牙龈干细胞（共7篇）
牙龈干细胞 篇1
牙周炎是临床上常见的口腔感染性疾病,导致患者牙周支持组织不同程度的破坏,是成人失牙的主要原因。病理学研究显示:牙周炎患者的牙龈组织呈现中性粒细胞大量浸润,提示:微生物感染引发的牙周组织过度免疫反应是牙周炎病变破坏的重要特征。IL- 8是一种中性粒细胞趋化因子,对中性粒细胞具有趋化、形态改变、刺激溶酶体酶释放等多种作用。牙龈组织中IL- 8的表达量随牙周炎病变程度的加重而升高,并与中性粒细胞的浸润程度呈正相关性,因此,IL- 8可能是参与牙周炎免疫炎症反应的重要介质之一。
牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, Pg) 是牙周炎重要致病菌, Pg及其毒力成分的刺激作用可显著影响宿主细胞IL- 8的表达,且该影响作用与细菌致病力的强弱相关[1]。近年的研究显示:Pg的致病性与其菌毛编码基因fimA的遗传多态性存在相关性[2,3]。本课题组前期研究结果表明:Ⅱ型fimA基因型Pg与我国人群牙周炎发生密切相关,并已发现不同fimA基因型Pg促进宿主细胞表达单核细胞趋化蛋白-1的能力存在差异[4]。本研究拟比较不同fimA基因型Pg对人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblast,HGF)表达IL- 8的影响,分析不同fimA基因型Pg引发的牙周组织中性粒细胞募集的差异,探讨fimA基因型与Pg致病力的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 Pg菌株和HGF细胞株
Pg菌株ATCC33277(Ⅰ型)、 WCSP115(Ⅱ型)、WCSP1.5(Ⅲ型)、W83(IV型) 和HGF细胞株均由口腔疾病研究国家重点实验室提供。菌株fimA基因型的确定和方法参见文献[2]。
1.1.2 主要材料与仪器
IL- 8 ELISA 试剂盒 (R&D,美国),Revert AidTM Frist Strand cDNA Synthesis 试剂盒(MBI,立陶宛),麦氏细菌比浊仪(BD Crystal SpecTM,美国),HTS 7000 plus 多孔板高效分析仪 (PE,美国),FTC2000型实时荧光定量基因扩增仪(Funglyn,加拿大)。
1.1.3 引物合成
IL- 8上游引物:CAAACCTTTCCACCCCAAAT;下游引物:CTCAGCCCTCTTCAAAAACT;探针:CTCTGTCTGGACCCCAAGGA,片段长度169 bp。内参照磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH)上游引物:TCATCATCTCTGCCCCCTCT;下游引物:ATGAGGTCCACCACCCTGTT;探针:ACCACAGTCCATGCCATCAC片段长度141 bp。均由上海生物工程公司合成。
1.2 方法
1.2.1 Pg和HGF的培养
将脱脂牛奶内冻存的Pg ATCC 33277(Ⅰ型)、WCSP115(Ⅱ 型)、WCSP1.5(Ⅲ 型)、W83(Ⅳ 型)复苏,接种在牛心脑浸液培养基上,37 ℃厌氧培养5～7 d,生化鉴定后传代。取对数生长期的菌株悬浮于新鲜配置的磷酸盐缓冲液(PBS)中分别制备成菌悬液,6 000 r/min (离心半径=16.1 cm),离心10 min,洗涤2 次,采用麦氏细菌比浊仪将菌悬液密度调至1×1011 CFU/L,6 000 r/min (离心半径=16.1 cm),离心15 min,弃上清液,用含10%小牛血清的低糖达克伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified eagle medium, DMEM)重悬备用。复苏HGF,置入标准条件(37 ℃、5%CO2、饱和湿度)的恒温孵箱培养。每3 d换液1次,取生长旺盛(存活率>95%)的HGF制备细胞悬液,细胞计数并调整细胞密度为1×109个/L,接种至6孔细胞培养板,每孔HGF细胞悬液2 ml,标准条件下继续培养,待细胞单层融合并铺满各孔底后备用。
1.2.2 实验分组
弃接种HGF的6孔板内原培养液,PBS洗孔2 次,将不同Pg菌株菌悬液(1×1011 CFU /L)2 ml分别加入HGF细胞培养孔中,实验组分别为:T1组:Pg ATCC 33277(Ⅰ型)、T2组:WCSP115(Ⅱ型)、T3组:WCSP1.5(Ⅲ型)、T4组:W83(Ⅵ型);对照组加入2 ml DMEM;每组3孔。细菌感染细胞的比率为100∶1(即约每100 个细菌感染1个细胞),然后分别在1、3、6及12 h吸取上清液备用,并应用Trizol法提取感染后细胞总RNA备用。
1.2.3 IL- 8 mRNA的检测
采用实时荧光定量RT- PCR法。应用RevertAidTM试剂盒(按照说明书)将细胞总RNA 逆转录为cDNA,然后行PCR反应。反应体系:RT产物 5 μl,10×PCR buffer 3 μl, 25 mmol/L MgCl2 3 μl, 4×dNTP 25 mmol/L 0.36 μl,上游引物1 μl,下游引物1 μl,Taq酶0.3 μl,加双蒸水至反应总体积为30 μl。反应条件:94 ℃ 2 min 94 ℃ 20 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 40 s,共35 个循环,再72 ℃ 5 min。以GAPDH为内参照。
1.2.4 标准曲线的制作
将PCR扩增产物按10 倍梯度进行稀释,制成标准模板系列,自每个稀释模板中取样5 μl,分别加入30 μl的反应体系中(反应体系同上),在FTC2000型荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量RT- PCR。反应条件:94 ℃ 2 min,94 ℃ 20 s,55 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s共45 个循环。将PCR仪的荧光采集时间统一设定在扩增反应的延伸期。45 个循环的扩增反应结束后,系统将采集到的每一循环反应时的各反应管荧光强度增长指数(DRn)进行分析,绘制每一反应管的扩增动力学曲线。根据动力学曲线确定样品管中荧光强度增加到某一特定阈值时的扩增循环数(cycle threshold,Ct值),根据Ct值与标准模板初始拷贝的对数值作图,得到该样品待测基因的标准曲线。
1.2.5 HGF中IL-
8目的基因相对拷贝数的测定 将反转录得到的cDNA样品各取5 μl,加入上述反应体系中,并在同样的反应条件下行PCR扩增。收集数据,绘制动力学曲线,测定各样品的Ct值与标准曲线进行比较,得出待测样品的相对拷贝数。在PCR反应过程中,以蒸馏水作为阴性对照。以内参引物的Ct值对样本拷贝数加以校正,以排除原始样本量差异对结果的影响。
1.2.6 IL- 8 蛋白的检测
采用ELISA法。应用人IL- 8 ELISA 试剂盒,根据使用说明书绘制标准曲线。每孔加入50 μl待测样本,采用HTS 7000 plus 多孔板高效分析仪双波长485/635 nm读数并自动换算出样本含量(pg/ml)。
1.3 统计学方法
实验数据以undefined表示,使用SPSS 11.0统计软件进行统计学处理。采用方差分析(ANOVA)和最小显著差法(least significant difference, LSD)多重比较法进行组间多重比较,检验水准为双侧 α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 HGF IL- 8 mRNA表达水平的比较
IL- 8 mRNA的检测结果见表 1。各实验组中HGF IL- 8基因和GAPDH内参基因的mRNA表达均以Ct值表示。根据样本Ct值对应标准曲线,以内参基因GAPDH Ct值对IL- 8拷贝数加以校正,计算得到样本中IL- 8 mRNA的拷贝数△Ct值[4]。经ANOVA- LSD多重比较法分析表明,不同fimA基因型Pg刺激HGFs 后,在1、3、6、12 h,实验组与对照组IL- 8的相对表达量均高于对照组(P<0.01);实验组间比较表明,各时间点T2组IL- 8 mRNA的相对表达量高于其它组(P<0.05);T4组在6、12 h时高于T3组(P<0.05);T1组在6 h时高于T3组(P<0.05)。
①与实验组比较P<0.01,②与其它实验组比较P<0.05,③与T3组比较P<0.05。各数据为3 次独立实验结果的undefined(下表同)
2.2 HGF IL- 8 蛋白表达水平的比较
经ANOVA- LSD多重比较法分析表明(表 2),在1、3、6、12 h,实验组IL- 8的分泌量显著增高,与对照组差异有统计学意义(P<0.01);实验组间比较表明, T2组在各时间点IL- 8的分泌量显著高于其它实验组(P<0.05);T4组在1、6、12 h时高于T3组(P<0.05);T1组在6、12 h时高于T3组(P<0.05)。
3 讨 论
牙周炎是一种由口腔微生物感染引发的牙周组织炎症性疾病,致病菌不仅破坏宿主牙龈上皮屏障,还可侵入深部结缔组织,引发持续的免疫反应和炎症损伤。牙龈成纤维细胞是含量最多的牙周组织固有细胞,牙周炎免疫反应早期,HGF在致病菌的刺激作用下,表达多种趋化因子参与对免疫细胞局部募集的调节,对后续炎症和免疫效应的持续放大起到了重要的始动作用。IL- 8是一种中性粒细胞趋化因子,是引发牙周组织中性粒细胞大量浸润的重要介质。研究显示[1,5]:Pg及其毒力成分可影响HGF IL- 8的表达,且这种影响作用与Pg的毒力相关。近年的研究发现[2,3]:Pg菌毛fimA基因的遗传异质性可能影响细菌的致病力。本课题组的前期研究证实[4]:ⅡfimA基因型Pg促进HGF表达单核细胞趋化蛋白-1的能力最强。本实验进一步探讨了fimA基因型对Pg刺激HGF表达IL- 8的影响,为研究fimA基因型与Pg致病性的关系提供新的实验依据。实验结果显示:各fimA基因型Pg均可促进HGF的 IL- 8 mRNA和蛋白水平的表达(P<0.01),其IL- 8 mRNA和蛋白表达量在6 h达到峰值;在各实验组间比较中,ⅡfimA基因型Pg组各时间点的IL- 8 mRNA相对表达量和IL- 8蛋白分泌量均高于其它实验组,而ⅢfimA型Pg组的表达量相对低于其它实验组,差异有统计学意义(P<0.05)。
近年来,国内外学者在对Pg调节宿主细胞表达IL- 8的研究中存在两种不同的结论和观点。第一种观点认为:Pg是IL- 8局部积聚的强烈抑制剂,能够阻止细菌感染部位中性粒细胞的募集。Nassar等[6]的研究显示:Pg的刺激作用可导致内皮细胞IL- 8 mRNA表达的上调,但细胞分泌IL- 8的水平下降。Tada等[7]则发现:Pg可能通过牙龈素- R水解宿主细胞表面的CD14,来阻止Pg- LPS诱导的成纤维细胞IL- 8 mRNA和蛋白水平的表达。持这一观点的学者们认为:Pg的刺激作用抑制了宿主细胞趋化因子的表达,使宿主无法探测入侵的细菌,不能有效启动免疫细胞的局部募集,从而有助于Pg在感染区域有效的躲避宿主防御机制。Pg的这种“局部细胞因子的化学麻痹作用(local chemokine paralysis)”[8]可能是其蛋白酶参与抑制宿主细胞转录或转录后水平表达IL- 8的结果。另一种观点则认为:Pg的感染可能引发局部牙周组织趋化因子的过表达,造成大量炎症和免疫细胞浸润,加重局部免疫反应。Kang等[9]应用Pg381、同源fimA缺陷株DPG3、同源牙龈素缺陷株MT10W刺激内皮细胞,结果显示:实验组趋化因子mRNA和蛋白水平的表达量均高于阴性对照组,且Pg刺激细胞趋化因子 mRNA和蛋白表达水平的上调与菌毛的存在与否有关,而与牙龈素无关。Takahashi等[10]的研究则发现:Pg的主要和次要菌毛参与了对宿主细胞IL- 8表达的上调作用,这种调节与菌毛激活的细胞肌动蛋白骨架的重排和核转录因子- κB的活化有关。这些研究者均强调了Pg的菌毛侵入能力在宿主细胞IL- 8表达上调中的重要作用。本研究中Pg促进HGF IL- 8 mRNA和蛋白水平过表达,且ⅡfimA基因型Pg的促进作用最强,这一实验结果与Kang和Takahashi的结论相似。ⅡfimA基因型Pg黏附和侵入多种宿主细胞的能力强于其它各fimA基因型Pg,而ⅡfimA基因的敲除显著影响Pg的侵入能力[11],提示:Pg的刺激作用可促进HGF mRNA和蛋白水平过表达趋化因子IL- 8,且这种促进作用与菌毛fimA基因型相关;ⅡfimA基因型Pg的促进作用最强,其导致的局部炎症和免疫反应程度可能强于其它fimA型Pg,造成Ⅱ型Pg携带宿主的牙周状况较差。这一结果为本课题组的前期研究结论[2]“Ⅱ型Pg与我国慢性牙周炎发生发展显著相关”提供了一定的病因学理论基础。
参考文献
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上下牙龈原发性浆细胞肉瘤 篇2
1 病例报道
患者陈××,男,54岁,住院号为372793,40d前发现下前牙龈肿物,无疼痛,10d后发现双侧上颌腭侧牙龈肿物,均无疼痛,曾到当地镇医院就诊,行牙周洁治。治疗后出现疼痛。随到当地诊所用抗生素治疗8d,无效。2d后到市口腔医院就诊,再次行牙周洁治,抗生素治疗,疼痛加重。因患者既往有高血病史7年,一直服用降压药(如倍他乐克、心痛定等)。口腔医院遂诊断为药物增生性牙龈炎,建议停用心痛定。停用2d后,患者上下牙龈处疼痛难忍,遂来我院就诊。
专科检查:面部左右不对称,左侧面部略肿胀,口唇无发绀,开口度及开口型正常,口腔异味明显,牙石Ⅱ度。17、12、27缺失,31、41Ⅲ度松动。其他牙Ⅰ度松动。左上腭侧牙龈缘肿物约35cm大小,18、17、16、15、14腭侧牙龈缘肿物21cm大小。下前牙龈肿物36cm大小,从42至右磨牙后区,唇颊侧牙龈区均肿胀。所有肿物均质韧,表面呈结节状,触之极易出血.患者下唇麻木。扁桃体未见肿大,双侧颌下及颈部未触及肿大淋巴结。
实验室检查及辅助检查:血、尿、大便常规和肝肾功正常,胸透、心电图正常,尿本周蛋白阴性。空腹血糖9.6mmol/L (后诊断为糖尿病)。口腔全景、ECT、上颌骨CT、如下图。
患者入院后,在局麻下切取上下牙龈各一块做病理检查,活检术后,给予抗生素预防感染。并用降血糖药控制好血糖;用降压药控制血压;用止痛药消除疼痛;用镇静药消除患者的恐惧紧张情绪。
2.1 病理所见
镜下观察,(上下牙龈)弥漫增生的小细胞,分化差,浸润生长,边缘处部分细胞核偏位,似浆细胞。免疫组织化学:CD20(-)、CD38(+)、CD45RO(-)、CK(-)、S-100(-)、Vimentin(+)、LCA(-)、CD138(-)、Ki-67:>80%考虑浆细胞瘤。
2.2 治疗方案
病理确诊后,制定化疗方案,第1天和第8天用长春新碱2mg,1～7d用环磷酰胺400mg,1～5d用泼尼松40mg,后每2d减10mg,治疗结果如图所示:
3 讨论
浆细胞肉瘤又称骨髓瘤.占口腔颌面部恶性肿瘤的0.13%。病因不明。临床表现多样化,但局部剧烈疼痛为主要症状。下颌多于上颌,发生于下颌者常伴有下唇麻木,X线示洞穿状缺损[5]。首发于颌面部牙龈者少见,本病例上下颌牙龈同时发生极为罕见。浆细胞肉瘤如多发于软组织,首先做病理以明确诊断后行化疗即可,化疗结束后长期服用环磷酰胺。患者可长期带瘤生存。本病例需要与颌骨或牙龈的恶性肿瘤做鉴别诊断。发生于颌骨或牙龈的恶性肿瘤如出现剧烈疼痛时,一般伴有颈部淋巴结的转移.而浆细胞瘤一般无淋巴结转移,局部剧烈疼痛为主要症状,病变发展迅速.且ECT可以协助诊断。必要时可做骨髓穿刺检查,与本病例符合。
参考文献
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牙龈干细胞 篇3
关键词：碱性成纤维生长因子,牙龈间充质干细胞,间充质干细胞,细胞增殖
Zhang等[1]2009年从牙龈组织来源细胞中分离得到干细胞，并开始使用牙龈间充质干细胞(gingiva-derived mesenchymal stem cells,GMSCs)这个概念。牙龈间充质干细胞具有自我更新能力，体外可向成骨、成脂及成软骨方向分化。GMSCs易于分离，来源广泛，具有同质性，比骨髓间充质干细胞增殖迅速。另外，GM-SCs在细胞多次传代后，GMSCs仍能保持正常的染色体核型和端粒酶活性，且没有致瘤性，在再生医学领域及治疗全身系统性疾病方面有很广阔的应用前景[2]。
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)属于肝素结合生长因子家族，在人体内广泛分布。已有实验证实bFGF可诱导和促进脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞增殖、迁移和分化[3,4,5]。b F-GF对人GMSCs增殖作用的研究，目前还未有报道。本实验旨在从牙龈组织中分离培养出GMSCs，探讨不同浓度的b-FGF对GMSCs生长增殖能力的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料和设备
细胞Alpha MEM培养基(Gibco，美国)、FBS(Hyclone公司)、CCK8试剂盒(日本同仁);茜素红、油红O(Sigma公司，美国);人bFGF(美国PeproTech)、IgG鼠抗人单克隆抗体(eBioscience，美国);STRO-1鼠抗人单克隆抗体、CD105鼠抗人单克隆抗体、流式细胞仪(BD，美国);CD90鼠抗人单克隆抗体、CD34鼠抗人单克隆抗体(eBioscience，美国);超净工作台，恒温孵箱，倒置显微镜(Leica，德国)。
1.2 细胞培养
取自临床冠延长手术切取的牙龈用于细胞培养。将收集的牙龈组织立即在含有双抗的D-hanks液中浸泡冲洗3次，转移至60 mm培养皿，加入1 ml的3mg/mlⅠ型胶原酶和4 mg/ml Dispase酶，去除牙龈组织的上皮组织，再充分剪碎，置于15 ml离心管，37℃震荡消化45 min，加入等体积培养基中止消化，1 200r/min离心5 min，去上清，1 ml培养基重悬，接种于60 mm培养皿，细胞培养基为10%胎牛血清、1%双抗和Alpha MEM培养基。于37℃、5%(体积分数)CO2孵箱中培养，每隔2～3 d换液1次，待细胞生长汇合，消化收集细胞，传代培养。
1.3 细胞的纯化
采用有限稀释法对人GMSCs进行克隆筛选。将第1代GMSCs密度稀释至2～3个/ml后接种于96孔板，显微镜观察保证孔内部不多于1个细胞，常规培养，待细胞克隆明显，并使孔底覆盖1/2时，将细胞转种于24孔板进行扩大培养。生长至汇合后，逐渐移至大孔板中扩增培养以便用于后续研究。
1.4 GMSCs鉴定
1.4.1 GMSCs的多向分化能力
成骨分化:P4代细胞以5×104/孔密度接种于6孔板，培养至80%汇合后，成骨诱导组更换成骨诱导培养液进行培养，对照组继续加入细胞培养液，每3 d换液，3周后终止培养。成骨诱导结束后细胞用4%多聚甲醛固定20 min,PBS漂洗3次，2%茜素红染色15 min,PBS漂洗3次，肉眼及镜下观察。
成脂分化:P4代细胞以5×104/孔密度接种于6孔板，培养至80%汇合后，成脂诱导组更换成脂诱导培养液进行培养，对照组继续加入细胞培养液，每3 d换液，4周后终止培养。成脂诱导结束后细胞用4%多聚甲醛固定20 min,PBS漂洗3次，加入PBS稀释的0.3%油红O溶液，室温染色10 min,PBS洗去浮色，肉眼及镜下观察。
1.4.2 流式细胞术检测表面标志物
取P4代细胞，常规消化、计数、离心，细胞用冷的Stain Buffer重悬，按测试每种抗体需要106个细胞的要求，将细胞分装至4个1.5 ml离心管中，4℃低温离心，用冷Stain buffer洗涤2次，分别与PE标记Stro-1、CD90、CD105、CD34单克隆抗体避光冰上孵育20 min，冷Stain buffer洗涤2次，加入二抗IgG，避光冰上孵育20 min，将细胞悬液过滤至流式细胞仪检测专用试管中，重悬后采用流式细胞仪进行细胞表面标志物鉴定。
1.5 不同浓度bFGF对GMSCs增殖能力的作用
实验分为6个组，实验组分别为含有0.5、1、5、10、20 ng/ml bFGF的培养液组，对照组为不含b FGF的培养液组，每组6个复孔。将P4代细胞以5×103个/孔密度接种于96孔板，于37℃、5%CO2培养。分别于1、3、5、7 d更换条件培养基，避光加入10μl CCK-8,37℃孵箱孵育3 h后将96孔板置于酶标仪内测定各孔吸光度值(A值)，检测各组细胞的增殖能力。终点时间为第9天
1.6 bFGF对GMSCs生长曲线的影响
实验分为2组，实验组为含有10 ng/ml浓度的bFGF培养液组，对照组为正常培养液。将对数生长期细胞经消化、计数后，按5×104个/孔的密度接种于6孔板中，37℃、5%CO2孵箱内培养，每3 d天换液1次。每天取3孔，计数各孔中细胞数。连续计数7 d。以培养天数为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞的生长曲线。
1.7 统计分析
相同实验条件重复3次，实验数据以表示，应用SPSS 19.0软件进行统计分析，同一时间点组间均数的比较以及同一组内部各时间点的比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD方法，显著性取α=0.05,P<0.05有统计学差异。
2 结果
2.1 GMSCs的分离培养鉴定结果
经酶消化法获得的人GMSCs呈典型的成纤维细胞状态，可稳定传代，传至5～6代形态均未明显改变。GMSCs具有克隆形成能力，经成骨及成脂诱导分化后，可形成矿化结节和脂滴(图1)。
流式细胞仪进行细胞表面标志物鉴定，结果显示STRO-1、CD105、CD90、CD34表达率分别为10.4%、99.8%、99.7%、1.3%(图2)。
2.2 b FGF对人GMSCs增殖能力的影响
CCK-8法检测结果显示，不同浓度bFGF均可促进GMSCs的增殖能力，尤其在第5、7、9天，各实验组GMSCs的A值均高于对照组(P<0.05，具有统计学差异)，其中浓度为10 ng/ml b FGF促进GMSCs的增殖能力作用最强(图3)。
A:克隆生长的GMSCs(×40);B:GMSCs成骨诱导后茜素红染色(×40);C:GMSCs成脂诱导后油红O染色(×100)
A:Clone of GMSCs(×40);B:ARS staining afer osteogenic induction for 3 weeks(×40);C:Oil red O staining after adipogenic induction for 4 weeks(×100)
2.3 b FGF对GMSCs生长曲线的影响
细胞生长曲线结果显示GMSCs在对数生长期增生活跃，加有10 ng/ml bFGF实验组的细胞比正常对照组的细胞提前进入平台期，细胞提前长满培养皿，生长停滞(图4)。
3 讨论
间充质干细胞具有自我更新以及多向分化潜能，在组织器官的发育以及损伤修复过程中发挥着重要的作用。GMSCs具有典型的间充质干细胞特性，有研究证实GMSCs可促进大鼠下颌骨缺损和颅骨缺损的骨组织再生[6]。除此之外，GMSCs具有显著的免疫调节和抗炎作用[1,7]。GMSCs自首次分离以来，因其来源广泛，取材方便，在再生医学领域有着广阔的应用前景，成为干细胞新的研究热点。而对于bFGF的研究则开始更早，且研究的更深[8]。选择合适的干细胞和生长因子，并确保后者对前者产生最佳的调控效果是再生医学研究的关键[9]。
本实验成功分离培养出了GMSCs。经鉴定GM-SCs具有成骨、成脂等多向分化能力，表达间充质干细胞特异性表面标记物CD105,CD90和STRO-1，不表达造血干细胞表面标志物CD34。
bFGF是含155个氨基酸的促有丝分裂的阳离子多肽，bFGF经证实可促进细胞增殖、趋化、成血管，有助于有丝分裂，并且对细胞的分化也起到重要作用。有研究表明，bFGF与牙髓干细胞、人根尖牙乳头细胞培养后，能促进间充质干细胞的增殖[10,11]。除此之外，bFGF已经发现作为分裂源和化学引诱物，不仅能促进脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞的增殖，在多向分化过程中，能促进血管生成、细胞迁移以及成脂分化。本实验主要研究bFGF对GMSCs增殖能力的影响，从结果可以看出，不同浓度的bFGF均能促进GM-SCs的增殖，在第5、7和9天时，浓度为10 ng/ml bF-GF对细胞的增殖能力最强，不依赖浓度的升高而增强。
综上所述，b FGF作为一种重要的细胞因子，其对细胞的作用是广泛而复杂的。本实验只是从一个方面来研究bFGF对GMSCs的影响，结果表明不同浓度的bFGF均能促进GMSCs的增殖。这将为GMSCs与细胞因子结合应用于组织再生提供了一定的研究基础。在今后的实验中还将从细胞分化、蛋白水平以及体内实验等方面进行更加深入细致的研究。
参考文献
[1]Zhang Q,Shi S,Liu Y,et al.Mesenchymal stem cells derived from human gingiva are capable of immunomodulatory functions and ameliorate inflammation-related tissue destruction in experimental colitis[J].J Immunol,2009,183(12):7787-7798.
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牙龈干细胞 篇4
关键词：牙龈卟啉单胞菌,血管内皮细胞,单核细胞,黏附
牙周炎是成人牙齿早失最主要的原因。牙龈卟啉单胞菌 (Porphyromonas gingivalis, Pg) 的感染与其发病关系密切, 是牙周炎的最主要致病菌之一[1]。
心血管疾病 (cardiovascular disease, CVD) 已成为威胁人类健康的主要杀手。动脉粥样硬化 (atherosclerosis, AS) 作为CVD的共同病理基础, 一直是人们研究CVD发病机制的突破口[2]。血管内皮细胞 (vascular endothelial cells) 黏附功能紊乱导致其与单核细胞发生聚集黏附是AS病变早期的关键性事件之一。尽管AS的许多传统危险因素业已明确, 然而并不能完全解释其发病情况, 应进一步寻找潜在危险因素[3]。
近年来有越来越多的证据表明牙周炎除了造成牙齿的松动脱落, 还是CVD的危险因素之一[4,5], 但具体生物学机制了解甚少。现已明确牙周炎时Pg可入血并侵入到血管壁中直接参与AS的发生发展[6,7,8,9,10,11]。那么Pg感染后是否对VEC与单核细胞的黏附产生影响则尚不清楚。本文通过建立Pg感染人脐静脉内皮细胞 (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) 的体外模型, 研究Pg感染HUVEC后对其与THP-1单核细胞黏附的影响, 为探讨Pg在牙周炎与CVD相关性中可能的生物学作用和机制奠定基础。
1 材料和方法
1.1 主要试剂
脑心浸液 (brain heart infusion, BHI) 培养基 (Bio Merieux, 美国) ;胎牛血清 (Gbico, 美国) ;高糖DMEM培养基和RPMI 1640培养基 (Hyclone, 美国) ;虎红 (Sigma, 美国) ;其他试剂均为国产或进口分析纯。
1.2 主要仪器
超净工作台 (苏州安泰) , 细胞培养瓶和细胞培养板、Crystal Spec比浊仪 (BD, 美国) , 细胞培养箱 (Sanyo, 日本) , 厌氧培养箱 (义乌冷冻机总厂) , HTS7000 Plus多孔板高效分析仪 (PE, 美国) 。
1.3 细菌培养
Pg381和Pg33277菌株由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供。将脱脂牛奶中冻存的以上菌株接种于BHI血琼脂平板 (含5 ml/100 ml脱纤维羊血、1 mg/100 ml维生素K1和1 mg/100 ml氯化血红素) 于37℃、80%N2、10%H2、10%CO2的专性厌氧条件下复苏和培养。取对数生长期的细菌接种于新鲜BHI液体培养基中培养48 h, 离心 (1 500 g, 5 min) , PBS洗涤2次后以DMEM培养基重新悬浮, Crystal Spec比浊仪调整菌悬液浓度。
1.4 细胞培养
HUVEC细胞株EA.hy926和人单核细胞株THP-1均由四川大学生物治疗国家重点实验室提供。EA.hy926于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中在37℃、5%CO2细胞培养箱中常规培养。THP-1于含10%FBS的RPMI 1640培养基中在37℃、5%CO2细胞培养箱中常规培养。
1.5 虎红染色法直接观察Pg对HUVEC与单核细胞黏附的影响
取生长旺盛的HUVEC制备细胞悬液 (2×108个/L) 按0.1 ml接种于96孔板, 待细胞汇合后以PBS洗涤2次, 分为实验组和对照组, 实验组分别加入浓度为2×1010CFU/L的Pg381和Pg33277菌悬液0.1 ml, 对照组加入空白细胞培养基0.1 ml, 孵育1.5 h后弃上清, PBS洗脱未黏附的细菌, 加入空白细胞培养基继续培养4.5 h和22.5 h, 当总的培养时间分别达到6 h和24 h时, 弃上清, 再次分为加THP-1细胞组与加空白RPMI 1640培养基组:加THP-1细胞组每孔加入THP-1细胞悬液0.2 ml (1×109个/L) , 孵育40 min后轻轻吸弃未黏附的细胞, 并用PBS洗涤3次, 每孔加入0.25%虎红溶液0.1 ml, 室温放置5 min, 吸弃游离虎红, 再以PBS洗涤3次后每孔加入50%乙醇溶液0.2ml, 室温放置1 h使单核细胞所吸收的虎红染料充分释放, 多孔板高效分析仪测定各孔A570nm值, 各实验组单核细胞黏附量相对值=A实验组- (A空白对照加THP-1组-A空白对照未加THP-1组) -A实验组未加THP-1组。实验采用复孔设计, 重复3次。
1.6 统计学分析
应用SPSS 13.0软件完成统计学处理。所有数据均代表3次实验的结果, 以±s表示。多个样本的比较采用单因素方差分析, P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞的培养
EA.hy926细胞每3~4 d传代1次, 细胞生长状态好, 可见突起、伪足, 呈铺路石样分布 (图1A) 。单核细胞呈圆球形悬浮状生长 (图1B) 。
2.2 Pg感染后HUVEC与单核细胞黏附的影响
6 h时Pg381感染组的THP-1细胞黏附量相对值为0.210±0.025, 高于Pg33277感染组 (0.078±0.024, P<0.05) 和空白对照组 (0.062±0.022, P<0.05) , Pg33277侵入组较阴性对照组略高, 但差异无统计学意义 (P=0.183) ;24 h时Pg381感染组、Pg33277感染组和空白对照组的THP-1细胞黏附量相对值分别为0.075±0.017、0.073±0.017和0.062±0.022, 3组间无显著差异 (P=0.309) 。表明Pg381侵入HUVEC后显著地增强其黏附功能, 促进其与THP-1细胞的黏附, 但Pg33277此作用则不明显 (图2) 。
3讨论
尽管CVD的许多传统危险因素, 如高胆固醇血症、高血压和肥胖等业已明确, 但这只能解释50%~75%的CVD发病原因, 仍有25%~50%CVD的发病原因不明[3]。近年来, 越来越多的证据表明牙周炎与CVD密切相关, 是其独立危险因素之一。本课题组[4]、Nesse等[5]经过大样本的追踪调查, 在校正了各种偏倚后发现牙周炎患者冠心病的发病率显著升高, 牙周炎与冠心病之间呈现中等强度的相关。这一结论也得到了众多临床干预研究的证实[12,13,14]。
目前研究已提示, 牙周炎时原本定植于人类口腔的Pg可通过牙周袋软组织壁溃疡面入血而直接侵入血管壁, 参与AS的发生发展。Marcelino[6]、Figuero[7]、Toyofuku[8]和Nakano等[9]在CVD患者的AS斑块中检出Pg DNA, 检出率从26%到100%不等。Li[10]和Pereira[11]证实Pg感染均可加速AS动物模型-Apo E基因敲除小鼠主动脉的AS病变发展, 且在其主动脉AS斑块内均有Pg DNA检出。在另外的前瞻性研究中还发现循环血液中Pg抗体水平与未来发生CVD的风险呈正相关[15]。此外本人前期研究已证实, Pg具有较强黏附和侵入HUVEC的能力[16]。
CVD的共同病理基础-AS的发病机制极其复杂, 现已证明循环血液中的单核细胞黏附聚集于VEC表面, 并迁入动脉内膜下吞噬脂质而成为泡沫细胞, 最终导致AS的形成。其中, 血管内皮细胞黏附功能的紊乱导致单核细胞与其发生黏附在AS早期病变中发挥重要作用, 有众多黏附分子参与介导VEC与单核细胞的黏附[3]。此前Hirose[17]研究发现Pg381菌毛蛋白促进HUVEC与人单核细胞株U937的黏附, 较空白对照组增加约3倍。然而目前对于Pg感染血管内皮细胞后对其黏附功能是否产生影响则仍不甚清楚。
本文采用了虎红染色法进行研究。虎红染色法是Gamble根据白细胞对虎红染料的吸收特性而建立的一种用于定量测定内皮细胞与单核细胞黏附的方法[18]。由于虎红可被单核细胞吸收, 且不受其活化与否的影响, 而VEC对虎红的吸收则很少。用虎红溶液与单核细胞孵育一定时间后用乙醇溶液将单核细胞所吸收的虎红释放出来, 通过测定溶液的A值, 即可间接反映所黏附单核细胞的数量。
本研究发现Pg381与HUVEC共孵育6 h后, 能够显著增强HUVEC与单核细胞的黏附, 较空白对照组增加了约2.4倍, 而Pg33277的作用则很微弱。镜下观察也进一步证实:Pg381感染组较空白对照组的THP-1细胞黏附明显增加, 而Pg33277感染组则与空白对照组类似。
本研究还发现, 不同的Pg菌株诱导HUVEC黏附功能变化的能力不同, Pg381较Pg33277显著促进HUVEC与单核细胞的黏附。虽然本人的前期研究已证实Pg33277可以侵入HUVEC, 然而并未对HUVEC的黏附功能产生影响。提示Pg感染上调血管内皮细胞黏附功能的能力与Pg的菌株和毒力有关。Gibson[19]的研究也得出类似的结论:通过口腔将Pg菌毛缺陷株DPG接种于apo E基因敲除小鼠, 发现DPG能侵入小鼠主动脉壁, 但其主动脉AS病变程度与空白对照组间无差异。
牙龈干细胞 篇5
1材料与方法
1.1样本制备材料和设备
4英寸的硅片,腐蚀液( 3HF ∶ 6NH4F ∶ 10H2O) ,光刻胶,清洗液( 4H2SO4+ H2O2,NH4OH + H2O2+ 5H2O, HNO3+ H2O2+ 5H2O) ,氧化4470四管微控制扩散系统,Karlsuss MA6 /BA6光刻键合对准机,双管等离子体去胶机-DQ-500,JS-3X-100B磁控溅射台,Dektak3 Series膜厚测量仪。环境扫描电镜( ES-EM) : XL30 ESEM-TMP,Philips-FEI。
1.2细胞培养、电镜观察细胞黏附形态的材料及设备
DMEM低糖培养液( Gibco,美国) ,胎牛血清FBS( Hy Clon,美国) ,0. 25% 胰蛋白酶( Gibco,美国) ,专用电镜固定液: 3. 7% 戊二醛 - 1. 5% 多聚甲醛( G5882, 16005,Sigma) ,临界点干燥仪( Leica EM CPD300) ,场发射扫描电镜( Nova Nano SEM 230 FEI) 。
1.3实验方法
1. 3. 1样本制备的方法湿法蚀刻步骤,硅片上制备钛表面的沟槽,具体步骤如图1A最后在材料表面溅射200 nm Ti。不同组别沟槽的剖面示意图如图1B表示,沟槽的剖面为倒梯形,沟槽侧壁与顶部交角为54. 74°。根据各组材料沟槽的宽度和深度,分组命名为: T0,T15 /5,T15 /10,T30 /5,T30 /10,T60 /5,T60 / 10。
1. 3. 2各向异性微沟槽形貌的表征环境扫描电镜 ( ESEM) ,放大倍数为1 000倍观察表面微沟槽的正面和侧面形貌,同时测量微沟槽的深度和宽度。
1. 3. 3细胞在材料表面的黏附形态观察细胞接种前材料( 1 cm × 1 cm) 消毒: 丙酮超声3 min,100% 酒精浸泡2 h,灭菌超纯水清洗,无菌镊子夹入24孔板中,紫外照射30 min。每个孔接种HGF 5 × 104个( 原代培养[2],第6代接种) ,细胞培养时间为1 d,将材料片夹出,纯水轻轻冲洗2遍后专用的电镜固定液: 3. 7% 戊二醛 - 1. 5% 多聚甲醛固定15 min,蒸馏水洗2 ~ 3次,2 min / 次,脱水: 30% 、50% 、70% 、90% 、 95% 、100% 酒精逐级脱水,每次3 min; 临界点干燥,喷金扫描,500和5 000倍场发射SEM观察拍照。
1. 3. 4HGF在材料表面的增殖效率检测材料 ( 1 cm × 1 cm) 放入24孔板同前消毒,每孔接种1 × 104个细胞,加入1 ml DMEM培养液,6 h,1、3、5、7d时间点进行测量,相应的时间点用镊子取出材料片,将材料片移入新的24孔板,PBS轻轻冲洗2次,每孔加500 μl培养基,设置一孔不含钛片的培养基,每个孔加入50 μl CCK-8孵育2 h,每个孔吸出200 μl加入新的96孔板中, 孔板周围用培养液充填; 酶标仪测量 ( 450 nm) 吸光度值,每组材料重复测量3次。所得A值采用SPSS 17. 0统计软件,单因素方差分析,组间统计SNK-q test进行两两比较,P < 0. 05差别有统计学意义。
2结果
2. 1各向异性微沟槽形貌的表征
观察不同宽度和深度的微沟槽表面呈现规则的各向异性排列走向,沟槽宽度和间隔尺寸如图2,利用扫描电镜测量各组沟槽的宽度,间隔和深度,各组沟槽表面尺寸均符合原始设计尺寸要求[2]。
2. 2扫描电镜图像下细胞在不同宽度和深度沟槽表面的黏附生长
细胞无规则排列,沟槽表面细胞顺着沟槽排列 ( 图3) ,观察细胞和沟槽的比例关系( 图3) ,T15组细胞跨过沟槽生长且很难进入槽沟,T30组细胞能够进入槽沟生长且与沟槽侧壁尚有间隙,而T60组细胞轻松进入槽沟生长且留有更大空间让更多细胞进入生长,为更多细胞提供更多生长空间。
2. 3HGF在不同宽度和深度微沟槽表面 的增殖 ( CCK-8)
相同时间点各组材料表面增殖结果的比较( 图4) 。黏附6 h: T60沟槽表面吸光度值大于其他组,在黏附第1天: T30,T60组的增殖高于T15,T15组与T0组差异不大,在相同宽度下深度不同对细胞增殖差异影响没有统计学意义( P > 0. 05) ,随着时间推进,进入第3天后,随着宽度的增加细胞增殖加大,T60组的增殖水平明显高于其他( P < 0. 001) ,高度对增殖水平的影响表现为,在窄的沟槽T15组深度越大增殖越弱,而宽的沟槽组( T30,T60) 深度越大增殖越强,这种趋势到了第5天更加明显。进入第7天这种趋势保持,不同的是T15组A值低于T0有统计学意义,其中T15 / 10 A值最低。每组材料随着时间推移增殖的比较: 从6 h到第5天各组材料表面随着时间的推移细胞逐渐增殖,到了第7天,T0,T15 /5,T15 /10增殖下降,均少于第5天的水平,下降的趋势以T15 /10最为显著; T60 /5,T60 /10仍保持较高的增殖水平。
3讨论
3.1沟槽形貌应用于种植体穿龈部位形貌的设计
研究认为[3,4]实现“接触诱导”效应的关键是形貌的尺寸应小于目的细胞本身,本实验选用的宿主细胞为HGF,完全铺展后约100 μm,为了保证“接触诱导”效应的实 现,沟槽宽度 确定为15、30、60 μm。 Clark[4]比较沟槽的深度对“接触诱导”效应中发现,随着沟槽深度增加( 1、5、10 μm) “接触诱导”现象越明显,此外Mrksich[5]研究发现在V形沟槽底细胞无法良好的贴覆而是跨过生长,因此沟槽深度设计上有所控制,沟槽形态为倒梯形( 图1A) ,5 μm和10 μm的深度能够保证有较宽的沟槽底部有利于细胞在此部位贴覆生长。
3.2HGF在不同宽度和深度微沟槽表面的黏附形态
1952年Weiss等[6]首先提出了“接触诱导”现象, 当黏附表面有台阶存在时,细胞很难跨过在有台阶的表面生长,而受到边界的限制延长转而高度极性化生长,不同的细胞对不同的微环境( 表面形貌形态和尺寸) 有不同的反应[7]。细胞黏附于光滑的表面,细胞骨架以细胞核为中心向四周伸展,而细胞所在沟槽环境则存在的“边界效应”影响,细胞膜受到边缘交线的顶起,感受到周围沟槽边缘嵴即落差后转换为环境对自身的力学作用,进而调整其自身顺着平面生长而躲避落差环境。本实验中不同沟槽的宽度和深度对细胞都成功起到了“接触诱导”效应,T60组为细胞提供更多生长空间的同时也保证了诱导细胞顺着沟槽生长。
3.3HGF在不同宽度和深度微沟槽表面的增殖
影响细胞黏附增殖的主要因素[8,9]包括了表面的化学成分、表面形貌、粗糙度以及亲水性。HGF更适于在光滑还是粗糙形貌表面附着还存在争议,Att[10]研究认为酸蚀粗糙的表面相比机械切割表面有利于HGF的贴覆生长,Kim[11]也认为粗糙的表面有利于形成更稳固的结缔组织附着,并建议用在种植体穿龈部份,而Abrahamsson[12]比较光滑表面与酸蚀处理表面证明种植体周软组织对表面的附着能力不受材料表面粗糙度的影响。本实验结果表明所有沟槽表面HGF黏附从6 h ~ 5 d都显示出比光滑表面较好的增殖趋势,可见沟槽形貌在一定时间内有利于细胞黏附增殖, 可能由于微沟槽的“接触诱导”导致的细胞有序排列, 增加了细胞的生长空间。沟槽形貌表面HGF的增殖决定于沟槽的尺寸与HGF的大小比例所决定的细胞生长空间的提供,T15沟槽的表面减少了细胞增殖的时间,增殖幅度也不如宽度大的沟槽明显,主要是因为随着细胞伪足的伸展,对于100 μm左右的HGF,15 μm宽度的沟槽过于狭窄,细胞无法进入槽沟生长生长空间相对减少。因此出现到细胞增殖的第7天, T15 /5,T15 /10组表面细胞数量下降,可能是由于生长空间有限导致细胞生长达到饱和进而产生接触抑制的结果,同时T15 /10可能由于窄而深的沟槽不利于细胞黏附,导致黏附第7天增殖大幅下降。
细胞增殖的结果一方面与三维空间关系密切,另一方面与表面的亲水性有关,本研究结果与大多数研究结果相似[13,14]: 材料表面的亲水性能增加材料表面细胞的黏附增殖。各组材料亲水性测试结果显示[2]随着沟槽的宽度变窄和深度增加材料表面的疏水性显著增大,T60组的接触角小于其他宽度的微沟槽表面, 且T60 /5的接触角最小亲水性最好,T15 /10接触角测量值最大为疏水性最强,甚至大于光滑组T0。黏附6 h,T60沟槽表面A值大于其他各组材料表面,与T60材料表面亲水性较大有直接关系,然而虽然T60 /5亲水性最好,但黏附后期的增殖水平小于T60 /10,可能由于表面形貌的影响程度超过了亲水性,较深的沟槽提供了更多的生长空间相对于亲水性促进黏附的影响更大,因此T60 /10组增殖结果最强。T15组最为疏水,其中T15 /10上方细胞的增殖效率最差,除了沟槽过窄导致的生长空间相对有限外,还与T15 /10组最为疏水有一定的关系。
综合以上: 本实验设计的沟槽尺寸均成功的诱导细胞顺着沟槽生长,T15组因沟槽间隔较窄,细胞跨过沟槽表面无法进入沟槽之间生长,随着沟槽宽度的增加,T60组细胞自由进入沟槽生长且保持“接触诱导” 效应,即沟槽宽度和深度的增大均有利于细胞的增殖。 就“接触诱导”及细胞增殖而言,T60 /10建议作为种植体穿龈部分的沟槽尺寸,当然最终穿龈部位沟槽尺寸的确定还要其他更为详实的实验支持。
摘要：目的:观察微沟槽形貌对人牙龈成纤维细胞(HGFs)黏附形态和增殖的影响。方法:在钛表面设计不同沟槽尺寸,利用光刻技术制作微沟槽形貌,沟槽宽度与间隔分别为15、30、60μm,沟槽的深度为5μm和10μm,分组为T15/5,T15/10,T30/5,T30/10,T60/5,T60/10,光滑钛(T0)表面为对照组,环境扫描电镜(ESEM)观察各组材料表面微沟槽形貌,接种HGFs后,通过扫描电镜和CCK-8实验观察分析不同沟槽尺寸上方细胞黏附和增殖差异。结果:T0组表面细胞排列不规则,其余组沟槽表面细胞均顺着沟槽排列,T60/10组沟槽表面细胞的增殖幅度最大,增殖时间最长。结论:本实验所设计的沟槽尺寸均能成功诱导细胞顺着沟槽排列,随着沟槽的宽度增加深度增大越有利于促进细胞增殖。
牙龈干细胞 篇6
1 临床资料
患者1, 姜某, 男, 52岁。以“左下后牙区牙龈瘤术后复发1个月”入院, 查体:心、肺、腹未触及异常, 专科检查示左面下略隆起, 张口度正常;左下第二前磨牙及第一、二磨牙缺失, 牙槽嵴可见一大小约2.5 cm×1.2 cm×1.0 cm的紫红色增生物, 呈结节状, 表面有齿咬痕, 界清, 质软, 无触压痛。X线示病变区骨影呈毛玻璃状, 其余无特殊。完善术前检查后行“左下后牙区牙龈肿物并下颌骨方块切除术”, 术中见肿物以纤维样成分为主, 伴砂样体;术后病检报告:纤维性牙龈瘤, 生长活跃, 部分区域钙化伴感染。经治疗愈合后出院。出院后3个月患者以“肿物复发”再次入院, 入院后行肿物扩大切除活检术, 术后病检为恶性骨母细胞瘤。因病变有口底及颌下侵袭, 待患者全身情况好转后, 行“左侧下颌骨节段性截除加根治性颈淋巴清扫术”。术后患者恢复良好, 定期行化疗维持治疗并随诊。
患者2, 李某, 女, 35岁。以“左上后牙区钝痛并牙龈增生牙体松动半年余”入院, 入院前曾行局部活组织病检, 诊断为牙龈纤维瘤。入院后查体:心、肺、腹及四肢无异常;专科检查示左面颊略隆起, 无触压痛;口腔内左磨牙后区可见一粉红色颊腭向增生物, 颌面有齿咬痕, 大小约3.0 cm×2.0 cm×1.5 cm, 质地韧;17Ⅲ度松动, 16Ⅱ度松动, 其余无特殊。X线示:左侧上颌骨磨牙区骨影模糊, 牙周间隙增宽, 无明显骨反应带。常规生化检查及胸片未见异常。行“左侧磨牙区牙龈增生物扩大切除并左下第一、二磨牙拔除术”, 术中见肿物为大量纤维组织构成, 出血多。病检诊断:牙龈纤维瘤, 患者术后痊愈出院。出院后第3周患者再次因“术区肿物复发伴左眼复视并持续低热”入院, 复查术后病理切片, 并行免疫组化, 确诊为恶性骨母细胞瘤。因复查胸片已发现肿瘤肺部转移且有恶病质表现, 故给予化疗姑息治疗, 随诊。
2 讨论
骨母细胞瘤是一种较少见的肿瘤, 类似骨肉瘤, 约占所有骨肿瘤的1%, 脊柱及四肢骨好发, 发生于颌骨者罕见[1]。本病病因不清, 有研究认为是非化脓性感染反应所致, 或与病毒感染及血管变异有关[2]。以前曾被命名为“成骨性纤维瘤”、“巨型骨样骨瘤”, 目前已弃用。1956年Jaffe[3]、Lichtenstein[4]首次将本病与骨化性纤维瘤、骨纤维组织细胞瘤和骨纤维结构不良等病变从临床病理上区别开来, 并命名为骨母细胞瘤, 被大家所接受。在早期人们一直认为它是一种良性肿瘤但自20世纪80年代以后, 陆续有恶性肿瘤征象的报道[5,6], 临床逐渐考虑其恶性病变的潜质, 将其定为交界瘤, 治疗以手术和化疗为主[7]。
下颌骨骨母细胞瘤较罕见, 总结文献[3-5, 8], 肿瘤具有如下临床特点:发病男性多于女性, 大约为2∶1;青壮年好发, 病程长短不一, 肿瘤大小1~11 cm;患者常有牙体疼痛松动或局部钝痛史, 随之增长局部骨体可见变形, 可侵袭口腔软组织;因发病位置不同还可表现为张口度受限, 唇部麻木。组织病理方面:肿瘤组织结构疏松, 由大量增殖的骨母细胞、排列规则的骨样组织和富含血管的间质构成, 部分区域含有丰富的纤维细胞;其间骨母细胞大小不一, 细胞没有不典型增生及核分裂;根据骨样组织钙化不同肿瘤大体表现为质地坚实﹑坚硬或柔软, 甚至囊性变。X线表现:肿瘤偏心性生长, 下颌骨病变区呈毛玻璃样致密影, 可见不同程度钙化, 有时可见囊性影;周边偶尔可见不连续骨皮质反应带。恶性骨母细胞瘤的组织学结构与良性骨母细胞瘤基本相似, 良性骨母细胞瘤一般不见异型的巨型上皮样骨母细胞, 不呈侵袭性生长, 细胞核分裂象罕见[4,9]。临床手术较易短期复发。
由于下颌骨骨母细胞瘤较为少见, 恶变者更罕见, 且口腔内的表现无典型特征, 很容易造成临床误诊。本文中笔者报道的2例均于首诊时误诊为牙龈纤维瘤, 分析误诊原因大体有如下几点: (1) 本专业范围内对疾病不熟悉或不了解是对之缺乏足够警惕并误诊的主要原因。 (2) 对本病的临床特点认识不足而致误诊。国内外报道[9,10,11]除牙体疼痛松动或面区钝痛以及局部颌面部变形有其共性外, 很少有首诊口腔内牙龈瘤样增生的报告, 本文所述2例首诊时均有牙体疼痛及局部咬合不适的症状, 查体有以多个牙为中心的牙龈增生, 牙体松动;增生软组织质地偏软, 色红。如果不行X线检查, 当病变局限时很易与牙龈增生﹑牙周炎及牙源性感染相混淆。 (3) 肿瘤X线表现无特征性变化, 对之缺乏认识, 致X线误诊。本病X线表现为无特征性变化, 发生在牙体周围的瘤体仅有以根周为中心的类圆形骨质破坏区, 边界欠清, 大小平均直径约2.7 cm, 呈絮状影, 与根周骨髓炎变化相似。 (4) 临床病理表现具有多样性, 易误诊[2,4,5,12]。骨母细胞瘤曾被命名为“成骨性纤维瘤”、“巨型骨样骨瘤”, 说明其病理组织学很复杂, 不易作诊断。本病病理成分除骨母细胞外还有丰富的血管、大量疏松纤维及骨样组织, 每种成分所占比例不同, 其组织学图谱也不尽相同, 如果组织切片单一表浅, 特别是瘤体恶变, 突破骨皮质进入软组织内, 则很可能只反应出纤维瘤样增生的临床病理变化, 加之临床思维贯性的影响, 易导致误诊。而本组中2例术前及术后病检均诊断为牙龈纤维瘤, 这是因为纤维性牙龈瘤的病理表现也包括大量纤维、毛细血管及骨样增生物。
骨母细胞瘤误诊常给医患双方带来痛苦和压力, 为防止肿瘤误诊对临床工作带来的不便, 笔者认为应注意以下几点: (1) 提高临床对可疑病例诊断的判断力。如不明原因颌面部钝痛或牙痛, 病程较长, 病变范围较大, 伴对应区软组织增生和骨组织影像学变化者, 应高度重视。本组2例患者均具有上述特点。而笔者发现骨质病变与牙体的关系不具有鉴别诊断的意义, 肿瘤与牙根可以相关也可无关, 这一看法同Borello等[10]的研究。 (2) 临床病理诊断要慎重, 对可疑病例应广泛切片, 反复对比阅片, 行免疫组化进行判断。此外, 临床医生在提送病理申请单时, 应尽量做到临床描述可靠, 体征突出, 避免经验性诊断以免误导病理诊断。 (3) 骨母细胞瘤良恶性判断要积极。由于骨母细胞瘤的发生有不同阶段, 各阶段病理特点不尽相同;组织学图像表现是良性, 结果转化为恶性及骨肉瘤者不在少数, 而肿瘤良恶性判断的错误也将给患者的治疗带来无法弥补的损失。因此, 骨母细胞瘤良恶性诊断应积极结合临床及病理综合判断。为便于诊断, 笔者认为具有如下特点的下颌骨母细胞瘤应考虑其恶性本质: (1) 具有骨母细胞瘤病理特点, 肿瘤囊外侵袭, 特别是病理片中见到异型巨型上皮样骨母细胞, 核异染、核分裂密度大者。 (2) 有复发病史者。 (3) 肿物体积较大, 呈侵袭性生长, 侵犯口腔软组织者。 (4) X线表现为恶性骨肿瘤征象者。 (5) 无法解释的牙体移位松动。符合上述特点的肿瘤应高度考虑其恶性变。而本组中2病例基本符合上述恶性骨母细胞瘤的判断。
牙龈干细胞 篇7
1 材料与方法
1.1 主要试剂、仪器和设备
人THP- 1单核细胞株 (ATCC, 中国科学院上海生命科学研究所传代分装) 、oxLDL (协和医科大学生化教研室) 、P. gingivalis LPS (Invivogen Corporation, 美国) 、胆固醇/胆固醇脂/游离胆固醇测定试剂盒 (Merk, 德国) 、油红O (Sigma, 美国) , 鼠抗人NF- κB p65单克隆抗体 (Santa Cruz, 美国) 、抗鼠Envision系统 (Dako) 、兔抗人IκB- α单克隆抗体 (Upstate Biotechnology, 美国) , 抗兔二抗和β- actin (42 000, 上海康成) 、荧光倒置相差显微镜 (Olympus) 和生物安全柜 (上海力申科学仪器有限公司) 。
1.2 细胞培养
1.2.1 单核细胞向巨噬细胞分化
人THP- 1单核细胞为悬浮细胞, 以含10%胎牛血清的RPMI 1640为基础培养基, 37 ℃、5% CO2培养箱中培养扩增。此后接种在孔板内, 以终浓度为160 nmo1/L的乙酸肉豆蔻佛波醇酯 (Phorbol 12- myristate 13- acetate, PMA) 诱导36 h使其形成巨噬细胞, 后换无血清RPMI 1640培养24 h同步化。
1.2.2 巨噬细胞向泡沫细胞分化
50 μg/ml oxLDL作用巨噬细胞48 h后, 利用油红O染色鉴定胞内脂质沉积, 酶法检测胞内胆固醇酯含量, 从而鉴定泡沫细胞形成。
1.3 实验分组
为研究P. gingivalis LPS对巨噬细胞吞噬oxLDL形成泡沫细胞过程中NF- κB信号通路的影响, 巨噬细胞按下面分组加入培养液:
空白对照组:基础培养基; oxLDL组:基础培养基+50 μg/ml oxLDL; oxLDL+ LPS组:基础培养基+50 μg/ml oxLDL+1 μg/ml P. gingivalis LPS。
为研究P. gingivalis LPS对泡沫细胞形成后NF- κB信号通路的影响, 巨噬细胞先以50 μg/ml oxLDL诱导48 h形成泡沫细胞, 然后按下面条件培养:
oxLDL48h组:基础培养基+50 μg/ml oxLDL;oxLDL48 h+LPS组:基础培养基+1 μg/ml P. gingivalis LPS。
1.4 免疫细胞化学检测P. gingivalis LPS对泡沫细胞中NF- κB p65亚单位核转位的影响
将细胞以每孔2 ml含5×105 个细胞接种于预先放置无菌盖玻片的6 孔板中, 每组3 个复孔。各组细胞相应刺激0、 30 min、1、2、4 h, 采用免疫细胞化学法按说明书步骤检测NF- κB p65核转位情况。每张细胞爬片计数400 个细胞, 计算核转位阳性细胞所占比率。
1.5 Western blot 检测P. gingivalis LPS对泡沫细胞中IκB- α含量的影响
取生长良好的细胞, 按每皿5 ml含3×106 个细胞接种于60 mm培养皿中, 每组3 个复皿。各组细胞相应刺激2 h后, 采用胰酶消化+机械刮除法收集细胞;蛋白抽提和定量后使用SDS- PAGE分离总蛋白, 并转移至硝酸纤维素膜, 在5% BSA溶液中室温孵育1 h以封闭膜上的非特异结合;冲洗后将封闭过的膜加入兔抗人IκB- α单克隆抗体4 ℃过夜, 抗原抗体结合;冲洗后加入HRP标记的抗兔二抗, 室温孵育1 h;将膜置于化学发光试剂盒反应液中室温孵育3 min, 显影后以X线胶片曝光; ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化, 并与内参β- actin灰度比值。
1.6 统计分析
所有图片及表格的数据均使用实验undefined显示, 采用单因素方差分析分析组间是否存在差别, 如存在差别时采用LSD法进行2 组之间的比较。P<0.05时认为组间具有统计学差异。
2 结 果
2.1 巨噬细胞及泡沫细胞模型的建立
人THP- 1单核细胞经PMA诱导48 h后, 分化为贴附牢固的角形和多角形巨噬细胞 (图 1A) ;巨噬细胞经50 μg/ml oxLDL诱导48 h, 油红O染色可见胞内红染脂滴 (图 1B) , 酶法检测显示胞内胆固醇酯含量达 (61.4±1.9) %。根据定义, 胞内胆固醇酯占总胆固醇含量的50%以上即为泡沫细胞。
A:巨噬细胞 (×200) ; B:泡沫细胞 (×400)
2.2 P. gingivalis LPS作用时间对泡沫细胞NF- κB核转位的影响
巨噬细胞中NF- κB未激活时, 集中于胞质, DAB显色后胞质呈棕黄色, 细胞核不着色, 呈典型的空泡状;NF- κB发生核移位后, 细胞核着色呈“实心状” (图 2A～C) 。第15 min时在各实验组即可见到明显的核转位, 2 h时达高峰, 4 h时仍可见;1、 2、 4 h时oxLDL和LPS共同刺激与oxLDL单独刺激相比, NF- κB核转位增高 (P<0.05) 。在泡沫细胞中加入P. gingivalis LPS后, 各时间点均能促进NF- κB p65核转位 (P<0.05) (图 3) 。
基础培养基 (A) 、基础培养基+50 μg/ml oxLDL (B) 和基础培养基+1 μg/ml P. gingivalis LPS+50 μg/ml oxLDL (C) 刺激2 h时免疫细胞化学检测p65核转位情况
Basic culture (A) , basic culture+1 μg/ml P. gingivalis LPS (B) , basic culture+50 μg/ml oxLDL and 1 μg/ml P. gingivalis LPS (C) were added into macrophage culture for 2 h, and NF- κB p65 translocation were detected by immunocytochemistry
2.3 P. gingivalis LPS浓度对泡沫细胞NF- κB p65核转位的影响
P. gingivalis LPS与50 μg/ml oxLDL共同刺激时, 核转位率随P. gingivalis LPS浓度升高而增高, 10 μg/ml LPS与其他浓度相比能提高30%的核转位率 (P<0.05) (图 4) 。
2.4 P. gingivalis LPS同oxLDL共同刺激对巨噬细胞IκB- α的影响
Western blot检测显示:在刺激2 h时, 1 μg/ml LPS与50 μg/ml oxLDL共同刺激能显著降低细胞质内IκB- α的水平 (P<0.05) (图 5) 。IκB- α水平降低, 意味着NF- κB核转位增高, 这就确认了细胞免疫化学检测中oxLDL和P. gingivalis LPS共同刺激能促进更高的NF- κB核转位。
2.5 P. gingivalis LPS同oxLDL共同刺激与巨噬细胞内IκB- α变化的时间效应关系
1 μg/ml LPS与50 μg/ml oxLDL共同刺激后, 在30 min到2 h期间, IκB- α水平逐渐下降, 4 h时有微弱上升 (图 6) 。
2.6 不同浓度P. gingivalis LPS与oxLDL共同刺激巨噬细胞内IκB- α变化
10、 100 ng/ml、 1、10 μg/ml P. gingivalis LPS与50 μg/ml oxLDL共同刺激2 h后细胞质内IκB- α检测显示, P. gingivalis LPS浓度对IκB- α未见显著影响 (图 7) 。
2.7 P. gingivalis LPS对泡沫细胞形成后IκB- α的影响
oxLDL作用48 h形成泡沫细胞后, 细胞质内IκB- α较oxLDL刺激2 h时明显上升。泡沫细胞中加入P. gingivalis LPS 2 h后, IκB- α水平下降, 不同浓度P. gingivalis LPS刺激2 h时, 10 ng/ml LPS作用较100 ng/ml、1 μg/ml、10 μg/ml LPS作用小 (P<0.05) , 而后三者之间没有差别 (图 8) 。
3 讨 论
炎症是AS发生和进展的重要原因, 细菌和病毒的感染可能参与了这个过程[4]。牙周局部感染来源的LPS可能与血浆中LPS结合蛋白 (LPS- binding protein, LBP) 结合, 然后呈递至巨噬细胞表面受体CD14和Toll样受体, 膜受体的改变会导致IκB激酶的激活, 导致IκB的磷酸化或者蛋白降解[5], 从而使NF- κB二聚体从IκB中脱离, 然后转移到细胞核内启动一系列因子的转录。
A:oxLDL 2h;B:oxLDL 50h;C:oxLDL 48h+10ng/mlLPS;D:oxLDL 48h+100ng/mlLPS;E:oxLDL 48h+1μg/mlLPS;F:oxLDL 48h+10μg/mlLPS.“*”:vsoxLDL 50h, P<0.05
在正常情况下, 无活性的NF- κB大多以p65- p50- IκB三聚体的形式存在于细胞质中, 其中IκB为抑制性亚单位, 在刺激剂作用下, IκB磷酸化降解, 激活的NF- κB迅速移入细胞核, 与靶基因上启动子区域的κB序列发生特异性结合, 从而启动相应基因转录和蛋白质表达[6]。因此检测细胞内NF- κB p65核移位及IκB含量变化可以反映NF- κB激活的情况[7]。实验结果显示oxLDL能够促进巨噬细胞中IκB- α的降解, 导致p65核转位, 从而启动多种免疫和炎症反应的基因表达, 如VCAM- 1、ICAM- 1、IL- 1、IL- 6、IL- 8及TNF等, 这与Ares 等的报道一致[8]。
LPS是牙龈卟啉单胞菌重要的致病因子, 实验结果显示oxLDL和P. gingivalis LPS共同刺激能促进细胞质内IκB- α进一步降解, p65- p50- IκB三聚体解离, p65核转位率进一步提高, 促进NF- κB通路激活, 从而加速动脉粥样硬化进展。与我们的结果相反, Ares等[8]报道重度氧化LDL抑制了LPS诱导的NF- κB核转位, 这种结果的差异主要原因可能在于oxLDL的氧化程度不同。
LPS作为P. gingivalis细胞膜表面主要致病成分, 可以激活内皮细胞和巨噬细胞促炎转录因子NF- κB的活性。Nakamura[9]报道P. gingivalis LPS 长时间作用会促进单核细胞黏附到血管内膜, 其机制是通过TOLL样受体- 2介导, oxLDL预孵化会导致LPS诱导的NF- κB激活的显著变化。有学者对修饰性LDL和E.coli源性LPS与宿主单核/巨噬细胞的相互作用进行了研究, 结果表明E. coli LPS对oxLDL预刺激的巨噬细胞的分子和基因表达具有一定影响[10]。我们的实验证实:P. gingivalis LPS不仅能促进巨噬细胞和泡沫细胞中NF- κB的显著激活, 而且P. gingivalis LPS诱导巨噬细胞和泡沫细胞中NF- κB的核移位与浓度具有一定的依赖关系, 10 μg/ml P. gingivalis LPS效应最强, 而10 ng/ml P. gingivalis LPS促进IκB- α降解作用最弱。
摘要：目的:研究牙龈卟啉单胞菌脂多糖 (Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide, P.gingivalisLPS) 在氧化低密度脂蛋白 (oxidized low density lipoprotein, oxLDL) 刺激巨噬细胞形成泡沫细胞过程中和形成泡沫细胞后对NF-κB信号通路的影响。方法:用oxLDL诱导THP-1人单核细胞源性巨噬细胞形成泡沫细胞, 在巨噬细胞和泡沫细胞中加入P.gingivalisLPS和oxLDL, 利用免疫细胞化学技术检测NF-κB p65亚单位核转位情况, Western blot检测细胞质内IκB-α变化。结果:P.gingivalisLPS能促进巨噬细胞和泡沫细胞中p65亚单位核转位, 在2h时达到最高水平;也能降低细胞质内IκB-α水平, 在2h时达到最低水平;在2h时, 10μg/ml比10、100ng/ml、1μg/mlP.gingivalisLPS更能提高p65核转位率。结论:P.gingivalisLPS可以促进泡沫细胞形成过程中和形成后NF-κB信号通路的激活, 促进动脉粥样硬化进展。
关键词：牙龈卟啉单胞菌,脂多糖,核因子,泡沫细胞
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