体细胞变异（通用4篇）
体细胞变异 篇1
摘要：沉水樟是亚热带常绿树种, 但由于不能忍受低温而死亡, 因此选育沉水樟抗寒品种有十分重要的意义, 为此利用生物技术对沉水樟叶片诱导培育幼苗, 并在连续低温下处理, 获得抗寒植株。结果表明, 在10℃光照培养箱中, 每隔12 h温度降低1℃, 处理10 d并将温度稳定在-10℃, 此时处理所得的愈伤组织活力最强。在10℃光照培养箱处理2 d, 5℃光照培养箱处理2 d, 0℃光照培养箱处理2 d, -5℃光照培养箱处理2 d, -10℃光照培养箱处理2 d时植株细胞的抗逆生理指标 (SOD, POD酶的活性增强, MDA的含量大为减少) 大为提高。
关键词：沉水樟,抗寒品种,体细胞变异
樟树是我国亚热带常绿阔叶林中珍贵的深根长寿树种, 树高30~50 m, 胸径可达3 m[1], 但由于不能忍受低温而死亡, 因此有必要选择适合北方生长的品种。抗寒品种的选育主要通过芽变和实生变异途径获得, 但自然突变存在时间长, 栽培选择范围广, 变异无方向性等不足, 制约了抗寒品种规模的扩大。体细胞的无性系变异育种的研究是随着植物细胞的培养技术的产生而发展起来的, 它能够在一定程度上克服常规育种的上述障碍。由于它比自然突变的频率高, 如果加以人工诱变和定向选择, 有望获得沉水樟的变异体, 为下一步选出优良的品种奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料及处理
试验材料选用15年生沉水樟树当年生幼嫩茎段。先将采回的幼嫩枝条用自来水冲洗, 然后在超净工作台上先用75%的乙醇消毒30 s, 接着用0.1%的Hg Cl2消毒5 min, 再用无菌水清洗4次, 用吸水纸吸干表面的多余的水分后, 将其剪成长度约为3 cm的小段接种在不含植物激素的MS培养基上 (培养基中附加2%的蔗糖和0.7%的琼脂粉, 聚乙烯吡络烷酮1 500 mg/L) , 在培养温度为25±2℃、光照强度为1 500 Lx、光照时间16 h/d的培养室内培养。40 d可以获得8 cm高的无菌苗, 无菌苗叶片作为植株再生的外植体。
1.2 试验方法
1.2.1 叶片诱导愈伤组织培养基的筛选
将上面获得的沉水樟无菌苗叶片剪成2cm2的小块放在MS基本培养基上[2], 附加0.1~0.3 mg/L的IBA (简写为0.1~0.3, 下同) 、1~7的BA (见表1) 。培养基中蔗糖和琼脂浓度分别为3.0%和0.78%。每个植物激素浓度组合10瓶, 每瓶3个外植体。在光照强度为1 500 Lx、光照时间16 h/d的条件下培养。30d时, 观察、统计愈伤组织诱导情况。
1.2.2 低温处理愈伤组织
将获得的沉水樟无菌苗叶片剪成2 cm2的小块放入已筛选出的MS﹢0.2IBA﹢3 BA培养基中, 每瓶3个外植体, 处理100瓶。分别将它们置于光照培养箱中, 培养温度25±2℃, 光照强度1 500 Lx, 15 d后产生的愈伤组织, 分成5组。第1组置于10℃光照培养箱处理2 d, 5℃光照培养箱处理2 d, 0℃光照培养箱处理2 d, -5℃光照培养箱处理2 d, -10℃光照培养箱处理2 d。第2组置于4℃光照培养箱处理4 d, -4℃光照培养箱处理4 d, -10℃光照培养箱处理2 d。第3组置于10℃光照培养箱, 每隔12 h温度降低1℃, 最终将温度稳定在-10℃, 处理10 d。第四组置于10℃光照培养箱处理5 d, 0℃光照培养箱处理1 d, -10℃光照培养箱处理4 d。第五组置于10℃光照培养箱处理5 d, -10℃光照培养箱处理5 d。将上面存活的愈伤组织置于25±2℃, 光照强度1500 Lx的光照培养箱中。
1.2.3 愈伤组织的细胞活力检测
用TTC测定[3]。称取低温处理愈伤组织300 mg, 放入具有刻度的10ml试管中, 加入5 ml氯化三苯基四氮唑 (TTC) 试剂, 在25℃的恒温箱中静止培养20~24 h。吸取TTC溶液, 用蒸馏水冲洗3次, 加入5 ml 95%乙醇, 将试管放入75℃水浴中, 加热30 min, 提取红色的三苯基四氮唑。用721分光光度计在485 nm处测试三苯基四氮唑的吸收值 (25±2℃条件下产生的愈伤组织为对照) 。用相对存活率表示愈伤组织或细胞的活力。
相对存活率=处理愈伤组织 (细胞) 的TTC值/对照的TTC值×100%
1.2.4 愈伤组织芽诱导培养基的筛选
将存活的愈伤组织放在WPM培养基[附加0.1~0.3 mg/L的IAA或IBA (简写为0.1~0.3 IAA或IBA, 下同) 、1~7的BA]上。培养基中蔗糖和琼脂浓度分别为3.0%和0.78%。每个植物激素浓度组合10瓶, 每瓶放入3块愈伤组织 (每块体积约为1cm3) , 30 d时, 观察、统计芽诱导结果, 诱导出的芽以肉眼清晰可见为标准。
1.2.5 低温处理幼芽
将愈伤组织 (第3组) 放入已筛选出的愈伤组织芽诱导培养基中, 每瓶放入3块愈块伤组织, 处理100瓶。分别将它们置于光照培养箱中, 培养温度25±2℃, 光照强度1 500 Lx, 40d后, 可获得3 cm左右的不定芽。将它们在常温下放置5 d后, 分成五组置于光照培养箱中:第一组置于10℃光照培养箱处理2 d, 5℃光照培养箱处理2 d, 0℃光照培养箱处理2 d, -5℃光照培养箱处理2d, -10℃光照培养箱处理2 d。第2组置于4℃光照培养箱处理4 d, -4℃光照培养箱处理4d, -10℃光照培养箱处理2 d。第3组置于10℃光照培养箱, 每隔12 h温度降低1℃, 最终将温度稳定在-10℃, 处理10 d。第4组置于10℃光照培养箱处理5 d, 0℃光照培养箱处理1 d, -10℃光照培养箱处理4 d。然后再将存活的苗子置于室温下培养。
1.2.6 酶活性的检测
超氧化物歧化酶 (SOD) 活性测定采用氮蓝四唑 (NBT) 光还原法[4], 过氧化物 (POD) 酶的活性采用邻甲基苯酚子氧化法[5]。
2 结果与分析
2.1 沉水樟叶片愈伤组织诱导
由IBA和BA对沉水樟叶片愈伤组织诱导的结果 (表1) 可以看出, 沉水樟叶片在IBA与BA不同浓度组合培养基上愈伤组织诱导率存在较大的差异。当IBA浓度为0.1时, 随BA浓度的升高, 愈伤组织诱导率从由10.0%升高到33.3%;当IBA浓度为0.3时, 随BA浓度的升高, 愈伤组织的诱导率逐渐增大, 最大的愈伤组织诱导率为83.3%;当IBA浓度为0.2时, 愈伤组织诱导率呈现先上升再下降的趋势, 在此激素浓度组合中, 愈伤组织最大诱导率可达100%。比较以上结果, 选择MS﹢0.2IBA﹢3 BA为沉水樟叶片诱导愈伤组织的最适培养基。
2.2 低温处理对愈伤组织活力的影响
低温处理沉水樟叶片愈伤组织后, 用TTC法测定[3]低温对愈伤组织活力的影响。结果表明, 第5组的TTC值最低, 相对存活率也最低, 可能是降温幅度过大, 细胞内水分来不及排除, 而形成大的冰晶对细胞内部的结构产生伤害;第3组的TTC值最高, 相对存活率也最高, 说明缓慢降温的过程实际上就是细胞内水分连续不断地被排除到细胞外的过程。从表中可以看出愈伤组织的存活率与TTC值 (即细胞的活力) 呈正相关。由此可以看出将愈伤组织置于10℃光照培养箱中, 每隔12 h降低1℃, 最终稳定在-10℃, 处理10 d的方法, 使愈伤组织的相对存活率最高。
2.3 芽诱导培养基的筛选
2.3.1 IAA和BA植物激素组合对低温处理愈伤组织诱导芽的影响
由IAA和BA对低温处理愈伤组织诱导芽的结果可以看出, 在增殖培养基上低温处理沉水樟叶片产生的愈伤组织均没有诱导出芽, 即芽的诱导率为0。这说明IAA和BA对沉水樟叶片诱导芽不敏感。
2.3.2 低温处理对IBA和BA植物激素组合愈伤组织诱导芽的影响
由IBA和BA对低温处理愈伤组织诱导芽的结果可以看出, 在IBA与BA不同浓度组合培养基上愈伤组织诱导率存在较大的差异。当IBA为0.1和0.2时随着BA浓度的增加, 芽诱导率逐渐增加, 最大诱导率为60%。当IBA为0.3时, 芽诱导率均为0。从诱导率的高低来看可以选择WPM+0.2 IBA+7 BA来作为芽的诱导培养基。
2.4 抗寒沉水樟SOD酶活性和POD酶活性检测
SOD可以清除体内的自由基, 从而减轻膜脂过氧化的程度, 避免了新陈代谢紊乱, 经过低温处理的沉水樟抗寒性明显提高了。尤其第1组的SOD酶活性最高, 这是最佳的选择处理温度, 第2组的降温幅度比较大, 自由基破坏了细胞膜系统导致了植物的抗寒性明显下降。因此, 我们选择第1组的条件来处理沉水樟的幼苗, 可提高植物的抗寒性。
沉水樟体内的POD能够及时的清除SOD产生的H2O2, 从而减轻细胞受到伤害, 也降低了膜得透性, 使植物的抗寒性明显增强。在第1组的连续低温处理下POD酶的活性最大, 沉水樟体内的POD酶可以清除过多的H2O2。
3 讨论
南方常绿树种引种到北方时, 由于不能忍受北方冬季低温而常常死亡。这主要是由于南方林木的遗传特性所决定。如要改变其生境, 必然会导致体内基因表达的变化, 随之产生抵御逆境的生理生化变化, 当这些变化与生境变化相适应时, 生物就能够存活, 否则, 就会导致生物的死亡。细胞是构成生物的最小活体单位, 包含生物的全部遗传信息。低温处理可以引起林木细胞DNA发生突变, 将长期在低温条件下能够存活细胞突变体经过诱导分化出芽, 并生长发育为完整的植株就可在低温条件下生长。因此, 在本实验中, 我们首先采用低温对细胞 (愈伤组织) 进行低温处理, 使细胞的遗传物质发生适应低温的变化, 去除死亡的愈伤组织, 保留基因发生突变的细胞系, 并从中筛选出在低温条件下能够生长的突变体, 进一步使其再生为完整的植株。这些植株再经过抗寒锻炼, 最终能够适应北方冬季寒冷的气温条件。已有的樟树引种驯化主要是对樟树种子萌发前进行为期70 d的层积处理 (也就是沙埋的方法) , 以提高樟树的萌发率和出苗率, 随后在幼苗的生长发育过程中给予良好的水、肥管理及防寒越冬措施, 通过这些栽培技术的改善使樟树逐步适应低温环境。这种方法所用时间很长, 管理过程和措施繁杂, 最重要的是无法得到具有抗寒遗传特性的樟树。而我们的实验是利用体细胞变异和低温筛选的方法, 能够在较短的时间内得到具有抗寒遗传特性的沉水樟, 通过抗寒生理检测, 已确定这些抗寒品种具有良好的抗寒生理指标。因此, 我们的方法不仅大大缩短了育种时间, 简化了育种程序和过程, 而且使沉水樟的抗寒遗传特性得到巩固和提高。
参考文献
[1]毛春英, 张纪德, 王秀梅.樟树引种驯化及抗寒育苗栽培技术[J].林业科技, 2001, 26 (6) :11-15.
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[4]白玉璋, 汤学军.植物生理学测试技术[M]北京:中国农业出版社, 1995.
[5]汤章城, 魏家绵, 陈因等.现代植物生理学实验指南[M].北京:科学技术出版社, 1993.
体细胞变异 篇2
1.1 材料
吉生羊草 (Leymus chinensis) 成熟种子, 采自吉林省乾安县。
1.2 方法
1.2.1 培养基
诱导培养基:MS+300 mg L-1酸水解酪蛋白+4.0 mg L-12, 4-D+3.0% 蔗糖+0.7% 琼脂;继代培养基:酸水解酪蛋白+2.0 mg L-12, 4-D+3.0% 蔗糖+0.7% 琼脂;再生苗分化培养基:MS+300 mg L-1酸水解酪蛋白+1.0mg L-12, 4-D+0.3 mg L-16-BA+3.0% 蔗糖+0.7% 琼脂;生根培养基:1/2 MS+1.0mg L-12, 4-D+0.1 mg L-1NAA+1% 蔗糖+0.7%琼脂 (所有培养基p H 5.8) 。
1.2.2 愈伤组织诱导、继代培养及再生苗分化
将吉生羊草种子去除颖片, 用水浸泡约10h后, 无菌蒸馏水清洗1 次。将种子用70% 乙醇表面消毒1 分钟, 用0.1% 的氯化汞溶液浸泡12min。最后将种子用无菌水冲洗5 次, 接种在愈伤组织诱导培养基上, 置于25±1℃条件下暗培养5 周后, 将诱导出的愈伤组织转接到继代培养基上进行继代培养5 个月后, 将胚性愈伤组织转接到再生苗分化培养基上培养, 获得再生植株。然后, 将高于3 厘米以上的再生苗转接进行生根壮苗培养。选取根系良好的健壮再生苗, 用自来水冲洗、彻底去掉培养基, 移栽至无菌土和蛭石 (2:1) 的混合基质中, 于培养室中湿润条件下培养驯化3 周后移栽至大田。
1.2.3 基因组DNA的提取
肉眼观察, 吉生羊草再生植株与对照幼苗表型相同。以愈伤组织诱导培养基上一粒吉生羊草种子长出的纤细幼苗为对照, 从来源于该粒种子愈伤组织分化的200 株再生植株中, 随机选取18 株用于ISSR和REMAP分析。
1.2.4 DNA提取方法
分别采集再生植株和用于对照实验幼苗的幼嫩叶片, 提取基因组总DNA, 用改良的CTAB法[1]。
1.3 ISSR分析
1.3.1 ISSR引物筛选
利用一套ISSR引物 (共52 个引物) 检测吉生羊草再生植株基因组变异, 分别随机从吉生羊草再生植株DNA样本中选取3 个样本作模板, 各自进行2 个独立重复PCR扩增实验。根据PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果, 分别从这52 个引物中选取重复性好、条带清晰、分布均匀的引物进行PCR扩增, 进一步筛选出分别适合吉生羊草的ISSR扩增引物, 同时记录条带的分布规律。
1.3.2 ISSR PCR扩增反应及产物检测
利用所筛选出的引物, 分别对18 株实验材料和对照幼苗的2 个独立提取批次DNA样本进行ISSR PCR扩增反应。将ISSR PCR扩增产物用2% 琼脂糖凝胶在TAE缓冲液中进行电泳后, 再经溴化乙锭染色, 用紫外扫胶仪进行检测、照相。
1.4 REMAP分析
1.4.1 REMAP引物筛选
分别以上述52 个ISSR引物作为前引物, 利用对应于BARE-1a (accession Z17327) LTR369-393 核苷酸序列为后引物 (该序列5′ 端含有一个Eco R Ⅰ酶切位点) [2], 作为REMAP分析的引物组合。针对每一引物组合, 分别随机从吉生羊草再生植株DNA样本中选取3 个样本作模板, 各自进行2 个独立重复PCR扩增实验。根据PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果, 分别从这52 个引物组合中选取重复性好、条带清晰、分布均匀的引物进行PCR扩增, 进一步筛选出分别适合吉生羊草的REMAP扩增引物组合, 同时记录条带的分布规律。
1.4.2 REMAP PCR扩增反应及产物检测
利用所筛选出的引物组合, 分别对18 株实验材料和对照幼苗的2 个独立提取批次DNA样本进行REMAP PCR扩增反应。产物检测分析同ISSR。
1.5 数据分析
仅对与引物组合筛选时结果都一致 (2 次独立的实验) 的长度为200~2000bp清晰条带进行统计。对于每一材料在同一位点有带则记为“1”, 无带则记为“0”, 分别获得吉生羊草亲本及所有再生植株研究样品在所有位点AFLP“0, 1”信息的二维矩阵。
应用NTSYS-PC version 2.10e软件包分别对上述二维矩阵进行分析, 采用SIMQUAL (Similarity of qualitative data) 程序的Jaccard’s Similarity Index (JSI) 方法产生遗传相似性矩阵, 采用非加权配对算术平均法-UPGMA (Unweighted pair-group method, arithmetic average) 方法进行聚类分析。
2结果与分析
2.1 高效的吉生羊草种子诱导愈伤组织和植株再生体系
愈伤组织诱导培养基有利于羊草俞伤组织的形成。当吉生羊草种子在愈伤组织诱导培养基上培养10d左右时, 在种子及其长出的嫩芽周围开始出现白色半透明、浆糊状愈伤组织, 并逐渐长大。继代培养2 个月后, 一半以上的愈伤组织转变为胚性愈伤组织, 如他人报道的玉米和大麦胚性愈伤组织结构相似的疏松、亮黄色愈伤组织[3]。同时, 继代培养基也适于胚性愈伤组织状态及其分化潜力的维持。将其转接到合适的分化培养基后, 颜色逐渐变淡、质地变硬, 其表面开始长出白色或淡紫色的不定根。随后愈伤组织表面出现绿色芽点, 逐渐伸出不定芽。通过该再生体系, 愈伤组织分化率均可达到80% 以上。移栽成活率可达到85%以上。
2.2 吉生羊草再生植株遗传不稳定性分析
分别随机从吉生羊草再生植株DNA样本中选取3个样本作模板, 用52 个ISSR引物各自进行2 个独立重复PCR扩增实验。结果表明, 用其中24 个引物进行扩增反应产生的产物具有高度重复性, 可产生不连续带谱, 因而被用于18 株再生植株和对照亲本基因组片段的扩增。关于ISSR引物筛选、适宜的退火温度、记录带数、多态性带数及多态性带数比例等详细信息见表1。每一引物产生4~10 条DNA片段, 平均为6.04 条DNA条带。在所筛选的24 个引物中, 相对于亲本对照, 其中17 个引物在所有18 株再生植株中产生的ISSR带谱为单态性, 另7 个引物至少在其中一个再生植株中产生了多态性条带。在所检测的145 条长度为200~2000bp ISSR条带中, 13 条 (8.97%) 具有多态性, 其中10条表现为亲本原有条带的缺失, 另外3 条为新产生的DNA条带 (见图1) , 缺失的条带数目明显高于新带数目。在52 个REMAP引物组合中, 其中26 个引物组合经PCR扩增反应产生了高度重复的带谱。在这26 个引物组合中, 其中3 个引物组合产生的带谱与ISSR所产生的带谱一致。因此, 为避免分析结果重复和混乱, 选择另外23 个引物组合用于吉生羊草再生植株的遗传不稳定性分析 (见表2) 。在所用23 个引物组合中, 其中19 个引物组合经扩增反应后产生了单态性的图谱, 而另外4 个引物组合扩增反应产物中有多态性条带产生。总共记录了127 条长度范围为200~2000bp的REMAP条带, 平均每个引物扩增出5.52 条DNA片段。在所记录的条带中, 共有4 条 (3.15%) 在供试植株中具有多态性, 均表现为亲本原有条带的缺失 (见图2) 。
以ISSR和REMAP实验数据为基础, 分别计算18株再生植株及亲本对照之间的遗传相似性系数, 结果表明不同植株彼此间基于ISSR的遗传相似性系数范围为0.931 ~ 1.000, 平均为0.974。基于Jaccard系数, 采用非加权几何平均法 (UPGMA) 对以上供试植株进行聚类分析, 结果表明19 株植株共聚成4 组, 亲本植物聚在第3 组 (见图3) 。基于REMAP分析, 所有分析样本彼此间的遗传相似性系数范围为0.976 ~ 1.000, 平均为0.996。从聚类树状图可以看出, 再生植株R6, R8, R13, R14 和R15变异较明显, 没有与亲本幼苗聚在一起 (见图4) 。由此可见, ISSR和REMAP 2 种分子标记分析结果均表明, 组织培养可诱导吉生羊草产生体细胞无性系变异, 表明经由种子诱导愈伤、再经分化的再生体系可为优良羊草种质选育提供新的途径。
3 讨论
吉生羊草为禾本科牧草, 具有较强的耐盐碱性。因此吉生羊草高效组培体系的建立具有重要意义。然而, 迄今为止关于吉生羊草组培、再生方面的研究报道非常少。根据目前的研究报道, 植物幼穗或未成熟胚有利于胚性愈伤组织的诱导, 因而许多难于组织培养的禾本科牧草愈伤组织诱导及分化体系多采用幼穗或未成熟胚作为外植体[4,5,6,7]。但幼穗或未成熟胚难于全年供应, 取材时期严格受限, 从而限制了对应植物组培体系的应用。相比较而言, 用成熟种子作为组培外植体, 具有取材容易、供应充足等优点。因此, 本研究首次以吉生羊草成熟种子为外植体, 在愈伤组织诱导培养基中添加适量2, 4-D, 建立了简单高效的吉生羊草胚性愈伤组织诱导及植株再生体系。该体系操作简单, 其组培苗再生率可达到80%以上, 因而可应用于吉生羊草生物技术育种研究工作。
体外培养通常会对植物细胞造成压力, 导致其在外植体接种成活、愈伤组织诱导和植株再生过程中产生突变。据报道, 亲本的基因型影响体细胞无性系变异范围和程度[7,8,9,10,11,12]。在本研究中, 应用ISSR和REMAP 2 种分子标记技术, 在18 株随机选择的吉生羊草再生植株中均检测到了遗传变异。所检测到的变异DNA条带, 既包括亲本原有条带的缺失, 也有新带产生 (见图1) 。同时, 为排除外植体杂合性及其他因素对实验结果的影响, 本研究严格选用由同一粒吉生羊草种子诱导愈伤、再经分化而来的18 株再生植株为研究对象, 且对2 个独立批次提取的DNA样本进行综合比较分析。由此表明, 本研究在吉生羊草再生植株中所检测到的遗传变异, 均是在组培过程中真实发生的。
近年来, 几种DNA分子标记技术已被成功应用于再生植株 (包括那些没有明显表型变化的再生植株) 体细胞无性系变异分析。在这些分子标记技术中, 简单重复序列间扩增 (ISSR) 具有高敏感性、操作简便及低成本等优点, 一直受到研究者的青睐[8,9,10,13]。
体细胞变异 篇3
1 资料与方法
1.1 一般资料
本次研究选取了自2006年1月至2010年1月我院治疗的患儿共140例, 年龄在7~12岁, 平均年龄8.8岁, 通过西医诊断标准核实均患有儿童CVA, 全部患儿随机分为2组, 一组为治疗组70例, 采取了防哮汤治疗干预;一组为对照组70例, 采用了传统西药介入治疗和喷雾治疗。两组患者在年龄、性别、病程等一般资料分布上, P>0.05无显著性差异, 具有临床研究可比性。
1.2 治疗方法
治疗组予补益肺肾之中药复方防哮汤治疗。防哮汤药物组成:黄芪30g, 太子参、枸杞、女贞子、熟地各15g。以东华集团产DHJ-DW3煎药机煎成汤剂, 每剂200mL。每日服用3次, 根据患儿病情进行药量的增减, 如果出现严重的呼吸问题则采用吸氧辅助治疗。对照组用必可酮气雾剂 (每喷含丙酸倍氯米松100μg, 重庆葛兰素威康制药有限公司产品) 治疗, 每日一次喷雾。两组的治疗了2个疗程, 1个疗程为4周。
1.3 试验方法
1.3.1 样本采集
140例病例患者全部治疗前进行静脉采血, 采血时间为清晨, 每人采血剂量为3mL, 其中1mL用于收集测EOS;2mL测CD34。
1.3.2 检测方法
(1) 外周血EOS计数:外周血常规涂片计数。 (2) CD+34检测:采集外周血2m L, 以EDTA抗凝;取混匀外周血100μL, 加入单克隆抗体CD34-pe) 20μL, 混匀;室温避光孵育15min, 加入Optilyse C溶血素500μL, 混匀;室温避光孵育10min, 去上清, 加PBS缓冲液500μL洗1次。加入PBS500μL, 混匀, 使细胞悬浮后, 上流式细胞仪检测CD+34细胞。
1.3.3 统计学处理
实验数据以均数±标准差表示。应用SPSS统计软件对试验结果进行方差分析、t检验等统计分析, P<0.05为具有显著统计学意义的标准。
2 结果
2.1 全部病例均进行了血液采样, 进行了治疗前后的对比分析, 具体情况详见下表1。
2.2 疗效分析
2.2.1 嗜酸性粒细胞
治疗组治疗后较治疗前明显降低, 有显著性差异 (P<0.05) ;对照组治疗后较治疗前亦有降低 (P<0.05) ;治疗后组间比较, 治疗组低于对照组 (P<0.05) 。
2.2.2 外周血CD34
治疗组治疗后较治疗前明显降低, 有显著性差异 (P<0.05) ;对照组治疗后与疗前无显著性差异;治疗后组间比较, 治疗组高于对照组 (P<0.01) 。
总之, 从表1中可以看出, 治疗前后的对比表明, 治疗效果都是比较明显的, 但是进行中药防哮汤治疗的治疗组效果更为明显, 表现出了很好的临床效果。
3 讨论
3.1 病因分析
咳嗽变异性哮喘是支气管哮喘的一种潜在形式或特殊类型, 近年来发病率逐年增高。临床以咳嗽为主要表现, 没有典型的喘息症状, 常易被误诊从而迁延不愈。在大量的临床实践中体会到, 哮喘确系儿科难治之证, 其表现有: (1) 病因复杂; (2) 容易反复, 缠绵不愈; (3) 家长缺乏对本病的认识, 调护不当; (4) 不能坚持治疗, 往往用药即止。通过采血化验可知, 哮喘对儿童的血液影响是很直接的, 会直接增加白细胞, 影响儿童的免疫系统功能, 造成身体损伤, 进而影响治疗, 出现反复发作的情况。
3.2 防哮汤的作用分析
从上面的研究可知, 防哮汤对治疗儿童变异性哮喘有着重要的作用, 从药剂作用来讲, 中医认为其病症:发作期咳、喘、哮兼备, 急则治标, 止咳、平喘、定哮。对于缓解期来说咳嗽有痰, 病势缓, 现肺脾肾虚之象, 如易感多汗、食少便溏、气短面白光等, 则止咳化痰调补诸脏。而防哮汤的作用, 正好可以转变这些临床症状。而中药的稳定期治疗, 可以真正治疗的祛除夙根阶段, 有效减少本病的复发率和复发时病情。本研究根据“补肾阴、补肺气”的治疗宗旨, 组成中药复方防哮汤治疗, 方中黄芪、太子参为补气之要药, 主补肺脾肾之气, 现代研究证明其不仅能增强免疫功能, 对免疫平衡的双向调节, 也具有明显的作用。熟地黄滋阴补肾, 能增加血液中淋巴细胞数量、诱生人干扰素产生。女贞子、枸杞滋补肝肾, 兼能润肺。综观整个方药, 有补肺脾之气、益肾之阴精的作用, 标本兼治, 故能获得良好疗效, 且补而不腻, 能够长期服用。本研究结果表明, 采用该方治疗CVA, 治疗组在免疫指标上的转变明显优于对照组, 说明中药的介入治疗起到了调节CVA免疫失衡、降低哮喘发病率的作用。
摘要：目的 观察防哮汤对儿童咳嗽变异性哮喘缓解期免疫功能的影响。方法 本次研究选取了自2006年1月至2010年1月黑龙江中医药大学附属第一医院治疗的患儿共140例, 将140例患者随机分为治疗组70例和对照组70例, 对照组吸入丙酸倍氯米松气雾剂。疗程8周。结果 治疗前后的对比表明, 治疗效果均比较明显, 防哮汤治疗组外周血嗜酸性粒细胞、CD34明显降低, 与对照比较有显著差异。结论 防哮汤能调节咳嗽变异性哮喘嗜酸性粒细胞的分化和发育, 降低变应性, 预防哮喘的作用。
关键词：儿童咳嗽变异性哮喘,防哮汤,外周血,粒细胞,CD34
参考文献
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[5]梁妤婷.哮喘儿童健康相关生命质量与临床表现相关性及其与健康儿童差异性研究[D].重庆医科大学, 2008:1-50.
体细胞变异 篇4
关键词：@变异型哮喘,穴位贴敷法,@冬病夏治,穴,神阙,免疫球蛋白E,嗜酸性粒细胞,人类,儿童
咳嗽变异型哮喘(CVA)是以咳嗽为主要症状,而无喘息发作的特殊类型哮喘,慢性咳嗽是其惟一的症状。笔者采用冬病夏治传统穴位加神阙穴贴敷配合治疗小儿咳嗽变异性哮喘,取得了较好的临床疗效,现报道如下。
1 临床资料
1.1 一般资料
所有病例均选取自2012年7月—2013年7月在本院儿科门诊的咳嗽变异性哮喘患儿,按照就诊顺序采用随机数字法将符合纳入标准的70例患儿分为2组。
其中观察组35例,男19例,女16例;年龄2~5岁8例,5~7岁17例,>7岁10例;病程1~6个月,平均3个月。观察组35例,男17例,女18例;年龄2~5岁9例,5~7岁17例,>7岁9例;病程1~6个月,平均3个月。2组患儿年龄、性别及病程方面比较,差别无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
1.2 诊断标准[1]
参照2008年中华医学会儿科学分会呼吸学组修订的《儿童支气管哮喘诊断与防治指南》[1]制定。
1)咳嗽持续>4 W,常在夜间和(或)清晨发作或加重,以干咳为主;2)临床上无感染征象,或经较长时间抗生素治疗无效;3)抗哮喘药物诊断性治疗有效;4)排除其他原因引起的慢性咳嗽;5)支气管激发试验阳性和(或)PEF每d变异率(连续监测1~2 W)≥0%;6)个人或一、二级亲属特应性疾病史,或变应原检测阳性。以上1~4项为诊断基本条件。
1.3 纳入标准
1)符合该病的诊断标准;2)年龄在2~14岁之间;3)依从性好,配合治疗;4)监护人知情同意,并签署知情同意书。
1.4 排除标准
1)患有感染性疾病的患儿,如发热、水痘、腹泻等;2)有心血管、肝、肾和造血系统等严重全身性疾病患者;3)有皮肤过敏史或对所用药物过敏者;4)贴敷局部有皮损者。
2 方法
2.1 治疗方法
对照组:予孟鲁司特钠咀嚼片(顺尔宁,杭州默沙东制药有限公司),用法用量:2~5岁4 mg;6~14岁5 mg;均为每d1次,临睡前顿服,共服用1个月为1个疗程。
观察组:在对照组的基础上,加用冬病夏治传统穴位配合神阙穴贴敷,贴敷Ⅰ号方:白芥子5 g、元胡7 g、甘遂4 g、细辛4 g、麝香0.1 g。贴敷Ⅱ号方:丁香1 g、砂仁1 g、苍术1g、白术1 g、黑胡椒1 g。以上药材分别粉碎后保存备用,临用前用鲜姜汁及蜂蜜调匀,做成直径约1 cm的药饼。选取肺俞、心俞、膈俞、天突、膻中为贴敷穴位[2]。将I号方药饼贴敷在以上各穴,用胶布固定。贴敷时间:2~5岁每次贴敷1 h,5~7岁每次贴敷2 h,>7岁每次贴敷3 h;Ⅱ号方药饼贴敷于神阙穴,贴敷8 h。于夏季初伏开始贴敷,每10 d1次,贴满三伏共1月为1个疗程。
2.2 疗效判定标准[3]
痊愈:咳嗽症状完全消失,或者咳嗽程度非常轻,已经达不到轻度咳嗽的标准;显效:咳嗽症状由重度转为轻度,患者全身症状消失;有效:患者全身症状有明显改善,咳嗽症状明显减轻,有原来的重至中度转为中度至轻度;无效:患者的临床症状无改善,咳嗽症状无减轻,甚至加重。
2.3 观察指标
2.3.1 患儿外周血嗜酸性粒细胞计数(EOS)及血清总Ig E水平
治疗前后检测2组患儿外周血嗜酸性粒细胞计数(EOS)及血清总Ig E水平。
2.3.2 安全性检测
治疗前后对2组患儿进行血、尿、粪常规及肝肾功能,并注意观察观察组患儿皮肤安全性情况。
2.4统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析,计量资料以(±s)表示,采用t检验。等级资料采用Ridit分析。P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 2组患儿治疗效果比较
见表1。
与对照组比较△P<0.05
3.2 2组患儿治疗前后外周血嗜酸性粒细胞(EOS)计数及血清总Ig E水平情况比较
见表2。
与本组治疗前比较*P<0.05;2组治疗后比较△P<0.05
4 讨论
咳嗽变异性哮喘(CVA)是儿童慢性咳嗽的常见病因,约占儿童慢性咳嗽的24%[4],其特点是慢性、顽固性咳嗽,临床易被误诊为支气管炎反复呼吸道感染等,常常使用抗生素治疗。由于现在的环境污染及饮食生活习惯,儿童CVA在我国儿童中的发病率呈逐年上升趋势[5]。咳嗽变异性哮喘与支气管哮喘有类似的病理学表现,气道高反应性是两者的基本特点,嗜酸性粒细胞浸润为其基本病变的慢性气道炎症,也是由Ig E介导的变态反应性疾病[6],据统计约30%的CVA儿童最终进展为典型哮喘[7]。嗜酸性粒细胞(EOS)是咳嗽变异性哮喘的主要效应细胞,EOS增高者患CVA的风险也随之增加[8]。因此,降低EOS及血清Ig E水平对于CVA患儿的临床治疗尤为重要。
临床上治疗咳嗽变异性哮喘的常用药物包括白三烯受体拮抗剂、支气管扩张剂以及糖皮质激素等,临床上单独用药疗效往往不理想,常需要联合用药。孟鲁司特钠为强效的特异性半胱氨酰白三烯受体拮抗剂,有抑制气道平滑肌中的白三烯活性,预防和抑制白三烯引起血管的通透性增加、气道嗜酸粒细胞浸润和支气管痉挛[9]的作用,为临床治疗咳嗽变异性哮喘的常用药物。单独使用孟鲁司特钠也有一定的缺点,为了达到良好的临床效果,需要增加剂量,但高剂量的孟鲁司特钠又会导致患者的耐受性降低,表现出一定的不良反应[10]。中医药在治疗咳嗽变异性哮喘(CVA)上有一定优势[11]。
中医认为本病属“久咳”、“哮证”、“喘证”的范畴,其发病与肺脾肾关系密切,小儿肺脏娇嫩,脾常不足,肾常虚。肺为娇脏,不耐寒热,加之寒暖不知自调,易受邪气侵袭,因此易致肺气宣发肃降功能失调而发为喘咳。小儿脾亦虚,其饮食不知自节,常致水谷运化失职,聚湿生痰,痰阻气道郁闭于肺而致咳,且脾土为肺之母,脾气不足,每致肺气更虚,使咳喘迁延不愈,先天禀赋不足或久病不愈导致肾气亏虚,肾不纳气则动辄喘息咳嗽。
“冬病夏治”是按照“子午流注,适时开穴”的经络理论为基础开创的一种治疗方法,是中医学的一种独特的外治方法[12]。中医“治未病”的思想,依照“发时治标,平时治本”的原则,与现代医学在缓解期进行的全身免疫调节和抗炎治疗有相通之处[13]。三伏天时,人体内阳气鼎盛,此时治疗有助于辛温、通络之药与经络腧穴共同作用,是温煦肺经阳气、驱散内伏寒邪的最佳时机。此时对肺俞、脾俞、肾俞等进行药物贴敷,可达到激发肺脾肾三脏经气、振奋阳气的目的,驱除伏痰留饮;药物贴敷膻中又有纳气扶阳的作用,共奏调整肺、脾、肾三脏功能,驱除伏痰,消除夙根,以减轻或控制哮喘发作[14]。方中白芥子温中通络,利气豁痰;细辛散寒祛风开窍;甘遂性味苦寒,泻水逐饮,能破癥积;元胡活血化瘀理气;配以生姜汁发表,温化寒饮。麝香芳香走窜[15],诸药合用,共奏温肺行气利水,活血化瘀,降气平喘之功。
神阙为任脉经穴,各种疾病的发生无不与脐有着极其重要的关系。药物贴敷在神阙穴,既有药物的刺激作用,又有腧穴的功效,通过神阙穴,借奇经和十二经脉及其十二经别之循行,布输于五脏六腑,达于四肢百骸,以达病所,而祛疾除痼。在传统用药贴穴的基础上,加用辛温燥湿之品贴在神阙穴,由表及里,以祛生痰之源,达到根治的目的。II号方中药物皆为辛温燥湿运脾之品,丁香辛温归脾胃经,温经散寒;砂仁行气温中,化湿醒脾;苍白术温中燥湿运脾;黑胡椒温中下气消痰。诸药共凑运脾燥湿化痰之功。