循环内皮细胞

循环内皮细胞（精选7篇）

循环内皮细胞 篇1

妊娠期高血压疾病子痫前期 (preeclampsia, PE) 是严重威胁孕产妇和围生儿生命的妊娠期特有疾病。有报道表明, 血管内皮细胞损伤及功能障碍在PE的发病机制有重要作用[1]。研究显示, 脂质过氧化和动脉粥样硬化与血管内皮细胞损伤的发生发展具有密切的关系[2]。PE患者螺旋小动脉常出现一种特征性的粥样硬化性改变, 提示此类患者可能存在氧化应激以及脂质过氧化加强。循环内皮细胞 (circulating endothelial cells, CEC) 是在生理或病理情况下从外周血中获得的血管内皮细胞, 其数量的变化能反映体内血管内皮细胞损伤程度。本研究通过检测妊娠晚期PE患者血清中CEC数量和血脂谱的变化, 旨在探讨PE患者血清CEC和脂蛋白的相关性, 进而为PE的病因、发病机理及预防提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

所有病例均为2006年12月-2008年10月我院妇产科住院分娩的孕妇, 孕周均达到36周, 且新生儿均为活产儿。选择PE患者60例作为试验组, 诊断标准参照文献[3]。其中轻度PE患者35例, 重度PE患者25例。年龄21～35 (27.8±3.3) 岁;孕周平均 (37.7±1.2) 周, 新生儿体质量 (2976.00±347.05) g。另取健康孕晚期妇女40例作为对照组, 年龄22～37 (27.3±2.7) 岁;孕周平均 (38.3±1.3) 周, 新生儿体质量 (3156.82±268.72) g。2组在年龄、孕周及新生儿体质量等方面差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。

1.2 研究方法

2组孕妇未行治疗前均空腹抽取肘静脉血3ml置于试管内, 静置0.5h后, 在4℃以3000r/min离心5min后取血清, 置于-70℃冰箱内保存, 待成批采用流式细胞仪检测血清中CEC个数: (1) Percoll密度梯度离心:1.060g/ml和1.045g/ml到2种密度的Percoll分层液各3ml轻铺于离心管内。生理盐水将抗凝血稀释1倍, 轻铺于分层液表面, 水平离心机离心, 1800r/min, 共20min。吸出悬于2层分层液面之间白膜状的细胞层, 生理盐水清洗离心2次, 1500r/min, 共10min。 (2) 抗体标记:100μl磷酸缓冲液重悬收获的目的细胞, 加20μl FITC小鼠抗人CD31单克隆抗体, 避光室温孵育30min。清洗离心1次, 1000r/min, 共4min。300μl磷酸缓冲液重悬, 4℃保存, 2h内上机。FITC小鼠IgG1作为阴性对照。 (3) 流式细胞仪检测:循环内皮细胞绝对值=CD31阳性细胞百分比×10 000/3×103 (单位:个/L) 。应用全自动生化分析仪进行生化指标的测定。

1.3 统计学方法

采用SPSS 11.5统计软件进行数据分析。计量资料以$\overline{x}\pm s$表示, 多组间比较采用q检验, 变量间的相关性采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CEC数量

试验组孕妇血中CEC个数为 (9.63～28.26) ×105个/L, 平均 (17.64±5.16) ×105个/L, 其中重度PE亚组为 (10.56～28.34) ×105个/L, 平均 (19.51±5.71) ×105个/L;轻度PE亚组 (9.63～18.26) ×105个/L, 平均 (15.77±3.89) ×105个/L;对照组CEC数量为 (7.74～19.64) ×105个/L, 平均 (12.91±4.21) ×105个/L。试验组与对照组相比, 血中CEC个数显著增高 (P<0.01) ;其中重度PE亚组较轻度PE亚组CEC个数明显升高 (P<0.05) 。

2.2 脂蛋白水平

试验组血清三酰甘油 (TG) 及重度PE亚组低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 均高于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) 低于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 且重度PE亚组TG水平高于轻度PE亚组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表2。

注:与对照组比较, *P<0.05;与轻度PE亚组比较, ﹟P<0.05

3 讨 论

血管内皮是一个复杂的、具有多种重要功能的“器官”, 有合成调节血管活性物质、抑制血小板聚集、对进出血管壁物质的机械屏障作用等。1976年, Ross与Glomset就提出了内皮细胞损伤学说, 认为高血压及血流的长期冲击等可促使内皮损伤, 形成动脉硬化病灶, 引起内皮细胞功能障碍。CEC是目前在活体内惟一可以特异而直接反映血管内皮细胞损伤的标志, 其数量的变化能反映体内内皮细胞损伤的程度[4,5], 且主要反应血管内皮细胞的脱落性损伤。Solovey等[6]研究血管内皮细胞受损脱落机制发现, 正常人外周血中, 64%的CEC表现出凋亡的特性, 而在镰状红细胞贫血患者CEC中凋亡细胞的百分比却明显下降, 仅占30%, 并认为在疾病状态下凋亡不是CEC形成的机制。这进一步表明内皮细胞损伤才是CEC形成的主要来源。本研究结果显示, PE患者CEC水平明显高于正常妊娠妇女, 其中重度PE患者CEC水平明显高于轻度PE患者, 轻度PE患者高于正常妊娠妇女, 这表明血管内皮细胞损伤的程度随病情加重而逐渐加重, 进一步证实了在PE病理生理机制中血管内皮细胞损伤的重要作用。故CEC数量的变化可作为PE临床危险性的预测指标。

正常妊娠时氧化和抗氧化作用保持相对平衡, 不会产生氧化应激, 而PE患者中这种平衡被打破, 常存在氧化应激反应过程。已有文献报道脂代谢异常与PE有密切关系。在患者发生临床症状前10～20周已出现脂代谢紊乱, 如过氧化的底物增加, TG和游离脂肪酸水平增高, 还可伴有LDL-C颗粒的增多[7]。体外试验也表明, 含高TG血浆会造成内皮细胞前列环素合成下降, 使血栓素A2与前列环素失衡导致血管收缩。另外, TG会抑制血管内皮细胞衍生的舒张因子, 抑制平滑肌舒张, 促进血小板聚集, 导致内皮损伤。由于PE患者血浆TG和游离脂肪酸水平明显升高, 过氧化底物增加, 还伴有极低密度脂蛋白 (sLDL) 的增加。而目前认为sLDL具有很强的致动脉粥样硬化作用。本研究中, PE患者中TG水平明显高于对照组 (P<0.05) , HDL-C水平明显低于对照组 (P<0.05) 。相关性分析进一步表明, PE患者体内血清CEC水平与HDL-C之间具有显著相关性。高水平的TG和LDL-C对血管起破坏作用, 而高水平的HDL-C则是血管损伤的保护性因素。

综上所述, PE患者血脂值结合CEC数量可作为预测PE病情严重程度的参考指标。提醒医务人员在救治PE患者的过程中, 要兼顾血脂代谢的变化以及内皮细胞功能的保护, 可能会收到更为理想的治疗效果。

摘要：目的 探讨血清中循环内皮细胞 (CEC) 个数和血脂水平变化与子痫前期 (PE) 发病及病情轻重程度的相关性。方法 选取60例PE患者作为试验组, 健康孕晚期妇女40例作为对照组。分别检测2组受试者血清CEC个数和血脂变化情况。结果 试验组血中CEC个数为 (17.64±5.16) ×105个/L显著高于对照组的 (12.91±4.21) ×105个/L, 差异有统计学意义 (P<0.01) ;其中重度PE亚组血中CEC个数[ (19.51±5.71) ×105个/L]和轻度PE亚组CEC个数 (15.77±3.89) ×105个/L均高于对照组 (P<0.05) , 且重度PE亚组亦高于轻度PE亚组 (P<0.05) 。试验组血清三酰甘油 (TG) 及重度PE亚组低密度脂蛋白胆固醇 (LDL-C) 均高于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;试验组高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) 低于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。且重度PE亚组TG水平高于轻度PE亚组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论 CEC数量、脂蛋白与PE发病及病情轻重程度有关。PE患者血脂值结合CEC数量可作为预测PE病情严重程度的参考指标。

关键词：子痫前期,循环内皮细胞,脂蛋白

参考文献

[1]许瑞环, 郑锐青, 尹学年, 等.妊娠高血压综合征患者血清对内皮细胞表达CD226的影响[J].细胞与分子免疫血杂志, 2004, 20 (4) :470-472.

[2]Wakatsuki A, Ikenoue N, Okatani Y, et al.Lipoprotein particles in pre-eclampsia susceptibility to oxidative modification[J].Obstet Gynecol, 2000, 96 (1) :55-59.

[3]乐杰.妇产科学[J].6版.北京:人民卫生出版社, 2004:99.

[4]Laskowska M, Vinson GP, Szumilo J, et al.Comparative analysis of the angiotensin-Ⅱrecepter in placental vascular endothelial cells in pre-eclamptic and normotensive patients[J].Gynecol Obstet Invest, 2003, 56 (1) :55-60.

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[6]Solovey A, Gui L, Ramakrishnan S, et al.Sickle cell anemia as a possible state of enhanced anti-apoptotic tone:survival effect of vascular endothe-lial growth factor on circulating and unanchored endothelial cells[J].Blood, 1999, 93 (11) :3824-3830.

[7]Belo L, Caslake M, Gaffney D, et al.Changes in LDL size and HDL con-centration in normal and preeclamptic pregnancies[J].Atheroscler, 2002, 162 (2) :425-432.

循环内皮细胞 篇2

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2010年10月～2011年8月于我院产科住院的妊娠高血压综合征患者12例作为研究对象(妊娠高血压综合征组),其中,年龄(28.5±3.7)岁;孕龄(35.2±4.1)周。所有病例的入选标准均符合乐杰主编的《妇产科学》(第6版)中妊娠期高血压疾病的诊断标准,并且除外多胎妊娠、妊娠心脏病、妊娠糖尿病和妊娠期哮喘。同时选取12例正常妊娠的同期入院患者作为对照组,年龄(27.9±4.2)岁;孕龄(35.8±3.7)周。经统计学分析显示,两组在年龄、孕龄上差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2 主要试剂

内皮细胞培养基-2(EGM-2,瑞士Lonza公司);DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-acLDL,美国Molecular Probes公司);FITC标记的血凝素(FITC-lectin,美国Sigma公司);纤维连结蛋白(fibronectin,美国Hematological Technologies公司);噻唑蓝(MTT,美国Duchfo公司);淋巴细胞分离液(天津TBD公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 循环内皮祖细胞体外培养

所有患者清晨空腹经肘静脉采集外周血20 mL,经过密度梯度离心收集外周血单个核细胞。用磷酸盐缓冲液(PBS)反复洗涤离心后,加入EGM-2培养基重新悬浮细胞并将其细胞密度调整至1×107/mL,将该细胞悬液接种至纤连蛋白包被的24孔板中,于37℃、5%CO2浓度的培养箱内进行细胞培养。培养至第3天用预热至37℃的PBS将未贴壁的细胞完全冲洗去除,更换新的培养液后对贴壁的细胞进行继续培养,以后采取隔日半量换液。

1.3.2 免疫荧光鉴定

在细胞培养至第7天时,培养基中加入DiI-acLDL使其终浓度为5 mg/L,于培养箱中继续培养4 h,经2%多聚甲醛固定、PBS洗涤后,在24孔板中于每孔加入含有5 mg/L FITC-lectin的PBS 0.2 mL,将其置于37℃温箱中孵育1 h,经PBS反复冲洗后于荧光显微镜下进行观察。显示红色荧光者为DiI-acLDL阳性细胞,显示绿色荧光者为FITC-lectin阳性细胞,经过Image J图像处理软件进行图像叠加呈现为黄色荧光的细胞(即双荧光阳性的细胞)被认为是内皮祖细胞。

1.3.3 细胞增殖能力检测

在细胞培养至第7天时,常规应用0.25%胰蛋白酶对细胞进行消化,并将其制备成密度为1×105/mL的单细胞悬液,于96孔板的每孔中加入0.2 m L细胞悬液,在37℃、5%CO2浓度的培养箱中培养96 h,在培养时间结束的前4 h于每孔中加入20μL MTT(5 mg/mL)。培养结束后,将培养基吸弃并加入100μL DMSO,经振荡后用酶标仪检测其570 nm处的吸光度(A值)。

1.3.4 黏附能力检测

在细胞培养至第7天时,常规应用0.25%胰蛋白酶对细胞进行消化,并将其制备成密度为5×104/mL的单细胞悬液,取1 mL加入纤维连结蛋白包被过的24孔板中,在37℃、5%CO2浓度的培养箱中培养30 min,经过PBS轻轻冲洗3遍后,利用相差显微镜(×200)对贴壁细胞进行计数。

1.3.5 细胞迁移能力检测

在24孔插入式培养皿的外孔中加入0.6 mL EGM-2培养基,在细胞培养至第7天时,常规应用0.25%胰蛋白酶对细胞进行消化,并用不含细胞因子、血清浓度仅为0.1%EGM-2培养基将其制备成密度为5×104/mL的单细胞悬液,取0.2 mL细胞悬液加于皿内。在37℃、5%CO2浓度的培养箱中培养24 h,取出培养皿,将皿内层的细胞去除后,对皿外层的细胞进行固定并行结晶紫染色,利用相差显微镜(×200)对细胞进行计数。

1.4 统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件包进行统计学分析。正态分布的计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,比较采用t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 内皮祖细胞培养及鉴定

外周血单个核细胞在体外培养至第7天时,可以见到典型的内皮祖细胞生成,经过免疫荧光染色后,通过荧光显微镜检测显示,细胞摄取DiI-acLDL后呈现为红色荧光,结合FITC-lectin后呈现为绿色荧光。通过Image J图像处理软件进行图像叠加后可以发现,该类细胞具有同时摄取DiI-acLDL和结合FITC-lectin的能力,并显示为黄色荧光(图1,见封三),这与相关报道中内皮祖细胞的特性完全一致。

2.2 内皮祖细胞增殖能力的变化

在体外增殖能力检测的MTT实验中,妊娠高血压综合征患者组循环内皮祖细胞在570 nm处的吸光度为(0.53±0.12),而对照组循环内皮祖细胞在570 nm处的吸光度则为(0.74±0.18)。经统计学分析显示,二者之间的差异具有高度统计学意义(t=5.94,P<0.01)。

2.3 内皮祖细胞黏附能力的变化

各组内皮祖细胞在体外培养30 min,经过PBS轻轻冲洗3遍后,利用相差显微镜(×200)对贴壁细胞进行计数,结果显示,妊娠高血压综合征组循环内皮祖细胞的贴壁细胞数为(5.82±1.69)个/HPF,明显少于对照组(12.37±2.96)个HPF的贴壁细胞数量,两组比较,差异有高度统计学意义(t=2.64,P<0.01)。

2.3 内皮祖细胞迁移能力的变化

各组内皮祖细胞在24孔插入式培养皿内培养24 h后,通过对皿外层的细胞进行固定并行结晶紫染色,利用相差显微镜(×200)对细胞进行计数。结果显示,妊娠高血压综合征患者组循环内皮祖细胞迁移至皿外侧的细胞数量为(6.37±2.13)个/HPF,明显少于对照组(13.24±2.36)个HPF的迁移细胞数量。两组比较,差异有统计学意义(t=3.62,P<0.05)。

3 讨论

妊娠高血压综合征主要是由于妊娠期全身小动脉痉挛性收缩和继发性损伤所致,血管内皮细胞激活和损伤所导致的血管内皮功能障碍的发生目前已被公认为该疾病的主要发病机制[1]。内皮功能障碍主要是由于内皮的损伤和修复之间的动态平衡发生破坏。而作为血管内皮细胞前体的内皮祖细胞,在血管损伤后的修复中发挥着至关重要的作用[2]。

通常认为,当胎盘发生缺血缺氧时,可以促使血管内皮细胞分泌内皮细胞生长因子、肿瘤坏死因子-α、血管紧张素-Ⅱ等细胞因子进而达到对骨髓内皮祖细胞的动员目的,促进其进入外周血,并归巢至血管损伤部位,以实现受损血管内皮的修复。有研究显示,在妊娠高血压综合征患者处于子痫前期时,其外周血内皮祖细胞的数量会出现明显的减少[3],并且在体外培养状态下内皮祖细胞集落形成能力同样会出现显著的下调[4]。尽管目前对于内皮祖细胞数量及集落形成能力的下调在妊娠高血压综合征患者发生子痫前期的过程中发挥着什么样的作用尚不完全明确,然而鉴于内皮祖细胞在血管损伤修复中所起到的关键作用,通常认为,与许多心血管疾病类似,妊娠期间由于各种原因所造成的内皮祖细胞的数量减少及功能下调,最终将致使机体应对炎症反应及代谢失衡能力的降低,从而导致广泛性的血管内皮舒张功能的障碍以及子痫前期的发生[5]。

目前对于妊娠高血压综合征患者循环内皮祖细胞数量的研究已经有较多的报道,但关于其功能状态的研究却相当较少。因此,在本研究中笔者采用体外培养的方式对妊娠高血压综合征患者循环内皮祖细胞进行扩增培养,并对其体外的功能进行了相关的检测,以便进一步了解妊娠高血压综合征患者循环内皮祖细胞除数量减少外,是否也同样存在一定程度的功能变化。研究结果显示,在恰当的培养体系下,各组外周血单个核细胞均能培养出内皮祖细胞,处于增殖期的内皮祖细胞同时具有摄取acLDL和结合lectin的能力,这与相关研究完全一致[6],这为下一步的研究奠定了基础。在随后的内皮祖细胞体外功能检测中,笔者发现,妊娠高血压综合征患者循环内皮祖细胞在体外的增殖、黏附、迁移能力较对照组相比均存在显著的下调。由此可见,妊娠高血压综合征的发生与循环内皮祖细胞数量的减少存在一定相关性的同时,其循环内皮祖细胞的功能亦存在不同程度的下调。正是由于这两方面共同作用的结果,导致患者受损的血管内皮细胞不能得到及时的修复,最终导致血管舒张功能严重受损。然而循环内皮祖细胞功能的下调是否与妊娠高血压综合征的严重程度存在一定的相关性还需要做进一步的研究。

摘要：目的 研究妊娠高血压综合征患者循环内皮祖细胞功能的变化。方法 选择2010年10月～2011年8月于我院产科住院的妊娠高血压综合征患者12例作为研究对象(妊娠高血压综合征组),同时选取12例正常妊娠的同期入院患者作为对照组。分离两组患者外周血单个核细胞进行体外诱导培养以获得内皮祖细胞,并对其增殖、黏附、迁移能力进行检测。结果 各组骨髓单个核细胞在体外培养下均能够获得内皮祖细胞,与对照组比较,妊娠高血压综合征组内皮祖细胞增殖、黏附、迁移能力均有不同程度的下降。结论 妊娠高血压综合征的发生与循环内皮祖细胞功能的下调存在明显的相关性。

关键词：妊娠高血压综合征,内皮祖细胞,外周血单个核细胞

参考文献

[1]林其德.妊娠高血压综合征病因学研究进展与展望[J].中华妇产科杂志,2003,38(8):471-473.

[2]Werner N,Kosiol S,Schiegl T,et al.Circulating endothelial progenitorcells and cardiovascular outcomes[J].N Engl J Med,2005,353(24):999-1007.

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[4]Sugawara J,Mitsui-Saito M,Hayashi C,et al,Decrease and senes-cence of EPC in patients with preeclampsia[J].Clin Endoerinol Metab,2005,90(9):5329-5332.

[5]Huppertz B.Placental origins of preeclampsia challenging the currenthypothesis[J].Hypertension,2008,51(4):970-975.

循环内皮细胞 篇3

关键词：急性肺损伤,内皮祖细胞,乌司他丁注射液,成血管能力

急性肺损伤时内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)参与到肺泡-毛细血管的修复,2008年内皮祖细胞移植至油酸诱导的急性肺损伤兔模型[1]的研究已证实,在急性肺损时内皮祖细胞可归巢到肺毛细血管,起到修复肺损伤的作用,在最近的研究中也有类似的研究。2013年在Chest[2]发表的一项研究中发现单独使用内皮祖细胞或单独使用辛伐他丁均能减轻急性肺损伤,如联合治疗效果更好,研究没有更深入讨论机制研究,实验提示内皮祖细胞可进行急性肺损伤修复,并且利用药物提高内皮祖细胞功能是研究的一个重要手段及研究热点。乌司他丁注射液(ulinastatin injection,UTI)具备了治疗急性肺损伤的潜力。乌司他丁是从健康尿液中提取的蛋白酶抑制剂,可有效地减轻炎症渗出及炎症因子的释放[3],也有研究证明它有利于内皮细胞修复及维持动脉内膜完整,现主要的研究偏向于乌司他丁减轻炎症因子或中性粒细胞从而减低内皮细胞的损伤,但暂未见乌司他丁和内皮祖细胞的研究。为此,本研究主要针对乌司他丁是否提高内皮祖细胞成血管能力展开。

1 材料与方法

1.1实验动物

成年新西兰大耳白兔(2.5kg~3.0kg)共40只,购自广东省动物中心,根据国家实验动物健康使用规范指南饲养,所有操作符合广东省人民医院伦理委员会的要求。

1.2材料与试剂

M199培养液、胎牛血清购自Hy-clone公司;人淋巴细胞分离液购自天津灏洋生物制品有限公司;体外血管形成试剂盒、DIL-labeled acetylat-ed LDL(Dil-acLDL)、FITC标记荆豆凝集素 Ⅰ(FIT-CUEA-1)、oleicacid(75 mg/kg)均购自Sigma公司。VWF抗体(博奥森);ChemMate TM DAKO Envision TM Detection Kit(DAKO),乌司他丁注射液(天普洛安)。PKB阻断剂(LY-294002);eNOS阻断剂(L-NAME)。

1.3 方法

1.3.1分组

肺毛细血管密度分3组:正常对照组、急性肺损伤组、乌司他丁治疗组。正常对照组:正常新西兰大耳兔,体重(2.0±0.5)kg,均为雄性,共10只,进行免疫组化观察肺毛细血管密度;病理评价肺泡炎症。急性肺损伤兔组:正常新西兰大耳兔,体重(2.0±0.5)kg,均为雄性,共10只。造模成功24h进行分别进行免疫组化观察肺毛细血管密度;病理评价肺泡炎。乌司他丁治疗组:正常新西兰大耳兔,体重(2.0±0.5)kg,均为雄性,共10只,造模成功后使用40 000U/(kg·d)乌司他丁治疗48h后处死实验动物,分别进行免疫组化观察肺毛细血管密度;病理评价肺泡炎症。

体外内皮祖细胞成血管能力检测分为3组:正常对照组、急性肺损伤组、乌司他丁治疗组。正常对照组:正常新西兰大耳兔,体重(2.0±0.5)kg,均为雄性,共6只,抽取10mL外周血分离诱导内皮祖细胞7d后,行内皮祖细胞鉴定。48h后,检测成血管能力测定。急性肺损伤组:正常新西兰大耳兔,体重(2.0±0.5)kg,均为雄性,共6只,造模成功24h后,抽取10 mL外周血,分离诱导内皮祖细胞。48h后,检测成血管能力测定。乌司他丁治疗组:正常新西兰大耳兔,体重(2.0±0.5)kg,均为雄性,共6只,造模成功24h后,抽取10mL外周血,分离诱导内皮祖细胞。内皮祖细胞加入1 000U/mL乌司他丁培养48h后,检测成血管能力测定。

1.3.2 EPCs的分离培养

肝素抗凝取骨髓10 mL,采用密度梯度离心法获取单个核细胞,接种在24孔板上。应用M199培养基(含20%胎牛血清,青霉素100U/mL,链霉素100 U/mL)培养,用PBS洗去非贴壁细胞。换培养液后培养至7d,PBS液去除非贴壁细胞,对贴壁细胞进行细胞鉴定。

1.3.3 EPCs的鉴定

按2×106~3×106接种在纤连蛋白包被24孔板,细胞爬片培养第4天取出,将细胞与2.4ng/mL的DIL-acLDL在37 ℃温度下孵育1h,以检测EPCs摄取DIL-acLDL。采用2%多聚甲醛固定细胞10min。应用PBS清洗2min,10ng/mL的FITC-UEA-1加于上述标本,37 ℃ 温度下孵育1h。采用激光共聚焦显微镜鉴定DIL-acLDL和FITC-UEA-1双染色阳性细胞被认为是正在分化的内皮祖细胞。

1.3.4病理切片评估肺泡炎症

部分左肺组织经10%甲醛固定,石蜡包埋切片,HE染色后用普通光学显微镜观察形态学变化。根据肺泡炎症的特点炎症细胞渗出,肺泡间隔增大,根据受损面积肺泡炎症分级:0级,无肺泡炎;Ⅰ 级,轻度肺泡炎,少于20%的肺病灶区;Ⅱ级,中度肺泡炎,病变区20%~50%;Ⅲ级,弥漫病变面积大于50%。

1.3.5 EPCs血管生成能力检测

采用体外血管生成试剂盒检测体外EPCs的血管生成能力。200倍倒置显微镜下观察小血管生成情况。细胞拉长变形,长度为宽度的4倍以上即可被认为形成小管。选择200倍光镜下5个视野,计数小管数。

1.3.6免疫组化评估肺毛细血管密度

血管性血友病因子(von willebrand factor VWF)是内皮细胞的标志物,经常被用于病理切片上确定毛细血管数目,按免疫组化试剂盒步骤,应用免疫组化图像自动分析模块,计算阳性目标总面积/统计场总面积,即每平方毫米的毛细血管密度。

1.3.7统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件分析,体外成血管能力检测、肺毛细血管密度方差分析,肺泡炎症评估采用秩和检验。

2 结果

2.1肺部HE染色

急性肺损伤见肺部严重渗出,经乌司他丁治疗后渗出较急性肺损伤组减少。根据受损面积肺泡炎症分级,急性肺损伤组与乌司他丁治疗组比较差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

只

2.2肺毛细血管密度

棕色染色为血管性血友病因子抗体阳性,肺毛细血管密度比较乌司他丁治疗组较急性肺损伤组明显增加(P <0.05)。详见表2。

2.3内皮祖细胞鉴定

共聚焦显微镜观察EPCs摄取荧光双染阳性:DiL-acLDL染色细胞呈红色;FITC-UEA-I染色细胞呈绿色;双染色细胞同时呈红、绿色。通过共聚焦显微镜鉴定,FITC-UEA-I和DiL-acLDL双染色阳性细胞被认为是正在分化的EPCs。

2.4体外EPCs血管生成能力检测

急性肺损伤组较正常对照组体外成血管数目下降,但两组比较差异无统计学意义(P>0.05);乌司他丁治疗组较急性肺损伤组体外成血管数目增加,差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

3 讨论

现有的研究主要考虑乌司他丁的内皮保护作用为炎症因子下降及炎症细胞减少导致内皮功能保护[4,5,6]。但在我们的实验中已发现乌司他丁能增加内皮祖细胞的归巢数目,在体内经免疫组化观察到肺毛细血管密度增加,在体外进行细胞培养同样发现经乌司他丁组治疗后内皮祖细胞的成血管能力提高。为此,认为乌司他丁的内皮保护作用,作用于内皮祖细胞,导致内皮功能改善,修复肺泡毛细血管屏障,减少肺部渗出。

内皮祖细胞在内皮保护起到主要的作用,内皮祖细胞组织归巢至受损的肺毛细血管起到修复的作用。有研究表明在急性肺损伤动物模型中大约有50%的肺毛细血管丢失,所以利用内皮祖细胞拯救肺毛血管是现在新的研究方向。参与肺血管[7]的修复有以下研究:Suratt等[8]的研究认为内皮祖细胞参与内皮修复提供了强有力的证据,证明内皮祖细胞参与肺血管的修复,在接受男性造血干细胞移植的女性病人肺组织中(活检或尸检)观察到含有Y染色体的内皮细胞,证明外源性内皮祖细胞在受者肺组织中定植并分化为成熟的内皮细胞。内皮祖细胞可减轻氧化应激反应,在研究中发现,油酸诱导的急性肺损伤兔的肺中线粒体中的血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、锰超氧化物歧化酶(Mn super oxide dismutase)蛋白水平升高,这两种酶对抵抗肿瘤坏死因子(TNF-α)介导的内皮损伤及凋亡起到重要作用[1]。内皮祖细胞除了直接的内皮修复作用还有免疫调节功能保护减少细胞内黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1),P-选择素(P-selectin)蛋白使炎症细胞渗出减少[9]。

从本实验可以发现内皮祖细胞能归巢至受损的肺血管及参与肺血管内皮修复和血管新生。并且发现乌司他丁有直接引起内皮祖细胞成血管功能提高的作用。

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循环内皮细胞 篇4

关键词：激素性股骨头坏死,内皮祖细胞,辛伐他汀

股骨头坏死是骨科较为常见的一种疾病,发病机制较为复杂。在我国由于存在广泛的糖皮质激素不合理应用,激素性股骨头坏死的发病率尤为突出。有研究显示,在长期大剂量激素的应用会造成股骨头局部血管通透性改变以及血管活性物质异常分泌,进而引起血流减缓、血管内皮细胞损伤及微血栓形成,最终导致局部骨组织正常结构的破坏,并且其范围和严重程度与血管内皮的损伤程度具有明显的相关性[1]。而在维持血管内皮的正常结构和功能中也发挥着至关重要的作用的内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPC),其数量和功能的下调参与了该疾病的进程。由于辛伐他汀能够显著改善EPC的功能状态,本研究采用辛伐他汀对激素性股骨头坏死患者进行治疗,并对其循环EPC数量和功能进行了检测,现报道如下:

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择华北油田总医院(以下简称“我院”)骨科2010年2月~2012年10月诊治的激素性股骨头坏死患者24例,随机分为治疗组及对照组,每组各12例。所有入选病例均符合股骨头坏死诊断标准[2]。另选择我院健康体检者12例为正常组。各组性别、年龄等一般资料比较,差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经我院伦理委员会审批通过,所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂

内皮细胞培养基EGM-2(瑞士Lonza公司);FITC标记的血凝素(FITC-lectin,美国Sigma公司);Di I标记的乙酰化低密度脂蛋白(Di I-ac LDL,美国Molecular Probes公司);噻唑蓝(MTT,美国Duchfo公司);纤维连结蛋白(fibronectin,美国Hematological Technologies公司);淋巴细胞分离液(天津TBD公司)。

1.3 研究方法

1.3.1 治疗方法及疗效评价

对照组患者予避免负重及相应的功能锻炼,并以常规剂量规律的服用肠溶性阿司匹林和地巴唑。治疗组患者在此基础上予口服辛伐他汀(山东罗欣药业股份有限公司,国药准字H20065119)进行治疗,0.01 g/d,连续应用12周。治疗前后分别对两组患者进行Harris评分以评价各组的临床疗效。

1.3.2 循环EPC体外培养及鉴定[3]

所有患者治疗前后于清晨空腹采集静脉血20 m L,经过密度梯度离心分离收集单个核细胞。磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤离心后,以EGM-2培养基重悬细胞并调整密度为1×107个/m L,将其接种至包被有纤连蛋白的24孔板中,于5%CO2、37℃培养箱内常规培养。第3天以PBS洗去未贴壁细胞,更换培养液继续培养,并予隔日半量换液。第7天加入终浓度0.005 g/L的Di I-ac LDL继续培养4 h,2%多聚甲醛固定后,加入0.005 g/L的FITC-lectin于37℃孵育1 h,PBS洗涤后于荧光显微镜下进行观察荧光表达情况,双荧光阳性的细胞被认为是EPC。

1.3.3 细胞增殖能力检测

细胞培养第7天时以0.25%胰蛋白酶消化细胞制备单细胞悬液并调整密度为1×105个/m L,加入96孔板中(0.2 m L/孔),在5%CO2、37℃培养92 h后加入5 g/L四甲基偶氮唑盐(MTT)(20μL/孔)。培养4 h后吸弃培养基,并加入100μL二甲基亚砜(DMSO)振荡溶解后用酶标仪检测其570 nm处的吸光度(A值)。

1.3.4 黏附能力检测

细胞培养第7天时以0.25%胰蛋白酶消化细胞制备单细胞悬液并调整密度为5×104个/m L,将其加入包被纤维连结蛋白的24孔板中(1 m L/孔),常规培养30 min后PBS冲洗3遍,200×相差显微镜下选取3个不同视野对贴壁细胞进行计数,取平均值。

1.3.5 细胞迁移能力检测

细胞培养第7天时以0.25%胰蛋白酶消化细胞,用0.1%血清浓度、无细胞因子的EGM-2培养基调整密度为5×104个/m L,加入24孔板插入式培养皿(0.2 m L/孔),在24孔板中加入EGM-2完全培养基(0.6m L/孔),并将插入式培养皿置于其中。常规培养24 h后取出培养皿去除内层细胞,1%多聚甲醛固定外层细胞并行结晶紫染色,200×相差显微镜下选取3个不同视野对细胞进行计数,取平均值。

1.4 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对数据进行分析,正态分布计量资料以均数±标准差表示,两独立样本的计量资料采用t检验;以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 疗效评价

治疗前治疗组Harris评分为(76.32±3.97)分,对照组为(78.29±4.13)分,差异无统计学意义(t=0.263,P>0.05)。经辛伐他汀治疗12周后,治疗组Harris评分[(93.47±4.06)分]较对照组[(87.63±3.59)分]有明显的增高,差异有统计学意义(t=1.427,P<0.05)。

2.2 EPC培养及鉴定

外周血单个核细胞体外培养7 d后可以呈短梭状的细胞生成,具有典型EPC的形态特征,并且这些细胞同时具有摄取Di I-ac LDL和结合FITC-lectin的能力,经Image J软件进行图像叠加后该类细胞呈现出双阳性的黄色荧光(图1)。

2.3 EPC增殖能力的变化

MTT实验显示,正常组循环EPC在570 nm处的吸光度为(0.76±0.13),而治疗组及对照组分别为(0.52±0.14)和(0.53±0.17),均低于正常组,差异均有高度统计学意义(t=5.73、4.95,均P<0.01),且治疗组与对照组之间差异无统计学意义(t=0.34,P>0.05)。在治疗12周后,治疗组患者EPC的体外增殖能力显示,其在570 nm处的吸光度为(0.72±0.15),明显高于对照组(0.62±0.11),二者差异有高度统计学意义(t=4.76,P<0.01)。

2.4 EPC黏附能力的变化

正常组EPC在体外培养30 min后的贴壁细胞数为(13.42±3.15)个/HPF,而治疗组与对照组分别为(5.93±1.67)个/HPF和(5.67±1.58)个/HPF,均少于正常组,差异均有统计学意义(t=4.68、4.37,均P<0.01),且治疗组与对照组之间差异无统计学意义(t=0.24,P>0.05)。在治疗12周后,治疗组患者EPC的体外黏附能力显示,其贴壁细胞数为(11.93±3.45)个/HPF,明显多于对照组[(8.51±3.63)个/HPF],差异有高度统计学意义(t=3.26,P<0.01)。

2.5 EPC迁移能力的变化

正常组EPC在24孔插入式培养皿内培养24 h后,迁移至皿外层的细胞数量为(13.62±3.73)个/HPF,而治疗组与对照组分别为(6.28±1.53)个/HPF和(6.64±1.75)个/HPF,均少于正常组,差异均有高度统计学意义(t=4.32、4.66,均P<0.01),且治疗组与对照组之间差异无统计学意义(t=0.22,P>0.05)。在治疗12周后,治疗组患者EPC的体外迁移能力显示,其迁移至皿外侧的细胞数为(10.56±3.09)个/HPF,明显多于对照组[(7.48±3.13)个/HPF],差异有高度统计学意义(t=3.37,P<0.01)。

3 讨论

尽管糖皮质激素的应用可以引起骨质疏松的发生已经得到广泛的认可,然而对于激素性股骨头坏死的发病机制却尚无定论。近年来,有研究显示,股骨头局部毛细血管密度的增加可以显著的降低股骨头缺血性坏死的发生[4],由此有学者认为,血管性因素有可能在股骨头坏死的病理生理机制中起到了关键性的作用[5]。作为血管内皮细胞前体的EPC主要定居于骨髓,仅有极少量存在于外周血中,它不仅参与了血管生成及再生,同时在特定的状态下,可以迁移并归巢至发生损伤的血管部位,在血管损伤后的修复中发挥着至关重要的作用[6],其数量及功能的变化对于血管相关性疾病的评估亦具有一定的价值。

相关的研究显示,在激素的长期使用可以在体内通过多种途径对EPC的数量和功能产生影响[7]。一方面激素可以对血管内皮产生的直接损伤作用,导致内皮细胞的损伤和凋亡,另一方面激素的使用可以显著降低体内一氧化氮及血管内皮生长因子等血管活性物质合成,进而使EPC的增殖、迁移能力和血管生成能力减低[8,9]。诸多方面因素共同作用的结果将有可能导致在激素长期应用过程中循环EPC数量和功能的改变,进而造成股骨头局部由于血管数量及功能的异常而发生骨细胞的营养状态受到抑制而产生凋亡甚至坏死。本研究对激素性股骨头坏死患者的循环EPC包括增殖、黏附、迁移能力在内的各项功能指标进行了检测。结果显示与正常人群相比,激素性股骨头坏死患者循环EPC的体外功能指标存在不同程度的下调。由此推测,在激素长期大量应用的过程中,由于其对血管内皮细胞的损害导致股骨头局部微血管内皮细胞的坏死脱落,而在血管损伤修复中起到关键性作用的EPC由于多种细胞因子的分泌受到抑制而使其数量减少,且严重影响了其功能的有效发挥,最终使得受损的血管内皮不能得到及时有效的修复而发生舒张功能受损,甚而造成局部微血栓的形成及血管的闭塞,从而影响股骨头局部的正常血液供应而导致骨质的广泛性破坏和结构的改变。

循环内皮细胞 篇5

1 材料与方法

1.1 孕早期绒毛收集

随机选择2008年12月至2009年6月在上海交通大学附属第六人民医院计划生育门诊手术室行人工流产的孕6～8周健康妇女, 年龄20～35 岁, 平素月经规则, 经B超检查证实为宫内早孕并探及原始心管搏动, 术前3月内未服用过甾体激素。孕妇无高血压、心脏病、肝炎、结核等妊娠合并症和并发症史; 患者均知情同意后签署经上海交通大学附属第六人民医院伦理道德委员会批准的同意书。将吸宫术所获得的无菌绒毛组织用于培养细胞滋养细胞。

1.2 血清标本收集及分组

选择住院正常足月妊娠剖宫产孕妇10例 (正常对照组) , 子痫前期患者20例 (子痫前期组) , 并收集两组孕妇外周血各 10 ml, 制备血清。另收集剖宫产孕妇 50例脐静脉血各50 ml, 制备血清用于培养细胞。此剖宫产孕妇和正常对照组孕妇剖宫产原因为骨盆或胎位异常、产程停滞、社会因素等。子痫前期诊断标准参考《妇产科学》第6版。两组病例的年龄、孕周、孕产次比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 所有病例均无肝肾疾病、糖尿病、原发性高血压及其他心血管疾病史。两组患者的临床资料见表1。

①与正常对照组比较: P<0.05

1.3 细胞滋养细胞、人脐静脉内皮细胞的原代培养及鉴定

按文献[3]报道的方法, 采用组织块贴壁法培养人孕早期细胞滋养细胞, 细胞在含20%人脐血清、1 ng/ml表皮生长因子 (EGF) 、青霉素和链霉素 (浓度分别为100 U/ml和100 g/ml) 的达尔伯克 (氏) 改良伊格尔 (氏) 培养基 (DMEM) 高糖培养基, 37℃、5% CO2温箱内培养。人脐静脉内皮细胞培养:无菌条件下取正常足月妊娠剖宫产胎儿娩出后脐带10 cm左右, 胰酶消化法行内皮细胞培养, 培养液为含20%人脐血清、青霉素和链霉素 (浓度分别为100 U/ml和100 g/ml) 的 RPMI-1640培养基。DAB显色加免疫组化法鉴定细胞滋养细胞和人脐静脉内皮细胞。

1.4 滋养细胞与脐静脉内皮细胞共培养模型的建立

取传至 3～4代呈对数生长期的内皮细胞 (1×106) 6孔培养板中培养24小时后行饥饿培养24小时 (更换含 1%正常脐静脉血清的培养基 ) , 进行后续实验, 将铺有鼠尾胶原的Transwell小室 (美国 BD公司 ) 放入6孔培养板, 取培养48小时的3～4代滋养细胞悬液于上室 (1×105个) , 或下室为滋养细胞上室加内皮细胞。正常对照组的模型建立:上、下室加入含10%正常对照组孕妇外周血清 ( 10%, 浓度梯度实验得出最佳有效浓度) 的培养基37℃培养24小时;子痫前期组的模型建立:上、下室加入含10%子痫前期组患者外周血清的培养基37℃培养24小时。各组实验均进行时间配对。

1.5 Transwell技术检测细胞滋养细胞的侵袭能力

取分别用正常对照组和子痫前期组孕妇外周血清共培养体系24小时后的Transwell小室, 用棉签拭去上室内未侵袭至底部的细胞, 0.1%结晶紫染色, 室温15分钟, 染色后清水漂洗, 高倍显微镜 (×200) 下每孔随机选择5个视野计数细胞。以侵袭细胞的相对数目来表示细胞滋养细胞的侵袭能力。

1.6 流式细胞仪检测人脐静脉内皮细胞 ( HUVEC) 凋亡

分别收集两组孕妇外周血清处理共培养体系24小时后HUVEC, 参照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 (购于南京凯基生物科技发展有限公司) 说明书进行HUVEC凋亡的检测。

1.7 逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 检测正常孕妇外周血清和子痫前期孕妇外周血清共培养所得细胞滋养细胞MMP-2、MMP-9mRNA及人脐静脉内皮细胞FasmRNA的表达

从PubMed检索MMP-2、MMP-9、Fas基因全序列, 以GAPDH为内参照, 引物序列由上海生物工程公司合成。内参GAPDH引物:上游5′-CAACGAATTTGGCTACAGCA-3′, 下游5′-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3′;所用MMP-2引物:上游5′-CACCTACACCAAGAACTTCC-3′, 下游5′-AACACAGCCTTCTCCTCCTG-3′;MMP-9引物:上游5′-CCCTTCTACGGCCACTACTGTG-3′, 下游5′- GCACTGCAGGATGTCATAG-3′;Fas引物:上游5′-TCTGCCATAAGCCCTGTC-3′, 下游5′- TTGGTGTTGCTGGTGAGT-3′。分别收集经两组孕妇外周血清处理24小时后的细胞, Trizol法提取细胞总 RNA, 紫外分光光度计测定其纯度及浓度, 模板 RNA500 ng, 参照TaKaRa RNA PCR Kit (大连宝生物公司) 试剂盒说明进行逆转录。PCR扩增条件:GAPDH、MMP-2、Fas: 94℃预变性 2分钟, 94℃×30秒, 56℃×30秒, 72℃×1分钟, 30个循环 , 72℃延伸5分钟;MMP-9: 94℃预变性 2分钟, 94℃×30秒, 53℃×30秒, 72℃×1分钟, 32个循环 , 72℃延伸 5分钟。 取10 μl PCR产物, 1.5%琼脂糖凝胶电泳, 用 UVIpro凝胶图像分析系统观察并摄像, 用UVIBand软件扫描分析, 以目的基因条带与GAPDH条带的灰度比值为目的基因 mRNA相对表达强度。

1.8 统计学处理

所有实验均用不同批次的标本重复3次。所有数据均采用SPSS 13.0进行处理, 结果用undefined表示, 两组间数据采用两样本均数的t检验, 以P<0.05为差异有高度统计学意义。

2 结 果

2.1 两组滋养细胞浸润结果

正常对照组细胞滋养细胞穿透 Transwell基底膜的数量为105.7±7.3, 子痫前期组为 57.5±4.4, 两组比较差异有统计学意义 (P<0.01) 。子痫前期组血清明显抑制细胞滋养细胞的侵袭能力。

2.2 流式细胞仪检测

HUVEC凋亡的结果 子痫前期血清共培养体系的人脐静脉内皮细胞凋亡率明显低于正常对照组 (P<0.05) , 见表2。

①与正常对照组比较:P<0.05 ②与同组MMP-9比较:P<0.05

2.3 RT-PCR检测细胞滋养细胞MMP-2、MMP-9和内皮细胞FasmRNA的表达结果

由表2可见:子痫前期组MMP-2、MMP-9和FasmRNA的表达明显低于正常对照组 ( P<0.05) 。结果还显示, 在孕早期6～8周细胞滋养细胞中MMP-2 mRNA的表达强度高于MMP-9 (P<0.05) 。琼脂糖凝胶电泳扩增结果见图1。

3 讨 论

1967年Robertson首次提出子宫螺旋动脉重铸 (remodel) 概念, 认为绒毛滋养细胞于妊娠的第10周开始沿着螺旋小动脉侵入蜕膜、肌层及血管, 逐步取代螺旋动脉血管内皮细胞, 深入血管壁, 降解血管平滑肌及弹力纤维从而使血管腔扩大, 血流阻力下降, 血流量增加。子宫螺旋动脉重铸障碍, 是导致病理妊娠如子痫前期的重要原因。因此正常妊娠的建立、维持有赖于胎盘滋养细胞正常侵入和子宫螺旋动脉成功重铸。滋养层细胞浸润能力的降低与子痫前期的发生密切相关。滋养细胞具有浸润性是由于自身能分泌 MMPs, MMPs是一类锌离子依赖性蛋白水解酶, 可降解细胞外基质, 在滋养细胞对母体子宫内膜侵袭过程中发挥着主要作用, 其中MMP-2与 MMP-9在细胞浸润过程中起了关键作用[4]。Staun Ram等[5]研究发现在妊娠 6～8周阶段 , MMP-2是滋养细胞浸润的关键水解酶 , 而妊娠 9～12周 , MMP-2与MMP-9共同参与了对滋养细胞浸润的调节。本研究采用的细胞均来自妊娠 6～8周, 结果显示, MMP-2 mRNA的表达强度高于MMP-9 (P<0.05) , 提示MMP-2调节滋养细胞的侵袭力可能比 MMP-9起了更关键的作用。

Fas属于肿瘤坏死因子 (TNF) 受体和神经生长因子 (NGF) 受体超家族。Fas广泛存在于多种组织细胞中, 如不成熟的胸腺细胞和活化的淋巴细胞 (包括活化的T、B细胞) 等。FasL是Fas 的配体, 分布较为局限, 仅表达于活化的T细胞、自然杀伤细胞 (NK) 、胎盘滋养细胞等处。FasL与Fas 分子交联, 结合Fas相关的死亡结构域 (fas-assosiated death domain, FADD) , FADD 与caspase-8相互作用, 形成死亡诱导信号复合体 (death-inducing signaling complex, DISC) , 活化的caspase-8 进一步活化效应caspases, 如caspase-3 等, 细胞发生凋亡, Fas/FasL 还可以通过线粒体途径引起细胞凋亡。Fas/FasL凋亡系统涉及正常血管形成和许多血管病变的发生, 包括:高血压、动脉硬化等[6]。而Fas/FasL与子宫螺旋动脉重铸的研究却少有报道。已有研究表明子宫螺旋动脉的内皮、平滑肌细胞表达Fas, 妊娠早期的滋养细胞能分泌FasL, 引起母体免疫细胞的凋亡, 在母胎界面的免疫耐受中发挥作用[7]。Ashton等[8]研究发现滋养细胞能通过Fas/FasL凋亡途径诱导子宫螺旋动脉内皮细胞凋亡, 使滋养细胞正常侵入子宫螺旋动脉取代内皮细胞保证子宫螺旋动脉成功重铸。除了线粒体内途径, 膜结合型Fas (mFas) 还主要通过自分泌/旁分泌或外部途径引起细胞凋亡。滋养细胞可能通过相邻的内皮、平滑肌细胞触发FasL的表达, 可见子宫螺旋动脉内皮、平滑肌细胞的凋亡很可能通过一种旁分泌形式实现的。Fas/FasL不是唯一涉及子宫螺旋动脉重铸中滋养细胞-内皮细胞作用的机制。最近证明, 组织相容性白细胞抗原-G1 (histocompatibility leukocyte antigen, HLA-G1) 复合物能直接与活化的内皮细胞表达的CD160受体结合, 通过一种凋亡途径抑制血管形成。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (tumor necrosis factor (TNF) -a-related, apoptosisinducing ligand, TRAIL) 是新发现的肿瘤坏死因子超家族成员, 与FasL和TNF一样可诱导细胞凋亡。Keogh等[9]研究发现妊娠前3个月的滋养细胞也表达TRAIL, 滋养细胞通过TRAIL依赖的机制引起子宫螺旋动脉内皮、平滑肌细胞凋亡。Roberta等[10]研究表明血管内皮钙黏蛋白 (vascular-endothelial cadherin) 通过细胞间接触机制而非凋亡程序促进滋养细胞侵入子宫螺旋动脉替代内皮细胞。Fas敲击小鼠表现正常的生育, 很可能是子宫自然杀伤细胞 (uterine natural killer cells, uNK) 而非滋养细胞调节子宫螺旋动脉的重铸[11]。

本研究通过建立滋养细胞与脐静脉内皮细胞共培养模型, 用子痫前期血清进行培养, 并用正常血清作对照, 结果表明, 子痫前期血清培养组滋养细胞侵蚀能力、MMP-2 mRNA、 MMP-9 mRNA、脐静脉内皮细胞Fas mRNA表达明显低于正常对照组, 脐静脉内皮细胞凋亡率明显下降, 提示子痫前期血清可降调滋养细胞MMP-2 mRNA、 MMP-9 mRNA表达, 进而影响脐静脉内皮细胞发生程序性死亡, 滋养细胞取代子宫螺旋动脉内皮细胞过程受阻, 子宫螺旋动脉重铸障碍, 胎盘缺血、缺氧, 将导致病理妊娠如子痫前期与FGR的发生。本研究为进一步探讨因滋养层细胞侵袭能力降低, 内皮细胞凋亡异常导致子宫螺旋动脉重铸障碍而引起的子痫前期等疾病的防治提供更有效的理论依据。当然, 除了凋亡还有其他的机制也在子宫螺旋动脉重铸过程中发挥了作用, 对子痫前期子宫螺旋动脉重铸障碍的分子机制及具体的调控路径的阐明仍需进一步的研究

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循环内皮细胞 篇6

关键词：恩度,血管内皮细胞,凋亡,Bcl-2

重组人血管内皮抑制素注射液(Endostar,恩度)是一种新型的多靶点的血管内皮生长抑制剂,能有效的抑制肿瘤血管的生成,临床用于多种肿瘤的治疗[1]。研究显示,恩度能特异性的作用于肿瘤微血管内皮细胞,抑制血管生成,抑制肿瘤的生长、侵袭、迁移。随着环境污染的加重(如PM2.5、PM10.0)、吸烟等因素的影响[2]。肺癌已占据肿瘤患者的发生率和病死率的首位。在临床治疗中,恩度常用于肺癌的治疗。目前文献报道多集中对恩度调控血管内皮生长因子(VEGF)、促血管生成素1、2(Ang1、2)、成纤维细胞生长因子(FGF)等表达的影响[3]。但对血管内皮细胞凋亡的研究较少。因此,在本研究中,将建立非小细胞肺癌细胞A549细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVECs)体外共培养体系,探讨恩度对内皮细胞凋亡的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人非小细胞肺癌A549细胞株、人脐静脉内皮细胞HUVECs(中国科学院上海细胞库);超净工作台(ESCO公司,新加坡);二氧化碳培养箱(长沙长锦科技有限公司,湖南);RPMI1640和DMEM培养基(GIBCO)、胎牛血清(杭州四季青公司,批号:110213)、重组人血管内皮抑制素(恩度):烟台麦得津生物工程有限公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(美国,Sigma公司);Transwll迁移小室(直径6mm,孔径5μm,Corning);Bax,Bcl-2抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。O-(氯乙酰-氨甲酰基)烟曲霉醇(TNP-470,日本Osaka Takeda公司产品)。AnnexinV2FITC凋亡检测试剂盒(南京凯基生物公司)。链霉亲和生物素酶复合物(SABC)试剂盒购自武汉博士得。酶联分析仪为SPECTRAmax190(Moleculor Devices,USA);荧光显微镜(Olympus IX71倒置荧光显微镜奥林巴斯BX51,日本)。其余试剂为商业来源的分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 A549细胞和HUVECs细胞共培养体系的建立

取对数生长期的A549和HUVECs细胞,分别以0.2 5%胰酶-0.01%EDTA消化,加入RPMI-1640培养基分别制备成2×104细胞/mL的A549单细胞悬液和1×105细胞/mL的HUVECs单细胞悬液,将6孔板Transwell小室的下室接种上HUVECs,上室接种上A549细胞,加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基(100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素培养),以保证上室的细胞培养在培养基中。将Transwell板置于37℃5%CO2培养箱中培养。

1.2.2 恩度共培养体系中对HUVECs生长抑制作用

待下室HUVECs长至75%~85%融合度时,将细胞以含药培养基处理。恩度的浓度分别为10、20、40、80、100μg/mL,空白对照组加100μL培养基代替,阳性对照组以TNP-470(终浓度25μg/mL),另设本底对照孔(等体积含相应浓度药物的无细胞培养液),每组设3个平行孔。待孵育48h后,弃去每孔的含药血清,重新加入1mL不含血清的培养基,另加入MTT液(5 mg/mL)20μL,培养箱中孵育4h,弃去液体,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100μL,于震荡器中振荡10min,酶联免疫检测仪580nm波长测定OD值。生长抑制率按以下公式计算。实验重复3次。

细胞生长抑制率=(对照组OD值—实验组OD值)/对照组OD值×100%

1.2.3 流式细胞术测定HUVECs凋亡

按1.2.2项下接种细胞,并给予药物。药物处理并培养48h后,根据下述步骤采用Annexin V-FITC试剂盒测定细胞凋亡:将下室HUVECs细胞以胰酶-EDTA消化,收集细胞,以培养基终止消化。每个样本至少计数1×104细胞。将收集的细胞以冷的PBS润洗2遍,以500μL结合缓冲液悬浮细胞,加入5μLAnnexin V-FITC,轻微混匀;测定前加入5μLPI并置于暗处避光反应15min。上机测定。每组平行2个样本。

1.2.4 免疫细胞化学检测恩度对HUVECs中Bcl-2和Bax凋亡蛋白的影响

以链霉亲和生物素酶复合物(SABC)方法评价恩度对共培养体系中HUVECs的Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。HUVECs接种在玻片上。恩度的浓度为10、20和40μg/mL。其他细胞接种和给药同1.2.2项下操作。待培养48 h后,细胞用PBS洗3次,每次1min;4%多聚甲醛室温下固定90min,PBS清洗标本3次,每次2 min;0.5%Triton X-100孵育20min,PBS洗涤3次,每次2min;以H2O2处理30min;PBS洗涤3次,每次2min;然后以10%封闭血清孵育37℃20min。加入Bcl-2(1∶200)和Bax(1∶200)抗体37℃下孵育;120min后,加入二抗,孵育20min;PBS洗涤,以SABC溶液处理样本。最后,以3,3'-二氨基联苯胺(DAB,0.3mg/mL)处理,镜下控制反应时间,苏木素轻度复染,PBS洗涤,中性树胶封片。镜下Image-ProPlus图像分析软件拍片。阴性对照组以PBS替代一抗。

1.2.5 Western blotting检测Bcl-2和Bax蛋白

细胞接种和给药同1.2.4项下操作。以胰酶-EDTA消化并收集细胞,加入冰冷PBS润洗3次,然后加入400μL裂解液,置于冰上裂解细胞30min。于4℃离心机中14000rpm离心5min,提取上清液,测定蛋白质浓度后,进行SDS-PAGE转膜。以含5%牛血清白蛋白(BSA)的TBST室温下封闭1h,加入Bcl-2与Bax抗体,4℃摇床过夜。加入HRP-IgG二抗(1∶1000)杂交,洗膜后显色。置于凝胶成像系统中分析Bax和Bcl-2蛋白的相对表达量。

1.2.6 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件统计分析。所有数据均以均数±标准差。以One-way ANOVA方差分析对各组数据进行组间差异比较。P<0.05被认为有统计学意义。

2 结果

2.1 恩度抑制内皮细胞增殖

恩度对HUVECs生长抑制率随着浓度的升高逐渐升高,10μg/mL恩度的生长抑制率为(8.19±2.04)%,100μg/mL恩度的生长抑制率为(65.13±3.78)%。阳性对照25μg/mLTNP-470对HUVECs的生长抑制率为37.56±7.22%(表1)。结果表明,恩度具有较强的抑制HUVECs细胞增殖活性。

2.2 恩度诱导内皮细胞凋亡

恩度处理48h后,10、20、40、80、100μg/mL浓度的恩度的凋亡率分别为(5.29±1.21)%、(8.33±0.62)%、(14.81±0.77)%、(21.87±0.96)%、(26.15±1.06)%(表2)。研究结果表明,在A549与HUVECs共培养体系中,恩度对HUVECs细胞具有诱导凋亡作用。

(n=3)

*P<0.05,**P<0.01,恩度vs.正常组;##P<0.01,TNP-470 vs.正常组

2.3 免疫细胞化学测定恩度调节凋亡蛋白表达

在给予10、20、40μg/mL恩度48h后,促凋亡蛋白Bad蛋白表达分别为(5.57±1.74)%、(6.26±2.34)%和(8.16±1.58)%;抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达分别为(12.33±2.18)%、(8.67±1.55)%和(6.39±2.14)%(表3)。结果表明,在共培养体系中,恩度上调促凋亡蛋白Bax的表达,而降低抑凋亡蛋白Bcl-2的表达。

(n=3)

*P<0.05,**P<0.01,恩度vs.空白组;#P<0.05,##P<0.01,TNP-470vs.空白组

2.4 凋亡蛋白的Western blotting测定

Western blotting检测结果表明,10、20、40μg/mL恩度对抑凋亡蛋白Bcl-2相对表达量分别为(0.46±0.06)%、(0.34±0.07)%、(0.27±0.05)%;对促凋亡蛋白Bax相对表达量分别为(0.25±0.09)%、(0.36±0.12)%、(0.48±0.11)%(表4)。实验组与空白组相比有统计学差异(P<0.05)。

*P<0.05,恩度vs.空白组;#P<0.05,TNP-470 vs空白组

3 讨论

据世界卫生组织统计数据显示,随着环境污染的逐渐严重以及吸烟等因素的影响,肺癌的发生率和病死率已经占据肿瘤的首位,严重威胁人类健康和生存质量。在临床中,肺癌常发生转移引发其他肿瘤。而在肺癌的发展与转移等生物学行为都依赖新血管的生成。研究显示,当瘤块及其转移灶生长至1~2mm以上时,需要进一步生长和转移,需要新生毛细血管提供氧和营养[4]。因此,通过抑制肺癌的血管生成成为抑制肺癌转移、抑制癌组织生长的有效措施。

近些年来,被称为“肿瘤饥饿疗法”的抗肿瘤血管生成成为抑制肺癌瘤块生长、转移的有效途径。恩度是国内首例重组人血管内皮抑制素,是通过抑制血管内皮细胞迁移来抑制肿瘤新生血管形成。目前,研究最多的是抑制血管内皮的生长因子如VEGF等的表达以及抑制内皮细胞的迁移。众多研究表明,诱导内皮细胞凋亡也是抑制血管生成的一个重要机制[5,6]。在本研究中,建立人非小细胞肺癌A549细胞与人脐静脉内皮细胞(HUVECs)共培养体系,探讨恩度诱导HUVECs凋亡的作用及机制。本研究的结果显示,在共培养体系中,恩度能显著抑制HUVECs的增殖,并促进HUVECs的凋亡。

Bcl-2家族蛋白在血管内皮的凋亡中扮演着重要的作用。Bcl-2家族包括抑凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax、Bad等。在正常细胞内,抑凋亡蛋白和促凋亡蛋白体系处于相对平衡状态;但当在处于因素的刺激下,这种平衡被打破,抑凋亡处于下调状态,而促凋亡蛋白处于上升状态[6]。本研究显示,当给予血管内皮抑制剂恩度48h后,抑凋亡蛋白Bcl-2被显著下调,而促凋亡蛋白Bax被显著上调。结果表明,在共培养体系中,恩度能通过调节凋亡因子促进血管内皮凋亡而抑制血管内皮的生长。

总之,我们的研究探讨了恩度抑制血管内皮生长的凋亡机制。这为恩度在临床上的进一步使用提供实验依据。

参考文献

[1]李忠义,刘江秋,徐璐,等.重组人血管内皮抑制素对小鼠Lewis肺癌肿瘤抑制作用[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2003,10(4):274-276.

[2]王玉彬,李迪诺,岳莉.重组人血管内皮抑制素对人胃癌MGC-803细胞株VEGF表达的影响[J].江苏医药,2011,37(13):1504-1506.

[3]殷宗宝,王洪武,邓超,等.重组人血管内皮抑制素注射液对低O2高CO2肺动脉高压大鼠IL-6,eNOS,VEGF的影响[J].实用医学杂志,2010,26(18):3311-3313.

[4]Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications[J].NEngl J Med,1971,285(21):1182-1186.

[5]许成云,倪庆桂,樊馨,等.重组人血管内皮抑制素对肺微血管内皮细胞增殖及其周期分布的影响[J].临床肿瘤学杂志,2009,14(5):410-413.

血管内皮祖细胞功能的影响因素 篇7

1 EPCs的生物学特性

1.1 来源及表型

通常认为EPCs来源于骨髓, 脐带血以及外周血中的EPC也来自骨髓, 在大多数相关的体外实验中, EPC由外周血或骨髓来源的单核细胞提取而来。人们通过其细胞膜上所表达抗原标记 (VEGFR2, AC133, CD34) 来识别。EPCs在培养过程中分出现两种表型:早期长出的EPCs和晚期长出的EPCs。前者呈纺锤形, 在接种培养后3 d～7 d长出, 2周～3周出现生长高峰, 第4周开始凋亡, 体外实验中形成血管不良, 通过分泌各种血管生成因子如血管内皮生长因子 (VEGF) 、白介素 (IL) -8、基质金属蛋白酶-9 (MMP-9) 促进血管生成;后者表现为鹅卵石样细胞, 接种后2周～3周才长出, 4周～8周生长高峰, 12周仍能存活, 体外实验可形成血管。两者都具备摄取乙酰低密度脂蛋白和凝集素的特征[2,3,4]。

1.2 EPCs与血管修复

血管损伤、组织缺血缺氧后释放诸如VEGF、基质细胞衍生因子-1 (SDF-1) 、单核细胞趋化因子-1 (MCP-1) 等因子进入外周血液循环, 这些因子作用于造血组织 (骨髓) , 削弱EPC与基质细胞之间的黏附作用, 从而使EPCs动员入外周血。接着, 由缺血组织产生的这类因子能与各自受体相互作用, 破坏细胞间的相互连接, 增加血管通透性, EPCs在内皮上贴壁。之后, 随着EPCs分泌金属蛋白酶 (MMPs) 和金属胰肽酶E (MMEs) 降解内皮基底膜, EPCs向外出芽样形成毛细血管样的结构, 并且EPCs通过分泌相关信号因子[IL-8、粒细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 、肝细胞生长因子 (HGF) 、SDF-1、干细胞生长因子 (SCF) ]形成了一个有利于血管新生的微环境, 招募更多的EPCs, 并且使得临近内皮迁移并覆盖上述毛细血管样结构的管壁。最后, 随着EPCs分化成为成熟的内皮细胞, 之前出芽样长出的毛细血管样小管形成了具备完整功能的血管。从上述新血管形成的过程可以看出, 组织的缺血、缺氧可以促进EPCs的骨髓动员, 从而促进受损血管的修复[5]。

2 EPCs功能的影响因素

2.1 生理因素对EPCs的影响

2.1.1 年龄

随着年龄的增长, EPC数量减少, 功能衰退, 凋亡增加, 这可能与胰岛素样生长因子 (IGF-1) 随着年龄增长而减少有关[6], 也有人发现是因为年龄的增加降低了组织中缺氧诱导因子1α (HIF-1α) 的稳定性, 使得组织对缺氧的反应性下降, 以及表达的SDF-1、VEGF减少而间接导致EPCs的活性减退[7]。

2.1.2 性别

雌激素能增加骨髓中EPCs的动员, 这与雌激素受体 (Ers) 介导的MMPs表达增多有关, 加之在女性排卵期, 诸多动员祖细胞的细胞因子[受体酪氨酸激酶 (cKIT) 、GSF、IL-1、IL-6]也显著增多[8], 雌激素能增强体外培养的EPCs的增殖及集落形成[9], 并能延缓其衰老, 这与其提高端粒酶活性有关[10];而雄激素无论体内还是体外实验中均显示与EPCs无直接相关性, 甚至在男性中雌激素水平与EPCs的数目也有相关性[11]。

2.2 病理状态下EPCs数目及功能的改变

2.2.1 高血压病

无论是动物实验还是调查原发性高血压病的患者, EPCs的存活率明显下降, 这可能与端粒酶的失活相关[12]。

2.2.2 高胆固醇血症

与正常对照组相比外周血中EPCs数目明显下降 (P<0.05) , 并与总胆固醇 (r=-0.659, P<0.001) 及低密度脂蛋白数值 (r=-0.611, P<0.001) 呈负相关, EPCs增殖、迁移、血管形成能力及存活率均下降[13]。

2.2.3 糖尿病

2型糖尿病患者体内的EPCs数目、增殖和黏附能力都低于正常人, 且血管并发症组EPCs的数目和功能又比无血管并发症组差, 此种差异与糖化血红蛋白 (HbA1c) 水平呈负相关, 可能与CXCR4 (SDF-1的特异性受体) 表达下调有关[14]。

2.2.4 高半胱氨酸血症

Chen等[15]证实高半胱氨酸血症不仅直接损伤内皮细胞, 同时影响EPC的数目及功能, 并通过体外实验发现这种变化与浓度和时间呈正相关, 在200 μmol/L (相当于严重的高半胱氨酸血症) 浓度下作用24 h外周血中EPC数目减半。

2.3 生活方式对EPCs的影响

虽然年纪的增长是血管老化的一个不可逆因素, 但通过有规律的运动完全有可能拥有一个较为年轻的血管, 甚至就算已经是患有心血管疾病的病人, 通过积极的适宜的运动也可显著纠正内皮损伤。高热量饮食之后的血脂、血糖一过性升高能损伤血管内皮细胞, 这一变化甚至在健康人之中也存在。健康的生活方式, 比如体育锻炼、健康饮食 (低糖、低脂、高蛋白饮食, 红酒, 蔬菜, 红茶, 绿茶) 、戒烟、控制体重、自我减压等都能促进EPCs的迁移、增殖等功能活动, 从而维持血管内皮系统的稳定, 坚持健康生活可以从预防的角度保持血管年轻[16]。

2.4 药物对EPCs的影响

2.4.1 他汀类药物

能增加外周循环中EPCs的数量、迁移、增殖以及骨髓动员, 并在体外实验中能促进血管的新生及再生, PI3K/Akt信号旁路在他汀类药物介导的新血管形成及EPCs功能的增强过程中起关键作用[17], 但长期应用他汀类药物又能减少外周血中EPCs的数目[18]。

2.4.2 血管紧张素Ⅱ受体阻断剂

除了降压作用外, 替米沙坦通过其增加EPC的数目及功能来保护心血管[19], 并且体外实验证实替米沙坦呈浓度依赖地增加EPC的数量, PI3K/Akt信号旁路亦是其关键途径[20]。

2.4.3 促红细胞生成素

通抗细胞老化、促进血管新生及发生, 增加EPC的骨髓动员等途径发挥抗组织缺血缺氧, Yip等[21]将其应用于急性缺血性中风患者 (5 000 U皮下) 后发现, 促红细胞生成素能显著增加其外周血中EPCs浓度, 并能改善患者90 d后的预后 (减低了严重的神经系统事件, 包括再发中风、NIHSS≥8分、死亡的发生率) 。

2.4.4 生长激素

Thoma等[6]发现人体或动物应用生长激素 (GH) 后随着IGF-1的显著增多, EPC的数目、集落形成、迁移能力、NO合酶表达显著提高。

2.4.5 阿司匹林

低浓度阿司匹林能促进EPC的功能, 阿司匹林在0.1 μmol/L～100 μmol/L浓度时能促进EPC的迁移、贴壁。在50 μmol/L～100 μmol/L能明显防止其衰老, 但不能影响其增殖、凋亡及eNOS的表达, 而高浓度 (1 mmol/L) 时阿司匹林却有碍EPC的迁移、贴壁、增殖, 减少eNOS的表达, 甚至能诱导该细胞凋亡[22]。

2.4.6 中药及中药提取物

人参皂苷Rg-1能促进EPCs的贴壁、增殖、迁移以及体外血管的生成, 与浓度和作用时间相关, 还能增加VEGF的数量[23]。丹参提取物丹参酮ⅡA体外实验是可明显促进EPCs的增殖、黏附、迁移能力, 呈浓度依赖, 但高浓度时对其数目及功能反而呈现抑制作用[24]。黄芪和三七在EPCs向成熟内皮细胞分化的过程中有促进作用[25]。柴胡疏肝散 (陈皮6 g, 柴胡6 g, 川芎6 g, 香附6 g, 枳壳6 g, 芍药9 g, 炙甘草3 g) 合大黄虫丸能促进下肢缺血动物EPC的动员, 改善缺血肢体供血, 并且增加了血管新生[26]。通心络胶囊 (人参、水蛭、全蝎、土鳖虫、蜈蚣、蝉蜕、赤芍和冰片等) 使外周血EPCs 的数量增加、增殖迁移黏附等功能有明显改善, 在500 μg/mL时最为显著[27]。

3 展 望