肿瘤细胞增殖（共9篇）
肿瘤细胞增殖 篇1
摘要：本文通过参考近年来对芹菜素抑制肿瘤细胞增殖作用的研究的相关文献,于芹菜素对肿瘤细胞的增殖抑制作用机制做了归纳和探讨。研究发现,芹菜素对多种癌细胞都有抑制其生长和促使其凋亡的作用,其对各种癌细胞作用的机理研究已经深入到细胞和分子水平,包括对细胞凋亡和周期相关基因的调控,对细胞周期G0/G1,S及G2/M期的阻滞,对与凋亡相关的线粒体途径和非线粒体途径的各种酶和蛋白表达的影响,抑制肿瘤细胞血管生成以及增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性等。芹菜素抑制肿瘤细胞增殖机理值得我们深入探索,其作为一种自然界广泛存在的抗癌症化合物具有广阔的应用前景。
关键词：芹菜素,癌细胞,抑制增殖,机制
芹菜素( apigenin,API) 又称芹黄素,是一种天然的黄酮类化合物,广泛存在于自然界中,以植物黄色素的形式在茶叶、蔬菜、水果和香料中广泛分布,中药如地钱、西藏雪莲花、车前子、络石藤等中也有很高的含量,近年来通过对芹菜素的研究发现,芹菜素在抗肿瘤方面作用显著,对乳腺癌,前列腺癌,膀胱癌,卵巢癌,胃癌,肺癌,胰腺癌等均有一定的抑制作用,现就近年来芹菜素在抑制肿瘤细胞增殖机制方面的研究新进展作一综述。
1调控凋亡基因
1. 1周期相关基因
杜俊瑶等［1］用芹菜素处理卵巢癌细胞CAOV3, 发现存活素( survivin) mRNA的表达下调,p21 mR- NA的表达上调,细胞周期在G2 / M期停滞。Zhang等［2］发现芹菜素作用KYSE-510细胞后,p21waf1基因上调表达,与G2 /M期细胞周期停滞有关的细胞周期素( cyclin) B1基因下调表达,p21waf1可能通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶［3］( cyclin-dependent kinase ,CDK) 1促进KYSE-510细胞发生G2 / M期细胞周期停滞。而芹菜素作用OE33细胞后, GADD45β、14-3-3σ 基因上调表达,cyclin B1基因下调表达,GADD45β 能破坏cyclin B /CDK1结合状态［4］,14-3-3σ 则能通过Weel磷酸化CDK1,或使Cdc25c去磷酸化,促进cyclin B / CDK1向细胞核外的转运［5］,并控制细胞进入有丝分裂期［6］,从而引起OE33细胞发生G2 /M期细胞周期停滞。APC是一种与大肠直肠癌发生有关的肿瘤抑制基因,它的功能失调对于芹菜素诱导细胞周期停滞有关键作用。Chung C S等［7］发现在人直肠癌细胞中,芹菜素使APC的表达上调,促使了癌细胞死亡。
1. 2凋亡相关基因
在对膀胱癌BIU-87细胞的研究中,姚善华等［8］研究发现芹菜素能通过下调survivin mRNA和sur- vivin蛋白表达,上调半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶( cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase) - 3蛋白表达,明显抑制细胞的生长,并促进细胞发生凋亡。Slusarz A等［9］发现芹菜素还可通过抑制Gli1 mRNA聚合,阻滞Hedgehog信号转导通路,抑制人前列腺癌细胞增殖。
1. 3能量摄取、血管形成相关基因
Melstrom等［10］等发现芹菜素可通过下调葡萄糖转运蛋白( GLUT-1) mRNA表达和蛋白质的表达显著抑制两种胰腺癌细胞系CD18和S2-013对葡萄糖的摄取,从而抑制胰腺癌细胞的生长; 还可通过低氧诱导因子1α 下调GLUT-1表达,以及阻碍血管内皮生长因子的表达,抑制在低氧状态下的胰腺癌细胞CD-18和S2-013的增殖。
2调控细胞周期
2. 1 G0 / G1期阻滞
Gupta等［11］发现芹菜素可下调人前列腺癌细胞cyclin D1、cyclin D2和cyclin E以及通过p53途径上调CDK抑制剂WAF1 /p21 and KIP1 /p27表达, 从而抑制了CDK2、CDK4、CDK6活性,将细胞阻滞在G0 / G1期。Shukla S等［12］还发现经芹菜素处理的前列腺癌细胞和PC-3细胞中与p38和PI3K-Akt的磷酸化减少相关的cyclin D1的表达减少,cyclin D2,E以及结合的CDK 2,4和6的明显抑制,使细胞阻滞于G0-G1期。
2. 2 G1 / S期阻滞
Zheng等［13］发现芹菜素通过P53途径的p21 / WAF1表达增加使人宫颈癌细胞G1期阻滞。Bektic等［14］发现芹菜素可使cyclin D1表达减少而p21 / WAF1表达增加来使细胞发生G1 / S期阻滞。Shuk- la S等［15］认为芹菜素通过使WAF1 /p21、KIP1 /p27、 INK4a / p16和INK4c / p18的表达增加,cyclins D1、 D2、E和CDK2、CDK4和CDK6表达下降,降低Rb在serine780的磷酸化,稳定p53 serine15的磷酸化, 使芹菜素在前列腺癌移植裸鼠的肿瘤组织中阻滞细胞周期,从而抑制肿瘤的生长。
2. 3 G2 / M期阻滞
Kobayashi等［16］发现芹菜素可以通过P53依赖的途径诱导P21产生,进一步抑制CDK1使细胞周期阻滞于G2 /M期从而发挥对前列腺癌细胞的生长抑制作用。Casagrande F等［17］研究发现芹菜素在黑色素瘤细胞中可以通过抑制CDK1( cdc2) 的Tyr15残基的磷酸化而抑制CDK1( cdc2) 活性,使肿瘤细胞被阻滞在G2 /M期。Wang W等［18］认为芹菜素通过抑制cyclin B1结合的CDK1编码蛋白激酶的活性,减少cyclin B1及p34( cdc2) 激酶的积聚将结肠癌细胞SW480,HT-29和Caco-2阻滞在G2 /M期。 Yin F等［19］则认为芹菜素抑制cyclin B1和CDK1蛋白的表达,导致CDK1激酶活性的抑制,伴有CDK4,cyclin D1和cyclin A蛋白水平的下调,使MCF-7和MDA-MB-468细胞被阻滞在G2 / M期。 Ujiki MB等［20］发现芹菜素通过下调cyclin A、cyclin B表达,以及减少cdc2、cdc25磷酸化诱导胰腺癌细胞G2 /M期阻滞。Choi EJ等［21］用芹菜素处理乳腺癌细胞SK-BR-3,细胞周期在G2 /M期停滞,CDK1和cyclin A、B含量下降,p53的积累增加,p21水平提高。
3调节参与凋亡的酶和蛋白的表达
3. 1线粒体途径
Choi EJ等［21］认为芹菜素通过抑制CDK1和积累P53,促进下游Bax和细胞色素C表达,进而增加p21( Cip1 ) 水平,诱导乳腺癌细胞SK-BR-3凋亡。 Gupta等［11］发现将人激素易感性前列腺癌细胞加入芹菜素共同培养后,观察到DNA呈片断化,Bax / Bcl-2比值增加,细胞发生凋亡。I-K1Wang等［22］认为芹菜素通过提高细胞内活性氧水平,改变线粒体跨膜电位促使细胞色素C释放到胞浆并激活Ca- pase-9的作用,进而导致细胞内Caspase-3蛋白酶活化,引起细胞凋亡。Lu等［23］认为芹菜素通过上调细胞色素C,AIF和Endo G水平,调节Bax /Bcl-2比率,引起Caspase-9和Caspase-3活化,从而引发人肺癌A549细胞凋亡,而对于人肺癌H460细胞,芹菜素通过下调Bid,Bcl-2,procaspase-8; 上调Bax, caspase-3,AIF,细胞色素C,GRP78和GADD153的表达; 降低线粒体膜电位以及增加ROS和Ca2 +来抑制增殖的［24］。Hussain等［25］研究芹菜素对淋巴瘤细胞系的影响,发现淋巴瘤细胞用芹菜素处理引起p-Bad蛋白去磷酸化,抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白和细胞凋亡蛋白抑制剂( IAPs) 下调,Bax /Bcl2比率增加, 同时Bax蛋白构象改变,从细胞质移位到线粒体,引起线粒体膜电位下降,随后细胞色素C释放,激活Caspase-9和Caspase-3。
3. 2非线粒体途径
Tzong-Der Way等［26-27］研究发现芹菜素能够诱导HER2 /neu过度表达的乳腺癌细胞发生凋亡,是通过减少HER2 /neu蛋白的表达,从而抑制HER2 / HER3-PI3K / Akt通路的信号转导,诱导细胞色素C及Caspase-3的激活而产生的。Lee等［28］认为芹菜素通过抑制肝细胞生长因子( HGF) 诱导的AKT磷酸化和PI3K途径的beta4整合蛋白来抑制MDA- MB-231细胞增殖。 Bektic等［14］发现芹菜素可使ERK1,ERK2的磷酸化减少,介导MAPK通路抑制前列腺间质细胞的增殖。Shukla S等［15］认为芹菜素抑制前列腺癌和PC-3细胞总RB蛋白和位于Ser780和Ser807 /811位点RB蛋白的磷酸化,促进ERK1 /2和JNK1 /2的磷酸化,从而抑制了ELK-1的磷酸化及原癌基因c-fos的表达,抑制肿瘤细胞的存活。在其它研究中Shukla S等［29］发现芹菜素通过对胰岛素样生长因子( IGF) -I诱导的IGF-IR的抑制和对p-Akt的抑制导致GSK-3beta磷酸化和cyclin D1表达下降,p27 / kip1表达增强,通过IGF / IGF-IR和PI3K/Akt途径诱导前列腺肿瘤细胞DU145凋亡。Liang Y C等［30］发现芹菜素可以通过抑制NF- κB抑制因子激酶活性,减少NF-κB抑制因子降解, 下调NF-κB活性促使肿瘤细胞凋亡。Seo HS等［31］发现芹菜素能上调p53,phospho-p53和p21水平,抑制磷酸化c-Jun氨基端激酶-1 ( JNK-1) 和磷酸化STAT3的表达和活性,降低胞质内的 κB抑制因子 α 的磷酸化水平,抑制p65入核,阻断核因子-κB( NF- κB) 通路的活化,诱导HER2过表达的乳腺癌细胞MCF-7 vec和MCF-7 HER2的凋亡。
4抑制肿瘤血管生成及增强对化疗药物的敏感性
LIU等[32]发现芹菜素通过抑制人肺癌A549细胞AKT和p70S6K1活性,致HIF-1和血管内皮生长因子表达下降,从而抑制肿瘤血管生成和细胞增殖。Choi等［33］发现芹菜素能下调Akt和Erb B2的表达来增加过度表达Erb B2的乳腺癌MDA-MB-453细胞对5-氟脲嘧啶的敏感性,促使细胞凋亡。 Kachadourian等［34］报道,在A549细胞和人类前列腺癌PC-3细胞中,芹菜素可以显著降低谷胱甘肽水平,而谷胱甘肽水平的降低可能与细胞对抗肿瘤药物的敏感度增强相关。
5结语与展望
芹菜素通过调控凋亡相关基因,调控细胞周期,调节参与细胞凋亡的蛋白和酶的表达,化疗药物的增敏等多种途径抑制肿瘤细胞增殖,发挥抗肿瘤作用,并且作为一种天然、低毒、高效的广泛存在于自然界的天然黄酮类化合物日益受到人们的重视,但是芹菜素具体抑制各种肿瘤细胞增殖的具体机理仍未探究清楚,值得深入研究,包括凋亡基因的表达与蛋白表达的一致性,芹菜素对其表达的量效关系,导致凋亡或周期阻滞的完整信号传导通路以及通路之间的选择性及相关性等。总之,芹菜素高效低毒,其抑制肿瘤细胞增殖的机制值得继续深入探究,并有望据此研发新型抗肿瘤药物。
肿瘤细胞增殖 篇2
“细胞的增殖”是必修一《分子与细胞》第六章第一节的内容，本节内容大致分为“细胞不能无限长大”，“细胞通过分裂进行增殖”，“有丝分裂”和“无丝分裂”四部分。重点以植物细胞有丝分裂过程为例学习有丝分裂的知识，并通过比较，让学生观察并归纳动物和植物细胞有丝分裂的相同点和不同点。继而领悟出二者的相同点：亲代细胞的染色体经过复制后，平均分配到两个子细胞中去，从而保持了遗传物质的稳定性，即是有丝分裂的重要意义。
本节内容在高中生物学习中起到了承下启上的作用。学生从前面几章了解了细胞生命系统的物质组成，结构和功能之后，自然而然地过渡到细胞增殖，学习起来并不会很陌生;同时，细胞增殖也是以后学习减数分裂，DNA复制以及遗传信息的传递，遗传规律的基础。本节内容更是高考的重点和难点。
二、教学目标
(一)知识目标：
1.使学生掌握细胞生长和增殖的周期性，明确细胞增殖对维持一切生命活动和延续种族的意义。
2.知道细胞增殖的方式和意义。
3.区分有丝分裂各时期，掌握细胞有丝分裂各时期的特点及染色体、DNA的变化规律。
4.会区分动物和植物细胞有丝分裂的不同。
(二)能力目标：
1.培养学生观察问题，运用数学方法处理和分析实验数据的能力。
2.养成批判性思考问题的能力。
3.能够利用多媒体获取生物信息。
(三)情感目标：
1.使学生学会从微观把握生物体的变化，并形成结构与功能相统一的生物学思想。
2.树立辩证唯物主义的运动观、发展观。
三、教学重点和难点
教学重点：细胞周期及植物细胞有丝分裂的过程。
教学难点：植物细胞有丝分裂各个时间DNA、染色体的变化规律。
难点突破：通过观察动态的多媒体课件，使抽象问题具体化，再结合传统讲授的教学模式，使复杂的问题变得易于接受，同时以启发式的问题引导学生深入思考，再加以随堂训练，攻克难点的同时完成能力目标
四、学情分析
本节授课对象为高一的学生：
1、学生在初中已学过“细胞通过分裂产生新细胞”，对有关癌症的知识也有所了解，具有一定的生物学知识基础。
2、对生物学的学习兴趣较高，主动性强，再加上多媒体的使用，学生很容易积极主动地参与到学习中来。
3、高一学生归纳，综合和抽象思维能力较差。
五、教学方法
讲授法、直观教学法、点评-点拨法、自学导思法
六、学法指导
引导学生形成“感知-辨认-概括-定义-迁移”的概念学习模式。
七、教学程序
(一)、问题导入，激发学生的学习兴趣
从学生最感兴趣的事情出发，更容易吸引学生参与，自主学习并且能够自然应用到生活实践中去。本节课中，以生命的起源和人体的奥秘提出问题：“我是从哪里来的?”这样设疑，既可以把细胞和个体联系起来，为将来学习胚胎发育和遗传变异奠定基础，又能回顾在细胞学说中认识到的细胞的来源。
(二)、观察现象，积累直观认识，培养学生自主探究能力。
这个环节的实施必须在学生充分预习的基础上来完成。先连续播放细胞分裂的动态过程动画，让学生自己找出规律。指出细胞周期的概念。提出问题“细胞周期的起点和终点为什么要以一次分裂完成时作为界限呢?”。学生通过思考，得出答案，找出分裂间期和分裂期的时间特点。
多媒体展示各时期图像，由学生自己总结各时期的特点，使学生初步对各时期的细胞图像建立直观的认识。再通过表格，让学生归纳各时期的染色体和DNA等的变化，师生共同总结填表。这样可以将全部学生的学习成果加以总结和统一，使学生将刚刚获得的知识系统化。
(三)、课堂反馈，及时调整教学。
学生在课堂小结后，进行课堂反馈
(一)，完成学案，解决实际问题。在这个过程中，学生会发现有丝分裂各时期的特点记忆不牢，无法顺利地用来解题。于是，师生通过共同总结，讲授“谐音记忆法”。在教学中，我比较注重对学生记忆方法的指导。生物学的知识点杂而多，学生只有记住了，才能灵活运用。学生在快速记忆后，继续完成课堂反馈
(二)，该反馈中所选题型难度加大，学生仍能顺利完成，说明上述方法使用得当。其中，我设计了一个环节，让两组学生到黑板贴图，将各时期图像排序，这样更能促使学生积极参与到学习中来。
(四)制作模型，演示说明，理解有丝分裂过程。
学生根据所学知识，分组进行实践。可以利用剪刀、纸、彩笔制作立体模型，也可以用不同颜色的笔画平面模型。由于时间关系，各学习小组分别选择一个时期作为制作对象。完成后，各小组挑选作品评价，并让学生描述和演示他们完成的模型，学生能够体验到学习的成就感。
(五)图像观察，自主分析，总结植物细胞和动物细胞有丝分裂的异同。
在前面学习的基础上，学生很容易找出二者的相同点和不同点，填写在表格项目中。通过观察比较，发展和完善学生的识图能力和分析能力。
(六)完成作业，找出有丝分裂过程中DNA和染色体的变化规律。
DNA和染色体的变化规律，可以作为本节的内容检验和练习来完成，以前面的实验和图像观察为基础，学生能够在作业题中完成DNA和染色体的变化曲线，教师在学生完成作业后要加以总结和强调。
(七)教师小结，联系下节内容，使知识具有连贯性。
八、教学反思
本节课课堂教学内容较多，时间安排紧凑。教师课前必须对各环节做好充分安排，印发学案，布置预习。而学生是否做好了预习，是本节课能否在规定的时间内完成和达到理想效果的关键。本节内容十分抽象，微观，为此，我很注重课堂资源的选择、整合和优化。通过课件演示有丝分裂各时期的特点，学生能很好的感受到细胞分裂过程是一个连续地、动态地过程。同时，我在课堂上充分运用了问题探究的方法，尽力挖掘学生原有的知识经验，注重学生的主体性学习，用探究式问题启发学生，培养学生的分析、处理问题能力、获取信息能力以及逻辑推理能力等。但是在探究性学习过程中，教师如何做好引导、指导工作，如何调动每一位学生的积极性，还有待于进一步研究。
肿瘤细胞增殖 篇3
1 非神经细胞中nAchRs的表达
人类、鼠和兔子的正常支气管表皮细胞表达多种nAchRs亚基。实验表明, 非神经nAchRs位于支气管表皮和内皮细胞膜上。许多实验数据表明, 支气管上皮、内皮细胞等合成乙酰胆碱, 这些细胞具有胆碱乙酰转化酶活性, 在非小细胞肺癌癌细胞、癌旁正常组织和正常组织中nAchRs的表达模式不同, 这揭示了β4亚基的上调和α4水平的伴随下降。通过RT-PCR和免疫杂交技术, 在胸膜间皮活组织切片检查到a7 nAchRs, 但其亚细胞定位不能通过免疫组化的方法定位, 且仍需进一步的实验验证人类非小细胞肺癌nAchRs亚基是通过尼古丁受体和离子门通道起作用的。
2 nAchRs和细胞增殖
2.1 尼古丁对细胞增殖的影响
nAchRs激动剂尼古丁是烟草的主要活性成分。尼古丁处理SCLC、NSCLC等细胞系诱导依赖nAchRs方式的细胞增殖[1]。此外, 在hamster鼠中研究表明尼古丁和氧过多结合能够诱导肺癌。这一发现表明肺部结合氧的减弱以及nAchRs的慢性刺激诱导肺癌发生。nAchR拮抗剂的产生加强了nAchRs在细胞增殖中作用的研究。尤其a7nAchRs被表明具有调节尼古丁的增殖作用。以往在NHBE、SCLC和NSCLC细胞的研究表明a7nAchRs拮抗剂、a金环蛇毒素等能够减弱尼古丁的增殖作用。然而, 有一些研究者在BEAS-2B无限增殖的人支气管上皮细胞和吸烟者的NHBE细胞中未检测到a7nAchRs的表达。已表明, 尼古丁通过a7nAchR刺激间皮瘤的增长。此外, 通过MTT和软凝胶实验在两株由胸膜活检组织建立原发肿瘤细胞系中, 100nm筒箭毒碱终止细胞生长。这些研究强调了nAchR做为肿瘤治疗分子靶位点的可行性。
2.2 尼古丁诱导细胞增殖的信号通路
尼古丁通过增加生长因子如BDNF等和生长因子受体如VEGFR-2等水平促进细胞增殖。尼古丁通过增加细胞内Ca2+和Ca2+通道诱导表皮生长因子受体转导。细胞内Ca2+引起EGFR转导的可能的机制之一, Ca2+的上升诱导胞浆激酶活性, 进一步磷酸化EGFR。尼古丁在胃癌细胞中通过刺激COX-2的表达上调血管内皮生长因子受体VEGFR。这些结果首次表明了MMPs和纤溶酶原在nAchR信号途径中的作用。
在A549细胞系中, 尼古丁可以促进蛋白磷酸酶1 (PP1) 的抑制性磷酸化。磷酸化使PP1功能丧失, 降低细胞周期依赖性激酶抑制子p27Kip1的水平, p27Kip1反作用促进细胞周期过程。尼古丁以依赖α7受体模式, 通过诱导纤维结合素和α5β1整合素的表达增强NSCLC细胞的生长。影响α7nAchR作用的纤维结合素受ERK和PI3K/mTOR信号通路的激活调节。
尼古丁在小细胞肺癌细胞、角质化细胞及间皮瘤中激活Ca2+流入, 尼古丁与α7 nAchR结合导致膜去极化、Ca2+通道激活和5-羟色胺释放[2～4]。尼古丁诱导细胞增殖的其它信号通路包括NF-kB、Src, Akt、HIF-1α和COX-2激活的信号通路[3]。在间皮瘤细胞中, 尼古丁结合nAchR引起Ca2+流入, 并激活激酶MEKK-1、ERK1/2和p90RSK。随后, MEKK1激活转录因子NF-kB复合物, 后者诱导细胞进入S期。尼古丁也能激活MAP激酶通路, 以依赖于α7nAchR的方式增加Raf-1、ERK1/2和MEK1的水平[4]。1μm尼古丁处理A549细胞引起Rb和Raf-1信号激酶的生理性相互作用。Rb-Raf之间的相互作用是调节细胞增殖的重要早期事件。此外, 尼古丁引起Rb-Raf下游的细胞周期蛋白和依赖细胞周期蛋白激酶的失活, 随后E2F1从Rb解离下来促进细胞生长。尼古丁可以促进E2F1、E2F2和E2F3结合到增殖启动子上, 引起它们的相互作用使细胞进入S期。
2.3 烟草烟碱诱导的信号通路
烟碱是烟草的主要成分, 它们与nAchR具有高亲和力。已发现NNK是α7 nAchR的高亲和力激动剂, 而NNN结合epabidine敏感的nAchRs。DEN具有与多种nAchR结合的低亲和力[5]。长期暴露在NNK的A/J鼠引发肺癌[1]。NNK和NNN也可以通过上调细胞核增殖抗原和Bcl-2, 引起Het-1A口腔上皮恶性转移[1]。此外, 在BEP2D支气管上皮细胞中, NNK和NNN通过α7nAchR刺激不同的信号通路, 而NNK引起转录因子GATA-3、NF-kB和STAT-1的激活, NNN主要激活GATA-3和STAT-1。此外, 在SCLC中, NNK促进Ca2+流入, 释放血清素, 并通过PKC和MAP激酶通路激活细胞增殖[1]。
2.4 尼古丁诱导的血管生成
新血管生成是肿瘤生长和转移的关键步骤。已证明尼古丁诱导血管生成和动脉粥状硬化[1], 并在上皮细胞高氧症和缺血症中上调和活化α7nAchR。此外, 尼古丁受体在肿瘤血管生成、免疫系统和心血管系统网络中起基础作用。
总之, nAchR诱导的增殖信号通路的近期资料强调了受体在调节非神经细胞级联反应中的重要作用。
3 nAchR和生存途径
尼古丁可以抵抗由于外界因素诱发的细胞凋亡。尼古丁通过磷酸化Bcl-2导致磷酸酯酶C活化, 保护H82 SCLC细胞避免由于顺铂诱导的凋亡。NHBE细胞中含a3和a4亚基的nAchR通过Akt通路调节尼古丁的凋亡活性。此外, 数据显示尼古丁可以诱导Akt位点特异性磷酸化 (Thr308和Ser473) 。尼古丁也导致下游Akt分子的磷酸化, 如mTOR、FKHR等。参与尼古丁抗凋亡的其它信号通路包括:PKC、PKA和NFkβ的激活以及肿瘤抑制因子p53的下调。尼古丁诱导前凋亡蛋白Bad的多位点磷酸化, 导致Bad失活并阻止凋亡。尼古丁诱导的Bad磷酸化通过PKC、PKA、MEK和PI3K信号途径调节。凋亡抑制蛋白IAPs在尼古丁抗凋亡中的作用在NSCLC中已有研究。尼古丁在A549细胞中, 以α3 nAchR依赖方式可以调节XIAP和survivin的上调。关于乙酰胆碱受体何种亚基负责尼古丁的抗凋亡作用, 目前存在争论。一些实验室数据显示, 在尼古丁生存作用中存在二氢-β-刺桐敏感的α3或α4受体[6], 这表明尼古丁增殖作用和生存作用是受不同nAchR受体类型调控的。α7nAchR和β-肾上腺素受体在一些细胞系中调节尼古丁抗凋亡作用。这种差异部分可由nAchR亚单位抑制子的多效性解释。
nAchRs在支气管、血管和口腔上皮中的功能鉴定, 有可能表明nAchR受体调节烟草相关的细胞毒作用。一些有争论的研究猜测, 烟草在心血管和呼吸系统的细胞毒性可能是通过尼古丁结合靶细胞nAchRs触发的。α3β2 nAchR通过p21、Bcl-2、NF-kB和STAT1途径调节烟草毒性。相反, α7nAchR在口腔角质形成细胞通过MAP激酶和JAK/STAT途径的激活调节烟草的细胞毒作用。通过对人类口腔角质形成细胞基因表达谱、吸烟环境和纯尼古丁条件下基因表达情况的研究发现, 尼古丁和吸烟环境都依赖α7-nAchR使生存因子NF-Kb的转录活性增加7倍。
4 结束语和前景
吸烟是肿瘤和心血管疾病的关键因素之一, 尤其是吸烟与90%小细胞肺癌和60%非小细胞肺癌相关。尼古丁在非神经细胞上通过nAchRs促进肿瘤生长和生存。nAchRs的促存活和有丝分裂作用为这些现象提供了可能的分子机制。从新的生长因子信号和烟草的作用两个角度, 非神经细胞nAchR信号对细胞命运和存活具有重要意义。nAchR信号网络的研究将与暴露于尼古丁替代物 (如粘贴或口香糖) 的患者尤为相关。
今后的研究需要定义不同nAchR亚基在非神经细胞中的功能及其参与细胞增殖和抗凋亡的下游信号通路。nAchR为基础的药物治疗在脑瘤中和中枢神经系统中有潜在的副作用, 需要进一步准确评估。nAchR类似物的发展将有助于nAchR信号通路的研究, 有利于与烟草相关肿瘤的抗癌药物的设计。
摘要：吸烟是肿瘤和心血管疾病的关键因素之一, 尼古丁是烟草的主要有效成分, 已发现尼古丁在非神经细胞上通过nAchRs促进肿瘤生长和生存。nAchRs的促存活和有丝分裂作用为这些现象提供了可能的分子机制。nAchR类似物的发展将有助于nAchR信号通路的研究, 有利于与烟草相关肿瘤的抗癌药物的设计。
关键词：肿瘤,尼古丁乙酰胆碱受体,细胞增殖,细胞凋亡
参考文献
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细胞增殖的过程？ 篇4
细胞增殖是生物体的重要生命特点，细胞以分裂的方式进行增殖。单细胞生物，以细胞分裂的方式诞生新的个体。多细胞生物，以细胞分裂的方式诞生新的细胞，用来补充体内衰老和死亡的细胞;同时，多细胞生物可以由一个受精卵，经过细胞的分裂和分化，最终发育成一个新的多细胞个体。必须强调指出，通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，均匀地分配到两个子细胞中去。
意义：细胞以分裂的方式进行增殖，细胞增殖是生活细胞的重要生理功能之一，是生物体的重要生命特点。细胞的增殖是生物体生长、发育、繁育以及遗传的基础。
肿瘤细胞增殖 篇5
关键词：Hsp70,TLR信号途径,肿瘤细胞
Toll样受体家族(Toll-like recepters, TLRs)和果蝇Toll蛋白都具有同源性,表达在细胞膜上和免疫系统识别微生物相关[1]。在TLR3识别病毒感染的过程中所产生的双链RNA,从而诱导炎症反应、激活信号转导途径、促进抗原呈现细胞活化,导致天然免疫反应来对微生物感染进行抵抗[2]。Hsp70和肿瘤的发展、发生有着密切的联系。HSP是TLR信号转导途径当中的内源性配体,通过TLR介导的免疫应答来参与肿瘤、炎症、自身免疫疾病发病机制[3]。本文主要研究Hsp70在TLR信号途径中对肿瘤细胞增殖的影响。
1 资料与方法
1.1 一般资料
H22肝癌细胞株:购自北京伯乐生命科学发展有限公司;谷氨酰胺,HEPES,小牛血清,RPMI 1640培养基,购自Sigma公司;Hsp70为本实验室纯化获得;逆转录引物oligo(dT),TaqDNA聚合酶,逆转录酶抑制剂,dNTP,DNA分子量标准,M-MLV逆转录酶,TRizol试剂均购自上海研拓生物科技有限公司;30%丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺溶液,5mol/L Tris-HCl(PH=6.8和8.8),细胞裂解液。
1.2 方法
将体外培养的H22细胞分成两组:A组为对照组;B组加入终浓度为10μg/mL的Hsp70。两组细胞培养在37℃、5%CO2培养箱中。按实验要求,各组细胞的培养时间不同。分别收集处理8h的A组和B组的H22细胞,然后对两组细胞TLR2和TLR4的mRNA表达水平进行检测。分别收集处理24h H22细胞,对β-catenin水平进行检测。设计基因表达所用的引物:TLR2:上游引物:5'-GTCTTTCACCTCTATTCCCTC-3',下游引物:5'-GTCTCTACATTTCCTATCCTG-3',扩增片段长度为362bp;TLR4:上游引物:5'-GAAACTCAGCAAAGTCCCTG-3',下游引物:5'-GAAAGGCTTGGTCTTGAATG-3',扩增片段长度为524bp;β-actin:上游引物:5'-ATGGGTCAGAAGGACTCCTATG-3',下游引物:5'-ATCTCCTGCTCGA AGTCTAGAG-3',扩增片段长度为536bp。PCR 扩增体系:10×PCR buffer 6μL,MgCl2 4μL,dNTP(2.5 mmol/L) 3μL,5'端引物 2μL,3'端引物2μL,cDNA 3 μL,TdH2O 28μL,TaqDNA聚合酶1.5μL,总体积50μL。PCR的反应条件:预变性95℃ 5min循环30次95℃1min、52 ℃55sec、72℃50sec、延伸72℃5min。然后对扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定后回收,用于下一步试验。
2 结果
2.1 TLR2、TLR4mRNA的表达
Hsp70分别处理H22细胞8h后,RT-PCR检测H22细胞内的基因TLR2、TLR4 mRNA 的表达均明显上调(图1)。
2.2 β-catenin的表达
体外加入Hsp70培养H22细胞24h后, Western blot检 H2 细胞中β-catenin的表达,与对照组相比, Hsp70促进H22细胞中β-catenin上调表达(图2)。
2.3 H22细胞培养10天后计数
分别收集A 组和B 组的H22细胞,接入6孔板内,每组3孔,每孔细胞数为1.5×105。刺激3天后,换液,细胞计数,此后每隔 2 天以同样的细胞量(1.5×105)传代培养,连续培养12天。Hsp70 处理组的细胞增殖倍数高于对照组。结果显示:当细胞处于正常增殖状态时,Hsp70会促进H22细胞的增殖(图3)。
3 讨论
TLRs 在肿瘤免疫当中的作用越来越引起人们的兴趣,包括通过介导免疫佐剂作用来对机体免疫力进行增强,以及识别了肿瘤细胞所产生的“危险信号”起就针对肿瘤的免疫反应[4]。TLR主要是激活于2条信号通路:其中一条是通过了激活转录因子 NF-кB,调控编码免疫与炎症相关的蛋白基因的转录;另外一条是激活MAPK与JNK[5]。TLRs与配体结合之后产生了信号转导的级联反应,并激活转录因子 NF-кB、p38、C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase, JNK)和细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK),从而对免疫相关蛋白进行调控,这些有可能和肿瘤的形成与生长有关。肿瘤细胞是通过TLR信号通路的介导肿瘤自身所保护的机制,产生了免疫逃逸[6]。Hsp70信号能够通过TLR4传导,从而对核转录因子NF-κB进行激活,通过了基因转录所诱发出一系列病理生理的改变。肿瘤细胞在不断地增殖并需要大量的 HSP 成为“分子伴侣”来稳定与调节这一异常的增殖过程[7]。近些年来研究发现了 HSPs可以通过和 c-myc、c-fos与P53等抑癌基因或原癌基因以及它的产物相互作用参与细胞的最基本活动,调节了细胞增殖。Wnt信号通路将通过激活β-catenin入核和核内转录因子(TCF/LEF,又称为了T细胞因子淋巴增强因子)相结合,来对靶基因的表达水平进行调节,从而影响细胞的凋亡与增殖。β-catenin是Wnt信号传导通道的最关键环节,调控 cyclin-D1以及c-myc等原癌基因的表达。通过研究,本文发现,Hsp70会促进H22细胞内的基因TLR2、TLR4 mRNA的上调表达,同时也会促进H22细胞中β-catenin上调表达,通过细胞计数得知,Hsp70会促进H22细胞的增殖。
综上所述,Hsp70会促进TLR信号途径中某些基因的上调表达,在TLR信号途径中肿瘤细胞的增殖具有促进作用。
参考文献
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肿瘤细胞增殖 篇6
1材料与方法
1.1主要试剂
p-AMPK抗体和p-m TOR抗体购自Cell Sig- naling Technology公司,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ig G和羊抗鼠Ig G购自Snata Cruz公司,Cyto- Buster蛋白提取试剂购自Novagen公司,蛋白酶和磷酸酶抑制剂购自Thermo公司。
1.2婴幼儿血管瘤内皮细胞获取及鉴定
婴幼儿血管瘤内皮细胞获取及鉴定方法参见文献报道[1]。
1.3细胞处理
采用0、5、10、20和40μg/ml的肿瘤抑素及40μg/ml的肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞0、12、24和48 h。
1.4 MTT方法检测细胞增殖能力
上述肿瘤抑素处理的细胞培养至对数生长期, 接种于96孔培养板中,采用不同浓度和不同时间的肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞后,每孔中加入20μl的MTT溶液,作用4 h后吸出上清,加入150μl的二甲基亚砜(DMSO) 溶液,低速震荡10 min后,波长490 nm处测定OD值。
1.5凋亡检测
收集上述肿瘤抑素处理细胞离心,1 000×g离心5 min,以含1% BSA的磷酸缓冲液(PBS)洗涤1次。用100μl Binding缓冲液将细胞重悬,加入2μl Annexin V染料和0.1μl PI染料,避光15 min,以含1% BSA的PBS洗涤2次。
1.6细胞总蛋白提取
上述细胞采用冰PBS洗涤2次,400×g离心,5min;弃去细胞上清,于沉淀中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂和Cyto Buster蛋白提取试剂,吹打混匀,室温放置15 min;4℃,12 000×g离心15 min;所得上清部分即细胞总蛋白,留部分细胞总蛋白检测蛋白浓度,其余每管15μl分装,-80℃冻存。
1.7 BCA法测定蛋白浓度
严格按BCA试剂盒说明书进行标准品BSA的稀释;按体积比为50∶1混合试剂盒中的试剂A和试剂B,即为工作液;96孔板中每孔加入200μL的工作液,随后加入25μl倍比稀释的标准品或待测样品,每种样品设置3个复孔。37℃孵育30 min后波长562 nm处测定OD值;根据标准品的光密度值和浓度梯度绘制出标准曲线,根据标准曲线及待测样品的OD值推算出样品浓度。
1.8 Western blot
等量的提取上述蛋白经8%~10% SDS-PAGE分离胶和5%浓缩胶分离后,半干转印至硝酸纤维素膜上,采用含5% BSA的TBST室温孵育封闭2 h, 加入鼠抗人p-AMPK抗体或p-m TOR抗体,4℃过夜孵育。次日以0.1%TBST洗膜3次,每次5 min,加入相应种属的HRP标记二抗,室温孵育1 h。0.1% TBST洗膜后, 采用Supersignal West Femto/Pico HRP敏感化学发光底物对条带进行显色。Actin作为内参对照。所有实验至少重复3次。使用Image J软件进行定量分析。
1.9统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。两组数据间比较采用t检验,P <0.05表示差异具有统计学意义。
2结果
2.1肿瘤抑素对婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖的影响
如图1所示,随着肿瘤抑素浓度的升高和处理时间的延长,婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖能力逐渐降低(P <0.01)。
2.2肿瘤抑素对婴幼儿血管瘤内皮细胞凋亡的影响
如图2所示,随着肿瘤抑素浓度的升高和处理时间的延长,婴幼儿血管瘤内皮细胞凋亡水平逐渐升高(P <0.01)。
†与0μg/ml组比较差异有统计学意义;A:不同浓度肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞后,采用MTT方法检测婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖能力;B:40μg/ml肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞不同时间,采用MTT方法检测婴幼儿血管瘤内皮细胞增殖能力
†与0μg/ml组比较差异有统计学意义;A:不同浓度肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞后,采用FCM方法检测婴幼儿血管瘤内皮细胞凋亡水平;B:40μg/ml肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞不同时间,采用FCM方法检测婴幼儿血管瘤内皮细胞凋亡水平
A：不同浓度肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞后，采用 Western blot 方法检测婴幼儿血管瘤内皮细胞中 AMPK 蛋白磷酸化水平；B：40μg/ml 肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞不同时间，采用 Western blot 方法检测婴幼儿血管瘤内皮细胞中 AMPK 蛋白磷酸化水平
2.3肿瘤抑素对婴幼儿血管瘤内皮细胞中AMPK蛋白磷酸化水平的影响
如图3所示,随着肿瘤抑素浓度的升高和处理时间的延长,婴幼儿血管瘤内皮细胞中AMPK蛋白磷酸化水平逐渐升高。
2.4肿瘤抑素对婴幼儿血管瘤内皮细胞中m TOR蛋白磷酸化水平的影响
如图4所示,随着肿瘤抑素浓度的升高和处理时间的延长,婴幼儿血管瘤内皮细胞中m TOR蛋白磷酸化水平逐渐降低。
A:不同浓度肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞后,采用Western blot方法检测婴幼儿血管瘤内皮细胞中m TOR蛋白磷酸化水平;B:40μg/ml肿瘤抑素处理婴幼儿血管瘤内皮细胞不同时间,采用Western blot方法检测婴幼儿血管瘤内皮细胞中m TOR蛋白磷酸化水平
3讨论
肿瘤细胞增殖 篇7
1 材料与方法
1.1 检测对象
66例卵巢上皮性肿瘤患者来自肿瘤医院病理科的库存石蜡包埋的组织块。最大年龄84岁, 最小年龄20岁, 平均年龄42.95岁。66例卵巢上皮性肿瘤中, 卵巢浆液性癌42例, 卵巢黏液性癌24例。
1.2 主要试剂
常规石蜡包埋组织块, 制备5μm厚连续切片5张, 1张用做HE染色, 其它4张的载玻片涂APE的防脱剂或赖氨酸的防脱剂, 用作免疫组织化学染色备用。
1.3 主要方法
常规HE染色, ERα、ERβ和PCNA免疫组织化学检测。
1.4 结果判定
ERα、ERβ在细胞浆中表达, PCNA在胞核表达, 所有的表达呈现棕黄色颗粒。每张切片随机观察, 根据阳性细胞占同类细胞总数的百分率及细胞染色强度综合判定[3]。采取半定量分析, 阳性表达的程度是指在细胞内表达的数量和强度之和。所有两种肿瘤组织中无表达者或<5%者为“-”;5%~30%为“+”;30%~50%为“++”;>50%为“+++”。根据Axiotis的病理评分标准, 0~1分为“-”, 阴性;2分为“+”, 阳性;3~4分为“++”, 中度阳性;5~6分为“+++”, 强阳性。
1.5 统计学方法
全部统计分析均采用SPSS 14.0统计软件包进行。采用χ2检验及Fisher精确检验。以P<0.05有显著性差异。
2 结果
2.1 卵巢上皮癌的病理所见
66例卵巢上皮性肿瘤的组织学分类:浆液性卵巢腺癌42例, 黏液性卵巢腺癌24例。浆液性的卵巢腺癌组织类型最多 (63.64%) 。浆液性的卵巢腺癌, 癌细胞的层次增多, 异型性明显, 上皮呈乳头状。黏液性卵巢腺癌, 癌细胞呈高柱状, 多层排列, 腔内富含黏液。
2.2 ERα、ERβ在卵巢上皮癌组织中的表达
ERα、ERβ主要在细胞的胞浆中表达。66例卵巢上皮性肿瘤的ERα的检测结果, 48例阳性表达 (48/66, 72.7%) 。在浆液性卵巢上皮癌的表达高于和黏液性卵巢上皮癌中的表达, 但无明显差异。66例卵巢上皮性肿瘤的ERβ的检测结果是, 28例阳性表达 (28/66, 42.4%) 。在浆液性卵巢上皮癌和黏液性卵巢上皮癌中的表达均低于ERα, 无明显差异。
2.3 Erα、Erβ、PCNA在卵巢上皮癌和子宫内膜癌组织的表达及相关性
ERα在卵巢上皮癌中的表达均较高, 为72.7%, 而ERβ在卵巢上皮癌中的表达均相对很低, 为42.4%。经χ2检验分析, ERα和ERβ在卵巢上皮癌组织中的表达之间有差异 (χ2=4.9675, P<0.05) , PCNA在卵巢上皮癌组织中的表达均非常高, 为87.9%。ERα和PCNA两者在卵巢上皮癌组织中的表达有显著差异 (χ2=12.13793, P<0.01) 。而ERβ和PCNA两者在卵巢上皮癌组织中的表达均无差异 (χ2=3.3539, P>0.05) 。结果提示, ERα的高表达可促进肿瘤组织的增值。ERα、ERβ、PCNA三种蛋白在卵巢上皮癌中表达及相关性, 详见表1。
ERα在卵巢上皮癌呈高表达 (72.7%) 。ERβ在卵巢上皮癌组织中高表达 (42.4%) , 但表达率低于ERα、ERα和ERβ之间具有统计学意义 (P<0.05和P<0.01) 。PCNA在卵巢上皮癌组织呈高表达 (92.0%) 。PCNA的表达与ERα在卵巢上皮癌组织中的表达均有显著差异 (P<0.01) , 而与ERβ在卵巢上皮癌组织中的表达无统计学差异 (P>0.05) 。
3 小结
ERα在卵巢上皮癌的表达增高, 可促进肿瘤的发生发展[4]。PCNA的高表达预示肿瘤细胞的增殖活跃。PCNA和ERα二个指标可成为反映卵巢上皮癌增殖的指标。
摘要：目的 就ERα、ERβ、PCNA在卵巢上皮癌组织中的表达与肿瘤细胞增殖的关系进行探讨分析。方法 66例卵巢上皮癌石蜡包埋组织块, 采用免疫组织化学的sABC法。ERα和ERβ兔抗人多克隆抗体、PCNA鼠抗人单克隆抗体、sABC试剂盒, 分别来自不同的试剂公司。结果 ①ERα在卵巢上皮癌组织中呈高表达 (72.7%) 。ERβ在卵巢上皮癌组织中有表达 (42.4%) , 但表达率低于ERα、ERα和ERβ之间具有统计学意义 (P<0.05) 。②PCNA在卵巢上皮癌组织中均呈高表达 (87.9%) 。PCNA的表达与ERα在卵巢上皮癌组织中的表达均有显著差异 (P<0.01) , 而与ERβ在卵巢上皮癌组织中的表达无统计学差异 (P>0.05) 。结论 ERα在卵巢上皮癌的表达增高, 可促进肿瘤的发生发展。PCNA的高表达预示肿瘤细胞的增殖活跃。PCNA和ERα二指标可成为反映卵巢上皮癌增殖的指标。为了探讨ERα、ERβ、PCNA在卵巢上皮癌组织中的表达与肿瘤胞增殖的关系。
关键词：ERα,ERβ,PCNA,卵巢上皮癌组织,肿瘤细胞增殖
参考文献
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肿瘤细胞增殖 篇8
1 材料与方法
1.1 细胞、菌株及载体
细胞株与质粒 MEPE cDNA质粒由美国EMORY大学王亚教授馈赠。293T细胞株购自上海中国科学院细胞研究所。质粒 pLEGFP-N1为BD Biosciences Clontech公司产品,大肠杆菌E.coli DH5α由本室保存。
1.2 主要试剂
PCR产物纯化采用BIO101公司提供的Geneclean II 试剂盒(Cat# 1001-400);质粒提取采用Qiagen公司QIAprep质粒提取试剂盒;限制性内切酶及T4 DNA连接酶购自Takara生物公司。
1.3 PCR扩增、表达质粒的构建及序列测定
由质粒上扩增出MEPE cDNA全长,所用扩增引物为:上游引物:5′-CATATGAAGC TGAATGAAGAT-3′,下游引物:3′-GGATCCTTA CATTTGGGGGAGATG-3′,PCR扩增的目的基因经Nde I与BamH I双酶切后,克隆到经过同样酶切处理的pLEGFP-N1载体上,得到融合表达质粒,转化感受态大肠杆菌DH5α挑取单克隆进行PCR筛选,选1～2个阳性克隆进行测序,鉴定序列及读码框架是否正确。
1.4 稳定转染细胞株构建
在细胞生长状态良好,融合率达90%～95%时进行转染。按照Lipofectamin2000操作手册转染六孔板内细胞。转染48h后消化、重悬细胞,10倍稀释后铺96孔板,每孔分别加入800μg/mL G418完全培养基进行克隆筛选,4周后选择阳性细胞克隆进行鉴定、扩增培养冻存。
1.5 MTT检测增殖能力
将生长密度达80%的293T细胞,常规胰酶消化、计数,以5×103密度的细胞200μL接种于96孔板。目的基因组、空载体组,每组3个复孔。置于37℃、5% CO2培养箱中培养。细胞培养1、3、5及7d后,每孔吸出100μL培养基后每孔再加入10μL MTT(5mg/mL),培养箱中继续孵育。4h后,吸去孔内液体,每孔加入200μL二甲基亚砜溶解沉淀。选择490nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值并记录结果。
1.6 RT-PCR检测
按照北京华大蛋白质研发中心有限公司总RNA提取试剂的说明书,用Trizol提取细胞总RNA。所用的实验器具使用前均需用DEPC水浸泡过夜,去除RNA酶。RT-PCR检测转染细胞中p53基因的表达。p53引物上游:TCAACAAGATGTTTTGCCAACTG,下游:ATGTGCTGTGACTGC-TTGTAGATG。
2 结果
2.1 稳定转染细胞株检测结果
提取稳定转染细胞株总RNA,进行RT-PCR,电泳结果显示两组细胞87bp左右均可见GAPDH扩增条带出现;转染目的基因细胞在110bp处见扩增条带;空载体组在110bp处无扩增条带出现,证明转染成功,细胞可用于后续试验。见图1。
1:DL500DNAmarker;2-3:转染目的基因及空载体细胞中GAPDH表达;4:转染MEPE质粒细胞中MEPE表达;5:转染EGFP细胞中MEPE表达。
2.2 MTT检测细胞增殖结果
MEPE转染细胞和EGFP空载体转染组细胞铺96孔板,并分别于1d、3d、5d、7d用MTT法测细胞增殖。从统计结果可知转染MEPE的293T细胞其增殖指数是转染EGFP空载体组细胞增殖指数的1.30倍。见表1,图2。
2.3 RT-PCR检测增殖与迁移相关因子表达情况
p53基因高表达细胞可表现出黏附、增殖、迁移侵袭等方面的生物学行为,实验通过实时荧光定量PCR,检测转染MEPE蛋白与转染空载体细胞中三种基因的表达,从PCR产物电泳图及实时荧光扩增曲线两方面比较三种基因在两种细胞中的不同表达。
1.DL500DNAmarker;2.转染MEPE细胞中p53表达;3.转染空载体细胞中p53表达;4.DL500DNAmarker;5.转染MEPE细胞中GAPDH表达;6.转染空载体细胞中GAPDH表达。
3 讨论
MEPE是小型N端连接整合素家族蛋白成员,近几年来,越来越多的报道显示SIBLING家族成员与肿瘤发展的各个阶段包括增殖、侵袭、转移、血管生成相关。Lee JL等[4]人发现骨桥蛋白(OPN)与细胞表面受体蛋白CD44相结合,可以使结肠癌HT29细胞加速增殖并提高转移潜能。Sharp JA等[5]人发现骨唾液蛋白(BSP)可以在体外促进乳腺癌MDA-MB231细胞增殖,转染IBSP基因的乳腺癌细胞注射裸鼠后肿瘤形成速度加快。Khodavirdi AC等[6]人在两株前列腺癌细胞中提高OPN蛋白的表达水平,发现OPN有增加细胞侵袭的能力,在小鼠成瘤模型中观察到高表达OPN的前列腺癌细胞侵入血管的能力增强。对大量的实验结果分析,我们可以发现SIBLING蛋白家族成员在许多肿瘤细胞中高表达,作为可溶性分泌性蛋白因子主要分布在细胞基质中,通过与细胞表面受体蛋白CD44、整合素受体、金属蛋白酶相互作用参与调节细胞信号传导,在肿瘤细胞的黏附性、趋化性、抗凋亡、侵袭、迁移、不依赖支持物生长等恶性生物学特性中具有重要作用,并与肿瘤转移以及预后不良相关。
在SBLING家族中对于MEPE在肿瘤发生发展中所起到的作用研究较少,与其他家族成员在结构上高度同源的MEPE是否也对肿瘤细胞的增殖侵袭有影响,需要进一步实验验证。近年来研究表明,许多肿瘤在发展过程中伴有MEPE蛋白的高表达,而且发现这些高表达MEPE蛋白的肿瘤同时也表现出高的转移倾向,且其抗电离辐射等抵抗DNA损伤诱导能力与MEPE蛋白的表达量呈正相关。本实验结果证明提高MEPE蛋白表达水平可影响细胞增殖等生物学特性,并进一步证实其作用机制是通过P53蛋白信号通路实现的。因此临床检测MEPE表达可对恶性肿瘤的发生、转移做出预测,为恶性肿瘤基因治疗奠定基础。而且检测MEPE的表达水平还可监测肿瘤治疗的预后,为肿瘤基因基因治疗提供新的靶点。虽然目前基因治疗尚未临床普及,但其具有良好的潜在应用前景,在人类攻克癌症,提高肿瘤患者生存率及生活质量上有望发挥重要作用。
参考文献
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肿瘤细胞增殖 篇9
氯化锂对人体具有广泛的生理活性, 其活性涉及神经、免疫、内分泌、血液等组织系统。另有研究表明氯化锂是糖原合成酶激酶3β (glycogensynthase kinase 3β, GSK 3β) 的高度选择性抑制剂[1], 糖原合成酶激酶3β是一种丝/苏氨酸蛋白激酶, 参与许多细胞生命的过程。新近研究显示, 氯化锂可通过抑制GSK 3β从而减少化疗药物所致的细胞凋亡, 即氯化锂可能促进肿瘤细胞的生长[2], 但亦有与此相反的结论, 氯化锂能抑制肿瘤细胞增殖并导致周期阻滞[3]。但关于LiCl对人类胃癌细胞系MGC 803有何作用尚未见文献报道。本文在体外研究LiCl对MGC 803胃癌细胞增殖和细胞周期的影响, 以观察一定浓度的LiCl对MGC 803细胞增殖和周期的作用。
1材料和方法
1.1实验细胞
MGC 803细胞为人胃低分化粘液癌, 由内蒙古医学院分子生物学研究中心提供。
1.2试剂
RPMI—1640培养基 (CIBCO, USA) 4℃保存。小牛血清 (FBS) 灭活后分装, -20℃冻存。LiCl, 用1640配成1.0mol/L贮存液, 4℃保存。PI (碘化丙啶) MTT (美国SigmaCo.) 用PBS配成5mg/mL浓度。
1.3方法
1.3.1细胞培养
MGC 803细胞培养于含10%新生小牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI—1640培养液中, 置于37℃, 湿化的5%CO2孵箱中培养。每 (1～2) d更换培养液, 每周按1∶3比例传代 (用0.25%的胰蛋白酶) 1次。待培养的MGC 803细胞生长至70%～90%汇合状态时进行无血清化及加药 (LiCl) 处理, 每次实验均采用同一代细胞, 并用不同批次的细胞重复实验。
1.3.2 MTT比色法检测细胞增殖
以约5×103个/孔密度将等量细胞接种于96孔板上培养24h后, 处理组分别加入含不同浓度LiCl (10、20、40mmol/L) 的新鲜无血清培养液, 未处理组加入等量RPMI 1640培养基, 每个浓度平行接种3孔, 再培养24h后每孔加入5mg/mLMTT 20μL及PBS100μL, 37℃, 5%CO2, 饱和湿度培养4h后去除上清, 加入100μLDMSO, 充分振荡溶解甲瓒颗粒后用酶标仪 (波长570nm) 测定各孔的OD值, 实验重复3次。
1.3.3流式细胞术检测细胞周期
以10、20、40mmol/LLiCl作用MGC 803细胞24h后, 将MGC 803细胞分别进行消化, 制成细胞悬液, 计数达到 (1～5) ×106个/mL, 离心 (1 000r/min, 5min) 弃去培养液;PBS洗1次;离心 (1 000r/min, 5min) 弃去PBS, 加入-20℃预冷的70%乙醇, 置于-20℃固定过夜。上机前离心 (1 000r/min, 5min) 弃去固定液, PBS重悬5min×2次, 离心 (1 000r/min, 5min) 后弃去PBS;采用PI染色液, 室温避光染色5min后上样, 每个样本获得2.0×104个细胞, FACSCalibur型流式细胞仪检测MGC 803细胞在细胞周期各时相所占的百分比。每组实验重复3次。
1.4统计学分析
实验数据以表示, 采用SPSS 12.0统计分析软件进行单因素方差分析 (OnewayANOVA) 。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 LiCl对MGC 803细胞MTT值的影响
MGC 803细胞与不同浓度的LiCl培养24h后, 结果显示处理组的MTT值显著低于未处理组, 并呈剂量依赖关系 (图1) 。
2.2 LiCl导致MGC 803细胞周期阻滞于G2/M期
流式细胞术分析细胞周期变化结果显示, 不同浓度的LiCl处理MGC803后, S期细胞减少, G2/M期细胞增多, 与对照组比较差异有显著性 (P<0.05) (图2) 。
3 讨论
早期, LiCl被用于治疗狂燥型的精神病, 在治疗的过程中人们对LiCl治疗疾病的作用机制进行了大量研究, 认为主要与以下几个机制有关:①锂阻断磷脂酰肌醇循环[4], 用以治疗精神系统疾病;②锂直接抑制糖原合成酶-3β (GSK3β) 而活化Wnt信号途径[5];③抑郁性神经症和躁狂症的患者血中5-羟色胺 (5-HT) 降低, 锂能降低去甲肾上腺素的活性, 增加5-羟色胺的释放[6], 起到治疗作用;④锂提高谷氨酸转运体的功能[7]等。有研究者证实在肝癌细胞[8]、原代培养的牛主动脉内皮细胞[9]中, LiCl能使细胞阻滞于G2/M期进而抑制细胞生长, 此作用在一定范围内呈剂量效应关系。然而, LiCl对细胞生长和细胞周期进展的影响可能随细胞类型的不同而不同。但未见LiCl对人类胃癌细胞系MGC803细胞作用的报道。
本实验用不同浓度的LiCl刺激MGC803细胞株, 24 h后进行细胞增殖活性及细胞周期分析。发现LiCl能明显抑制MGC803细胞的增殖, 并呈剂量依赖关系, 使得细胞发生G2/M期阻滞。这种细胞增殖抑制作用可能与糖原合成酶激酶3β有关[10]。GSK3β是一种多功能的丝/苏氨酸磷酸激酶, 能磷酸化抑制或降解许多底物, 包括与调节细胞增殖有关的Cyclin D1蛋白及转录因子β-catenin等[11]。抑制GSK3β的功能将促进这些转录因子的活化, 从而促进相应基因的转录。作为GSK3β的特异性抑制剂, LiCl被广泛用于研究GSK3β的功能。本实验表明, LiCl减慢MGC803细胞增殖, 导致G2/M期阻滞, 提示在胃癌细胞中抑制GSK3β的功能具有抗肿瘤的作用, 但有关的信号通路不明, 其意义和分子机制有待进一步研究。
摘要：研究氯化锂 (LiCl) 在体外对MGC803胃癌细胞增殖及周期的影响, 以不同浓度的LiCl作用MGC803细胞24h后, 采用四甲基偶氮唑盐 (MTT) 比色法检测各组细胞的增殖活性, 利用流式细胞术进行细胞周期分析。结果:①不同浓度的LiCl (10、20、40mmol/L) 均对MGC803细胞具有抑制增殖的作用, 这种增殖抑制作用呈剂量依赖关系。②随着LiCl浓度的升高, 发生G2/M期阻滞, 与正常对照组相比, 差异具统计学意义。说明LiCl能抑制MGC803胃癌细胞增殖和导致G2/M期阻滞。
关键词：氯化锂,MGC803细胞系,细胞增殖,细胞周期
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