亚群保持合适的比例。研究显示, COPD急性加重期组和缓解期组外周血CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、B细胞水平与对照组比明显降低, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;这与王娜等[3]研究结果相似, 经治疗进入病情缓解期后CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、B淋巴细胞比值出现显著的上升, 而与对照组对比差异有统计学意义。说明COPD缓解期免疫功能出现恢复, 但不可能全部保持正常水平, 由于自身防御和免疫功能的降低以及外界各种有害因素的影响, 经常反复发作, 加重病情的发展。自然杀伤细胞是重要的天然免疫细胞, 能够非特异地溶解某些肿瘤和病毒感染的靶细胞, 也能通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用 (ADCC) 效应杀伤某些靶细胞, 并可分泌细胞因子调节其他免疫细胞的功能, 在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用[4]。本研究显示, COPD患者急性加重期组和稳定期组外周血自然杀伤细胞水平与对照组相比均显著降低, 与国外Urbanowicz等[5]研究结果一致, 提示体内自然杀伤细胞介导的细胞免疫功能降低, 使疾病预后不佳。总之, COPD患者出现免疫功能紊乱, 尤其于COPD急性发作期时, 细胞免疫功能明显下降, 出现自然杀伤细胞水平降低, 同时T淋巴细胞亚群失衡, 这可能是COPD的发病机制之一。COPD患者进行综合治疗时, 还要合理调整免疫功能, 如此对缓解疾病进展有益, 还利于改善预后。

摘要：目的 探讨慢性阻塞性肺疾病 (COPD) 患者T淋巴细胞亚群、自然杀伤细胞及B淋巴细胞变化的临床意义。方法用流式细胞仪检测30例急性加重期及30例缓解期COPD患者外周血中T淋巴细胞亚群 (CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+) 、自然杀伤细胞 (CD56+) 、B淋巴细胞 (CD19+) 水平的变化, 同时检测30例同期来院体检的正常人作为对照组。结果 COPD急性加重期组外周血CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+、自然杀伤和B淋巴细胞水平均比对照组要低, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;COPD缓解期组CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+、自然杀伤以及B淋巴细胞水平均较对照组低, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;COPD患者缓解期组外周血CD3+、CD3+CD4+、CD4+/CD8+、自然杀伤以及B淋巴细胞水平均比急性加重期较高, 但均无统计学意义 (P>0.05) 。结论 COPD患者出现免疫功能紊乱, 尤其在COPD急性发作期, 细胞免疫功能明显下降, T细胞亚群失衡, 同时自然杀伤细胞水平降低, 这可能是COPD的发病机制之一。

关键词：慢性阻塞性肺疾病,T淋巴细胞亚群,自然杀伤细胞,B淋巴细胞

参考文献

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[3]王娜, 夏婧.慢性阻塞性肺疾病患者免疫功能的变化[J].贵州医药, 2011, 35 (7) :593-595.

[4]傅佩芳, 殷少军, 颜正茂, 等.慢性阻塞性肺疾病患者与免疫功能关系的临床研究[J].中国现代医学杂志, 2008, 18 (3) :338-340.

B淋巴细胞增殖性疾病 篇7

1 资料与方法

1.1 研究对象 资料来自2004年1月-2009年12月就诊我院门诊及社区筛查的COPD患者,符合纳入标准共1500例;排除人数220例,失访人数28例;完成试验人数1252例,男1046例,女206例;平均年龄69±11.2岁,体重70.1±5.2kg。

1.2 诊断标准 符合2002年中华结核和呼吸杂志慢性阻塞性肺疾病诊治指南[2]。

1.3 纳入标准 入选的病例为确诊COPD且肺功能分级为Ⅱ-Ⅲ级的患者,即肺功能:FEV1/FVC<70%,30% ≤FEV1<80%预计值。

1.4 排除标准 ①对氨茶碱等药物过敏者;②患者肺功能分级在Ⅲ级以上者(不含Ⅲ级);③存在心、肝、肾功能损害者;④合并肺部肿瘤、血液系统、风湿免疫系统等基础疾病或受试过程中出现骨折、急性心脑血管病等其他系统疾病而无法继续参加研究者;⑤合并支气管哮喘等其他肺部疾病;⑥患有可能影响肺功能结果的疾病者,如近2个月内做过胸腹部手术;⑦不愿意或无法配合者不列为调查对象。

1.5 25只实验羊产地新疆,属绵羊科系,由新疆生产建设兵团绵羊繁育重点实验室提供,月龄5个月,15雄10雌,平均体重24±5.0kg,其实验标准符合《医学实验动物学》标准[3]。每只实验羊在实验过程中均用麦草微贮饲料喂养。

1.6 实验方法

1.6.1 稳定期COPD患者的试验方法

1.6.1.1 分组及比较方法 本研究对符合试验标准的患者采用双盲、随机分组,在进行研究之前均有2周的洗脱期,具体洗脱方案如下:①既往未治疗的COPD患者不经洗脱随机分为治疗组和对照组;②将既往曾应用氨茶碱、沙美特罗替卡松、异丙托溴铵等药物治疗的COPD患者需要停用原用药物的5个半衰期后随机分入治疗组(小剂量茶碱+常规治疗)和对照组(常规治疗)。③在洗脱期内如患者出现喘息及气短加重等急性发作情况,经过系统治疗好转后,按照原洗脱方案进行洗脱后再重新纳入实验。本次调查通过研究中心伦理委员会批准,入选对象均签署知情同意书。

1.6.1.2 给药方法 小剂量氨茶碱:“茶碱缓释片”0.4 g/d口服(平均每公斤体重2.5 mg～4 mg)共75d;常规治疗:异丙托溴铵2.5mL/d 1次雾化吸入+舒利迭50/250μg/d 2次吸入。

1.6.1.3 监测方法 治疗组及对照组患者在试验开始前3d禁用一切影响AP代谢的药物、茶叶、咖啡、可可、烟、酒等。实验开始后第四日晨起8:00取患者上肢外周静脉血查血常规。治疗开始后每间隔15d复查一次外周静脉血血常规。

1.6.2 受试实验羊均于检测前描记心电图一份,测量体重;在给药前取羊耳静脉血0.5 mL做瑞士染色后血常规检查;取髂后上棘处穿刺,抽取骨髓液0.5 mL涂片瑞士染色后20 min,油镜下计数250个有核细胞,在低倍镜下观察骨髓增生程度。此后予氨茶碱注射液3 mg/(kg·d)+5%葡萄糖注射液250 mL以30～40滴/min速度静滴,每隔15d重复上述检测一次,共5次;每周均测量体重,及时调整给药剂量。

1.6.3 仪器、试剂、试药 采用日本OLYMPUS公司BX51T-32F01型显微镜;氨茶碱注射液(广州白云山明兴制药有限公司,批号080901);茶碱缓释片(山西新华制药股份有限公司,0.1g/片,批号1002002),瑞士染色试剂(沈阳市试剂三厂生产)。

1.7 数据处理 外周血及骨髓片为瑞士染色,油镜计数,细胞之比以百分数计算。用SPSS11.5统计软件进行统计分析,采用重复测量资料的方差分析,全部资料采用undefined表示,给药前后资料采用配对数据t检验进行统计学分析,P<0.05有统计学意义。

2 结果

2.1 人和动物的外周血白细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞 粒细胞增殖在用药前和用药后15d、30d、45d、60d及75d增殖与减少不明显,t值分别是1.298、1.292、1.297、0.845、0.627、0.924和0.920、0.1476、1.20、0.727、0.792、0.923,即人和动物外周血粒细胞增殖在用药前后无显著性差异(P>0.05,表1、2)。

2.2 在长期应用小剂量AP后,动物骨髓中嗜酸粒细胞的比率逐渐增多,但在用药的第15天、30天和45天与用药前比无差异,而在用药后第60天开始骨髓的嗜酸粒细胞的比率较用药前有显著增高,并有统计学意义,第60天和第75天的P值分别为P<0.05和P<0.025(表3)。

2.3 长期应用小剂量AP后,动物骨髓的红系呈增生改变,各阶段比例正常,用药前后比较无统计学差异(P>0.05);而粒:红比值明显增大,用药前后有统计学意义(P<0.05),其中嗜酸粒细胞增生活跃,研究结果也显示用药前后其它粒细胞增生无显著性影响(P>0.05);血红系统增生无变化(P>0.05)。

3 讨论

AP是磷酸二酯酶(PD)抑制剂,同时也是腺苷受体的阻断剂,能对抗内源性腺苷诱发的气道收缩。近年来有些学者还发现,AP还有调节免疫和抗炎的作用。本文通过1252名患者和25只实验羊进行长期应用小剂量AP观察发现:AP可通过调节骨髓嗜酸性粒细胞增殖而引起抗炎调节免疫的作用。

嗜酸性粒细胞是血液粒细胞中的一个重要组成部分,是由骨髓干细胞产生,不产生于粒-单细胞(CFU-GM),它与红细胞及巨核细胞一样,有独立的前体细胞;CFU-E,嗜酸性粒细胞集落形成因子主要受抗原刺激淋巴细胞产生。骨髓中嗜酸早幼粒细胞及中性粒细胞构成了嗜酸性细胞分裂,其分裂、增殖及成熟方式与中性粒细胞相似。成熟的嗜酸性粒细胞在进入外周血液前数天储存于骨髓内,平均渡过时间为9d。分裂后的过渡时间约为2.5d。本组资料发现:长期应用小剂量AP,骨髓红系增生无显著性变化(P>0.05),粒细胞增生呈递增性活跃(P<0.05),粒:红比值明显增大(P<0.05),而外周血嗜酸细胞比值无明显变化(P>0.05)。提示:AP可能通过调节淋巴细胞功能,而产生趋化因子和促嗜酸性粒细胞生成因子,以促进骨髓嗜酸性粒细胞生成。因嗜酸性粒细胞的循环半衰期(T1/2约30min)明显短于中性粒细胞半衰期,并于骨髓释放以后进入循环最初期间一小时,嗜酸粒细胞约有50%离开血液并大部分进入组织中,若一旦离开循环和进入组织就不能再进入循环中[4]。因此,用药后骨髓嗜酸粒细胞比值较外周血中嗜酸性粒细胞比

值明显增大(P<0.05)。

bcl - 2 (b-cell lymphoma/Leukemia-2,B细胞淋巴瘤/白血病-2)蛋白质家族是控制线粒体致凋亡因子释放的主要调节因子,作为细胞内蛋白,可以抑制众多因素诱导的细胞凋亡,在调节嗜酸性粒细胞细胞凋亡过程中也起重要作用[5]。茶碱可以抑制免疫机制等刺激反应从而使哮喘患者的祖细胞表达Bcl-2蛋白,茶碱可以减少嗜酸性粒细胞系统的移植和增加嗜酸性粒细胞的凋亡,而这个过程是通过cAMP系统抑制bcl-2的表达来实现的。而茶碱的抗炎的作用抑制了祖细胞的循环[6]。

嗜酸性粒细胞是人体内一种重要的白细胞,正常情况下,其在人体内所占白细胞的百分比相对稳定。当人体因寄生虫感染而导致过敏反应或患有哮喘、SLE、类风湿关节炎、湿疹等变态反应性疾病时,嗜酸性粒细胞会增多,并参与非特异性免疫反应[7,8]。巩惠芸等[9]对100例嗜酸性粒细胞增高的患者以及100名正常人进行了外周血T淋巴细胞的细胞核仁银染面积与细胞核面积比值(I.S%值)进行检测,发现嗜酸性粒细胞增高者的I.S%值明显高于正常人(P<0.01),说明嗜酸性粒细胞增高者的T淋巴细胞增殖活跃,机体细胞免疫功能增高,帮助机体对抗异物,参与机体的免疫应答。AP可能通过调节骨髓粒细胞增殖而参与调节免疫,以提高机体抗炎、调节免疫作用。由于本研究资料欠缺,AP导致骨髓嗜酸性粒细胞增生活跃的原理还有待进一步研究。

摘要：目的 探讨长期应用小剂量氨茶碱(Aminophyllin,AP)对稳定期慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)患者、动物骨髓、外周血粒细胞增殖的影响。方法 (1)应用前瞻、随机分组、对照及自身对照的方法,将1252例稳定期COPD患者(Ⅱ～Ⅲ级)分为治疗组(常规治疗+茶碱缓释片0.4g/d)和对照组(常规治疗)。治疗开始后每间隔15d复查1次血常规,对治疗前后的指标进行自身前后比较。(2)25只实验用羊采用自身对照法,在应用AP 3mg/(kg.d)后,对治疗前后的各项指标进行自身前后比较。结果 (1)长期应用小剂量AP,对稳定期COPD患者的外周血粒细胞增殖无影响(P>0.05);(2)长期应用小剂量AP可使动物的骨髓嗜酸性粒细胞增生活跃(P<0.05);(3)长期应用小剂量AP对动物的骨髓、外周血粒细胞增生无影响(P<0.05)。结论 长期应用小剂量AP可使骨髓嗜酸性粒细胞增生活跃以提高机体抗炎及调节免疫能力,而对骨髓血红系统及外周血粒细胞增殖无影响。

关键词：氨茶碱,慢性阻塞性肺疾病,外周血/骨髓,调节免疫,人/动物

参考文献

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